Grundlagen
Zellen
Größe
Innenleben
ca. 1µm
Nukleotide & DNA —> Einfache Struktur
Einfache Eukaryotische Zelle ca. 6µm
Mehr Elemente (Zellkern) —> Strukturiert
Bakterie
Menschliche Zelle
20 - 40µm
Noch mehr Elemente —> Strukturiert
Zentrale Dogma
Genom
Eukaryotisches Genom:
- Ein oder Mehrere Chromosomensätze
- Lineare Chromosomen
- Kern DNA, Mitochondrien DNA, Chloroplasten DNA
- Mehrere ORIs
- Centromere und Telomere
Prokaryotisches Genom
- Ein zirkuläres Chromosom
- Zirkuläre, extrachromosomale Plasmide
- Operons: funktionell verwandte Gene hintereinander geschalten
- Ein ORI
Vergleich:
Gene
Introns
Intergenische Sequenz
Bakterien
Relativ kurz
Keine
Kurz
Niedere Eukaryoten
Relativ kurz
Wenig kurze
Kurz
Höhere Eukaryoten
Relativ lang
Viele lange
Lang
DNA-Replikation
DNA-Struktur
Nukleotidbasen:
Purine (Bizyklisch)
Adenin (A)
Pyrimidine (monozyklisch)
Thymin (T)
in DNA
Guanin (G)
Basenpaarung
Uracil (U)
in RNA
2 Fach
über Wassersto brückenbindungen
Cytosin (C)
3 Fach
über Wassersto brückenbindungen
Allgemein:
- Thymin — Adenin und Cytosin — Guanin
- CG Gehalt bestimmt die Schmelztemperatur und die Stabilität
- Starke Variation im Mengenverhältnis zwischen TA und CG —> Chara ’sche Regel
DNA-Doppelhelix:
- Doppelstrang aus 2 Antiparallel zueinander laufende Einzelstränge
- Windet sich in Helix —> große / kleine Furche (Verschiebung Rückgrat nach unten)
- Rückgrat = Kovalente Bindungen (stark) zwischen Zucker & Phosphat
- Strangpaarung = Wassersto br cken und van-der-Waals-Kr fte (schwach)
DNA-Polymerase
DNA-Synthese durch DNA-Polymerisation:
- Vom 5’ zum 3’ Ende laufend —> Energie kommt vom eingebauten Nukleotid
- Polymerase-DNA-Komplex durch β-Clamp stabilisiet
- DNA-Polymerase lll bindet Nukleotid am 3’Ende —> Abspaltung 2 Phosphat
DNA-Replikation
SSB-Proteine halten
Stränge geö net & getrennt
DNA-Pol lll synthetisiert
DNA am „leading Strang“
Komplex durch β-Clamp
stabilisiert
To p o i s o m e r a s e
ö net DNA-Stränge
Helikase entwindet
DNA
Kontinuierliche Synt.
= Leading Strang
Primase synthetis.
RNA-Primer, sonst
kann DNA-Pol nicht
starten
DNA-Pol lll
Diskontinuierliche Synthese = Lagging Strang
DNa-Pol l hydrolysiert RNA-Primer, ersetzt ihn durch DNA
und Ligase schließt Lücken zwischen Okazaki-Fragmenten
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Replikationsursprung:
Prokaryoten:
- Eine Ori Region —> beginn Initiation
- Während Elongation geht DNA-Synthese bidirektional voran
Eukaryoten:
- Mehre Ori Regionen —> beginn Initiation
- Während Elongation tre en 2 „Gabeln“ aufeinander —> verbinden sich
- Schwerer Chromatiden aber weiterhin am Centromer verbunden
Besonderheiten Eukaryoten
Problem:
- In Säugerkörperzellen gehen 1.000 bis 10.000 bp pro Replikaitonsrunde verloren
- In Keim- und Stammzellen müssen Chromosomenenden erhalten bleiben
Lösung:
- Lineare Eukaryotische Chromosomen haben an jedem ende ein Telomer
- Telomere = komplex aus telomerischer DNA-Sequenz und den gebundenen Proteinen
- Telomerstruktur schütz das Ende von Chromosomen
Telomerase:
- Besitzt relevante Transcripase-Enzymaktivität (Transkription von RNA nach DNA)
- Enthält ein RNA-Template zur Verlängerung des 3’-Endes
- Die RNA ist komplementär zur Telomer-DNA-Sequenz
Aufbau:
- Telomerische Sequenz besteht aus Hexanukleotid- / Heptanukleotid-Wiederholungen
- Ende ca. 12-16 16 Nukleotide langer Einzelstrang (durch Entfernung RNA-Primer)
ff
DNA-Schäden & DNA-Reparatur
Schäden vs. Mutation
Schäden
Mutation
Änderung der DNA-Struktur
Erbliche Änderung der DNA-Sequenz
Spontan oder Induziert
Entsteht aus nicht / falsch reparierten DNA-Schäden
Kann erkannt & Repariert werden Kann nicht erkannt & nicht Repariert werden
Replikationsfehler und deren Reparatur
= Basensubstitution durch Fehlpaarung aufgrund einer Wobble-Paarung (C-A, T-G, G-A)
Proofreading:
- Scann der DNA, während Replikation, nach falschen Nukleotiden
- Enzym des Proteinkomplexes (Exonuklease) schneidet falschen Nukleotid heraus
- Pol lll fügt richtiges Nukleotid ein und setzt Replikation fort
Mismatch-Reparatur:
- MutS scannt DNA nach einem Mismatch und bindet dieses
- Rekrutiert MutH & MutL, die einen “nick“ erzeuget
- Falsche Base kann so einfach von Exonuklease herausgeschnitten werden
- DNA-Pol lll fügt Lücke mit richtigem Nukleotid
DNA-Schäden:
Depurinierung: — Häufigster spontaner DNA-Schaden
- w rmelabile N-glykosidische Bindung zwischen Purinbase und Zucker bricht
- Guanin bricht ab und es entsteht eine apurinische Stelle - AP-Stelle
- Spontan: N-gykonische Bindungen Wärmeinstabiel (besonders Guanin betro en)
- Induziert: durch z.B. A atoxin das sich an Blase bindet
Desanimierung:
- C —> U kann erkannt werden, da U in DNA nicht vorkommt
- 5-Mecyl-C —> T schwer erkennbar und führt häu g zu Mutationen
Oxidative Schäden:
- Superoxidradikale oder H2O2, die bei vielen Reaktionen als Nebenprodukt anfallen,
k nnen Basen besch digen!oxidative Basenmodi kationen
- z.B: 8-Oxo-Desoxyguanidin (h u gster Oxidativer DNA-Schaden)
Methylierung:
- durch S-Adenosylmethionin (SAM)
Strahleninduzierte Schäden:
- Durch Ionisierende Strahlung / Radioaktivität
- Folgen: Doppelstrang-, Chromosomenbrüche, Deletionen (fehlen einer Nukleotidsequenz)
Pyrimidindimere:
- Durch UV-Strahlung
- Folgen: Cyclobutanring, 6-4 Photoprodukt —> Stoppt Replikation
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Reparaturmechanismen:
Fehlerfreie Reparatur:
Direkte Reperatur: (DR)
- Direkte Erkennung und Reparatur von Basenmodi kationen
- z.B. methyliertes Guanin
Basenexzisionsreparatur: (BER)
- DNA-Glykosilase entdeckt modi zierte Base und spaltet N-glykosidische Bindung
- AP-Exonuklease erzeugt „nick“, DNA-Pol l füllt & Ligase verschließt Lücke
- z.B. Uracil oder 8-Oxo-Desoxyguanidin
Nukleotidexzisions-Reparatur: (NER)
- Erkennt defekte DNA-Struktur, anschließend Entfetnung Nukleotiden & Neusynthese
> Aktiviert durch Deformation der Doppelhelix
> Endonuklease erzeugt zwei Einzelstrangbrüche („nicks“)
> Helikase entwindet dsDNA, Pol I synthetisiert neuen Strang und ligase schließt Lücke
Postreplikative Rekombinations-Reparatur: (PRR)
= homologe Rekombination
Fehlerhafte Reparatur:
Nonhomologous end joining: (NHEJ)
- Repariert Doppelstrangbürcke
- Rekombination zwei auseinander gebrochenen Stränge —> Risiko von Verlusten
Transl sionssynthese: (TLS)
- Transl sionspolymerasen syntetisieren über geschädigte Basen „bulky lesions" hinweg
- Häu ges einsetzen von Adenin —> entstehen von Mutigeren möglich
- Hohe Fehlerquote
Zusammenfassung:
Schaden
Reperatur
DR
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Induziert Spontan
BER NER PRR TLS NHEJ
Depurinierung
JA
JA
Oxidative Schäden
JA
JA
Desanimierung
JA
JA
Methylierung
JA
JA
Einzelstrangburch
JA
JA
Doppelstrangbruch
JA
Pyrimidindimere
JA
Bulky lesions
JA
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Genmutationen
Beispiele:
- Phenylketonurie
- Anormales H moglobin
Somatische vs. Keimbahnmutation:
Somatische Mutationen
Mutation in Soma —> erblich für teilende Zellen —> keine Weiterabe nächste Generation
Keimbahn Mutation:
Mutation in Keimbahn —> Weitergabe an nächste Generation —> Mutation in allen Zellen
Mutationen:
Genom-Mutation:
- Durch Defekte im Spindelapperat
- Polyploidie (Vervielfachung von Chromosomensatz)
- Aneuploidie ( nderung Anzahl von Choromosomen)
Chromosomen-Mutation:
- Durch DNA-Brüche und bei Fehlern in der Replikation
- Konsequenzen: Deletionen & Insertionen (Indels), Inversion, Translokationen
Punktmutationen
- Transition — Zwischen Purinen oder Pyrimidinen
- Transversion — Zwischen Purin & Pyrimidin oder Pyrimidin & Purin
- = Stille, Missens, Nonsens & Frameshift Mutation
Begrifflichkeit:
- Deletion — Nukleotidsequenz / ein Teil bis hin zum gesamten Chromosom fehlt
- Insertion — Einbau von Zusätzlichen Nukleotiden / DNA-Sequenzen
- Inversion — Chromosomaler Abschnitt ist dabei um 180° gedreht
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Transkription
Typen der RNA in Eukaryoten:
Funktion
RNA-Pol
mRNA Massanger RNA:
Dient als Informationsträger (Kopie von DNA), der aus Zellkern
transportiert wird. —> Zwischenstufe bei Herstellung von Protein
RNA-Pol ll
tRNA
Transfer RNA:
RNA-Pol lll
Hilfsmolek l bei Proteinbiosynthese, dass eine Aminosäure
aufnimmt & transport zum Ribosom
rRNA
Ribosomal RNA:
Die rRNA beein usst Struktur & Funktion der Ribosomen
RNA-Pol l
Transkriptions Ablauf:
Allgemein:
- Initiation (RNA-Polymerase bindet an Promotor & beginnt mit Entspiralisierung der DNA)
- Elongation (RNA-Pol. bewegt sich 3’—> 5’ DNA-Matrizenstrang entlang & erzeugt RNA-Transkript)
- Termination (RNA-Polymerase erreicht Terminationsstelle —> RNA-Transkript verlässt Matrize)
Initiation:
Echericha Coli
Mensch
- Sigmafaktor (σ) erkennt & bindet im o enen Komplex - Komplizierter
- Allgemeine & spezi sche
mit RNA-Polymerase an Promotor der DNA
- Promotorsequenz: -35, -10 Sequenz & +1
Terminationsfaktoren Nötig
(Transkripitionsstartpunkt)
- Vor Elongation, verlässt Sigmafaktor RNA-Polymerase
Elongation:
Echericha Coli
Mensch
- Etwa 17 Basenpaare in Transkriptionsblase entwunden - Transkription Exons & Introns
- Etwa 8 Basenpaar lange RNA-DNA-Helix
- Introns entfernt, Exons zusam-
- Hohe Prozessivität
- Stoppt nach Fehleinbau —> Proofreading
mengespleißt (RNA-Speißeln)
- 5’Ende — 5’-Cap-Gruppe
- 3’Ende — Poly(A)-Schwanz
Termination:
Echericha Coli
Mensch
ρ (rho)-unabh ngige Termination:
- Haarnadelstruktur (7-9 Uridine) —> Polymerasestopp
- U-reiche Region destabilisiert DNA-RNA-Hybrid —> Zerfällt
- Torpedo Modell
- Allosterisches Modell
ρ (rho)-abh ngige Termination:
- Roh bindet an rut-Seqeunz auf mRNA
- Roh bewegt sich nach 3’-Richtung
- Roh trennt RNA-DNA-Hybrid
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RNA-Prozzesierung & der Genetische Code
Modi kation der mRNA:
Kotranskriptionale Modifikationen in Eukaryoten:
- Exons & Introns codierender DNA werden transkribiert —> Prä-mRNA
- Spleißen —> Introns entfernt Exons zusammengespeißelt werden (snRNA beteiligt)
- Alternatives Spleißen —> durch Spleißen entstehen verschiedne mRNAs
Polyadenylierung:
- Polyadenylierungssignal (AAUAAA) erkannt, Endonuklease schneidet Strang nach 20n.
- PolyA-Polymerase fügt 80-200 Adeninnukleotide am 3’-Ende an = PolyA Schwanz
- Höhere mRNA Stabilität und Translationse zienz
- Kleine nucleäre Ribonucleoproteinpartikel → snRNPs binden an 5‘ und 3‘ Spleißstelle
- Durch die Bindung der snRNPs werden weitere Proteine rekrutiert —> Spleißosom
Capping:
- Am 5’-Ende
- Höhere mRNA Stabilität und Translationse zienz
- 7-Methylguanosin 5’-5'-triphosphat
- Wichtig bei Initiation der Translation
-
Die carboxyterminale Dom ne (CTD) der RNA-Pol ll:
- Alle Vorgänge geschehen auf einmal
- Repetitive Heptamersequenz ist bis zu 7 mal l nger als RNA-Pol II
- Bindet Faktoren f r Capping, Splicing und Polyadenylierung —> Cotranscirptopnal
Dechi rierung des Codes:
1966 — Der kanonische genetische Code:
- Unterschiedliche Codons für Aminosäuren (20 Aminosäuren Aber 64 Codons —> Degeneriert)
- Die ersten beiden Positionen determinieren die Codonspezi tät stärker als letzte
Spezielle Codons:
- Startcodon — AUG (Met - Eukaryoten & fMet - Prokaryoten)
- Stoppcodons — UAG; UAA; UGA
Offener Leseramen:
- In einer Zufallssequenz erscheint etwa alle 20 (3/64) Trippelst ein Stoppcodon
- 50 und mehr Codons ohne Stopp bezeichnet man als o enen Leserahmen
- Die Nukleotide eines Gens, die Codons bilden, die Aminosäuren spezi zieren
tRNAs
- Unbeladene tRNA — tRNAAla & Beladene tRNA mit Aminoacyl-tRNAs — z.B. Alanin …
- 10-15% zellulärer RNA ist tRNA
- Aminosäuren werden an 3’-Ende angehängt
- Jede Aminosäure hat eine spezi sche Aminoacyl-tRNA- Synthetase
—> richtige Einau der AS durch Bindungsspezi tät Aminoacyl-tRNA-Synthetase
„Wooble - Base“:
- Ein Codon erkannt (C — G, A — U)
- Zwei Codons erkennt (U — G & A, G — C & U)
- Drei Codons erkennt (Inosin — A, U & C)
Cricks „Wobble“-Hypothese:
- Ersten beiden Basen im Codon bilden (starke) Paarungen & tragen zur Spezi t t bei
- Die erste Base im ANTI-Codon bestimmt wie viele Codons erkannt werden
- Mind. 32 tRNAs werden zur Translation aller 61 Codons ben tigt (31 AS + 1 Initiation)
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Ribosom:
- Für Bindung der tRNAs gibt es drei stellen (E, P & A)
Prokaryoten:
- Größere Einheit = 50s (5s + 23s rRNA)
- Kleinere Einheit = 30s (16s rRNA)
70s gesamt
Eukaryoten:
- Größere Einheit = 60s (5.8s + 5s + 28s rRNA)
- Kleinere Einheit = 40s (18s rRNA)
80s gesamt
Translation
Allgemein:
Positionen im Ribosom:
- A = Aminoacyl „Dekodierzentrum“
- P = Peptidyl
- E = Exit
Wechselwirkung mit mRNACodon und tRNA-Anticodon
Initiation:
Prokaryoten
- 16s RNA bindet an Shine-Dalgarno-Sequenz
- tRNA bindet erstes AUG
- 30s Untereinheit bindet an Initationsfaktor
- 50s UE bindet an 30s —> 70s Initiationskomplex
Eukaryoten
- „Scannen“ erstes AUG
nach 5’-Cap
- 60s bindet an 40s UE
—> 80s Initiationskomplex
Shine-Dalgarno-Sequenz
(Erkannt von 16s rRNA —> Basenpaarung —> nach ca. 10
Nuckleotiede kommt Startcodon)
Startcodon = AUG
Erste Aminosäure
fMET
Erste Aminosäure
MET
Initiationsfaktoren
IF 1, 2, 3 —> binden an 30s Untereinheit
Initiationsfaktoren
eIF3, eIF4A - eIF4G
Elongation:
Prokaryoten
- EF-Tu liefert neue tRNA — Energie durch GTP-Spaltung
- EF-Ts berät EF-Tu wieder mit GTP
- Bildung einer Peptidbindung zwischen den AS
- Katalysiert durch die Peptidyltransferase
- EF-G bewegt mRNA & daran gebundene tRNA um Codon
Eukaryoten
Ähnlich Prokaryoten
—> GTP-Verbrauch
Elongationsfaktoren
EF-TU, EF-G & EF-Ts
Elongationsfaktoren
eEF1a, eEF1y & eEF-2
Termination:
Prokaryoten
- Release Factor bindet an Stoppcodon in A-Stelle
(RF-1 = UAG, UAA — RF-2 = UGA, UAA — RF-3)
- Hydrolytische Abspaltung der Peptitkette aus P-Stelle
- "Ribosomal Recycling Factor" (RRF) katalysiert Zerfall in
zwei Untereinheiten und Freisetzung der tRNAs
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Eukaryoten
Ein Release Factor (eRF)
f r drei Stoppcodons
Posttranslationale Modi kationen:
Funktion
Acetylierung
Histonmodi kationen —> Marker an Histonschwänzen
Methylierung
Histonmodi kationen —> Marker an Histonschwänzen
Phosphorlierung
- Aktivit tssteuerung von Enzymen
- Durch Proteinkinasen
Ubiquitinilierung
- Festigung Ubiquitin an Protein welches abgebaut werden sol
- Protein wird nun von Proteasom erkann
- Proteasom löst Ubiquitin und hydrolysiert Protein
Weitere Begriffe:
Heterochromatin: dicht gepackt, Transkription unaktiv
Echromatin: locker gepackt, Transkription zugänglich
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Regulation der Genexpression
Grundlagen:
Regulation der Genexpression:
- Regulation v. Sto wechselwegen:
> Allosterische Regulation — Regulation der Enzymaktivit t
> Regulation der Transkription — Regulation der Enzymkonzentration = Zentrale Rolle
- Dynamische Anpassung an wechselnde Nährsto e & Umweltbedingungen
- Zelldi erenzierung in Wirtszellen
- Ökonomieprinzip (Proteinsynthese teurer/schnell; Transkription günstig/langsam)
—> Regulation der Transkription nimmt zentrale Rolle ein
Prinzipien der Transkriptionsregulation:
„Trans“-Komponente bindet immer an „Cis“-Komponente
„Trans“-Komponente = in der Regel Proteine
- Repressor —> Durch Bindung wird Transkription blockiert
- Aktivator —> Durch Bindung wird Transkription stimuliert
„Cis“-Komponente = DNA
- Operator / Repressor-Bindestelle
- Aktivator-Bindestelle / Enhancer / Upstream Activating Sequence (UAS)
Transkriptionskontrolle in Bakterien:
- Aktivator bindet an Aktivator-Bindestelle —> Transkription
- Repressor an Operatorsequenz —> keine Transkription
Proteine:
- Regulatorproteine: Schalten die Transkription spezi scher Gene an- & aus
- Sensorproteine: für spezi sche Umweltbedingungen, Nährsto e, …
- Manchmal sind beide Funktionen in einem Protein vereint (z.B. Allosterische E ektoren)
Allosterische E ektoren:
- Induktor (fördert Transkription durch Repressor-Hemmung / Aktivator-Aktivierung)
- Corepressor (hemmen Transkription durch Repressor-Aktivierung)
Escherichia coli:
Bakterielles Operon:
- Promotor: De nition Transkriptionsstartpunkt & Bindung σ-RNA-Polymerase-Komplex
- Regulatorische Sequenz: Aktivatorbindestelle & Repressorbindestelle
- Transkriptionseinheit: Oft polycistronisch — mehrere Gene auf einem Transkript
Regulation des trp-Operons:
trp-Repressor bindet in Gegenwart von Tryptophan (trp) an Operon und hemmt
Transkription. Ohne trp keine Bindung —> Aktivierung
lac-Operon:
- Kodiert f r 3 Gene:
> lacZ — β-Galaktosidasee
> lacY — Lactose-Permease
> lacA — Thiogalactosidtransacetylase
- Abwesenheit von Laktose & Anwesenheit von Glucose
—> lacI Repressor bindet an Operator (Unterdr ckung der Transkription)
- Eintritt von Laktose in Zelle —> Umwandlung in Allolactose
—> Bindet Repressor —> Inaktivierung von diesem —> Expression der lac-Gene
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- Positive Kontrolle
Wenig Glucose —> cAMP / CRP Komplex bindet an Promotor —> Bildung
Polymerase —> Transkription des lac-Operons
> Viel Glucose —> niedriges cAMP Level —> Kein Bindung an Promotor durch cAMP
—> Verringerung der Transkription des lac-Operons
Übersicht:
>
SOS-Antwort
- Genomweite Zellreaktion auf schwere DNA-Sch den
- SOS-Regulon: 15 regulatorisch verkn pfte Operons
- Kontrolle durch LexA-Repressor
Abfolge:
- Kontrolle
- Einzelstr ngige DNA—> Bindung RecA; RecA wird zur Protease (Aktivierung)
- RecA spaltet LexA
- Entfernung d. Repressor auf gesamten Genom
- Transkiption verschiedener DNA- Reparaturgene
Mensch:
Regulation auf verschiedenen Ebenen möglich:
- Chromatin-Remodeling: Euchromatin / Heterochromatin
- Transkriptionskontrolle:
> Kontrolle durch Initiation (Komplex, TATA Box, allgemeine- & spezi sche Transkripitonsfaktoren)
> DNA-Bindedomänen (Homeodom ne, Zink nger-Dom ne, Leucin-Zipper, Helix-Loop-Helix)
- Kontraskriptionale Modi kation
- Translationskontrolle: Regulation der RNAs
- Posttranslationale Modi kationen
- Stabilit t d. Proteine
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Genom & DNA-Verpackung
Genome
Genome und ihre Größen:
- Menschliches Genom hat haploiden Chromosomensatz
> im Menschen liegt diese Information “zweifach” vor
> diploider Chromosomensatz (2 x 22 Autosomen & 2 x 1 Gonosom)
- Die Größenordnung der Genome in “Basenpaaren “ (von Virus bis Mensch)
> 1 nt - 1 bp - 1 kbp - 1 Mbp - 1 Gbp
- Eukaryoten haben alle ähnlich viele Gene
- Große Varianz in den Genomgrößen vielzelliger Organismen
- Genomgrößen: E. coli 4,6 Mbp - Mycoplasma genitalium 580 kbp
Gene:
- Eukaryoten haben alle ähnlich viele Gene
- Anzahl von protein-codierenden Genen:
E. coli ~4300 (Prokaryot!) <—> Wirbeltiere ~20.000 | P anzen ~30.000
- Kompakte Gene bei Prokaryoten = 1 Gen / 1000 bp
- Gen-Anzahl variiert also wenig in vielzelligen Organismen
- Genomgrößen variieren dagegen → viele Introns und intergenische Bereiche
- 1 % des menschlichen Genom kodiert für Proteine
Transposons
Definition:
- Was sind Transposons oder sogenannte “springende Gene”?
> codierende DNA-Sequenzen, die innerhalb der DNA ihren Standort wechseln können
> kann man sich am Besten als generische “Viren” vorstellen
- Wo ndet man solche Transposons
> in allen Organismen (Prokaryoten & Eukaryoten)
> auf der DNA
Arten:
Es gibt 2 Arten der Vermehrung von Transposons:
- Retrotransposons (“RNA-Transposons”)
> Copy & Paste Mechanismus —> RNA-Intermediat —> Reverse Transkriptase
> machen ~42% des menschlichen Genoms aus
- DNA-Transposons
> Cut & Paste Mechanismus —> DNA-Intermediat
> machen ~3% des menschlichen Genoms aus
Anteile im menschlichen Genom:
- ~45 % des menschlichen Genoms besteht aus Transposons
- LINE-1 hat mit 17% den größten Anteil (Autonomes Retrotransposon)
- Alu-Repeats (> 10% - Nicht-autonomes Retrotransposon)
- Alle 20 Generationen gibt es 1 neue Alu oder LINE-1-Insertion
- alle anderen Transposons sind komplett inaktiv
- Große Genome wie Arabidopsis thaliana sind groß, weil sie viele Transposons haben
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DNA-Verpackung — Nukleosomen
Genome und ihre Größen:
- Nukleosom ist die Einheit des Histonkomplexes mit der darum spiralig 2x gewundenen
DNA-Kette
- Verpackungsproblem: 2 m DNA in diploider Zelle
- Eukaryotische DNA durch Nukleosomen verpackt:
> Nukleosom-Kern besteht aus Histonen (2x 4 verschiedene) & DNA wickelt sich 2x
> Posttranslationale Modi zierung an den N-termini der Histone reguliert den
Verpackungsgrad der Nukleosome (zB. Acetylierung, Methylierung)
> Verpackungsgrad während Mitose/Meiose stark (Chromosomen kondensiert & sichtbar)
Verpackung bestimmt die Genregulation:
- Euchromatin: Locker gepackt, zugänglich für Transkription
- Heterochromatin: dicht gepackt und transkriptionell inaktiv
- Der Verpackungsgrad bestimmt die Genregulation (=Epigenetik)
- Epigenetik = erblich genetische Modi kation ohne Änderung der DNA-Sequenz
- X-Inaktivierung:
> Beispiel für das Abschalten eines ganzen Chromosoms (Gendosis soll ausgeglichen sein)
> Während frühen Embryonalentwicklung wird in jeder Zelle ein X-Chromosom
zu
Heterochromatin und so dauerhaft inaktiviert
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Vererbung
Mendel
Mendel in seiner Zeit:
- Gregor Mendel, *1822, 1884, in einfachen Verhältnissen geboren
- wurde später Mönch, um sich seinen Studien widmen zu können
- Charles Darwin & Lehre der “blending inheritance” (=irreversible Vermischung der Erbanlagen)
- Konstanz (Mendel) <—> Variabilität (Darwin)
- Nutzte Erbsen als experiment System mit reinbringen Linien & kontrollierter Kreuzung
- Wahrnehmung & Wiederentdeckung von Mendel Anfang 1900 & Benennung Gesetze
Vererbung mit dem Wissen von heute:
- Wichtige Begri e:
> homozygot (gleiche Allee) und heterozygot (verschiedene Allee)
> Lokus — Allele eines Gens oder eines Genorts (DNA Lokus)
> dominant und rezessiv (nur in diploiden Lebewesen relevant)
- Die drei Mendelschen Regeln:
1. Uniformitätsregel - 2. Spaltungsregel - 3. Unabhängigkeitsregel
(Nur wenn die Gene für die zwei Eigenschaften auf verschiedenen Chromosomen liegen)
Erbgänge
Mendelschen Erbgänge:
- = monogenetischer Erbgang (=Krankheiten, die durch Mutation in einem Gen ausgelöst werden)
—> die Allele, die Phänotyp bestimmen, liegen alle an einem Lokus/Gen
- Unterscheidung dominant — rezessiv und autosomal — gonosomal ist anhand von
Familienstammbäumen möglich
Beispiele:
- Phenylketonurie (autosomal rezessiv)
- Mukoviszidose (autosomal rezessiv)
- Chorea Huntington (autosomal dominant)
- Rot‐Gr n Blindheit (X‐chromosomal rezessiv)
Erbgänge Analysieren:
- autosomal: Krankheit betri t Geschlechter gleichermaßen / Verteilung ist ausgewogen
- gonosomal: Falls die Krankheit hauptsächlich Männer oder Frauen betri t
- dominant: betro ene Person mind. 1 kranken Elternteil - jeder Generation eine krank
- rezessiv: betro ene Person (homozygot) muss keinen kranken Elternteil haben
Beyond Mendel — Quantitative Phänotypen
Abweichung von idealisierten Mendelschen Erbg ngen:
- Mendelschen Erbgänge = Idealisierung, Wahrheit liegt zwischen “Schwarz” & “Weiß”
- unvollständig dominant/intermediär: weiß+rot = rosa
- Ko-Dominant: 2 Allele eines Gens wirken sich gleich stark auf den Phänotyp aus
- Pleiotropie: Gen/Allel beein usst mehrere Phänotypen (schrumpelig & süße Erbse oder PKU)
- Epistase: Interaktion Allelen / Gene , E ekt Allel an Lokus 1 abhängig von Allel Lokus 2
—> Ein Gen beein usst die Ausprägung eines anderen Gens
Quantitativer Phänotyp
- Summe der E ekte von Allelen an mehreren Loci/Genen führt zu kontinuierlichen
Verteilung eines Phänotyps (auch ohne Ein uss von Umwelt oder anderen komplexen Vorgängen)
- Ausprägung Merkmale variiert stark, —> keine Einteilung in klar abgrenzbare Klassen
- die verschiedenen Ausprägungen können gemessen werden
- z. B. Körpergröße, Gewicht, etc.
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Komplexer Phänotyp
- Viele Phänotypen sind komplex —> quantitative Phänotypen mit vielen Allelen (polygen),
Umweltein üssen, Umwelt-Gen-Interaktionen und Gen+Gen Interaktionen (=Epistase)
- Vererbung ist Kontinuum an Ein üssen von Mendelscher bis polygener Vererbung mit
unterschiedliche großem Ein uss nicht-genetischer Faktoren (=Umwelt)
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Genkartierung und Rekombinante DNA
Genkartierung
Meiose mit unabhängigen Loci:
- Wenn die Gene f r zwei Ph notypen auf dem gleichen Chromosom liegen sind sie
gekoppelt und werden nicht unabh ngig vererbt (= Unabh ngigkeitsregel gilt nicht)
Rekombination:
- Rekombination Meiose l, homologe Chromosomen sich überkreuzen (= Crossing over)
—> Häu gkeit Meiose ll: je 2 mal 50-x% — x%
- Genetische Karte:
> H u gkeit Rekombinanten und damit die genetische Distanz wird in Centimorgan
(=%Rekombinanten) gemessen
> Diese Kopplung wurde zuerst von Thomas Morgan in Drosophila festgestellt und war
entscheidend Chromosomen als Tr ger der Gene zu etablieren
> Durch gezieltes Kreuzen verschiedener Mutanten konnte man Genkarten erstellen
Genetische Marker:
- DNA Mutationen k nnen durch Zufall (=genetische Drift) in einer Population h u g werden
—> DNA Polymorphismen
- Mittels PCR & Elektrophorese kann man so Polymorphismen “sichtbar” machen
- Werden als genetischer Fingerabdruck f r Forensik & Vaterschaftsanalyse eingesetzt
- Polymorphismen kann man als genetischen Marker nutzen und kartieren
- So können auch Krankheitsallele katiert werden
- Nachweisbare Allele (z.B. mit PCR), die h u g in der Population vorkommen (=polymorph)
- Es gibt viele polymorphe genetische Marker, die im gesamten menschlichen Genom
verteilt sind
- Die Kombination von Allelen von nur wenigen Markern ist einzigartig f r einen
Menschen und dieser genetische Fingerabdruck wird z.B. f r forensische Analysen
oder Vaterschaftstest verwendet
- Eine genetische Karte dieser Marker erlaubt es Krankheitsallele von Mendelschen
Erbg ngen zu kartieren
Positional Cloning
- Bezeichnet die Klonierung/Identi zierung eines Mendelschen Krankheitsgens bzw.
Allels aufgrund seiner chromosomalen Position, die man durch Genkartierung
eingegrenzt hat
- Kartierung eines Mendelschen Krankheitsallels (=Gene Mapping = Linkage Analyse): je
nachdem wieviele Familien/DNA Proben/Meiosen man zur Verf gung hat l sst sich die
Position des Krankheitsgens auf wenige Centimorgan (entspricht wenige Millionen
Basenpaare) eingrenzen
- Durch Sequenzierung von Genen in dem Bereich lassen sich Mutationen in einem Gen
nden, welche den mendelschen Erbgang plausibel erkl ren k nnen
- Die Hochdursatzsequenzierung (Next Generation Sdequencing) hat diesen Prozess sehr
e ektiv gemacht
- F r ~5500 der ~8000 Mendelschen Krankheiten beim Mensch ist das Krankheitsgen
derzeit bekannt
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Rekombinante DNA
Allgemein:
- Bezeichnen die Typologien, die es erlauben DNA Fragmente zu kombinieren, das heißt
zu schneiden, zusammen zu kleben und zu vermehren (= DNA Klonieren)
- Plasmide werden dabei als „Träger“ (= Vektor) -DNA genutzt
- Restriktionsenzyme erlauben das schneiden von DNA an spezi schen DNA-Sequenzen
- Ligase „klebt“ DNA zusammen
Plasmide:
- Zirkuläre Chromosomen lassen sich isolieren, mit Restriktionsenzymen und Ligase
manipulieren und wieder in E. Coli einbringen (= transformieren)
- Abwesenheit lässt sich durch eine Antibiotikaresistenz auf dem Plasmid nachweisen
- Haben ORIs, die viele Kopien pro Bakterienzelle erlauben und Schnittstellen für mehr
Restriktionsenzyme in „Multiple Cloning site“ für e ziente & exible DNA Klonieren
—> EcoRl ist Enzym, das „GAATTC“ bindet und schneidet
Was kann man Klonen:
- Bruchstücke genetischer DNA
- cDNA
- Fragmente von anderen Plasmodien
- PCR-Produkte
- DNA-Doppelstränge
Herstellung von Komplementärer DNA (cDNA)
Reverse Transkriptase
- Enzym, nimmt geprimte RNA als Template und stellt DNA her (RNA-Abhängige DNA-Pol)
- Bestandteile des Lebenszyklus von Retrovieren, Telomerase ist Reverse Transkriptase
- Zentrales Enzym in Molekularbiologie (Nachweis von RNA Vieren, RNA zu cDNA, dann PCR)
Polymerasekettenreaktion (PCR)
- Durch Hitze werden die Doppelstränge getrennt
- Künstlich hergestellte, einzelsträngige DNA Oligonukleotide (20bp) werden als „Primer“
dazugegeben
- Die Bindung der Primer bestimmt wo die DNA-Pol synthetisiert
—> Primer begrenzen den exponentiell ampli zierten Bereich
DNA Bibliotheken:
- Genetische Bibliothek: DNA aus generischer DNA eines Organismus wird kloniert
- cDNA Bibliothek: in DNA umgeschriebene RNA (komplementäre DNA = cDNA) wird kloniert
- Reverse Transkriptase kann RNA in DNA umschreiben (bei PCR Tests nötig)
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Genomanalyse und Gendiagnostik
Genomsequenzierung
Sanger Sequenzierung:
- 1977 von Fred Sanger erfunden
- Radioaktiv markierte DNA wird in vier Reaktionen synthetisiert
- Zusätzlich ddGTP, ddATP, ddTTP, ddCTP Anwesen —> Kettenabbruch bei G, T, C, A
- Synthetisierte DNA wird der Größe nach auf einen Gel getrennt
—> Kettenbruch durch Einbau von Di-desoxynukleotide
Leroy Hood — Automatische DNA-Sequenzierung:
- Radioaktivität durch Farbsto e ersetzt
- Unterschiedliche Markierungen aller vier Nukleotide
- Alle Nukleotide können in einer Spur sequenziert werden
Menschliches Genomprdjekt:
- 1990‐2003, 3 Milliarden $,
- Entscheidende E zienzsteigerung durch Sanger‐Kapillarsequenzierer (ABI3730)
- Genomsequenz haupts chlich von einem freiwilligen Spender aus Bu alo, NY
Next Generation Sequencing:
- Next Generation Sequencing (NGS) ist andere Technologie als Sanger Sequenzierung
und meint heute haupts chlich die Technologie der Firma Illumina
- E zienzsteigerung von 1600 $/Mio bp (Sanger in 2004) zu 0,008 Cent $/Mio bp (NGS, 2021)
- Einzelmolek lsequenzierung (=3rd Sequencing) neue, Technologie mit langen Lesel ngen
- DNA Sequenzierung als eins der e zientesten Werkzeuge der Biologie und Medizin
Ausblick:
- Routinediagnostik in den nächsten Jahre vor allem gegen Krebs
- Genome aller Arten sequenzieren
- Seqeunzing ist das neue Mikroskop
Gendiagnostik
P=G+U+G*U:
- Phänotypvarianz (P) = genetischen Varianz (G) + Umwelt Varianz (U) + deren Interaktion
- Erblichkeit: genetischer Anteil der gesamten phänotypischen Varianz einer Gruppe
-> Erblichkeit ist relativ, weil sie immer auf die Population & der darin vorkommenden
genetischen und nicht‐genetischen Faktoren bezogen ist
-> Erblichkeit ist nderbar, weil man z.B. Umweltbedingungen so ndern kann, dass
die genetischen E ekte reduziert oder sogar eliminiert werden
Erblichkeit f r komplexe Ph notypen:
- Meisten menschlichen Ph notypen sind komplex und deren Erblichkeit ist hoch (>50%)
- Erblichkeit geht auf viel Allele zurück
- Stichprobengr ßen von einer Millionen Menschen identi zieren hunderte Allele, die alle
kleine E ekte haben & nur Teil der Erblichkeit erkl ren (700 Allele = 27,5% der Erblichkeit)
-> Komplexe Ph notypen werden durch hunderte/tausende von Allelen mit kleinen
E ekten verursacht
-> Vorhersagekraft f r komplexe Ph notypen ist sehr begrenzt
Diagnostik und gegebenenfalls Therapiemöglichkeiten:
- Genomsequenzierung wird Routine, Vorhersagekraft nur f r Allele mit großem E ekt
(Mendelsche Krankheitsallele)
- In den meisten F llen und insbesondere bei der Pr nataldiagnostik
- Kaum Therapiem glichkeiten
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DNA-Replikation
SSB-Proteine halten
Stränge geö net & getrennt
DNA-Pol lll synthetisiert
DNA am „leading Strang“
Komplex durch β-Clamp
stabilisiert
To p o i s o m e r a s e
ö net DNA-Stränge
Helikase entwindet
DNA
Kontinuierliche Synt.
= Leading Strang
Primase synthetis.
RNA-Primer, sonst
kann DNA-Pol nicht
starten
DNA-Pol lll
Diskontinuierliche Synthese = Lagging Strang
DNa-Pol l hydrolysiert RNA-Primer, ersetzt ihn durch DNA
und Ligase schließt Lücken zwischen Okazaki-Fragmenten
Nukleotidbasen:
Purine (Bizyklisch)
Adenin (A)
Guanin (G)
Pyrimidine (monozyklisch)
Thymin (T)
in DNA
Uracil (U)
in RNA
Cytosin (C)
Basenpaarung
2 Fach
über Wassersto brückenbindungen
3 Fach
über Wassersto brückenbindungen
—> Transversion: Purin zu Pyrimidin
—> Translation: Purin zu Purin / Pyrimidin zu Pyrimidin
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Zusammenfassung:
Schaden
Reperatur
DR
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Induziert Spontan
BER NER PRR TLS NHEJ
Depurinierung
JA
JA
Oxidative Schäden
JA
JA
Desanimierung
JA
JA
Methylierung
JA
JA
Einzelstrangburch
JA
JA
Doppelstrangbruch
JA
Pyrimidindimere
JA
Bulky lesions
JA