今日化学 崔晓杰 中央民族大学 生命与环境科学学院 第二章 核糖体化学 Ribosome Brief Introduction to GFP • 含有238个氨基酸残基的蛋白质，分子量26.9kDa • 曝光在蓝光-紫外光范围内时，发出绿色荧光 • 通常GFP指最早在Aequorea victoria水母中发现的avGFP • avGFP主要激发光峰值为395nm，次要激发光峰值为475nm；发射光峰值为509nm——可见 光的下绿色光区域 • avGFP量子产率为0.79 • 腔肠动物海肾(Renilla reniformis)的GFP有一个主要激发波长498nm • 许多动物体系中的excellent tool：具有内生色团，除O2外不需要外在的cofactors，基因表达 产物或是酶/底物。 • 在细胞和分子生物学中，GFP基因被大量地用来做表达报告基因。 Brief Introduction to GFP 2008 Nobel Price in Chemistry History In Nature Structure Other Fluorescent Proteins Application 1. History-wtGFP ➢ 1960s-1970s, Osamu Shimomura首次在A. victoria中纯化分离出了GFP和发光蛋白水母素(aequorin)，并研究了 其性质。Aequorin与Ca2+相结合时发蓝光，释放的能量部分转移给GFP，使得颜色偏移至绿色。 ➢ 1992年，Douglas Prasher 克隆并得到了wtGFP基因的核酸序列。 ➢ 1994年，Martin Chalfie组利用wtGFP的编码序列，在E. coli和C. elegans中成功表达出了GFP蛋白，结果发表在 Science杂志上。 ➢ 两个月后，Frederick Tsuji组表达出了重组GFP蛋白，使得GFP分子在不需要水母相关的外源辅助因子作用下就 能折叠并在室温下发出荧光。但这种重组分子有两个激发谱、对pH敏感、对氯化物敏感、量子产率低、光稳 定性差且在37 °C时折叠较弱。 ➢ 1996年，Remington组报道了S65T突变的GFP蛋白晶体结构，发表在Science上。 ➢ 一个月后， Phillips组报道了wtGFP蛋白晶体结构，发表在Nature Biotechnology上。 1. History-GFP derivatives 由于researchers广阔的应用需求，多种GFP突变体被开发出来。 ➢ 1995年， Roger Tsien组首先报道了S65T 突变的GFP，发表在Nature上。 S65T 突变GFP极大提高了GFP的谱学 性质、光稳定性，并且将激发波长迁移至488nm，而发射波长维持在509nm，这种光谱性质与通常可用的 FIFTC信号处理技术相匹配，从而极大提高了GFP的实用性。 ➢ 1995年，Thastrup和Falkow组开发出了F64L点突变的EGFP (enhanced GFP)，EGFP在 37 °C下的折叠效率大大提 高， 从而使得GFP可以被应用到哺乳细胞中。 ➢ 2006年，对GFP进行了一系列突变的sfGFP (Superfolder GFP)被报道，这种GFP即使被整合到折叠很差的多肽中 时，也可以快速折叠并且成熟。 1. GFP derivatives ➢ 多种多样的其他突变体也相继被开发出来， ➢ Blue fluorescent protein (EBFP, EBFP, EBFP2, Azurite, mKalama1) Y66H突变，在近紫外区380nm处有广谱吸收， 最大发射波长488nm. 还有一种突变体BFPms1能够优先结合Zn(II)和Cu(II). 它包含以下几个重要突变：生色团 Y66H、Y145F（提高量子产率），H148G （产生beta-barrel空腔），还有一些其他突变增大水溶性。.Zn(II)能 够增强荧光强度，而Cu(II) 会使荧光淬灭并把最大吸收峰迁移至379 到444 nm，因而BFPms1可以用来做Zn生 物传感器。 ➢ Cyan fluorescent protein (ECFP, Cerulean, CyPet, mTurquoise2) ➢ Yellow fluorescent protein derivatives (YFP, Citrine, Venus, YPet) , 1. History-GFP derivatives ➢ 生色团结合。靛青色突变体的关键突变为Y66W，由此导致生色团中的苯酚基团变为吲哚基团。另外，由于吲 哚基团体积的增大，包裹生色团的外腔体积也需要相应变大，因而还需要一些补充突变位点。在ECFP中，第 7条链的N端可以通过van der Waals力与生色团相互作用，Y145A 和H148D突变稳定这些相互作用并使生色团 构象更加平整、堆叠更加紧密，从而减少坍塌淬灭的可能性。 ➢ 红移的YFP衍生物是通过T203Y 来实现的，这种突变使得取代后的酪氨酸和生色团之间产生π-电子堆叠作用， 从而使得发射光红移。 1. History-GFP derivatives 用表达不同荧光蛋白的细菌所涂抹制成的San Diego海滩图 1. History-GFP derivatives 多种多样的荧光蛋白 1. History-nomenclature ➢ GFPs的命名经常有交叉和混乱，例如mGFP a) 指在N端进行了棕榈烷酰化(palmitoylation)从而可以结合到细胞膜上的GFP。 b) mGFP也经常被用来指单体(monomeric)GFP，因为wtGFP在5 mg/mL以上浓度时会有弱的二聚倾向，打破 A206K的突变可以破坏二聚并保持单体状态。 c) mGFP还可以指通过氨基酸残基交换在植物中进行稳定表达的修饰的(modified) GFP。 2. In Nature ➢ 为什么在水母中存在着一级生物发光（水母素）和二级发光（GFP荧光）还不得而知。 ➢ GFP 在水母的伞状边缘与水母素共表达，水母素发出的蓝光能够激发GFP发光，使得生物荧光更偏绿色。 ➢ wtGFP生色团中第65位残基上的丝氨酸使得其具有双重激发峰，几乎所有在此位置上进行的突变都能使得激 发峰变为395 nm或者480 nm的一个激发峰. 这种灵敏性的确切机理很复杂，可能包含65位丝氨酸上的质子向 222位谷氨酸的传递，并由此影响到生色团的离子化。 ➢ 由于单点突变就能导致480 nm 处的激发峰剧烈增强并使GFP成为水母素的更有效partner， A. victoria 貌似在 进化上倾向于选择效率更低、双激发峰模式。.Roger Tsien推测随着海水深度的变化，水压发生变化，并会导 致65位丝氨酸向生色团供给质子的能力受到影响从而改变两种激发峰的比例。因此，水母的生物发光颜色应 该会随着水深的变化而变。然而，在GFP的发源地Friday Habor地区水母数量的断层使得在天然环境中GFP在 水母中的作用研究难以进行。 3. Other Fluorescence Proteins ➢ 像GFP蛋白一样具有荧光，但不是来源与A.victoria的蛋白： dsRed, eqFP611, Dronpa, TagRFPs, KFP, EosFP/IrisFP, Dendra, and so on. 它们不一定要来源于有荧光的蛋白，例如KFP，来源于对无荧光或弱荧光的 蛋白的修饰。 ➢ FbFPs (FMN-bing fluorescent proteins)是一类衍生自蓝光受体的不需要O2的荧光蛋白，分子量11-16kDa，在 2007年被开发出来。因为其生色团核黄素的形成和结合不需要O2参与， FbFPs蛋白可以在厌氧或缺氧环境 研究中使用。 ➢ 采用其他生色团的蛋白，例如UnaG蛋白，其生色团为胆红素分子，激发波长和发射波长相距足够大，能够 实现从绿光到红光的颜色转变。 ➢ 蓝藻细菌中的荧光蛋白smURFP(small ultra red fluorescent protein)，他们可以自发与生色团胆绿素相结合， 不需要氧气，也不产生过氧化物。光谱性质类似于有机染料Cy5。 3. Other Fluorescence Proteins 在紫外光照射下各种荧光蛋白发出的荧光 表达不同荧光蛋白的e.coli细菌培养基 在白光照射下（肉眼观察）各种荧光蛋白发出的荧光 4. Structure ➢ 11条b折叠链构成水桶样空腔 ➢ 1条a螺旋共价连接生色团 4-(p-hydroxybenzylidene)imidazolidin-5-one (HBI) ➢ 5条短a螺旋形成两端的帽子 ➢ b折叠圆筒长宽分别为42和24Å 4. Structure ➢ HBI来源于Ser66-Tyr66-Gly67三肽的同步修饰，环化脱水并氧化形成生色团的过程叫做GFP蛋白的成熟过程。 ➢ H-键网络和电子堆叠效应影响GFP的颜色、强度和光量子产率。 ➢ Gln94, Arg96, His148, Thr203, and Glu222 起稳定剂作用， Gln94, Arg96, His148分散生色团的电子云密度，稳定生 色团结构； Arg96尤为重要，它能促进结构重排以使环化反应得以发生。 4. Structure 5. Application ➢ ( 1) Reporter Assays • 环境毒性水平监测报告基因。例如ethanol, p-formaldehyde, phenol, triclosan, and paraben等环 境毒性分子的监测。污染物浓度的上升会导致细胞存活数目的下降以及萤光强度的下降。 • GFP的优点：对宿主细胞的生存无影响，不需要外加染色剂、ATP或者共表达因子。 可遗传。 • 注意事项：把GFP融合到宿主细胞蛋白中时，需要设计合理的linker，来保持宿主细胞蛋白的正 确折叠。 5. Application ➢ ( 2) Fluorescence microscopy 进行GFP-Snf2H和RFP-H2A标记的单个骨癌细胞细胞核成像。在470 µm2内可以观测到120,000个定位分子。 5. Application ➢ ( 3) Split GFP 5. Application ➢ ( 4) GFP pets YFP zebrafish GFP zebrafish GFP mice