Biotecnología médica
Inmunoensayos
Dra. Lize*e Liliana Rodríguez Verástegui
Inmunoensayos
En BM, son las herramientas que nos sirven para detectar moléculas
de interés médico
Inmunoensayo
Son las técnicas analíCcas que uClizan la acción anEgeno-anCcuerpo
como medio para generar un resultado percepCble.
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Enzimoinmunoensayo (ELISA)
Western blot
Inmunofluorescencia
Inmunohistoquímica
InmunocromatograOa
Marcar el analito (Ag o Ac)
ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,
ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas)
Es una técnica de Inmunoensayo en el cual
un an+geno inmovilizado se detecta
mediante un anCcuerpo enlazado a un
ENZIMA capaz de generar un producto
(rxn. Ag-Ac) detectable mediante un cambio
de color.
Western blot, inmunoblot o
electrotransferencia
Es una técnica analíCca usada para detectar proteínas
específicas en una muestra determinada (extracto proteico).
• Peso molecular
• Hidrofobicidad
• Estructura
Preparación de la muestra
Electroforesis en gel
Transferencia
Bloqueo
Marcadores
quimioluminiscentes
Peróxidasa de rábano
Detección
Lisis celular o
proteína naCva
Acrilamida
Membrana
Nylon o PVDF
Caseína o
albúmina
Preparación de la muestra
Electroforesis en gel
Transferencia
Bloqueo
Detección
Tipo de marcador
Método de medición
EnzimáCco
Espectrofotometría
Fluorescentes
Fluorescencia
Luminiscentes (HRP)
Quimioluminescencia
Diagnóstico de:
• Virus del VIH
• Enfermedad de las vacas locas
• Diabetes (GAD)
Inmunohistoquímica
Es una técnica de inmunoCnción que permiten
demostrar una variedad de anEgenos presentes
en las células o tejidos uClizando anCcuerpos
marcados con una sustancia que absorbe o
emite luz o produce coloración.
Permite
• IdenCficar y localizar una sustancia específica
en los tejidos
• Diferenciar entre patologías cutáneas
Consiste en:
Corte histológico + incubación con Ac + cromógeno = Unión Ag-Ac
Microscopio de luz
Uso en diagnósCco y diferenciación de
• Receptores de membrana de células cancerosas (marcadores
tumorales)
• IdenCficar los marcadores anCgénicos caracterísCcos de una
línea celular
• IdenCficar células que secretan una proteína
Desventajas
Tejidos congelados o frescos o fijados en formalina e inclusión en parafina
Conservación del anEgeno
InmunoEluorescencia
Es una técnica de inmunomarcación que hace uso de anCcuerpos
unidos químicamente a una sustancia fluorescente para demostrar
la presencia de una determinada molécula.
Primaria. Un anCcuerpo está unido al fluoróforo
o fluorocromo y este complejo se une a la
molécula diana y emite fluorescencia.
Secundaria. Se emplean dos anCcuerpos, uno
primario (Ag-Ac) y uno secundario (AgFluoróforo)
Primaria (directa)
Secundaria
(indirecta)
Tiempo de
preparación
Corto
Largo
Sensibilidad
Menos sensible
Más sensible
IsoCocianato de fluoresceína
Es necesario el uso de un microscopio que detecte fluorescencia
Se pueden emplear tejidos fijados en parafina o tejidos vivos
Limitante el fotoblanqueo.
Se usa para la detección de virus respiratorios (esputo)
InmunocromatograEía
Es una de técnica de inmunodiagnósCco
Se basa en la migración de una muestra a través de una
membrana de nitrocelulosa
Almohadilla
de absorción
de la muestra
Ig o anEgenos
conjugadas a
nanoparEcluas
coloreadas
PRUEBA
CONTROL
Almohadilla
de absorción
Capilaridad
PosiCva
NegaCva
Almohadilla
de absorción
de la muestra
Ig o anEgenos
conjugadas a
nanoparEcluas
coloreadas
PRUEBA
Ig específica
del Ag a
detectar
COMPLEJO Ag-Ac
CONTROL
Proteínas
Almohadilla
de absorción
InmunocromatograEía
Ventajas
• Simplicidad
• Rapidez
• No es necesario el uso de reacCvos ni instrumentación
adicional
DiagnósCco de:
• Test de embarazo de las farmacias
• HepaCCs
• Test de troponina I
• Test sobre el VIH
REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR)
U@lizada por primera vez por Kary
Mullis en 1983
ObjeCvo de la reacción
Obtener un gran número de copias de
un fragmento de ADN parCcular,
parCendo de una escasa canCdad de
este.
Propósito
El ADN amplificado puede ser clonado
directamente o usado en una gran
variedad de procedimientos analíCcos
¿Cuál es el procedimiento?
¿Y cómo saber si se ha generado el fragmento de ADN?
• Electroforesis en geles de agarosa o acrilamida (Southern blot,
Western blot)
Usos
• Se uCliza mucho esta técnica para rastrear el origen de los
virus humanos y en estudios forenses.
• Formación de clones
• Determinación de mutaciones que impliquen la expresión de
una enfermedad hereditaria (diagnósCcos previos al
embarazo)
• Determinación de la carga viral (VIH o HepaCCs B)
Repaso para examen
• Reacciones anEgeno anCcuerpo
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Precipitación
Neutralización
AgluCnación
Opsonización
• AcPol y Ac Mo
• Inmunoensayo
• ELISA
Wetern blot
• Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
• Inmunohistoquímica
• Inmunofluorescencia
• InmunocromatograOa