[실험 7] Bradford Assay
Bradford reagent는 염색제 포함된 강산 용액, 실험복&장갑 착용.
Bradford Assay
Cuvette 사용 시 빛이 지나가는 투명한 well 만지지 않도록 주의
✌✊🖐 일단 측정 순서부터 정합시다
1.
E tube에 standard sample 농도 별 5가지, unknown protein sample 준비.
**Bradford reagent는 가장 마지막에, 앞 조 측정 시작할 때**
B
1
2
3
4
5
1 mL
9.0 uL
8.0 uL
7.0 uL
5.5 uL
4.0 uL
0 uL
Standard Protein
(2 mg/mL)
×
1.0 uL
2.0 uL
3.0 uL
4.5 uL
6.0 uL
Unknown 10 uL
Bradford Reagent
×
990 uL
990 uL
990 uL
990 uL
990 uL
990 uL
3DW
Unknown (6)
2.
실온 & 빛 차단 상태로 5 min inverting
3.
7개 각각 cuvette에 1 mL 전부 옮겨 담고
4.
1~5번 595 nm 흡광도 측정, 기록 ⇒ calibration curve
5.
6번 595 nm 흡광도 측정, 기록
6.
측정된 흡광도가 calibration curve 바깥에서 나오면, 범위 안으로 들어오도록 희석해서 다시 측정
On your table :
bradford reagent
On the front table :
cuvettes
To the bin :
tips, tubes, samples, gloves
Reagents & Apparatus
- purified protein solution, MBP, 3DW
Bradford reagent(Coomassie Brilliant Blue G-250, ethanol, phosphoric acid)
- microtube, micro pipette, spectrometer, cuvette
Results
- Standard protein으로부터 얻은 calibration curve 도시 ⇒ 일차식
- 측정한 흡광도 값을 일차식에 대입해 미지 시료에 포함된 protein 농도(mg/mL) 계산
Discussion
- Bradford assay 원리; Coomassie brilliant blue G-250, Beer-Larmbert law, 적용 가능 농도 범위 등
- Bradford reagent에 포함된 phosphoric acid의 역할은?
- 높은 순도로 정제한 target protein sampl과 소량의 불순물 단백질이 섞여있는 target protein
sample의 농도 측정 결과가 모두 1.00 mg/mL일 때 어떤 sample의 농도값이 target protein 농도의
참값에 더 가까울까? Target protein의 절대량이 다른 sample에서 같은 농도가 계산된 이유는
무엇일까?