=+ 卷 *期
*+++年(月
微
生
物
学
报
!"
#
$%&
"
’
(
)
&
(
*
(
&
"
$,
&
&
"
$
+
T"
D#
=+ !"#
*
S0
U
/
6
O
/
V *+++
"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
"
工程菌人溶菌酶的纯化和性质 !
叶 军 钱世钧
（中国科学院微生物研究所
提
要
北京 *)))$)）
将人溶菌酶工程菌株在发酵培养、菌体经超声破碎、变性和复性后所得的粗酶液经
／78。此酶的最适 .9
,-.
/
0
1
1
&
2
"
34阳离子交换柱层析，得到电泳纯的酶，比活达到 5$)))6
为:;%；等电点为 $;+*；对溶壁微球菌的米氏常数 !7<);)=**78
／7>；
:)? 保温 =) 7@
3，酶
活力剩余5$;=A。! 末端氨基酸序列除了第一个 B0
C，其余5个与预期相符。一些重金属离
／> 的浓度下 E6(F 可使该酶完全失活。
子对酶的活性影响不尽相同，在);)* 7"
D
关键词
重组人溶菌酶，纯化，性质
（*+++）
分类号 G%% 文献标识码 H 文章编号 )))*
&
:()+
)*
&
))%%
&
%+
天然人溶菌酶主要存在于人奶、人胎盘和唾液等中，不易提取，且价格昂贵。而通过
人工合成基因，用微生物发酵法生产人溶菌酶将为其在食品、医药等方面的广泛应用提供
有利条件。本实验室已经成功地合成了人溶菌酶基因并构建重组质粒［*!(］，在 "#$
%
&
’
中得到了高水平表达［=］。本文在此基础上对该酶进行了纯化，得到 4I4
&JHK, 纯的酶，
并对其性质作了一些研究。
! 材料和方法
!#
! 菌种
工程菌株LMJ
&9>N，由本课题组构建。
!#
" 仪器和试剂
,-.
/
0
1
1
&
2
"34 阳离子交换剂、卵清溶菌酶、溶壁微球菌（(’
$
)
%
$
%
$
$
*
+&
+
%
.
’
/
0
’
$
*
+）均
,
为4
@
O
/7O
Q
@
O公司产品，
H7.P"
&
87O公司产品。测定等电点的标准蛋白及电泳装置为 JP
D
@
3
0为 >RM 公司产品。其它试剂均为国产分析纯试剂。
!#
# 菌体制备、粗酶液的提取及酶活性的测定方法
见参考文献［=!5］。
!#
$ 人溶菌酶的纯化
将粗酶液经冷冻干燥浓缩，对 );)*7">／>，
.9%;) 的柠檬酸&柠檬酸钠缓冲液透析，
再通过经上述缓冲液平衡的 ,-.
/
0
1
1
&
2
"34 阳离子交换柱，用 )!*7">／>!OE
D进行梯度
洗脱。收集活性部分的下柱液，用聚乙二醇反透析浓缩，利用 4I4
&JHK, 检查纯度。
!#
% 蛋白含量和等电点测定
［ ］
蛋白含量用 S"
D
@
3
&
0
3
"
D法测定 % 。等电点测定参照文献［:］进行。
.P
!
“八五”国家科技攻关项目（
!"#
$%
&
’((
&
)%
&
)(）
收稿日期：
*++’
&
)’
&
*$，修回日期：
*++’
&
*(
&
(%
微
JT
生
物
学
报
#( 卷
! 结果
!!
" 酶的分离纯化
按材料和方法所述进行分离纯化，洗脱曲线见图"，纯化结果见表"。从结果可看出，
收率为#$%&，纯度提高了"’$(倍。)*)
+,-./ 检查结果见图’，为一单一泳带。
表" 工程菌人溶菌酶的纯化
01
2
3
4" ,5
6
7
8
7
9
1
:
7
;
<;
8=5>1
<3
@
;
A
6
;>4
<B
7
<
4
4
6
4
C2
1
9
:
4
6
7
5> !"
#
$
%
&
?
?>48
步
骤
总活力／5
总蛋白／>B
比活／
（5
／>E）
纯化倍数
收率／&
)
:
4
@
D
0;
:
1
31
9
:!
0;
:
1
3D
6
;!
)D
4
9!
1
9
:
,5
6!
8
;
3
C
-9
:!
6
4
9!
F6
5C
44
<
A
?>4
"$GH"IJ
K($J
#KJK
"$I
"II
/LD
6
4
@
@
+
M
;
<)
K
"$(
K%III
"’$(
($"H"I
#$%
图" 人溶菌酶纯化曲线
N
7
" FO
6
;>1
:
;
6
1
8:
O
4=5>1
<
B!
B
DO?;
3
@
;
A
</LD
6
4
@
@
+
M
;
<)
?
?>4;
’’%I；
"!
’!酶活 /<
A
9
:
7
P
7
:
?>41
?!
图’ 人溶酶酶的 )*)
+,-./
N
7
’ )*)
+,-./;
8:
O
4=5>1
<3
@
;
A
B!
?
?>4
卵清溶菌酶
（
/B
7
:
43
@
;
A
"!
BQO
?
?>4"K$#R*）；
（"K$GR*）!
’!人溶菌酶 0O
4=5>1
<3
@
;
A
?
?>4
!!
! 酶的最适反应温度
选取不同温度条件，测定纯酶活性，结果表明，酶的最适反应温度为KJS（图#）。
!#
$ 酶的最适反应 %&
选择不同缓冲液配制底物溶液，浓度为I$’ >B
／>E，其它条件不变，测定酶活力。结
果见图K。在磷酸缓冲液和磷酸氢二钠+柠檬酸缓冲液中的最适反应 D= 均为 T$J，在
06
7
@
+=F
3缓冲液中的酶活性较其它缓冲液为高，最适反应 D= 为%$I。各种缓冲液所显示
的最适反应 D= 略有差别。在一定范围内，该酶在 06
7
@
+=F
3和磷酸氢二钠+柠檬酸缓冲液
中对 D= 敏感程度较差，而在磷酸缓冲液中对 D= 敏感程度最大。
H期
叶
军等：工程菌人溶菌酶的纯化和性质
B@
图! 人溶菌酶反应最佳温度
图7 人溶菌酶的最适反应 ’1
"
#
! &’
(
#)*)(
+)’
+
,
(
*
,
+.
/(
0
+1*)23
5
.
6
$%
4
4)+
"
#
7 &’
(
#
)*),
+
8
(
#
.
2’1.
/(
0
+1*)23
5
.
6
$%
4
4)+
9-:1;&7<
8
#
(
,
(
+；
:%
9-:1;&7<9-1:;&7；
!%
=,
#
5
<1>
3%
!%
" 酶的热稳定性
将等量酶液分别置于不同温度下!? )#
2，冷却后于 !@A 按常规方法测酶活性，结果
见图B。酶在7BA以前稳定性较好，而在C?A加热!? )#
2，酶活剩余7DE!F。
!%
# 等电点测定
利用聚丙烯酰胺凝胶电泳法，
G)’0.
3
#
2
+ 的 ’1 范围是 !!H?，测得此酶等电点为
DEIH。
!%
$ 9<末端氨基酸序列测定
利用北京大学生命科学学院 GJK7IH 型蛋白测序仪测得酶的 9<末端 B 个氨基酸依
次为 L+
(、
M4
5、
N3、
;0
+和 O
3
*，除了 L+
(外，其它氨基酸与人工合成 P9G 序列所预期的
9<氨基酸顺序一致。第一个 L+
(是由于 P9G 序列中起始密码子 G=O 也被翻译所至。
!%
% 酶的米氏常数
以 !"
／)M 的
#
$
%
#
%
#
#
&
’(
’
%
*
+
"
,
"
#
&
’ 为酶的底物，分别配制 ?EH、
?E:、
?E!、
?E7、
?EB)$
)
浓度，测定酶活力，用双倒数法作图（图C），得到 .)Q?E?!HH)$
／)M。
!%
& 金属离子对酶活性的影响
选取不同金属离子分别加入酶溶液，终浓度为 ?E?H).M／M 时测定酶活力，结果见表
:。结果表明，以上各种离子都对酶活力有影响，其中 >*:R 最显著，酶活力全部丧失。
表! 一些金属离子对人溶菌酶的影响
=S
3
+: =0
++
/
/
+
8
(
5.
/5
.)+#
.
2
5.
2(
0
+1*)23
5
.
6
4
4)+
离子K
.
2
相对活力／F
V+%
8
(%
9.#
.
2
>*:R
"+!R
T2:R
>U:R
>.R
1$:R
9#R
L2:R
>-:R
H??
?
!BE@
7:EB
7@EB
@HE7
@BE?
@DEC
@DEC
D?E?
微
!F
生
物
学
图! 人溶菌酶的热稳定性
报
AN 卷
图6 双倒数法测人溶菌酶的米氏常数
"
#
! &’
(
)*+
,
.
/
#
0
#
+’
(’3*.
40
,
+
5
$%
12
1
1*(
"
#
6 7
#
4
(8
(
.
9
(
)
:;
3
)
<=
0
+
-+
2’
(>3*.
40
,
+
5
$%
1
1*(
! 讨论
在工程菌?@;
:>0
1表达的人溶菌酶以不溶性的、没有生物活性包涵体形式积累，这对
于获取有活性的酶带来不少困难，但对酶的纯化却是非常有利的。在包涵体的变性、复性
过程中去除了很多杂蛋白，所以经一步离子交换层析即得到电泳纯的人溶菌酶，纯化步骤
很简单。我们曾利用凝胶过滤，但效果不如离子交换层析。因为凝胶过滤的上柱体积要
求很小，而粗酶液的体积达ABB!CBB *7，不易浓缩。
［E］
天然人奶溶菌酶的最适 => 为6DA!
，与基因工程人溶菌酶（以下简称工程酶）十分
接近。该工程酶的热稳定性较鸡卵清溶菌酶和天然人溶菌酶差。从结构上和焓值!> 的
分析［F］表明，人溶菌酶的热稳定性高于鸡卵清溶菌酶。而工程酶系从包涵体经变性、复
性而来，蛋白质重折叠后的构象可能与天然的人溶菌酶有一定差异，对酶活性区域无影
响，而对其热稳定性产生影响。
／7 即可使该
不同的金属离子对工程酶的活力影响各不相同。G3HI 浓度为 BDBJ*+
0
H
I
I
H
I
H
I
酶完全失活；而相同浓度的 G. 、
K# 、
L4 对酶活力的影响远远小于 G3 。G3HI 对该
酶影响很大，有文献报道 G3HI 可在 JBBM=>E 时催化自由硫氢基的氧化，引起溶菌酶分
子间、分子内二硫键的改变［N］，使酶不能维持稳定的构象，从而丧失活性。
参
［J］ 钱世钧，于
考
文
献
颖，田开荣等%生物工程学报，
（J）：
JNNC，
"#
AC!AF%
［H］ 矫庆华，钱世钧，叶
军等%生物工程学报，
（J）：
JNNE，
"!
JJJ!JJA%
［A］ 郭良栋，钱世钧，叶
军等%微生物学报，
（J）：
JNNE，
!$
!A!!E%
［C］ 钱世钧，陈
军等%生物工程学报，
（增刊）：
JNN6，
"%
H66!H6F%
欣，叶
［!］ 7+8)
P+
3
,
(
/
)
+
3
".
)
)Q7!
"#
$%
&’
(
)
$*+
!, ，
JN!J，
"&!：
H6!!HE!%
1O>，
$’K?，
［6］ 张树政，孟广震，何忠效主编%酶学研究技术%北京：科学出版社，
JNFE%
JFE!JNC%
［E］ @.
)
)
G’
.
4R
.
4PG，
S’
.
4
.
4
#T L!
"#
$%
-.
/
+’
(
)
/
+
!,’
(
)
2，
JN6N，
"#!：
!N!6!%
1P L，
0+
1
［F］ ;.
)
(
0QO，
@
)
#
(
(
0
,?@，
L.
(
,U!
"#
$%
’
(
)
/
+
!,’
(
)
2-/
"
#，
JNEH，
%’$：
HFF!HN6%
0+
1
［N］ &+*#
（H）：
5
.8.>，
V.*.
R
.>，
&.
4
#
.8.T!
"#
$%
&’
(
)
/
+
!, ，
JNN!，
""$
A6N!AEA%
$
E期
叶
军等：工程菌人溶菌酶的纯化和性质
<S
!"#$
%
$&’($)*’*+!#)!,#($,-)%."/’*01-)21/,
#$%&!
$*,*3$*,,#,+4’&(,#$"/ !"
A%B
C, D+
/
,3*
+
C,
$
（!
"
#
$
%
$
&
$
’(
+
,
(
%
(
.
(
12
%
"
’
#
’3+
45
’60(
+
%
’
"
+
’
#，
8
’
%
%
"/ E@@@;@）
)*%
/
0，
)7
9
’5
6
7
8
9
:
7 5##
F
’
/
+
,’
*
%373
=!GHI
=
C
"
%*C2/
,0
#
J
’
*
%&
"
C
4
%%
,
J
(%
,1
+
,
%
%
"
%
4F
/
&
’
%
"
+
=
9
6
62%，
62%#
+
(
.
% K/
-9
C
"
+
(
+
%
4F
*
"
#2/
’
#
"
/
,&
/
’
+
#
,+
#
,
%
L
&
*
/
,1
%#
(IL9
"
%
=
M
#
,3:
5*
%#
’
+2C2
C2 :;
6&
1
9*6#
9
，
"
%
/
&
’
+
#
,’
%29
%
"
/
’
C
"
%/
,49N#
(’
*
+
-0
#
J
"
%O<P/
,4QR< "
%
%
&
’
+
8
%
0
5*
%+
#
%
0
%
&
’
"
+
&9
#
+
,
’
6
62%K%
9
6:
／2U:
/
,4<2#
(’
*
%%
,
J
#
"*%
+
,
(
+
(
+
+
&
#.
#
(
5
’
%
=
$
%
+
&
#+
-@R@TEE21
5*
%’
*
%
"2/
0’
/
=
+
-9N;RSE，
62%(
0
F
+
0
+
’
(’
*
%%
,1
+
,
%
%
"
%
4%
,
J
-2#
"
%%
,
+
F
0
%’
*
/
,*
%
,%
+
’
%0
#
J
,4*C2/
, 2+
0
V
6#
62%+
1
1 K*
6
62%/
%
L
&
%
’/
,X%
’/
’’
*
%(
+
"
’:
0
#
J
5*
%%
C
%
,
&
%#
(</2+
,
#/
&
+
4
-+
,.=
%
,4+
-/2%/
-4
%
+
%
4，
9
6
62%:
W
1,
／U&
5*
%/
(
(
%
&
’
-#
(#2%2%
’
/
0+
#
,#
,’
*
+
-%
,
J
"
%*
#K,:
)C?Y #
(@R@E22#
0
#
C,4&
#29
0
%
’
%
0
62%K%
6
+
,
/
&
’
+
8
/
’
%’
*
%%
,
J
62%:
;<
8
@
6 Z%
&
#2F
+
,
/
,
’NC2/
,0
#
J
!C
"
+
(
+
&
/
’
+
#
,，
!
"
#
%
"
’
+
%
6
62%，
9
=>?
（.#:
!
"
#
%
&
’#
()*
+
,
%
%./
’
+
#
,
/
0!
"
#
"
/2-(
#
"3
&
+
%
,
&
%/
,45%
&
*,
#
0
#
8
%
0
#
,
’
;<
=
>??
=
@<
=
@?）
$
1
1
67%
92%
!