Солюбилизация биосурфактантов: Бакалаврская работа по биотехнологии

МИНОБРНАУКИ РОССИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Тульский государственный университет» Кафедра ______ Биотехнологии____________ (наименование выпускающей кафедры) БАКАЛАВРСКАЯ РАБОТА направление________________19.03.01___________________________ ________________________Биотехнология________________________ (наименование) «Определение солюбилизирующей способности биосурфактантов бактерий-деструкторов гидрофобных соединений» Студент группы _______________ Парфенова А.С. (подпись, дата) Руководитель работы (фамилия, инициалы) ____Нечаева И.А._ (подпись, дата) (фамилия, инициалы) Заведующий кафедрой _________________Понаморёва О.Н. (подпись, дата) Тула, 2022 (фамилия, инициалы) СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ.................................................................................................... 4 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР ....................................................................... 6 1.1. Общие характеристики сурфактантов ............................................. 6 1.2. Классификация биоПАВ. .................................................................. 7 1.3. Физико-химические свойства биосурфактантов .......................... 10 1.3.1. Способность снижать поверхностное значение .................... 10 1.3.2 Критическая концентрация мицеллообразования (ККМ) и методы ее определения ................................................................................. 10 1.3.3. Гидрофильно-липофильный баланс........................................ 12 1.3.4. Солюбилизация ......................................................................... 13 1.4 Физико-химические характеристики процесса солюбилизации.. 13 1.5. Бактерии рода Rhodococcus – продуценты биосурфактантов ..... 15 1.6. Области применения биосурфактантов ......................................... 17 1.6.1. Нефтяная промышленность. .................................................... 17 1.6.2. Биодеструкция нефти и нефтепродуктов ............................... 17 1.6.3. Сельское хозяйство ................................................................... 18 1.6.4. Медицина, фармацевтика и косметология ............................. 18 1.6.5. Пищевая промышленность ...................................................... 19 1.6.6. Производство моющих и чистящих средств .......................... 19 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ................................ 20 2.1. Объекты исследования и условия культивирования .................... 20 2.1.1. Объект исследования ................................................................ 20 2.1.2. Питательные среды и условия культивирования .................. 20 2.2. Экстракция биосурфактантов хлороформом и метанолом ......... 21 2.3. Тонкослойная хроматография ........................................................ 21 2.4. Определение содержания трегалолипидных биосурфактантов .. 21 2 2.5. Определение ККМ на основе измерений поверхностного натяжения растворов......................................................................................... 23 2.6. Газохроматографический анализ .................................................. 23 2.7. Колориметрическое определение солюбилизации ....................... 24 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ................................................. 26 4. ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ................................................................ 43 4.1. Технико-экономическое обоснование дипломной работы .......... 43 4.2. Расчет стоимости исследования ..................................................... 43 4.3. Расчет затрат на электроэнергию и воду для технических нужд 44 4.4. Расчет заработной платы и начислений на социальные нужды . 45 А) Основная заработная плата исполнителя .................................... 45 Б) Заработная плата руководителя и консультантов ....................... 46 B) Дополнительная заработная плата ............................................... 46 Г) Начисления на социальные нужды............................................... 46 4.5. Расчет накладных расходов ............................................................ 46 4.6. Расчет амортизации приборов, оборудования и стеклянной посуды ................................................................................................................ 46 4.7. Смета затрат на проведение исследований ................................... 49 4.8. Научно-практическая значимость работы ..................................... 50 5. ОХРАНА ТРУДА .................................................................................... 51 5.1. Общие сведения ............................................................................... 51 5.2. Обоснование мер предосторожности при работе в лаборатории 51 5.3. Токсические и пожароопасные свойства веществ........................ 52 ВЫВОДЫ ..................................................................................................... 56 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ .......................................................................... 57 Приложение 1 .............................................................................................. 64 Приложение 2 .............................................................................................. 65 Приложение 3 .............................................................................................. 66 3 ВВЕДЕНИЕ В настоящее время поверхностно-активные вещества (ПАВ) являются одними из самых востребованных соединений в мире, поскольку они используются в различных областях деятельности человека: при производстве моющих средств, косметики, лекарственных препаратов, продуктов питания, текстиля, бумаги, полимеров, пластмассы и т.д. Однако Синтетические ПАВ при накоплении в окружающей среде могут оказывать неблагоприятное действие на живые организмы, так как являются ксенобиотиками. Природные ПАВ (биоПАВ, биосурфактанты), полученные из животных или растительных материалов, такие как мыла, лецитины и сапонин, а также вторичные метаболиты микроорганизмов - могут постепенно заменить синтетические вещества, так как не являются ксенобиотиками, но при этом обладают теми же свойствами, что и синтетические ПАВ. Природные ПАВ микробного происхождения были обнаружены как внеклеточные амфифильные соединения при исследовании ферментации на углеводородах, начавшейся в конце 1960-х годов [53]. С этого времени начался направленный поиск веществ с высокой биоразлагаемостью и экологической безопасностью - «альтернативы» синтетическим поверхностно-активным веществам. Наиболее перспективным является использование микробных биосурфактантов в производственных масштабах вследствие высокой их биодеградабельности, низкой токсичности, высокой активности в малых количествах и в экстремальных условиях среды [28]. Среди микробных биосурфактантов особое внимание привлекают гликолипидные биосурфактанты, так как они продуцируются в основном микроорганизмами-деструкторами гидрофобных веществ, актиномицетами и грибами [51]. Важным аспектом применения гликолипидных биосурфактантов является то, что для их биотехнологического получения можно использовать недорогое сырье, доступное в больших количествах, например, промышленные отходы и нефтесодержащие побочные продукты, включая углеводороды нефти, отходы фритюрного масла и отходы оливкового масла [54-56]. Представители рода Rhodococcus являются эффективными деструкторами углеводородов нефти различных групп, они легко адаптируются к экстремальным условиям окружающей среды и часто входят в состав биопрепаратов для очистки от нефтяных загрязнений [57], вследствие продуцирования ими в среду биосурфактантов гликолипидной природы, а именно трегалолипидов. В связи с широким применением биосурфактантов в различных отраслях и процессах жизнедеятельности человека [19, 20, 41, 42], исследования по поиску эффективных продуцентов биосурфактантов, 4 изучение свойств продуцируемых микроорганизмами биосурфактантов, как например, способность к снижению поверхностного натяжения и солюбилизация гидрофобных веществ в мицеллах ПАВ, является актуальной задачей. Целью данной работы является определение физико-химических характеристик гликолипидных биосурфактантов, продуцируемыми бактериями Rhodococcus erythropolis S67 и Rhodococcus erythropolis X5 при росте на гидрофобном субстрате на примере нгексадекана. Для достижения цели были поставлены следующие задачи: ―Выделить биосурфактанты из культуральной жидкости путем экстракции двухкомпонентной системой полярных органических растворителей и подтвердить наличие биосурфактантов гликолипидной природы методом тонкослойной хроматографии. ―Определить количественное содержание гликолипидных биосурфактантов фенольно-серным методом. ―Измерить поверхностное натяжение бесклеточного супернатанта методом отрыва кольца и определить критическую концентрацию мицеллообразования гликолипидных биосурфактантов. ―Определить солюбилизирующую способность выделенных биосурфактантов в отношении гидрофобных органических веществ и основные физико-химические параметры данного процесса. 5 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1. Общие характеристики сурфактантов Сурфактанты – это амфифильные поверхностно-активные соединения, основной функцией которых является снижение поверхностного натяжения на границе раздела двух фаз (жидкость-жидкость, жидкость-газ, жидкость-твердое тело). Выделяют два основных класса сурфактантов: химически синтезированные и продуцируемые различными живыми организмами. Биосурфактанты – это вторичные метаболиты, вырабатываемые микроорганизмами, растениями и высшими животными в процессе их жизнедеятельности [4]. В литературе [5, 21-23] описано большое количество схем классификации ПАВ, которые основаны на физических свойствах или функциональности. Наиболее распространено разделение ПАВ по физическому свойству – ионности, то есть по способности к диссоциации в водных растворах. Вследствие этого ПАВ делят на ионогенные и неионогенные, ионогенные ПАВ подразделяют на анионные, катионные и амфолитные. На рисунке 1 представлены примеры синтетических ПАВ. Рисунок 1. Синтетические поверхностно-активные вещества [61] Структуру сурфактантов можно представить двумя функциональными составляющими, а именно гидрофобной неполярной и гидрофильной полярной (рис.2). У биосурфактантов в гидрофильную часть могут входить аминокислотные или пептидные катионы, или анионы, моно-, ди- или полисахаридами, гидрофобная часть представлена ненасыщенными или насыщенными жирными кислотами, как например декановой, октадекановой и гексадекановой кислотами [24-27]. 6 октановой, Рисунок 2. Общая схема структуры сурфактантов По своей эффективности биоПАВ ничем не уступают синтетическим сурфактантам, но следует выделить ряд преимуществ: ― отсутствие токсичности; ― высокая активность в экстремальных условиях среды (температура, рН); ― высокая биодеградабельность; ― высокая биологическая активность в малых дозах; ― получение в возобновляемых источниках, что делает их более перспективными для разработки экологически безопасных технологий [28]. 1.2. Классификация биоПАВ. Биологические поверхностно-активные вещества (биоПАВ) – это вторичные метаболиты, которые образуются многими микроорганизмами, растениями и высшими животными в процессе их жизнедеятельности. По своей природе биоПАВ так же являются амфифильными соединениями и могут выступать альтернативой при применении в отраслях химической промышленности, вследствие того, что по своей эффективности к эмульгированию не уступают синтетическим сурфактантам, полученным химическим синтезом из углеводородов нефти. В отличие от синтетических ПАВ биологические обладают преимуществами – биодеградабельность, низкая токсичность, функционируют в широких диапазонах рН, стабильны к высоким и низким температурам, а также возможность получения биотехнологическими способами из промышленных отходов и побочных продуктов нефтедобывающих производств [76], что дает перспективу для разработки новых экологически безопасных технологий их получения и применения. Наиболее часто биоПАВ выделяют микроорганизмы, и их делят на несколько классов: гликолипиды, фосфолипиды, протеолипиды, липопротеиновые комплексы, 7 биополимеры, липопротеины. Некоторая часть авторов анализируемой литературы делят биоПАВна две группы в зависимости от их молекулярной массы – с низкой (гликолипиды, липопептиды и фосфолипиды) и высокой (липополисахариды, полисахариды, протеины, липопротеины) молекулярной массой. Первая группа, биосурфактанты, способна эффективно снижать межфазное и поверхностное натяжение, вторая группа, биоэмульгаторы, обладает ярко выраженными свойствами эмульсификаторов и стабилизаторов эмульсий типа «масло воде» [77]. На данный момент наиболее изучены и широко применимы подгруппы биоПАВ, относящихся (рамнолипиды, к низкомолекулярной группе, к софоролипиды, трегалопиды, которой относятся гликолипиды целлобиозолипиды, липиды маннозилэритрит) и липопетиды. Липопептиды можно представить циклическими молекулами. По химической структуре липопетиды разделяют на лактамы и лактоны. В лактамах N-концевой аминокислотный остаток пептидной цепи связан амидной связью с β-аминожирной кислотой, а С-конец пептидной цепи замкнут на β-аминогруппу жирнокислотного остатка. В лактонах N-концевой аминокислотный остаток пептидной цепи связан амидной связью с β-гидроксижирной кислотой, а карбоксильная группа С-концевой аминокислоты ковалентно замыкает кольцо взаимодействуя с β-гидроксильной группой [78]. Рисунок 3. Примеры структур липопептидных биосурфактантов бактерий рода Arthrobacter sp. MIS38 [81] Такие как антрофактин, сурфактин (рис.3), циклические липопетиды, продуцируется бактериями Arthrobacter [9], сурфактин синтезируется и различными штаммами Bacillus и Paenibacillus, проявляющий антагонистические и ростостимулирующие свойства [79]. Гликолипиды - это углеводы, такие как моно-, ди-, три- и тетрасахариды, которые включают глюкозу, маннозу, галактозу, глюкуроновую кислоту, рамнозу и сульфат галактозы в сочетании с алифатическими гидроксиалифатическими кислотами. 8 кислотами с длинной цепью или Рисунок 4. Примеры структур гликолипидных биосурфактантов [82] Наиболее изученными в подгруппе гликолипидов являются рамнолипиды, продуцируемые родом бактерий Pseudomonas [80], и софоролипиды, которые синтезируются дрожжами рода Candida и состоят из дисахарида софорозы, соединенного гликазидной связью с гирокслированной жирной кислотой [81]. Структура рамнолипидов представлена одним или двумя остатками углевода рамнозы, которые связаны гликозидной связью с одним или двумя радикалами β-гидроксидекановой кислотой (рис. 4). Трегалолипидные биосурфактанты на данные момент в стадии изучения. Наиболее известны, как трегалозомиколаты, которые синтезируются бактериями Mycobacterium tuberculosis. Однако, трегалолипиды продуцируются не только патогенными микроорганизмами, но и актинобактериями родов Rhodococcus, Tsukamurella при росте на различных гидрофобных органических субстратах. Рисунок 5. Структура сукциноилтрегалолипида [33] 9 Вследствие низкого числа гидрофильно-липофильного баланса (ГЛБ) большая часть биоПАВ (до 90 %) остается клеточно-ассоциированной (эндо-тип), а именно липиды трегалозы, продуцируемые бактериями рода Rhodococcus [46]. Представители рода Rhodococcus являются продуцентами двух основополагающих типов биосурфактантов: трегаломиколатов (моно-, ди-, тримиколатов), относящихся к эндо-типу и сукцинилтрегалолипидов (рис. 5), относящих к экзо-типу, выделяются в культуральную жидкость [34]. 1.3. Физико-химические свойства биосурфактантов Сурфактанты микробиологического происхождения имеют те же физикохимические свойства, что и синтетические. Для них известны значения ККМ, ГЛБ поверхностного и межфазного натяжения и другие физико-химические характеристики [3]. 1.3.1. Способность снижать поверхностное значение Важной характеристикой биосурфактантов является эффективность уменьшать межфазное и поверхностное натяжение растворов, которая связана с величиной их критическая концентрация мицеллобразования, но рассматривается как отдельная характеристика. Значения поверхностного натяжения уменьшаются в диапазоне от 1 до 30 мН/м под воздействием биосурфактантов, в то время как «хорошие» синтетические ПАВ способны снизить поверхностное натяжение воды с 72 до 35 мН/м и межфазное натяжение н-гексадекана с 40 до 1 мН/м [4]. 1.3.2 Критическая концентрация мицеллообразования (ККМ) и методы ее определения Критическая концентрации мицеллообразования (ККМ) – эта характеристика описывает значение минимальной молярной концентрация ПАВ, при которой можно экспериментально обнаружить коллоидно-дисперсную фазу. При малых концентрациях ПАВ образуют истинные растворы. При увеличении концентрации раствора до ККМ, в растворе наряду с молекулами ПАВ присутствуют мицеллы, то есть появляется новая фаза. Такие системы характеризуются двумя свойствами: высокой дисперсностью и гетерогенностью, т. е. обладают свойствами присущие коллоидным растворам [5]. Методы определения ККМ основаны на резком изменении физико-химических свойств растворов ПАВ. Чаще всего для нахождения ККМ в экспериментах исследуется такие свойства, как мутность и оптическая плотность, удельная и эквивалентная электропроводность, поверхностное натяжение, показатель преломления и осмотическое 10 давление. Типичные формы некоторых зависимостей от концентрации ПАВ показаны на рисунке 6. Рисунок 6. Зависимость физико-химических свойств системы от концентрации ПАВ Как видно на кривых зависимостях присутствует излом, который при пересечении с осью концентрации соответствует значению ККМ. Во многих случаях ККМ, определенные различными методами, не совпадают и чаще всего такие отличия встречаются у слабоассоциирующих веществ [5]. Фотометрический метод основан на том, что при образовании мицелл в растворах ПАВ резко возрастает рассеяние света частицами и увеличивается мутность системы. Метод использует для определения мицеллярной массы, чисел агрегации мицелл и их формы [40]. При солюбилизации красителей и углеводородов в мицеллах ПАВ позволяет определять ККМ ионогенных и неионогенных ПАВ как в водных, так и в неводных растворах. При ККМ, растворимость водонерастворимых красителей и углеводородов резко увеличивается. Наиболее удобно применять жирорастворимые красители, интенсивно окрашивающие растворы ПАВ при концентрациях выше ККМ [8]. Определение ККМ титрованием с красителем основан на резком изменении цвета растворов ПАВ. Солюбилизация красителя в углеводородной части мицелл изменяет его спектр поглощения на спектр, характерный для растворов красителей в углеводородах. Установить ККМ анионоактивных ПАВ можно с помощью катионных красителей, таких как пинацианолхлорид и родамин 6G [5]. Тензиометричекие измерения проводят для определения поверхностного и межфазного натяжения. На основе измерений поверхностного натяжения растворов биосурфактантов определяется значение ККМ [9]. Наибольшее применение нашел простой 11 метод отрыва кольца Дю Нуи для определения поверхностного натяжения растворов, содержащих биоПАВ [10-12]. Метод отрыва кольца основан на измерении силы, необходимой для отсоединения кольца на границе двух жидких фаз или на поверхности раздела фаз «жидкость/воздух». Сила отрыва пропорциональна поверхностному натяжению на границе раздела фаз (рис.7). Ее можно измерить с помощью автоматизированного тензиометра. Выявлено, что уменьшение поверхностного натяжения на границе «вода-воздух» до 40 мН/м и ниже, свидетельствует о присутствии биосурфактантов в культуральной среде [13]. Рисунок 7. Схема взаимодействия кольца с поверхностью жидкости при измерении поверхностного натяжения Сила поверхностного натяжения рассчитывается как разница между максимальным усилием (Fmax), для отрыва кольца, и силой гидростатического столба жидкости под кольцом (Fв). 𝐹 −𝐹 𝑚𝑎𝑥 в 𝜎 = 𝐿∙cos , 𝜃 (1) где Fmax – максимальное усилие, Fв – сила гидростатического столба водного раствора, L – длина смачивания, θ – угол смачивания. 1.3.3. Гидрофильно-липофильный баланс Гидрофильно-липофильный баланс (ГЛБ) – оптимальное соотношение гидрофильной группы к гидрофобной группе молекулы ПАВ. Чем больше в молекуле преобладает гидрофильная часть над гидрофобной, тем выше число ГЛБ. Биосурфактанты, для которых величина ГЛБ от 3 до 6, проявляют тенденцию к стабилизации эмульсий типа "вода в масле", а при значении ГЛБ, равном 1016, они образуют системы типа "масло в воде". Эмульсии получаются в том случае, когда одна жидкая фаза диспергируется в виде микроскопических капель в другой жидкой 12 непрерывной фазе. Биосурфактанты могут стабилизировать и дестабилизировать эмульсии. Эмульгаторы характеризуются по времени распада суспензии углеводорода в водном растворе биосурфактанта, а деэмульгаторы рассматриваются по действию биосурфактанта на стандартную эмульсию, созданную с использованием синтетического сурфактанта [6]. 1.3.4. Солюбилизация Солюбилизация – явление резкого повышения растворимости в воде малополярных органических соединений в присутствии ПАВ. В водных мицеллярных системах ПАВ солюбилизируются вещества, практически нерастворимые в воде, например, углеводороды — гексадекан, гептан, бензол, красители, жиры. Это обусловлено тем, что вводимые в раствор ПАВ вещества включаются в состав мицелл, таким образом они растворяются в ядрах мицелл, обладающих свойствами неполярных жидкостей — углеводородов [20]. Механизм коллоидного растворения в мицеллах ПАВ условно можно разделить на следующие стадии: ― растворение солюбилизата в воде; ― диффузия его молекул из объема раствора в мицеллы ПАВ; ― проникновение и распределение солюбилизата внутри мицелл. Особенности явления солюбилизации: ― Процесс начинается только при с > ККМ, так как связан с существованием мицелл. Доказано, что солюбилизация – это, по сути, поглощение молекул добавленного в систему нерастворимого вещества мицеллами ПАВ. ― Солюбилизация приводит к образованию термодинамически устойчивых равновесных систем. При избытке добавки достигается предельное значение солюбилизации, которое характеризует солюбилизирующую способность [7]. 1.4 Физико-химические характеристики процесса солюбилизации Солюбилизирующую способность обычно характеризуют величиной, называемой молярной солюбилизацией при насыщении Sm: 𝑛 −𝑛 𝑠 𝑤 𝑆𝑚 = 𝐶−ККМ , (2) где ns и nw растворимость солюбилизата полная и в воде соответственно; с – общая концентрация биоПАВ; (с–ККМ) – концентрация биоПАВ в мицеллярной форме. Если растворимость солюбилизата в воде и ККМ очень малы, то Sm ≈ nS/c. Другим существенным параметром является коэффициент солюбилизата между мицеллами и дисперсионной (водной) средой Кm: 13 распределения 𝐾𝑚 = 𝑛𝑠 −𝑛ККМ 𝑛𝑤 . (3) Объединяя уравнения (1) и (2) получается: 𝑆 ∙(𝑐−ККМ) 𝐾𝑚 = 𝑚 𝑛 . 𝑤 (4) Получается, что коэффициент распределения, 𝐾m, зависит от концентрации ПАВ. Поэтому его зачастую относят к 1 молю ПАВ: 𝑆 ∙(1−𝑐) 𝐾𝑚 = 𝑚 𝑛 𝑤 , (5) Поскольку в единице объема мицеллярного раствора ПАВ содержится некоторое количество мицелл, их число ν можно определить, как: 𝑣= 𝑁𝐴 ∙(𝑐−𝑐𝑘 ) 𝑁 , (6) где с - общая концентрация ПАВ, моль/л; 𝑐𝑘 - концентрация неассоциированных молекул, моль/л; N - число агрегации мицелл; 𝑁𝐴 - число Авогадро. Общее количество солюбилизированных молекул в растворе ПАВ данной концентрации 𝑚∝ = 𝑚 ̅ ∙ 𝑣, (7) где 𝑚 ̅ - среднее количество молекул солюбилизата в мицелле при насыщении, т.е. средняя солюбилизационная емкость мицелл данного типа. Солюбилизационная емкость мицелл (СЕМ) характеризует отношение числа молекул солюбилизата и солюбизатора. Величина СЕМ определяется тангенсом угла наклона линейной изотермы солюбилизации к оси концентраций. Если изотермы линейны, что служит подтверждением неизменности формы мицелл и позволяет определить СЕМ по отношению к выбранному солюбилизату. При насыщении водного мицеллярного раствора ПАВ солюбилизатом зависимость равновесной солюбилизации от концентрации ПАВ можно определить, как: ̅ 𝑚 𝑆∝ = 𝑁∙(𝑐−ККМ), (8) где 𝑆∞ - предельная солюбилизация, моль/л. Таким образом, при постоянстве молярной концентрации ПАВ равновесная солюбилизация определяется соотношением трех характеристик: солюбилизационной емкостью мицелл, числом агрегации и концентрацией мицелл. Коэффициент распределения солюбилизата между мицеллами и дисперсионной средой, Кm, рассчитывают для определения эффективности процесса солюбилизации: 𝜒 𝐾𝑚 = 𝜒м, (9) в 14 где χм – молярная доля солюбилизата в мицеллярной фазе, χв – молярная доля солюбилизата в водной фазе. Если каждую молярную долю солюбилизата в двух фазах выразить через Sm, то получается: 𝑆 𝑚 𝜒𝑚 = (1+𝑆 , ) (10) 𝜒в = 𝑆ккм ∙ 𝑉в, (11) 𝑚 где Vв – молярный объем воды, Vв=0,01805 дм3/моль-1 при 298 К. Таким образом коэффициент распределения, Km, рассчитывается по формуле: 𝑆𝑚 𝐾𝑚 = 𝑆 . (12) ККМ ∙𝑉в (1+𝑆𝑚 ) В качестве параметра взаимодействия между солюбилизатом и ПАВ рассматривают константу связывания (константу связывания по первой ступени). Зная число агрегации можно найти K1/N по тангенсу угла наклона зависимости ([St] –[SKKM])/[SKKM] = f(Ct –KKM) и разделить на величину агрегации мицелл ПАВ [61]. [𝑆𝑡 ] –[𝑆𝐾𝐾𝑀 ] 𝑆𝐾𝐾𝑀 𝐾 = 𝑁1 (𝐶𝑡 − 𝐾𝐾𝑀). (13) Среднее число молекул солюбилизата на мицеллу можно рассчитать: 𝑆̅ = 𝐾1 ∙ 𝑆ккм . (14) Свободную энергию мицеллообразования рассчитывается на основе уравнения: ККМ ∆𝐺 = 𝑅 ∙ 𝑇 ∙ (𝑙𝑛 мол ), (15) в где ∆G – свободная энергия мицеллообразования (кДж/моль); R – газовая постоянная, R=8,31 Дж/моль∙К; Т – температура; молв - молярность растворителя (воды), молв = 55,5. 1.5. Бактерии рода Rhodococcus – продуценты биосурфактантов Бактерии, относящиеся к роду Rhodococcus, являются актиномицетами с высоким содержанием гуанина и цитозина. Актинобактерии рода Rhodococcus представляют собой разнородную группу микроорганизмов, которые обнаруживаются во многих экологических нишах в таких, как почва, морская вода, патогены растений и животных [29]. При росте на агаризованной среде данный род бактерий образует круглые колонии, появляющиеся в среднем через 48 часов, чаще гладкие, но могут быть и шероховатыми с блестящей или матовой поверхностью от розоватого, молочно-белого, желтого цвета. Морфологические признаки: клетки грамположительные, подвижные, неспорообразующие, аэробы. Родококкам свойственен циклический характер развития, на 15 различных стадиях культивирования могут иметь как палочковидную форму, так и шарообразную (кокки). Выделить можно такие физиологические свойства, как температурный диапазон роста от 4 °С до 40°С, оптимальное значение 30°С. Микроорганизмы растут при рН 4,5-10, оптимальное значение рН 7,0. В качестве источника углерода для энергии и роста используют широкий антибактериальным диапазон препаратам органических лизоциму, - соединений. Вид чувствителен бензилпенициллину, к канамицину, мономицину, стрептомицину, тетрациклину. Бактерии рода Rhodococcus известны как наиболее активные деструкторы нефтепродуктов как в естественных биотопах загрязненных объектов, так и в составе специальных биотехнологических препаратов. Клеточная оболочка Rhodococcus ассоциирована с липидными компонентами (гликолипидами, пептидолипидами), и поэтому имеет липофильний характер, то есть высокую афинность к гидрофобным субстратам [31]. Родококки биохимически являются уникальными микроорганизмами. Синтезируемая ими ферментная система катализирует реакции биотрансформации практически всех классов органических соединений, они способны ассимилировать в качестве единственных источников углеродного питания газообразные углеводороды (пропан, н-бутан); способны расщеплять парацетамол, другие лекарственные препараты и некоторые наркотические вещества [30]. Для микроорганизмов данного рода характерно образование поверхностноактивных веществ гликолипидной природы в ответ на присутствие в питательной среде алканов. Такие вещества представляют собой один или два не восстанавливающих дисахарида трегалозы - С12Н22О11 (α-D-глюкопиранозил-1,1-α-D-глюкопираноза), связанных с миколовыми кислотами – длинноцепочечными α-разветвлёнными-αгидроксилированными жирными кислотами с различной длиной углеродной цепи. Бактерии рода Rhodococcus продуцируют два основных типа трегалолипидных биоПАВ: эндо-типа и экзо-типа. На основе ранее проведенных исследований [33, 34] предложили, что структура биосурфактанта соответствует тетраэфиру трегалозы, содержащий остаток янтарной кислоты и три остатка жирных кислот – октановой и декановой. Гидрофобная часть молекулы представлена остатками жирных кислот, а гидрофильная часть представлена трегалозой и сукцинатом, за счет этого вещество обладает поверхностно-активными свойствами и относится к анионному биоПАВ. Следует отметить, что тип и строение биоПАВ зависят от вида и штамма бактерий, субстрата и условий культивирования [39]. 16 1.6. Области применения биосурфактантов За счет своего химического разнообразия, многофункциональности и низкой токсичности биосурфактанты имеют множество преимуществ на ряду с синтетическими ПАВ. Они находят все большее практическое применение в различных отраслях промышленности, а именно: нефтяная и добывающая промышленность; сельское хозяйство; производство продуктов питания, моющих и чистящих средств; косметологии, медицине и т.д. Благодаря своей способности снижать натяжение поверхности и границы раздела как в водных растворах, так и смесях углеводородов, биоПАВ становятся потенциальными кандидатами для повышения выхода нефти и процессов разрушения эмульсии [38]. 1.6.1. Нефтяная промышленность. В нефтяной и добывающей промышленности возможно применение микробиологического происхождения сурфактантов для уменьшения вязкости нефти и облегчения ее транспортировки по нефтепроводам, для очистки танкеров и других емкостей от остатков нефти, для стабилизации и дестабилизации эмульсий, для улучшения горючих свойств нефти. В данной отрасли биосурфактанты наиболее активно применяются в качестве агентов для микробиологического увеличения нефтедобычи на основе группы культур микроорганизмов, которые продуцируют биосурфактанты различного строения [42]. 1.6.2. Биодеструкция нефти и нефтепродуктов В последнее время биологический метод очистки углеводородных загрязнений, основанный на применении микроорганизмов деструкторов нефти и нефтепродуктов, становится приоритетным при любых количествах и масштабах загрязнения. Он характеризуется как наиболее экономический, эффективный и безвредный способ очистки [1]. В результате проводимых лабораторных исследований установлено, интенсивное развитие всех использованных микроорганизмов в среде с нефтью, бензином, соляровым и машинным маслами наблюдается на 13-16 дни, и составляет в среднем 3,45•108 Кл/мл при росте на всех субстратах. На эффективность и скорость деструкции нефти и нефтепродуктов влияют состав и виды микроорганизмов, с которыми они контактируют. Степень окисления нефтепродуктов максимальна при участии большего количества смешанных видов нефтеокисляющих бактерий, относящихся к родам: Pseudomonas, Clostridium, Micrococcus, Brevibacterium, Bacillus, Flavobacterium., Alcaligenes. В присутствии трех культур (роды Pseudomonas, Micrococcus, Brevibacterium) степень 17 окисления уменьшается, а в среде с одной монокультурой (Pseudomonas) она минимальна. Исключение составляет опыт с бензиновой фракцией, растворимость которой максимальна по сравнению с другими применяемыми углеводородными компонентами, что облегчает транспорт молекул в клетку и её окисление. Кроме того, более высокая эффективность применения консорциума культур объясняется и сложностью субстрата, каковым является товарная нефть и масла. Эффективность деструкции бензина достигает 90% при применении трёх культур, что связано, по–видимому, с избирательностью и использованием этими углеводородокисляющими микроорганизмами лёгких фракций нефти. На это указывает нарастание численности микрофлоры в одинаковые сроки, которое наблюдалось на 13 – 16 дни эксперимента [28]. 1.6.3. Сельское хозяйство В области сельского хозяйства данные вещества применяются как агенты для биоремедиации сельскохозяйственных земель, которые загрязнены тяжелыми металлами и пестицидами, а также имеют высокопотенциальное значение благодаря своим противомикробным и противогрибковыми свойствам [41]. Все перечисленные свойства биосурфактантов допускают возможность их применения в роли агентов безопасного биоконтроля для растений, животных и человека. Кроме того, например, рамнолипиды оказывают стимулирующее действие на иммунную систему сельскохозяйственных растений [2]. 1.6.4. Медицина, фармацевтика и косметология В данных сферах деятельности человека биосурфактанты являются в главную очередь безопасными аналогами синтетических ПАВ и вспомогательными компонентами средств. Благодаря физико-химическим характеристикам эта группа веществ сохраняют свои свойства при изменениях условий внешней среды, что делает их наилучшими компонентами основы различных лекарственных форм, что является актуальной тенденцией при изготовлении легочных препаратов [14]. Биосурфактанты не только обладают противомикробной и противогрибковой активностью, но и антибиотикопленочной, антиадгезной и противовирусной активность, за счет этого они могут быть использованы как основные действующие вещества лекарственных свойств [15]. На данный момент известно, что синтетические липопетидные вакцины могут индуцировать вирус-специфические цитотоксические Т-лимфоциты против эпитопануклеопротеина гриппа, что дает возможность в поиске аналогичного препарата, но микробного происхождения [20]. Софоролипиды демонстрируют иммуномодулирующие и 18 противовоспалительные свойства, за счет чего их применение улучшают показатели выживаемости при сепсисе [16]. Софоролипиды коммерчески производятся в качестве увлажнителя компанией «Kao Corporation Ltd» (Япония) и используются в таких продуктах, как губная помада, увлажняющие средства для волос и кожи. Кроме того, предполагается, что софоролипиды уменьшают подкожную перегрузку кожи за счет стимуляции синтеза лептина через адипоциты. Точно так же исследования показали, что рамнолипиды являются биосовместимыми и идеально подходят для использования в косметических и фармацевтических препаратах для индивидуального ухода за кожей [58]. 1.6.5. Пищевая промышленность В данной отрасли промышленности сурфактанты микробиологического происхождения наиболее часто применяют в качестве функциональных компонентов и пищевых добавок, как эмульгаторы, антиоксидантые агенты и антиадгезивные агенты, так как обладают антиоксидантной активностью, стойки к высоким температурам и нетоксичны [19]. Например, рамнолипиды используют для улучшения текстуры теста, сохранения объема и консервации будущих хлебобулочных изделий [17]. 1.6.6. Производство моющих и чистящих средств На данный момент времени биосурфактанты являются основными претендентами на замену синтетических ПАВ в области производства моющих и чистящих средств. Множество коммерческих компаний перешли на использование гликолипидов в производимой продукций для стирки, мытья посуды и чистки [18]. 19 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Объекты исследования и условия культивирования 2.1.1. Объект исследования В качестве объекта исследования было выбрано 2 штамма бактерий Rhodococcus erythropolis S67 и Rhodococcus erythropolis X5, которые были представлены ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН г. Пущино. 2.1.2. Питательные среды и условия культивирования Чистые культуры микроорганизмов были получены пересевом на агаризованную полноценную среду Лурия-Бертрани (ЛБ), состав среды представлен в таблице 1. Инокулят был выращен на жидкой питательной среде ЛБ в пробирках при температуре 26°С и аэрации с частотой вращения 180 об/мин на орбитальной качалке «Excella 25» (Eppendorf, Германия) в течение 24 часов. Таблица 1. Состав питательных сред Компонент среды Содержание Cреда Лурия-Бертрани (на 1 л) Триптон 10 г Дрожжевой экстракт 5г NaCl 10 г Агар-агар 20 г Среда Эванса (на 1 л) K2HPO4 8,71 г 5M NH4Cl 1 мл 0,1M Na2SO4 1 мл 62мМMgCl2 1 мл 1мМCaCl2 1 мл 0,005 мМ (NH4)6Mo7O24 1 мл Микроэлементы (состав в 1% растворе HCl, г/л:ZnO – 0,41; FeCl2 – 1 мл 2,9; MnCl2 – 1,28; CuCl2 - 0,13; CoCl2 – 0,26; H3BO3 – 0,06) Готовую среду Эванса (табл.1) титровали 1М раствором соляной кислоты до pH=7,0. Автоклавировали в течение 30 мин при 121°С и давлении 1 атм. В качестве единственного источника углерода и энергии в среду добавляли субстрат – н-гексадекан (2% от общего объема), который добавляли перед автоклавированием. В коническую колбу, содержащую 150 мл среды Эванса, вносили 2 мл тщательно перемешанного инокулята. Культивирование 20 микроорганизмов проводили в колбах Эрленмейера объемом 750 мл при температуре 26°С и аэрации с частотой вращения 180 об/мин на орбитальной качалке «Excella 25» (Eppendorf, Германия) в течение 3 суток. 2.2. Экстракция биосурфактантов хлороформом и метанолом Экстракцию биосурфактантов проводили из проб культуральной жидкости объемом 100 мл. Пробы подкисляли 1 М HCl до рН=2,0 и оставляли на 12 ч при 4°C для того, чтобы произошел переход анионных биоПАВ в форму кислоты, если они находились в форме соли. Экстракцию проводили системой растворителей хлороформ:метанол (3:1 об/об). Соотношение объемов проб и растворителя 1:1 (100 мл : 100 мл). Органическую фазу (нижний слой) отделяли с помощью делительной воронки. Быстрое разделение фаз было достигнуто центрифугированием суспензии при 10000 об/мин в течение 10 мин. Пробы пропускали через сухой Na2SO4 для удаления остатков H2O. Растворитель удаляли на ротационном испарителе ИР – 1 ЛТ, labtex при 36°С и давлении 0,2 атм. Незадолго перед окончанием упаривания добавляли бензол для получения азеотропа и лучшего удаления следов воды, и упаривали досуха [32]. 2.3. Тонкослойная хроматография Разделение компонентов проводили на пластинах TLC Silicagel 60 F254 (Merck, Germany). В качестве подвижной фазы использовали систему хлороформ : метанол : вода (65 : 15 : 2 об/об/об). Для обнаружения гликолипидов пластины обрабатывали нафтольным реагентом (0,25 г α-нафтола в 50 мл смеси метанол : вода (1:1, об/об)), затем 10%-ой серной кислотой, и нагревали при 110°С до максимального проявления окраски [27]. 2.4. Определение содержания трегалолипидных биосурфактантов Содержание трегалолипидных биосурфактантов оценивали по количеству сахаров в водных растворах липидных экстрактов по данной методике [44]. Для этого определяли их содержание фотометрически методом абсолютной градуировки по содержанию трегалозы в стандартных растворах. Исходный раствор трегалозы (C12H22O11 × 2 H2O) концентрацией 1 мг/мл готовили, растворив 11,05 мг трегалозы в 10 мл воды. Для построения градуировочного графика делали серию стандартных растворов объемом 12,5 мл согласно таблице 2. В пробирку вносили 2 мл стандартного раствора, добавляли 1 мл свежеприготовленного 5% водного раствора фенола и 5 мл концентрированной серной 21 кислоты (ρ = 1,84 г/мл). Интенсивно перемешав в течение 10 с, выдерживали полученные растворы в течение 10 мин. Затем пробирки встряхивали и помещали на 20 мин в термоблок 4020 (Экрос, Россия) при температуре 30°С перед снятием показаний. Таблица 2. Состав серии стандартных растворов для градуировочной зависимости № Объем исходного Объем дистиллированной Концентрация трегалозы, раствора трегалозы, мл воды, мл мкг/мл 1 0,125 12,375 10 2 0,250 12,250 20 3 0,500 12,000 40 4 0,750 11,750 60 5 1,000 11,500 80 6 1,250 11,250 100 7 1,500 11,000 120 8 1,750 10,750 140 Измерение оптической плотности полученных растворов проводили на фотометре «Эксперт-003» (Эконикс-Эксперт, Россия), при длине кюветы 1 см и длине волны 470 нм. Раствор сравнения готовили аналогично, заменяя 2 мл раствора трегалозы дистиллированной водой. С анализируемыми водными образцами биосурфактантов проводили аналогичные операции. В том случае, если оптическая плотность образца превышала максимальное значение для линейного диапазона, исходную пробу разбавляли. Состав исследуемых образцов с учетом разбавления представлен в таблице 3. Содержание трегалозы находили по ранее полученной градуировочной зависимости. Таблица 3. Состав исследуемых образцов Объем Объем серной Объем 5% дистиллированной кислоты фенола, мл воды, мл (конц.), мл Штамм Объем пробы, микроорганизма мл Rh. erythropolis S67 1 1 1 5 Rh. erythropolis X5 1 1 1 5 22 Для расчета содержания биосурфактанта полученное значение концентрации сахара умножали на коэффициент, равный отношению молекулярной массы биосурфактанта на молекулярную массу соответствующего углевода. Для трегалолипидов, продуцируемых бактериями рода Rhodococcus этот коэффициент составляет 2,5. 2.5. Определение ККМ на основе измерений поверхностного натяжения растворов Поверхностное натяжение полученных водных растворов биосурфактантов определяли по методике [43] с использованием тензиометра Kruss K6 (Kruss, Германия). Готовили исходный водный раствор с концентрацией 250 мг/л. Методом разбавления получали серию образцов, в которых концентрации биосурфактанта находились в интервале 0-250 мг/л, измеряли поверхностное натяжение каждого раствора. ККМ определяли по точке перегиба на кривых зависимостях поверхностного натяжения от концентрации. 2.6. Газохроматографический анализ Анализ проводили на газовом хроматографе «Хроматэк Кристалл 5000.2» с колонкой Varian Capillary Column CP-Sil 8 CB (50 м) и пламенно-ионизационным детектором. С помощью микрошприца в испаритель вводили пробу и анализировали в условиях, указанных в таблице 4. Таблица 4. Условия проведения анализа № Условие анализа Значение 1 Температура колонки, °С 250 2 Температура испарителя, °С 300 3 Температура детектора, °С 250 4 Расход газа-носителя, мл/мин 17,4 5 Объем пробы, мкл 6 6 Время анализа, мин 10 Содержание гексадекана оценивали по количеству гексадекана растворенного в гексане методом абсолютной градуировки. Для этого готовили шесть стандартных растворов, содержащих 0,2; 0,5; 1; 2,5; 5 и 10% гексадекана. В мерные колбы с притертыми крышками вместимостью 25 мл вносили соответственно 0,05; 0,125; 0,25; 0,625; 1,25; 2,5 23 мл гексадекана. Доводили объем до метки гексаном и перемешивали. Строили градуировочную зависимость площади пика от концентрации гексадекана в стандартном растворе. Для установления солюбилизирующей способности биосурфактантов определяли остаточную концентрацию гексадекана в водной пробе различной концентрации. Для этого в пробирки добавляли 300 мкл гексадекана и 10 мл анализируемой пробы, закрывали пробкой и интенсивно встряхивали в течение 1 минуты. После пробирки оставляли при температуре 28°С, с частотой вращения 180 об/мин на орбитальной качалке «Excella 25» (Eppendorf, Германия) на 24 часа. После в пробирки с помощью градуированной пипетки приливали 10 мл гексана, закрывали пробкой и интенсивно встряхивали в течение 1 минуты. После отслоения фаз пипеткой отбирали верхний слой и переносили в колбу с притертой крышкой (50 мл). Таблица 5. Состав исследуемых проб для определения солюбилизирующей способности биосурфактантов Объем Содержание Объем исходного водного биосурфактантов, г/л раствора биосурфактантов, мл 1 0,035 1,4 8,6 2 0,050 2 8 3 0,100 4 6 4 0,150 6 4 5 0,200 8 2 6 0,250 10 0 № дистиллированной воды, мл Измерение концентрации гексадекана в анализируемых пробах также проводили в условиях, указанных в таблице 5. Если определяемый компонент был обнаружен, то его концентрацию определяли с использованием градуировочной зависимости, установленной ранее. 2.7. Колориметрическое определение солюбилизации В пробирки вносили растворы общим объемом 10 мл трегалолипидов в концентрации 0,035; 0,050; 0,100; 0,150; 0,200 и 0,250 г/л (табл. 6). Концентрация исходного раствора составляет 0,250 г/л. В каждый приготовленный раствор добавляют 10 мг олеофильного красителя, Судан III. Пробирки закрывали и оставляли при температуре 24 28°С, с частотой вращения 180 об/мин на орбитальной качалке «Excella 25» (Eppendorf, Германия) на 24 часа. После перемешивания содержимое пробирок пропускали через бумажный фильтр. Таблица 6. Объем растворов и воды для приготовления серии анализируемых растворов Объем исходного водного Объем раствора биосурфактантов, дистиллированной мл воды, мл 0,035 1,4 8,6 2 0,050 2,0 8,0 3 0,100 4,0 6,0 4 0,150 6,0 4,0 5 0,200 8,0 2,0 6 0,250 10,0 0 Номер Содержание раствора биосурфактантов, г/л 1 Измерение оптической плотности полученных растворов проводили на фотометре «Эксперт-003» (Эконикс-Эксперт, Россия), при длине кюветы 1 см и длине волны 525 нм. Раствор сравнения –дистиллированная вода. С помощью калибровочного графика по величине оптической плотности определяли количество солюбилизированного до насыщения Судана III в растворах. Для получения калибровочного графика в колбу вносили точную навеску красителя (10 мг) и приливали 10 мл ацетона, тщательно перемешав. Из исходного раствора последовательным разбавлением готовили несколько растворов, измеряя оптическую плотность после каждого разбавления. Далее рассчитывали содержание растворенного красителя в каждом измеренном растворе и строили графическую зависимость оптической плотности от концентрации Судана III. 25 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Биосурфактанты являются альтернативой синтетическим сурфактантам в связи их низкой токсичностью, практически полной биоразлагаемостью, возможностью получения из дешевых и возобновляемых источников, разнообразием физико-химических свойств и т.д. Биосурфактанты уже в настоящее время применяют в различных отраслях и процессах жизнедеятельности человека [19, 20, 41, 42], таких как нефтяная и добывающая промышленность, при биоремедиации загрязненных территорий нефтью; сельское хозяйство; производство продуктов питания, моющих и чистящих средств; косметологии, медицине. Гликолипиды, наиболее известные и изученные биосурфактанты, состоят из углеводов в сочетании с жирными кислотами. Среди них наиболее известны рамнолипиды (Pseudomonas sp.), трегалолипиды (Rhodococcus) и софоролипиды, продуцируемые дрожжевыми штаммами [51]. В большинстве случаев в состав биопрепаратов включается биомасса штаммовдеструкторов, обладающих различными свойствами, в том числе способностью к продуцированию биосурфактантов, которые применяются для очистки территорий загрязненной нефтью. Однако целесообразным может оказаться дополнительное включение в состав биопрепаратов выделенных биосурфактантов химическими методами для увеличения их концентрации в конечном препарате с целью повышения эффективности очистки загрязненных территорий. Поэтому актуальным является не только получение биосурфактантов как индивидуальных веществ, но и изучение их свойств для дальнейшего определения сфер их применения. Объектом исследования в нашей работе являлись два штамма бактерий рода Rhodococcus, входящих в состав биопрепарата «МикроБак» [70], который применяется для биоремедиации почв загрязненных нефтью и нефтепродуктами. Для выделения биосурфактантов гликолипидной природы культуры Rh. erythropolis S67и Rh. erythropolis X5 выращивали на жидкой минеральной среде с добавлением нгексадекана в качестве единственного субстрата. Для определения физико-химических характеристик в первую очередь необходимо выделить биосурфактанты из культуральной жидкости и подтвердить наличие гликолипидов в их структуре методом тонкослойной хроматографии. Выделение липидных биосурфактантов из культуральной жидкости проводили экстракцией полярными органическими растворителями. Экстракция является одним из перспективных методов разделения и концентрирования веществ. Выделение биоПАВ 26 прежде всего зависит от их заряда, растворимости в воде и местоположения. Заранее пробы подкисляли до pH=2,0 для осуществления перехода анионогенных биоПАВ в форму кислоты, так как вещества, несущие в себе заряд, не могут переходить в органический растворитель. В качестве экстрагента хлороформ:метанол (3:1 об/об). было взята система растворителей Данные вещества являются эффективными и удовлетворяют ряду требований, применяемых к экстрагентам: являются летучими веществами и хорошими растворителями определяемых компонентов, обладают селективностью, обладают малой растворимостью в воде и не реагируют с извлекаемыми компонентами [46]. Далее полученный экстракт упаривали на роторном испарителе, получив смесь внеклеточных липидов, которые могут представлять собой биосурфактанты. Для подтверждения химической структуры выделенных биосурфактантов, продуцируемых исследуемыми бактериями, полученный экстракт липидов анализировали методом тонкослойной хроматографии. Для обнаружения на хроматограмме тетраэфиров трегалозы применяли α-нафтольный реагенткоторый является специфическим проявителем для сахаров, позволяющий идентифицировать трегалолипиды среди других липидных компонентов. Трегалолипиды проявляются в виде сине-фиолетовых пятен. Рисунок 8. Хроматограмма липидных экстрактов, выделенных бактериями штаммов X5 и S67 при росте на н-гексадекане. На хроматограмме (рис. 8) смесей липидных экстрактов на линии старта обнаружены пятна, которые говорят о присутствии воды в образцах, которую полностью 27 не удалось удалить с помощью сульфата натрия. Вследствие этого не было достигнуто четкого разделения трегалолипидных компонентов. Проявленные компоненты в виде сине-фиолетовых пятен подтверждают наличие углеводной части молекул, соединений, которые относятся к трегалолипидным биосурфактантам. Для полученных хроматограмм по наиболее проявленным пятнам были определены величины удержания Rf, полученные данные представлены в таблице 7. Пятна, обнаруживаемые у линии финиша, не относятся к гликолипидам, однако могут проявляться при использовании реагента α-нафтола и серной кислоты. Сравнивая полученные данные с литературными (табл. 7), можно сделать вывод, что биосурфактанты штаммов бактерий Rhodococcus дают разные хроматограммы с различным количеством пятен и величинами удерживания, однако одно наиболее окрашенное крупное пятно присутствует во всех хроматограммах с Rf 0,35 – 0,39, кроме хроматограммы штамма Rh. erythropolis A29-k1. Нужно отметить, что на величину удерживания влияют различные факторы, такие как природа вещества, органический растворитель, состав элюирующей смеси, поэтому для детального сравнения выделяемых биосурфактантов разными штаммами бактерий необходимо ставить ТСХ в одинаковых условиях, чтобы учесть все влияющие факторы. Таблица 7. Сравнительная характеристика значений Rf трегалолипидов различных штаммов бактерий Rhodococcus Штамм микроорганизмов Rf1 Rf2 Rf3 Rh. erythropolis X5 0,38 0,50 0,59 Rh. erythropolis S67 0,37 0,50 - Rh. ruber IEGM 231 [59] 0,18 0,39 0,75 Rh. erythropolis A29-k1 [60] 0,46 0,54 - Rh. sp. 3-2 [32] 0,35 0,53 0,56 Вещества с Rf1 являются наиболее окрашенными пятнами на хроматограмме. Проявленные трегалолипидные компоненты могут иметь структурные различия, однако все содержат остатки углеводов и полученные результаты соответствуют результатам более ранних исследований [34, 45]. Количество полученных трегалолипидов определяли по измерению содержания трегалозы в образцах водных растворов липидных экстрактов обоих штаммов. Далее делали перерасчет на биосурфактанты. 28 Содержание биосурфактантов определяли фотометрически высокочувствительным фенольно-серным методом [44]. Заранее строили градуировочную зависимость оптической плотности от концентрации трегалозы (рис. 9). Результаты измерений представлены в приложении 1, параметры уравнения градуировочной зависимости – в таблице 8. Оптическая плотность, опт.ед. 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Концентрация трегалозы, мкг/мл Рисунок 9. Графическая зависимость оптической плотности от содержания трегалозы в стандартных растворах Таблица 8. Параметры уравнения градуировочной зависимости Параметр Значение y0 0,0266 A 0,0026 Коэффициент корреляции 0,9929 В таблице 9 приведены результаты измерений оптической плотности образцов водных растворов липидов фенольно-серным методом. Таблица 9. Результаты измерений исследуемых образцов по фенольно-серному методу Штамм Оптическая плотность, опт. ед. D̅ S Δ 0,202 0,190 0,0160 0,020 0,159 0,157 0,0038 0,004 микроорганизма D1 D2 D3 Rh. erythropolis X5 0,170 0,185 Rh. erythropolis S67 0,153 0,160 29 Содержание трегалозы в пробах рассчитывали через уравнение градуировочной зависимости и далее рассчитывали содержание биосурфактантов через коэффициент, равный отношению молекулярной массы биосурфактанта (862 г/моль) на молекулярную массу трегалозы (342 г/моль) (k = 2,5) с учетом разбавления образцов [44]. Результаты расчетов представлены в таблице 10. Таблица 10. Содержание биосурфактантов в исследуемых пробах с учетом разбавления Содержание трегалозы, Содержание мкг/мл биосурфактантов, г/л Rh. erythropolis X5 120±10 0,31±0,04 Rh. erythropolis S67 101±3 0,251±0,008 Штамм микроорганизма Бактерии обоих штаммов культивировали в течение 3-х суток и в ходе эксперимента можно заметить, что Rh. erythropolis X5 продуцируют биосурфактанты в большем объеме в отличие от Rh. erythropolis S67. Представленные результаты соответствуют уже более ранним исследованиям Лыонг Т.М. [34] , где содержание трегалолипидных биосурфактантов составляет около 0,3 г/л. Такое же содержание (0,3 г/л) трегалолипидов было получено Вайтом [47] в бесклеточном супернатанте в ходе культивирования Rhodococcus sp. PLM026 на подсолнечном масле при 19°С . Одним из важных коллоидно-химических свойств ПАВ является способность снижать поверхностное натяжение (воздух – вода). Вследствие этого эффективность биосурфактантов можно оценить, измерив поверхностное натяжение бесклеточного супернатанта. Бесклеточную среду получали центрифугированием культуральной жидкости при 10 000 об/мин в течение 10 минут и с помощью тензиометра определяли поверхностное натяжение растворов методом отрыва кольца [9]. Определение проводилось при температуре 26°С, результаты представлены в таблице 11. Таблица 11. Значения поверхностного натяжения бесклеточного супернатанта Штамм микроорганизма Поверхностное натяжение ± Δ, мН/м Rh. erythropolis X5 24,2 ± 0,3 Rh. erythropolis S67 25,0 30 Полученные результаты соответствуют данным других авторов. Трегалолипиды, продуцируемые бактериями рода Rhodococcus, способны снижать поверхностное натяжение водных раствор с 72 мН/м до значения от 19 по 43 мН/м при достижении ККМ от 0,7 до 37 мг/л [52]. В работе Тулевой [71] исследовали так же тетраэфиры трегалозы продуцируемые штаммом Rh. wratislaviensis BN38, которые способны снижать поверхностное натяжение до 24, 4мН/м при ККМ равной 5 мг/л. Биосурфактанты как природные ПАВ количественно можно охарактеризовать, определив его критическую концентрацию мицеллообразования. Определение ККМ поверхностно-активных веществ основано на изучении зависимости какого-либо физического свойства системы от его концентрации. При концентрациях, меньших ККМ, в растворах ПАВ присутствуют лишь молекулы и зависимость любого свойства определяется именно концентрацией молекул. При образовании мицелл в растворах свойство претерпевает резкое изменение в связи со скачкообразным увеличением размера растворенных частиц. Наиболее распространены методы определения ККМ по измерению поверхностного натяжения и межфазного натяжения растворов, солюбилизации гидрофобных красителей, электропроводимости (для ионогенных ПАВ), осмотического давления, мутности растворов турбидиметрией [22]. На кривой зависимости «свойство – концентрация» в области ККМ обычно появляется излом Одна из ветвей кривых описывает свойства системы в молекулярном состоянии, а другая — в коллоидном. Абсциссу точки излома условно считают соответствующей переходу молекул в мицеллы, т. е. критической концентрацией мицеллообразования. В отдельных случаях определенные значения ККМ различными методами не совпадают. Необходимо упомянуть, что ККМ — это не точное значение концентрации, а некоторый узкий интервал концентраций, в котором начинается процесс мицеллообразования. По данной причине необходимо описывать метод определения, условия измерения и погрешность определения ККМ. Для определения ККМ в нашей работе получали зависимость поверхностного натяжения водных растворов липидных экстрактов от его содержания. Результаты представлены в таблице 12. Таблица 12. Значения поверхностного натяжения водных растворов биосурфактантов Штамм микроорганизма Rh. erythropolis X5 31 Rh. erythropolis S67 № Содержание биосурфактантов, мг/л Поверхностное натяжение, мН/м 1 0 68,7 ± 0,7 68,7 ± 0,7 2 11,3 58,7 ± 0,7 60,7 ± 0,7 3 17 41,2 ± 0,3 39,5 ± 0,6 4 256 33,7 ± 0,7 31,7 ± 0,7 5 38 27,0 27,0 6 57,5 27,2 ± 0,3 27,0 7 69 27,0 26,8 ± 0,3 8 83 26,8 ± 0,3 26,3 ± 0,7 9 100 25,3 ± 0,7 25,7 ± 0,7 10 120 25,3 ± 0,7 25,8 ± 0,3 11 144 25,0 25,7 ± 0,7 12 173 25,0 25,8 ± 0,3 13 250 24,7 ± 0,3 25,0 Анализ зависимости (рис. 10) поверхностного натяжения раствора от содержания водных растворов биосурфактантов выявил четкую зависимость его поверхностной активности от их содержания в растворе. При низких содержаниях до 25 мг/л наблюдается линейная зависимость, причем происходит резкое уменьшение поверхностного натяжения при увеличении содержания биосурфактанта в пределах от 30 - 35 г/л. При дальнейшем увеличении содержания биосурфактанта темпы снижения поверхностного натяжения замедляются вследствие постепенного насыщения поверхностного слоя молекулами биосурфактанта. При достижении ККМ биосурфактанты в водном растворе начинают образовать мицеллы и поверхностное натяжение дальше не изменяется при увеличении содержания биосурфактантов. Абсцисса точки излома на графиках зависимости поверхностного натяжения от содержания биосурфактанта равна 33 мг/л. 32 80 X5 60 Поверхностное натяжение, мН/м Поверхностное натяжение, мН/м 80 40 20 S67 60 40 20 0 0 0 50 100 150 200 250 0 300 50 100 150 200 250 300 Содержание биосурфактантов, мг/л Содержание биосурфактанта, мг/л Рисунок 10. Графики зависимости поверхностного натяжения от содержания биосурфактантов В таблице 13 приведены характеристики некоторых биосурфактантов, которые выделяли другие исследователи, где были определены значения поверхностного натяжения и ККМ. Таблица 13. Характеристики биосурфактантов в других исследованиях № 1 Биосурфактант / микроорганизм Поверхностное натяжение, мН/м Рамнолипиды / Pseudomonas aeruginosa S6 [48] ККМ, мг/л 33,9 50,0 30,9 24,0 30,7 40 26,8 54 26-32 4-15 Гликолипиды (стафилозан) / 2 Staphulococcus saprophyticus SBPS – 15 [49] 3 4 5 Гликолипиды / Rhodococcus sp. HL – 6 [50] Гликолипиды / Rhodococcus ruber IEGM 235 [72] Трегалолипиды / Rhodococcus erythropolis DSM 43215 [72] Полученные нами результаты согласуются с данными других авторов по поверхностной активности водных растворов биосурфактантов бактерий родококков при росте на гидрофобных субстратах и по эффективности не уступают другим видам гликолипидов. 33 Выделенные трегалолипиды эффективнее снижают поверхностное натяжение системы «вода-воздух» при низкой концентрации их в водных растворах. В сравнение синтетические ПАВ, как например, додецилсульфат натрия (ККМ=2,34 г/л) и Твин-80 (ККМ=0,016 г/л) снижают поверхностное натяжение воды с 72 мН/м до 37 и 34,8 мН/м соответственно [61, 68, 69]. Биосурфактанты способствуют биодоступности гидрофобных субстратов для клеток за счет окружения трудодоступного органического субстрата молекулами ПАВ в форме мицелл, далее мицеллы связываются с поверхностью бактерий и уже затем диссоциируют в гидрофобном сайте клеточной стенки [65]. Способность ПАВ эффективно участвовать в солюбилизации гидрофобных веществ с точки зрения коллоидной химии можно охарактеризовать солюбилизацией. Солюбилизация - процесс псевдорастворения гидрофобного субстрата в мицеллах ПАВ. Эту величину могут выражать в размерности моль солюбилизата/моль ПАВ, т.е. количество гидрофобного вещества солюбилизированного одним молем ПАВ. На данный момент наиболее распространённым метод определения солюбилизирующей способности биосурфактантов к гидрофобном вещества является газовая хроматография [48-50, 72-74]. Вследствие определения трудоемкой солюбилизирующей пробоподготовки способности для газохроматографического биосурфактантов был рассмотрен колориметрический метод анализа, основанный на насыщение водных растворов ПАВ олеофильным красителем. Судан III – олеофильный краситель красновато-коричневого цвета, который нерастворим в воде, но растворяется в гидрофобной части мицелл, вызывая окрашивание раствора. Интенсивность окраски раствора выше, чем больше количество солюбилизировано красителя в мицеллах ПАВ. Концентрацию солюбилизированного Судана III определяли фотометрически. Для этого заранее строили градуировочную зависимость оптической плотности от содержания красителя растворенного в ацетоне (рис. 10). Результаты измерений представлены в таблице 14, параметры уравнения градуировочной зависимости – в таблице 15. Таблица 14. Результаты измерений стандартных растворов № 1 Концентрация Оптическая плотность, опт. Судана III, ед. (*10-5) моль/л D1 D2 D3 14,2 1,284 1,295 1,296 34 D̅ S Δ 1,292 0,007 0,008 2 7,1 0,897 0,905 0,908 0,903 0,006 0,006 3 3,5 0,566 0,573 0,572 0,570 0,004 0,004 4 1,8 0,297 0,310 0,306 0,304 0,007 0,008 5 0,7 0,118 0,119 0,119 0,119 0,001 0,001 1,6 Оптическая плотность 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Концентрация ацетонового раствора Судана III, (*10-5)моль/л Рисунок 10. Графическая зависимость оптической плотности от концентрации красителя в стандартных растворах Таблица 15. Параметры уравнения градуировочной зависимости Параметр Значение y0 0,1793 A 0,0839 Коэффициент корреляции 0,9732 На рисунке 11 представлены полученные растворы биосурфактантов с различным содержанием их в системе и с избытком гидрофобного красителя. Наглядно видно, что при увеличении содержания гликолипидов в системе Судан III не растворяется равномерно в объеме раствора. Наблюдается эмульгирование красителя в верхнем слое жидкости, с увеличением содержания биосурфактантов в системе данное явление увеличивается. 35 Рисунок 11. Растворы Судана III в присутствии биосурфактантов Это можно объяснить скорее всего природой изучаемых биосурфактантов. На основе ранее проведенных исследований [33, 34] было доказано, что структура выделенных биосурфактантов бактериями Rh. erythropolis X5 и Rh. Erythropolis S67 соответствует тетраэфиру трегалозы с миколовыми кислотами - остаток янтарной кислоты и три остатка жирных кислот – октановой и декановой. Гидрофобная часть молекулы представлена остатками жирных кислот, а гидрофильная часть представлена трегалозой и сукцинатом, за счет этого вещество обладает поверхностно-активными свойствами и относится к анионному биоПАВ. В поставленном эксперименте выделенные биосурфактанты проявляют себя как биоэмульгаторы. Вследствие полученных результатов было принято решение проверить методику колориметрического определения солюбилизирующей способности на одном из более изученном синтетическом анионном ПАВ, додецилсульфате натрия (ДСН). Условия проведения опыта не изменяли, концентрация в водных растворах была взята выше ККМ. Значение ККМ синтетического поверхностно-активного вещества составляет 8,1*10-3 моль/л (2,34 г/л) [6]. На рисунке 15 представлены окрашенные растворы до и после пропускания через бумажный фильтр. Заметно увеличение интенсивности окраски растворов при увеличении концентрации ДСН. В таблице 16 приведены результаты измерений оптической плотности окрашенных водных растворов колориметрическим методом. Рисунок 15. Окрашенные водные растворы Судана III в присутствии ДСН до и после фильтрования 36 Таблица 16. Результаты измерений исследуемых растворов Судана III в присутствии ДСН № Оптическая плотность, опт. ед. Содержание ДСН, D̅ S Δ 0,489 0,486 0,003 0,003 0,729 0,731 0,732 0,003 0,003 1,430 1,393 1,414 1,410 0,019 0,020 1,767 1,765 1,781 1,770 0,009 0,010 г/л D1 D2 D3 1 2,5 0,483 0,486 2 5,0 0,735 3 10,0 4 15,0 Определили псевдорастворимость Судана III в мицеллах ДСН каждого полученного водного раствора (табл. 17), результаты представлены в таблице. Через 24 часа средняя молярная солюбилизация Судана III в водном растворе в присутствие ДСН составляет 0,004 моль/моль. Таблица 17. Молярная солюбилизирующая способность мицелл ДСН при различной концентрации № Концентрация ДСН, моль/л Концентрация Молярная солюбилизированного Судана солюбилизирующая III, (*10-5)моль/л способность (Sm), моль/моль 1 0,009 3,66 0,0042 2 0,017 6,58 0,0038 3 0,035 14,70 0,0042 4 0,052 18,97 0,0037 Среднее значение Солюбилизирующую способность 0,0040 ПАВ для гидрофобного органического соединения можно охарактеризовать солюбилизирующей емкостью мицелл (СЕМ), которая определяется как увеличение концентрации солюбилизированного гидрофобного соединения (моль/л) на единицу увеличения концентрации мицеллярного ПАВ (моль/л) или тангенс угла наклона изотермы солюбилизации (рис. 16). 37 Концентрация солюбилизированного Судана III, моль/л 0,00025 0,00020 0,00015  0,00010 0,00005 0,00000 0,00 tg = СЕМ 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 Концентрация ДСН, моль/л Рисунок 16. Изотерма солюбилизации ДСН СЕМ додецилсульфата натрия для Судана III в нашей работе составляет 0,0037 моль/моль. В таблице 18 представлены значения СЕМ различных систем и определенные двумя различными методами для сравнительного анализа. Значения СЕМ отличаются друг от друга, вследствие того, что есть различие в природе солюбилизата и в условиях поставленного опыта (температура, наличие перемешивания, время выдерживания). Все данные факторы влияют на значение ККМ и, следовательно, на солюбилизирующую способность ПАВ. Например, Судан I в химической структуре имеет на одно ароматической кольцо меньше в отличие от Судана III, за счет чего Судан I лучше солюбилизируется мицеллами ДСН. Таблица 18. Сравнительная таблица величин солюбилизации гидрофобных веществ мицеллами ДСН № Гидрофобное органическое Метод соединение 1 гексадекан 2 Судан I 3 перхлорэтилен Газовая хроматография [61] Колориметрический [29] Газовая хроматография [64] 38 СЕМ, моль/моль 0,0180±0,0020 0,0118 0,16 На основе полученного результата и изученной литературы можно утверждать, что колориметрическое определение солюбилизирующей способности ПАВ является рабочим и используемым методом на практике. Однако в нашей работе показано, что для ПАВ микробиологической природы колориметрический метод определения солюбилизирующей способности не подходит, вследствие того, что преобладает эмульгирующая способность трегалолипидных биосурфактантов бактерий рода Rhodococcus, особенно при содержании биоПАВ 0,2-0,25 г/л. Газохроматографическое определение солюбилизированного н-гексадекана проводили по методике определения содержания нефтепродуктов в природных и сточных водах газохроматографическим методом [66] на газовом хроматографе «Хроматэк Кристалл 5000.2» с колонкой Varian Capillary Column CP-Sil 8 CB (50 м) и пламенноионизационным детектором. Заранее строили градуировочную зависимость площади пика н-гексадекана от концентрации гексадекана растворенного в гексане (рис. 18). Время удерживания гексана при заданных условиях анализа составило 6,92 минут, время удерживания н-гексадекана – 7,42 минут (рис. 17). Рисунок 17. Хроматограмма гексанового экстракта анализируемой пробы Результаты измерений представлены в приложении 2, параметры уравнения градуировочной зависимости – в таблице 19. 39 3,5e+5 Площадь пика 3,0e+5 2,5e+5 2,0e+5 1,5e+5 1,0e+5 5,0e+4 0,0 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 Концентрация гексадекана, моль/л Рисунок 18. Графическая зависимость площади пика от концентрации гексадекана в стандартных растворах Таблица 19. Параметры уравнения градуировочной зависимости Параметр Значение y0 6302,8481 A 807692,1287 Коэффициент корреляции 0,9946 В таблице 20 приведены результаты газохроматографического определения несолюбилизированного н-гексадекана, его количество в пробах рассчитывали через уравнение градуировочной зависимости. Количество солюбилизированного биосурфактантами н-гексадекана определяли по разности его начальной концентрации в системе и концентрации несолюбилизированного, но экстрагированного гексаном. Начальная концентрация н-гексадекана в водных растворах биосурфактантов составляла 0,00995 моль/л. Таблица 20. Результаты измерений анализируемых проб Концентрация № биосурфактантов, *10-4 моль/л 1 0, 41 Концентрация солюбилизированного нгексадекана , *10-4моль/л 1,4 Площадь пика 2 0,58 86552,537 86475,700 3 1,16 86343,561 4,0 4 1,74 86085,771 7,2 5 2,32 85870,763 9,9 6 2,90 85688,853 12,1 2,4 40 Через 24 часа средняя молярная солюбилизация н-гексадекана в водном растворе в присутствие биосурфактантов составляет 3,95 моль/моль. Изотерма солюбилизации имеет линейный характер (рис. 19) при концентрации трегалолипидов выше ККМ, что Концентрация солюбилизированного н-гексадекан, моль/л свидетельствует о постоянной форме мицелл. 0,0014 0,0012 0,0010 0,0008 0,0006 0,0004 0,0002 0,0000 0,0000 0,0001 0,0002 0,0003 Концентрация биосурфактантов, моль/л Рисунок 19. Изотерма солюбилизации гексадекана мицеллами биосурфактантов Для описания процесса солюбилизации в нашей работе использовали молярный коэффициент солюбилизации (MSR) или же солюбилизационная емкость мицелл (CEM); коэффициент распределения солюбилизата между мицеллами и дисперсионной средой (коэффициент распределения мицелла-вода, Кm) и энергию солюбилизации (∆Gs̊). Эти характеристики рассчитывали на основе солюбилизированного н-гексадекана выделенными биосурфактантами, результаты представлены в сравнительной таблице 21. Таблица 21. Сравнительная таблица полученных и литературных данных физикохимических характеристик солюбилизации различных по природе веществ СЕМ, log(Km) ∆Gs̊, кДж/моль 4,34 1,065 -35,5 Монорамнолипиды [67] 0,89 8,25 - 3 Дирамнолипиды [67] 3,8 - - 4 ДСН [61] 0,018±0,002 9,40 -54,5 5 Твин 80 [61] 15,1±0,7 11,12 -64,4 6 Тритон X-100 [61] 40±8 11,13 -64,6 № ПАВ 1 Трегалолипиды 2 моль/моль 41 Для изученной системы величина свободной энергии солюбилизации имеет отрицательное значение (∆Gs̊ = -35,5 кДж/моль), что указывает на самопроизвольно протекающий процесс. Выделенные трегалолипидные биосурфактанты имеют низкое значение сродства гидрофобного н-гексадекана к молекулам в форме мицелл. Среди гликолипидных биосурфактантов (табл. 21) выделенные трегалолипиды эффективней солюбилизируют н-гексадекан в водных растворах. Однако уступают в солюбилизации гексадекана синтетическим ПАВ, а именно ПАВ с неионногенной природы, как Твин 80 и Тритон Х-100, которые на десяток и выше лучше солюбилизируют н-гексадекан. В работе [75] обнаружиди, что гликолипидные биосурфактанты, продуцируемые бактериями Rhodococcus sp. H13-A, в 2,5 раза эффективнее, чем Твин 80, при солюбилизации нафталина и его метилпроизводного. Бактерии-нефтедеструкторы Rhodococcus sp. S67 и Rhodococcus sp. X5 компоненты, входящие в состав биопрепарата «МикроБак» [70] – являются эффективными продуцентами гликолипидных биосурфактантов. По сравнению с остальными видами гликолипидных биосурфактантов выделенные нами трегалолипиды, проявляющие эффективную солюбилизирующую способность в отношении н-гексадекана в водном растворе, обладают значительным биотехнологическим потенциалом для получения сукциноилтрегалолипидов с целью их дальнейшего жизнедеятельности человека. 42 применения в сферах 4. ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ 4.1. Технико-экономическое обоснование дипломной работы Биосурфактанты в последнее время находят все более широкое применение в различных областях промышленности и жизнедеятельности человека. Основной задачей ученых является разработка эффективных методов очистки окружающей среды, в том числе методов биоремедиации почв от продуктов нефти с применением микроорганизмовдеструкторов. Изучение свойств биосурфактантов является актуальной темой для возможного дальнейшего их применения в биотехнологических целях. В нашей работе использовались два штамма бактерий-нефдеструкторов Rhodococcus sp. S67 и Rhodococcus sp. X5 для получений сведений о солюбилизирующей способности выделенных трегалолипидных биосурфактантов данными микроорганизмами в отношении гидрофобных веществ. Для поставленной цели были применены такие методы, как экстракция – выделение и концентрирование веществ, тонкослойная хроматография – подтверждения наличия гликолипидов, фенольно-серный метод – количественное определение содержания трегалолипидов в пробе, тензиометрическое определение поверхностного натяжения и методы определения солюбилизирующей способности гидрофобных веществ. 4.2. Расчет стоимости исследования Расчет стоимости сырья и материалов представлен в таблице 22. Таблица 22. Затраты на сырье и материалы Наименование сырья и материалов Триптон Дрожжевой экстракт NaCl Агар-агар K2HPO4 NH4Cl Na2SO4 MgCl2 CaCl2 (NH4)6Mo7O24 ZnO FeCl2 MnCl2 CuCl2 CoCl2 Единица Количество измерения 500 г 2,5 г 500 г 1,25 г 1 кг 2,5 г 500 г 5г 500 г 2,18 г 100 мл 0,5 мл 100 мл 0,5 мл 100 мл 0,5 мл 500 г 1г 1л 0,5 мл 100 г 0,41 г 250 г 2,9 г 100 г 1,28 г 100 г 0,13 г 100 г 0,26 г 43 Цена, руб./ед.изм. 5 739 3 064 119 3 687 856 240 140 425,7 262 523 277 3 900 121 312 707 Сумма, руб. 28,70 7,66 0,30 36,87 3,73 1,20 24,50 2,13 0,52 0,26 1,14 45,24 1,55 0,41 1,84 H3BO3 н-гексадекан HCl Хлороформ Метанол Na2SO4 Бензол α-нафтол H2SO4 Трегалоза Фенол Судан III Лаурилсульфат натрия Ацетон Гексан Наконечники для автоматических пипеток до 200 мкл Наконечники для автоматических пипеток до 1 мл Наконечники для автоматических пипеток до 5 мл Фильтровальная бумага Пластины TLC Silica gel 60 F254 Всего Транспортно-заготовительные затраты Итог 100 г 1л 1л 1л 1л 500 г 1л 50 г 1л 10 г 750 г 10 г 100 г 1л 1л 0,06 г 14,4 мл 25 мл 215 мл 65 мл 100 г 1 мл 0,25 г 70 мл 11,05 мг 2,5 г 0,13 г 0,325 г 60 мл 360 мл 465 4 425 238 374 800 320 436 2 202 193 2 050 2 349 484 284 220 651 0,28 63,72 5,95 80,41 52,00 64,00 0,44 11,01 13,51 2,27 7,83 6,29 0,92 13,20 234,36 96 шт 25 шт 683 177,86 500 шт 25 шт 480 24,00 250 шт 25 шт 3 720 372,00 1 кг 10 г 271 2,71 25 шт 1 шт 13 490 539,60 1 828,41 182,84 2 011,25 4.3. Расчет затрат на электроэнергию и воду для технических нужд Расчет затрат на электроэнергию производится по формуле: Пз = ∑(М ∙ Ки ∙ 𝑡𝑖 ∙ 𝑉), (16) где М - мощность электроприбора по паспорту, кВт; Ки - коэффициент мощности электроприборов, 0,8; ti- время работы электроприбора в период выполнения дипломной работы, ч; V - цена одного кВт × ч (4,80 руб.). Расчет затрат на электроэнергию представлен в таблице 23. Таблица 23. Расчет затрат на электроэнергию Наименование прибора Мощность прибора, кВт Время работы, ч Сумма, руб. Шкаф вытяжной 0,750 20,0 57,60 Центрифуга 0,485 0,5 0,93 Холодильник 0,280 1 200,0 44 1 290,24 Автоклав 2,000 1,5 11,52 Весы технические 0,005 1,0 0,02 Весы аналитические 0,011 1,0 0,04 Магнитная мешалка 0,005 2,0 0,04 Орбитальная качалка 0,240 144,0 132,71 Ротационный испаритель 1,500 5,0 28,80 Ламинарный бокс 0,300 1,0 1,15 pH-метр 0,100 2,0 0,77 Термостат 0,500 144,0 276,48 Термоблок 0,350 1,5 2,02 Фотометр 0,006 3,0 0,07 Газовый хроматограф 0,700 15,0 40,32 Итог 1 842,71 Расчет затрат на воду для технических нужд производится по формуле и представлен в таблице 24: 𝑉 = ∑(𝑉𝑖 ∙ 𝑡𝑃𝑖 ∙ Цв ), (17) где Vi - часовой расход воды, м /ч; tpi - время работы, ч; Цв - цена 1 м3 воды с учетом слива в канализацию (47,15 руб.). Таблица 24. Расчет затрат на воду для технических нужд Наименование Расход воды, м3/ч Время работы, час Сумма, руб. Водоструйный насос 0,4 4 75,44 Вода проточная 0,35 40 660,1 Мытье посуды 0,2 10 94,3 Итог 829,84 Энергозатраты и затраты на воду в сумме составляют: 1842,71 + 829,84 = 2 672,55 руб. 4.4. Расчет заработной платы и начислений на социальные нужды А) Основная заработная плата исполнителя Должность исполнителя: студент 45 Время работы: 4 месяца Основная заработная плата исполнителя в месяц: 15 279 руб. Основная заработная плата исполнителя за весь период работы: 15 279 × 4 = 61 116 руб. Б) Заработная плата руководителя и консультантов Заработная плата руководителя и консультантов рассчитывается по следующей формуле: ЗП = Т ∗ N, (18) где Т - общее число часов работы, N - оплата за 1 час (руб.). Заработная плата руководителя и консультантов: 20×600 = 12 000 руб. B) Дополнительная заработная плата Дополнительная заработная плата принята в размере 10% от основной заработной платы. Дополнительная заработная плата: 0,1×(61 116 + 12 000) = 7 311,60 руб. Г) Начисления на социальные нужды Начисления на социальные нужды составляет 26% от суммы основной и дополнительной заработной платы. Начисления на социальные нужды: 0,26×(61 116+12 000+7 311,60) = 20 911,18 руб. Итог: заработная плата с отчислениями на социальные нужды составит 101 338,78 руб. 4.5. Расчет накладных расходов Накладные расходы принимаются в размере 150% от суммы основной и дополнительной заработной платы без начислений в социальные фонды. Накладные расходы: 1,5×(61 116 +12 000+7 311,60)=120 641,40 руб. 4.6. Расчет амортизации приборов, оборудования и стеклянной посуды Затраты на амортизацию приборов и оборудования вычисляют по формуле и представлены в таблице 25: 𝐶∗𝐻 ∗𝑡 𝐴 𝑖 Агодовая = ∑ [100∗365 ], 46 (19) где С - стоимость прибора или оборудования, руб.; НА - норма амортизации прибора или оборудования, % в год; ti- время использования прибора или оборудования, дни. Таблица 25. Расчет амортизации приборов и оборудования Наименование прибора Стоимость прибора, Время Норма использования амортизации, Сумма, руб. руб. прибора, дни %/год 587 407,00 6 5 482,80 Центрифуга 52 334,00 1 6 8,60 Холодильник 55 430,00 50 10 759,32 Автоклав 461 664,11 2 10 252,97 2 085,00 6 10 3,43 108 287,00 6 10 178,01 4 386,06 1 10 1,20 212 393,00 3 10 174,57 227 099,00 1 10 62,22 459 900,00 3 10 378,00 pH-метр 34 947,00 1 5 4,79 Термостат 64 699,00 8 6 85,08 Термоблок 69 200,00 1 10 18,96 Фотометр 34 947,00 3 10 28,72 2 000 120,00 3 10 Шкаф вытяжной Весы технические Весы аналитические Магнитная мешалка Орбитальная качалка Ротационный испаритель Ламинарный бокс Газовый хроматограф Итог 1 643,93 4 082,60 Для расчета амортизации стеклянной посуды необходимо произвести расчет затрат на ее приобретение (табл. 26). 47 Таблица 26. Расчет затрат на приобретение стеклянной посуды. Наименование посуды Воронка Количество, шт Стоимость единицы, руб. Сумма, руб. 2 554,00 1 108,00 2 1 152,00 2 304,00 2 182,00 364,00 1 326,00 326,00 1 738,00 738,00 1 217,00 217,00 1 2 674,00 2 674,00 Чашка Петри 4 101,00 404,00 Мерная колба, 50 мл 1 1 693,00 1 693,00 2 543,00 1 086,00 3 510,00 3 060,00 3 851,00 5 106,00 10 15,00 150,00 6 25,00 150,00 Стеклянная палочка 2 15,00 30,00 Испарительная колба 2 1 633,00 3 266,00 лабораторная Колба Эрленмейэра, 750 мл Стакан лабораторный, 150 мл Стакан лабораторный, 600 мл Цилиндр мерный, 500 мл Цилиндр мерный, 100 мл Делительная воронка, 500 мл Мерная колба, 100 мл Мерная колба со шлифом, 25 мл Коническая колба со шлифом, 50 мл Пробирка химическая, 20 мл Пробирка химическая, 100 мл 48 Камера хроматографическая 1 17 938,00 17 938,00 1 525,00 525,00 1 529,00 529,00 для пластин, 15×15 Пипетка градуированная, 5 мл Пипетка градуированная, 10 мл Итого 37 585,00 Затраты на амортизацию стеклянной посуды вычисляются по формуле: С ∗Н ∗𝑡 А 𝑖 Аст.пос = пос , 100∗12 (20) где Спос - общая стоимость стеклянной посуды, руб.; НА - норма амортизации стеклянной посуды, % в год; ti- время выполнения работы, мес. Аст.пос. = (37 585∙33∙4) (100∙12) = 4 134,35 руб. Затраты на амортизацию приборов, оборудования и стеклянной посуды составляет: 4 082,60 + 4 134,35 = 8 216,95 руб. 4.7. Смета затрат на проведение исследований Общая сумма затрат на проведение исследований отражается в таблице 27. Таблица 27. Смета затрат на проведение исследований Наименование затрат Сумма, руб. Доля в общих затратах, % 2 011,25 0,86 2 672,55 1,14 101 338,78 43,14 8 216,95 3,50 Накладные расходы 120 641,40 51,36 Итог 234 880,93 100 Затраты на сырье и материалы Энергозатраты Заработная плата с начислениями Амортизационные отчисления 49 4.8. Научно-практическая значимость работы В результате проведенной работы были получены сведения о солюбилизирующей способности выделенных трегалолипидных биосурфактантов бактерий Rh. erythropolis S67 и Rh. erythropolis X5 в отношении гидрофобных веществ. Было отмечено, что среди гликолипидных биосурфактнтов, полученные трегалолипиды обладают большей солюбилизирующей способности к н-гексадекану. Колориметрический метод определения солюбилизирующей способности ПАВ не подходит для изучения физико-химических свойств, выделенных биосурфактантов. Полученные результаты указывают на перспективность исследованного штамма и его дальнейшее применение в области очистки окружающей среды от углеводородов, в частности при биоремедиации почв. 50 5. ОХРАНА ТРУДА 5.1. Общие сведения Охрана труда — это система правовых, технических и санитарных норм, обеспечивающих безопасные для жизни и здоровья трудящихся условия труда. Охрана труда в РФ установлена и регулируется Конституцией РФ, Основами законодательства РФ, Кодексом Законов о труде РФ, Постановлениями, нормами, правилами, инструкциями. Ответственность за безопасность труда возлагается на руководителя предприятия, лаборатории и учреждения. Охрана здоровья трудящихся, обеспечение безопасных условий труда, ликвидация профессиональных заболеваний и травматизма на производстве являются важнейшими направлениями в деятельности государства. Под безопасностью условий труда нужно понимать отсутствие возможности воздействия на работающих опасных и вредных производственных факторов или состояние условий труда, при котором отсутствует производственная опасность. Охрана труда в нашей стране охватывает мероприятия по дальнейшему облегчению и оздоровлению условий труда на основе механизации и автоматизации тяжелых и вредных производственных процессов, мероприятия по широкому внедрению современных средств техники безопасности, устранению причин, порождающих травматизм и профессиональные заболевания рабочих и служащих, по созданию на производстве необходимых гигиенических и санитарно-бытовых условий, что является важной государственной задачей. Коренное улучшение профилактической работы по предупреждению производственного травматизма и профессиональной заболеваемости должно стать основным направлением в практической работе. Большую роль должны играть коллективные договоры, соглашения, охраны труда и санитарно-оздоровительных мероприятий. Для эффективности мероприятий по охране труда необходимо соблюдение каждым сотрудником установленных правил техники безопасности на конкретном рабочем месте. В особенности это касается работы в химической лаборатории, где приходится иметь дело с токсичными, пожароопасными и взрывоопасными веществами. 5.2. Обоснование мер предосторожности при работе в лаборатории Практически все использованные в ходе выполнения дипломной работы растворители являются легковоспламеняющимися и горючими жидкостями, обладающими токсическими свойствами. Поэтому важно не допускать их случайных разливов и испарения. 51 В соответствии с правилами техники безопасности все растворители и их сливы хранились в толстостенной посуде с притертыми пробками в металлических шкафах вдали от радиаторных батарей. При работе с вредными и пожароопасными веществами использовалось герметичное оборудование. Герметичность обеспечивалась вакуумной смазкой, прокладками, проведением процессов под вакуумом. В отношении некоторых растворителей надо соблюдать особую осторожность. Так хлороформ должен храниться в склянках из темного стекла, так как в хлороформ под действием света окисляется до фосгена. В качестве первичных средств пожаротушения в лаборатории имеются песок и асбестовые одеяла. Индивидуальными средствами защиты служили хлопковые халаты, резиновые перчатки, очки и защитные экраны. В лаборатории имеется аптечка для оказания первой медицинской помощи. Работа с пожароопасными и токсическими веществами проводилась в вытяжном шкафу. 5.3. Токсические и пожароопасные свойства веществ Токсичность – это способность веществ вызывать в организме нарушение нормальных процессов жизнедеятельности при воздействии этих веществ на организм в условиях работы даже с малыми их количествами. Для токсичных веществ установлены предельно допустимые концентрации в воздухе рабочей зоны. ПДКр.з. – это концентрация, которая при ежедневной работе (не более 41 часа в неделю) в течение всего рабочего стажа не может вызвать заболевания или отклонения в состоянии здоровья, обнаруживаемые современными методами исследования в процессе работы или в отдаленные сроки жизни настоящего и последующих поколений. В соответствии с ПДКР.3 вещества подразделяют на 4 класса опасности: Чрезвычайно-опасные вещества — ПДКр.з.< 0.1 мг/м3 ; Высоко-опасные вещества — 0.1 мг/м3 < ПДКР.3< 1 мг/м3 ; Умеренно-опасные вещества — 1 мг/м3 < ПДКР.3< 10 мг/м3 ; Малоопасные вещества — ПДКр.з.> 10 мг/м3. Вещества, оказывающие токсическое действие, их свойства, а также способы оказания первой помощи приведены в таблице 28, свойства пожаро- и взрывоопасных веществ – в таблице 29. 52 Таблица 28. Токсическая характеристика веществ Наименование вещества 1 Характер воздействия на ЦНС, обладает кумулятивным действием, при контакте со слизистой оболочкой вызывает ожоги. Метанол Класс первой помощи мг/м3 опасности 3 4 5 200 4 5 3 5 3 5 3 Свежий воздух, чай; при попадании внутрь промыть 0,5 %-ным растовром тиосульфата натрия; при обморочном состоянии вдыхание нашатырного спирта. Сильный нервный и Удаление метанола из сосудистый яд с резко организма: выраженным промывание желудка, кумулятивным обильное питье. действием. Вызывает Противоядие – слепоту. этиловый спирт. Раздражает дыхательные пути, при попадании на Соляная кожу вызывает ожоги. кислота Действует разъедающее, особенно на глаза и слизистые оболочки. Нарушает обмен веществ. Вызывает Хлороформ ПДКр.з., 2 Наркотик, действует Ацетон Меры и средства рвоту, головокружение, при попадании на кожу – Свежий воздух, покой; при попадании на кожу промывание 2% раствором соды. При поражении глаз – промывание глаз струей воды в течение 115 минут. Свежий воздух, покой, искусственное дыхание, при попадании в желудок – растительное масло, промывание. 53 дерматит, токсически действует на печень. При отравлении фенолом промывают желудок осторожно взвесью жженой магнезии до Фенол Попадая в организм, исчезновения запаха фенол очень быстро фенола в промывной всасывается даже воде; дают пить через неповрежденные жженую магнезию или участки кожи и уже взвесь мела (1 через несколько минут столовая ложка на начинает стакан воды) через 5 воздействовать на минут по глотку, ткани головного мозга. белковую воду. При Вызывает нарушение поражении кожи функций нервной фенолом смывают системы. препарат 10-40 % 1 2 раствором этилового спирта или растительным маслом, затем водой с мылом и принимают душ. Таблица 29. Пожароопасные свойства веществ Наименование вещества Плотность Температура, °С Пределы воспламенения пара по воздуху, г/см3 1* 2* Температурные, Концентраци- °С онные, %об. 3* Нижний Верхний Нижний Верхний Ацетон 2 -18 -9 465 -20 54 +6 2,2 13,0 Метанол 1,1 8 13 440 +5 +39 6,7 36,5 Хлороформ 4 -12 112 592 +53 +90 - - *Примечание: 1 – вспышки, 2 – воспламенения, 3 –самовоспламенения 55 ВЫВОДЫ 1. Методом экстракции двухкомпонентной системой полярных органических растворителей (хлороформ:метанол в соотношении 3:1 об/об) удалось выделить смесь гликолипидных биосурфактантов, что было подтверждено результатами тонкослойной хроматографии. Гликолипидный компонент с величиной удержания Rf1 0,37 и 0,38 является основным компонентом внеклеточных липидов бактерий Rh. erythropolis S67 и Rh. erythropolis X5 соответственно. 2. Штамм Rh. erythropolis X5 является лучшим продуцентом биосурфактантов по сравнению с Rh. erythropolis S67, т.к. содержание внеклеточных биоПАВ незначительно выше на третьи сутки роста бактерий в минеральной среде с н-гексадеканом (0,306 г/л по сравнению с 0,251 г/л). 3. Поверхностное натяжение бесклеточного супернатанта штамма Rh. erythropolis X5 составляет 24,2 ± 0,3 мН/м, штамма Rh. erythropolis S67 – 25,0 мН/м. Полученные данные подтверждают, что бактерии Rh. erythropolis X5 продуцируют больше внеклеточных гликолипидных биосурфактантов в отличие от штамма S67. 4. Трегалолипидные биосурфактанты, продуцируемые Rh. erythropolis S67 и Rh. erythropolis X5, являются эффективными ПАВ, т.к. снижают поверхностное натяжение воды с 68 мН/м до 25 мН/м (26 °С) при ККМ равном 33 мг/л. 5. Трегалолипидные биосурфактанты проявляют большую солюбилизирующую способность в отношение н-гексадекана по сравнению с биосурфактантами такой же природы в других исследованиях. В солюбилизации н-гексадекана слабоаннионые трегалолипидные биосурфактанты уступают неионногенным поверхностно-активным веществам синтетической природы. 6. Метод колориметрического определения солюбилизирующей способности ПАВ с использованием Судана III не подходит для характеристики биосурфактантов вследствие эмульгирования олеофильного красителя. 56 трегалолипидных СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Matvyeyeva O. L., Aliievа O. R. Microbial biosurfactants role in oil products biodegradation. – 2014. 2. Vatsa P. et al. Rhamnolipid biosurfactants as new players in animal and plant defense against microbes //International journal of molecular sciences. – 2010. – Т. 11. – №. 12. – С. 50955108. 3. Елисеев С. А., Кучер Р. В. Поверхностно-активные вещества и биотехнология. – Наук. думка, 1991. 4. Рудакова Майя Анатольевна, Галицкая Полина Юрьевна, Селивановская Светлана Юрьевна Биосурфактанты: современные тренды применения // Учен. зап. Казан. ун-та. Сер. Естеств. науки. 2021. 5. Любченко С. Н. Мицеллообразование в растворах ПАВ. Солюбилизация : учебное пособие / С.Н. Любченко ; Южный федеральный университет. -Ростов-на-Дону; Таганрог : Издательство Южного федерального университета, 2019. - 116 с. 6. Елисеев С.А., Кучер Р.В. Поверхностно-активные вещества и биотехнология. – Киев: «Наукова думка», 2001. – 260 с. 7. Вережников В. Н. Избранные главы коллоидной химии //Издательскополиграфический центр Воронежского государственного Университета, Воронеж. – 2011. 8. Демьянцева Е. Ю., Копнина Р. А. Солюбилизация в растворах поверхностноактивных веществ: учебно-методическое пособие //СПб.: ГТУРП. – 2015. 9. Осовская И. И., Демьянцева Е. Ю., Андранович О. С. Определение поверхностного натяжения методом отрыва кольца Дю-Нуи: ВШТЭ СПбГУПТД //ВШТЭ СПбГУПТД.–СПб.–2016.–24с. – 2016 10. Борзенков И. А. и др. Штамм Gordonia amicalis, способный к генерации непосредственно в нефтяном пласте нефтевытесняющего агента-биоПАВ и снижающий содержание сероорганических соединений нефти. – Патент RU2673747C1. Заявл. 16.05.2018; опубл. 29.11.2018. 11. Петриков К. В. и др. Образование биосурфактантов психротрофным штаммомнефтедеструктором Rhodococcus erythropolis X5 при различных условиях культивирования //Актуальная биотехнология. – 2016. – №. 3. – С. 109-111. 12. Борзенков И. А. и др. Штамм Rhodococcus erythropolis HO-KS22, обладающий высокой уреазной активностью, способный к генерации в нефтяном нефтевытесняющего агента биоПАВ. – Патент RU2717025C1.; опубл. 17.03.2020. 57 пласте 13. Понаморева О. Н., Нечаева И. А., Мо Л. Т. Методы скрининга биосурфактантпродуцирующих бактерий (мини обзор) //Известия Тульского государственного университета. Естественные науки. – 2019. – №. 4. 14. Ismail R., Baaity Z., Csóka I. Regulatory status quo and prospects for biosurfactants in pharmaceutical applications //Drug Discovery Today. – 2021. – Т. 26. – №. 8. – С. 1929-1935. 15. Rodrigues L. R., Teixeira J. A. Biomedical and therapeutic applications of biosurfactants //Biosurfactants. – 2010. – С. 75-87. 16. Sajid M. et al. Biosurfactants: potential applications as immunomodulator drugs //Immunology Letters. – 2020. – Т. 223. – С. 71-77. 17. Nitschke M., Silva S. S. E. Recent food applications of microbial surfactants //Critical reviews in food science and nutrition. – 2018. – Т. 58. – №. 4. – С. 631-638. 18. Fracchia L. et al. Industrial applications of biosurfactants //Biosurfactants: production and utilization—processes, technologies, and economics. – 2014. – С. 245-260. 19. НичкеМ., СильваС.С. Недавнееприменениемикробныхповерхностно- активныхвеществвпищевыхпродуктах//Критическиеобзорывобластипищевойнаукиипитан ия. - 2018. - Т. 58. - №. 4. - С. 631-638. 20. Deres K. et al. In vivo priming of virus-specific cytotoxic T lymphocytes with synthetic lipopeptide vaccine //Nature. – 1989. – Т. 342. – №. 6249. – С. 561-564. 21. Буканова Е.Ф. и др. Коллоидная химия ПАВ. Часть 2. Солюбилизация. Физикохимические основы моющего процесса: учеб. пособие.–М.: МИТХТ им. М.В. Ломоносова, 2010. - 76 с. 22. Фролов Ю. Г. Курс коллоидной химии: Поверхностные явления и дисперсные системы. – Издательство Альянс, 2004. 23. Ланге К. Р. Поверхностно-активные вещества //Синтез, свойства, анализ, применение. Профессия. – 2005. – С. 240. 24. Sharma D. et al. Isolation and functional characterization of novel biosurfactant produced by Enterococcus faecium //SpringerPlus. – 2015. – Т. 4. – №. 1. – С. 1-14. 25. Mnif I., Ghribi D. Glycolipid biosurfactants: main properties and potential applications in agriculture and food industry //Journal of the Science of Food and Agriculture. – 2016. – Т. 96. – №. 13. – С. 4310-4320. 26. Jezierska S., Claus S., Van Bogaert I. Yeast glycolipid biosurfactants //FEBS letters. – 2018. – Т. 592. – №. 8. – С. 1312-1329. 27. Афанасьева Вера Александровна, Алферов Сергей Валерьевич, Нечаева Ирина Александровна Сравнение жирнокислотного состава липидов бактерий при росте на средах с разным источником углерода // Известия ТулГУ. Естественные науки. 2019. №4. 58 28. Гоготов И.Н. и др. Биосурфактанты: продуценты, свойства и практическое использование. – Пущино: ИЦ «Биоресурсы и экология», 2006. – 111 с. 29. Singh R. Solubilization of organic dyes in surfactants micelles. Div Appl Surface Chem. 2012: 1-45. 30. Трапезникова Б.В., Иванова Т.Н., Кожедуб А.П. Бактерии рода Rhodococcus: клиническое значение, диагностика и возможности антибактериальной терапии // КМАХ. 2013. №3. 31. Карпенко Е.В., Вильданова-Марцишин Р.И., Щеглова Н.С. и др. Перспективы использования бактерий рода Rhodococcus и микробных поверхностно-активных веществ для деградации нефтяных загрязнений // Прикладная биохимия и микробиология. Т.42.№2.С.175-179. 2006. 32. Леонова Т.И., Акатова Е.В., Пунтус И.Ф. Выделение гликолипидных биосурфактантов, продуцируемых бактериями Rhodococcus sp.3-2, методом экстракции // Известия ТулГУ. Естественные науки. 2021. №2. 33. Лыонг Т. М. и др. Структура и физико-химические свойства гликолипидных биосурфактантов, продуцируемых бактериями-нефтедеструкторамиRhodococcussp. X5 //Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. – 2017. – Т. 7. – №. 2 (21). 34. ЛыонгТ.М., НечаеваИ.А.,ПетриковК.В., ПунтусИ.Ф., ПонамореваО.Н. БактериинефтедеструкторыродаRhodococcus - потенциальныепродуцентыбиосурфактантов // Известиявузов. Прикладнаяхимияибиотехнология. 2016. №1 (16). 35. Лыонг Тхи Мо, Нечаева Ирина Александровна, Понаморёва Ольга Николаевна, Сатина Валерия Эдуардовна Влияние физиологических особенностей бактерий рода Rhodococcus на деградацию н-гексадекана // Известия ТулГУ. Естественные науки. 2016. 36. Панина Н. Е., Сверкалова Д. Г. Изучение некоторых биологических свойств культуры рода Rhodococcus spp //Студенческий научный форум -2017. – 2017. 37. Жук, О. Н. Функциональная оценка выделенных из природы свободноживущих почвенных бактерий Rhodococcus erythropolis. / О. Н. Жук, Я. С. Камельчук, Д. А. Грушевская, И. С. Лихтар, К. А. Риженков // Сборник материалов IV Международной научно-практической конференции «Биотехнология: достижения и перспективы развития». – Пинск: ПолесГУ, 2019. – 10-14 с. 38. Куюкина М. С. Биосурфактанты актинобактерий рода Rhodococcus: индуцированный биосинтез, свойства, применение. Автореф.дис.док. биол.наук. – Пермь, 2006 – 48 с. 39. ЛЫОНГ Т. М. и др. Влияние пониженной температуры на биодеградацию гексадекана бактериями-нефтедеструкторами Rhodococcus sp. Х5, продуцирующими 59 гликолипидные биологические поверхностно-активные вещества //Биотехнология. – 2017. – Т. 33. – №. 6. – С. 49-56. 40. Слюсарев А. В., Персиянова М. А. Определение критической концентрации мицеллообразований в водных растворах ПАВ методом релеевского рассеяния света //Современные наукоемкие технологии. – 2013. – №. 9. – С. 64-64. 41. Naughton P. J. et al. Microbial biosurfactants: current trends and applications in agricultural and biomedical industries //Journal of applied microbiology. – 2019. – Т. 127. – №. 1. – С. 12-28. 42. Lazar I., Petrisor I. G., Yen T. F. Microbial enhanced oil recovery (MEOR) //Petroleum Science and Technology. – 2007. – Т. 25. – №. 11. – С. 1353-1366.р 43. Luong T. M. et al. Characterization of biosurfactants produced by the oil-degrading bacterium Rhodococcus erythropolis S67 at low temperature //World Journal of Microbiology and Biotechnology. – 2018. – Т. 34. – №. 2. – С. 1-10. 44. DuBois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.T., Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances // Anal. Chem. - 1956. - V. 28. - № 3. - Р. 350-356. 45. Петриков К. и соавт. Гликолипиды бактерий-нефтедеструкторов Pseudomonas и Rhodococcus, используемые в препаратах биоремедиации: формирование и структура // Биохимия процессов. – 2013. – Т. 48. – №. 5-6. – С. 931-935. 46. Rapp P. et al. Formation, isolation and characterization of trehalosedimycolates from Rhodococcuserythropolis grown on n-alkanes //Microbiology. – 1979. – Т. 115. – №. 2. – С. 491503. 47. White D.A., Hird L.C., Ali S.T. Production and characterization of a trehalolipid biosurfactant produced by the novel marine bacterium Rhodococcus sp.,strain PML026 // J Appl Microbiol. – 2013. V. 115. № 3. P. 744-55. 48. Yin H. et al. Characteristics of biosurfactant produced by Pseudomonas aeruginosa S6 isolated from oil-containing wastewater //Process Biochemistry. – 2009. – Т. 44. – №. 3. – С. 302308. 49. Balan S. S. et al. Structural characterization and biological evaluation of Staphylosan (dimannooleate), a new glycolipid surfactant produced by a marine Staphylococcus saprophyticus SBPS-15 //Enzyme and Microbial technology. – 2019. – Т. 120. – С. 1-7. 50. Tian Z. J. et al. Characterization of a Biosurfactant-producing Strain Rhodococcus sp. HL-6 //Romanian Biotechnological Letters. – 2016. – Т. 21. – №. 4. – С. 11651. 51. Mnif I., Ellouz-Chaabouni S., Ghribi D. Glycolipid biosurfactants, main classes, functional properties and related potential applications in environmental biotechnology //Journal of Polymers and the Environment. – 2018. – Т. 26. – №. 5. – С. 2192-2206. 60 52. Arab F., Mulligan C. N. 'BIOSURFACTANTS research trends and applications //Rhamnolipids characteristics, production, applications, and analysis. – 2014. – С. 49. 53. Kitamoto D., Isoda H., Nakahara T. Functions and potential applications of glycolipid biosurfactants—from energy-saving materials to gene delivery carriers— //Journal of bioscience and bioengineering. – 2002. – Т. 94. – №. 3. – С. 187-201. 54. Wadekar S. D. et al. Microbial synthesis of rhamnolipids by Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145) on waste frying oil as low cost carbon source //Preparative Biochemistry and Biotechnology. – 2012. – Т. 42. – №. 3. – С. 249-266. 55. Gudiña E. J. et al. Bioconversion of agro-industrial by-products in rhamnolipids toward applications in enhanced oil recovery and bioremediation //Bioresource technology. – 2015. – Т. 177. – С. 87-93. 56. Benincasa M. et al. Chemical structure, surface properties and biological activities of the biosurfactant produced by Pseudomonas aeruginosa LBI from soapstock //Antonie Van Leeuwenhoek. – 2004. – Т. 85. – №. 1. – С. 1-8. 57. Неустроев М.М. Экологическая оценка нефтезагрязненных мерзлотных почв и разработка способов их биоремедиации: Афтореф. дис. канд. биол. наук. – Якутск, 2016. – 18 с. 58. Adu S. A. et al. Microbial biosurfactants in cosmetic and personal skincare pharmaceutical formulations //Pharmaceutics. – 2020. – Т. 12. – №. 11. – С. 1099. 59. Kuyukina M. S. et al. Recovery of Rhodococcus biosurfactants using methyl tertiarybutyl ether extraction //Journal of Microbiological Methods. – 2001. – Т. 46. – №. 2. – С. 149156. 60. Ratnikava M. S. et al. Rhodococcus erythropolis strain A29-k1–an effective producer of surface active compounds. – УП «Экоперспектива». Минск - 2019. С. 163-165. 61. Заруева Е.С., Нечаева И.А., Понаморева О.Н. Солюбилизация н-гексадекана в минеральной водной среде в присутствии поверхностно-активных веществ // Известия ТулГУ. Естественные науки. 2020. 62. Rangel-Yagui C. O. et al. Micellar solubilization of ibuprofen: influence of surfactant head groups on the extent of solubilization //Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas. – 2005. – Т. 41. – С. 237-246. 63. Бакеева Р. Ф., Вахитова О. Е., Юсупова Л. М., Сопин В. Ф. Солюбилизационная способность неионных ПАВ по отношению к биологически активному 5,7-дихлор-4,6-динитробензфуроксану // Вестник Казанского технологического университета. 2013. №4. 61 64. Hou X. et al. Colloids and surfaces A: physicochemical and engineering aspects //J. Polym. Sci. Lett. Polym. Ed. – 2010. – Т. 363. – №. 1. 65. Beal R., Betts W. B. Role of rhamnolipid biosurfactants in the uptake and mineralization of hexadecane in Pseudomonas aeruginosa //Journal of Applied Microbiology. – 2000. – Т. 89. – №. 1. – С. 158-168. 66. Методика выполнения измерений содержаний НП в природных и сточных водах газохроматографическим методом с пламенно-ионизационным детектором. МВИ-05-94. М.:1994. 67. Zhong H. et al. Degradation of pseudo-solubilized and mass hexadecane by a Pseudomonas aeruginosa with treatment of rhamnolipid biosurfactant //International Biodeterioration & Biodegradation. – 2014. – Т. 94. – С. 152-159. 68. Опанасенко О. Н. и др. Мицеллообразование в растворах бинарных смесей разнотипных поверхностно-активных веществ //Известия Национальной академии наук Беларуси. Серия химических наук. – 2013. – №. 3. – С. 9-13. 69. Абрамзон А. А. и др. Поверхностно-активные вещества: справочник/Под ред. АА Абрамзона и ГМ Гаевого //Л.: Химия. – 1979. 70. Биопрепарат для очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, способ его получения и применения / А.Е. Филонов [и др.]. Патент на изобретение РФ № 2378060, 05.07.2007 71. Tuleva B., Cohen R., Stoev G., Stoineva I. Production and structural elucidation of trehalose tetraesters (biosurfactants) from a novel alkanothrophic Rhodococcus wratislaviensis strain // J Appl Microbiol. – 2008. – V.104. – №.6. – P.1703-10 72. Philp J. et al. Alkanotrophic Rhodococcus ruber as a biosurfactant producer //Applied microbiology and biotechnology. – 2002. – Т. 59. – №. 2. – С. 318-324. 73. Zhong H. et al. Aggregate-based sub-CMC solubilization of n-alkanes by monorhamnolipid biosurfactant //New Journal of Chemistry. – 2016. – Т. 40. – №. 3. – С. 20282035. 74. Liu Y. et al. Effect of rhamnolipid solubilization on hexadecane bioavailability: enhancement or reduction? //Journal of hazardous materials. – 2017. – Т. 322. – С. 394-401. 75. Kanga S.A., Page C.A., Mills M.A. Autenrieth R. L., Solubilization of Naphthalene and Methyl-Substituted Naphthalenes from Crude Oil Using Biosurfactants // Environmental Science & Technology. – 1997. – V.31. – №.2. – P. 556-561. 76. Desai J.D. and Banat I.M. Microbial production of surfactants and their commercial potential // MicrobiolMolBiol Rev. – 1997. – V.61– №.1. – P. 47-64. 62 77. Smyth T.J.P., Perfemo A., Marchant R., Banat I.M. Isolation and Analysis of Lipopeptides and High Molecular Weight Biosurfactants in Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology / Timmis K.N. (ed). - Springer Berlin Heidelberg: Berlin. - 2010. - P. 3687-3704. 78. Мелентьев А. И., Кузьмина Л. Ю., Курченко В. П. Циклические липопептиды– перспективный биотехнологический продукт. – Перспективы и проблемы развития биотехнологии в рамках единого экономического пространства стран Содружества: Материалы Междунар. науч.- практ. конф. Минск-Нарочь – 2005. 79. Актуганов Г. Э. и др. Влияние источников углерода и минеральных солей на формирование биопленок и синтез циклических липопептидовPGPB-штаммами Bacillus и Paenibacillus //Экобиотех. – 2019. – Т. 2. – №. 4. – С. 468-481. 80. Gobbert U., Lang S., Wagner F. Sophorose lipid formation by resting cells of Torulopsis bombicola // Biotechnol. Lett. – 1984 – V. 6. – P. 225–230. 81. Morikawa M., Daido H., Takao T., Murata S., Shimonishi Y., Imanaka T. A new lipopeptidebiosurfactant produced by Arthrobacter sp. strain MIS38 // J Bacteriol. – 1993. – V.175. – №.20. – P. 6459-66. 82. Banat I. M. et al. Microbial biosurfactants production, applications and future potential //Applied microbiology and biotechnology. – 2010. – Т. 87. – №. 2. – С. 427-444. 63 ПРИЛОЖЕНИЕ 1 Таблица 30. Результаты измерений стандартных растворов Содержание № трегалозы, мкг/мл Оптическая плотность, опт.ед. D1 D2 D3 D̅ S Δ 1 10 0,060 0,060 0,057 0,059 0,002 0,002 2 20 0,093 0,086 0,101 0,093 0,008 0,009 3 40 0,135 0,127 0,130 0,131 0,004 0,005 4 60 0,161 0,161 0,166 0,163 0,003 0,003 5 80 0,237 0,234 0,210 0,227 0,015 0,017 6 100 0,281 0,291 0,284 0,285 0,005 0,006 7 140 0,413 0,409 0,405 0,409 0,004 0,005 64 0,0068 0,0171 0,0342 0,0854 0,1709 0,3417 1 2 3 4 5 6 № Концентрация н-гексадекана, моль/л 77607,353 29948,793 25274,341 7656,312 ПП2 78059,609 25412,414 24568,741 6665,92 ПП3 275144,842 259594,968 298630,079 137571,372 153356,582 168367,927 77410,767 29644,252 21234,141 7113,227 ПП1 Площадь пика (ПП) 277800 153100 77700 28300 23700 7150 ППср 19652 15400 333 2536 2158 496 S 222000 17400 400 2900 2400 560 Δ ПРИЛОЖЕНИЕ 2 Таблица 31. Результаты измерений стандартных растворов 65 ПРИЛОЖЕНИЕ 3 Журнал проверки ВКР 66

Солюбилизация биосурфактантов: Бакалаврская работа по биотехнологии

Related documents

Products

Support

Солюбилизация биосурфактантов: Бакалаврская работа по биотехнологии

Related documents

Add this document to collection(s)

Add this document to saved

Suggest us how to improve StudyLib