Framst¨allning av M1-protein med hj¨alp av E. coli-bakterier
Serhat Aktay
SerhatAktay@gmail.com
Sebastian Valenzuela
Sebastian.Valenzuela@live.se
Forskningsmentor
Robert Daniels, Forskarassistent
Institutionen f¨or Biokemi och Biofysik
Stockholms Universitet
Research Academy for Young Scientists
6 juli 2011
Abstract
The M1 protein in the influenza virus is thought to have a major part in the forming
and spreading of the virus which would make it a suitable target for antiviral drugs. The
method used in order to produce the M1 protein using E. coli-bacteria was a standard
procedure for cloning, transforming and inducing protein expression. The method used
proved to be highly effective since we were able to show that the use of IPTG induced the
expression of the M1 protein in E. coli. In order to make sure that the desired outcome
was achieved, the use of electrophoresis gels were applied. The main issue is the limited
amount of knowledge there is about the M1 protein. With a reliable method of producing
the protein, more time and resources can be spent on researching new and more effective
antivirals.
Introduktion
sistans mot dessa mediciner vilket belyser faktumet
att nya metoder f¨or att stoppa virus m˚
aste utveck-
Varje ˚
ar d¨
or mellan 250.000 och 500.000 i spora- las.1
diska fall av influensan,12 men vid flera tillf¨allen i
Fr˚
agest¨allningen som unders¨oks i denna raphistorien har ¨
aven vissa stammar orsakat pande- port, huruvida framst¨allningen av M1-protein ur
mier.1 1918 h¨
arjade spanska influensan som d¨oda- E. coli-bakterier ¨ar m¨ojlig, ¨ar en del av vad som en
de omkring 50 miljoner m¨
anniskor.2 Detta motsva- dag kan leda till nya mediciner mot influensavirus.
rade >2.5% av v¨
arldens befolkning j¨
amf¨ort med F¨or att kunna forska p˚
a M1 beh¨ovs en effektiv och
andra pandemier som oftast ligger <0.1% av be- p˚
alitlig process f¨or framst¨allningen av proteinet f¨
or
2
folkningen. Idag skulle >2.5% motsvara ungef¨ar att korrekt och anv¨andbar forskning ska kunna g¨
o175 miljoner m¨
anniskor.3
ras inom ¨amnet.
Influensan ¨
ar ett h¨
oljevirus med transmembrana glykoprotein som g¨
or att viruset kan f¨
asta och ta
Material och metod
sig loss fr˚
an v¨
ardceller.6 Ett glykoprotein, hemagg-
lutinin (HA), binder till sialinsyra, som finns p˚
a Experimentet inleddes med att agarplattor med
v¨
ardcellernas membran, och hj¨
alper till med att olika antibiotika, Ampicillin, Tetracyklin och Chlosl¨
appa ut virusets genetiska information i v¨ardcel- ramphenicol, f¨orbereddes. Fyra sorters modifierade
len.1 Neuraminidas (NA), det andra glykoprotei- stammar av arten E. coli anv¨andes. Dessa var XLG,
net, har en enzymatisk funktion att klyva bind- Rosetta 2, samt XLG med plasmiderna pET21d
ningar mellan HA och v¨
ardcellen i ett sent skede respektive pHW187. XLG och Rosetta 2 gjordes
4
av replikationen. Tidigare rapporter visar att M1- kompetenta och frystes sedan ned. Stammarna med
proteinet sitter mellan virusets lipidh¨
olje och ytt- plasmiderna, pET21d och pHW187, inkuberades
7
re membran och att M1 ger virus partiklarna sin tills de befann sig i en logaritmisk tillv¨axtfas. Sedan
struktur.6
centrifugerades 6ml av l¨osningarna, supernatan-
De fr¨
amsta f¨
orsvaren mot influensan idag ¨ar terna avl¨agnades och pelleterna resuspenderades i
vaccin i form av d¨
oda eller f¨
orsvagade virus och 600 µL vatten. D¨arefter extraherades plasmiderna
TM
mediciner som riktar in sig p˚
a M2 proteinet eller med PureYield
NA.1 Studier har visat att flera virus utvecklat re-
Plasmid Miniprep System.8
F¨or att amplifiera pET21d k¨ordes en PCR
2
med forwardprimers (5’ CTCGAGCACCACCAC- agarose-gel. Dessa transformerades in i XLGCAC 3’) och reverseprimers (5’ CATGGTA- celler, vilka sedan inkuberades p˚
a selektiva plattor.
¨
TATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC 3’). Aven
ge- Koloni-PCR och en ny 1% agarose-gel utf¨ordes som
nen M1 i pHW187d kopierades med forward kontroll. De nya plasmiderna extraherades och f¨
or
primers (5’ CTTTAAGAAGGAGATATACCAT- att kontrollera att M1-genen, med och utan his-tag,
GAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAAC 3’) och ligerats in i vektorn r¨att testades dessa p˚
a en 1%
reverse primers (5’ GGTGGTGGTGGTGCTC-
agarose-gel. De klipptes med restriktionsenzymet
GAGTCACTTGAATCGTTGCATCTGCAC 3’). NcoI innan elektroforesen p˚
ab¨orjades. TransformaM1 i pHW187d k¨
ordes ocks˚
a med reverse-nostop tion in i Rosetta 2 utf¨ordes sedan. IPTG reglerar
primer (5’ GGTGGTGGTGGTGCTCGAGCTT- genen p˚
a samma s¨att som laktos men bryts inte
GAATCGTTGCATCTGCACC 3’) som ger his- ned. D¨arf¨or anv¨andes IPTG f¨or att f˚
a en stabil och
tag.
h¨og transkription av genen innan produkten testa-
PCR-produkterna kontrollerades p˚
a en 1% des i en elektroforesgel f¨or att p˚
avisa M1-protein.
(a)
(b) M1-gen och pET-vektor efter PCR
100bp- med 100bp-stege till v¨
anster och 1kbstege
stege till h¨
oger.
(c) 1kb-(d) M1-gen fr˚
an koloni-PCR med 1kbstege
(e) 1kb-(f) Uppklippta plasmider med 1kb-
(g)
stege
kDa-stege
stege till v¨
anster
stege till v¨
anster.
(h) Proteingel med 10-200 kDa-stege till h¨
oger
3
Resultat
tre band fr˚
an M1-genen och tv˚
a av M1-genen med
his-tag l˚
ag mellan 0,5 och 1kb. Eftersom M1-genen
Figur (b) visar agarose-gelen d¨
ar PCR-produkten
var knappt 0.8kb11 visar detta att kopieringen lyc-
av pET21d och pHW187 k¨
orts. I f¨
orsta brunnen,
kats. Vektorn borde ha g˚
att i fler PCR-cykler f¨
or
till v¨
anster, har vi en 100bp-stege och l¨angst till
att tillr¨ackligt med produkt skulle bildas och d¨
ar-
h¨
oger en 1kb-stege. I brunn 2-4 finns pET21d-
med ge ett tydligare resultat i gelen. I den ˚
attonde
vektorn, i 5-7 M1-genen och i brunn 8-10 M1-genen
brunnen med M1-gen med his-tag har produkten
med his-tag.
g˚
att betydligt l¨angre ¨an i ¨ovriga. Detta tyder p˚
a
I figur (d) visas agarose-gelen p˚
a koloni-
att det endast fanns sm˚
a fragment utan M1-gen,
PCR:en. Det som efters¨
oks ¨
ar M1-genen i 27 kolo-
t.ex. primers.
nier som hade tagits fr˚
an tre plattor. De 18 f¨orsta
brunnarna, efter 1kb-stegen, var kolonier med enI (d) efters¨oks M1-genen och M1-genen med his-
bart M1 och de sista nio var M1-genen som hade
tag f¨or att bekr¨afta att dessa ligerats in i vektorn.
his-tag.
17 av 27 band bekr¨aftar detta. I ¨ovriga har liga-
Den tredje agarose-gelen, figur (f), k¨ordes med
tionen misslyckats. Detta kan bero p˚
a att vissa av
syftet att kontrollera att r¨
att plasmid bildats.
plasmiderna g˚
att ihop sj¨alva utan M1-genen, med
Plasmiden var s¨
onderklippt i tv˚
a delar och frag-
eller utan his-tag.
menten skulle ha en storlek p˚
a drygt 6kB respektive 0.1kB. I brunn 2,4,6 och 8 fanns de s¨onder-
I figur (f) var det den modifierade plasmiden
klippta plasmiderna. Till h¨
oger om var och en av
dessa brunnar fanns respektive oklippta plasmider. som kontrollerades. Eftersom den var uppklippt i
a bitar skulle det ocks˚
a synas tv˚
a band, ett p˚
a
I de fyra f¨
orsta brunnarna fanns enbart plasmider tv˚
a 0.1kb. Bilden visade tydligt dessa
eller plasmidrester med M1-genen. I de fyra sista 6kb och ett p˚
tv˚
a band i brunn tv˚
a och sex. I brunn fyra syntes
brunnarna fanns M1-genen med his-tag.
agot band p˚
a 0.1kb och i brunn ˚
atta syntes
Fr˚
an fyra kolonier k¨
ordes tre prover vardera, inte n˚
a 6kb. S˚
aledes hade vi tv˚
a posioinducerad, inducerad i 1h och inducerad i 2h, och inget tydligt band p˚
a ¨ovriga var os¨akra. Trots
figur (h) visar att i sex av tolv brunnar finns ett tiva resultat medan de tv˚
det
var
plasmiden
i
brunn
8 godk¨and b˚
ade fr˚
an
band mellan 25 och 30 kDa. De band p˚
a gelen till
v¨
anster, var fr˚
an en koloni med plasmid och enbart sekvenseringen och i proteingelen medan brunn 4
ada. I brunnarna med hela
M1-genen och de fyra band p˚
a den h¨
ogra gelen var bevisades felaktig i b˚
a tydliga band urskiljas. Detta
fr˚
an tv˚
a olika kolonier med M1-genen med his-tag. plasmider kunde tv˚
bevisar n¨odv¨andigheten att klippa upp plasmiden
d˚
a dessa band ¨ar fr˚
an den vanliga plasmiden och
Diskussion
supercoil-versionen av dessa. Banden s˚
ag alla unge-
Gelerna var viktiga verktyg f¨
or att kontrollera att f¨ar lika ut och visade inte skillnaderna som visades
varje steg i processen gav r¨
att produkt. I delmo- n¨ar de var uppklippta.
menten fanns alltid en risk f¨
or fel och med gelerna
M1 ¨ar ett 252 aminosyror l˚
angt protein11 och
kunde resultaten s¨
arskiljas.
Figur (b) visar att PCR p˚
a pET21d-vektorn ba- v¨ager 28 kDa.10 Proteingelen (h) visar tydligt sex
stora band mellan 25kDa och 30 kDa vilket bekr¨
af-
ra gav ett av tre lyckade resultat p˚
a en storlek mel9
tar att det ¨ar M1.
lan 5 och 6kb. Vektorn borde inneh˚
alla 5.4kb. Alla
4
Framtida forskning
http://www.cdc.gov/ncidod/eid/vol12no01/pdfs/
05-0979.pdf [5 July 2011]
NA och M2 har l¨
ange varit m˚
al f¨
or l¨
akemedel f¨or
[3] U.S. Census Bureau. [Online] (4 May 2011). Availab-
att f¨
orhindra influensan.1 Men eftersom influensa-
le at: http://www.census.gov/main/www/popclock.
viruset st¨
andigt f¨
or¨
andras och utvecklar resistens
html [4 July 2011]
1
mot mediciner kr¨
avs hela tiden ny forskning. Det
[4] Huang, I.C., Li, W., Sui, J., Marasco, W., Choe, H.,
finns fortfarande mycket ok¨
ant hos viruset. F¨orsta
Farzan, M., 2008. Influenza A Virus Neuraminidase Limits Viral Superinfection. Journal of Virology,
steget ¨
ar att studera virusets alla ing˚
aende delar.
82(10), pp.4834-43.
M1 ¨
ar en av dessa delar d¨
ar vidare unders¨okning-
[5] Rossman, J.S., Lamb, R.A., 2011. Influenza virus as-
ar beh¨
ovs och proteinet kan bli ett framtida m˚
al
sembly and budding. Virology, 411, pp.229-36.
f¨
or l¨
akemedel. Det verkar som att M1 har en viktig
[6] Elster, C., Larsen, K., Gagnon, J., Ruigrok, R.W.H.,
del i ytproteinernas, NA och HA, gruppering p˚
a
Baudin, F., 1997. Influenza virus M1 protein binds to
virusets yta. Det g˚
ar i dagsl¨
aget inte att s¨aga hur
RNA through its nuclear localisation signal. Journal
of General Virology, 78, pp. 1589-96.
NA och HA binder till sj¨
alva viruset. Det ¨ar dock
[7] Ruigrok, R.W.H., Barge, A., Durrer, P., Brunner, J.,
k¨
ant att M1 finns precis innanf¨
or membranet och
Ma, K., Whittaker, G.R., 2000. Membrane interac-
det finns teorier om att NA och HA binder till just
tion of influenza virus M1 protein. Virology, 267, pp.
M1.6 St¨
ammer detta kan M1 bli ett attraktivt m˚
al
289-98.
TM
f¨
or mediciner, fr¨
amst eftersom virusets f¨orm˚
aga att
[8] Promega Quick Protocol, 2008, 2009. PureYield
Plasmid Miniprep System, [PDF] Promega Cor-
sprida sig skulle kunna p˚
averkas.
poration, Available at: http://www.promega.com/
resources/protocols/technical-bulletins/101/
pureyield-plasmid-miniprep-system-protocol/
Tillk¨
annagivanden
[5 July 2011]
[9] LabLife, 2011, LabLife Vector Database. [Onli-
Vi tackar v˚
ar forskningsmentor Robert Daniels f¨or
ne] Available at: http://www.lablife.org/p?a=vdb_
all hj¨
alp och f¨
or att han m¨
ojliggjort v˚
art projekt. Vi
view&id=g2.NeMBIu5BBungSIe9l7H6gH6H_ts- [5 July
tackar ocks˚
a Johan Nordholm f¨
or sitt engagemang
2011]
och st¨
od under projektets g˚
ang. Till sist tackar vi
[10] Ruigrok, R., Baudin, F., Petit, I., Weissenhorn, W.,
2001. Role of influenza virus M1 protein in the viral
alla p˚
a Rays* och dess sponsorer.
budding process. International Congress Series 1219,
pp. 397-404
Referenser
[11] Influenza
Research
Database,
2011,
Segment
Details (A/WSN/33 (M1 gene) Seg. 7). [On[1] Das, K., Aramini, J.M., Ma, L.C., Krug, R.M., Ar-
line]
Available
at:
http://www.fludb.org/
nold, E., 2010. Structures of influenza A proteins and
brc/fluSegmentDetails.do?ncbiProteinId=
insights into antiviral drug targets. Nature Structu-
AAA43252&decorator=influenza&context=
ral and Molecular Biology, 17(5), pp.530-38.
1309856111896 [5 July 2011]
[2] Taubenberger, J.K., Morens, D.M., 2006. 1918
[12] World Health Organization, 2009, Influenza (Sea-
Influenza: the Mother of All Pandemics, Emer-
sonal) [Online] Available at: http://www.who.int/
ging Infectious Diseases, [Online] Available at:
mediacentre/factsheets/fs211/en/ [5 July 2011]
5