CONCEPTOS - LABORATORIO N°6
PROPIEDADES ESPECTRALES DE GFPs. APLICACIÓN EN UN
BIOSENSOR BASADO EN FRET
Asignatura: BIOFISICA – Lic. en Biotecnología
OBJETIVO GENERAL
•
Verificar las características espectrales de GFP y sus variantes. Ejemplificar cómo estas
características permiten su aplicación en el diseño de nanosensores biológicos basados en FRET.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Comparar los espectros de fluorescencia de GFP con las variantes “cyan” (CFP) y “yellow” YFP.
• Caracterizar in vitro las propiedades espectrales de un nanosensor de sacarosa basado en transferencia
de energía (FRET).
• Observar el fenómeno de fluorescencia derivado de estas proteínas en células bacterianas
• Observar el efecto del agregado de sacarosa sobre un sensor basado en FRET diseñado para monitorear
la concentración de azúcares.
• Determinar la constante de afinidad por sacarosa de dicho sensor y su rango dinámico
GFP: barril beta
La cavidad del cromóforo:
• está revestida residuos de aa. cargados en las inmediaciones del cromóforo
• moléculas de H2O importantes para establecer una red ptes H que rodea el cromóforo
• además de fuerzas de van der Waals, apilamiento π-orbital e interacciones hidrofóbicas con otros aa en el área,
⇒ Fundamentales para establecer las propiedades fotoquímicas espectroscópicas y dinámicas de GFP y derivados.
Las mutaciones que alteran directamente la estructura covalente del cromóforo, o que cambian significativamente el
microambiente circundante, generalmente tienen un profundo efecto en las propiedades espectroscópicas (perfiles de
absorción y emisión) de proteínas fluorescentes.
Interestingly, EGFP has a single excitation peak at ~490 nm due
to the suppressing of the 395 nm peak by S65T since it
modulates the ionized state of Glu222 nearby. On the other
hand, F64L increases the folding efficiency at 37 °C.
Importantly, the codon sequence of EGFP is optimized for the
expression in the mammalian cells.
Una pregunta a responder….
Las moléculas dentro de las células tienen las mismas propiedades que en solución???
Mas allá de que las proteínas pueden ser afectadas por proteasas, oxidasas y demás enzimas de las células…
El pH intracelular, la presencia de ligandos eventuales/interferencias, las características del solvente intracelular …
Entonces…?
Siempre, luego de la caracterización de un
nanosensor (o construcción cualquiera) de la
manera tradicional (en solución), es preciso validar
su comportamiento en las células en las que se va a
utilizar….en las condiciones en las que se va a
utilizar…
Dentro de las innumerables aplicaciones de las proteínas fluorescentes en el visible….Fluorescent protein indicators
roGFP
pHLUORIN
CONSTRUCCIONES REPORTERAS
NANOSENSORES FRET
Y otros…
https://www.ibiology.org/talks/fluorescent-protein-indicators/
NANOSENSORES FRET
NANOSENSORES FRET
Fluorescencia ratiométrica: se miden las intensidades en dos o
más longitudes de onda de un espectro de excitación o emisión
para detectar cambios en el entorno local.
Se usa una sonda que es específicamente sensible a un
parámetro ambiental como la concentración de iones, pH,
viscosidad o ligando.
• El sensor FRET mide los cambios conformacionales de las
proteínas y no de los metabolitos per se.
• El análisis cuantitativo de los niveles absolutos in vivo de un
analito requiere la calibración de los sensores.
Como se hace?
Frente a cada agregado de analito
R=Ifaceptor/ Ifdador,
Y se puede construir una grafica de saturación
S = (R- Rmin)/(Rmax -Rmin)
Ajuste: union a ligando, un sitio
f= Bmax*x/(Kd + x)
Como evaluamos al sensor?
Como se hace?
Frente a cada agregado de analito
R=Ifaceptor/ Ifdador,
Como evaluamos al sensor?
Rango dinámico, RD= Rmáx/Rmin.