ДОСЛІДЖЕННЯ ВАРІАБЕЛЬНІСТІ ГЕНЕТИЧНИХ МАРКЕРІВ ВІРУСУ ПТАШИНОГО ГРИПУ А Н1N1 та Н7N9 НА ТЕРРИТОРІЇ УКРАЇНИ Буряченко С. В., Стегній Б. Т. ННЦ Інститут експерементальної та клінічної ветеринарної медицини, м. Харків, вул. Пушкінська 83 Метою роботи визначено аналіз епізоотичної ситуації вірусу грипу птиці в Україні, зумовленого субтипами Н1N1 та Н7N9, порівняльний аналіз різних методів діагностики пташиного грипу та їх придатність, дослідити варіабельність генетичних маркерів пташиного грипу. Завданням даного дослідження представити епізоотичну ситуацію по поширеності пташиного грипу в Україні та світі; проаналізувати різні методи діагностики вірусу пташиного грипу в порівнянні; проаналізувати варіабельність генетичних маркерів пташиного грипу. Вказано, що природним резервуаром вірусу і причиною розповсюдження епізоотії є мігруючі водоплавні птахи, що завдяки своїй природній резистентності вони найменш сприятливі до інфекції і в процесі міграції можуть подолати великі відстані. До ураження пташиним грипом сприятливі не тільки птахи, але й інші дикі та свійські тварини. Зазначено, що в Україні діагностика грипу птиці проводиться комплексно з урахуванням епізоотологічних даних, клінічних, патологоанатомічних змін та лабораторних досліджень. Розглянуто простий молекулярний метод та realtime reverse transcriptase PCR (RRT-PCR) аналіз і представлено їхні недоліки, а саме значна тривалість проведення досліджень, відсутність можливості диференціації вірусу від інших близькоспоріднених видів та використання великої кількості патологічного матеріалу. Результати досліджень діагностичного матеріалу за допомогою жодної молекулярно-генетичної методики чи протоколу детекції збудника того чи іншого захворювання не можна вважати вірогідними, якщо немає прямих доказів специфічності реакції. Виникає необхідність швидкого одержання результатів дослідження. Велике практичне значення має метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). В зв’язку з використанням дорогого обладнання та реактивів для проведення ПЛР аналізу не всім лабораторіям є економічно досяжним. Ключові слова: високопатогенний грип птиці, лабораторна діагностика, молекулярно-генетичні тест-системи, полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), молекулярне клонування, генотипова варіабельність, філогенетичний аналіз. RESEARCH OF VARIATION OF THE GENETIC MARKERS OF ANTIPATHOGENIC ARRIVAL VIRUS OF A H1N1 AND H7N9 ON THE TERRITORY OF UKRAINE The objective of this research paperistheanalysisoftheepizooticsituationoftheavianinfluenzavirusinUkraine, causedbythesubtypes H1N1 and H7N9, a comparative analysis of different methods of diagnosing avian influenza and theirsuitability, andtoinvestigatethevariabilityofthegeneticmarkersofavianinfluenza. Thisstudyaimsatpresentinganepizooticsituationregardingthespreadofavianinfluenza inUkraineandintheworld; analyzingdifferentmethodsofdiagnosingavianinfluenzavirusincomparison; analyzingthevariabilityofthegeneticmarkersofavianinfluenza.Itisnotedthatthenatural reservoirofthevirusandthecauseofthespreadofepizooticsaremigratorywaterfowlbirds , which,duetotheirnaturalresistance,areleastsusceptibletoinfectionandcanovercomelo ngdistancesintheprocessofmigration. Avianinfluenzacanaffectnotonlybirds, butalsootherwildanddomesticanimals. ItisnotedthatinUkraine, theavianinfluenzaisdiagnosedin a combinedway, takingintoaccountepizooticdata, clinical, pathoanatomicalchangesandlaboratorytests. A simplemolecularmethodand a real-timereversetranscriptase andtheirdrawbacksarepresented, PCR (RRT-PCR) analysisareconsidered, namelytheconsiderabledurationofresearch, thelackofdifferentiationofthevirusfromothercloselyrelatedtypesandtheuseof a largevolumeofpathologicalmaterial. Theresultsofexaminationsofthediagnosticmaterialusinganymoleculargeneticmethod orprotocolforthedetectionof a pathogenof a particulardiseasecannotbeconsideredsignificantunlessthereisdirectevidenceofspecifi cityofthereaction. Thereis a needfor Themethodofpolymerasechainreaction a quickobtainingoftheresearchresults. (PCR) Duetotheuseofexpensiveequipmentandreagentsfor isofgreatpracticalimportance. PCR analysis, notalllaboratoriescanaffordit. Keywords:highpathogenicavianinfluenza, laboratorydiagnosing, moleculargenetictestsystems, polymerasechainreaction (PCR), molecularcloning, genotypevariability, phylogeneticanalysis. Актуальність. Пташиний грип (Avian influenza) – висококонтагіозне вірусне захворювання, яке характеризується високою смертністю (до 100 %) птиці. Етіологічний агент, що викликає дане захворювання – РНК-вмісний вірус. Він є переважно сферичної форми, вібріони діаметром 80-120 нм, поліморфні. Вірус відноситься до типу А(Influenza A virus) і має 16 підтипів за гемаглютинінами та 9 підтипів – за нейрамінідазою. Для птиці найбільш патогенними є підтипи Н1 та Н7 [1,2,3]. Природним резервуаром вірусу і причиною розповсюдження епізоотії є мігруючі водоплавні птахи. Завдяки своїй природній резистентності вони найменш сприятливі до інфекції і в процесі міграції можуть подолати великі відстані. До ураження пташиним грипом сприятливі не тільки птахи, але й інші дикі та свійські тварини. Аналіз досліджень та публікацій. Проблеми варіабельності генетичних маркерів вірусів пташиного групу Н1N1 та Н7N9 розглядали в своїх дослідженнях В. І. Болотін, А. П. Геріловіч, В. О. Загребельний, А. О. Меженський, В. О. Постоенко, В. А. Прискока, М. А. Сапачова, С. І. Симоненко, Б. В. Сорочинский, Б. Т. Стегній та інші. Значну увагу даному питанню приділяють вчені інших країн, особливо уваги заслуговують такі вчені: Сідоті Ф, Ріццо Ф, Коста К., Шивакоті С., Іто Х., Мурасе Т., Оно Е., Такакава Н., Ямашіро Т., Оцукі О. та ін. Проаналізувавши результати багатьох лабораторій світу, однією з яких є GD AnimalHealth, прийшли до висновку проводити моніторинг усіх штамів вірусу грипу А. В Україні використовують тест-систему InfluenzaAVirusAntibodyTestKit (IDEXXInfluenza A), за допомогою якої знаходять антитіла до усіх штамів вірусу грипу А. Лабораторія серології «ЦВД» цією тест-системою користується з 2005 року, щo у міжнародних порівняльних дослідженнях підтверджує достовірність отриманих результатів [11]. Останнім часом знову постає проблема пташиного грипу в Україні, для запобігання нищівних наслідків інфекції за найменшої підозри варто проводити діагностичний моніторинг. Мета статті: аналіз епізоотичної ситуації вірусу грипу птиці в Україні, зумовленого субтипами Н1N1 та Н7N9, порівняльний аналіз різних методів діагностики пташиного грипу та їх придатність, дослідити варіабельність генетичних маркерів пташиного грипу. Завдання: визначити епізоотичну ситуацію по поширеності пташиного грипу в Україні та світі; проаналізувати різні методи діагностики вірусу пташиного грипу в порівнянні; аналізувати варіабельність генетичних маркерів пташиного грипу. Виклад основного матеріалу. Вірус грипу А класифікують на підставі їх поверхневих протеїнів, а саме гемаглютеніна (H), нейрамінідази (N) тануклеопротеїда (NP). На теперішній час визначено 16 Н (H1–H16) та 9 N (N1–N9) субтипів вірусу. Згідно досліджень багатьох науковців субтипу Н1 та Н7 вірусу грипу А є найбільш патогенними і призводять до летальних випадків серед птиці та людей. Також на думку багатьох дослідників вірус грипу А є вкрай мінливим, характеризується великим рівнем мутації. Навіть низькопатогенні субтипи завдяки варіабельності викликають падіж серед птиці. Зараження відбувається респіраторним, респіраторно-фекальним або через шлунково-кишківниковий тракт. Хвороба протікає без симптомів, але може викликати захворювання дихальної системи, а в гострій формі – летальний результат. Завдяки своїй швидкій розповсюдженості пташиний грип нотифікується та моніториться Міжнародним епізоотичним бюро. Навіть в благополучних європейських країнах існує державна програма моніторингу усіх стад на циркуляцію вірусу грипу А, що проводиться мінімум 1 раз на рік. У Гонконгу в 1997 році було вперше зареєстровано «пташиний грип» у людини. Інфікування людей співпало з епідемією високопатогенного штаму вірусу H1N1, субтип викликав важке захворювання дихальних шляхів у 18 осіб, з яких 6 померло. Під час лабораторних досліджень було підтверджено, що хвороба викликана тим же самим штамом, що й серед популяції свійських птахів та хворі контактували з інфікованою домашньою птицею. Провівши моніторинг країн східної та західної Європи, а саме: Румунії, Польщі, Угорщини, Болгарії, Нідерландів, Швейцарії, Австрії, Німеччини, відмічені спалахи «пташиного грипу» серед диких та перелітних птахів у 2016 році. Цього ж року в Україні випадки пташиного грипу були зареєстровані в Херсонській області (Кіцманському районі) та Чернівецької області (рис.1) [12]. В Україні діагностика грипу птиці проводиться комплексно з урахуванням епізоотологічних даних, клінічних, патологоанатомічних змін та лабораторних досліджень. Грип необхідно диференціювати від інших захворювань птиці таких, як ларинготрахеїт, хвороба Ньюкасла, пастерельоз та респіраторні захворювання [4, 6]. Саме тому, до методу діагностики вірусу грипу птиці (ВГП) висувається ряд вимог за показниками специфічності, чутливості, відтворюваності та тривалості проведення аналізу [4]. Рис. 1.Схема основних перелітних шляхів осінньої міграції птиці на Україні *джерело [25] При лабораторній діагностиці особливе місце займає високочутливий метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Цей метод базується на ампліфікації специфічних ділянок геному певного типу збудника. Висока чутливість, специфічність та короткий час проведення аналізу роблять його перспективним при діагностиці ВГП. Але, на жаль, проведення ПЛР аналізу вимагає використання коштовного обладнання та реактивів і тому не завжди є доступним для лабораторій, що мають ресурсні обмеження [7, 8]. Тому важливим є розробка простих і чутливих експрес-методів діагностики пташиного грипу, адаптованих до місцевих умов. Одним із таких є новий підхід, який заснований на ізотермічній ампліфікації нуклеїнових кислот (LAMP). У комбінації зі зворотною транскрипцією, LAMP придатний для ампліфікації РНК – матриці (RT – LAMP). Дослідниками раніше підібрано реакційну суміш та оптимізовано умови проведення реакції RT – LAMP для діагностики пташиного грипу субтипу Н1N1 [5, 9,10]. При визначенні антитіл до вірусу пташиного грипу за спалаху ендемії 1997 року стандартний для серологічного виявлення інфекції грипу у людини аналіз інгібування гемаглютинації показав низьку чутливість. Тому був запропонований більш чутливий метод мікронейтралізації і Н1 специфічний непрямий ELISA (імуноферментний аналіз) для визначення антитіл до вірусу пташиного грипу у людини. Чутливість і специфічність значно збільшувалася при поєднанні цих методів з Вестерн-блот. При визначенні антигенів Н1 антитіл у дорослих у віці від 18 до 59 років максимальна чутливість (80%) і специфічність (96%) досягалася при застосуванні мікронейтралізації в поєднанні з Вестерн-блот. Максимальна чутливість (100%) і специфічність (100%) при застосуванні ELISA в поєднанні з Вестерн-блот за визначення антигенів Н1 антитіл у сироватці дітей молодше 15 років досягалася. Алгоритм такого поєднання може використовуватися при проведенні сероепідеміологічних досліджень спалахів грипу штаму H1N1 [13]. Було також показано, що високопатогенні нейротропні варіанти вірусу пташиного грипу H1N1 можуть бути швидко виділені на мишах [14]. Крім того, ще в 1995 році для швидкого визначення послідовності сайту розщеплення гемаглютиніну, маркера потенціалу вірулентності вірусів пташиного грипу, була використана RT-PCR (полімеразна ланцюгова реакція). Ця методика в поєднанні з секвенуванням сайту розщеплення гемаглютиніну може служити в якості швидкого та чутливого методу оцінки потенційної вірулентності вірусів пташиного грипу. Раннє виявлення пов'язаних з вірулентністю послідовностей на сайті розщеплення гемаглютиніну в польових ізолятах вірусу допоможе краще контролювати грип серед величезної популяції домашньої птиці [15]. З часом науковцями був розроблений простий молекулярний метод швидкого генотипування для моніторингу внутрішніх генів циркулюючого вірусу грипу А. Ними стратегію субтипування вірусу було протестовано наосліп на 10 контрольних вірусах кожного субтипу H1N1, H3N2 і H5N1 (всього на 30) і виявлено високу ефективність. Надалі було розроблено стандартизований метод генотипування і використовувався для ідентифікації джерела внутрішніх генів 51 вірусу грипу А, виділеного від людей у Гонконгу в ході спалахів 1997-1998 років і одразу після них. Також ця методика використовувалася для характеристики внутрішніх генів двох ізолятів вірусу H9N2 пташиного грипу, отриманих в Гонконзі в 1999 році[16]. Пізніше для швидкого визначення вірусу грипу А і субтипів Н1 і Н7 вірусу грипу А був розроблений real-time reverse transcriptase PCR (RRT-PCR) аналіз. Суть цього методу полягає в використанні одностадійного способу визначення і флуоресцентних зондів. Межа визначення – близько 1000 копій мішені-РНК. За допомогою цього методу можна визначити 0,1 50%інфекційнудозу для курячих ембріонів. Для аналізу субтипів вірусу грипу А межа визначення – 103-104 копії мішені-РНК. Чутливість і специфічність даного методу безпосередньо порівнювалася із стандартними методиками для визначення вірусу грипу: виділення грипу на курячих ембріонах і субтипування гемаглютиніну в реакції інгібування гемаглютинації. Порівняння проводились на 1550 трахеї та клоачних мазках від різних видів птахів і мазків, узятих з навколишнього середовища на ринках живої птиці в Нью-Йорку і Нью-Джерсі. Результати RRT-PCR корелювали з результатами виділення грипу на курячих ембріонах у 89% зразків. Інші зразки були позитивними при визначенні тільки одним з методів. У цілому чутливість та специфічність Н7 і Н1 специфічних аналізів була схожа з методом виділення вірусу на курячих ембріонах і реакції інгібування гемаглютинації [17]. Загальними недоліками методів, що розглядалися вище, є значна тривалість проведення досліджень, відсутність можливості диференціації вірусу від інших близькоспоріднених видів та використання великої кількості патологічного матеріалу. Результати досліджень діагностичного матеріалу за допомогою жодної молекулярно-генетичної методики чи протоколу детекції збудника того чи іншого захворювання не можна вважати вірогідними, якщо немає прямих доказів специфічності реакції. Критерієм її у кожній окремо взятій постановці слугують контролі реакції. Негативний контроль доводить дослідникові факт специфічності отриманих результатів та відсутності контамінації застосованих компонентів реакційної суміші. Позитивний контроль реакції забезпечує доказову базу щодо активності компонентів реакційної суміші [18]. Питання створення та застосування позитивного контролю реакції при дослідженні матеріалів на інфекції, зумовлені РНК-вміщуючими вірусами, стоїть гостро, оскільки РНК-матриці є доволі нестабільними структурами. Вони піддаються швидкому руйнуванню при заморожуванні та під впливом ендогенних ферментів. Для забезпечення стабільності контрольних позитивних зразків учені всього світу вже давно користуються клонованими ДНК-копіями РНК-матрицями [19]. Якщо проаналізувати випадки виникнення захворювання свійської птиці на грип, які спостерігались на території України впродовж останніх років, то можна зазначити, що на долю підтипу Н7 припадає 2% від усіх зареєстрованих спалахів. Було зареєстровано випадки виявлення РНК збудника високопатогенного грипу птиці субтипу Н7. Зразки були виділені з клінічного матеріалу від гусей одного з птахогосподарств Сумської області. Збудник був ідентифікований як вірус грипу А штаму InfluenzaAvirus/goose/Ukraine/2006/H7N7 [20]. На цьому етапі роботи дослідниками був проведений генетичний аналіз вірусів грипу А субтипу Н7 з колекції ННЦ «ІЕКВМ». Причиною для проведення цієї роботи стала розрізненість інформаційних ресурсів щодо дослідження філогенетичних профілів вірусів грипу А субтипу Н7 у світі. Було проведене множинне вирівнювання 307 послідовностей фрагментів гена гемаглютиніну вірусу грипу А субтипу Н7, ізольованого від птиці у країнах американського та євроазіатського континентів, яке показало наявність двох ендемічних гілок вірусів, які мали дивергенцію до 22 % між собою. Гілка 1 була представлена американськими штамами вірусу грипу переважно субтипу H7N2 та деякими субтипами H7N3. Дивергенція в середині кладу складала до чотирьох відсотків. Американська геногрупа була представлена шістьма підгрупами (1а–1е) з різницею нуклеотидних послідовностей від 0,1 до 2,5% та зовнішньою дивергенцією від 1 до 4%. Клад вірусу грипу А європейського генотипу був представлений п’ятьма генетичними підгрупами (2а-2д), кожна з яких вміщувала від чотирьох до 50 ізолятів. Більшість європейських ізолятів була виділена від дикої водоплавної птиці та індичок. Дивергенція між групами кладу склала до 6 %, а дивергенція в середині груп – до 5 %. Найбільшу нуклеотидну поліморфність продемонструвала група вірусів позначена як 2в. Вона була представлена чотирма високопатогенними штамами, ізольованими від різних видів птиці (качка, лебідь, індичка та курча) в Європі та Америці. Цю групу можна розцінювати як переміжну ланку в еволюції відокремлених ендемічних популяцій вірусу. Дивергенція у ній склала понад 5 %, що свідчить про високий мутаційний фон в аналізованого кластера вірусів [18, 21]. Після визначення топографічних особливостей дендрограми, яка відображала зв’язки вірусу грипу А субтипу Н7, було встановлено, що збудник американського генотипу не змішувався з популяцією європейських вірусів філогенетично. Тому при аналізі секвенованих послідовностей ізолятів InfluenzaAvirus/ch/Italy/2001/02/H7N1 (IZPVe) таInfluenzaAvirus/goose/Ukraine/2006/H7N7 вчені досліджували їх лише у порівнянні до кДНК вірусів європейського генотипу[21]. Проведене клонування та секвенування фрагментів гена гемаглютиніну українських ізолятів показало, що вірус українського походження найбільш подібний до італійського вірусу, виділеного від страусів у 2001 році (рис. 2). Дивергенція між ізолятами складала 0,5 %. У кладу вірусів з послідовностями плазмідного контрольного зразка pBlunt_AIVH7 були присутні віруси італійського та китайського походження з дивергенцією не більше 2 %, всі ізоляти характеризувались хазяїноспецифічністю по відношенню до диких водоплавних. Отримані на підставі аналізу консервативних ділянок дані дозволили розрахувати праймери АіvН7 (Аm) до американського генотипу та АіvН7 (Eu) до європейського генотипу вірусу грипу А субтипу H7, які мають температуру плавлення 57°С та 54°С відповідно. Фланковані ними фрагменти олігонуклеотидів мають довжину 284 п.н. та 641п.н. і демонструють високу внутрішньовидову специфічність по відношенню до перехресних генотипів вірусу грипу А інших субтипів, до інших вірусів птиці та геномної ДНК курки й інших видів птиці. Використання праймерів Aiv H7 (Eu) до вірусу європейського генотипу і Аіv Н7 (Аm) – американського генотипу за оптимізованих параметрів реакції забезпечує утворення специфічних ампліконів довжиною 641п.н. (європейський генотип) та 284п.н. (американський генотип) та детекцію вірусу в пробах з активністю до 0,2–0,4lg/см3 за РГА, що задовольняє діагностичним потребам. Створена на підставі теоретичного аналізу гена гемаглютиніну вірусу грипу А субтипу Н7 модель рекомбінантної плазміди, що складається з pCRBlunt відкритого вектора, вставки ділянки гена НА європейського генотипу, довжиною 641п.н., може застосовуватися як позитивний контрольний зразок при діагностиці грипу птиці (тип А, субтипу Н7). Отриманий за допомогою трансформації вектором pCR-Blunt стабільний клон №3 інтродукує фрагмент гена НА вірусу грипу субтипу Н7 європейського генотипу [17, 21, 22]. lcl|DQ991304 Inf luenza A virus (A /ost... lcl|DQ991312 Inf luenza A virus (A /ost... lcl|CY 024898 Inf luenza A virus (A /pek... lcl|DQ991343 Inf luenza A virus (A /ost... lcl|DQ991328 Inf luenza A virus (A /chi... lcl|CY 025125 Inf luenza A virus (A /chi... lcl|CY 022653 Inf luenza A virus (A /chi... lcl|CY 020685 Inf luenza A virus (A /ost... lcl|A J493217 Inf luenza A virus (A /Tur... lcl|A J493214 Inf luenza A virus (A /Chi... lcl|A F364171 Inf luenza A virus (A /tur... lcl|A F364163 Inf luenza A virus (A /tur... lcl|A F364168 Inf luenza A virus (A /tur... lcl|A J489520 Inf luenza A virus (A /tur... lcl|A J493213 Inf luenza A virus (A /Tur... lcl|A J493216 Inf luenza A virus (A /Tur... lcl|A J704810 Inf luenza A virus (A /chi... lcl|CY 021557 Inf luenza A virus (A /duc... lcl|CY 022669 Inf luenza A virus (A /qua... lcl|CY 024858 Inf luenza A virus (A /tur... lcl|DQ991320 Inf luenza A virus (A /chi... Inf luenza A virus/goose/Ukraine/2006/H7N lcl|CY 015014 Inf luenza A virus (A /chi... lcl|A F364169 Inf luenza A virus (A /tur... lcl|CY 021533 Inf luenza A virus (A /tur... lcl|A F202255 Inf luenza A virus (A /chi... lcl|A F364135 Inf luenza A virus (A /tur... lcl|A F364146 Inf luenza A virus (A /tur... lcl|CY 006037 Inf luenza A virus (A /tur... lcl|CY 021421 Inf luenza A virus (A /tur... lcl|CY 021549 Inf luenza A virus (A /chi... lcl|CY 021541 Inf luenza A virus (A /tur... lcl|A F364158 Inf luenza A virus (A /tur... lcl|CY 025165 Inf luenza A virus (A /tur... lcl|A B268557 Inf luenza A virus (A /duc... lcl|CY 043840 Inf luenza A virus (A /mal... lcl|EU158105 Inf luenza A virus (A /mal... Inf luenza A virus/ch/Italy/2001/02/H7N1 lcl|A B269694 Inf luenza A virus (A /duc... lcl|A B473543 Inf luenza A virus (A /duc... lcl|CY 005983 Inf luenza A virus (A /mal... Рис. 2. Філогенетичні зв’язки між вірусами європейського генотипу (▲– українські ізоляти). *джерело [8;10] Швидкість еволюції вірусу пташиного грипу в природних господарів (водоплавні птахи, сивки і чайки) та аберантних господарів (кури, індички, поросята, коні і люди) різниться. Швидкість еволюції, визначена для всіх трьох спалахів, була подібною зі швидкістю, що спостерігається у ссавців, що є вагомим доказом адаптації вірусу пташиного грипу до нових видів господарів [23]. На сьогодні, мабуть, пташиний грип не передається від людини до людини, проте через епідемію серед свійської птиці така передача стає все більш вірогідною. Необхідна лише правильна рекомбінація між штамами H1N1 або H7N9 і існуючим штамами грипу людини. Це може трапитися за умови, якщо тварина чи людина захворіє специфічним своєму виду штамом грипу А і пташиним грипом одночасно, що дозволить вірусам обмінятися генами і утворити новий штам, який зможе легко передаватися від біологічного об’єкту певного виду до іншого об’єкту його виду. До цих пір немає доказів, що це відбулося, оскільки у всіх відомих випадках хвороби інфікування відбувалося при прямому контакті з курми [24]. Висновок. Описано, що вірус пташиного групу є небезпечним та розповсюдженим у світі захворюванням. Це вимагає проведення постійного моніторингу спалахів інфекції і своєчасної її діагностики. Важливе місце в діагностиці пташиного грипу займає експрес-діагностика. Виникає необхідність швидкого одержання результатів дослідження. Велике практичне значення має метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). В зв’язку з використанням дорогого обладнання та реактивів для проведення ПЛР аналізу не всім лабораторіям є економічно досяжним. Отже, важливим є розробка простих і чутливих експрес-методів діагностики пташиного грипу, адаптованих до місцевих умов. Перспективним є удосконалення, розробка та впровадження в виробництво України експрес-методу діагностики, заснованого на ізотермічній ампліфікації нуклеїнових кислот субтипів вірусу Н1N1 та Н7N9. СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ 1. Діагностика інфекційних захворювань тварин: теорія и практика/ В. А. Прискока, В. О. Загребельний, А. О. Меженський и др. – К., ДНДІЛДВСЕ, 2014. – 454 с. 2. Особоопасные болезни животных. Справочное пособие / И.А. Бакулов, В.М. Котляров, А.С. Донченко, И.Ю. Хухоров, С. Ф.Терновая, А.В. Книзе. – Покров – Новосибирск, 2002.-184 с. 3. Avian Infl uenzain Italy 1997-2001 / I. Capua, S. Marangon, M. dallaPozza [ etal.] // AvianDis. – 2003. – Vol. 47. – P. 839-843. 4. Микробиологические и вирусологические методы исследований в ветеринарной медицине. Справочное пособие / А.Н. Головко, В.А. Ушкалов, В.Г. Скрыпник, Б.Т. Стегний и др; Под ред. А.Н. Головко. –Х.: «НТМТ», 2007.512 с. 5. Постоенко В. О. Оптимізація умов проведення ізотермічної ампліфікації нуклеїнових кислот вірусу пташиного грипу Н5N1 /Постоенко В. О., Сорочинский Б. В., Сапачова М. А. //Наукове видання. Науково-технічний бюлетень. – Львів, 2013. – Вип. 14. – С. 325-330. 6. Практикум по ветеринарной вирусологии. / Белоусова Р. В., Троценко Н. И., Преображенская Э. А. – М.: Колос, 2006.– 248 с. Avian Infl uenzain Italy 1997-2001 / I. Capua, S. Marangon, M. dallaPozza [ etal.] // AvianDis. – 2003. – Vol. 47. – P. 839-843. 7. Francesca Sidoti,Development of a Real – Time Reverse Transcriptase PCR Assay for Type A Infl uenza Virus and Avian H5 and H7. 8. Hemagglutinin Subtypes. / Francesca Sidoti, Francesca Rizzo, Cristina Costa and all // Mol.Biotechnol. – 2010. Vol 44:41 – 50, P.41 – 50.Highly pathogenic avian infl uenza //Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines / O. I.E. – 2009. 9. J. Ji Molecular detection of Muscovy duck parvovirus byloop – mediate diso thermal amplifi cation assay. / J. Ji, Q. M. Xie, C. Y. Chenandall // Pultru Science. – 2010. – Vol 89: 477, P. 477 – 483. 10. Shivakoti S., Ito H., Murase T., Ono E., Takakuwa Н., Yamashiro T., Otsuki О. Development of reverse transcription – loop – mediatedisothermal amplifi cation (RT – LAMP) assay for detection of avian infl uenza viruses in fi eld specimens // J. Vet. Med. Sci. – 2010. – Vol. 72. – P. 519 – 523. 11. https://www.researchgate.net/publication/321431202_Comparison_of _influenza_A_virus_inhibition_in_vitro. 12. http://docplayer.ru/55287268-Rossiyskiy-universitet-druzhby-narodov –akanina-darya-sergeevna-razrabotka-sredstv- diagnostiki- vysokovirulentnogo – shtamma-virusa-grippa-a-podtipa-n5n1.html. 13. Elena A. Govorkova, Irina A. Leneva, Olga G. Goloubeva, Karen Bush, and Robert G. Webster, Comparison of Efficacies of RWJ-270201, Zanamivir, and Oseltamivir against H5N1, H9N2, and Other Avian Influenza Viruses, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Oct. 2001, p. 2723-2732 Vol. 45, No. 10. 14. Influenza Epidemic of 1918 Linked With Avian Virus GG Brownlee and E. Fodor, The divdicted antigenicity of the haemagglutinin of the 1918 Spanish influenza pandemic suggests an avian origin, Phil.Trans. R. Soc. Lond. B (2001) 356, 1871-1876. 15. Ryan-Poirier KA, Kawaoka Y. Distinct glycoprotein inhibitors of influenza A virus in different animal sera, J. Virol., 1991, vol.65, 389-395. 16. Toshihiro Ito, J. Nelson SS Couceiro, Sorge Kelm, Linda G. Baum, Scott Krauss, Maria R. Castrucci, Isabella Donatelli, Hiroshi Kida, James C. Paulson, Robert G. Webster, and Yoshihiro Kawaoka, Molecular Basis for the Generation in Pigs of Influenza A Viruses with Pandemic Potential, Journal of Virology, Sept. 1998, Vol. 72, No. 9, p. 7367-7373. 17. 50KS Li, KM Xu, JSM Peiris, LLM Poon, KZ Yu, KY Yuen, KF Shortridge, RG Webster, and Y. Guan, Characterization of H9 Subtype Influenza Viruses from the Ducks of Southern China: a Candidate for the Next Influenza Pandemic in Humans?, Journal of Virology, June 2003, Vol. 77, No. 12, p. 69886994. 18. Герилович А. П. Создание средств индикации высокопатогенного гриппа и ньюкаслской болезни, а также идентификации изолятов N1-, Н5- и Н7-субтипов /А. П. Герилович, Б. Т. Стегний, С. И. Симоненко // V междунар. вет. конгр. по птицеводству: материалы С.91–95. 19. Симоненко С. И. Разработка методики выявления РНК высокопатогенного гриппа птиц субтипа Н7 американского генотипа при помощи полимеразной цепной реакции и исследование внутривидовой специфичности /С. И. Симоненко, Б. Т. Стегний, А. П. Герилович // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: материалы науч.-практ. конф. — Щелково, 2009. — С. 319–323. 20. Gerilovych A. P. Development of avian influenza virus detection protocol for RNA European of type H7 / A. P. Gerilovych, B. T. Stegniy, S. I. Symonenko // XVIth World Veterinary Poultry Association Congress : Book of abstracts. — Marrakesh, Morocco, 2009. — P1–A1. 21. Герілович А. П. Розробка позитивного контрольного зразка гена гемаглютиніну вірусу грипу птиці субтипу Н7 європейського генотипу на основі рекомбінантних ДНК / А. П. Герілович, С. І. Симоненко, В. І. Болотін, О. С. Солодянкін // Ветеринарна медицина: міжвід. темат. наук. зб. — Х., 2009. — Вип. 92. — С. 113–119. 22. Симоненко С. И. Разработка методики выявления РНК высокопатогенного гриппа птиц субтипа Н7 американского генотипа при помощи полимеразной цепной реакции и исследование внутривидовой специфичности / С. И. Симоненко, Б. Т. Стегний, А. П. Герилович // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: материалы науч.-практ. конф. — Щелково, 2009. — С. 319–323. 23. Michael L. Perdue, David L. Suarez, Structural features of the avian influenza virus hemagglutinin that influence virulence, Veterinary Microbiology 74 (2000) 77-86. 24. Mikhail Matrosovich, Nannan Zhou, Yoshihiro Kawaoka, and Robert Webster, The Surface Glycoproteins of H5 Influenza Viruses Isolated from Humans, Chickens, and Wild Aquatic Birds Have Distinguishable Properties, Journal of Virology, Feb. 1999, Vol. 73, No. 2, p. 1146-1155. 25. Високопатогений грипп птиці (ВПГП) Електронний ресурс/ Режим доступу: http://www.gudpss.zp.ua/working_25.html
