研究室の紹介 Recent progress in aquaporin research • 発現制御 (expression) 分子種間 (among genes) 部位/分化特異性 (tissue/development specific) 環境ストレス応答性 (stress response) 形質転換系 (transgenic) • 活性制御 (activity) リン酸化 (phosphorylation) 分子間相互作用 (intermolecular interaction) 細胞内輸送 (cellular trafficking) • 個体形質との関連 (phenotype) 発現制御 Expression (Normalize to control (0 mM NaCl)) 4 HvPIP1;1 2 109 (control) 0h 0 mM/1 h 0 mM/2 h 108 1 HvPIP1:3 1/2 HvPIP1;4 HvPIP1;5 1/4 HvPIP2;1 1/8 HvPIP2;2 1/16 HvPIP2;3 0 mM/4 h 0 mM/8 h 107 0 mM/12 h 106 1h 2h 4h 8h 12 h 24 h 0 mM/24 h HvPIP2;4 HvPIP2;5 はるな二条 100 mM NaCl 109 (100mMNaCl) 4 100 mM/4 h 100 mM/12 h 106 100 mM/24 h (200mMNaCl) 0h 200 mM/1 h HvPIP1;1 2 100 mM/8 h 107 108 100 mM/1 h 100 mM/2 h 108 109 0h HvPIP1;2 Relative ratio Amount of transcript (copies/µg total RNA) 1010 HvPIP1;2 Relative ratio オオムギ根でのPIPアクアポリン10種のmRNA量 1 HvPIP1:3 1/2 HvPIP1;4 HvPIP1;5 1/4 HvPIP2;1 200 mM/2 h 200 mM/4 h 107 200 mM/8 h 106 200 mM/24 h 200 mM/12 h 105 var. Haruna-nijyo (salt tolerance: middle) 5-day old seedlings (PCP 52:663) 1/8 HvPIP2;2 1/16 HvPIP2;3 1h 2h 4h 8h 12 h 24 h HvPIP2;4 HvPIP2;5 はるな二条 200 mM NaCl Mild (100 mM) stress → No changes Severe (200 mM) stress → Mostly decrease However, in root hydraulic conductivity (Lpr) … (根水透過性) 1 LPr [10-6 m s-1 MPa-1] Salt tolerant var. K305 Salt sensitive var. I743 0.5 K305 I743 0 0 100 200 NaCl [mM] (4 hr after salt stress) Pressure chamber Sap flow: Jv Jv /A = Lpr (ψp - Y) sap flow (ml h-1 mm-2 root surface area) 発現量の多いPIPや発現変動が大きいPIP ・・・品種間で一致する傾向 全体的に塩感受異性品種で発現が多い (SSPN 57:50) A : total root surface area ψp: applied pressure Y : Yielding pressure 0.004 0.003 0.002 0.001 0 R² = 0.9764 0 0.1 0.2 Pressure (MPa) 0.3 0.4 33種類のイネアクアポリン プロファイル (東北農研他) PIP1;1 PIP1;2 PIP1;3 Related to cold stress TIP1;1 TIP1;2 Related to the flooding NIP1;1 (NIP1;2) SIP1;1 SIP2;1 RiceXPro TIP2;1 Lateral root NIP1;3 PIP2;1 ‘house keeping’ (CO2) PIP2;2 TIP2;2 TIP3;1 internodes & panicle neck (CO2) (H2O2) Putative ABRE in promoter NIP1;4 NIP2;1 (Si) (As) (H2O2) PIP2;3 PIP2;4 Sensitive to water stress PIP2;5 ‘rescue’ internodes & panicle neck PIP2;6 PIP2;7 (TIP3;2) TIP4;1 TIP4;2 TIP4;3 TIP5;1 NIP2;2 (Si) (As) NIP3;1 (B) NIP3;2 (As) (H2O2) NIP3;3 (As) (H2O2) NIP4;1 全ての器官に存在 (>105 copies/ μg total PIP2;8 RNA) 鱗被, 花糸、節間成熟部位 根に特異的 節、節間成熟部位 葉に特異的 葯に特異的 登熟中の種子に特異的 どの器官でも発現していない。 http://ricexpro.dna.affrc.go.jp/ における OsMIP familyの発現 → 例 シロイヌナズナPIP (資源植物科学研究所・森先生と) シロイヌナズナ孔辺細胞で発現が多いPIPの同定 AtPIP2;2, 2;3, 2;5, 2;8 遺伝子破壊株の気孔運動解析 3.5 (ΔPIP2;3) 3 Col #099862 (PIP2;3) 3.5 #117876 (PIP2;3-2) #072405 (PIP2;5) 3 #099089 (PIP2;8) (明所 → 暗所 での気孔閉鎖の時間経過) (ΔPIP2;5) Col #099862 (PIP2;3) #117876 (PIP2;3-2) #072405 (PIP2;5) #099089 (PIP2;8) 3.5 3 2.5 2.5 2.5 2 2 2 1.5 1.5 1.5 1 1 0 15 30 45 60 (ΔPIP2;8) Col #099862 #117876 #072405 #099089 (PIP2;3) (PIP2;3-2) (PIP2;5) (PIP2;8) 1 0 15 30 45 60 ΔPIP2;3とΔPIP2;5: 暗誘導閉口に関係ない 0 15 30 45 60 ΔPIP2;8: 閉鎖が早い(理由解析中) トマトアクアポリン (名大:白武先生の研究) RT-PCR TIP 8種 XIP 2種 NIP 8種 PIP 9種 SIP 2種 若い果実で多く発現するもの SiPIP2;3, 2;5など トマトに新規AQP XIP 2種発見 合計25種 アクアポリンタンパクの発現(組織/細胞内) Indirect immunofluorescense (間接蛍光抗体法) Alexa 647 (red) conjugated antirat IgG goat antibody Anti-HvPIP1s rat antibody (IgG) (common among HvPIP1s) HvPIP1s Alexa 488 (green) conjugated anti-rabbit IgG goat antibody Anti-HvPIP2;1 (or 2;2) rabbit antibody (IgG) (specific to each molecular species) HvPIP2s (明視野) 内皮 (抗PIP1s抗体) 根毛 中心中 皮層 後生木部 表皮 (抗PIP2;2抗体) (Overlay) (PCP 52:663) AtSIPタンパクの細胞内局在 → ER (イネPIPの発現部位) 免疫染色 (東北農研) 免疫前血清 Anti-OsPIP2;1 Anti-OsPIP2;5 OsPIP2;1、OsPIP2;5は、根の内皮細胞の内側(向心側)に多く局在する 免疫電顕 (秋田県立大学) 一次抗体:anti-Kar2 (Bip)、anti-SIP1s 二次:anti-(rabbit IgG) linked with Alexa488 免疫染色 (名大・前島先生) OsPIP1;3(根) OsPIP1;3(根) OsPIP1;1(根) OsPIP1;1、OsPIP1;3とも細胞内で原形質膜近傍とER膜近傍で検出 免疫染色・・・もとは免疫組織化学(化学発色または発光)が多かったが、現在は蛍光抗体が主流 免疫電顕・・・抗体につなげた金粒子を電顕で検出 環境ストレス応答性 (Stress response) 10 OsPIP2;5 8 6 4 2 0 -11 0 2 4 6 8 12 OsPIP2;1 10 OsPIP2;5 8 6 4 2 0 2.0 -11 0 2 4 6 (×106 copies mRNA/μg total RNA) 140 140 PIP2;5 mRNA Ep (4:00-8:00) 3.5 3.5 3.0 3.0 2.5 2.5 120 120 8 100 100 Ep 80 80 60 60 1.5 1.5 40 40 6 2.0 2.0 1.0 1.0 0.5 0.5 20 20 00 0.0 0.0 8/1011 8/11日 (6~8月)126/12166/16196/19236/23246/24 77/7167/16197/19207/20217/21227/22287/28307/30317/31 28/2 38/3 48/4 58/5 68/6 78/7 88/9 10 OsTIP1:1 1.5 1.0 0.5 0 2.0 OsTIP2;2 1.5 1.0 0.5 0 蒸散要求量 Ep (W m -2 ) OsPIP2;5mRNA 蒸散要求量Ep(W m-2) (x10 copies mRNA/ ug Total RNA) アクアポリン発現量 アクアポリン発現量 4.0 4.0 冠水 → → → 節間成長 ↓ ↑ TIP発現上昇 → 細胞伸長 光に反応するように見えが 実は蒸散要求(湿度)に応答 4.5 4.5 冠水適応に関与するOsTIPsの同定 (浮イネ Deepwater rice) 名大 Relative protein amount OsPIP2;1 (x 106 copies / 1μg total RNA) 12 mRNA amounts (x 106 copies / 1μg total RNA) mRNA amounts 根での発現におよぼす地上部の影響(イネ) 東北農研 Dry (RH=40~50%) Humid (RH=90%) 非 半 全 非 半 全 冠 冠 冠 冠 冠 冠 水 水 水 水 水 水 1日 3日 タンパク量 温度応答性(Temperature) 低温 Chilling (秋田県大) 25℃ So: Chilling tolerant rice Wa: Chilliing senxsitive rice → 4℃ → 25℃(Recovery) 高温 High temperature (名大) 低温ストレス応答 (イネアクアポリン) シロイヌナズナPIP2;3は高温に応答する イネPIP1;3は低温耐性と関連 低温で根の吸水量が減り、しおれる植物の事例 イネ (春季の低水温) ソラマメ 地上部 5ºC 5ºC Shoot 地下部 25ºC 5ºC Root → アクアポリンの機能と発現量が低温(冷温)によって低下する アクアポリンあたりの活性が下がる → どう対応するか? アクアポリンの数を増やして、細胞あたりの活性を維持する (耐寒性Figleaf Gourd(クロダネカボチャ)の場合) Days at low temp. Days at low temp. アクアポリン タンパクの量 (Western blotting) Chilling tolerant Chilling sensitive イネの吸水障害を克服する一つの方法 軽い脱水処理(浸透圧処理) → アクアポリンの発現量上昇 → 低温条件下での、吸水量低下が軽減 → 耐冷性強化 水輸送活性の制御 リン酸化サイトアミノ酸の置換 Substitution リン酸化Phosphprylation・・・活性化 0.4 水透過係数 Pf ( 10-2 cm/s) 抗リン酸化抗体によるリン酸化の検出 (名大) 0.3 0.2 0.1 0 果実肥大(吸水)時にリン酸化↑ Fruit riping 根の水透過性Lprとリン酸化(オオムギ) 根の水透過性はリン酸化を阻害 すると阻害される LPr [10-6 ms-1 MPa-1] Water PcPIP2:2 AlaAla (SerSer) AspAla AlaAsp AspAsp アミノ酸置換 0.8 0.6 リン酸化阻害剤 Sutaurosporine (kinase inhibitor) 0.4 0.2 0 DMSO (%) St (μM) 0.1 - 0.1 0.1 0.1 1.0 0.1 10.0 Oocyte swelling assay チューリップ 開花時にもリン酸化↑ Flowering アサガオ Kinase inhibitor 抗リン酸化抗体 抗PIP(全体)抗体 • 朝の開花前に活性化 • • • • 低温→高温で開花 花の細胞(特に花下部の細胞)が吸水 原形質型アクアポリン・・・恒常的発現 低温→高温でアクアポリンのリン酸化 (リン酸化されて、水輸送活性上昇) 分子間相互作用 heteromerization (First reported in Maize, Plant Cell 16:215. 2004) (ここではオオムギでの研究結果を示す) HvPIPs Single injection Relative volume 1.25 HvPIP1;1 HvPIP1;2 HvPIP1;3 HvPIP1;4 HvPIP1;5 HvPIP2;1 HvPIP2;2 HvPIP2;3 HvPIP2;4 HvPIP2;5 Water 1.2 HvPIP2s (2;1~ 2;5) 1.15 1.1 1.05 1 0 活性あり HvPIP1;2 or other HvPIP1s and negative control 活性なし 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Time (sec) Co-injection of HvPIP1s and HvPIP2s (水透過性) 活性化 RNAインジェクション量 Pf:吸水グラフの傾き(吸水速度)から算出する水透過性 HvPIP1s とHvPIP2sの共発現 → 活性化(Hetermelization) HvPIP1;x HvPIP2;x HvPIP2;x HvPIP1;x 分子種間相互作用の分子機構 ・・・ キメラ分子の作成 → N末が相互作用部位 N末 Water 1型 PIP1;2(10 ng) 2型 PIP2;4(2 ng) PIP2;4(2 ng) + PIP1;2(10 ng) PIP1;2(N2;4)(10 ng) PIP2;4(N1;2)(2 ng) PIP2;4(N1;2)(2 ng)+PIP1;2(N2;4)(10 ng) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 Pf ( x 10-2 cm/s) 1.4 1.6 1.8 2 Co-expression of HvPIP1;2 and HvPIP2;4 activated each others by two means: ① Translocation to the plasmamembrane ② Direct activation ┏ 検出用蛍光標識抗体 ┓ Fluorescence antibodies 抗HvPIP2;4抗体 抗HvPIP1s抗体 Single expression PIP2;4 PIP2;4 PIP2;4 Co-expression PIP1;2 HvPIP2;4-injection HvPIP1;2-injection PIP1;2 PIP1;2 PIP1はPIP2と共に膜へ移行して機能する Inactive HvPIP2;1 T229M can activate PIP2;1 via heteromerization Inactive HvPIP2;4 T229M can activate PIP1;2 via heteromerization Inactive HvPIP1;2 T238M can activate PIP2;4 via heteromerization Water PIP1;2(10 ng) PIP1;2T238M(10 ng) PIP2;4(2 ng) PIP2;4T229M(2 ng) PIP2;4T229M(2 ng) + PIP1;2T238M(10 ng) PIP2;4(2ng) ng)++PIP1;2T238M PIP1;2M238(10 ng) PIP2;4(2 (10 ng) PIP2;4T229M(2 ng) + PIP1;2(10 ng) PIP2;4(2 ng) + PIP1;2(10 ng) 0 0.5 1 Pf (x10-2 cm/s) 1.5 PIP2;4T229M ---- Thr 229 is replaced by Met. < Loss of water transport activity> PIP1;2T238M ---- Thr 238 is replaced by Met. < Loss of water transport activity> 2 2.5 活性調節機構 (共発現/分子種間相互作用) イネプロトプラスト 相互作を蛍光で検出 (秋田県大) 植物組織(オオムギ根:前出) 内皮 皮層 表皮 H2O 道管 <Apoplastic or Symplastic > Root hair PIP1とPIP2が共発現 主にPIP1s 主にPIP2s (HvPIP2;2) 分子間相互作用による活性制御を組織ごとに使 い分けている可能性 水輸送活性の調節 Internalization/Recycling haruna K305 I743 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Salt tolerance: low Salt tolerance: middle Salt tolerance: high 0 Lpr [10-6 m s-1 MPa-1] Lpr [10-6 m s-1 MPa-1] Barley Lpr after 100 mM NaCl (Time course) 4 8 12 16 Time [h] 20 24 Rice (Nipponbare) Lpr after 100 mM NaCl 2 1.5 1 No reduction of Lpr 0.5 0 0 4 8 12 Time [h] 16 20 24 Root hydraulic conductance (Lpr) is regulated by phosphorylation and possible trafficking of aquaporins in early phase of salt/osmotic stress Lpr of Haruna-nijo after salt (100 mM NaCl) or osmotic (177 mM sorbitol) stress 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 NaCl DMSO OA Lpr [10-6 m s-1 MPa-1] Lpr [10-6 m s-1 MPa-1] Isotonic sorbitol induced identical Lpr change 100 0 - 100 0.1 - 100 0.1 0.5 (mM) (mM) (μM) 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 NaCl DMSO OA wm 100 - 100 0.1 3 100 0.2 0.5 3 (mM) (mM) (μM) (μM) Protein-phosphatase inhibitor (Okadaic acid; OA) and enodcytosis inhibitor (wortmannin: wm) inhibit salt-induce Lpr reduction at 1 h after stress Root hydraulic conductance (Lpr) is regulated by phosphorylation and possible trafficking of aquaporins in early phase of salt/osmotic stress Lpr [10-6 m s-1 MPa-1] Lpr of Haruna-nijo after salt (100 mM NaCl) or osmotic (177 mM sorbitol) stress 0.4 0.3 0.2 Exocytosis inhibitor (brefeldin A : BFA ) inhibits temporal recovery of Lpr at 4 h after stress 0.1 0 NaCl DMSO BFA 100 0.1 - 100 0.1 5 Root hydraulic conductance (Lpr) is regulated by phosphorylation and possible trafficking of aquaporins in early phase of salt/osmotic stress Lpr of Haruna-nijo after salt (100 mM NaCl) or osmotic (177 mM sorbitol) stress Lpr [10-6 m s-1 MPa-1] 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Time DMSO MG132 1 - 1 0.1 5 2 - 2 0.1 5 4 - 4 0.1 5 8 - 8 0.1 5 12 - 12 0.1 5 Proteasome inhibitor (MG132 ) inhibits reduction of Lpr after stress > 4 h 24 - 24 0.1 5 Barley Lpr after 100 mM NaCl ot isotonic sorbitol/manitol リン酸化、細胞内局在、タンパク質合成/分解が 水透過性の浸透圧ストレス応答に関与している 処理 水透過性 リン酸化阻害剤 (ストレス処理前) 低下 エンドサイトーシス阻害 (1時間) 低下しない エキソサイトーシス阻害 (4時間) 回復しない ストレス解除 (4時間以降) 回復 タンパク質分解阻害 (ストレス下4時間以降) 回復 Salinity (Osmotic) stress Model Non-stress H2O Osmotic stress signal PIP aquaporin WM OA P Severe stress P BFA (<4h) Transient Pool Mild stress (>4h) Activated mRNA & Protein degradation MG132 Protein degradation Early Effects of Salinity on Water Transport in Arabidopsis Roots. Molecular and Cellular Features of Aquaporin Expression. Boursiac et al. Plant Physiology (2005) 139:790 Standard sol. GFP-LTP 100 mM NaCl 45 min 120 min 原形質膜マーカー タンパク PIP1;1-GFP PIP2;1-GFP Stimulus-induced downregulation of root water transport involves reactive oxygen species-activated cell signalling and plasma membrane intrinsic protein internalization. Boursiac et al. The Plant Journal (2008) 56, 207–218 Fluorescence recovery after photobleaching reveals high cycling dynamics of plasma membrane aquaporins in Arabidopsis roots under salt stress. Luu et al. Plant Journal (2012) 69:894 Selective regulation of maize plasma membrane aquaporin trafficking and activity by the SNARE SYP121. Plant Cell (2012)24: 3463 YFP CFP or FM4-64 merge mYFP:ZmPIP2;5 FM4-64 mYFP:ZmPIP2;5 mCFP:PMA2 (PM marker) Co-expression mYFP:ZmPIP2;5 mCFP::AtSYP121-Sp2 (変異AtSYP121) Co-expression SNARE: Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor Nature Cell Biology 14(10), 991-998 (2012) Background • Aquaporin determines Lpr. • Total root water uptake depends on root architecture and amount (including root hair). • Auxin changes root formation. • How about relationship between PIPs and Auxin? Nature 446, 621-622 (2007) Auxin response factor (ARF) proteins function as transcription factors controlling auxin-responsive genes. ARF7 plays a key role during lateral root formation and emergence. arf7: loss-of-function mutant ARF7 Bending induced lateral root formation Most PIPs decreased after bending. AtPIPsの発現量 PIP amounts water relations Auxin Receptor mutant (arf7) Bending Lpr-h: Root hydraulic conductivity (root pressure chamber) Lpr-o: Root osmotic conductivity (natural sap exudation) Lpcell: Cell hydraulic conductivity (cell pressure chamber) T1/2, Turgor, Ep GUS・・・PIP2;1 transcript accumulation mCHERRY・・・PIP2;1 protien accumulation mirror image to Auxin accumulation IAA reduced PIP2;1 expression and induce lateral root formation Auxin inhibitor increased PIP2;1 expression and reduced lateral root formation 形質転換体 水輸送との関係 Transgenic rice * Expression analysis <qRT-PCR> (WT: Nipponbare 24-day old) Absolute quantification • Mutant lines of OsPIP2;4 Root specific Internal standarads: eEF-1α:Eukaryotic elongation factor 1-alpha UBC: Ubiquitin-conjugating enzyme E2 Overexpression Antisense T-DNA (POSTECH, Korea) Acknowledgement: The vector for the transgenic rice plants were kindly provided by Dr. Ichikawa (NIAS) and Dr. Horiguchi (NIBB). Total OsPIP mRNAs in roots and Lpr in OsPIP2;4 overexpressor VS. WT Lpr 14 * 12 OsPIP2;4 Lpr (10-6 m s-1 MPa-1) 10 8 WT OsPIP2;4OE 6 4 * 2 0 WT NOTE: Less increases of total OsPIP mRNAs. OsPIP2;4OE P<0.05 Expressions of OsPIPs in roots of OsPIP2;4 transgenic lines ○ PIP1;1 PIP1;2 PIP1;3 PIP2;1 PIP2;2 ◎ ◎ ◎ ○ PIP2;3 PIP2;4 PIP2;5 PIP2;6 Root specificity PIP2;7 PIP2;8 eEF-1α UBC x6.4 P<0.05 P<0.001 Total mRNAs in the T-DNA line (root) 96% PIP2;4 OE Wt PIP2;4 T-DNA Other PIPs Other PIPs Compensative change against OsPIP2;4 mRNA. OsPIP2;4 ↓ ○ ↓ ↑ ↓ ↑ ↑ Root specificity Changes in roots Wild-type(WT) Osmotic stress /WT Non-stress PIP2;4 T-DNA line Non-stress /WT Non-stress PIP2;4 Overexpression line(OE) Non-stress ↓ ↓ ↑ /WT Non-stress Osmotic stress /PIP2;4 OE Non-stress ↓ ↑ ↓ ◎◎◎○ ↓ ↓ ↓ ↑ ↓ ↑ ↑ ↓ ↑ ↓ ↓ ↓ Up-regulation (P<0.05) Down-regulation(P<0.05) • Expression of root specific OsPIPs were co-regulated with OsPIP2;4. Simultaneous down-regulation under osmotic stress. Compensative regulation against OsPIP2;4 in transgenic lines. ↑ ↓ ↑ ↑ ↑ ↓ ○ ↓ ↑ ↓ ↑ ↑ Root spesificity Changes in roots Wild-type(WT) Osmotic stress /WT Non-stress PIP2;4 T-DNA line Non-stress /WT Non-stress PIP2;4 Overexpression line(OE) Non-stress ↓ ↓ ↑ /WT Non-stress Osmotic stress /PIP2;4 OE Non-stress ↓ ↑ ↓ ◎◎◎○ ↓ ↓ ↓ ↑ ↓ ↑ ↑ ↓ ↑ ↓ ↓ ↓ Up-regulation (P<0.05) Down-regulation(P<0.05) • Expression of root specific OsPIPs were co-regulated with OsPIP2;4. OsPIP1;3 may compensate OsPIP2;4 activity partially. Co-expression increased the activity in oocyte system. (Modified after Matsumoto et al. PCP 50:216 (2009)) ↑ ↓ ↑ ↑ ↑