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Cada um de nós possui cerca de 30 mil genes e todos nós, independente da cor, raça ou credo, pertencemos a mesma espécie, a espécie humana. A definição do conceito de espécie não é tarefa simples, mas podemos simplificar dizendo que dois indivíduos são da mesma espécie se o cruzamento entre eles produzir indivíduos férteis. Além disso, indivíduos de uma mesma espécie possuem o mesmo número de cromossomos em suas células. E apesar de tudo isso, somos diferentes uns dos outros. O que determina essas diferenças? Porque uns são louros, outros morenos, uns brancos outros negros? Essas diferenças são determinadas pelos alelos que cada um de nós possui. Alelos são as diferentes formas que um gene pode apresentar. Assim como existem variações para uma mesma cor, existem variações para um mesmo gene. Sendo assim, cada um de nós possui um grupo de alelos e o que faz sermos quem somos é a soma da combinação de todos os nossos alelos (genótipo) com as influências recebidas do meio ambiente (que determina o nosso fenótipo).
Cada indivíduo possui um genótipo diferente, com exceção dos gêmeos monozigóticos (ou gêmeos idênticos) e dos organismos clonados a partir das células de outro indivíduo. Alguns genes existem sob um grande número de formas, ou seja, apresentam um grande número de alelos. Estes genes são chamados genes polimórficos. Para melhor entendermos este conceito, vamos chamar cada gene pelo nome de uma cor. Vamos supor que estamos trabalhando com 3 genes que chamaremos de gene azul, gene preto e gene verde. Destes 3 genes, quais você acha que são polimórficos? Já sabemos que genes polimórficos são aqueles que apresentam várias formas possíveis.
Então você consegue imaginar diferentes formas de verde? Que tal verde escuro, verde claro, verde musgo...O mesmo pode ser feito com a cor azul: azul marinho, azul celeste, azul anil... Agora tente o mesmo para a cor preta. O nosso gene preto é um gene monomórfico porque não apresenta nenhuma variação; preto é sempre preto. Já os genes verdes e azuis são os chamados genes polimórficos.
Os alelos para um mesmo gene são semelhantes o suficiente de modo que possamos reconhecê-los como alelos (todas as formas de verde são antes de tudo verde, esta é a característica), mas não são idênticos (verde claro não é idêntico ao verde escuro – estas são as diferentes formas da mesma característica). Além disso, os alelos para um mesmo gene estão localizados na mesma posição nos cromossomos homólogos. Deste modo, alelos de um mesmo gene apresentam sequências de DNA semelhantes (mas não idênticas - lembre-se que verde claro não é igual ao verde

Os alelos podem ser compradaos aos diferentes tons de uma cor escuro) e estão localizados na mesma posição em cromossomos homólogos. Por exemplo, o gene da beta-globina, que é uma das proteínas que compõem a hemoglobina, responsável pelo transporte de oxigênio no sangue, se localiza numa região específica do cromossomo 11 chamada p15.5. Todos os alelos do gene beta-globina possuem uma sequência de DNA semelhante e estão localizados nesta mesma região. Sendo assim, o que caracterizam os alelos são suas semelhanças na sequência de DNA e suas posições nos cromossomos, e cada um destes alelos é representante do mesmo gene, o da Beta-globina. Indivíduos que possuem o mesmo alelo para um determinado gene são chamados homozigotos enquanto indivíduos que possuem alelos diferentes são chamados de heterozigotos.
O principal processo que origina as variações de um mesmo gene é chamado de mutação. Pelo processo de mutação, alterações específicas ocorrem na seqência de DNA de um determinado gene, surgindo deste modo um novo alelo. O processo de mutação, segundo a teoria atual, acontece ao acaso. No entanto, a permanência ou não deste novo alelo na população poderá depender de alguns fatores, entre eles, a seleção natural. Se houverem fatores que favoreçam a permanência de um determinado alelo na população, dizemos que este alelo está sendo positivamente selecionado. Nós iremos entender melhor todos estes conceitos nas atividades seguintes.
Nesta atividade nós entenderemos melhor o conceito de gene polimórfico. Cada grupo receberá
4 caixas de lápis de cera. Dentro de cada caixa, vocês encontrarão diferentes tonalidades de lápis azuis, verdes, amarelos e um lápis preto. Escolha um tom para cada cor (pode ser repetido) e faça o seu genótipo preenchendo os quadrados abaixo.
Seu genótipo
Gene azul Gene verde Gene amarelo Gene preto
Agora, repita o mesmo exercício DE OLHOS FECHADOS . Separe as cores na mesa, feche os olhos, e pegue um tom sem olhar. É muito importante que, após preencher um quadrado com o tom escolhido ao acaso, você coloque o lápis utilizado novamente junto aos outros, misture os tons e então feche os olhos e pegue outro lápis ao acaso. Você verá que pode acontecer de você pegar o mesmo lápis. Se isso acontecer, você deverá utilizar o lápis escolhido ao acaso, mesmo que seja igual ao anterior.
2 Gene azul Gene verde Gene amarelo Gene preto

Compare os resultados obtidos nos dois exercícios. Para isto, complete a tabela com as frequências dos alelos de cada uma das cores. A frequência do alelo representa o número de vezes que aquele alelo é encontrado na população em relação ao número total de alelos na população para um determinado gene. Se por exemplo, nosso grupo de alunos é composto por 20 estudantes, quantos alelos do gene azul você espera encontrar? Considere que o gene azul está localizado num cromossomo autossômico, ou seja, esperamos que cada indivíduo possua duas cópias deste gene. Deste modo, cada aluno terá dois alelos para o gene azul, não é? Se nosso grupo tem 20 alunos, então, o número total de alelos deve ser 40! Se por exemplo, 4 alunos escolheram o alelo
Blue que aparece apenas uma vez em seus genótipos, então a frequência do alelo Blue, em relação a todos os alelos azuis será de 4/40, ou seja, 0,10. A soma de todas as frequências de todos os alelos para um determinado gene deve ser sempre 1.
Gene Azul
Com os olhos abertos
Blue Cornflower Blue Green Turquoise Blue Periwinkle Sky Blue Cerulean
Com os olhos fechados
Blue Cornflower Blue Green Turquoise Blue Periwinkle Sky Blue Cerulean
Gene Verde
Com os olhos abertos
Forest Green Aspargus Yellow Green Granny Smith Apple Green
Com os olhos fechados
Forest Green Aspargus Yellow Green Granny Smith Apple Green
Gene Amarelo
Com os olhos abertos
Goldenrod Dandelion Yellow
Com os olhos fechados
Goldenrod Dandelion Yellow
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A primeira enzima de restrição foi isolada em 1968 por Werner Arber,
Hamilton O. Smith, e Daniel Nathans quando trabalhavam na
Johns Hopkins
University, nos
Estados Unidos. Em
1978 os três receberam juntos o prêmio Nobel. Para saber mais sobre essa importante descoberta, visite o
Nobel e-museum no link http:// www.nobel.se/ medicine/ laureates/1978/
1)Existe alguma diferença na frequência dos alelos entre o exercício feito de olhos abertos e o exercício de olhos fechados? A que fatores você atribuiria tais diferenças?
2)Compare o seu genótipo com os genótipos de seus colegas. Há alguém com o mesmo genótipo que o seu?
3)Que genes, neste exercício, são polimórficos?
4)Quais são os mais polimórficos e quais os menos polimórficos?
5)Como você chegou a esta conclusão?
W. Arber
D. Nathans
H.O. Smith
A identificação humana por DNA tem sido mundialmente empregada como prova de perícia judicial de investigação de paternidade, maternidade e identificação em certos crimes e homicídios. O DNA pode ser isolado de sangue ou sêmen desidratado, ossos, bulbo capilar, saliva, células da pele, esfregaço anal, vaginal e bucal, tecidos derivados de biópsias ou cirurgias, tecidos mumificados, congelados, ou de líquido amniótico. Além disso, é possível coletar DNA de pontas de cigarro, tampa de caneta mordida, chiclete, pentes, selos, envelopes entre outros.
Os genes utilizados na investigação por análise de DNA são altamente polimórficos e, para a realização de um teste, são utilizados vários genes. Porque será que se trabalha com genes altamente polimórficos? Porque não se pode utilizar o gene Preto de nosso exemplo anterior?
Assim como no jogo das cores, onde variações de tons de uma mesma cor representam os alelos, na análise por DNA, a variação diz respeito ao tamanho do fragmento ou a diferença na seqüência de DNA. Por exemplo, em análises que consideram tamanho, fragmentos que apresentam o mesmo tamanho representam cópias do mesmo alelo.
A diferença de tamanho nos alelos pode ser observada através da ação de enzimas de restrição. Endonucleases de restrição, também chamadas enzimas de restrição, são proteínas bacterianas que cortam em fragmentos a longa molé-cula linear de DNA. As enzimas de restrição são as principais ferramentas da tecnologia do DNA recombinante. Uma enzima de restrição reconhece uma seqüência específica de nucleotídeos, como AGCT, cortando o DNA nos locais onde estas combinações de “letras” ocorrer. Essas enzimas são isoladas de bactérias e nomeadas com uma seqüência de três ou quatro le-tras seguidas por um número romano. Por exemplo,
Eco RI é uma enzima de restrição isolada da Escherichia coli . As enzimas de restrição reconhecem seqüências geralmente curtas (quatro a seis pares de base, ocasionalmente mais). Por exemplo, a enzima Ps I (isolada a partir de Providencia stuarti ) corta o DNA quando encontra a seqüência
CTGCAG; em contrapartida, Eco RI (isolada de Escherichia coli ) reconhece o sítio GAATTC.
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A alteração de uma base nitrogenada de uma sequência de DNA pode abolir ou criar um novo sítio de restrição, podendo gerar um polimorfismo. Isto é, quando o DNA de um indivíduo cuja alteração na sequência de DNA aboliu ou criou um sítio de restrição for incubado com enzimas de restrição específicas, as mesmas poderão detectar a presença de polimorfismo. A presença de um mesmo padrão de fragmentos gerados em duas amostras poderá indicar que as amostras em questão pertencem a indivíduos relacionados, ou constituem duas amostras do mesmo indivíduo. Dependendo do caso apresentado e do tipo de vínculo genético que se deseja determinar entre as amostras em questão, o cientista irá estabelecer quantos polimorfismos (e de que tipos) deverão ser testados.
Diferentes enzimas reconhecem diferentes sítios de restrição
Os testes de investigação por DNA podem ser utilizados para diversos fins tais como determinação da paternidade, determinação de vínculo genético entre indivíduos, e estabelecimento de casos de homicídio e estupro, onde neste caso as amostras encontradas no local do crime são comparadas com amostras recolhidas de suspeitos. A seqüência de DNA testada nestes casos geralmente se encontra localizada em cromossomos autossômicos, mas em alguns casos pode se utilizar também seqüências localizadas no cromossomo Y ou mesmo DNA mitocondrial. Seqüências localizadas nestas regiões não sofrem recombinação (porque não possuem homólogos) e deste modo são transmitidas para a geração seguinte intactas. Esta estratégia é utilizada quando se deseja investigar a linhagem parental de um indivíduo ou mesmo de uma população. Uma vez que o DNA mitocondrial é transmitido apenas pela linhagem materna (somente a mãe transmite DNA mitocondrial para todos os filhos e filhas) e o cromossomo Y é transmitido pelo pai somente para os filhos homens, a análise destas regiões pode fornecer importante informação quanto à origem parental dos indivíduos.
Havendo a possibilidade, o cientista sempre utiliza as seqüências localizadas nos cromossomos autossômicos porque produz resultados com maior grau de confiança já que um maior número de seqüências podem ser testadas. No entanto, em alguns casos especiais, como veremos a seguir, isso não é possível.
Genes polimórficos podem ser usados para se determinar a paternidade biológica de um indivíduo.
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O Dr. Silva é um cientista renomado que trabalha com casos complicados de investigação de vínculo genético por análise de DNA. Todos os casos complicados são enviados ao laboratório do Dr. Silva, que por ser uma autoridade no assunto e por ter muita experiência, sempre encontra uma resposta para os casos que chegam as suas mãos. E como tantas outras vezes, mais um caso complexo de assassinato chega ao laboratório do Dr. Silva.
O corpo de um homem jovem foi encontrado num descampado. O homem, identificado como Miguel Antunes, foi brutalmente assassinado com 7 facadas. Graças ao trabalho de Cardoso, um detetive esforçado e talentoso, descobriu-se que Miguel Antunes estava prestes a receber uma herança milionária devido a morte recente de seu pai, de um ataque do coração. Miguel
Antunes já havia perdido sua mãe (que teve seu corpo cremado) e não possuía nenhum outro parente conhecido vivo. No entanto, uma vizinha informou à polícia que Miguel Antunes tinha um irmão por parte de pai que nunca havia conhecido. Vasculhando a casa de Miguel, a polícia descobriu que este irmão, quando soube da morte do pai e também da herança que o mesmo havia deixado, enviou uma carta à Miguel informando que por ser filho do mesmo pai ele também tinha direito à herança. Miguel ignorou os apelos deste susposto irmão, dando entrada ao processo de pedido de herança. Alguns dias depois, Miguel foi assassinado. O detetive Cardoso então formulou a hipótese de que este suposto irmão poderia ter matado Miguel para mais tarde requisitar a herença deixada pelo pai. O trabalho de investigação da polícia levantou o nome de
5 suspeitos que foram vistos nos arredores do local do crime, no mesmo horário em que o crime foi cometido. No local do crime não foram encotradas pistas ou restos de material biológico. Se a hipótese do detetive Cardoso de que um irmão por parte de pai de Miguel haveria cometido o crime, como saber quais destes suspeitos é o irmão fraterno de Miguel? Se eles fossem filhos também da mesma mãe, então a comparação de várias regiões do DNA poderia indicar se há realmente entre os suspeitos algum que seja irmão de Miguel. No entanto, como seriam irmãos apenas por parte de pai, o Dr. Silva teria que analisar um número muito grande de regiões polimórficas até chegar a um resultado que indicasse o vínculo genético entre Miguel e o suspeito.
E como havia 5 suspeitos, esta análise seria complicadíssima e também muito cara. Dois irmãos por parte de pai compartilham em média apenas 25% do material genético, podendo compartilhar até menos que isso (10% ou 15%). Seria muito díficil excluir qualquer um dos suspeitos, e também muito difícil incluir um dos suspeitos com um bom grau de confiança. E o Dr. Silva também corria o risco de realizar testes e mais testes e não conseguir obter nenhum resultado significativo.
O Dr. Silva sentou-se entaõ em sua cadeira, olhou o trânsito da barulhenta rua onde fica seu laboratório e pensou com seus botões se não haveria uma maneira mais rápida e simples de resolver este caso. Como demonstrar através da análise de DNA que Miguel e um dos suspeitos possuíam o mesmo pai? Foi então que o Dr. Silva lembrou-se do cromossomo Y. O cromossomo
Y é passado pelo pai para todos os seus filhos, mas nunca para as filhas (que são XX). No cromossomo Y existem 3 regiões distintas. Duas pequenas regiões são homólogas ao cromossmo
X e podem sofrer recombinação. No entanto, há uma parte do cromossomo Y que é exclusiva e

que não sofre recombinação com o cromossomo X e por isso é passada de pai pra filho sem sofrer qualquer alteração. Mutações nesta região do cromossomo Y podem acontecer, mas é um evento raro que acontece a cada 10 7 gerações. Por isso, indivíduos masculinos de uma mesma família apresentam o mesmo padrão de DNA nesta região do cromossomo Y, enquanto indivíduos não relacionados geneticamente apresentam padrões diferentes. Se houver realmente um irmão paterno de Miguel entre os 5 suspeitos, está estratégia esclarescerá o caso.
O Dr. Silva arregaçou as mangas e começou a trabalhar.
Para realizar a análise do cromossomo Y, o Dr. Silva primeiro isolou um fragmento do cromossomo Y de 8.000 pares de bases (pb) do
DNA de cada um dos suspeitos e também de Miguel. Em seguida, ele submeteu este fragmento de DNA à ação de uma enzima de restrição cujo sítio de restrição apresenta-se em número e locais variados neste fragmento de 8.000 pb. Esta variação gera fragmentos de DNA de diversos tamanhos diferentes em cada amostra de DNA analisada. Cada um dos padrões de polimorfismo
é chamado de haplótipo. Ainda usando o exemplo com as cores,
A técnica de estabelecimento de vínculo genético a partir de sequências polimórficas do genoma foi desenvolvida pelo pesquisador inglês
Alec Jaffrey em 1987.
cada tom de cor verde, por exemplo, poderia ser considerado um haplótipo. Haplótipo e alelo podem ser vistos como termos equivalentes. No entanto, enquanto o termo alelo é usado para designar uma das formas de um gene específico, o termo haplótipo é usado quando se analisa um segmento de DNA que não necessariamente se limita a apenas um gene, podendo se estender por mais de um gene ou ainda ser uma seqüência do DNA que não codifica nenhum gene. Através do padrão dos haplótipos gerados em cada amostra, o Dr. Silva poderá dizer se há, entre os suspeitos, algum indivíduo apresentando o mesmo padrão que Miguel. A comparação entre as amostras será feita através da digestão com uma enzima de restrição específica e subseqüente análise por eletroforese em gel de agarose.
Exercício
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Se o DNA de cada amostra abaixo for incubado com a enzima Eco RI (que reconhece o sítio
GAATTC), responda:
Amostra 1: CAGTGATCTCGAATTCGCTAGTAACGTTGAATTCGTAACTTTCCCT
Amostra 2: TCATGAATTCCTGGAATTCCGGAATTCAGCAAATGGAATTCCATTC
Amostra 1: .......................número de sítios de Eco RI
.........................número de fragmentos gerados após a clivagem.
..........................tamanho do fragmento (pb)
O processo de polimerização de gel de agarose é semelhante àquele que ocorre quando fazemos gelatina.
Diferentes tampões têm sido recomendados para a eletroforese de
DNA. Os mais usados são TAE
(Tris-acetato-
EDTA) eTBE (Trisborato-EDTA). Os fragmentos de
DNA migram ligeiramente diferentes nestes dois tampões devido a diferenças na força iônica dos dois tampões.
Amostra 2: .......................número de sítios de Eco RI
.........................número de fragmentos gerados após a clivagem.
..........................tamanho do fragmento (pb)
1- Coloque o tubo que contém a enzima de restrição (tubo etiquetado ENZ) no gelo.
2- Marque os tubos: tubo verde CS (Cena do Crime); tubo azul S1 (suspeito 1); tubo laranja S2
(suspeito 2), tubo violeta S3 (suspeito 3); tubo vermelho S4 (suspeito 4) e tubo amarelo S5
(suspeito 5); com seu nome.
3- Usando uma ponteira limpa, pipete 10 µL de DNA do tubo estoque para os tubos coloridos correspondentes. Aplique a gota na parede do tubo para você ter a certeza de que ela foi transferida.
4- Troque a ponteira por outra limpa e pipete10 µL de enzima em cada um dos tubos que contém as amostras de DNA. Assegure-se de que pipetou corretamente.
5- Tampe os tubos. Centrifugue os tubos por 20 segundos.
6- Incube os tubos em banho-maria a 37 o C por 45 minutos.
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Os fragmentos gerados através da digestão por enzimas de restrição podem ser analisados através da técnica de eletroforese de agarose. Eletroforese é a técnica pela qual fragmentos de DNA de diferentes tamanhos são separados. O DNA é carregado em um poço do gel (que tem aspecto de gelatina) e este é submetido a um campo elétrico. O DNA irá se mover na direção do pólo positivo, uma vez que a molécula de DNA é negativa devido à presença de grupamentos de fosfato. Durante a corrida eletroforética, os fragmentos de menor tamanho correm mais rapidamente que os fragmentos maiores e, deste modo, a posição relativa dos fragmentos no gel depende dos tamanhos dos mesmos. Após a corrida eletroforética, o gel deve ser tratado com um corante específico que permite a visualização dos fragmentos de DNA.
Gel de agarose

O preparo do gel depende da concentração desejada e do volume da bandeja. Por exemplo, o volume da bandeja é de 25 mL e você deseja preparar um gel a 1%: 1% significa 1 g em 100 mL, portanto em 25 mL você usará 0,25g para fazer um gel a 1%.
1g’! 100mL xg’! 25 mL x= 0,25 g
Lembre-se de que o gel sempre deve ser preparado em tampão, nunca em água. Por convenção , os géis são interpretados da esquerda para a direita, com os poços orientados para cima e as amostras são aplicadas no poço da esquerda para a direita.
Preparação do gel de agarose
1) Pese ___________ g de agarose.
2) Coloque a agarose pesada num Beaker.
3) Adicione _____________ml de tampão de eletroforese.
4) Usando o microondas, ou outro dispositivo como bico de Bunssen, deixe a mistura ferver. Quando a solução estiver totalmente em ebulição e já não for mais possível observar a agarose, remova o Beacker do microondas.
5) Deixe a solução esfriar por aproximadamente 10 minutos.
6) Enquanto a agarose estiver esfriando, prepare a fôrma para o gel. Se necessário, use fita durex para selar as extremidades da fôrma. Adicione o pente a uma das extremidades do gel.
7) Quando a solução chegar a aproximadamente 60 graus, derrame o gel na fôrma.
8) Deixe-o solidificar por uns 15 minutos.
9) Quando o gel ficar duro, remova o durex e também o pente, com cuidado para não furar o gel.
10) Coloque o gel na cuba de eletroforese.
11) Adicione o tampão de eletroforese até que cubra o gel totalmente.
DNA lambda Hind III (DNA marcador) Tubo M
Adicionar 20 µL de corante ao tudo contendo lambda Hind III. Se possível, incube esse tubo a 65 o C por 5 minutos, resfrie e conserve o tubo no gelo até o uso.
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As alíquotas poderão ser feitas transferindo-se 15 µL do DNA marcador contendo corante para tubos identificado com a letra M.
1-Remova os tubos contendo as amostras de DNA digeridos na e mantenha-os em banho de gelo.
2-Centrifugue rapidamente por 20 segundos para reunir todo o volume no fundo do tubo.
3-Usando uma ponteira para cada tubo adicione 5 µL de corante de aplicação LD em cada tubo. Tampe o tubo centrifugue por 20 segundos.
4-Prepare um gel de agarose como descrito acima. Após solidificar adicione tampão TAE 1X o suficiente para cobri-lo.
5-Usando uma ponteira para cada amosta aplique as amostras no gel na seguinte ordem:
Poço 1: 10 µL DNA marcador;
Poço 2: 20 µL amostra CS (tubo verde)
Poço 3: 20 µL amostra S1 (tubo azul)
Poço 4: 20 µL amostra S2 (tubo laranja)
Poço 5: 20 µL amostra S3 (tubo violeta)
Poço 6: 20 µL amostra S4 (tubo vermelho)
Poço 7: 20 µL amostra S5 (tubo amarelo)
1) Feche a tampa da cuba de eletroforese.
2) Ligue a fonte de eletroforese e coloque na voltagem de ____volts.
3) Verifique se o gel está realmente correndo através da observação das bolhas que se formam no tampão de eletroforese. Se não forem observadas bolhas significa que o gel não está correndo. Neste caso você deve (a) certificar-se de que o tampão de eletroforese está cobrindo o gel; (b) certificar-se de que o durex foi removido da fôrma; (c) certificar-se que a cuba de eletroforese está ligada e que os eletrodos estão firmemente conectados; (d) verificar se não há fios soltos dentro da cuba de eletroforese.
4) Deixe o gel correr por _____minutos.
1) Coloque o gel numa cuba plástica e adicione algumas gotas do tampão de eletroforese.
2) Coloque o lado azul do papelote voltado para a face do gel.
3) Passe os dedos sobre o gel de modo firme, mas sem esmagar o gel, várias vezes.
4) Coloque a forma do gel com o Beaker vazio sobre o papelote azul.
5) Aguarde 15 minutos.
6) Remova o papelote azul e coloque o gel em água distilada.
7) Troque a água até que as bandas estejam visíveis.
No dia seguinte o Detetiver Cardoso telefonou para o Dr. Silva pra saber se ele já possuía alguma pista de quem era o criminoso. O que o Dr. Silva disse para o Detetive Cardoso?