Comprendre la composition et les propriétés de la membrane plasmique Comment font les chercheurs? Méthodes essentielles dans la compréhension des TD de Biologie Cellulaire 1 Sommaire des techniques Voici l’essentiel des techniques qui se rapportent aux différents TD résumé en 16 fiches Voici un lien d’accès au portail moodle Univers-cell si vous souhaitez en savoir plus ou vous entraîner : https://moodle.univ-lyon1.fr/course/view.php?id=1253 Fiche n°1 : La culture Cellulaire – TD n°2,4, 5 Fiche n°2 : Le SDS-PAGE – TD n°1 Fiche n°3 : L’anticorps – TD n°2, 4, 5 Fiche n°4 : La fluorescence – TD n°2, 4, 5 Fiche n°5 : La microscopie à épifluorescence – TD n°2 Fiche n°6 : L’hybridation somatique – TD n°2 Fiche n°7 : Le FRAP – TD n°2 Fiche n°8 : La radioactivité – TD n°3 Fiche n°9 : La microscopie électronique à transmission – TD n°3 Fiche n°10 : Le marquage à l’or – TD n°3 Fiche n°11 : L’Immunofluorescence indirecte – TD n°4, 5 Fiche n°12 : La microscopie confocale – TD n°4, 5 Fiche n°13 : Le fractionnement cellulaire – TD n°4 Fiche n°14 : Le western blot – TD n°4 Fiche n°15 : La transfection – TD n°4 Fiche n°16 : L’ARN interférent – TD n°4 p.3 p.4-5 p.6-7 p.8 p.9 p.10 p.11 p.12 P.13 P.14 P.15 p.16-17 p.18 P.19-20 p.21 p.22 Comment étudier les propriétés des cellules ? Fiche n°1 La culture cellulaire Principe général: technique utilisée pour faire se multiplier des cellules hors de leur organisme. La manipulation se fait sous poste de sécurité microbiologique, PSM (environnement stérile). fibroblastes Culture primaire : 1- le tissu est disséqué 2- les cellules sont dissociées 3- Elles sont ensemencées dans un support (boite de pétrie, flacon) avec un milieu approprié et à une température de 37°C Remarque : les cellules vieillissent et ne peuvent se garder indéfiniment Cellules épithéliales Lymphocytes T Lignée cellulaire: cellules immortelles (cellules transformées, tumorales) 1- les cellules prolifèrent jusqu’à remplir tout le support 2- les cellules sont resuspendues et dissociées 3- elles sont réensemencées en densité plus faible dans un nouveau support dans un milieu approprié et à une température de 37°C Comment analyser les propriétés des protéines membranaires ? Le SDS-PAGE Fiche n°2 1/2 Principe général: le Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis permet de séparer des molécules chargées électriquement selon leur masse moléculaire. - - - protéine SDS - - sens de migration 1- Les protéines sont solubilisées et détanurées par le SDS, détergent anionique (-). Elles perdent alors leur conformation tertiaire 2- Du DTT est ajouté dans le tampon pour réduire les ponts disulfure et séparées les chaînes peptidiques reliées par ce type de liaison 3- les protéines sont déposées dans un puit du côté de la cathode (-) sur un gel polyacrylamide qui se comporte comme un tamis moléculaire en ralentissant la diffusion des protéines de forte masse moléculaire. Un champ électrique est alors imposé 4- les protéines migrent vers le bas du gel en direction de l’anode (+) Révélation des protéines après l’électrophorèse: 2 méthodes 2/2 Les protéines sont révélées grâce à la présence de TCE (cf TP) ou équivalent dans le gel Les protéines sont révélées par le bleu de Coomassie qui se lie aux acides aminés basiques (arginine) Le chemidoc émet des UV qui permettent aux tryptophanes des protéines d’émettre une lumière visible en présence de TCE Comment observer la localisation de protéines dans une cellule? Fiche n°3 L’anticorps 1/2 Principe général: les anticorps produits par les lymphocytes B (plasmocytes) sont utilisés en biologie pour reconnaître des épitopes exprimés sur les antigènes. 1- Les immunoglubolines sont en forme de Y, possèdent deux sites de fixation pour un antigène (paratope) au niveau de la région variable (extrémité des deux branches) 2- pour la méthode de production des anticorps : cf cours d’Immunologie 2/2 Préparation des anticorps pour la biologie Anticorps primaires récupérés du lapin après injection de l’antigène purifié anticorps Iaire anti-A Anticorps secondaires récupérés du mouton après injection de sérum d’un autre lapin anticorps IIaire anti-espèce marqueur antigène A l’anticorps IIaire est couplé avec un marqueur pour permettre la révélation le marqueur peut être - une enzyme convertissant un substrat incolore en produit visible (cf fiche n° 12) - une molécule fluorescente (cf fiche n°4) - une particule d’or (cf fiche n°10) Comment observer la localisation de protéines dans une cellule? Fiche n°4 La fluorescence Principe général: les molécules fluorescentes aborbent la lumière à une certaine longeur d’onde et émettent en retour une lumière à une longueur d’onde plus grande. Découverte et extraction de la GFP à partir de méduse dans les années 60 par O. protéine fusionnée à la GFP Shumomura. Prix nobel en dans les cellules HeLa 2008 1- La lumière absorbée par la molécule fluorescente est la lumière d’excitation 2- La lumière émise par la molécule fluorescente est la lumière d’émission Remarques: les molécules fluorescentes peuvent être des protéines comme la GFP ou bien des petites molécules chimiques = fluorochromes Les anticorps sont couplés à des fluorochromes Chaque fluorochrome est excité à une longueur d’onde particulière Comment observer la localisation de protéines dans une cellule? Fiche n°5 Le microscope à épifluorescence Principe général: la lumière d’illumination du microscope passe par un filtre afin de ne laisser passer que la lumière d’excitation de l’échantillon fluorescent. La lumière émise par l’échantillon est récupérée au niveau des oculaires. Lumière d’excitation : lampe à vapeur de mercure ou Led Remarque : dans le microscope à épifluorescence les 2 filtres et le miroir associé sont caractéristiques d’une molécule fluorescente donnée. Il existe en général jusqu’à 4 jeux de filtres pour voir les lumières émises dans le bleu, le vert, le rouge et le rouge lointain Comment étudier la fluidité membranaire ? Fiche n°6 L’hybridation somatique Principe général: la fusion de cellules de deux espèces suivie du marquage fluorescent de protéines membranaires permet l’observation au cours du temps de la mobilité des protéines. FUSION CELLULAIRE + IMMUNO FLUORESCENCE cellule humaine cellule murine cellule hybride= hétérocaryon 1- des cellules humaines et de souris sont artificiellement fusionnées au moyen du virus de Sendaï pour produire des hétérocaryons (cellules hybrides avec deux noyaux) 2- des anticorps Iaires marqués différemment (fluorochrome) dirigés contre une protéine membranaire de chaque espèce sont incubés 3- la fluorescence est observée au cours du temps Comment mesurer la diffusion des protéines membranaires dans des cellules ? Fiche n°7 Le FRAP = fluorescence recovery after photobleaching Principe général: éteindre définitivement la fluorescence associée à des protéines membranaires dans une cellule et observer le retour de la fluorescence indiquant que d’autres protéines membranaires émettant de la fluorescence se sont déplacées pour recouvrir la zone préalablement photoblanchie. laser recovery temps 1- on irradie une zone donnée d’une cellule unique avec un laser de forte puissance afin d’éteindre la fluorescence associée aux protéines membranaires 2- On mesure dans la zone donnée la fluorescence au cours du temps au microscope à fluorescence 3- On observe avec le temps le retour de la fluorescence si les protéines membranaires associées à de la fluorescence se sont déplacées Remarque : les protéines membranaires peuvent être directement couplée à une protéine fluorescente ou bien marquée avec un anticorps couplé à un fluorochrome Comment suivre une protéine ? La radioactivité Fiche n°8 Principe général: des atomes radioactifs peuvent être utilisés pour marquer des protéines et les suivre par dosage de la radioactivité ou à l’échelle de l’ultrastructure par microscopie électronique à transmission. Mesure de la radioactivité Grains d’argent qui apparaissent dense aux électrons 1- Les cellules sont incubées en présence du composé radioactif 2- Elles sont ensuite lavées 3- la radioactivité est mesurée à partir des extraits par scintillation liquide Comment observer à l’échelle de l’ultrastructure ? Fiche n°9 La microscopie électronique à transmission (MET) Principe général: la résolution du microscope électronique à transmission permet de voir l’ultrastructure des cellules à condition d’utiliser des coupes ultrafines sur tissu ou cellules. coupe ultrafine (80 nm d’épaisseur) 1- les échantillons sont fixés, déshydratés et inclus dans une résine dure 2- des coupes ultrafines sont réalisées avec un couteau de diament à l’aide d’un ultramicrotome 3- des métaux lourds sont utilisés pour contraster les échantillons Remarque: l’utilisation des électrons au lieu des photons permet d’obtenir une meilleure résolution qu’en microscopie photonique mais nécessite de faire le vide dans la colonne du microscope Comment faire un marquage en MET ? Le marquage à l’or Fiche n°10 Principe général: en microscopie électronique à transmission, les billes d’or apparaissent denses aux électrons et permettent de visualiser des protéines au sein des différentes structures de la cellule. Au Au composé Protéine d’intérêt 1- L’anticorps couplé à des billes d’or peut être appliqué sur les cellules avant fixation et inclusion ou bien sur les coupes ultrafines après inclusion 2- Des composés directement couplés à l’or comme le fer peuvent aussi être visualisés en MET à condition de traiter les cellules à ces composés avant la fixation et inclusion Remarque : Différentes tailles de billes peuvent être utilisées pour marquer plusieurs protéines. Il peut être nécessaire d’utiliser un marquage immunofluorescent indirect avec 2 anticorps Comment observer la localisation de protéines dans une cellule? Fiche n°11 L’immunofluorescence indirecte Principe général: on utilise des anticorps qui reconnaisent de manière spécifique des protéines pour révéler leur présence au sein de cellules. anticorps secondaires reconnaissant les anticorps de lapin (ex: produit par un âne) épitope fluorochrome anticorps primaire reconnaisant la protéine d’intérêt (ex: produit par un lapin) 1- on fixe les cellules et on les perméabilise pour faire des « petits trous » 2- on applique un anticorps primaire spécifique de la protéine d’intérêt 3- on applique un anticorps secondaire qui reconnaît l’espèce de l’anticorps primaire Remarque: l’immunofluorecence directe est possible mais cela coûte plus cher et c’est moins sensible. Dans l’immunofluorescence indirecte, il y a un phénomène d’amplification. Comment observer la localisation de protéines dans une cellule? Fiche n°12 1/2 Le microscope confocal à balayage laser Principe général: obtenir une image résolutive tridimensionnelle d’un échantillon qui émet de la fluorescence. Permet de voir la colocalisation de deux protéines. diaphragmes x y coupe optique z lumière d’excition 1- On utilise un laser pour exciter l’échantillon en un seul point 2- On récupère toute la fluorescence du plan focal par balayage point par point dans l’axe XY (b) 3- On acquiert une succession de coupes optiques en changeant à chaque fois de plan focal en se déplaçant sur l’axe z sur toute l’épaisseur de la cellule Remarque: on arrive ainsi à obtenir des images de meilleure résolution qu’avec un microscope à épifluorescence lumière lumière émise émise hors du plan au niveau du focal qui est plan focal qui largement est écupérée exclue au travers du diaphragme épifluorescence confocal cellules d’embryon de drosophile Obtention de plans de coupes dans l’axe xz (vue perpendiculaire) 2/2 Représentation 3D de cellules épithéliales mdck polarisées et jointives (rouge = actine, bleu = noyau) Axe z Pôle apical Axe y Pôle basal Coupe orthogonale xz Vue Pôle apical xz Pôle basal Axe x Coupe orthogonale yz Vue yz Comment étudier les protéines dans un compartiment nucléaire ? Fiche n°13 Le fractionnement cellulaire Principe général: par une succession de centrifugrations, on peut séparer les différents compartiments de la cellule du fait que les divers organites cellulaires diffèrent par leur taille et leur densité. Les éléments les plus gros et les plus denses sédimentent plus rapidement que les autres structures. 1- Les cellules sont homogénéisées par broyage sur de la glace puis centrifugées à faible vitesse 2- Le surnageant est récupéré à chaque fois et centrifugé à une plus forte vitesse et pendant un temps plus long afin de faire tomber les éléments qui deviennent de plus en plus légers Comment révéler la présence d’une protéine dans des cellules ? 1/2 Le western blot Fiche n°14 Principe général: sur des extraits cellulaires, les protéines sont séparées par taille puis les protéines d’intérêt sont révélées grâce à un anticorps spécifique. tampon de lyse 1- les cellules sont lysées dans un tampon contenant des détergents pour solubiliser et dénaturer les protéines 2- le lysat cellulaire est déposé sur SDS-PAGE pour séparer les protéines en fonction de leur masse moléculaire (cf fiche n°2) 3- Les protéines sont transférées à partir du gel sur une membrane 4- l’anticorps primaire spécifique de la protéine d’intérêt est appliqué sur la membrane 5- l’anticorps secondaire est appliqué sur la membrane. Celui-ci est couplé à une enzyme 6- Un subtrat de l’enzyme est appliqué pour permettre la révélation 2/2 Étapes de l’immunoblot sur la membrane papier Système de transfert permettant de transférer les protéines chargées négativement du gel vers la membrane en appliquant un champ électrique papier substrat chimioluminescence chemidoc utilisé pour récupérer la lumière émise par le substrat anticorps secondaire couplé à une enzyme agissant sur un substrat chimio-luminescent Comment introduire un agent exogène (ADN-ARN) dans la cellule ? Fiche n°15 la transfection Principe général: introduction d’un fragment d’ADN (plasmide) ou ARN exogène dans des cellules afin de surexprimer un gène ou bien d’inactiver un gène (cf fiche n°16). 1- On applique sur les cellules l’ADN ou l’ARN en présence d’agents de transfection permettant l’endocytose des molécules 2- l’ADN est ensuite libéré dans le cytoplasme et passe dans le noyau pour être transcrit Remarques : On peut aussi transfecter par électroporation en appliquant un champ électrique afin que l’ADN puisse rentrer dans la cellule Il s’agit dans tous les cas d’une transfection transitoire. Le matériel est dégradé, dilué, perdu au cours des divisions cellulaires. Il est également possible d’obtenir une transfection stable à condition que l’ADN soit incorporé dans le génome de la cellule Comment étudier la fonction d’une protéine ? Fiche n°16 L’ARN interférent Principe général: introduction dans des cellules d’ARN complémentaires de l’ARNm d’intérêt, qui vont provoquer la dégradation de cet ARNm cible et empêcher la traduction de la protéine. 5’ siARN contrôle ARNm cible protéine cellules transfectées siARN spécifique 3’ siARN 5’ 3’ ARNm cible 1- les cellules sont transfectées (fiche n°14) avec un siARN = small interfering ARN qui est un ARN double brin 2- le siARN est reconnu dans le cytoplasme par un complèxe protéique qui va libérer l’ARN complémentaire de l’ARNm cible 3- En s’hybdridant sur l’ARNm cible, le tout est reconnu par des nucléases qui vont dégrader l’ARNm empêchant la traduction de la protéine
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