APOPTOSIS II
clearance
Consiste en la fagocitosis de los cuerpos apoptóticos por parte de células fagociticas como
son los macrofagos.Los macrofagos sacan a la célula muerta del medio de manera que no
perturbe a su entorno. Los cuerpos apoptóticos no tienen solo la función de depurar a la
célula muerta, tienen forma de vesícula, y pueden contener información de la célula de la
que provienen como: micro rna, dna, organelas residuales, lípidos, RNAm y proteínas, de tal
manera que llevan información en la célula en la cual van a ingresar.
Los cuerpos apoptóticos son elementos que intervienen en la comunicación intercelular. Se
consideran un tipo de vesícula extracelular. Pueden impactar sobre las células vecinas
llevando información, puede inducir en los tejidos procesos de reparación y regeneración,
intervenir en procesos inflamatorios, pueden actuar como inmunomoduladores, se los puede
cargar con drogas y utilizarlos como una plataforma de entrega en determinadas células.
Son potenciales herramientas de diagnóstico y terapéuticas.
Se debe realizar el clearence
porque si presenta defectos puede
inducir patología, en condiciones
normales se llega a la homeostasis
del sistema inmune
La apoptosis puede funcionar
como un mecanismo de protección
celular frente a determinados tipos
de daño para eliminar la célula
dañada y que no modifique el
entorno. Cuando este proceso se
desregula da lugar a la presencia
de patologías.
por muerte en defecto:cáncer, lupus, artritis reumatoidea
muerte por exceso:sida, infarto de miocardio, enfermedades neurodegenerativas
LA DESREGULACIÓN DE LA APOPTOSIS ES IMPORTANTE PARA EL CRECIMIENTO
DE TUMORES, esto conlleva a un aumenta de la proliferación celular y una
disminución de la apoptosis
Esto puede relacionarse con una sobreexpresión de proteínas como las IAP y de la familia
de Bcl2
AUTOFAGIA (comerse a sí mismo)
Proceso mediante el cual la célula elimina componentes propios de ella misma.
Hay diferentes vías que aportan materiales a los lisosomas, por un lado la vía de la
endocitosis que lleva a través del endosoma temprano, tardío, el material para ser
degradado por el lisosoma. Por otro lado, la fagocitosis, en la que la vesícula que se forma
se llama fagosoma y se termina degradando en el lisosoma.
En el caso de la autofagia se forma una vesícula especial que se llama autofagosoma que
presenta doble membrana e incluye componentes propios de la célula, puede incluir
organelas enteras. Se produce en condiciones basales,a una baja velocidad, para mantener
su homeostasis. En determinadas situaciones se puede estimular y producirse a mayor
velocidad.
¿por qué este modelo?
Eligió este modelo porque es fácil de manipular, tiene un tiempo de vida relativamente corto,
se puede cultivar en el laboratorio. Es una célula unicelular eucariota
La vacuola de la levadura es el equivalente del lisosoma de las eucariotas superiores.
Entonces, los autofagosomas tienen un tiempo de vida breve, se forman tienen un tiempo
de vida de 0 minutos y una vez que se fusionan con el lisosoma son degradados. Son
difíciles de ver en el microscopio
¿Cuál fue la estrategia?
Utilizar levaduras mutantes que carecían de enzimas hidrolíticas en la vacuola y a su vez
estimuló la autofagia sometiendo a las levaduras a inanición. Con las segundas logro ver la
acumulacion de los autofagoomas dentro de la vacuola.
En múltiples cultivos introdujo levaduras con distintas mutaciones, induce la autofagia, si en
esas condiciones(con las mutaciones) no se veia el auofagosoma quiere decir que el gen
mutado es importante para la autofagia. De esa manera fue encontrando diversos genes, y
se determinaron 15 genes esenciales para el desarrollo de la autofagia.
La autofagia se produce por una cascada de complejos proteicos.
La autofagia es un mecanismo que le sirve a la célula para adaptarse y sobrevivir en
condiciones de determinados tipos de estrés, el principal estímulo que desencadena la
autofagia es la inanición, también existen la falta de energía, hipoxia, la falta de factores de
crecimiento.
La alteración del
proceso de autofagia
puede tener
implicancia en la
generación de
enfermedades
neurodegenerativas y
cáncer.
Tipos de autofagia:
La clasificación está dada por la carga que va a tener el autofagosoma
● macroautofagia, primero se forma una membrana de aislamiento que es en la que se
empieza a formar el autofagosoma. Va a reclutar una carga que se va a degradar,
luego la membrana se cierra para formar el autofagosoma que luego se va a
fusionar con el lisosoma formando el autolisosoma. En esta organela se produce la
degradación total tanto de la membrana como de los componentes que tiene el
autofagosoma.
● microautofagia, lo que se degrada son pequeños agregados proteicos o proteínas
disfuncionales que están en el citosol, se forman pequeñas vesículas hacia adentro
del lisosoma, en ello interviene los complejos ESCRT y chaperonas
● autofagia mediada por chaperonas, tiene una secuencia señal específica(KFERQ)
las que presenten estas misma puede ser degradadas por este mecanismo. Primero
son asistidas por chaperonas que las trasladan hacia el lisosoma e ingresan a ella a
través de un complejo proteico donde se encuentra LAMP2. Ingresan al lisosoma de
manera desplegada y dentro del lisosoma son degradadas por las enzimas
hidrolíticas.
MACROAUTOFAGIA
Se puede clasificar en selectiva/no selectiva
La autofagia no selectiva, ocurre continuamente para reciclar componentes celulares, en
general está estimulada por el ayuno y su función es ayudar a la supervivencia celular
reciclando moléculas. Dentro de ese autofagosoma puede transportar distintos tipos de
carga.
La autofagia selectiva, requiere receptores de autofagia, incluye determinadas estructuras y
proteínas, la carga tiene que estar unido al receptor y a su vez este a la membrana del
autofagosoma.
De acuerdo al tipo de estructura que transporte ese autofagosoma se puede clasificar
como: mitofagia(la carga son mitocondrias) , reticulofagia, lipofagia(gotas lipidicas) y
peroxifagia(peroxisomas)
Tanto en la levadura como en los humanos los
genes están conservados.
En este caso tanto para levadura y humanos las
proteínas participantes son homólogas(las que
están una al lado de la otra) pese a que tengan el
mismo nombre o no.
Formación del autofagosoma
Ante un estímulo se reclutan determinados ATG en un sitio específico llamado sitio de
ensamblaje del fagosforo (son las primeras membrana donde ocurren los reclutación y se
comienza a formar el autofagosoma) , se recluye la carga y la membrana se va formando
alrededor de ella y luego se cierra. Una vez que se forma tenemos el autofagosoma con su
doble membrana, luego se fusiona con el lisosoma y se forma el autolisosoma.Finalmente
los componentes degradados son reciclados para que la célula los pueda volver a utilizar,el
lisosoma se recicla también.
La formacion del auofagosoma se produce en diferentes etapas:
hay una primera etapa de iniciación y una de nucleación del fósforo, luego la expansión del
fagosforo junto con la inclusión de la carga(procesos simultáneos), sellado del
autofagosoma, la maduración del autofagosoma, la fusión con el lisosoma y el reciclaje de
los nutrientes.
Estímulos que desencadenan la autofagia
Una vez que se estimul la auofagia, se
produce la iniciacion . El primer complejo
que es el iniciador es el complejo ULK1,
dentro de él tenemos proteínas como la
ULK1 que es una kinasa act-serinatreonina, fosforila dichos residuos, puede
autofosforilarse y fosforila a algunos
componentes de este mismo complejo, y
además fosforila a una proteína(VPS34) presente en el complejo de la PI3K. Cuando se
activa ULK1 fosforila a la proteína del segundo complejo, PI3K clase 3 que interviene en la
nucleación del fagosforo. La VPS34 es una quinasa de lípidos que fosforila al PI en posición
3 ,produciendo PIP3 que es importante para reclutar a otras proteínas, en una región del RE
llamada omegasoma Beclina 1: regula la actividad quinasa de la VPS34. Entonces el
complejo PI3K es reclutado por el complejo ULK hacia ese sitio del RE, entonces VPS34
fosforila al PI y la membrana del omegosoma se va a ir enriqueciendo el PIP3 y eso va a
reclutar a otras proteínas. La Beclina 1 es importante porque regula la actividad quinasa de
la VPS34.
Cuando se forma el fagosgoro este tiene que expandir su membrana y en simultáneo se
tiene que ir incluyendo la carga, para la expansión del fagosforo hay vesículas específicas
que tienen en su membrana ATG9 (proteína integral de membrana) ¿de donde vienen las
vesículas? vienen de distintos compartimentos celulares como la m.p, la mitocondrial, del
golgi, todas las membranas que presenten ATG9 vienen a este sitio y van aumentando el
tamaño de la membrana del fagosforo.
La membrana del omegasoma enriquecida en PIP3 recluta es WIPI2(con afinidad por el
PIP3).
Una vez en ese sitio WIPI2 recluta a otras proteínas ATG, ATG3, ATG5/2/16 que tienen
actividad simil ubiquitina(transfieren sustratos de un lado a otro). En este punto
LC3(proteína citosólica) es reclutado por el complejo de ATGS’ hacia la membrana del
fagosforo y es modificada por un corte proteolítico y una conjugación a
PE(fosfatidiletanolamina) que esta presente en la membrana del fagosforo, produciendo el
pasaje de LC3I a LC3II quedando unida a la membrana del fagosforo. Constituye una
molécula marcadora de autofagia por excelencia.
LC3II es muy importante ¿por qué?
-promueve la expansión y el posterior sellado del autofagosoma
-atare a proteínas con dominios LIR
-reclutar carga específica
-fusión con el lisosoma
Las vesículas que contienen ATG9 son las que llevan membrana al fagosforo para su
crecimiento. Una vez formado el autofagosoma ATG9 es reciclada para poder ser
reutilizada.
En rojo tenemos LC3 soluble, que primero sufre un corte proteolítico
realizado por ATG4(proteasa), una vez que está truncada ATG3/7/etc
conjugan LCR con PE y se convierte en LC3II.
Es llamada LC3 en los mamíferos, en las levaduras es ATG8.
Como la imagen corresponde a las levaduras donde dice ATG8
corresponde a LC3 también.
Entonces, LC3I sufre corte proteolítico por ATG4. Luego la ATG7 se une a
LC3I la activa y se la pasa a ATG3 que induce la conjugación con PE, une
a la LC3I con PE formando LC3II. Para que este proceso sea eficiente
tiene que actuar el complejo ATG12/5/16 en la conjugación.
LC3 recluta proteínas que tienen dominios de reconocimiento de LC3, llamados dominios
LIR. Entonces, en el caso de la autofagia selectiva las mitocondrias(proteínas carga) se
deben unir primero a receptores que reconozcan a LC3II. Una vez que se produce el
sellado, hay una maduración del autofagosoma consiste en perdida de determinadas
ATG(por ej ATG9) se recicla, y se recluta la maquinaria de transporte y de fusión del
autofagosoma.
Maquinaria de transporte
El autofagosoma va a ser transportado a
través del citoesqueleto sobre microtúbulos
por interacción de proteínas motoras de los
microtúbulos como la kinesina, esta misma
se va a unir a través proteínas adaptadoras a
la membrana del autofagosoma a través de
LC3II.
Maquinaria de fusión
Además también van a ser incluidas las
proteínas SNARE que van a permitir la fusión
del autofagosoma con el lisosoma y las
proteínas RAB que van a permitir la
interacción con el efector RAB correspondiente para interaccionar con la membrana del
lisosoma y después fusionarse las dos membranas.
Sellado o cierre del autofagosoma
Participan los complejos ESCRT I y III, son reclutados hacia el fagosforo o un mecanismo
desconocido, ESCRT III polimeriza en forma de espiral (se supone que se produce para que
las membranas se acerquen algún tipo de cambio conformacional), para despolimerizar esta
proteína interviene la VPS4 que es una ATPasa y finalmente se fusionan las membranas, se
despolimeriza ESCRT III y se tiene el autofagosoma formado.
¿Cómo se recluta la carga en la autofagia
selectiva?
xenofagia:cuando la carga es un patógeno
agregofagia: la carga son agregados proteicos
Tiene que haber señales presentes en las
moléculas que van a ingresar en el
autofagosoma o en las estructuras, las más
comunes son monoubiquitina,poliubiquitina, o
ubiquitina fosforilada.
Por otro lado se necesitan receptores de
autofagia, tienen que tener dominios de unión:
uno de unión a ubiquitina (UBA,UBAN,UBZ) A través de estos dominios el receptor se une a
la molécula que tiene que ser incluida en el autofagosoma
A su vez tienen que tener dominios LIR para interaccionar con LCIII2.
El mecanismo es reclutamiento selectivo a través de receptores de autofagia que se unen a
LC3II
MITOFAGIA
A partir de una mitocondria saludable, que en un determinado momento sufre un
daño dando lugar a una mitocondria no funcional/polarizada. Cuando sucede
esto,se activa una quinasa llamada PINK1 además de fosforilar puede reclutar una
ubiquitina ligasa E3, las dos trabajan en conjunto para introducir residuos de
ubiquitina y fosforilarlos. Una de las marcas principales para introducir una
estructura en el autofagosoma es la ubiquitina fosforilada.
La ligasa introduce ubiquitinas y la quinasa las fosforila, entonces van a tener
muchas proteínas en la membrana de la mitocondria con marcas de ubiquitina
fosforiladas(en rosa). Esa ubiquitina fosforilada se va a unir a un receptor de
autofagia a través de su dominio de unión a ubiquitina(UBD) y el otro dominio LIR se
va a unir a LC3II y asi se incluye la mitocondria dentro del autofagosoma. El proceso
de acoplamiento de la mitocondria dañada con el receptor se ve estimulado por la
fosforilación del receptor por determinadas quinasas que se estimulan durante
condiciones de estrés.
Hay otro mecanismo que es independiente de ubiquitina, se da en casos de
proteínas de la membrana mitocondrial
que ya tengan un dominio LIR, entonces
no haría falta el receptor para que se
incluyan en el autofagosoma. Esto se
estimula en condiciones de estrés, se
activan determinadas quinasas que
fosforilan el dominio LIR y de esa manera
y esto es reconocida por el dominio LIR de
LC3II y se incluye la carga dentro del
autofagosoma.
El otro caso es reconocimiento de la carga mediada por lípidos, hay ciertos
lípidos(cardiolipina o ceramida) que en muchos tipos celulares actúa también como
un mecanismo de incorporación de las mitocondrias en los
autofagosomas.Normalmente la cardiolipina se expresa en la membrana interna
mitocondrial, ante estrés mitocondrial puede ser translocada hacia la membrana
externa, expuesta es reconocida por
el dominio LIR de LC3II y es incluida
en el autofagosoma.
¿Cómo se activa ULK1?
Está involucrada la vía mTor con la
inducción de la autofagia.
Cuando el complejo mTor está activo
y a su vez está unido a una proteína
Rheb, por un lado estimula la síntesis
de proteína, biogénesis del ribosoma, transcripción por Pol III, e inhibe la
macroautofagia.
mTor=(target of rapamicina), es una proteína diana de la droga rapamicina.La rapamicina inhibe a
mTor y como la inhibe estimula la autofagia.
La inactivación o activación depende de un complejo proteico formado por TSC1 y
TSC2 que es la rheb gap, la proteína que inhibe o cataliza la hidrólisis del GTP de
Rheb. Cuando está activa esta hidroliza a Rheb e inactiva a mTor
Se regula por distintos estímulos:
La presencia de factores de crecimiento inhibe a esta proteína, el estrés por hipoxia,
la disminución de energía estimula a esta quinasa(AMPK) que lo que hace es
fosforilar al complejo y activarlo.
Estímulos presentes-complejo activo e hidroliza Gtp- inactiva mtor
Además, el complejo mTor se puede regular directamente por la concentración de
nutrientes, una baja concentración directamente inhibe la vía mTor
Cuando hay nutrientes suficientes, mtor activo fosforila a diversos componentes del
complejo ULK1, puede fosforilar a ULK en sitios inhibitorios inhibiendo la autofagia,
y a su vez AMPK está inactiva porque
hay suficiente energía y la relación
normal adp/atp es alta
En condiciones de inanición o estrés,
AMPK se activa porque censa la
relación ATP/ADP cuando disminuye
se activa y fosforila a diversos
sustratos. En principio fosforila a
Rheb-GAP y fosforila a un
componente de mTOR inactivando y
además fosforila en sitios activadores
a ULK1, a su vez esta se desfosforila en sitios inhibitorios. Cuando ULK1 se activa
se puede autofosforilar en diferentes sitios y a su vez fosforilar a otros componentes
del complejo, de manera que el complejo se activa y puede inducir el inicio de la
formación del autofagosforo y se induce la autofagia.
¿Cómo se relacionan la apoptosis y la autofagia?
Ambos eventos se disparan por el estrés, la cuestión es ¿cómo sabe la célula que
proceso debe activarse ante un mismo estímulo?
Cada tipo celular va a tener un umbral diferente en determinados momentos de la
vida de ese tipo celular. Por otro lado en cierta medida, los procesos se inhiben
mutuamente, si bien los dos son procesos catabólicos, la autofagia tiende a la
supervivencia celular mediante la adaptación a distintos tipos de estrés mientra que
la apoptosis lleva a la muerte celular.
Hay que considerar que las proteínas antiapoptóticas de la familia BCL2 tienen
dominios de unión a membranas, se pueden unir a la membrana del retículo, pero
además se pueden unir a beclina porque tienen un dominio BH3 al igual que las
bcl2. Cuando están unidas en la membrana del retículo, no hay autofagia
Esto se puede revertir cuando otras proteínas reclutan estas proteínas de autofagia
y deja libre al complejo PI3K para que se pueda llevar a cabo la autofagia
Si bien la autofagia es un proceso que lleva a la supervivencia celular en
determinadas condiciones puede llevar a la muerte de la célula.
Podemos hablar de muerte asociada a autofagia, muere por apoptosis y durante ese
proceso se produce autofagia.Puede estar mediada por autofagia, primero se
produce la inducción de la autofagia y luego la apoptosis.Puede ser dependiente de
la autofagia, ante determinada señal la autofagia es excesiva y lleva a la muerte de
la célula, es independiente de apoptosis y de otros tipos de muerte y utiliza la
maquinaria de la autofagia. Por otro lado puede haber una acción coordinada de
apoptosis y autofagia, al mismo tiempo se disparen los dos procesos y lleven
conjuntamente a la muerte celular o que se dispare la apoptosis y luego la autofagia,
en este caso están involucradas Bax/ Bak
Tanto para el estrés de retículo, la autofagia y la apoptosis el estímulo disparador es
un tipo de estrés. En el caso del primero es por el aumento de proteínas no
plegadas o mal plegadas y se dispara una respuesta para que se plieguen
correctamente en caso de no darse así se degradan la proteínas. En algunos casos
la célula no logra sobrepasar el estrés de retículo y se pueden disparar procesos de
autofagia, en el caso de no ser suficiente finalmente lleva a la apoptosis.
BCL2 cuando está unida a la membrana del retículo, se une a beclina e inhibe la
formación del complejo PI3K e inhibe la autofagia. cuando se produce un alto estrés
de retículo se activa una vía citosólica que lleva a la activación de la quinasa JAM
que puede fosforilar a bcl2 unida a la membrana del RE.Cuando se fosforila, cambia
su conformación y beclina se puede liberar para inducir la autofagia. Por otro lado
como consecuencia puede salir a través y canales del calcio, el calcio al citosol que
junto a la calmodulina puede activar a AMPK que favorece a la autofagia. Si la cc de
calcio aumenta mucho,también puede entrar a la mitocondria y disparar la apoptosis
por la via intrínseca.
Métodos para monitorear la autofagia
Se pueden observar vacuolas autofágica por el microscopio electrónico de
transmisión o realizando un WB para observar la relación LC3I/ LC3II
(El - indica que no hay inhibidor de proteasas
lisosomales. )
Otra estrategia es la microscopía de
fluorescencia marcando a LC3, se induce la
autofagia con rapamicina y se observa marca de
LC3. En la tercera tenemos un control con un
inhibidor de autofagia, se observa que disminuye la fluorescencia con respecto a la
segunda imagen.
Otra estrategia para detectar mitofagia es utilizar un fluorocromo específico para
marcar mitocondrias y otro para lisosomas, en un caso se ve verde la mitocondria y
rojo el lisosoma, se analiza si colocalizan si lo hacen podemos decir que hay
mitofagia.
Otra estrategia es usar inmunofluorescencia, se podría detectar a cualquier ATG
con un anticuerpo primario, luego con un anticuerpo 2dario unido a fluorocromo.