Mario Vaneechoutte
Laboratorium Bacteriologie Research
RAPD of AP-PCR
voor de genotypering van bacteriën
19 april 2012
Staf Microbiologie
UZ Gent
Dia’s beschikbaar op:
http://users.ugent.be/~mvaneech/LBR.htm
I. RAPD: Nomenclatuur
AP-PCR: arbitrarily primed PCR
of?
RAPD: randomly amplified polymorphic DNA analysis
2
II. RAPD: Principe
Eén korte primer +
Lage annealingst°
= veel random priming
3
II. RAPD: Principe
Hoe mutaties aanleiding geven tot verschillende RAPD fingerprints
4
II. RAPD: Principe
Isolaat 1
Isolaat 2
opgezuiverd genomisch DNA
PCR met korte primer (5’AGTCAGCCAC)
bij lage annealing temperatuur
Elektroforese
5
III. RAPD: Praktisch
1. Start from pure culture
2. Extract DNA for PCR: Crude cell extract
take 1-3 small colonies
heat in 100 μl water for 15 min at 95C
dilute 1:10 in distilled water
centrifuge for 30"
use supernatant as DNA-extract
30 min
3. PCR-mixture preparation - adding DNA (30 isolates):
PCR ready mix with dNTP, polymerase, buffer
Add primer at final concentration of 0.1-1 µM
Add 1 μl of DNA-target
Final volume per reaction: 10 μl
30 min
4. PCR-cycling – preparing agarose gel:
2 hours
5. 3% Agarose gel electrophoresis at 7 V/cm
1 hour
Total time (1 – 30 isolates)
4 hours
6
IV. RAPD: PCR + Electroforese
1. Agarose gel electroforese
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
M
7
IV. RAPD: PCR + Electroforese
2. Capillair electroforese (fluo primer, ABI3130)
 Hogere resolutie: 1 bp
 Automatische digitalisatie
A
B
C
C
C
8
El Aila et al. 2009. Genotyping of Streptococcus agalactiae (group B streptococci) isolated from
vaginal and rectal swabs of women at 35-37 weeks of pregnancy. BMC Infect. Dis. 2009, 9: 153.
IV. RAPD: PCR + Smelt curve analyse (MCA)
3. McRAPD
 Geen electroforese
 Automatische analyse
 Praktischer – sneller - goedkoper dan electroforese
9
Deschaght et al. 2011. Rapid genotyping of Achromobacter xylosoxidans, Acinetobacter baumannii,
Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Stenotrophomonas maltophilia isolates using
melting curve analysis of RAPD-generated DNA-fragments (McRAPD). Res. Microbiol. 162: 386-392.
IV. RAPD: PCR + Smelt curve analyse (MCA)
3. McRAPD
 Geen electroforese
 Automatische analyse
 Praktischer – sneller - goedkoper dan electroforese
A A A’ B B C C C C C D D
10
Deschaght et al. 2011. Rapid genotyping of Achromobacter xylosoxidans, Acinetobacter baumannii,
Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Stenotrophomonas maltophilia isolates using
melting curve analysis of RAPD-generated DNA-fragments (McRAPD). Res. Microbiol. 162: 386-392.
V. RAPD: reproduceerbaarheid?
Typering van Sphingomonas paucimobilis
met 2 afzonderlijke random primers: PH1, M13
Andere primers
= andere patronen, maar zelfde clustering
Andere run met zelfde primer = andere patronen, maar zelfde clustering
 RAPD fingerprints zijn reproduceerbaar binnen 1 run: beperkt aantal stammen/test
11
Lemaitre et al. 1996. Tracheal colonization with Sphingomonas paucimobilis in mechanically ventilated
neonates due to contaminated ventilator temperature probes. J. Hosp. Infection 32: 199-206.
V. RAPD: Interlaboratorium-reproduceerbaarheid?
Set up: 40 clinical Acinetobacter isolates - 7 laboratories
DNA-extraction in each lab
Ready-to-Go RAPD beads (Pharmacia)
Analysis of profiles on agarose gel in each lab
Analysis of profiles on high resolution gels on ALF Express (Pharmacia) in one lab
Results
1. Highly comparable profiles between labs
2. Clustering reproducibility
On agarose gels: identical in 4 labs
3 other labs: 1, 2, 4 isolates wrongly clustered
On ALF express: identical for all 7 labs
Conclusions
12
1. High interlaboratory reproducibility of (profiles and) clustering
2. Interpretation and reproducibility problems are due to agarose gel electrophoresis
Grundmann et al. 1997. Multicenter study using standardized protocols and reagents for evaluation
of reproducibility of PCR-based fingerprinting of Acinetobacter spp. J Clin Microbiol 35: 3071-3077.
V. RAPD: Interlaboratorium-reproduceerbaarheid?
Set up: 60 isolaten, 7 laboratoria
Resultaten: geen volledige overeenstemming met PFGE
16-30 types naargelang laboratorium
toch epidemiologisch correct clusteren (?)
Van Belkum et al. 1995. Multicenter evaluation of arbitrarily primed PCR
for typing of Staphylococcus aureus strains. J Clin Microbiol 33: 1537-1547.
13
VI. RAPD: vergelijking met
andere genotyperingstechnieken
Comparison of RAPD with other methods for typing of Gram-negatives
Species
A. baumannii
A. baumannii
E. cloacae
K. pneumoniae
P. aeruginosa
Technique compared with
Macrorestriction analysis
SDS PAGE protein profiles
Ribotyping
Macrorestriction analysis
Serotyping
Phage typing
Publication
Struelens et al. (1993)
Vaneechoutte et al. (1995)
Grattard et al. (1994)
Gori et al. (1996)
Elaichouni et al. (1994)
Elaichouni et al. (1994)
Results
1. Whatever primer was used: nearly identical clustering with all primers
2. Almost perfect correspondence with other techniques
3. Almost perfect correspondence with epidemiological data
Conclusion
All DNA-fingerprinting techniques, included RAPD, perform well
Certainly for Gram-negatives
14
VII. RAPD: Toepassingen
1. Opsporen contaminatiebron
Nosocomiale outbreaks
Bron Pseudomonas aeruginosa besmetting bij muco-patiënten
2. Vergelijken van isolaten van zelfde patiënt
Soort
Patiënten
Locatie
Haemophilus influenzae
otitis prone children
keel-oor
Vaginale soorten
zwangere vrouwen
rectaal-vaginaal
Pseudomonas aeruginosa
muco-patiënten
sputum
eradicatiesucces monitoren
voor elke patiënt slechts de verschillende stammen verder typeren (AFLP)
3. Herkennen van virulente stammen
Staphylococcus aureus bij konijnen
Streptococcus gallolyticus bij duiven
15
VII. RAPD: Toepassingen
1. Opsporen contaminatiebron.
Nosocomiale outbreaks
PH1
M13
16
VII. RAPD: Toepassingen
1. Opsporen contaminatiebron.
Nosocomiale outbreaks
Lemaitre et al. 1996. Tracheal colonization with Sphingomonas paucimobilis
in mechanically ventilated neonates due to contaminated ventilator
temperature probes. J. Hosp. Infection 32: 199-206.
17
VII. RAPD: Toepassingen
1. Opsporen contaminatiebron.
Oorsprong P. aeruginosa stam bij nieuw-geïnfecteerde muco-patiënten
50 huizen van nieuw-geïnfecteerden
18 huizen: P. aeruginosa positief (vnl. badkamers)
9 stammen identiek aan stam van de patiënt
Besluit: maximum 1 op 5 CF patiënten werd thuis besmet?
Schelstraete et al. 2008. Pseudomonas aeruginosa in the home environment
of newly infected cystic fibrosis patients. Eur Respir J 31: 822-829.
18
VII. RAPD: Toepassingen
2. Vergelijken van isolaten van zelfde patiënt
Haemophilus influenzae bij otitis-gevoelige kinderen:
vergelijking van keel-oor isolaten
Large genetic diversity: all individuals had different strains
Except for the 3 sibling pairs: both siblings same strain in throat
Paired isolates from nasopharynx and middle ear: 66% of pairs, strain identical
After one month interval of sampling: different strains in same patients
Easy transmission between individuals and within individuals
Rapid turnover = replacement: developing immunity?
Dhooge et al. 2000. Turnover of Haemophilus influenzae isolates
in otitis-prone children. Int J Pediatr Otorhinolaryngol 54: 7-12.
19
VII. RAPD: Toepassingen
2. Vergelijken van isolaten van zelfde patiënt
Haemophilus influenzae bij otitis-gevoelige kinderen:
vergelijking van keel-oor isolaten
Dhooge et al. 2000. Turnover of Haemophilus influenzae isolates
in otitis-prone children. Int J Pediatr Otorhinolaryngol 54: 7-12.
: keel
: oor (L resp. R)
20
2. Vergelijken van isolaten van zelfde patiënt
Vaginale soorten bij zwangere vrouwen: recto-vaginale staalnames 37 weken
21
2. Vergelijken van isolaten van zelfde patiënt
Vaginale soorten bij zwangere vrouwen: recto-vaginale staalnames 37 weken
GBS
R A
NT
R B
II
R C
III
V
C
III
V
C
III
El Aila et al. 2009. Genotyping of Streptococcus agalactiae (group B streptococci) isolated from
vaginal and rectal swabs of women at 35-37 weeks of pregnancy. BMC Infect. Dis. 2009, 9: 153.
22
2. Vergelijken van isolaten van zelfde patiënt
Vaginale soorten bij zwangere vrouwen: recto-vaginale staalnames 37 weken
Lactobacillus crispatus
50 x zelfde soort V & R
34 x ook zelfde stam
23
El Aila et al. 2009. Identification and genotyping of bacteria from paired vaginal and rectal samples from
pregnant women indicates similarity between vaginal and rectal microflora. BMC Infect. Dis. 2009, 9: 167.
2. Vergelijken van isolaten van zelfde patiënt
Vaginale soorten bij zwangere vrouwen: recto-vaginale staalnames 37 weken
Enterococcus faecalis
R1
R2
R3
R4
V1
V2
24
El Aila et al. 2009. Identification and genotyping of bacteria from paired vaginal and rectal samples from
pregnant women indicates similarity between vaginal and rectal microflora. BMC Infect. Dis. 2009, 9: 167.
2. Vergelijken van isolaten van zelfde patiënt
Monitoring van het eradicatiesucces van AB-behandeling
bij nieuw-geïnfecteerde muco-patiënten
Schelstraete, P., P. Deschaght, L. Van Simaey, S. Van daele, F. Haerynck,
M. Vaneechoutte, and F. De Baets. 2010. Genotype based evaluation of
Pseudomonas aeruginosa eradication treatment success in cystic fibrosis patients.
J Cystic Fibrosis 9: 99–103.
Methods:
January 2003 - December 2008: respiratory samples cultured from 41 patients
with a first ever P. aeruginosa isolate and with early aggressive eradication therapy.
Sixteen patients immediately rescued: no further positive cultures
Twenty five patients had at least one subsequent isolate:
re-infection with other strain or chronic colonization with same strain?
Clinical criteria: 3 positive cultures within 6 months  11 chronically colonized
< 3 positive cultures within 6 months  14 intermittently colonized
Genotypic criteria: 11 chronically colonized: confirmed
7 of 14 ‘intermittently colonized’  are probably also chronically colonized
25
2. Vergelijken van isolaten van zelfde patiënt
Monitoring van het eradicatiesucces van AB-behandeling
bij nieuw-geïnfecteerde muco-patiënten
Patient
Patient
Patient
Patient
Patient
Patient
Patient
Patient
Patient
Patient
Patient
Patient
Patient
Patient
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
Patient
Patient
Patient
Patient
Patient
Patient
Patient
Patient
Patient
Patient
Patient
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
Intermittently colonized: < 3 + cultures in last 6 months
Same genotype: 50%
Chronically colonized: 3 + cultures in last 6 months
Same genotype: 100%
12
24
36
60
26
2. Vergelijken van isolaten van zelfde patiënt
Pseudomonas aeruginosa in sputum van gekoloniseerde muco-patiënten
Van daele S, M. Vaneechoutte, K. De Boeck, C. Knoop, A. Malfroot, P.
Lebecque, J. Leclercq-Foucart, L. Van Schil, K. Desager, and F. De Baets.
2006. Survey of Pseudomonas aeruginosa genotypes in Belgian colonised
cystic fibrosis patients. Eur Resp J 28: 740-747.
Nationale studie:
‘AFLP’ fingerprinting + digitale electroforese
276 patiënten in 2003 en daarvan 95 nog eens in 2004
AFLP: duur en omslachtig
Om werk en kosten te sparen 
per patiënt alle isolaten vergelijken met RAPD 
per patiënt van elke RAPD genotype slechts 1 stam meenemen in AFLP
Conclusies (op basis van RAPD & AFLP):
totaal 910 isolaten, 163 genotypes: veel diversiteit in CF populatie
80% van 95 patiënten hebben zelfde stam nog in 2004
75 % van de patiënten hebben slechts 1 stam
slechts 10-tal clusters, sommige clusters multicentrisch
grootste cluster: 10 patiënten
27
VII. RAPD: Toepassingen
3. Herkennen virulente stammen: S. aureus bij konijnen
Set up: 53 S. aureus stammen uit 13 verschillende kwekerijen
13 RAPD-types
Type
a
b
c-m
NT
Stammen
23
13
1 of 2
1
Gerelateerd aan chronische stafylococcose
+
28
Geen type a stammen in kwekerijen zonder chronische infectie
Betere overeenstemming met epidemiologie dan faag-biotypering
Hermans et al. 2000. Differentation between high and low virulence Staphylococcus aureus strains from
rabbits by randomly amplified polymorphic DNA (RAPD)-analysis. Vet. Microbiol. 72: 311-319.
Baele et al. 2000. Genomic fingerprinting of pigeon Streptococcus gallolyticus strains of differing virulence
by randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis. Vet. Microbiol. 71: 103-111.
Met dank aan Leen Van Simaey & Bart Saerens
Laboratorium Bacteriologie Research
RAPD of AP-PCR
voor de genotypering van bacteriën
19 april 2012
Staf Microbiologie
UZ Gent
Dia’s beschikbaar op:
http://users.ugent.be/~mvaneech/LBR.htm