DIAGNOSTICO
VIRICO
Ronny Ramos Ramos. 2019 MICROBIOLOGIA
.En algunas enfermedades virales como elsarampión,
el diagnóstico puede establecerse sobre bases
clínicas.
.En la mayoría de infecciones víricas, es necesario
llegar a un diagnósico definitivo, en el laboratorio,
mediante métodos directos e indirectos, que
requieren el aislamiento del virus en animales o en
cultivos de tejidos, la identificación del virus o la
detección de antígenos específicos del virus o de los
ácidos nucleicos virales (directos); o la demostración
de respuestas serológicas específicas (indirectos)
La Muestra:
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La presuncion clínica, la epidemiología orientan
sobre la prueba adecuada
Las mejores muestras, en el estadío temprano de la
enfermedad (primeras 72 horas)
Después de 7 días no realizar cultivos virales en
inmunocompetentes
Obtención aséptica y volumen suficiente
Medio de transporte (estabilidad) albúmina de
bovino, gelatina, antibióticos, antifúngicos
Transporte a 4°C. Si la inoculación es entre el 1° y
4° día se guardan en nevera 4°a -8°C
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Si la inoculación es después de 4 días se congela a
-70°C
Recipientes adecuados, tapa hermética, contenedor
metálica, tapa rosca, rotulado de peligro biológico.
METODOS DIRECTOS
:VISUALIZACION DE LA
PARTICULA VIRAL
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Microscopía de luz.- Tinciones especiales con
Wright o Giemsa, extendidos de lesiones
vesiculares, se visualizan inclusiones o cambios
celulares, células gigantes multinucleadas
Microscopía ultravioleta.- Tinción de anticuerpos
fluorescentes de virus en células infectadas
Microscopía electrónica.- Detectan partículas
víricas (tamaño y morfología). Sales de metales
pesados como el uranio, plata, tungsteno. Equipo
especializado, costoso. Nivel investigativo o
académico
o
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Aislamiento viral en cultivo: Intracelulares,
sistemas basados en líneas celulares que permitan
su desarrollo. Invasión viral se evidencia a través de
cambio celular o efecto citopático (EC) y mediante
pruebas complementarias
Proceso lento (días a semanas), laborioso, caro
Obtenido de explantes de órganos o embriones de
animales. Células se disocian con tripsina, en
recipientes, adhieren, multiplican, formando una
monocapa celular
Monocapas crecen en medio de cultivo complejo
(álbumina, vitaminas, sales, glucosa, buffer,
antibióticos). También cultivos en suspensión,
órganos
Los cultivos celulares se dividen en:
.Cultivos primarios: A partir de células, tejidos u
órganos, tomados del organismo. (riñón embrionario
humano)
.Líneas celulares diploides: De tejidos normales,
número cromosomico diploide original (fibroblastos)
Líneas celulares contínuas: Células inmortalizadas en
el laboratorio, resisten (n) números de pases, se
derivan de tejidos normales o tumorales, células
Vero (riñon de mono verde africano), HeLa y Hep-2
de células humanas malignas, son heteroploides
La monocapa se inocula con una muestra, del
individuo infectado, el virus se descubre por el
desarrollo de un efecto citopático (3 a 4 días),
sincicios, vesículas, inclusiones, redondeamiento
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Cuando los virus no producen efecto citopático, se
puede recurrir a técnicas que ponen en evidencia
la presencia del virus:
Hemadsorción, el virus infectante,incorpora
proteinas virales (hemaglutininas) en la membrana
celular, que provoca la adsorción de eritrocitos
(ortomixovirus, paramixovirus)
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Disminución en la producción de ácido por las
células infectadas, mediante un cambio de color en
el rojo fenol (indicador de ph) del cultivo. Permace
rojo (alcalino) en presencia de células infectadas;
vira a amarillo en presencia de células normales,
debido a la producción de ácido (en enterovirus)
Detección de antígenos:Técnicas
inmunológicas, biología
molecular
Técnicas inmunológicas:
.Inmunofluorescencia directa (ID).-Detección del
antígeno, mediante utilización de anticuerpo
marcado con fluorocromo (conjugado) que es
específico para el antígeno a descubrir.
Un extendido en placa de la muestra, del tejido en
monocapa celular inoculada con la muestra, se fija,
se agrega el conjugado con fluoresceína, incubación
y lavado, se observa con microscopio de
fluorescencia
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En el diagnóstico rápido de infecciones virales de
tracto respiratorio, influenza, sincitial respiratorio,
parotiditis, sarampión, coronavirus. En biopsias de
cerebro, encefalitis por herpes simple, rabia
Es laboriosa, requiere microscopio de fluorescencia,
de una persona con experiencia
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Test de aglutinación.- Método simple de un solo
paso, para la detección de antígenos virales en
muestras clínicas. Fijación inicial de anticuerpos
antivirales específicos sobre eritrocitos o partículas
de látex, se incuban, con antígenos con varios
epítopos y anticuerpos multivalentes, se produce un
entramado (aglutinación visible)
Fácil de realizar, se lee a simple vista, desventaja
que da reaccíones cruzadas, interferencias (
prozona , en exceso de anticuerpos). Rotavirus,
adenovirus
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Radioinmunoanálisis (RIA).- Se fijan los
anticuerpos específicos en superficie de matriz, tubo
o microplaca, luego se agrega la muestra que
contiene el antígeno que se quiere demostrar,
después de la reacción antígeno-anticuerpo, se
lava, se agrega un anticuerpo marcado con un
isótopo radioactivo (yodo), anti IgG. Se mide la
radioactividad mediante un contador de centelleo.
Inmunoanálisis enzimático sobre fase sólida
(ELISA).Se basa en la captura del antígeno por anticuerpos
específicos unidos a una fase sólida (pocillo de una
microplaca). El antígeno viral presente en la
muestra clínica se combina con el anticuerpo fijado
a la fase sólida y el antígeno viral se detecta
mediante adición de otro anticuerpo específico
conjugado a una enzima (peroxidasa de rábano,
fosfatasa alcalina). El sustrato para estas enzimas
varía (peróxido de hidrógeno,
paranitrofenilfosfato)
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La cuantificación se realiza con un espectrofotómetro.
Técnica rápida y automatizada, no requiere
observador experimentado, en más objetiva que la
técnica de RIA
Técnicas de Biología Molecular..Hibridización con sondas.- Se extraen secuencias
espefícas de un fragmento de ADN, por medio de
endonucleasas de restricción. Luego estas secuencias
se desnaturalizan y marcan con una enzima o
isotopo radioactivo. A estas cadenas marcadas, con
secuencia conocida se llaman sondas de ácidos
nucleicos. Por clonación, utilizando el plasmido como
vector y hongos o bacterias como huéspedes, es
posible producir sondas genéticas en grandes
cantidades
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Se trata la muestra con reactivos que solubilizan y
desnaturalizan los ácidos nucleicos. Posteriormente
se añade un DNA marcado, complementario del
DNA del virus, se incuba para que se produzca la
hibridación. Se pasa por una columna que contiene
un gel que separa la sonda ligada al ADN viral
hibridado de la no hibridada.
Dependiendo de cómo este marcada la sonda se
detecta la hibridación (isotopo radioactivocontador gamma, Rx, enzima- evaluación
colorimétrica
Amplificación de ácidos nucleicos virales, mediante
reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Incrementa el número de moléculas de DNA blanco
en las muestras, gracias a la amplificación selectiva
y repetitiva de una secuencia de nucleótidos de un
microorganismo determinado. Consta de 3 pasos:
a)Desnaturalización del ADN en la muestra (95°C)
separar las cadenas, b)Hibridización de cebadores
(55°C), fragmentos cortos de ADN complementarios
a extremos 5 y 3 de secuencias por amplificar,
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a partir de los cuales se inicia la síntesis, estos son
específicos de la secuencia del agente a descubrir,
c)La extensión de estos cebadores por la enzima
ADN polimerasa (72°C) termoestable, que
produce cadenas deADN identicas a la banda
blanco original. Deoxinucleótidos trifosfatos como
ladrillos
Estas reacciones se realizan en forma automatizada
en termociclador. Se multiplica , hasta que se
evidencia en un gel de agarosa con tinción con
bromuro de etidio (luz ultravioleta), o hibridación
con sonda marcada(después 30 ciclos, se evidencia
Limitaciones , como necesidad de cebadores
específicos (conocimiento de adecuado de la
secuencia de nucleótidos del agente),
infraestructura y entrenamiento
No indica infección activa
Ventaja, que puede evidenciar infección, en ventana
inmunológica.
Métodos indirectos
Reconocen la respuesta inmune, por parte del
huesped
En una primera fase predominan las IgM, luego
disminuyen aumentan las IgG
Las IgM son útiles para el dx de infección reciente:
Rubeola, citomegalovirus, hepatitis A, etc
Las IgG,tomar muestra en el periodo agudo, luego a
los 15 a 21 días (convalescencia), seroconversión
(diagnóstico retrospectivo)
Fijación del complemento.-En dos etapas.
1)Se utiliza un antígeno conocido, para determinar si
el suero de un paciente contiene anticuerpos contra
ese antígeno, se añade cantidad conocida de
complemento (cobayo). Si el Ag y Ac se reconocen
mutuamente se combinaran y captarán el
complemento
2)Se añade un sistema indicador formado por
globulos rojos sensibilizados (globulos rojos con
anticuerpos contra glogulos rojos)
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Si el Ag-Ac en la primera etapa fijaron el
complemento, y no queda, y los eritrocitos no se
lisaran en la segunda etapa, entonces la prueba es
positiva
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Hemaglutinación indirecta:- Los eritrocitos se
pueden sensibilizar con diversos antígenos y se
pueden utilizar como sistema indicador. Si se
evidencian los anticuerpos, la reacción revelará una
hemoaglutinación que se advierte a simple vista
Agutinación de látex.- El antígeno conocido se
encuentra fijo a la partícula de látex, se espera
descubrir los anticuerpos que se encuentran en la
muestra. Inmune (si es positivo), susceptible (si es
negativo)
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Neutralización viral.- Demuestra anticuerpos por su
efecto inhibitorio en la infectividad viral. Pueden
utilizarse en cultivos celulares (análisis de inhibición
de efectos citopáticos) o en hospedadores animales
(prueba de protección de ratones). Dengue
Inhibición de la hemaglutinación.- Algunos
antígenos virales tienen capacidad para aglutinar
eritrocitos de diversas especies, sin embargo la
presencia de anticuerpos específicos en el suero del
paciente evitan la aglutinación de eritrocitos por
tales antígenos, cuando esto ocurre se evidencia la
presencia de anticuerpos
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Inmunofluorescencia indirecta (IFI) rápido y
confiable. Unión de anticuerpos antivirales
presentes en el suero del paciente a los antígenos
virales expresados en la superficie y citoplasma de
células infectadas, que han sido fijadas a un
portaobjeto de vidrio. Lavado y agregado de
anticuerpo anti IgG humana conjugada con
isotiocianato de fluoresceína. La presencia de Ac se
evidencia por la aparición de fluorescencia en el
citoplasma y superficie de las células infectadas
Enzimoinmunoanálisis indirecto (ELISA)
Los antígenos virales se inmovilizan sobre una fase
sólida (esferita, policubetas, u otros elementos de
plástico), se agregan los sueros en estudio
(anticuerpos), se incuban, se lavan y se revela la
reacción Ag-Ac, por el agregado de una
inmunoglobulina antiespecie conjugada con una
enzima, con el sustrato apropiado, los resultados se
leen con espectofotómetro o en forma visual
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Inmunoblot o Western blot.a)Virus de muestra, son tratados para disgregación e
inactivación, antígenos del lisado viral se separan
por electroforesis en gel de poliacrilamida
b)Se realiza transferencia (blotting) de los Ag
separados a membranas de nitrocelulosa
c)Se coloca el suero del paciente sobre la membrana.
Posteriormente se añaden anticuerpos antiinmunoglobulina humana unida a enzima
(peroxidasa o fosfatasa), se agrega el sustrato,
para visualizar las bandas reactivas.
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Elección de una prueba diagnóstica
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Tres parámetros, sensibidad, especificidad y valor
predictivo
Sensibilidad.- Proporción de personas con la
infección que reaccionan positivamente con la
prueba realizada. Ejm. Una prueba es más sensible
cuando detecte un mayor número de personas
infectadas
Especificidad.-Proporción de personas sin la
infección que reaccionan como negativos. Ejm Una
prueba es más específica cuando tiene menos
reacciones positivas entre las muestras de personas
Valor predictivo.- Es la probabilidad de tener la
enfermedad dado el resultado del test
Valor predictivo positivo: Es la probabilidad de tener
la infección o enfermedad si el resultado del test
es positivo
Valor predictivo negativo: Es la probabilidad de no
tener la infección si el resultado del test es negativo
Un test de alto valor predictivo negativo será aquel
que tenga una alta especificidad y no
necesariamente una alta sensibilidad
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Por el contrario un test de alto valor predictivo
positivo tendrá que tener una gran especificidad
Un test ideal detectaría el 100% de las personas
infectadas y excluiría el 100% de las personas sin
la enfermedad, no dando nunca resultados falsos
positivos o falsos negativos
Se debe tener en cuenta, costos, complejidad, tiempo,
disponibilidad.