فعالیت آنتی اکسیدانی ضایعات چای ( (Camellia sinensis L. رضا فرهوش ،محمد حسین حداد خداپرست ،غالمعلی گل موحد دانشگاه فردوسی مشهد ،دانشکده کشاورزی ،گروه علوم و صنایع غذایی چکیده فعالیت آنتی اکسیدانی ضایعات چای اعم از برگهای قدیمی چای و ضایعات فراوری چای سیاه در مقایسه با برگهای سبز چای مورد ارزیابی قرار گرفت .بیشترین بازده استخراج و فعالیت آنتی اکسیدانی در عصاره حاصل از استخراج برگهای سبز چای با آب داغ مشاهده شد. عصاره حاصل از استخراج برگهای قدیمی چای و ضایعات چای سیاه با آب داغ دارای فعالیت آنتی اکسیدانی یکسانی از دید آماری بودند ( .) P<0/05همچنین اختالف معنی داری بین فعالیت آنتی اکسیدانی عصاره های استخراجی از آنها به روشهای آگاروالی و متانولی مشاهده نشد ،و حتی در برخی موارد عصاره های آنتی اکسیدانی ضایعات چای سیاه حائز عملکرد بهتری نیز بودند .از این رو ،برگهای ً به عنوان قدیمی چای و ضایعات چای سیاه را که غالبا ضایعات کشاورزی محسوب می شوند می توان به عنوان منابع توانمند آنتی اکسیدانهای طبیعی مورد استفاده قرار داد. واژهای کلیدی :فعالیت آنتی اکسیدانی ،ضایعات چای ،برگ قدیمی چای ،ضایعات چای سیاه. مقدمه برگهای سبز چای حاوی 10تا 30درصد (بر مبنای وزن خشک) ترکیبات پلی فنلی شامل کاتشینها ،فالوونولها، فالوانونها ،اسیدهای فنلی و گلیکوزیدهاست ( .)1پلی فنلهای چای ،آنتی اکسیدانهای طبیعی بوده ( ،)2مسئول خصوصیات ضد سرطانی و ضد جهش زایی چای و نیز آثار حمایتی آن در مقابل بیماریهای قلبی عروقی می باشند ( .)5 ،4 ،3آنها همچنین برخوردار از فعالیت آنتی اکسیدانی قوی تری نسبت به BHT ،BHAو -توکوفرول بوده ،ویژگیهای ایمنی شناسی آنها بهتر از انواع یاد 1 شده است ( .)6فعالیت آنتی اکسیدانی قوی عصاره های چای ً برگرفته از حضور کاتشین ،اپی کاتشین ،اپی عمدتا گالوکاتشین ،اپی گالوکاتشین گاالت و اپی کاتشین گاالت است ( .)7کاتشینها ترکیبات طعمی غیرفرار چای سبز به شمار می آیند ( )8و 8تا 15درصد از وزن برگ خشک چای را به خود اختصاص می دهند (.)9 ً چایهای سبز و سیاه از پایجوشهای جوان ،عمدتا 2تا 4برگ اول به انضمام یک جوانه ،تولید می شوند .سایر برگهای چای (برگهای قدیمی چای) که در چای سازی به کار نمی روند و نیز ضایعات الینفک صنعت تولید چای سیاه در مجموع تحت عنوان ضایعات چای در ردیف ضایعات کشاورزی قرار می گیرند .هدف از این پژوهش ،مطالعه قدرت آنتی اکسیدانی ضایعات چای در مقایسه با برگهای سبز چای و نیز بررسی اثر شیوه استخراج بر فعالیت و بازده استخراج آن می باشد. مواد و روشها مواد اولیه .برگهای سبز و قدیمی چای از یک باغ چای و ضایعات چای سیاه از یک کارخانه چای سازی در رامسر تهیه شدند .فعالیت پلی فنل اکسیدازی برگهای سبز و قدیمی چای با فرو بردن آنها در آب جوش به مدت 3دقیقه نابود گردید .برگها پس از آبکشی و خشک کردن در دمای اتاق آسیاب شدند ( .)10تمام معرفها و مواد شیمیایی با درجه آنالیتیکال از شرکتهای مرک آلمان و سیگما- آلدریچ انگلستان خریداری گردیدند. آماده سازی عصاره های چای .عصاره های چای بر طبق سه روش ذیل آماده شدند : (الف) روش آگاروال .ده گرم نمونه خشک با 150میلی لیتر آب مقطر داغ ( )80°Cسه بار استخراج شد .عصاره استحصالی پس از خنک کردن به دمای اتاق و صاف کردن ،در معرض همان حجم کلروفورم قرار گرفت تا کافئین و رنگدانه های آن حذف گردد .فاز آبی جدا و دو بار با همان حجم اتیل استات استخراج گردید .فاز اتیل استاتی با دستگاه تبخیر گردان تحت فشار کاهش یافته در دمای 40°Cحذف شد .عصاره تغلیظ شده تحت خأل و دمای 40°Cخشک و توزین گردید (.)11 (ب) روش آب داغ .چهار گرم نمونه خشک به مدت 20دقیقه در یک اتوکالو 80تا 105°Cبا 40میلی لیتر آب مقطر 2 استخراج شد (فراکسیون .)1بقایای نمونه با 60میلی لیتر آب مقطر در محدوده دمایی 100تا 130°Cبه مدت 30 دقیقه استخراج گردید (فراکسیون .)2دو فراکسیون پس از خنک کردن به دمای اتاق و صاف کردن ،با هم ترکیب و تحت خأل در دمای 40°Cخشک و سپس توزین شدند (.)12 (ج) روش متانولی .ده گرم نمونه خشک با 70میلی لیتر متانول به مدت یک ساعت در دمای اتاق و ضمن تکان دادن استخراج گردید (دو بار) .بقایای نمونه با 60میلی لیتر متانول در دمای اتاق به مدت 12ساعت عصاره کشی شد .تمام عصاره ها پس از صاف کردن با کاغذ صافی و ترکیب با یکدیگر ،تحت فشار کاهش یافته و دمای 40°C تغلیظ ،خشک و سپس توزین گردیدند (.)13 تعیین فعالیت آنتی اکسیدانی .فعالیت آنتی اکسیدانی بر طبق روش تیوسیانات تعیین گردید .به طور خالصه ،مخلوطی از 200میلی گرم بر لیتر عصاره چای ( 2میلی لیتر) در آب مقطر ،اسید لینولئیک %2/51در اتانول مطلق ( 2میلی لیتر) ،بافر فسفات 0/05موالر ( pHمساوی 4( )7میلی لیتر) ،و آب مقطر ( 2میلی لیتر) در ظرف شیشه ای دربداری به ابعاد 38در 75میلی متر ریخته و به دور از نور در آون 40°Cقرار داده شد .به 0/1میلی لیتر از این محلول 9/7 ،میلی لیتر اتانول %75و 0/1میلی لیتر کلرید فرو 0/02موالر در اسید کلریدریک %10اضافه شد. درست 3دقیقه بعد ،جذب نمونه پس از افزودن 0/1میلی لیتر تیوسیانات آمونیوم %30در طول موج 500نانومتر خوانده شد .اندازه گیریها هر 24ساعت یکبار تا زمان رسیدن جذب به حد اکثر میزان خود ادامه یافت .نمونه شاهد (آب مقطر) نیز در معرض مراحل مزبور قرار گرفت ( .)14اثر عصاره چای بر اکسایش سیستم لیپیدی بر اساس دو پارامتر سینتیکی فاکتور حمایتی ( )Fو نسبت سرعت اکسایشی ( )ORRتعیین گردید (نمودار .)15( )1 3 Tea extract Control F = IPinh/IP0 ORR = Winh/W0 Peroxide value PV )(meq/kg Slope = W0 Slope = Winh Time IP0 IPinh نمودار .1نمای ترسیمی منحنی سینتیکی تجمع پراکسیدها طی اکسایش سیستم لیپیدی و مقادیر سینتیکی مشتق شده از آن IPinh .و Winhدوره القا و سرعت آغازین اکسایش در حضور ترکیب آنتی اکسیدانی ،و P0 و W0دوره القا و سرعت آغازین اکسایش در حضور ترکیب آنتی اکسیدانی است. تجزیه و تحلیل آماری .تمام اندازه گیریها در سه تكرار انجام و نتایج در قالب طرح كامالً تصادفي تجزیه واریانس گردید .میانگین صفات با نرم افزار آماري MSTATCو بر اساس آزمون چند دامنه اي دانكن در سطح 5درصد مورد مقایسه قرار گرفت. نتایج و بحث بازده استخراج نمونه های مختلف چای در نمودار 2 نشان داده شده است همان طور که مشاهده می شود ،بازده عصاره های ناشی از روش آب داغ (به طور متوسط )%30/56 به طور معنی داری بیش از عصاره های متانولی (به طور متوسط )%14/53و این به نوبه خود بیش از عصاره های آگاروالی است (به طور متوسط .)%5/17این را می توان به میل ترکیبی متفاوت روشهای استخراج در خصوص اجزاء تشکیل دهنده برگ حسب شرایط مختلف استخراج نظیر قطبیت حالل ،دما و غیره نسبت داد ( .)16بازده هر سه روش استخراج با افزایش عمر برگهای چای به طور معنی داری کاهش پیدا کرد که این ممکن است ناشی از تغییرات 4 فیزیولوژیکی برگ و یا فرایند انتقال مواد در گیاه طی دوره رشد باشد ( .)17بر خالف روش آگاروال ،هر دو روش آب داغ و متانولی ،اختالف معنی داری بین بازده استخراج برگهای قدیمی چای و ضایعات چای سیاه به وجود آوردند. آگاروال -برگهای سبز چای d آگاروال -برگهای قدیمی چای f آگاروال -ضایعات چای سیاه f آب داغ -برگهای سبز چای a آب داغ -برگهای قدیمی چای c آب داغ -ضایعات چای سیاه b متانول -برگهای سبز چای c متانول -برگهای قدیمی چای d متانول -ضایعات چای سیاه e 40 35 30 25 20 15 10 5 0 بازده استخراج ()% نمودار .2بازده عصاره های مختلف چای .میانگینهای با حروف می یکسان فاقد هرگونه اختالف معنی داری در سطح 5درصد باشند. نتایج اثر روش استخراج و نوع ماده خام بر روند اکسایشی امولسیون اسید لینولئیک در دمای 40°Cدر جدول به استثنای عصاره آگاروالی حاصل از 1درج شده است. ضایعات چای سیاه ،دوره القای تمام عصاره های چای به طور معنی داری بیش از نمونه شاهد بود .در بین عصاره های چای ،عصاره استخراجی از برگهای سبز چای به روش آب داغ حائز بیشترین اثر معنی دار بود .بر خالف این حقیقت که روشهای آگاروالی و متانولی فراهم آورنده خلوص باالتری از کاتشینها هستند ،عصاره های حاصل از روش آب داغ دارای فاکتور حمایتی باالتری از دید آماری بودند. مانزوکو و همکاران ( )1998نشان دادند عملیات حرارتی سبب افزایش خصوصیات گیرندگی رادیکالی عصاره های چای می شود ( .)18می و همکاران ( )1990دریافتند هنگامی که 5 برگهای سیاه چای در معرض محیطهای آبی با دمای 120تا 210درجه سانتیگراد قرار گیرند ،عصاره هایی به وجود می آیند که حاوی مقادیر قابل مالحظه اسید گالیک می باشند .این عصاره ها دارای فعالیت آنتی اکسیدانی همسنگ یا بیش از آنتی اکسیدانهای سنتزی هستند (.)12 فاکتور حمایتی باالتر عصاره آگاروالی برگ سبز چای از عصاره متانولی آن را می توان به خلوص باالتر ترکیبات پلی فنلی در آن نسبت داد .جالب توجه است که اختالف معنی داری میان فاکتور حمایتی عصاره های حاصل از برگهای قدیمی چای و ضایعات چای سیاه در هر سه روش استخراج وجود نداشت. جدول .1پارامترهای سینتیکی مشخص کننده اثر روش استخراج و نوع ماده خام بر روند اکسایشی امولسیون اسید لینولئیک درPV0 = ( 40°C .)0 meq/kg, IP0 = 59.224 h, W0 = 0.006 meq/kg/h نوع روش استخراج و ماده خام آگاروال – برگ سبز چای آگاروال – برگ قدیمی چای ضایعات – آگاروال چای سیاه آب داغ – برگ سبز چای آب داغ – برگ قدیمی چای آب داغ – ضایعات چای سیاه متانول – برگ سبز چای متانول – برگ قدیمی چای متانول – ضایعات چای سیاه پارامتر سینتیکی )ORR (Winh/W0 )F (IPinh/IP0 3/883 c 2/524 e 2/290 e 18/620 a 14/350 b 12/940 b 3/245 d 2/576 e 2/697 e 0/556 cd 0/583 cd 0/694 d 0/003 a 0/005 a 0/014 a 0/589 cd 0/435 c 0/256 b میانگینهای با حروف مشترک در هر ستون فاقد هرگونه تفاوت معنی داری در سطح 5درصد می باشند. 6 نسبت سرعت اکسایشی عصاره های چای حاصل از روش آب داغ به عنوان معیاری از سرعت اکسایش طی دوره القا به .طرز معنی داری پایین تر از دو روش استخراج دیگر بود اختالف معنی داری میان نسبت سرعت اکسایشی تمام،همچنین جالب.عصاره های چای حاصل از روش آب داغ مشاهده نشد توجه است که عصاره متانولی ضایعات چای سیاه از این نظر حائز عملکرد بهتری نسبت به عصاره های متانولی .ناشی از برگهای سبز و نیز قدیمی چای بود نتایج این تحقیق نشان داد برگهای قدیمی،در مجموع ً به عنوان ضایعات چای و ضایعات چای سیاه را که غالبا کشاورزی محسوب می شوند می توان به عنوان منابع توانمند آنتی اکسیدانهای طبیعی مورد استفاده قرار .داد منابع (1) Pan, X., Niu, G., & Liu, H. (2003). Microwave-assisted extraction of tea polyphenols and tea caffeine from green tea leaves. Chemical Engineering and Processing, 42, 129-133. (2) Tanizawa, H., Toda, S., Sazuka, T., Taniyama, T., Hayashi, T., Arichi, S., & Takino, Y (1984). Natural Antioxidants. I. Antioxidative components of tea leaf (Thea sinensis L.). Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 32, 2011-2014. (3) Shahidi, F., & Wanasundara, P.D. (1992). Phenolic antioxidants. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 32, 67-103. (4) Wiseman, S.A., Balentine, D.A., & Frei, B. (1997). Antioxidants in tea. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 37, 705-718. (5) Tijburg, L.B.M., Mattern, T., Folts, J.D., Weisgerber, U.M., & Katan, M.B. (1997). Tea flavanoids and cardiovascular diseases: a review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 37, 771-785. (6) Chen, W.J., & Wan, S.Q. (1994). Research progress on polyphenols of tea. Natural Products Research and Developments, 6, 74-80. (7) Salah, N., Miller, N.J., Parganga, G., Tifburg, L., Bolwell, G.P., & ice-Evan, C. (1995). Polyphenolic flavonols as scavengers of aqueous phase radicals and as chain-breaking antioxidants. Archives of Biochemistry and Biophysics, 322, 339346. (8) Nwuha, V., Nakajima, M., Tong, J., & Ichikawa, S. (1999). Solubility study of green tea extracts in pure solvents and edible oils. Journal of Food Engineering, 40, 161-165. (9) Goto, T., Yoshida, Y., Amano, I., & Horie, H. (1996). Chemical composition of commercially available Japanese green tea. Foods Food Ingredients J. Jpn., 170, 46-51. (10) Zandi, P., & Gordon, M.H. (1999). Antioxidant activity of extracts from old tea leaves. Food Chemistry, 64, 285-288. 7 (11) Agarwal, R., Katiyar, S.K., Zaidi, A., & Mukntar, H. (1992). Inhibition of skin tumor promoter-caused induction of epidermal ornithine decarboxylase in SENCAR mice by polyphenolic fraction isolated from green tea and its individual epicatechin derivatives. Cancer Research, 52, 3582-3588. (12) Mai, J., Chamber, L.J., & McDonald, R.E. (1990). Process for inhibiting lipid oxidation in food and composition thereby. United State Patents No. 4, 925, 681. (13) Sakanaka, S., Tachibana, Y, & Okada, Y. (2005). Preparation and antioxidant properties of extracts of Japanese persimmon leaf tea (kakinoha-cha). Food Chemistry, 89, 569-575. (14) Xu, J., Yang, F., Chen, L., Hu, Y., & Hu, Q. (2003). Effect of selenium on increasing antioxidant activity of tea leaves harvested in early spring tea producing season. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51, 3379-3381. (15) Farhoosh, R. (2005). Antioxidant activity and mechanism of action of butein in linoleic acid. Food Chemistry (in press). (16) Moure, A., Cruz, J.M., Franco, D., Dominguez, J.M., Sineiro, J., Dominguez, H., Nunez, M.J., & Parajo, J.C. (2001). Natural antioxidants from residual sources-a review. Food Chemistry, 72, 145-171. (17) Taiz, L., & Zeiger, E. (2001). Plant Physiology. Sunderland: Sinauer Associates, Inc. (18) Manzocco, L., Anese, M, & Nicoli, M.C. (1998). Antioxidant properties of tea extracts as affected by processing. Lebensmittel-Wissenschaft Uun-Technologie, 31, 694-698. Antioxidant Activity of Tea Wastes (Camellia sinensis L.) Reza Farhoosh, Mohammad Hossein Haddad Khodaparast, Gholam Ali Golmovahhed Ferdowsi University of Mashhad, Faculty of Agriculture, Food Science and Technology Department, Mashhad, Iran. P.O. Box: 91775-1163, Tel: +98 511 8795618, Fax: +98 511 8787430 E-mail: rfarhoosh@um.ac.ir Abstract The antioxidant activity of various extracts of old tea leaves and black tea wastes in comparison with that of green tea leaves was evaluated. The highest extraction yield and 8 antioxidant activity were found in hot water extracts of green tea leaves. Hot water extracts of old tea leaves and black tea wastes showed the same statistically significant antioxidant activity (P<0.05). Also, there was not statistically significant difference between the antioxidant activity of the extracts of old tea leaves and black tea wastes in the other two extraction methods (Agarwal and methanolic methods), and even in some cases, the extracts of black tea wastes acted better than the extracts of old tea leaves. The extracts of black tea wastes had the antioxidant activity comparable with or even better than that of the extracts of old tea leaves. Hence, old tea leaves and black tea wastes, which are often considered as agricultural wastes, can be used as potent natural antioxidative sources. Key words: Antioxidant activity, tea wastes, old tea leaves, black tea wastes. 9