DNA 半保留复制实验----CsCl离心
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超速离心技术在 生物医学中的应用 赵 勇 博士 中山大学生命科学学院 中心已将本次培训讲座录制视频，需要 视频的老师和同学请带移动硬盘到科技 楼北810房（原北806房）进行拷贝。 内容： • 超速离心的基本方法 • 离心转子的选择 • 如何用超速离心做研究 Meselson-Stahl 实验 15N 20 min 取样 0 min 取样 破碎细胞 提取DNA 14N 14N 14N 14N 培养基 破碎细胞 提取DNA 破碎细胞 提取DNA 40 min 取样 破碎细胞 提取DNA 14N/ 14N 14N/ 14N 15N/ 14N 15N/ 15N 15N/ 14N DNA 半保留复制实验----CsCl离心 离心方法 • 差速离心法 • 速率区带离心法 • 等密度梯度离心法 密度梯度离心法 离心方法 - 差速离心法 • 差速离心法（Differential Centrifugation) 特点：最常用的方法操作简便，但其分离的纯度不高。 基本原理：逐次增加离心力，每次可沉降样品溶液中的 一些 组分。 在这种方法中，离心管在开始时装满了均一的样品溶液（见图）。通过 在一定速度下一定时间的离心后，就可得到两个部分：沉淀和上清。 沉降系数 （s） 离心方法 - 差速离心法 离心管中离心前后的样品 差速离心后的细胞组分 －组织样品的亚细胞分离－ 离心方法 - 密度梯度离心法 （Density Gradient Centrifugation） v = 沉降速率 d = 颗粒直径(流体力学等效球体) Pp = 颗粒密度 P1 = 液体密度 η= 介质粘度 g = 离心力 • • • • • 颗粒沉降速率和它的大小成比例。 沉降速率和它自身密度与周围介质密度之间的差别成比例。 当颗粒密度等于周围培养基密度时，沉降速率为0。 沉降速率随着介质粘度的增加而降低。 沉降速率随着离心力的增加而增加。 离心方法 - 速率区带离心法 （Rate Zonal Centrifugation） 离心前，在管中预先装入密度梯度 介质；而样品铺在梯度介质上 – 利用各颗粒在梯度介质中的沉降速度 不同，使具有相同沉降速度的颗粒处 于同一梯度层内而达到分离的目的 – 样品颗粒的密度必须大于梯度柱中任 何一点的密度；在最大颗粒沉降到管 底前必须停止离心 离心方法 - 速率区带离心法 速率区带离心常用的介质 蔗糖 细胞器、病毒、大片断DNA、RNA 聚蔗糖 （Ficoll） 分离各种细胞、细胞器（淋巴、肝、肿瘤、血） Percoll SiO2/PVP复合物，细胞、细胞器分离 氯化铯 （CsCl） DNA、RNA、病毒、脂蛋白 卤化物 K(Na)Br(I) 脂蛋白、RNA 离心方法 - 等密度梯度离心法 （Isopycnic Centrifugation） – 分离效果取决于颗粒密度差异 – 分离前，样品与梯度介质混合 一起 – 在离心时，梯度介质在管中重 新分布，自我形成梯度 – 样品颗粒随着梯度的分布在管 中沉降或上浮，直到与其密度 相等的介质处停留 可以自我形成的物质 • CsCl自形成梯度 • 碘盐自形成梯度（ Nycodenz或 metrizamide） • 胶体硅（Percoll）自形成梯度 离心方法选择 区别速率区带离心和等密度梯度离心 速率区带离心 等密度梯度离心 通常应用蔗糖 密度相近大小不等 通常应用氯化铯 密度相差较大 最大的梯度密度低于最小密 度的沉降样品 最大的梯度密度大于密度最 大的沉降样品 在最高的沉降物质达到管底 前停止，短时间，低速度 使各组分沉降到其平衡的密 度区，长时间，高速度 密度梯度离心法介质的选择 介 质 DNA RNA 核蛋白 膜 亚细胞 细胞 病毒 蔗 糖 — — + ++ +++ + ++ 聚蔗糖 — — — + + +++ ++ 氯化铯 +++ ++ + — — — ++ 细颗粒 硅溶胶 — — — + ++ ++ + 碘化物 + + +++ +++ +++ ++ ++ *+++ 很好， ++ 好，+ 可以，— 不适用 转 头 转头---离心技术的核心 纯 度 垂直转头 近垂直转头 固定角转头 分离速度 水平转头 转头选择：定角转头 • 在离心过程中，离心管与轴之间的角 度是固定的。 • 优点 – 沉降效率高。 – 非常好的适用性，容量范围也很广，从 几拾微升到几百毫升的样品都可处理。 • 基本应用范围： – 亚细胞器片段的差速沉降。 – 脂蛋白的差速悬浮分离。 转头选择：水平转头 • 在离心过程中，离心管与轴之间的角度从开 始 0变成90，停止时又成为0。 • 优点 – 由于长通径，因此可以得到最好的纯度。 – 可以使用开口离心管，因此装卸样品量较大。 • 基本应用范围： – 等密度的亚细胞片段的分离和亚细胞器的沉降。 – 蛋白复合体､亚细胞器的速率区带离心。 – 病毒､DNA的等密度梯度分离。 转头选择：垂直转头 • 分离机理与固定转头相似，但与轴之间的角 度为0° • 优点 – 分离效率最高。 – 样品密度可达1.7g/ml，两个小时就可完成质粒 DNA的分离。 • 基本应用范围： – 等密度的质粒DNA的分离。 – 亚细胞器片段的等密度分离。 – 蛋白质的速率区带分离。 – 脂蛋白的等密度分离。 转头选择：近垂直转头 • 转头的设计是基于垂直转头，弥补其低沉 淀回收率的不足，离心管与轴之间的角度 少于10°。 • 优点 – 可承受与垂直转头同样的速度，但可达到固定 转头所能达到的分离样品的纯度。 – 分离较快，而且密度可达1.7g/ml。 • 基本应用范围 – 等密度的质粒DNA的分离。 – 等密度的脂蛋白的分离。 密度梯度在不同转子中的形成 转子的选择 Type of rotor Type of separation Pelleting Rate-zonal Isopycnic Fixed-angle Excellent Poor Poor Vertical Poor Good Good Swing-out Inefficient Excellent Adequate 分离细胞的常用方法 收集细胞 或组织勻浆 细胞破碎 5 000 x g 10 分钟 台式 / 高速 / 大容量 离心机 通过 差速沉淀离心方法 浓缩细胞器 30 – 100 000 x g 1 – 6 小时 （超过一次） 超速 / 高速 离心机 利用 密度梯度离心方法 纯化细胞器 100 000 1 000 000 x g 2 - 24 小时 超速离心机 肝组织细胞中亚细胞结构的分离 肝组织匀浆液 差速离心 1,000 g，10分钟 沉淀物 （细胞核） 上清液 3,300 g，10分钟 沉淀物 （线粒体） 上清液 16,300 g，20分钟 沉淀物 （溶酶体） 沉淀物 （核糖体） 上清液 100,000 g，30分钟 上清液 肝组织细胞中核糖体亚基的分离 沉淀物 速度区带离心 444,000 g 沉淀物 (核糖体, 70S） 水解 30,000 g 沉淀物 25-40% 蔗糖梯度 268,000 g 沉淀物 (核糖体亚基, 30S, 50S） NaBr梯度分离血清脂蛋白 人全血 速率区带离心 100g 血细胞 血清 NaBr 密度梯度离心 NaBr 剃度 血清 VLDL LDL HDL 血清蛋白 质粒DNA的分离纯化 细菌沉淀 等密度梯度离心 NaOH-SDS方法得到粗制的质粒DNA 质粒DNA溶解于 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.6缓冲液纯化 每毫升溶液加入1g CsCl和0.6mg EB，加入Triton X100使其最终浓度为0.01% 离心分离 个人的研究经历 Telomere End Structure (Telomeric Overhang) T-loop formation Telomerase extension Question: Whether or not both ends of chromosome have a long overhang Determination of the Length of the Telomeric Overhang Is there an overhang at each end of each chromosome? Replication of the Chromosome End Replication complex 5’ 3’ TTAGGG 5’ + AATCCC 5’ Leading 3’ AATCCC 3’ Lagging 3’ 5’ Leading TTAGGG Chromosome 3’ 5’ Lagging Separation of Leading and Lagging Telomeres 3’ TTAGGGTTAGGG AATCCCAATCCC 5’ Lagging CsCl T → BrdU TTAGGGTTAGGG AATCCCAATCCC 3’ 5’ Leading Zhao Y et al. Nucl. Acids Res. 2008. Lagging Telomeres have a Much Longer Overhang than the Leading Telomeres Lead Exo I Lag + - + - 384 96 54 36 21 Mean Length: 30 110 nt Zhao Y et al. Nucl. Acids Res. 2008. Long overhang is present at one end of the chromosome How to study telomerase extension during one cell cycle Telomerase Extension of Telomeric Overhang Telomere hTR template hTERT The Strategy to Study Telomerase Extension Replication In BrdU TTAGGG-3’ AATCCC-5’ 5’ 3’ Thymidine TTAGGG-3’ CsCl DSN Un-extended Extended (L) Telomerase Thym+BrdU DSN= Duplex Specific Nuclease 100% Ends of Telomeres Were Extended by Telomerase in H1299 Cells (50%/50%) Signal Intensity T/BrdU Thy 3 BrdU Un-extended 2 Extended Full-BrdU 1 0 1.72 1.74 1.76 1.78 1.80 1.82 1.84 Density (g/ml) Zhao Y et al. Cell. 2009. Telomere Length Maintenance in Human Cancer Cells Exo I ＋ － ~126nt In the absence of telomerase PD 0 35 19kb — 50% 50% 1600— Replication induced overhang (~60nt) Telomerase extended overhang (~60nt) Telomerase add ~60nt to each telomere 400— 250— 96— 54— 7.7kb — 6.2kb — 4.3kb — 3.5kb — 2.7kb — 1.9kb — 1.5kb — 0.9kb — Overhang ~126nt Length Tel-shortening: 55 ( bp/PD ) Zhao Y et al. Mol Cell. 2011 Dogma: Telomerase Preferentially extend the shortest telomere Total Sucrose Gradient Separation of Long and Short Telomeres Long telomeres short telomeres Gradient Telomerase Extension of Telomeres is not Length Dependent Long Telomeres Short Telomeres 谢 谢 ！
