1. 여러 식품 속의 세균 수 측정
3조
202233634
이준혁 (ppt 제작)
202233614
양지성 (발표)
202233636
이태희 (보고서 작성)
202334072
심재휘 (보고서 작성)
목차
1.실험제목
2. 실험목적
3. 이론
1) 균수 측정법과 현미경 직접계수법(Direct microscopic count)
2) 생균수 측정법(viable count)
3) 균체량 측정법
4) MRS 배지(MRS broth/agar)(De Man Rogasa & Sharpe agar)
5) 다음 균주에 대한 설명
4. 실험
4.1) 기기 및 기구
4.2) 시약 및 배지
5. 실험방법(평판 계수법)
6. 참고사항
7.참고문헌
1.실험제목
여러 식품 속의 세균 수 측정
2. 실험목적
여러 식품 속 균수를 측정하는 것은 다양한 식품의 품질과 안전성을 평가
하기 위한 필수적인 과정이다. 예를 들어, 식품 내 세균 수가 높게 측정되
었다면 실험자는 식품이 오염되었고, 식중독을 유발할 가능성이 높다고 결
론 내릴 수 있을 것이다. 이러한 결과를 바탕으로 실험자는 위험한 식품을
식별해낼 수 있게된다. 이는 균수 측정이 식품의 안전성을 확보하는데 큰
역할을 한다는 것을 의미한다.
실험자는 식품의 특성과 같은 다양한 요인들을 고려하여, 적합한 균수 측
정법을 선택해야한다. 이번 실험에서 우리는, 다양한 균 수 측정법에 알아
보고, 익혀서 적절하고 정확하게 균수 측정을 수행해낼 수 있는 것을 목표
로한다.
3. 이론
1) 균수 측정법과 현미경 직접계수법(Direct microscopic count)
균수 측정법이란 시료안에 포함된 균수를 측정하는 방법으로
총균수 측정법, 직접계수법, 생균수 측정법, 표준평판법 등이 있다.
그림 1
Microbe
Uses .Retrieved from
Notes.(n.d.).
Direct
Microscopic
Counts:
Principle,
Procedure,
https://microbenotes.com/direct-microscopic-counts
총균수 측정법이란 생균수와 사멸균수를 모두 합한 총균수를 측정하는 방
법으로 총균수 측정법 중에 현미경 직접계수법이 있다.
현미경 직접계수법(DMC, Direct Microscopic Count) 방법은 현미경을 사용
하여 샘플 내 균을 직접 관찰하고 균수를 세는 방법이다. 자세한 과정은
다음과 같다. 먼저 샘플준비이다. 샘플은 슬라이드의 형태로 제작되어야 하
며, 그 방식은 다양하다. 그 다음, 균이 더 잘 보이도록 크리스탈 바이올렛
(Crystal Violet) 또는 그람 염색(Gram Stain)과 같은 특수 염료로 염색 시킨
다. 이는 선택 사항이다. 마지막으로 슬라이드를 현미경에 놓고 특정 영역
의 균을 관찰하고 균수를 추정해낸다. 균이 agar에서 성장할 때까지 기다
릴 필요가 없기에 빠르게 결과를 얻어낼 수 있다는 장점이 있지만, 샘플
속의 모든 균들을 보기에, 특수 염색을 사용하지 않는 한 살아있는 균과
죽은 균을 구별해낼 수 없다.1
2) 생균수 측정법(viable count)
1
Henrici, A. T. (1932). Studies of Freshwater Bacteria: A Direct Microscopic Technique.University of
Minnesota.
① 평판 계수법(plate count)
생균 평판 계수법은 미생물을 배지에서 배양 시킨 뒤 생성되는 집락(colony)
의 수를 세는 방법이다. 배지에서 성장하여 집락을 형성할 수 있는 즉, 생
존 가능한 균들만 골라 계수할 수 있다. 이는 살아있는 균과 죽은 균을 구
별해낼 수 없었던, 직접계수법과의 차이점이기도 하다. 자세한 과정은 다음
과 같다. 여러번 희석하여 샘플을 준비한 뒤, 희석된 샘플의 일정량을 배지
(주로 agar)에 도말 혹은 주입한다. 먼저 샘플의 일정량을 배지에 도말하는
'도말평판법'에 대해 설명하겠다.
그림 2 BioRender. (n.d.). Spread Plate Method. Retrieved from
https://www.biorender.com/template/spread-plate-method
위 그림 처럼, 도말 평판법이란 고체배지 표면에 미생물을 도말한 다음 배
양한 후 집락을 측정하는 방법이다. 다음으로 샘플을 배지안에 주입하는
'주입 평판법'에 대해 설명하겠다.
그림 3 Microbe Notes. (2022). Pour plate method: Definition, principle,
procedure,
uses[Diagram].
Microbe
Notes.
https://microbenotes.com/pour-plate-technique-procedure-significanceadvantages-limitations/
위 그림처럼, 주입 평판법이란 빈 배지에 균을 접종한 다음 고체 배지를
혼합한 후 다 굳은 배지에 있는 균을 측정하는 방식이다. 이렇게 배지에서
미생물은 (24~72)시간 동안 배양되고, 실험자는 집락 수를 계수하면 실험
은 마무리된다. 결과는 그램당 콜로니 형성 단위(CFU/g) 또는 밀리리터당
(CFU/mL)로 표현될 수 있다. 생균 평판계수는 (24~72)시간 이라는 긴 배양
시간으로 신속한 다른 측정법들과 비교하여 결과가 지연될 수 있다는 한계
가 있다. 2
2
Bajwa A, Tan ST, Mehta R, Bahreyni B. Rapid detection of viable microorganisms based on a
plate count technique using arrayed microelectrodes. Sensors (Basel).2013;13(7):8188-8198.
doi:10.3390/s130708188.
② 최확수법(= MPN법, most probable number procedure)
최학수(MPN)법은 시료 내에 존재하는 균수를 '추정'하는 통계적 방법이다.
세균을 하나하나 세는 것이 어려울 때, 이 방법을 사용한다. 시료를 단계적
으로 희석하여 여러 시험관에 일정량 주입하여 균이 성장, 혹은 성장하지
않았는지를 기록하여 MPN표에 결과를 대입해서 본 시료 균의 농도를 추정
한다. 3
그림 4 Deborah, A. R. (n.d.). Most Probable Number (MPN) method for
counting
coliform.
Online
Biology
Notes.
Retrieved
from
https://www.onlinebiologynotes.com/most-probable-number-mpnmethod-for-counting-coliform/
3) 균체량 측정법
3
Papen, H., & von Berg, R. (1998). A Most Probable Number method (MPN) for the estimation of
cell numbers of heterotrophic nitrifying bacteria in soil. Plant and Soil, 199, 123–130. Kluwer
Academic Publishers.
① 균체 중량법
균체 중량법 (dry cell weight method)은 균을 정량화하는데 사용되는 기법
이다. 이 방법은 일반적으로 원심분리, 여과를 통해 균을 배양배지로부터
분리한 후, 남아 있는 배지 성분을 제거하기 위해 세척하는 과정들이 포함
된다. 분리된 균은 특정 온도에서 건조된다. 이는 수분, 타 이물질들을 제외
한 순수한 균체의 질량을 정확하게 평가할 수 있다.
그림 5 Ratha, S. K., Rao, P. H., Govindaswamy, K., Jaswin, R. S., Lakshmidevi, R., Bhaskar, S., &
Chinnasamy, S. (2016). A rapid and reliable method for estimating microalgal biomass using a
moisture analyser. Journal of Applied Phycology, 28(3), 1547–1555.
② 쿨터 카운터법(Coulter count)
쿨터 카운터법이란 전기저항법의 원리를 이용하여 입자(세포,균)의 크기와
분포를 측정한다. 이는 균을 신속하고 정확하게 계수할 수 있다. 아래 사진
을 설명해보자면, 약한 전해질 용액에 분산된 입자가 aperture 튜브 (23번)
를 통과할 때 발생하는 전류랑의 변화를 특정하여 입자의 크기와 분포로 변
하는 원리이다.
그림 6 Coulter, W. H. (1953). Means for counting particles suspended in a fluid. U.S. Patent No.
2,656,508.
United
States
Patent
and
Trademark
Office.
Retrieved
from
https://patentimages.storage.googleapis.com/1e/be/f1/724ae3a4ad7d5d/US2656508.pdf
③ 흡광광도법
흡광광도법이란 균이 포함된 배양액의 흡광도(OD, Optical Density)를 측정
하여 균의 농도를 추정하는 방식이다. 이는 균이 포함된 배양액이 빛을 얼
마나 흡수,산란 시키는지를 추정한다는 것이다. 그러나 흡광광도법은 살아
있는 세포와 죽은 세포를 구별할 수 없고, 부유물질이나 색소로 정확도가
떨어질 수 있으므로 평판계수법, MPN법 과 같은 다른 방법과 병행하여 사
용하는 것이 좋다.
그림 7. DewWool Team. (2022, March 2). Optical density: Meaning, measurement, applications.
DewWool. Retrieved from https://dewwool.com/optical-density-meaning/
4) MRS 배지(MRS broth/agar)(De Man Rogasa & Sharpe agar)
MRS 배지란 젖산균(Lactic Acid Bacteria, LAB), 특히 김치에서 분리된 균주
의 성장을 지원하는 데 널리 사용되는 배지이다. 이 배지는 포도당
(glucose), 자당(sucrose)등의 탄소원을 포함한다. MRS agar(MRS 고체배지) ,
MRS broth(액체배지)는 젖산균, 특히 Lactobacilius 속에 있는 종들의 성장
을 촉진시킨다.4
4
HiMedia Laboratories. (n.d.). Lactobacillus MRS Agar (MRS Agar) - Technical Data. Retrieved
5) 다음 균주에 대한 설명
㉠ Lactobacillus acidophilus
Lactobacillus acidophilus는 Lactobacillus속에 속하는 균이며 유제품과 사람
의 장내에서 흔히 발견되는 유산균이다. 이 균은 유해균의 생산을 억제하는
젖산을 생성하여 장 건강 유지에 중요한 역할을 한다. L. acidophilus의 계수
는 일반적으로 MRS 한천 배지에서 43°C, 72시간 혐기성 배양한다. 이 균은
다른 유산균보다 성장 속도가 느리다.5
㉡ Lactobacillus casein
Lactobacillus casei는 Lacticaseibacillus속에 속하는 균이며 유제품에서 자주
사용되는 중요한 프로바이오틱 유산균이다. 이 균은 반코마이신(당 펩타이
드 항생제)에 내성을 가질만큼, 가혹한 환경에서도 생존할 수 있다. 이 균은
일반적으로 MRS-반코마이신 한천 배지에서 37°C, 72시간 동안 혐기성 배
양하여 계수된다.6
from https://www.himedialabs.com/media/TD/M641.pdf
5
Tharmaraj, N., & Shah, N. P. (2003). Selective and differential enumerations of Lactobacillus
delbrueckiissp. bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus
casei, and Bifidobacteriumspp. in yogurt. Journal of Dairy Science, 86(7), 2288–2296.
6
Tharmaraj, N., & Shah, N. P. (2003). Selective and differential enumerations of Lactobacillus
delbrueckiissp. bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus
casei, and Bifidobacteriumspp. in yogurt. Journal of Dairy Science, 86(7), 2288–2296.
4. 실험
4.1) 기기 및 기구
01.Incubator(배양기)
02.전자저울
03.시약스푼
04.magnetic stirrer
05.magnetic bar
06.Petri dish
07.Autoclave(고압증기멸균기)
08.Clean bench(무균작업대)
09.메스실린더
10.삼각플라스크
11.pH meter
12.EP(Eppendorf)
13.tube(1.5mL)
14.spreader(유리)
15.알코올램프
16.마이크로피펫(50㎕)
17.피펫
18.필라
19.피펫꽃이
20.파라필름
4.2) 시약 및 배지
㉠ 0.1N HCl
제조 방법: 농축 염산의 농도(약 12M)를 기준으로 희석 공식 C₁ × V₁ =
C₂ × V₂를 사용하여 필요한 부피 V₁ = (0.1 × 1000) / 12 ≈ 8.33mL를
계산한다. 측정한 8.33mL의 농축 염산을 약 900mL 증류수에 천천히 넣고
잘 섞은 뒤, 총 부피가 1L가 되도록 증류슈를 추가한다.
또한, 0.1N HCl은 강산이므로 pH를 낮춰주는 역할을 한다.
㉡ 0.1N NaOH
제조방법: 0.1N NaOH의 몰질량 40.00 g/mol,
필요한 무게(g) = 농도(N) × 부피(L) × 몰질량(g/mol) 의 공식을 이용하여 ,
0.1N × 1L × 40.00g/mol = 4.00g 임을 계산한다.
측정한 4.00g의 NaOH를 약 100mL 증류수에 녹인 후, 부피가 1L가 되도
록 증류수를 추가한다.
참고로 NaOH는 공기중 이산화탄소와 잘 반응하기에 확실한 밀폐 보관이
요구된다.
또한, 0.1N NaOH는 강염기이므로 pH를 높여주는 역할을 한다.
㉢ 메틸알코올
㉣ 0.85% NaCl 용액
-먼저 NaCl 8.5그램을 정확히 측정한다. 이후 약 900mL의 증류수에 NaCl
을 넣고 완전히 녹을 때까지 저어준다. 이후 총 부피가 1리터가 되도록 증
류수를 추가한다.
㉤ MRS 배지(MRS broth/agar)
(1) MRS 액체배지
a.증류수 1L당 약 55.15g의 MRS분말을 준비한다.
b.분말과 증류수를 혼합한다.
c.가열하여 완전히 녹인 후 pH를 6.5 ± 0.2로 조정하고, 121°C에서 15분간
고압증기멸균한다.7
(2) MRS 고체배지
a.증류수 1L 당 약 62g의 MRS분말을 준비한다.
b.분말과 증류수를 혼합한다.
c.1.5% 한천(agar)을 용액에 추가한다.
d.가열하여 완전히 녹인 후 121°C에서 15분 간 고압증기멸균(autoclave)한
다.
e. 멸균된 페트리 접시에 붓고 굳힌다. 8
-균주 ; Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casein
-시료 ; 김치, 우유, 야쿠르트 윌
5. 실험방법(평판 계수법)
1) 시료의 희석(10배수법)
① 7개의 EP tube에 각각 희석배수를 ⓐ부터 ⓖ까지 적는다.
② 7개의 EP tube에 0.85% NaCl 용액을 각각 900㎕씩 넣는다.
③ ⓐ 시험관에 시료를 마이크로피펫을 통해 100㎕을 넣는다.(* 사용한
피펫 팁은 버린다.)
④ ⓑ 시험관에 ⓐ 시험관의 희석액을 마이크로피펫을 통해 100㎕ 주
입하고 잘 섞는다.(* 사용한 피펫 팁은 버린다.)
7
Merck Millipore. (n.d.). MRS broth preparation instructions. Retrieved from
https://www.merckmillipore.com
8
Hayek, S. A., Gyawali, R., Aljaloud, S. O., Krastanov, A., & Ibrahim, S. A. (2019).Cultivation media
for lactic acid bacteria used in dairy products.Journal of Dairy Research, 86, 490–502.
⑤ ④의 방법을 반복해 10-7까지 희석한다.(* 사용한 피펫 팁은 버린다.)
2) 희석액의 접종[각 희석배수 마다 2개씩(1, 2차)]
① MRS broth/agar가 부어져 있는 petri dish 뒷면에 희석비율을 기록
한다.
② MRS 배지가 있는 petri dish위에 10-4배 희석균액을 마이크로피펫을
통해 50㎕ 주입한다.
③ spreader(알코올용액에 담긴)를 화염멸균하고 식힌 다음 ②의 균액
을 petri dish 위에 골고루 분산시킨다.
④ 10-5배, 10-6배, 10-7배 희석 균주액도 같은 방법으로 plating한다.
⑤ 배양기에서 30℃에서 48시간 배양한다.
3) 집락수의 측정 & 계수
배양 후 생성된 집락수를 세어보고 평판 1개당 30 ~ 1,000개의 집락을 형
성한 평판배지 만(예, 10-6일 때 41, 10-5일 때 275)을 골라 colony수를 계
측한다.(유효숫자는 2자리가 편리함)
예) 10-6을 계측하면 ; 41 × 20(희석배수) × 106 = 8.1 × 108 CFU/mL
10-5을 계측하면 : 275 × 20(희석배수) × 105 ≒ 4.8 × 108 CFU/mL
6. 참고사항
-실험에서 세균을 배양할 때 결로 현상을 방지하기 위해 페트리접시는 뚜껑
을 아래로 하여 뒤집어 배양한다.
-계수결과를 CFU로 환산할 때 희석배수를 정확히 적용한다.
7. 참고문헌
Henrici, A. T. (1932). Studies of Freshwater Bacteria: A Direct Microscopic Technique.University of
Minnesota.
Bajwa A, Tan ST, Mehta R, Bahreyni B. Rapid detection of viable microorganisms based on a plate
count
technique
using
arrayed
microelectrodes.
Sensors
(Basel).2013;13(7):8188-8198.
doi:10.3390/s130708188.
Papen, H., & von Berg, R. (1998). A Most Probable Number method (MPN) for the estimation of cell
numbers of heterotrophic nitrifying bacteria in soil. Plant and Soil, 199, 123–130. Kluwer Academic
Publishers.
HiMedia Laboratories. (n.d.). Lactobacillus MRS Agar (MRS Agar) - Technical Data. Retrieved from
https://www.himedialabs.com/media/TD/M641.pdf
Tharmaraj, N., & Shah, N. P. (2003). Selective and differential enumerations of Lactobacillus
delbrueckiissp. bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei,
and Bifidobacteriumspp. in yogurt. Journal of Dairy Science, 86(7), 2288–2296.
Tharmaraj, N., & Shah, N. P. (2003). Selective and differential enumerations of Lactobacillus
delbrueckiissp. bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei,
and Bifidobacteriumspp. in yogurt. Journal of Dairy Science, 86(7), 2288–2296.
Merck
Millipore.
(n.d.).
MRS
broth
preparation
instructions.
Retrieved
from
https://www.merckmillipore.com
Hayek, S. A., Gyawali, R., Aljaloud, S. O., Krastanov, A., & Ibrahim, S. A. (2019).Cultivation media for
lactic acid bacteria used in dairy products.Journal of Dairy Research, 86, 490–502.