해조류를 이용한 치매예방 및
기억력개선 기능성 식품개발
2012. 12. 12
한림대학교 강일준
가파른 고령사회 진입 속도
[2000년 고령화 사회(노인인구: 7%)→2019년 고령사회(노인인구: 14%)]
치매의 심각성
세
계
•치매 환자수
약 5,800 만명
국
내
치매 발병
[치매 환자수] 5년 만에
2.7배 증가
[총 진료비] 3268억원으
로 5년만에 5.8배 증가
[노인장기요양보험]
44% 치매환자
치매 원인
기타
주원인
알츠하이머병
혈관성 치매
37-50%
20-38%
알코올성치매
파킨슨병
Huntington병
infection
brain injury
치매 치료제의 문제점
코그넥스(tacrine)
Exelon (rivastigmine)
The first approved
drug in the United
States (a potent
AChE inhibitor)
vertigo,
emesis
vertigo,
emesis
hepatotoxicity
간독성
Aricept (donepezil)
구토
위장장애
부작용
천연물 유래 제품 개발 시급
고령화
해양자원의
기능성
치매환자
급증
의료비부담
사회적
문제
인지능력 개선 및 치매 예방 물질 개발
연구동향
알츠하이머병 치료 접근법
 Acetylcholinesterase inhibitors: Increase acetylcholine contents
 β-Secretase inhibitors: Decrease β-amyloid protein accumulation
 Antioxidants: Decrease ROS and free radical
혈관성 치매 치료 접근법
 뇌허혈/ 뇌졸중 예방
 뇌 신경세포보호
 뇌 신경세포재생
후보소재 도출
• 총 29종의 해조류를 채집하여
이들로부터 3가지의 용매추출물을 제조
• 항산화, 뇌신경세포 재생, AChE억제효과,
β-secretase 억제효과 등의 효능평가
• 이상의 연구를 통해 감태, 구멍쇠미역의 후보물질을 도출함
감태 (Ecklonia cava E6)
분류: 갈조류
서식지: 동해안
식용 여부: 식용가능
특징: Seanol을 함유, 의약품
원료로 사용
구멍쇠미역 (Agarum clathratum, E13)
분류: 갈조류
서식지: 동해안
식용 여부: 식용가능
Mechanism of Aβ secretion via β-secretase
β-secretase inhibition = sAPPα/sAPP(sAPPα+ sAPPβ)
정상인
AD환자
Human APP(amyloid precursor protein) swedish mutants를
발현하는 plasmid를 함유한 HEK293T cell
Effects of butanol extract of E. cava on APP processing
The butanol extract did not show any toxicity in the HEK293-APPsw stable cells
(A)The culture media (sAPPs) and cellular lysates (CTFs) were analyzed by the immunoblots.
Soluble APPa and sAPPs (sAPPa and sAPPb) were detected by 6E10 and 22C11 monoclonal
antibodies. CTFa was detected by the A8717 antibody.
(B)The densitometry data were calculated for the ratios. BACE inhibitor IV (5 μM)
Butanol extract of E. cava prevents Aβ secretion via β-secretase inhibition.
Butanol extract of E. cava prevents Aβ secretion
- HEK293-APPsw stable cells
were
treated
with
various
concentrations of butanol extract
of E. cava for 8 h.
- The concentrations of Aβ1–40
and Aβ1–42 in the culture media
were assayed by ELISA methods
after the treatment of the
butanol extract.
Butanol extract of E. cava inhibits Aβ oligomerization
(a)The butanol extract was incubated with
10 μM Aβ1–42 solution for 18 h at 4oC
to determine the effect on low-size
(monomer
to
tetramer)
Aβ
oligomerization.
(b) The butanol extract was incubated with
10 μM Aβ1–42 for 18 h at room
temperature to determine the effect on
middle-size (40–120 kDa, particularly
around 50 kDa) Aβ oligomerization.
(c and d) TEM images of middle size Aβ
oligomer (untreated control, c) and of
the co-treatment of 50 μM butanol
extract with Aβ (d) are shown.
In Fig. 2c, large globular aggregates (white
arrowhead) were shown, but not in Fig. 2d,
only small aggregates were shown.
100 nm
Butanol extract of E. cava inhibits Aβ fibrillogenesis
(black bar = 200 nm)
(a) Congo red assay was performed after 7 days of incubation without and with the increasing
amount of butanol extract co-incubated with 100 μM Aβ1–42 (measuring of β-sheet structure)
(b) Thioflavin T assay results
Transmission electron microscopy images of the Aβ fibril preparation(untreated control, c)
and of the Aβ fibril preparation treated with 50 μM butanol extract (d) are shown.
Butanol extract of E. cava inhibits Aβ-induced cell death
(Primary rat cortical Neurons)
β-amyloid를 10μM로 처리
(A) MTT assay (B) LDA release
Schematic illustration of the pathogenesis
by beta-amyloid and its aggregates
Butanol extract of E. cava inhibits Aβ synthesis via BACE inhibition
and reduces Aβ oligomerization and further fibrilization.
Ultimately, the extract prevents Aβ-induced neuronal cell death.
TLC chromatogram of the subfractions obtained from
E. cava butanol fraction (silica open column)
E1
E2
E3
E4
E5
E6
E7
BtOH fr.
E1
E2
E3
E4
E5
E6
Aβ1-42 inhibition of sub fractions of
E. cava butanol fraction
90
80
70
Aβ
Inhibition(%)
60
50
40
30
20
10
0
EA
E1
E2
E3
E4
5.1 μg/mL
E5
E6
E7
TLC chromatogram of the subfractions of E. cava E5
(sephadex open column)
BtOH fr.
E5
E5-4
E5-5
E5-6
E5-7
E5-8
E5-9
Aβ1-42 inhibition of sub fractions of E. cava E5
120
100
Aβ
Inhibition(%)
Aβ
Inhibition(%)
100
80
60
40
80
60
40
20
0
20
0
E5-1 E5-2 E5-3 E5-4 E5-5 E5-6 E5-7 E5-8 E5-9
5.1 μg/mL
0.6375
1.275
2.55
1H, 13C
NMR and maldi-tof mass spectrum
δH (multi, J Hz)
δc
Position
1
122.5
123.32
2
147.2
147.79
3
98.3
99.14
6.31 s
4
142.1
142.86
9.87 s OH
4a
122.7
123.47
5a
134.1
134.81
6
103.3
104.09
7
103.5
104.25
8
146.6
147.34
8.22 s
9
99.2
99.95
6.45 s
150.5
151.21
9.85 s OH
9.44 s OH
5
1H
NMR spectrum of E5-9 compound
9a
10
10a
13C
NMR spectrum of E5-9 compound
11
120.0
120.97
11a
149.6
150.34
12a
151.0
151.67
13
94.8
95.66
6.74
14
144.9
145.60
10.13 s OH
14a
126.4
127.19
15a
137.0
137.69
1'
160.2
161.08
2'
93.7
94.58
3'
158.8
159.69
9.18 s
4'
96.2
97.20
5.85 d, J=2.0
5'
158.8
159.69
9.18 s
6'
96.2
97.20
5.78 d, J=2.0
1''
158.8
159.69
2''
93.7
94.58
3''
159.9
160.76
9.21
4''
93.4
94.35
5.85 d, J=2.0
5''
159.0
159.87
9.21
6''
93.4
94.35
5.74 d, J=2.0
5.78 d, J=2.0
5.74 d, J=2.0
MALDI-TOF m/z 602
1H, 13C
Maldi-tof mass spectrum of E5-9 compound
NMR and maldi-tof mass data of
E5-9 compound in DMSO-d6
Chemical structure of E5-9 compound
4’
HO
OH
1’
OH
12
Oa
HO
11
a
1
’’
4
’’
HO
O
O
15
a
13
6
5a
HO
O
OH
11
D
1
O
C
7
9
E
A
OH
3
4a
OH
B
Phlorofucofuroeckol A
혈관성치매 연구를 위한 뇌세포연구
저빌에서 뇌허혈 유발
Cryosection 30 ㎛
크레실 바이올렛
Fluoro-jade B염색
Cresyl violet staining in the sham, vehicle, and E13-ischemia groups
at 4 days post-ischemia
.
Relative analysis as a percentage in the number of Cresyl Violet+ neurons
NeuN immunohistochemistry
NeuN immunohistochemistry in the sham, vehicle, and E13-ischemia groups
at 4 days post-ischemia.
Relative analysis as a percentage in the number of NeuN+ neurons
Relative analysis as a percentage in the number of NeuN+ neurons in the sham, vehicle-,
and E13-ischemia groups at 4 days post-ischemia.
Fluoro-Jade B histofluorescence
Fluoro-Jade B histofluorescence in the sham, vehicle, and E13-ischemia groups
at 4 days post-ischemia.
미세아교세포 활성화 억제
정상군: 세포질이 작고 돌기가 발달하
지 않은 휴지형 미세아교세포 관찰
뇌허혈 유발군: 세포질 및 돌기가 발
달한 미세아교세포 뿐만 아니라 아메
바형 미세아교세포 또한 다수 관찰.
미세아교세포 활성화 억제가 신경세
포 보호와 밀접한 연관성이 있음
Iba-1 immunohistochemistry in the sham, vehicle, and E13-ischemia groups at 4 days postischemia.
후보 물질의 분리, 정제 및 구조분석
Fig. 구멍쇠미역 EtOAc
분획물의 TLC 사진.
Table. 구멍쇠미역 EtOAc 분획물의 silica chromatography 분리 후, 활성검사 (50 μg/mL)
CHCl3:EtOAc
EtOAc
fraction
activity (%)
48.52 ±0.46
100:95
12.13±1.39
95:5
12.79
±1.85
93:7
35.25 ±0.23
80:20
50:50
73.44 ±0.93 63.11 ±0.23
40:60
0:100
60.49
54.59
±0.23
±0.37
후보 물질의 분리, 정제 및 구조분석
13C
1H
NMR spectra (ppm)
Ring A
Table 구멍쇠미역 효능성분의 1H 및
13C
Ring C
Ring A
3,5
6.92
1
136.3
1
150.7
2,6
2.06
2,6
143.4
2
133.7
4
2.28
3,5
115.0
3
144.4
4
148.8
4
112.2
4
6.75
5
147.4
6
6.54
6
108.6
3
2.20
5
2.24
Ring B
Fig. 구멍쇠미역 효능 물질의 QTOF-MS를 이용한 분자량
분석(m/z: 498.93)
NMR spectra
(ppm)
Ring C
1
154.5
2,6
109.3
3,5
144.2
1
158.4
4
134.2
2,6
107.4
2,6
6.68
3,5
151.5
3,5
2.06
4
110.3
Ring D
NMR spectrum (in CDCl3)
정제된 효능 물질의 분자량 및 구조는 Q-TOF-MS 및 NMR을 이용.
구멍쇠미역 주요 효능 물질의 분자량은 498.93으로 측정되었으며,
C24H16O12의 분자구조를 가짐
Ring B
Ring D
2,6
6.56
4
6.63
C-3, 5
2.24
Chemical structure of key compound
(Tetraphloroethol E)
Fig. 구멍쇠미역 기능물질/지표물질의 구조
단기 기억력: Passive avoidance Test
Avoidance latency (sec)
90
a
a
80
b
70
60
c
50
40
30
20
10
0
C
CS
E6S
E13S
group
Effect of Phlorofucofuroeckol (E6) and tetraphloroethol E (E13) on the memory deficit
mice induced by scopolamine in the passive avoidance performance test (50 μg/kg)
공간학습능력: Morris water maze
a
80
70
4
60
50
40
a
3.5
bc
c
b
30
20
Frequency
Stop-through latency (sec)
90
b
3
b
2.5
2
c
10
1.5
0
1
C
CS
group
E6S
E13S
0.5
0
C
CS
group
E6S
E13S
Effect of Phlorofucofuroeckol (E6) and tetraphloroethol E (E13) on the memory deficit mice
induced by scopolamine on the stop-through latency and frequency (50 μg/kg 100sec)
표준화 필요성
일정한 효과(활성)를 함유한 원료 생산
 유효성분 함량이 가능한 높은 원료 생산
 원료의 수율 최적화 공정 확립
 기준규격에 적합한 원료의 안정적 생산
지표성분설정
•
물질 분리 및 정제
- 용매분획
-Column 분리
- 단일화합물
• 기능/지표 성분
설정
원재료표준화
제조공정표준화
• 식물 종
• 추출
•확보량
- 용매, 온도, 시간 등
• 사용부위
• 농축
• 채취시기
- 온도, 압력, 시간 등
• 원산지
• 건조
- 건조(VD, FD, SD 등)
• 분말
기능성평가
• 안전성(독성)평가
• 시험관 및
동물시험
• 인체적용시험
감태/구멍쇠미역
액상
소재화
분말/캡슐화
과립화
제조공정 표준화
구분
세부 사항
대량전처리
조건확립
원료 수세
비고
원료 측량
냉풍 건조
수분 함량 15% 내외
건식 분쇄
Pin mill, 4,000rpm, 10분 (250 micron이하)
원료 회수
유효 물질의
효율적인 추
출조건확립
고온고압추출
주정, 80oC, 15MPa, 1시간
원심 분리
한외 여과
액상소재화
주정 추출액
5oBrix
제조공정 표준화
구분
수율
세부 사항
비고
구멍쇠미역/감태
주정추출액 규격 (지표성분함량/100g)
주정 추출 수율
Tetraphloroethol E: 1.895 g
20%로 표준화
분말소재화
Phlorofucofuroeckol A: 1.325 g
주정 추출액
85 g
말토덱스트린 첨가
15 g
공정
균질화
분무건조
상온 냉각
주정추출물 분말
유입공기 온도 160℃, 배출공기 90℃,
아토마이저 속도 20,000 rpm, 시료유입 속도 30 mL/min
액상 소재화 공정
37oC 저장기간(주)
검사항목
0주
1주
2주
3주
4주
5주
총균수
(CFU/ ml)
-1)
-
-
-
-
-
주정추출물
색도차이
＊2)
＊
＊
＊
＊
＊
↓
pH
3.95
3.88
3.90
3.89
3.90
3.91
감태/구멍쇠미역 주정추출물
산도(%)
0.20
9
0.21
7
0.27
5
0.220 0.225
0.21
5
10% 첨가(100 g/kg)
관능적 특성
＊2)
＊
＊
＊
＊
＊
1) not detected, 2) 변화 없음
↓
부형제: maltodextrin, 2%
↓
구연산, 구연산나트륨, 비타민 C,
니코틴산아미드, 비타민 B2, 비타민 B6,
비타민 B12, 망고향, 고과당시럽 첨가
구분
세부사항
비고
저장성
총균수, pH, 산도
이상없음
안정성
층분리 현상 없음
안정함
↓
정제수 첨가, 혼합, pH 조정(pH 4)
↓
살균, 충전, 포장
기능성분
(100 mL당)
Tetraphloroethol E
Phlorofucofuroeckol A
190mg (구멍쇠미역)
133mg (감태)
분말 소재화 공정
분무건조 주정추출물분말
↓
입자 흐름성 조절
↓
캡슐레이션(충진)
↓
이물 및 미립자 제거
(air cleaning)
↓
캡슐 검사
↓
포장
구분
세부사항
스펙
주정추출물분말 85%
말토덱스트린 15%
안정성
흡습성 양호
기능성분
(100 mg당)
Tetraphloroethol E
Phlorofucofuroeckol A
비고
안정함
1.69mg(구멍쇠미역)
1.13mg(감태)
감사합니다.