Walidacja metod analitycznych
Raport z walidacji
Małgorzata Jakubowska
Katedra Chemii Analitycznej WIMiC AGH
Walidacja metod analitycznych (według ISO)
to proces ustalania parametrów charakteryzujących
sprawność działania i ograniczeń metody oraz sprawdzenie jej
przydatności do określonych celów.
Podczas wykonywania walidacji należy:
ƒ określić, które parametry charakteryzujące metodę powinny
być wyznaczone
ƒ wyznaczyć wartości tych parametrów
ƒ na tej podstawie określić czy metoda spełnia stawiane jej
wymagania związane z zamierzonym zastosowaniem
wyników analitycznych.
W efekcie wykonania walidacji można uzyskać pewność, że
proces analizy przebiega w sposób rzetelny i precyzyjnie oraz
daje wiarygodne wyniki.
Proces walidacji składa się zazwyczaj z następujących
etapów:
ƒ określenie przeznaczenia metody analitycznej i jej zakresu,
ƒ definicja testowanych parametrów analitycznych oraz
kryteria akceptacji,
ƒ opracowanie planu eksperymentów walidacyjnych,
ƒ sprecyzowanie charakterystyki sprzętu,
ƒ przygotowanie wzorców oraz odczynników,
ƒ eksperymenty walidacyjne z ewentualną korektą parametrów
metody,
ƒ obliczenia, interpretacja wyników,
ƒ sprawdzenie kryteriów akceptacji,
ƒ opracowanie standardowej procedury operacyjnej dla
badanej metodyki,
ƒ określenie kryteriów rewalidacji,
ƒ sporządzenie raportu.
Parametry brane pod uwagę podczas walidacji:
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
specyficzność
precyzja (powtarzalność i odtwarzalność)
dokładność
zakres metody
liniowość
granica wykrywalności
granica oznaczalności
elastyczność.
Specyficzność:
ƒ jedynie analit jest źródłem niezakłóconego sygnału
analitycznego, zaś interferencje nie występują
ƒ zdolność
jednoznacznego
określenia
substancji
analizowanej w obecności składników, które mogą być
zawarte w próbce, np. substancji pomocniczych,
zanieczyszczeń, itd.
ƒ zdolność rozróżniania związków o podobnej strukturze.
Precyzja:
ƒ stopień zgodności między pojedynczymi wynikami
analizy (rozrzut wyników), gdy dana procedura jest
stosowana dla wielokrotnie powtarzanych, niezależnych
oznaczeń jednorodnej próbki
ƒ najczęściej miarą precyzji jest odchylenie standardowe
S, względne odchylenie standardowe RSD lub
współczynnik zmienności CV
ƒ obejmuje dwa pojęcia: powtarzalność i odtwarzalność.
Kryteria akceptacji:
CV wyników zawartości składnika głównego nie powinno
być większe niż 3%
CV wyników oznaczania zawartości składników na
poziomie śladowym nie powinno być większe niż 15%.
Powtarzalność :
ƒ wyraża precyzję oznaczeń wykonanych w krótkim odstępie
czasu, przez tego samego analityka i w tych samych
warunkach (te same odczynniki, ten sam sprzęt)
ƒ należy wykonać minimum 6 powtórzeń dla poziomu
stężenia 100% lub po trzy powtórzenia dla każdego z
minimum trzech poziomów stężeń w zakresie metody
(zalecane 50 – 150% nominalnego stężenia)
ƒ wyznacza się wartość średnią, przedział ufności,
odchylenie standardowe, względne odchylenie standardowe
oraz współczynnik zmienności uzyskanych wyników.
Odtwarzalność:
ƒ pozwala ocenić, czy metoda prowadzi do tych samych
rezultatów w różnych laboratoriach z różnymi analitykami, na
innym sprzęcie i w innych warunkach, z zachowaniem
parametrów wymaganych w opisie metody
ƒ badania są prowadzone analogicznie jak w przypadku
powtarzalności
ƒ wyznacza się wartość średnią, przedział ufności, odchylenie
standardowe, względne odchylenie standardowe oraz
współczynnik zmienności uzyskanych wyników.
Dokładność:
ƒ zgodność między wartością rzeczywistą (zawartością,
stężeniem) a wartością będącą wynikiem analizy
ƒ miarą dokładności metody analitycznej jest wielkość jej
błędu systematycznego
ƒ metoda niedokładna może być obarczona błędem
systematycznym stałym (niezależnym od poziomu zawartości
oznaczanego składnika) i zmiennym (zależnym od stężenia
oznaczanego składnika)
ƒ powinna być oszacowana na podstawie minimum 9
wyników oznaczeń dla minimum trzech różnych poziomów
stężeń z badanego zakresu (np. trzykrotne oznaczenie dla
trzech poziomów)
ƒ najczęściej wynik przedstawia się jako błąd bezwzględny
lub względny.
Szacowanie dokładności metody :
ƒ przez analizę próbki o znanym stężeniu (np. certyfikowany
materiał odniesienia) i porównanie wyników uzyskanych
walidowaną metodą z wartością prawdziwą
ƒ przez porównanie wyników uzyskanych walidowaną metodą
z wynikami otrzymanymi metodą odniesienia, której
dokładność jest znana
ƒ przez dodanie znanej ilości analitu do badanego produktu, a
następnie jego oznaczenie sprawdzaną metodą.
Dokładność może być przedstawiona
odzysku, który oblicza się wg wzoru:
xi
µ
jako
procent
*100%, gdzie
xi – oznaczona ilość analitu w badanej próbce,
µ- znana ilość analitu w badanej próbce
Kryteria akceptacji
Odzysk powinien wynosić 95 – 105% w przypadku składnika
głównego i 80 – 120% dla składników na poziomie śladowym
(wartości te zależą między innymi od stężenia analitu w
badanej próbie i metody badania).
Zakres:
ƒ przedział między minimalną i maksymalną zawartością
(stężeniem) substancji aktywnej w badanej próbie, w którym
metoda analityczna ma odpowiednią liniowość, dokładność i
precyzję.
Minimalny zakres stosowania metody analitycznej
powinien wynosić (kryteria akceptacji):
ƒ dla zawartości substancji głównej – od 80% do 120%
deklarowanej ilości analitu w badanej próbie
ƒ w przypadku oznaczania substancji na poziomie
śladowym zakres powinien wynosić od 10% do 120%
maksymalnej dopuszczalnej zawartości tej substancji
określonej w specyfikacji.
Granica wykrywalności (DL)
ƒ jest to najmniejsza ilość (stężenie) badanej substancji w
próbce, które może być wykryta, lecz niekoniecznie oznaczona
z odpowiednią dokładnością.
Granica oznaczalności (QL)
ƒ jest to najmniejsza ilość (stężenie) badanej substancji w
próbce, jaka może być ilościowo oznaczona z odpowiednią
precyzją i dokładnością.
3.3 * S
DL =
b
10 * S
QL =
b
S – odchylenie standardowe ślepej próby
b – nachylenie prostej kalibracji
Liniowość:
ƒ zdolność do uzyskiwania wyników pomiaru analitycznego
wprost proporcjonalnych do stężenia (zawartości) substancji
oznaczanej w próbce, w określonym zakresie – zgodnie z
wyznaczonym równaniem matematycznym y = ax+b
ƒ zależność między obu zmiennymi charakteryzuje
współczynnik korelacji r
ƒ liniowość wykazuje się przez analizę próbek o stężeniach
analitu, obejmujących deklarowany zakres stężeń metody
ƒ należy wykonać badanie minimum 5-ciu serii wzorców (36 powtórzeń), których stężenia obejmują 80-120% stężenia
spodziewanego w próbce.
Kryterium akceptacji:
w przypadku oznaczania substancji głównej współczynnik r
powinien być większy od 0,995, w przypadku oznaczania
śladów powinien być większy od 0,98.
Liniowość:
0,30
y = 0,0085x + 0,00235
r = 0,99662
y,zmierzony sygnał
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
0
20
40
60
80
x,odważka badanej próbki [mg]
100
120
Elastyczność (stabilność metody):
ƒ badanie elastyczności metody powinno udowodnić
niezawodność analizy po wprowadzeniu niewielkich
celowych zmian parametrów metody
ƒ jeśli pomiar jest wrażliwy na zmianę warunków
analitycznych, warunki te powinny być odpowiednio
kontrolowane lub dokładnie opisane w procedurze.
Raport walidacyjny
Raport z walidacji metod analitycznych (wykonany po
zakończeniu prac laboratoryjnych) powinien zawierać:
ƒ przedmiot i zakres walidacji
ƒ rodzaj oznaczanych związków i matrycy
ƒ opis metody
ƒ kryteria akceptacji
ƒ stosowane odczynniki, substancje porównawcze i wzorce
ƒ opis aparatury (producent, typ)
ƒ względy bezpieczeństwa
ƒ parametry pomiaru
ƒ opis przeprowadzonego eksperymentu
ƒ postępowanie statystyczne i obliczenia
ƒ reprezentatywne wykresy
ƒ kryteria rewalidacji
ƒ podsumowanie i wnioski.
Raport walidacyjny
1. Oznaczana metoda analityczna
- ogólne informacje o metodzie i zastosowanej aparaturze
z podaniem jej typu
- roztwory wzorcowe
- rozwory badane
- wykonanie pomiaru.
Raport walidacyjny
2. Wybór optymalnych warunków pomiaru
- badania jakie wykonano w celu okreslenia optymalnych
warunków pomiaru
- parametry podlegające modyfikacji
- wyniki osobno dla każdego zmienianego parametru (w
tabeli – wartość parametru, wyniki – np. 7 powtórzeń,
średnia, odchylenie standardowe)
- wnioski.
Raport walidacyjny
Przykład: Dobór optymalnego przepływu acetylenu (fragment
tabeli wyników)
Numer
poziomu
Absorbancja
2
0.051
0.052
0.050
0.047
0.049
4
0.076
0.077
0.080
0.077
0.078
Średnia
absorbancja
Odchylenie
standardowe
Raport walidacyjny
3. Założenia walidacyjne
3.1. Specyficzność/selektywność
- opis pomiarów jakie należy wykonać
- wymagane wzorce wraz z okeśleniem stężeń
- sposób obliczenia wyniku
- kryterium akceptacji.
3.2. Powtarzalność
3.3. Precyzja pośrednia
3.4. Dokładność
3.5. Liniowość
3.6. Zakres metody
3.7. Granica oznaczalności.
Raport walidacyjny
4. Wyniki testów walidacyjnych
4.1. Specyficzność/selektywność
- opis pomiarów jakie wykonano
- lista wzorców jakie wykorzystano wraz z podaniem
stężeń
- wyniki pomiarów
- wyniki obliczeń
- informacja czy spełnione kryterium akceptacji.
Raport walidacyjny
Przykład. Badanie wpływu Na na wynik oznaczenia Ca
metodą ASA.
Stosunek
stężeń
Na:Ca
Średnia
absorbancja
Różnica średnich
absorbancji wzorca bez
dodatku Na i wzorca z
dodatkiem Na
0:1
0.163
0.000
1:10
0.159
0.004
1:5
0.165
0.002
Kryterium
akceptacji
0.006
1:2
0.168
0.005
1:1
0.169
0.006
10:1
0.186
0.023
Raport walidacyjny
4. Wyniki testów walidacyjnych
4.2. Powtarzalność
- opis pomiarów jakie wykonano
- lista wzorców jakie wykorzystano wraz z podaniem
stężeń
- wyniki pomiarów
- wyniki obliczeń
- informacja czy spełnione kryterium akceptacji.
Raport walidacyjny
Przykład. Badanie powtarzalności oznaczania Ca metodą
ASA.
Stęże
nie
[mg/l]
A1
A2
A3
A4
A5
A6
A7
1
0.067 0.068 0.071 0.070 0.069 0.071 0.070
2
0.110 0.107 0.110 0.107 0.109 0.110 0.109
3
4
5
7.5
A
S
CV
[%]
Raport walidacyjny
4. Wyniki testów walidacyjnych
4.2. Precyzja pośrednia
- tak jak powtarzalność ale dwóch różnych dniach
Raport walidacyjny
4. Wyniki testów walidacyjnych
4.4. Dokładność
- opis pomiarów jakie wykonano
- lista wzorców jakie wykorzystano wraz z podaniem
stężeń
- wyniki pomiarów
- obliczony wynik wraz z podaniem poziomu niepewności
- pozostałe wyniki obliczeń
- informacja czy spełnione kryterium akceptacji.
Raport walidacyjny
Przykład. Badanie dokładności oznaczeania Ca metoda
ASA.
Stężenie
[mg/l]
Absorbancja
2.5
0.134
0.132
0.133
0.132
0.133
4.5
0.226
0.228
0.224
0.225
0.228
Średnia
absorbancja
Średnie
stężenie
Stopień
odzysku [%]
Prosta kalibracji: y=0.0485x+0.0075
Raport walidacyjny
4. Wyniki testów walidacyjnych
4.5. Liniowość
- opis pomiarów jakie wykonano
- lista wzorców jakie wykorzystano wraz z podaniem
stężeń
- wyniki pomiarów
- wyniki obliczeń (współczynniki prostej kalibracji,
współczynnik korelacji)
- wykres prostej kalibracji
- informacja czy spełnione kryterium akceptacji.
Raport walidacyjny
Przykład. Badanie liniowości oznaczania Ca metodą ASA.
Stężenie [mg/l]
Średnia absorbancja
0
0.000
1
0.059
2
0.109
3
0.154
4
0.203
5
0.250
7.5
0.368
Raport walidacyjny
4. Wyniki testów walidacyjnych
4.6. Zakres metody
- informacja jak obliczono zakres metody
- uzyskany wynik (tj. zakres)
- informacja czy spełnione kryterium akceptacji.
Raport walidacyjny
4. Wyniki testów walidacyjnych
4.7. Granica oznaczalności
- informacja jak obliczono granicę oznaczalności
- uzyskany wynik (tj. DL)
- informacja czy spełnione kryterium akceptacji.
Raport walidacyjny
5. Wnioski końcowe
- informacja czy walidacja została zakończona wynikiem
pozytywnym i metoda może być stosowana.
KONIEC RAPORTU
Wykonał: xxx
Dziękuję za uwagę!