IUI OLGULARINDA SPERM KROMATİN
KONDANSASYONU BOZUKLUKLARI
VE ANTİOKSİDAN İLİŞKİSİ
UTD Kongresi 2011 Antalya
Prof.Dr.Tülay İrez
DNA Kalitesinin önemi
• Erkekte DNA kalitesi üreme yeteneği ile
eşdeğerdir.
• DNA hasarlı sperm fertilizasyon
gerçekleştirebilir,ancak aneuploidy oranı yüksek
embriyo oluşumu, erken dönem gebelik
kayıpları,epigenetik değişimlere bağlı olarak
metabolik hastalık riski, çocukluk çağı kanserleri
gibi problemler halen araştırma konularını
oluşturmaktadır.
Sperm DNA hasarı oluşturan
mekanizmalar
* Anormal kromatin paketlenmesi
Manicardi et al., 1995, Sakkas et al., 1999
* Reaktif oksijen türevleri (ROS)
Sharma & Agarwal, 1996; Aitkin & Krausz,2001;
Agarwal & Said,2005; Lewis & Aitkin, 2005
* Sperm apoptozu
Sakkas D. et al. 1999
Shen H. et al 2000
Agarwal A. Et al 2003,2004,2007
Spermatogenezde histonprotamin degişimi
Spermde Kromatin Kondensasyonu
Protaminler fertilizasyonda
maternal histonlar ile yer
değiştirirler
Sperm chromatin condensation in
normal development
(15 % histone, 85% protamine)
Zini et al 2005
İnfertil grupta protamin-histon
problemi görülmektedir
Zzhang et al 2006
•
Sperm kromatin hasarı neden bir
problem olarak görülür
• Çok sayıda çalışma ile fertilite ile ilişkisi gösterilmiştir.
• Kromatin hasarlı babalardan doğan çocuklarda doğum
defektlerinde artış riski vardır.(RR 3.00)
Ngo et al., Int J Epi 2006
• Kimyasal boyalara maruz kalan babaların çocuklarında doğumsal
defektler görülmüştür.(OR 6.2)
• Hooiveld et al., Occup Environ Med 2006
• Böcek öldürücü ilaçlara(pestisid) maruz kalan babaların
çocuklarında anensefali riski artmıştır.(OR 2.5)
• Lacasna et al., Occup Enviro Med 2006
• Sigara içen babaların çocuklarında çocukluk çağı kanserlerinin
artışı. (OR 3.8)
• Ji et al J Natl Can Inst 1997
• ANORMAL KROMATİN PAKETLENMESİ IVF
SONUÇLARINI ETKİLEMEKTEDİR
•
•
•
•
•
•
•
Relationship between abnormal sperm chromatin packing and IVF results
M.V. Filatov1,3, E.V. Semenova1, O.A. Vorob'eva2, O.A. Leont'eva2 and E.A. Drobchenko1
1999.
Abstract
This study was initiated to determine the relationship between the fertilizing potential of spermatozoa
and abnormalities in the compact packing of their chromatin which occurs in the final stage of male
germ cell differentiation. Chromatin packing involves disulphide bridge covalent cross-linking. The
degree of packing was determined from the accessibility of DNA to a fluorescent dye, ethidium
bromide, following detergent treatment of the spermatozoa. The amount of dye bound was
determined by flow cytometry in the presence or absence of heparin, a polyanion which removes
only non-disulphide bridge-linked proteins. The results of a number of different sperm samples were
compared with their results following in-vitro fertilization, and a relationship between disordered
sperm chromatin packing and rates of embryo cleavage was observed. This study suggests that
abnormal chromatin packing in spermatozoa may contribute to male fertility.
Key words
chromatin packing ethidium bromide fertility disorder flow cytometry human spermatozoa
Protamine levels vary between induvidual sperm cells of infertile human
males and correlate with viability and DNA integrity
Aoki et.al 2006
• Sperm nuclear histone H2B:correlation with sperm DNA denaturation
and DNA stainability.
•
Zini et al 2008
• Genome-wide analysis identifies changes in histone retention and
epigenetic modifications at developmental and imprinted gene loci in
the sperm of infertile men
•
Hammoud et al 2011
• Anomalies in sperm chromatin packaging:implications for assisted
reproduction techniques.
•
Tarozzi et al 2009
Sperm Kromatin Kondensasyon
Testleri
•
•
•
•
•
•
•
Toluidin Blue (TB)
Chromomycin A3 (CMA3)
SDS+EDTA
Anilin Blue (AAB)
Acridine Orange
Feulgen
SCSA
Kromatin kondansasyonu
Morfoloji ve Kondensasyon
• Normal sperm morfolojisi ile kromatin
paketlenmesi arasında anlamlı ve negatif
korelasyon r = 0.40 (P = 0.001) ve r = 0.33
(P = 0.001 CMA3 ve AAB için
bulunmaktadır.
Franken DR et al. Andrologia. 31(6):361-6. 1999
30
20
20
MORFOLOJİ
30
10
MORFOLO
MORFOLOJİ
MORFOLO
Sperm Morfolojisi ve Kromatin
Kondensasyon defektleri
İlişkisi
İrez ve Avcı 2004
0
0
20
40
60
80
10
0
100
0
TB
TBK
AB
P= 0.01
20
40
60
80
100
Kondensasyon defekti
1.% 100
2.% 20
3.% 50
4.%70
5.%80
İrez, Avcı,Kuruş, 2005
Kromatin kondensasyonu
254 subfertil olgu CTF IVF
İrez ve ark 2006 unpublished
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Yaş>35
Yaş<35
mot >50
Mot<50
Mot<10
Mot=0
Morf>14
Morf<14
Kons>20
Kons<20
47
54
4
99
6
4
6
97
90
19
41.89 ±
40.50 ±
52.50 ±
36.02 ±
20.6 ±
15.25 ±
54.33 ±
31.80 ±
44.43 ±
17.33 ±
22.76
20.99
26.61
20.40
16.46*
18.39*
18.31
19.90*
20.42
18.20*
OAT grubunda sonuçlar
• Normo
• OAT
+varicocele
+smoking
-sm or vari.
Total
*p <0.05
**p<0.001
16
49
14
17
18
114
59.93±22.78
21.65±17.95*
25.70±19.02*
10.71±7.89**
21.87± 18.93*
İrez ve ark 2007
ICSI results (aniline blue
staining)2005-2006 CTF
(n=234)
• Chr. Cond. > 30 %
n
91
% Pregnancy
39
29-20
45
31
20-10
36
11
10-5 <5
27 35
3.5 0
T.Irez et al (unpublished)
The predictive value of sperm chromatin condensation test in
infertility laboratory
T.İrez ve ark 2007, ASRM
•
•
•
•
•
•
•
•
•
N=526 olgu
Fertil
Normospermik
Varikosel (+)
Varikosel (-)
Sigara (+)
Sigara (- )
Şiddetli
Asthenospermi
•
•
* p<0.05
** p< 0.01
n
Kromatin kondensasyonu
19
56.93±15.05
16
59.93±22.78
64
32.79±20.82*
426
41.85±21.29
164
38.40±20.54*
228
42.53±21.51
26
20.91±6.49**
Effects of Smoking Cigarette on Intrauterine Insemination Outcomes
T.İrez, P.Öcal, M.İdil, S.Kaleli, Y.Uyar, B.Aydogan, N.Erol, S.Sahmay,FIGO 2009
Smoker
Sp.conc (mil/ml)
Motility
Nor.morph(Kruger)
Prepared conc.
Leucocyte conc
Chromatin conden.
n=120
81.00±73.90
31.57±13.52
4. 65±3.99
7.85 ±9.75
2.98±0.87
27.25± 25.85
non smoker
p
n=125
74.19±40.00
33.96±14.67
5. 04±4.18
8.13 ±9.83
0.76± 011
49.13± 15.92
0.077
0.407
0.593
0.780
0.038
0.048
Irez et al 2009,FIGO
IUI Pregnancy rate
The Sperm Chromatin Dispersion Test: A Simple Method for the Determination of
Sperm DNA Fragmentation
JOSE LUIS FERNÁNDEZ*,,, LOURDES MURIEL*,, MARIA TERESA RIVERO*,,
VICENTE GOYANES*,, ROSANA VAZQUEZ AND JUAN G. ALVAREZ,
Sperm Halo test-SCD test
Sperm kromatin stabilite testi (SDS-EDTA)
ICSI uygulamasında fertilizasyon belirlemede
Kruger’e göre daha sensitif
SCD test ICSI sonuçları
T.İrez et.al. 2007
Pregnancy
N
Aniline blue
SCD 1
SCD 2
SCD 3
(+ )
19
35.50 ±21.70
36.00 ±10.23
51.70 ± 27.62
13.30 ± 23.67
(-)
20
34.77 ±24.31
14.33 ±11.41
63.00 ±25.13
23.77 ±28.15
p
ns
<0.05
ns
ns
SCD(Sperm
Chromatin Dispersiyon)
• Basit ,ucuz
• Asit denatürasyonu sonası nükleer
proteinlerin ortaya çıkması ve agoroz jelde
halo vermesi
• * SDS-EDTA ile benzer sonuçlar
Antioxidants and semen quality
Wong et al., F&S, 77, 491, 2002
•
•
•
•
•
108 fertile & 103 subfertile men
• Double-blind, randomized, placebo controlled
• 4 groups
– Zinc sulphate 66 mg, folic acid 5 mg
– Placebo + FA, placebo + Zn, Zn + FA, 2
placebos
• • Results
• ⇒ Zinc and folate: associated with ⇑ total normal
sperm
• count (74%) and ⇑ sperm morphology (4%)
Antioxidant and ICSI outcome
Greco et al., HR, 20, 2590, 2005
•
•
•
•
•
•
•
•
38 men: >= 15 % DFI
1 failed ICSI attempt
• 1gr Vit C & 1gr Vit E for 2 months
• 29 (76 %): decrease in DFI ⇒ 2nd ICSI attempt
• Results
No difference in FR, cleavage rate & embryo morphology
Significant ⇑ clinical PR (48.2 vs 6.9 %) and IR (19.6 vs
2.2 %
Antioxidant and IVF/ICSI outcome
Tremellen et al., Aust N Z J Obstet
Gynaecol, 47, 216, 2007
• 60 men with severe OAT
• • Randomized, double-blind placebo-controlled
trial
• • 3 months Menovit or placebo before IVF trial
• • Results
• No difference in FR & embryo morphology
• Significant ⇑ viable* PR (38.5 vs 16 %)
• * viable = > 13 weeks
antioxidants ↔ sperm DNA fragm &
decondensation
Menezo RBMOnline, 14, 418, 2007
Study-population
– >= 2 previous IVF-ICSI failures
– DFI & sperm decondensation (SCMC) before and after 90 days of Tt
– Tt: antioxidant vitamins + Selenium + zinc
• Results
⇒ decrease in DNA-fragmentation ( - 19.2 %)
⇒ Increase in sperm decondensation ( + 22.8 %)
• Comment
Vit C: able to open the cystin net – may interfere with paternal gene activity
L-Carnitine kombinasyonu(L carnitine,Co
enzyme,Fructose,Zn,Acetyl L carnitine,Folic acid,
C vit,Se,Citric acid)uygulaması ile ilgili preliminer sonuçlar
Fertil (26)
İnfertil (31)
p
Yaş
33.6 ± 3.9
34.1 ± 2.7
NS
FSH
5.8 ± 3.6
6.1 ±3.1
NS
E2
44.7 ± 8.9
52.2 ± 5.5
NS
VKI
24.1 ± 2.8
23.9 ± 4.5
NS
Irez ve ark 2011
Fertil grup (26)
İnfertil grup (31)
İnfertil tedavili grup(20)
Sperm konsantrasyonu
32.4±15.2
15.3±12.1
29.6±9.9*
Sperm motilitesi
52.3±16.8
26.1±10.2
39.5±8.8*
Sperm morfolojisi
4.9±2.3
2.8±1.9
3.7 ± 2.1
Kromatin kondensasyonu
68.1±6.3
38.4±7.1
45.4±5.7*
SDS-EDTA
42.4±5.6
15.8±3.3
27.3±6.8*
Gebelik(%)
100
0
15 *
Sonuç
• Sperm kromatin kondansasyonu infertil
hastaların takibinde kullanılabilir bir test
olmaya adaydır
• Kombine antioksidanların kromatin
kondansasyonu ve dekondansasyonu
üzerine olumlu etkileri görülmüştür.