UE L2 - Biologie Cellulaire et Immunologie
Travaux Dirigés
de BIOLOGIE CELLULAIRE
1- Organisation des protéines dans la membrane plasmique du globule
rouge : les données de la biochimie
2- Dynamique des membranes biologiques
3- La capture du fer par les réticulocytes
4- Internalisation et transport nucléaire du récepteur à l’IGF
5- Internalisation du Coxsackievirus B (CVB)
6- Entrainement à l’examen de TD
Attention, bien consulter le diaporama des fiches de méthodologie associé à
chaque TD pour l’explication des techniques
L2 – UE Biologie Cellulaire et Immunologie
TD de Biologie Cellulaire/1
TD n°1 - ORGANISATION DES PROTÉINES DANS LA MEMBRANE DU GLOBULE
ROUGE :
LES DONNÉES DE LA BIOCHIMIE
Introduction
La structure et la réactivité d'une protéine dépendent de la nature des chaînes latérales des acides aminés qui
composent cette protéine. Ces chaînes latérales peuvent établir entre elles différents types de liaisons :
- des liaisons covalentes, comme les ponts disulfure qui se forment entre deux résidus cystéine; ces liaisons sont
détruites par les agents réducteurs, comme le Dithiothréitol (DTT) ou le β-Mercaptoéthanol,
- des liaisons ioniques entre les chaînes latérales de résidus chargés; ces interactions sont facilement détruites
par les solutions salines "concentrées" (≥ 0,5M),
- des ponts hydrogène; ces liaisons sont détruites par les agents chaotropiques tels que les solutions d'urée 2M
ou de chlorure de guanidinium 4M.
Si un domaine protéique renferme une forte proportion d'acides aminés apolaires hydrophobes, il aura tendance
à se positionner de façon à ne pas avoir de contact avec l'eau.
Dans les années 1970, le perfectionnement des techniques d'analyse des protéines et les connaissances
acquises sur leur structure ont permis de préciser l'organisation des membranes biologiques.
MANIPULATION A
Matériel et Méthodes
Pour étudier les protéines de la membrane plasmique, on a utilisé des "fantômes d'hématies" obtenus en
soumettant une suspension d'hématies à un choc osmotique. Les membranes des hématies éclatées ont été
récupérées par centrifugation (culot) puis lavées en les remettant en suspension dans du tampon phosphate à
5mM (pH 8) pour enlever toute trace d'hémoglobine. Après une centrifugation finale, un culot blanchâtre de
membranes plasmiques (= "fantômes d'hématies" ou "membrane ghosts", en anglais) est obtenu (cf TP).
Ces fantômes d'hématies ont été ouverts par traitement aux ultrasons et partagés en deux lots : l'un des lots a
subi un traitement par une solution de chlorure de sodium 0,5M dans du tampon phosphate (pH 7,4), l'autre non
(= lot témoin).
Chaque lot a ensuite été centrifugé afin de sédimenter les structures membranaires. Les surnageants ("S") et les
culots ("C") obtenus ont chacun été soumis à une électrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de SDS
(cf. Fiche n°2).
A la fin de la migration électrophorétique, le gel a été coloré par le bleu de Coomassie.
Résultats
Les principales bandes observées dans les gels d'électrophorèse sont représentées sur la figure 1.
(cathode)
(anode)
Figure 1 : gel d'électrophorèse coloré
par le bleu de Coomassie
1
L2 – UE Biologie Cellulaire et Immunologie
TD de Biologie Cellulaire/2
Questions :
1. Quels sont les avantages de l’utilisation des hématies dans cette expérience en comparaison de lignées
cellulaires (cf Fiche n°1)
2. Dans quel type de milieu a-t-on placé les hématies pour provoquer le choc osmotique des hématies ?
Expliquez pourquoi.
3. Qu’est-ce qu’un SDS-PAGE ? Quelles sont les grandes étapes permettant la réalisation d’un SDS-PAGE ? cf.
Fiche n°2 et de notre vidéo https://www.youtube.com/watch?v=SrYzulGMBBE pour répondre à ces deux
questions.
4. Sur les figures des électrophorèses, indiquez le sens de migration des protéines dans le gel, localisez le front
de migration et désignez la place de la protéine de masse moléculaire (MM) la plus élevée et celle de la
protéine de MM la plus faible.
5. Quels sont les renseignements fournis par les électrophorèses du lot témoin colorées par le bleu de
Coomassie sur la composition en protéines de la membrane des hématies ?
6. Quel est l'effet produit par les solutions salines concentrées sur les protéines ?
7. Comparez les résultats de l'électrophorèse du lot traité par le chlorure de sodium 0,5M (culot et surnageant)
et ceux de l'électrophorèse du lot témoin; que peut-on en conclure quant à la position des différentes protéines
de la membrane du globule rouge ?
MANIPULATION B
Matériel et Méthodes
Des fantômes d'hématies préparés comme précédemment ont été placés dans des tubes contenant une solution
tampon 5mM à pH 8 additionnée ou non de MgSO4. Après homogénéisation on a obtenu :
a/ dans les tubes additionnés de MgSO4 : des vésicules closes dont la membrane est orientée normalement
(c'est-à-dire dont la face "cytoplasmique" est située vers l'intérieur de la vésicule),
b/ dans les tubes ne contenant pas de MgSO4 : des vésicules closes dont la membrane est retournée (c'est-àdire dont la face "cytoplasmique" est située sur la face externe de la vésicule).
Des suspensions de chacun des deux types de vésicules (à membrane retournée et à membrane non retournée)
ont été soumises à un traitement protéolytique (au moyen d'une endopeptidase). Après centrifugation, les culots
(vésicules) sont récupérés et les surnageants obtenus ont été analysés, comme précédemment, par
électrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de SDS. A la fin de la migration, le gel a été coloré par le
bleu de Coomassie.
Résultats
a/ sur la piste correspondant au culot obtenu à partir des vésicules à membrane non retournée (homogénéisation
en présence de MgSO4) traitées par l'endopeptidase, les bandes 1, 2, 4, 5 et 6 ont montré des distances de
migration identiques à celles observées sur l'électrophorèse du lot témoin non traité de l'expérience précédente.
Par contre, la position de la bande 3 sur le gel a changé.
b/ sur la piste correspondant au culot obtenu à partir des vésicules à membrane retournée (homogénéisation en
absence de MgSO4) traitées par la protéase, les bandes 1, 2, 4, 5 et 6 ont disparu. La position de la bande 3
sur le gel a varié dans le même sens que pour le lot précédent (vésicules à membrane non retournée), mais
de façon plus importante.
c/ aucune bande n'apparaît sur les pistes correspondant aux deux surnageants.
Questions :
8. Schématisez les membranes des vésicules (en montrant les deux feuillets) lorsque lorsqu’elles sont incubées
en présence ou en absence de MgSO4.
9. Précisez la localisation des protéines correspondant aux bandes 1, 2, 4, 5 et 6, au niveau de la membrane
plasmique des hématies. Justifiez vos réponses.
10.Dans quel sens la position de la bande 3 sur le gel s'est-elle déplacée ? Justifiez votre réponse.
11.Représentez schématiquement toutes les protéines au niveau de la membrane plasmique d'une hématie
(pensez à orienter votre schéma).
2
L2 – UE Biologie Cellulaire et Immunologie
TD de Biologie Cellulaire/3
TD n°2 LA DYNAMIQUE DES MEMBRANES BIOLOGIQUES :
1. L'HYBRIDATION SOMATIQUE (expérience de Frye et Edidin)
Introduction
A la fin des années 1960s, des chercheurs ont voulu suivre des protéines membranaires (= antigènes Ag) à la
surface de cellules par fluorescence (cf Fiches n°3-4) en produisant des "hétérocaryons" à partir de deux espèces
différentes (cf Fiche n°6).
Matériel et Méthodes
Préparation des anticorps fluorescents : Des anticorps dirigés contre les protéines présentes dans la membrane
plasmique de cellules humaines (lignée cellulaire, cf Fiche n°1) ont été obtenus par injection sous-cutanée de
cellules humaines dans un lapin. Les anticorps ont ensuite été isolés à partir du sérum de ce lapin.
Un deuxième sérum renfermant des anticorps dirigés contre les protéines membranaires de cellules de souris
(lignée cellulaire) a été obtenu de la même manière en immunisant un autre lapin par injection de cellules de
souris.
Des marqueurs fluorescents (= fluorochromes) ont ensuite été greffés chimiquement sur les anticorps présents
dans chaque sérum : les anticorps de lapin anti-homme ont été couplés à une substance fluorescente verte
(l'isothiocyanate de fluorescéine = FITC) tandis que les anticorps de lapin anti-souris ont été couplés à une
substance fluorescente rouge (l'isothiocyanate de tétra-rhodamine = TRITC). (cf Fiches n° 3-4)
Confection des hétérocaryons : Des cellules humaines et des cellules de souris ont été mélangées (en proportion
2:1) avec une petite quantité de virus Sendaï. Cette suspension cellulaire a été maintenue sous agitation pendant
10 min à 4°C, puis pendant un temps court (5 à 10 min) à 37°C pour permettre la formation d'hétérocaryons. Les
cellules ont ensuite été placées dans du milieu de culture neuf et incubées à 37°C sous agitation modérée pour
éviter l'adhérence des cellules à la paroi du récipient.
Marquage fluorescent des cellules : Des fractions de la suspension cellulaire ont été prélevées à intervalles
réguliers, lavées dans du tampon PBS (solution saline isotonique avec un pH de 7,4), et fixées (pour préserver
les structures cellulaires). Les cellules ont été mises en présence d'un mélange des deux anticorps [Ac antihomme + Ac anti-souris] fluorescents pendant 15 minutes à température ambiante. Après un lavage soigneux
dans du tampon PBS, les cellules ont été placées entre lame et lamelle.
Des préparations témoins ont été réalisées en mettant des cellules humaines ou des cellules de souris non
fusionnées en présence du mélange des deux anticorps.
Observations : L'observation des préparations a été effectuée au moyen d'un microscope à épifluorescence,
munie d’une source de lumière, des filtres d'excitation et d'arrêt correspondant à chaque fluorochrome utilisé. (cf.
Fiche n° 5)
Résultats
Les résultats observés après marquage des hétérocaryons sont reportés dans le tableau ci-dessous.
Les marquages [S1/2-H1/2] désignent des hétérocaryons dont la moitié de la surface émet une fluorescence verte
en microscopie de fluorescence, et l'autre moitié une fluorescence rouge ; les marquages [S1-H1] correspondent
à des hétérocaryons dont toute la surface émet à la fois une fluorescence verte et une fluorescence rouge.
Les cellules humaines non fusionnées mises en présence du mélange d'anticorps fluorescents montrent
uniquement une fluorescence verte sur toute leur surface, tandis que les cellules de souris montrent seulement
une fluorescence rouge.
Temps
d'incubation
(min)
5
5
10
10
25
25
40
40
40
40
120
Nombre d'hétérocaryons marqués par les deux Ac
Marquages
[S1/2-H1/2]
Marquages
intermédiaires
Marquages
[S1-H1]
Total
% de formes
[S1-H1]
26
25
6
9
2
1
0
0
0
0
0
3
1
24
4
7
20
4
2
1
0
0
0
0
1
0
6
25
26
14
14
37
31
29
26
31
13
15
46
30
16
15
37
31
0
0
3
0
40
54
87
88
93
100
100
3
L2 – UE Biologie Cellulaire et Immunologie
TD de Biologie Cellulaire/4
Questions
1. Énumérez brièvement dans l'ordre les différentes étapes de la manipulation effectuée par Frye et Edidin.
2. Au moyen d’un schéma, représentez les différents anticorps en place à la surface des hétérocaryons [S1/2H1/2] et [S1-H1] après réalisation de la technique d'immuno-marquage.
Pour votre schéma :
- Les Ag membranaires de souris seront représentés sous la forme de carré à la surface membranaire et les
Ag membranaires humains sous une forme triangulaire (Cf. ci-dessous).
- Les anticorps doivent être représentés en respectant leur structure (Cf. cours d’immunologie et Fiche n°3).
- Les fluorochromes fixés sur les anticorps seront représentés sous la forme de ronds verts pour le FITC et
rouges pour le TRITC.
3. Proposez une hypothèse permettant d'expliquer l'évolution des pourcentages de formes [S1-H1] observés en
fonction du temps.
2. LE PHOTOBLANCHIMENT
(ou FRAP pour ”Fluorescence Recovery After Photobleaching”)
Introduction
Le déplacement des molécules au sein de la membrane plasmique des cellules a été étudié par la méthode de
FRAP (cf Fiche n°7).
Matériel et Méthodes
Dans trois boîtes de Pétri contenant des fibroblastes de souris (lignée cellulaire 10T1/2) cultivés in vitro (cf Fiche
n°1), la membrane plasmique des cellules a été rendue fluorescente :
- boîte A : au moyen d'anticorps spécifiques produits chez le rat et dirigés contre la glycoprotéine membranaire
GP80 et couplés à de l'isothiocyanate de rhodamine (TRITC),
- boîte B : au moyen d'anticorps spécifiques produits chez le rat et dirigés contre la protéine membranaire Thy-1
et couplés à de l'isothiocyanate de rhodamine (TRITC)
- boîte C : au moyen d'une sonde lipidique qui fluoresce dans le rouge (NBD-PtdCho) et marquant
spécifiquement la phosphatidylcholine.
Les opérations de photo-blanchiment et les mesures d'intensité de la fluorescence ont été réalisées au moyen
d'un microscope équipé d'un éclairage laser, des filtres d'excitation et d'arrêt correspondant à la rhodamine, et
d'un compteur de photons relié à un système d'enregistrement (cf Fiche n°5).
Dans chaque boîte, on a mesuré la fluorescence émise par une zone circulaire de 8,75 µm de diamètre de la
surface d'une cellule soumise à un éclairement de faible puissance. Puis cette même zone a été illuminée pendant
37 à 150 msec. au moyen d'un faisceau laser d'une puissance 100 fois supérieure afin de produire l'extinction de la
fluorescence (blanchiment) des molécules marquées situées dans cette zone (fig.1). Après photo-blanchiment, les cellules ont
été à nouveau éclairées par une lumière de faible puissance et l'intensité de la fluorescence émise par la zone photo-blanchie
a été enregistrée toutes les 20 msec.
Figure 1
4
L2 – UE Biologie Cellulaire et Immunologie
TD de Biologie Cellulaire/5
Résultats
Après photo-blanchiment, on constate que les zones "blanchies" retrouvent toutes une partie de leur capacité de
fluorescence après un temps plus ou moins long (cf Fiche n°7). Le temps nécessaire pour que chaque zone
photo-blanchie retrouve 50 % de sa fluorescence initiale (50 % FRAP) a été déterminé pour chacune des trois
molécules marquées (fig.2).
Figure 2
Les valeurs de temps mesuré sont les suivantes :
Temps (50% FRAP)
Coefficient de diffusion
Glycoprotéine GP80
25 min. 35 sec. ± 48 sec.
2.10-10
Protéine Thy-1
1 min. 15 sec. ± 3 sec.
3,5.10-9
Phosphatidylcholine
1 min. 40 sec. ± 3 sec.
3.10-9
Questions
4. A quoi correspond une lignée cellulaire ?
5. Comment peut-on expliquer le phénomène de "restauration de fluorescence" observé au niveau de la
membrane plasmique des cellules après le photo-blanchiment ?
6. Dessinez la localisation probable de GP80 et Thy-1, sachant que :
- La glycoprotéine GP80 possède un domaine hydrophobe organisé en hélice alpha, et
- Thy-1 est une glycoprotéine intrinsèque de la membrane plasmique, dont la chaîne polypeptidique (111
résidus amino-acides) ne renferme pas de domaine hydrophobe caractéristique.
7. En vous appuyant sur les résultats de l'expérience (et de votre précédant schéma), formulez une hypothèse
expliquant la différence observée entre la vitesse de diffusion de la protéine Thy-1 et celle de GP80.
5
L2 – UE Biologie Cellulaire et Immunologie
TD de Biologie Cellulaire/6
TD n°3 - LA CAPTURE DU FER PAR LES RETICULOCYTES
Introduction
Les ions fer circulent dans l'organisme, liés à une protéine du plasma sanguin : l'apotransferrine. On appelle
"transferrine" une molécule d'apotransferrine ayant fixé deux ions fer. De la transferrine purifiée à partir de plasma
sanguin peut être rendue radioactive, soit en y associant du 59Fe, soit après avoir fixé de l'125Iode sur les résidus
tyrosine de la protéine (apotransferrine ou transferrine) (cf Fiche n°8).
Les réticulocytes sont des cellules précurseurs des globules rouges qui possèdent environ 50 000 récepteurs de
la transferrine à leur surface ; ces récepteurs leur permettent de capturer et d'internaliser le fer.
MANIPULATION A
Matériel et Méthodes
Des réticulocytes de lapin sont cultivés en boîtes de Pétri. Les cellules sont incubées pendant 1 heure à 4°C en
présence de transferrine marquée soit par du 59Fe, soit par de l'125Iode. Les cellules sont ensuite lavées,
réparties dans plusieurs boîtes de Pétri contenant un milieu de culture sans transferrine, puis remises à 37°C
(temps 0).
A différents temps, on détermine :
- la radioactivité du milieu de culture (n),
- la radioactivité détachée des cellules suite à la dissociation du complexe transferrine - récepteur (l),
- la radioactivité restant associée aux cellules après ce traitement (o).
Les résultats obtenus sont présentés sur les figures 1 et 2 :
Fig. 1 : transferrine marquée à l'125I.
Fig. 2 : transferrine marquée par le 59Fe
Questions :
1.
Justifiez le choix des réticulocytes comme matériel biologique pour cette étude.
2.
Expliquez pourquoi les chercheurs ont effectué une incubation à 4°C pendant 1 heure avec de la transferrine
marquée, avant d’initier les cinétiques à 37°C.
3.
Expliquez pourquoi on a marqué les molécules de transferrine de deux façons différentes ?
4.
En vous basant sur l'évolution des taux de radioactivité (de l'125Iode et du 59Fe) enregistrés dans les milieux
de culture, à l'intérieur des cellules, et à la surface ces cellules, précisez la destinée du fer et de
l'apotransferrine au cours du processus de capture du fer par les cellules.
6
L2 – UE Biologie Cellulaire et Immunologie
TD de Biologie Cellulaire/7
MANIPULATION B
Matériel et Méthodes
Des billes d'or de 15 nm ont été greffées chimiquement sur des molécules de transferrine (= AuTf).
Des réticulocytes ont été incubés à 37°C pendant 5, 10, ou 20 minutes dans un milieu de culture (pH 7,4)
contenant de l'AuTf. A la fin du temps d'incubation, les cellules ont été lavées avec du milieu de culture à 4°C
dépourvu de transferrine.
Une partie des réticulocytes incubés pendant 30 minutes en présence d'AuTf a été soumise, après lavage, à
une incubation de 10 ou 25 minutes dans un milieu de culture renfermant de la transferrine non couplée à l'or (=
Tf).
Toutes les cellules ont ensuite été préparées classiquement pour leur examen au microscope électronique à
transmission. La localisation des billes d'or (= molécules de transferrine) au niveau des différents compartiments
a été observée à partir de différents clichés pris à différents grossissements. (cf Fiches n°9-10)
Résultats
Les images observées sont illustrées par les clichés 3a-e.
Fig. 3: Coupes ultrafines de réticulocytes placés à 37°C en présence de AuTf pendant 5 minutes (a), 10 minutes (b), et 20
minutes (c), et de réticulocytes incubés pendant 20 minutes en présence de Au Tf puis soumis à une incubation de 10
minutes (d) et 25 minutes (e) en présence de Tf non marquée. - [a, c et e : barre = 100 nm; b et d : barre = 200 nm].
7
L2 – UE Biologie Cellulaire et Immunologie
TD de Biologie Cellulaire/8
Questions :
5. Sur les clichés de la fig. 3, identifiez les principaux compartiments ayant fixé la protéine (couplée aux billes
d’or = AuTF). Que remarquez-vous au niveau des membranes qui délimitent ces compartiments sur la fig. 3a
? Que remarquez-vous au sein du compartiment sur la fig. 3c ?
6. D'après les résultats vos observations, que peut-on dire du trajet suivi par les molécules d'AuTf dans les
cellules ?
MANIPULATION C
Résultats
Des études biochimiques ont permis de déterminer (cf. figure 4) l'effet du pH sur :
- la liaison des ions fers à l'apotransferrine (courbe 1) ;
- la liaison de la transferrine au récepteur (courbe 2) ;
- la liaison de l'apotransferrine au récepteur (courbe 3).
Fig. 4
Questions :
7. Commentez les courbes de la fig. 4.
8. D’après les résultats des expériences 1, 2 et 3, faites un schéma montrant un mécanisme d’internalisation du
fer par les cellules, sachant que :
- le pH du compartiment intracellulaire visible sur la figure 3c est voisin de 5,5,
- le pH du milieu extracellulaire est supérieur à 7.
8
L2 – UE Biologie Cellulaire et Immunologie
TD de Biologie Cellulaire/9
TD n°4 – INTERNALISATION ET TRANSPORT NUCLEAIRE
DU RECEPTEUR A L’IGF
Introduction
Le facteur de croissance apparenté à l’insuline (IGF-1, pour Insulin-like Growth Factor-1) est une molécule de
signalisation capable de stimuler la prolifération, la différenciation et la croissance des cellules, suite à sa fixation
sur son récepteur membranaire IGF-1R. Cette expérience consiste à comprendre le devenir dans la cellule de
l’IGF-1R, suite à son interaction avec son ligand IGF-1.
MANIPULATION A
Matériel et Méthodes
Une lignée de cellules épithéliales intestinales humaines a été incubée à 37°C en présence d’IGF-1. A différents
temps, les cellules sont fixées, perméabilisées et préparées pour une immunofluorescence indirecte en utilisant
un anticorps primaire dirigé contre l’IGF-1R et un anticorps secondaire anti-souris couplé au fluorochrome alexa
546 (fluorescence dans le rouge) (cf Fiches n°3, 4, 11). Les chercheurs ont ensuite analysé le devenir de l’IGF1R avec un microscope confocal (cf Figure n°12). Les pointillés sur la première image indiquent la position du
noyau .
En parallèle, des cellules cultivées en présence d’IGF-1 ont été lysées après différents temps d’incubation et leurs
noyaux ont été isolés (cf Fiche n°13). Les extraits nucléaires ont été soumis à un Western-blot (cf Fiche n°14)
avec des anticorps dirigés contre l’IGF-1R ou contre l’histone H1.
Les résultats obtenus sont présentés sur les figures 1 et 2 :
Figure n°1
Figure n°2
Extraits nucléaires
0
3
15
30
60
90
min.
10 µm
IGF-1R
Histone H1
Questions :
1.
Décrivez et interprétez la figure n°1
2.
-
En vous aidant du film https://www.youtube.com/watch?v=SrYzulGMBBE
Que doit contenir le tampon de lyse ? Que veut dire électrophorèse dénaturante ?
Quelle est la différence entre SDS-PAGE et western blot ?
3.
Sur le western blot de la figure n°2 A quoi correspond l’histone H1. Pourquoi avoir choisi un anticorps dirigé
contre cette protéine ?
4.
Décrivez et interprétez la figure n°2.
MANIPULATION B
Matériel et Méthodes
Des cellules cultivées sans IGF-1 ont été fixées, perméabilisées et préparées pour une double
immunofluorescence indirecte en utilisant des anticorps primaires dirigés contre l’IGF-1R et la cavéoline (haut)
ou la clathrine (bas). Les chercheurs ont ensuite analysé les marquages avec un microscope confocal. « Merge »
indique la surperposition des images.
9
L2 – UE Biologie Cellulaire et Immunologie
TD de Biologie Cellulaire/10
Les résultats obtenus sont présentés sur la figure n°3
Figure n°3
Questions :
5. Pourquoi est-il préférable de choisir un microscope confocal plutôt qu’un microscope à épifluorescence dans
cette expérience ?
6. Décrivez la figure n°3 et indiquez vos hypothèses sur les mécanismes réalisant l’internalisation de l’IGF-1R.
MANIPULATION C
Matériel et Méthodes
Des petits ARN interférents (siRNA) contrôles (CON) ou spécifiques de l’ARN messager cavéoline (CAV) ou
clathrine (CLT) ont été introduits (par transfection) dans les cellules (cf Fiches n°15-16). 48 heures après la
transfection, le lysat total de ces cellules a été soumis à un Western-blot avec les anticorps anti-cavéoline, anticlathrine, anti-IGF-1R et anti-tubuline (Figure n°4).
En parallèle, d’autres cellules comportant les petits ARN interférents contrôles (CON) ou spécifiques de l’ARN
messager cavéoline (CAV) ou clathrine (CLT), ont également été incubées pendant 30 minutes en présence
d’IGF-1. A l’issue du traitement, les noyaux de ces cellules ont alors été isolés et les extraits nucléaires (cf Fiche
n°13) ont été soumis à un Western-blot avec des anticorps dirigés contre l’IGF-1R ou contre l’histone H1 (Figure
n°5).
Les résultats des western blot obtenus sont présentés sur les figures n°4 et 5
Questions :
7. Comment fonctionnent les ARN interférents et à quoi servent-ils dans notre cas ?
8. Décrivez et interprétez la Figure n°4. Vous préciserez pourquoi les chercheurs ont utilisé des anticorps antiIGF-R1 et anti-tubuline.
9. Décrivez et interprétez la Figure n°5.
10. En vous basant sur les résultats que vous avez analysés, donnez une conclusion générale sur les événements
permettant l’internalisation du récepteur de l’IGF-1 suite à la fixation de sont ligand.
10
L2 – UE Biologie Cellulaire et Immunologie
TD de Biologie Cellulaire/11
TD n°5 – INTERNALISATION DU COXSACKIEVIRUS (CVB)
Introduction
Les virus du groupe B des coxsackievirus (CVB) traversent les épithélia (intestinal ou respiratoire) pour initier
l’infection au sein d’un organisme et ainsi provoquer des méningites et des myocardites. Les CVB peuvent infecter
les cellules épithéliales polarisées en utilisant deux types de récepteurs : le récepteur CAR, absent de la surface
apicale, et le récepteur DAF, présent sur la surface apicale. Les mécanismes permettant l’entrée de ces virus
dans les cellules ont été démontrés dans les expériences décrites ci-dessous.
MANIPULATION A
Matériel et Méthodes
Des cellules épithéliales polarisées CaCo-2 (cf Fiche n°1) sont fixées et la localisation des protéines ZO-1 et
CAR est analysée par immunofluorescence indirecte (cf Fiche n°11) en utilisant un microscope confocal «
MERGE » correspond à la superposition des deux images.
Les résultats obtenus sont présentés sur la figure n°1
Figure n°1
Questions :
1. Quelles jonctions connaissez-vous ?
2. Dans quel type de jonction cellulaire trouve-t-on ZO-1 ?
3. Quels sont les deux intérêts de l’utilisation du microscope confocal dans cette expérience
4. Qu’observez-vous sur la figure n°1 ? Qu’en déduisez-vous ?
MANIPULATION B
Matériel et Méthodes
Des cellules CaCo-2 sont mises en contact avec le virus CVB3-RD à 4°C. La température est ensuite élevée à
37°C et les cellules sont fixées à différents temps. La localisation des protéines CAR et VP1 (protéine de la
capside virale) est analysée par immunofluorescence indirecte en utilisant un microscope confocal. La barre
correspond à 10 μm dans toutes les expériences.
Les résultats obtenus sont présentés sur la figure n°2
Questions :
5. Que représentent les XY et XZ sur la figure n°2 (cf Fiche n°12) ?
6.
Que se passe-t-il lorsque les cellules sont placées à 4°C
Expliquez pourquoi la mise en contact des cellules avec les particules virales s’effectue initialement à 4°C.
7.
Qu’observez-vous sur la figure n°2 ? Qu’en déduisez-vous ?
11
L2 – UE Biologie Cellulaire et Immunologie
TD de Biologie Cellulaire/12
Figure n°2
MANIPULATION C
Matériel et Méthodes
Des cellules Caco-2 sont mises en contact avec le virus CVB3-RD et sont fixées à des temps différents après
l’infection. La localisation des protéines DAF, VP1 et CAR est ensuite analysée par immunofluorescence indirecte
en utilisant un microscope confocal. Le DAPI est un marqueur fluorescent (bleu) pour révéler les noyaux.
Les résultats obtenus sont présentés sur la figure n°3 A et B
Questions :
8.
Qu’observez-vous et que déduisez-vous de cette expérience ?
9.
Sachant que l’internalisation de CVB3-RD se situe au niveau des radeaux lipidiques, réalisez un schéma
retraçant les différentes étapes d’internalisation du virus en incorporant les résultats de ce TD et vos
connaissances.
12
L2 – UE Biologie Cellulaire et Immunologie
TD de Biologie Cellulaire/13
Figure n°3
13
L2 – UE Biologie Cellulaire et Immunologie
TD de Biologie Cellulaire/14
TD n°6 – ENTRAINEMENT A L’EXAMEN
1. En 25 min : Lisez le sujet et répondez aux 3 questions (total/10points). Rédigez votre
réponse sur une feuille comme vous le feriez en condition d’examen.
Introduction
Le facteur de croissance épidermique (EGF) est une molécule de signalisation capable de stimuler la prolifération
des cellules. Cette expérience historique consiste à comprendre le devenir de l’EGF, suite à son interaction avec
son récepteur membranaire EGFR.
MANIPULATION A
Matériel et Méthodes
Des cellules, cultivées en boîtes de Pétri, sont incubées pendant 1 heure à 4°C en présence de EGF marqué
avec des billes d’or (EGF-Au). Les cellules sont ensuite lavées, incubées dans un milieu de culture sans EGF,
puis remises à 37°C (temps 0). La distribution d’EGF-AY associé à différentes structures ultracellulaires (voir
légende) a été mesurée à différents temps (Figure n°1). (x) indique la présence d’agrégats de 5 ou plus particules
d’EGF-Au retrouvés à la surface des cellules. En parallèle, aux mêmes temps, des cellules ont fixées et préparées
pour leur observation au microscope électronique à transmission. Les chercheurs ont ensuite analysé le devenir
de l’EGF-Au sur ces cellules en analysant les différents clichés.
La Figure n°2 montre les clichés de microscopie électronique à transmission de cellules incubées avec EGF-Au
à différentes étapes de l’expérience : (A) incubation à 4°C pendant 40 min, (B) incubation à 37°C pendant 30
secondes et (C) incubation à 37°C pendant 30 minutes. Les clichés sont au même grossissement.
Les résultats obtenus sont présentés sur les figures n°1 et 2
Figure n°1
Figure n°2
EGF-Au associé aux structures cellulaires (%)
Membrane plasmique
Lysosome
Vésicules
x Agrégats (surface cellulaire)
A
B
0
B
B
C
Temps (minutes)
Questions :
1.
Décrivez et interprétez la Figure n°1 (4 points)
2.
Décrivez et analysez la Figure n° 2 (3 points)
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L2 – UE Biologie Cellulaire et Immunologie
TD de Biologie Cellulaire/15
MANIPULATION B
Matériel et Méthodes
Des cellules cultivées en boîtes de Pétri sont incubées pendant différents temps à 37°C dans un milieu contenant
(+) ou non (-) de l’EGF. Les chercheurs ont ensuite lysé les cellules. Le Lysat cellulaire a ensuite été soumis à un
Western-blotting avec des anticorps dirigés contre le récepteur de l’EGF (EGFR) ou contre l’Actine.
Les résultats obtenus sont présentés sur la figure n°3
3.
Indiquez quelles informations apporte la Figure n°3 (3 points)
Figure n°3
Questions :
2. En 25 min : Nous allons vous présenter 3 réponses d’étudiants (A, B, C). Lisez ces réponses
et donnez une note aux 4 étudiants en utilisant le barème indiqué pour chaque question et
justifiez en quelques lignes la note donnée à chaque question.
3. En 25 min : Discussion des notes notées
4. En 15 min : Donnez une note à votre propre travail et indiquez comment vous pourriez
améliorer votre note. Vous pouvez aussi échanger votre copie avec votre voisin et discuter de
vos notes et de vos réponses avec votre voisin. L’enseignant passera discuter avec les
étudiants individuellement.
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