Тема: Цитохром c оксидаза: история открытия, основы строения и функционирования.
Введение
Бесспорно, в любой момент времени на Земле происходит преобразование и перенос энергии.
Для живых систем это необходимое условие существования. Все процесс в биологических
системах затрачивают огромное количество энергии на упорядочивание внутренних процессов, а
ещё больше – на поддержание внешнего хаоса. И перенос электронов – это физическая основа
энергетической составляющей любой жизни. В животной клетке он осуществляется в
митохондриях.
Митохондрии сжигают молекулы пищи для производства АТФ путем окислительного
фосфорилирования, и они присутствуют практически во всех клетках организма животных, грибов
и растений. На электронных микрофотографиях наиболее яркими особенностями митохондрий
являются их обширные внутренние мембранные системы. Эти внутренние мембраны содержат
наборы мембранных белковых комплексов, которые работают вместе для сбора энергии, а затем
используют эту энергию для катализа производства большей части клеточного АТФ. В 20 веке
были выделены и исследованы белковые комплексы во внутренней мембране митохондрий,
которые передают электроны по дыхательной цепи и вырабатывают энергию. Всего известно 4
подобных комплекса, одним из которых является Комплекс IV или цитохром-с-оксидаза.
Глава 1. История изучения цитохром-с-оксидазы
Изучение клетки началось с изобретения микроскопа. Появилась клеточная теория, было открыто
ядро. Однако в клетках живых существ были найдены и другие структуры – «биобласты», ныне
известные как митохондрии. В 1890 году Ричард Альдман наблюдал их впервые для
цитоплазматической структуры, напоминающих бактерии, в самых различных видах
эукариотических клеток. Далее началось исследование структуры и внутренних процессов
митохондрий.
Цитохромоксидаза была открыта ирландским врачом и учёным Чарльзом Александром
МакМанном, который в 1885 году описал обратимые изменения в спектре поглощения при длине
волны в 605 нм, происходящие при окислении в клетках животных, что является характерной
спектральной подписью цитохромоксидазы. Однако его работы были раскритикованы
влиятельными физиологами Гоппе-Зейлером и Леви, которые постулировали, что МакМанн просто
наблюдал поглощение продуктов распада гемоглобина. В результате исследования этого фермента
прекратились более чем на 30 лет, пока в 1923 году Ханс Фишер не подтвердил результаты
МакМанна.
Дальнейшие исследования этого фермента были продолжены немецким учёным Отто Варбургом.
В своей работе он ингибировал дыхание в суспензии дрожжей при помощи CO, а затем
получал спектры поглощения, снимая ингибирование путём облучения когерентным пучком света
с
разной длиной
волны.
Из
полученных
данных
следовало,
что
ингибируемый фермент — гемопротеин, в котором гем находится в комплексе с CO. Варбург
связал новый, неизвестный белок с функцией клеточного дыхания и применил к нему
используемый им с 1924 года термин «дыхательный фермент». Работа была опубликована в 1929,
а в 1931 Варбург получил за неё Нобелевскую премию по физиологии и медицине с формулировкой
«за открытие природы и механизма действия дыхательного фермента».
Немалый вклад в понимание природы комплекса IV внёс британский учёный Дэвид Кейлин. В 1939
году, в совместной работе с Е. Ф. Хартри он обнаружил неизвестный ранее цитохром, получивший
название a3, который обладал способностью окислять цитохром c. Новый цитохром обладал тем же
спектром поглощения, что и загадочный дыхательный фермент Варбурга, а также ингибировался
под действием СО и KCN. В своей работе Кейлин ввёл в обиход название цитохром c-оксидаза,
предложенное Малкольмом Диксоном в 1928 году. Варбург и Кейлин длительное время спорили о
природе циохромоксидазы: Варбург считал, что кофактором этого фермента может быть
только железо, в то время как Кейлин полагал, что это медьсодержащий белок. По прошествии лет
оказалось, что оба великих учёных были правы: в состав цитохромоксидазы входит как
железосодержащий гем, так и атом меди.
Механизм
связывания
цитохромоксидазой
кислорода
исследовал
американский
биохимик Бриттон Ченс, который в середине 70-х годов двадцатого века, используя передовую
технику ЯМР и спектроскопии при
низких
температурах,
обнаружил
ферментсубстратный комплекс цитохромоксидазы — аддукт гема a3 с молекулярным кислородом.
В 1977 году финский учёный Мартин Викстрём показал, что цитохромоксидаза в процессе своей
работы перекачивает протоны через мембрану, чего долгое время не мог принять
создатель хемиосмотической гипотезы, Питер Митчелл. Тем не менее накапливавшиеся
экспериментальные данные свидетельствовали в пользу правоты Викстрёма, и позже Митчел
признал свою ошибку.
Первые попытки выделить фермент предпринимались, начиная с 1941 года: поскольку тогда ещё
не было разработано процедур для выделения больших мембранных белков, то приходилось
действовать путём проб и ошибок. В первых процедурах выделения использовались соли желчных
кислот, что вызывало большие потери активности. Появление неионных детергентов
наподобие Triton X-100 вызвало новый подъём в этой области с 1966 по 1974 год и позволило
получить первые чистые препараты. Первая трёхмерная структура с атомным разрешением
комплекса появилась чуть позже, в 1995 году.
Глава 2. Внутреннее устройство фермента цитохром-с-оксидазы
1. Структура ферментного комплекса
Цитохром-с-оксидаза (E.C. 1.9.3.1 или комплекс IV) входим в группу комплексов дыхательной цепи,
который, как и другие ферменты этого рода, является интегральным белком, построенным из
большого числа полипептидов и содержащим большой ряд простетических групп (группы гемов).
Комплекс IV является конечным ферментом дыхательной цепи митохондрий.
Состоим цитохром-с-оксидаза из 13 субъединиц у млекопитающих (рис.1) и имеет молекулярную
массу 204 кДа. Редокс-активные центры фермента располагаются в субъединицах Ι (57 кДа) и ΙΙ (26
кДа). Остальные, по-видимому, играют вспомогательную роль, способствуя регуляции активности
или сборке трех субъединиц, составляющих ядро фермента.
(а)
(б)
Рис 1. (а) – Структура комплекса IV и расположение его простетических групп, (б) Молекулярная структура цитохромоксидазы. Переносчики электронов локализованы в субъединицах I и II,
как показано.
Цитохромы это группа редокс-активных веществ, которые претерпевают быстрое окисление и
восстановление. Они обладают большим сродством к электрону, поэтому располагаются
преимущественно в конце электрон-транспортной цепи. Цитохром с выполняет функцию
приёмника электронов от комплекса III и передаёт на цитохром-с-оксидазу. Структуру цитохрома с
можно увидеть на рисунке 2.
Рис 2. слева - Трехмерная структура цитохрома c (зеленый) с молекулой гема, координирующей
центральный атом железа (оранжевый), справа – скелетная структурная формула цитохрома с
Субъединицы Ι и ΙΙ делят между собой все редокс-центры комплекса IV . Субъединица ΙΙ содержит
место связывания цитохрома с, образованное кольцом отрицательно заряженных аминокислотных
остатков (𝐴𝑠𝑝136 , 𝐴𝑠𝑝187 и 𝐺𝑙𝑢227). Также она содержит медьсодержащий центр 𝐶𝑢А , состоящий из
двух ионов меди, связанных с атомами серы цистеиновых остатков, аналогично железосерным
кластерам.
Субъединица Ι содержит медьсодержащий центр 𝐶𝑢𝐵 , состоящий из иона меди, который вместе с
ионом железа гема 𝑎3 формирует железомедный кластер (Fe-Cu) центр. Также туда включён и
остаток тирозина, ковалентно связанный с одним из гистидиновых лигандов. (гем-медный
биядерный центр), расстояние между атомами металлов которого составляет 4,5 𝐴̇. У гема 𝑎3
отсутствует один из аксильных лигандов, что позволяет связывать кислород.
Рис 3. Главные реактивные центры цитохром с оксидазы
Также цитохром с-оксидаза содержит 2 протонных канала, показанных на рисунке 1 слева, K-канал
и D-канал. Оба канала проходят через субъединицу I цитохром c-оксидазы и образованы
системой полярных аминокислотных остатков и связанных с ними молекул воды. Точная
структура каждого из каналов варьируется в зависимости от
2. Процесс функционирования комплекса 4 при переносе электронов
Цитохромоксидазная реакция состоит их множества стадий, её можно даже разделить на
отдельные механизмы. Она принимает на себя около 90% всех реакций захвата кислорода в клетке.
Рис 4. Реакция О2 с электронами в цитохромоксидазе
Комплекс IV цитохром-c-оксидаза катализирует перенос 4 электронов с 4 молекул цитохрома с на
O2, используя при этом 4 протона для образования воды в ферменте, и перекачивает при этом
4 протона в межмембранное пространство. Суммарно затрагивается 8 протонов, что отражено в
реакции (1) ниже.
Сначала цитохром с связывается с кольцом отрицательно заряженных аминокислотных остатков на
субъединице ΙΙ. Далее от цитохрома электроны поступают на медьсодержащий центр 𝐶𝑢𝐴 . Через
гем a электроны переносятся на Fe-Cu биядерный центр, то есть этот гем переносит четыре электрона
на молекулу O2, удерживаемую в активном сайте двуметаллического кластера. В биядерном центре в
несколько стадий (рис. 5) происходит восстановление связанного молекулярного кислорода.
Рис 5. Схема восстановления молекулярного кислорода в биядерном центре цитохрос с-оксидазы
На первой стадии молекула кислорода связывается с восстановленным ионом железа 𝐹𝑒 2+ гема
𝑎3 . Образуется смешанный пироксокомплекс, который включает связи с железом и медью. На
следующей стадии происходит перенос четырёх электронов и разрыв связей в молекуле
кислорода: один атом кислорода остаётся связанным с ионом железа, второй связывается с
ионом меди, за счёт чего образуется новое редокс-состояние. Два электрона переносятся на
молекулу кислорода с иона железа (𝐹𝑒 2+ → 𝐹𝑒 4+ | 𝑂0 → 𝑂2− ), один электрон – с иона меди
(𝐶𝑢+ → 𝐶𝑢2+ ) и ещё один – с тирозина (𝑇𝑦𝑟𝐻 → 𝑇𝑦𝑟 ∙ ). На третьей стадии происходит перенос
одного электрона от цитохрома с и одного протона из матрикса, восстанавливается тирозин. На
четвёртой стадии переносится ещё одна пара из электрона и протона и восстанавливается уже
ион железа (𝐹𝑒 4+ → 𝐹𝑒 2+) и при этом формируется гидроксил. На пятой стадии присоединяется 2
электрона и 2 протона при этом образуется 2 молекулы воды, ионы биядерного центра
восстанавливаются и цикл может начинаться заново.
Суммарную реакцию переноса электронов через гем-железный биядерный центр и перенос
протонов из матрикса в межмембранное пространство митохондрий можно записать следующим
образом:
4𝑐𝑦𝑡 𝑐 (𝐹𝑒 2+ ) + 𝑂2 + 8𝐻𝑁+ → 4𝑐𝑦𝑡 𝑐 (𝐹𝑒 3+ ) + 2𝐻2 𝑂 + 4𝐻𝑝+ .
(1)
При функционировании цитохром с-оксидазы перенос протонов из матрикса в межмембранное
пространство реализуется с участием двух механизмов «окислительно-восстановительной петли»
и «протонного насоса». Электроны для восстановления молекулярного кислорода поступают из
межмембранного пространства митохондрий, протоны - из матрикса. Это эквивалентно переносу
двух положительных зарядов из матрикса в межмембранное пространство. Таким образом,
восстановление кислорода в биядерном центре сопровождается генерацией разности
электрохимического потенциала (механизм петли). В дополнение к этому, перенос двух электронов
в комплексе IV сопровождается трансмембранным переносом двух протонов из матрикса в
межмембранное пространство по механизму протонного насоса. Именно D- и K-каналы
осуществляют транспорт протонов.