Preparación de células de E. coli químicamente competentes
Para la preparación de células químicamente competentes de E. coli DH10B
y E. coli BL21 , se utilizó el método “Preparation and Transformation
of Competent E. coli Using Calcium Chloride” con modificaciones menores [ 19 ].
1. Todos los pasos de centrifugación se procesaron a +4˚C. Brevemente, el
cultivo de E. coli DH10B/BL21 en fase logarítmica media (DO 600 : 0,4–0,6).
2. se incubó en hielo durante 30 minutos y se centrifugó a 5000 rpm durante 10 min.
3. El pellet se lavó con dH 2 O, solución de glicerol al 10 % y solución de MgCl 2 80
mM - CaCl 2 20 mM.
4. Después de la centrifugación final (5000 rpm durante 10 min), el pellet se
resuspendió en solución de CaCl 2 0,1 M.
5. Se mezclaron 100 μl de células competentes y 10 μl de ADN de fago y se
incubaron en hielo durante 30 minutos. Para la transformación, la mezcla se
incubó a 42 °C durante 2 minutos y se transfirió inmediatamente a hielo durante
2 minutos.
6. Se añadió 900 μl de caldo de soja tripsínica (TSB) a las células y se incubó a 37
°C. Después de una hora, las células se transfirieron a 10 ml de TSB y se incubaron
durante la noche. Al día siguiente, las células se centrifugaron a 5000 rpm durante
10 minutos y el sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,22 μm. El filtrado
se utilizó para los pasos continuos.
Este protocolo describe la preparación de células de E. coli químicamente competentes
mediante el tratamiento con sales como CaCl₂ y MgCl₂, y la posterior transformación
con ADN, en este caso, ADN de fago. A continuación te explico paso a paso lo que se
hace y por qué:
1. Crecimiento de las células
"El cultivo de E. coli DH10B/BL21 en fase logarítmica media (DO600: 0,4–0,6)..."
¿Por qué?: En esta fase las bacterias están metabólicamente activas y sus
membranas están más receptivas a incorporar ADN extraño.
OD600 = 0.4–0.6 indica la densidad óptica del cultivo, que refleja el número de
bacterias en crecimiento activo.
2. Incubación en hielo (30 min) y centrifugación (5000 rpm, 10 min, 4 °C)
¿Por qué?: El hielo ayuda a estabilizar las membranas celulares y favorece la
unión del Ca²⁺ a la membrana externa.
Centrifugación: para recolectar las células.
3. Lavado del pellet con:
Agua destilada (dH₂O)
Solución de glicerol al 10%
Solución de MgCl₂ 80 mM + CaCl₂ 20 mM
¿Por qué estos componentes?
o Agua destilada: elimina restos de medio.
o Glicerol al 10%: protege las células durante el congelamiento si se van a
almacenar.
o Mg²⁺ y Ca²⁺: ayudan a neutralizar cargas negativas de la membrana
bacteriana y del ADN, facilitando su entrada.
4. Resuspensión final en CaCl₂ 0.1 M
¿Por qué?: Es un paso clásico del método de Mandel y Higa (1970) para inducir
competencia química en E. coli. Ca²⁺ “abre” temporalmente poros en la
membrana.
🔬 Transformación del ADN
"Se mezclaron 100 μL de células competentes y 10 μL de ADN de fago..."
Se hace una incubación en hielo (30 min): permite que el ADN se acerque a la
membrana.
Luego choque térmico a 42 °C (2 min): crea un gradiente térmico que favorece
el paso del ADN al citoplasma.
Inmediatamente de vuelta al hielo (2 min): estabiliza las membranas.
� Recuperación post-transformación
Se añade 900 µL de TSB (tryptic soy broth) y se incuban a 37 °C: esto permite
que las bacterias se recuperen y comiencen a expresar genes del ADN
transformado (por ejemplo, resistencia a antibióticos).
Luego se pasan a 10 mL de TSB y se incuban toda la noche.
� Filtración y uso del sobrenadante
"Las células se centrifugaron, y el sobrenadante se filtró por 0,22 μm..."
Esto sugiere que el ADN transformado o el producto expresado se encuentra
en el medio, y se va a utilizar en experimentos posteriores (probablemente para
ensayos con fagos o expresión de proteínas).
✅ Resumen del objetivo:
Este protocolo permite preparar células ultracompetentes químicamente (aunque no usa
ese nombre formal) mediante tratamiento con sales divalentes, choque térmico y una
recuperación prolongada. Es aplicable a cepas como DH10B y BL21, y es especialmente
útil si se busca una alta eficiencia de transformación para trabajar con fagos, plásmidos
o BACs.
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