DEEL 2: DNA-REPLICATIE
HYBRIDISATIE
= het proces waarbij een enkelstrengig stuk DNA, de probe, de complementaire DNA-streng vindt en
ermee basenpaart. Een probe is een stukje enkelstrengig DNA dat complementair is aan de sequentie
die moet opgespoord worden.
(1) Denaturatie
(2) Renaturatie: bij het dalen van pH en natuur zullen de complementaire strengen elkaar
vinden
(3) Hybridisatie: als hier een probe aan wordt toegevoegd kan deze basenparen met het
overeenkomstig complementair DNA-fragment.
Analyse van SNP’s:
Met een korte probe en stringente hybridisatiecondities zal enkel een perfect complementaire probe
hybridiseren. Korte probes zijn meestal 20 nucleotides lang en worden ontworpen dat ze per paar
verschillende allelen kunnen onderscheiden (= ASO’s : allel specific oligonucleotides).
Dit principe kan gebruikt worden voor een detectie van mutatie.
RESTRICTIE EN HYBRIDISATIE
RFLP-analyse: restriction fragment length processing
Een verschil in lengte van restrictiefragmenten veroorzaakt door verschillen in DNA-sequentie tussen
twee allelen (vaak door mutatie). Er worden specifieke restrictiefragmenten zichtbaar gemaakt.
DNA-REPLICATIE IN DE CEL
Prokaryoten:
(1) Helicase
Het enzym helicase scheidt de twee DNA-strengen van elkaar. Deze twee oude strengen
vormen een template voor de nieuwe strengen. Een template is de streng op basis waarvan
de nieuwe streng gesynthetiseerd wordt. Er ontstaat een leading strand (3’ -> 5’) en een
lagging strand (5’-> 3’).
(2) Primase
Maakt RNA-primers zodat de synthese kan starten. Een primer is een oligonucleotide met
een vrije 3’OH-groep die zal binden aan de template om zo een dubbelstrengige configuratie
te vormen waaruit nieuwe nucleotiden aangebouwd worden. Primase maakt 1 RNA-primer
op de leading strand en meerdere RNA-primers op de lagging strand.
(3) DNA-polymerase
Zijn enzymen die DNA bijmaken op basis van de streng in de 5’ -> 3’ richting. Op de leading
strand zal dit geen probleem zijn.
De lagging strand zal discontinue replicatie vertonen. Het RNA-polymerase zal kleine stukjes
5’->3’ synthetiseren tegen de richting van de replicatievork, Okazaki-fragmenten. Elk
Okazaki-fragment is voorzien van een 3’OH-groep van een RNA-primer door primase. De
3’OH van deze RNA-primers wordt als primer gebruikt voor DNA-synthese van het DNApolymerase III.
(4) DNA-polymerase I en DNA ligase
Het DNA-polymerase I verwijdert de Okazaki-fragmenten en vervangt ze door DNA. Daarna
worden de overgebleven openingen dichtgemaakt door DNA-ligase.
Het primosoom is een complex van primase en andere eiwitten en maakt 1 primer op de leading
strand en scant de lagging strand om primers te maken op verschillende plaatsen.
Het replisoom (een multi-enzym complex) voert de DNA-replicatie uit.
De proofreading activiteit van DNA-polymerasen is belangrijk voor synthesefouten. Wanneer een
verkeerde base ingebouwd wordt zal de 3’ -> 5’ exonuclease geactiveerd worden.
Eukaryoten:
De mens heeft meerdere initiatieplaatsen van replicatie. Ieder stukje DNA dat verdubbeld wordt
noemt een replicon.
Telomeren:
= beschermen chromosoomuiteinden tegen afbraak en ‘kleven’, want voor de lagging streng is er
geen aanhechtingspunt, ze zouden bij elke verdubbellingsronde een stukje korter worden.
Er moet dus een systeem ontstaan die de chromosoomuiteinden repliceert.
Telomerase
= een eiwit met intern RNA-template dat DNA-synthetiseert.
= een reverse transcriptase
= op basis van DNA synthetiseert het telomerase DNA op een RNA-template
Alleen bij voortplantingscellen en stamcellen komt telomerase voor om de lengte van telomeren te
behouden.
DNA-REPLICATIE IN VITRO
PCR
= vermeerdering van kleine hoeveelheden DNA voor detectie
Op basis van de gekende sequenties aan de uiteinden van de te ampliceren sequenties worden twee
primers gemaakt. Wanneer deze primers toegevoegd worden aan het DNA met DNA-polymerase
(Taq-polymerase), kunnen ze basenparen op het template-DNA en daaruit start de synthese van
nieuw DNA. De primers worden ingebouwd en maken deel uit van de nucleïdestreng.
(1) Denaturatie = strengscheiding
(2) Primer annealing = binden van primers
(3) DNA-synthese
VNTR (variable number of tandem repeats) zijn clusters van herhalingen van bepaalde
sequentiemotieven die hypervariabel zijn want ze verschillen in aantal herhalingen tussen individuen.
De meeste zijn microsatelieten (1-5 bp)  STR of SSR
SEQUENTIE-ANALYSE
= bepalen van de DNA-nucleotide volgorde
Dideoxymethode van Sanger gebaseerd op DNA-synthese
(1) Basenparen vann een primer op enkelstrengig DNA
(2) DNA-synthese in 4 verschillende reacties gestart door DNA-polymerase en 4 nucleotiden
(3) Toevoegen van ddNTP (dideoxynucleotide) in elke reactie
(4) Nucleotide wordt ingebouwd, maar niet verlengd
 ontbreken van 3’OH zorgt voor ketenterminatie
Eindresultaat: mengsel van alle mogelijke lengtes van DNA-moleculen die eindigen op een
bepaalde nucleotide. Hierna gelelektroforese om te scheiden op basis volgens grootte.
Next generation sequencing
Bv. Pyrosequencing: er worden parallele sequentiereacties uitgevoerd in platen met heel kleine
vakjes, enkel als dNTP past wordt er licht geproduceerd, achteraanvolgens worden verschillende
babsen getest en afgebroken.
Hier wordt geen gelelektroforese voor gebruikt.
Nanopore sequencing
De DNA-streng wordt getrokken via nanoparie en de basen worden afgelezen via elektrische
verschillen.
DEEL 3: GENEXPRESSIE
TRANSCRIPTIE
= het DNA wordt overgeschreven naar mRNA
Prokaryoten:
(1) Initiatie
Het RNA-polymerase is een holo-enzym bestaande uit (α2ββ’σ). De functie van de σ-eenheid is
herkenning van de promotor en binding van het RNA-polymerase op de promotor (-35 box).
De promotor is een DNA-regio die de bindings- en startsignalen bevat uit -35 box en -10 TATA
box.
Hierna wordt de factor losgelaten zodat het RNA-polymerase verder langs het template kan
schuiven. De transcriptiestartplaats is +1.
(2) Elongatie
Na het loslaten van de σ-factor wordt de RNA-synthese door het core-enzym uitgevoerd. Het
RNA-polymerase heeft een plaatselijke DNA-ontwindende en herwindende activiteit.
(3) Terminatie
Wanneer het RNA-polymerase een terminatiesignaal tegenkomt, stopt de RNA-synthese. Dit is
een omgekeerde sequentieherhaling (GC-rijk) gevolgd door een 6-tal AT’s. Door het palindroom
vormt er zich een hairpin of stemloop in het RNA, waardoor het RNA-polymerase vertraagt en de
DNA-RNA-helix ter hoogte van de AT’s losgeraakt.
Eukaryoten:
(1) Initiatie
De bindingsplaats voor RNA-polymerase is de TATA-box (-25). Het RNA-polymerase II kan
enkel op de TATA-box binden nadat er reeds transcriptiefactoren op gevonden zijn.
TFII bevat het TATA-box bindend proteïne (TBP) en Transcription Associated Factors (TAF’s).
Het RNA-polymerase kan binden en vormt een complex met andere TF.
Stroomopwaarts komen activerende sequenties voor zoals de CAAT-box en GC-box die
geactiveerd worden nadat eiwitfactoren binden op deze boxen. Er zijn enhancers (activeren
transcriptie) of silencers (gaan transcriptie tegen).
Het RNA-polymerase II produceert de primaire transcripten die na processing aanleiding geven tot de
mRNA’s.
(2) Elongatie
(3) Terminatie
TRANSLATIE:
Prokaryoten:
(1) Initiatie
Het 30S-ribosoom sub-eenheid bindt zich op de specifieke plaats RBS op het ribosoom,
gekenmerkt door de Shine Dalgarno sequentie 10 nucleotiden stroomopwaarts voor elk
startcodon. Dit is complementair aan het 16s-RNA
De vorming van het initiatiecomplex. De combinatie van het mRNA en de 30s-subeenheid op het
startcodon wordt aangevuld met initiator-RNA opgeladen met methionin. Samen met de
initiatiefactoren IF1,2,3 wordt het initiatiecomplex gevormd.
De 50S-subeenheid kan erop binden eens het initiatiecomplex gevormd is. Zo worden er twee
verschillende tRNA-bindingsplaatsen gevormd (P- en A-plaats). De t-RNA-met bezet nu de Pplaats.
(2) Elongatie
Methionine van t-RNAi wordt overgezet op tweede tRNA, de peptidebinding door het
peptidyltransferase (23S) koppelt de aminozuren. Daarna gebeurt er translocatie en het
ribosoom verschuift 3 basen of 1 codon. Het lege tRNA wordt eruit gegooid en daarna komt het
volgende opgeladen tRNA op de A-plaats. Er zijn elongatiefactoren betrokken.
(3) Terminatie
Elongatie gaat door tot het ribosoom een stopcodon tegenkomt, deze stopcodons worden
herkent door releasefactoren waarna alle componenten loskomen. Er ontstaat een dissociatie
van ribosomen.
Eukaryoten:
(1) Initiatie
De kleine ribosoomeenheid 40S bindt op de 5’ cap van het mRNA en scant vandaar tot aan het
startcodon, hierbij zijn minstens 8 initiatiefactoren nodig.
De eukaryotische mRNA’s vormen een cirkel waarbij de 5’ cap en de poly-A staart dicht bij elkaar
zitten en zo beschermd worden tegen afbraak.
Er is sprake van een polysoom, er kunnen meerdere ribosomen na elkaar translatie uitvoeren.
GENREGULATIE
Prokaryoten:
LAC-OPERON INDUCEERBAAR OPERON
Het afbreken van lactose gebeurt door 3 eiwitten die samen liggen op één operon (lacY, lacZ en lacA).
De genen komen zeer zwak tot expressie bij binding van repressor op de operator.
Negatieve controle
Door een repressor gecodeerd door het LacI gen (ligt voor de operator).
Geen lactose: repressor bindt op operator en blokkeert promotor
 Geen transcriptie
Wel lactose: lactose (rol inducer) bindt op repressor en kan niet meer op operator
 Transcriptie!
Positieve controle
Geen glucose: adynelaatcyclase is actief en hoge concentraties cAMP, cAMP+CAP-eiwit op
CAP-plaats en het lac-operon wordt geactiveerd.
 Transcriptie
Wel glucose: adynelaatcyclase geïnhibeerd, geen cAMP, CAP-eiwit niet op CAP-plaats en het
lac-operon komt zeer zwak tot expressie.
 Zeer zwakke transcriptie
Optimale expressie: lactose (blokkeren van repressor) + veel cAMP
TRYPTOFAANOPERON REPRESSEERBAAR OPERON
De genen komen hoog tot expressie, maar repressie bij een te hoge concentratie van het
eindproduct.
Negatieve controle
Veel tryptofaan: tryptofaan als corepressor op aporepressor die bindt op trp-operator.
 Geen transcriptie
Weinig tryptofaan: repressor komt los
 Transcriptie
Attenuatie
= het vroegtijdig optreden van terminatie van transcriptie
Deletie van het Trlp-operon => verhoogde expressie
Weinig tryptofaan: weinig geladen tRNAtrp, ribosoom blijft plakken, basenparing 2 en 3
 Transcriptie
Veel tryptofaan: tRNAtrp en ribosoom gaat door, basenparing 3 en 4
 Terminatie
Eukaryoten
CONTROLE TRANSCRIPTIE-INITIATIE

Transcriptiefactoren:
= eiwitten die regulatorische sequenties herkennen en DNA-bindende eiwitten zijn
Bevatten een DNA-bindend domein + activatordomein

Voorbeelden van transcriptionele genregulatie
Steroïdhormonen
Kunnen door het celmembraan wegens grootte en lipofiel. Het steroïd bindt op de receptor
die in het cytoplasma voorkomt. Het hormoon-receptorcomplex migreert naar de kern, waar
het op de HRE-sequenties kan binden van verschillende genen en deze genen activeert.
Proteïnehormonen
Kunnen niet door het celmembraan door grootte. Er ztten membraanreceptoren op de
buitenkant van het membraan waarop de moleculen kunnen binden. Door binding van het
molecule op de receptor, wordt een signaal naar binnen doorgegeven via fosforylatie.
Transcriptiefactor wordt geactiveerd en de genexpressie start.

Genregulatie tijdens ontwikkeling
Celdifferentiatie gebeurt door irreversible cascade van TF’s die leiden tot bepaald celtype.
Differentiatie van cellen wordt doorgegeven bih deling in hetzelfde weefsel.
Homeotische genen coderen voor TF die segmentidentiteit bepalen.
Mutatie in hox-genen leidt tot verkeerde plaatsgroei van lichaamsdelen.
DNA-HERSCHIKKINGEN
Elke B-cel produceert een specifiek anti-lichaam. DNA-veranderingen hebben tot gevolg dat elke
mature B-cel een ander anti-lichaam tot expressie brengt.
POSTTRANSCRIPTIONELE REGULATIE

Controle mRNA-stabiliteit
MiRNA’s zijn gecodeerd door specifieke genen en ontstaan uit genen die in het genoom
zitten. Ze komen gereguleerd tot expressie. MiRNA’s doen aan genexpressie van andere
genen die al dan niet tot expressie komen door te basenparen met complementaire mRNA’s.

RNAi
Het dubbelstrengig RNA wordt afgebroken door Dicer tot siRNA’s.
Deze gaan naar boodschapper RNA’s en gaan naar overeenkomstige sequenties om die te
knippen.
PTGS = post-transcriptionele genslicing: transcript wordt gevormd maar direct afgebroken.

Controle translatie
Binding van specifiek eiwit of metaboliet RNA op mRNA kan translatie inhiberen.
Riboswitch = sequentie in een RNA die de RNA-structuur verandert bij het binden van een
metaboliet en zo expressie reguleert.
VIA CHROMATINE

Chromatinestructuur
In lever: gen voor vitellogenine
In oviduct: gen voor ovalbulmine
 Produceren apart de eindproducten
 Genen die geactiveerd moeten worden zitten verpakt in verschillende
chromatines
Actief chromatine: meer acetylatie van de hystonen, minder methylatine, minder binding H1

DNA-methylatie
Compact chromatine: meer methylatie
DEEL 4: GENETICA, EPIGENETICA EN GGO
MONOHYBRIDE KRUISING -> TWEEDE WET VAN MENDEL (SPLITSINGSWET)
= allelen worden gescheiden in de voortplantingscellen en komen random terug samen bij de
bevruchting.
3:1 dominant-recessieve overerving
1:2:1 segregatie op partiële of co-dominantie
Partiële dominantie: heterozygoot produceert minder eiwit dan homozygoot
Multiple allelen: bloedgroepen hebben 3 allelen (meer dan Mendel onderzocht heeft)
Codominantie: beide allelen prpoduceren een functioneel eiwit
FAMILIALE OVERERVINGSPATRONEN
Autosomaal recessief = niet-geslachtsgebonden (mannen + vrouwen) + niet elke generatie heeft het
AFWIJKINGEN VAN 1:2:1 SEGREGATIE
Lethale allelen: er is een 2:1 ratio wegens nakomelingen die homozygoot zijn voor het lethale allel
Penetrantie: het kenmerk komt al of niet tot uiting in een individu
Expressiviteit: kenmerk in genetisch identieke individuen komt minder of meer of enkel op bepaalde
plaatsen tot uiting
Pleiotropie: één gen beïnvloedt één aspect van het fenotype
Epistasie: een gen gaat op 1 locus de fenotypische expressie van een gen op een andere locus
beïnvloeden
DIHYBRIDE KRUISING -> DERDE WET VAN MENDEL (ONAFHANKELIJKHEIDSWET)
= tijdens meiose worden de chromosomen onafhankelijk verdeeld over de dochtercellen, dus zullen
de genen onafhankelijk van elkaar overerven.
Gekoppelde genen: genen die dichter bij elkaar op hetzelfde chromosoom gelegen zijn worden vaker
samen overgeërfd dna genen die op verschillende chromosomen gesitueerd zijn.
Niet alle nakomelingen hebben één van beide fenotypes van de ouders door crossing over
tijdens de meiose, dit is partiële koppeling.
≠ mendeliaanse overerving
CYTOPLASMATISCHE ERFELIJKHEID
≠ mendeliaanse overerving
Er zit DNA in de mitochondria (maternale overerving) en in de plastiden.
KWANTITATIEVE KENMERKEN OF QTLS (QUANTITATIVE TRAIT LOCI)
Variatie in een gegeven kenmerk is indicatief voor polygenische overerving.
Twee of meer genen gaan tesamen het fenotype bepalen.
≠ mendeliaanse overerving
Epigenetica
= studie van mitotische en/of meiotische overerfbare variatie niet te wijten aan veranderingen in de
DNA-sequentie maar gebaseerd op gen ‘imprints’, RNA- of eiwitveranderingen.
Epi-allelen: verschillende overerfbare vormen van een gen die verschillen in expressie, niet
veroorzaakt door een andere DNA-sequentie maar te wijten aan een andere gen-imprint.
EPIGENETISCHE IMPRINTS
De epigenetische imprint is een modificatie op DNA zelf: methylaties of histonmodificaties en is
omkeerbaar.
Euchromatine: actief, acetylaties
Heterochromatine: compact, methylaties:
Invloed van de omgeving: epigenetische veranderingen (mitose) kunnen bij nakomelingen komen.
Parentale imprinting: specifieke genen die tijdens de meiose een imprent krijgen verschillen tussen
eicellen en zaadcellen.
LAMARCK: verworven eigenschaooen kunnen doorgegeven worden
DARWIN: selectie van bestaande genotype veranderingen
 SLUIT GEEN EPIGENETICA UIT
GGO’S
= genetisch gewijzigd organiscme waarvan het genetisch materiaal veranderd is op een wijze welke
van nature door voortplanting en/of natuurlijke recombinantie niet mogelijk is. (EU)
= een organisme dat een neiuwe combinatie van genetisch materiaal bevat door het gebruik van
moderne biotechnologie. (protocol)
RECOMBINANT DNA-TECHNOLOGIE
DNA vermeerderen in plasmide: knippen door restricitie-enzyme uit bacterie, knipt specifieke
sequenties zodat er sticky ends zijn, dan verbindt DNA-ligase de stukjes DNA.
KLONEN
Het gewenste DNA-fragment wordt geïnsereerd in een vector met als bedoeling het gen in grote
hoeveelheden te produceren. Eerst in E. Coli -> als alles oké is -> gastheer.
Chimere genen: worden gemaakt door stukken van verschillende genen aan elkaar te zetten.
CRISPR-CAS
= het RNA-molecule herkent DNA waarna op die plaats geknipt wordt door het geassocieerde CASeiwit. Een vooraf gekozen sequentie in het genoom wordt geknipt, die wordt dan hersteld via het
DNA-herstelsysteem van de cel.
(1) RNA aanpassen om gewenste doelsequentie te knippen, deze geknipte wordt in de cel
hersteld door enzymen die de losse uiteinden aan elkaar kleven, er gebeuren wel vaak kleine
mutaties.
(2) Als donor-DNA toegevoegd wordt, kunnen exacte wijzigingen in het genoom gebracht
worden.