UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA
LA MOLINA
FACULTAD DE AGRONOMÍA
“FORMULACIÓN DE EXTRACTOS VEGETALES PARA EL
CONTROL DE ENFERMEDADES AGRÍCOLAS”
TRABAJO DE SUFICIENCIA PROFESIONAL PARA OPTAR EL
TÍTULO DE INGENIERA AGRÓNOMA
NADIR FIORELLA RAMIREZ QUISPE
LIMA – PERÚ
2021
La UNALM es titular de los derechos patrimoniales de la presente investigación
(Art. 24 – Reglamento de Propiedad Intelectual)
1
UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA
FACULTAD DE AGRONOMÍA
“FORMULACIÓN DE EXTRACTOS VEGETALES PARA EL
CONTROL DE ENFERMEDADES AGRÍCOLAS”
Nadir Fiorella Ramirez Quispe
Trabajo de Suficiencia Profesional para optar el título de:
INGENIERA AGRÓNOMA
Sustentado y aprobado ante el siguiente jurado:
…..................................................
Ph. D. Walter Apaza Tapia
PRESIDENTE
..........................................................
Ing. Mg. Sc. Medali Huarhua Zaquinaula
MIEMBRO
....................................................
Ing. Mg. Sc. Liliana Aragón Caballero
ASESORA
..................................................
Ing. Mg. Sc. Isabel Montes Yarasca
MIEMBRO
LIMA – PERÚ
2021
DEDICATORIA
A Dios por su infinito amor y bondad.
A mis padres y hermana por su constante apoyo
en la realización de todos mis proyectos.
AGRADECIMIENTOS
A la Universidad Nacional Agraria La Molina porque las enseñanzas otorgadas me han
abierto muchas oportunidades y me han llevado a ser la persona de hoy en día.
Agradezco a los profesores por brindarme sus conocimientos y contribuir a mi formación
profesional, por su orientación en la vida universitaria y por siempre forjarnos el espíritu
de ser los mejores.
Agradezco a mis compañeros de estudios por compartir sus conocimientos conmigo, por
ser un soporte durante la vida universitaria y, sobre todo, por brindar su amistad y cariño.
Un agradecimiento especial a la Ing. Liliana Aragón por su apoyo, consejos y orientación
en la realización de este trabajo.
Finalmente, agradecer a la especialidad de Fitopatología y a mis amigos Cledy Ureta, Juan
José Oviedo, José Soto, Walter Chacón y Carlos Huamán por las enseñanzas impartidas y
contribuir en gran medida a mi desarrollo profesional.
PRESENTACIÓN
Los extractos vegetales son una alternativa para el control de enfermedades agrícolas, ya que
el abanico de productos químicos utilizados para el control de dichos patógenos, es cada vez
más reducido, debido a las restricciones impuestas por los mercados de destinos de los
productos agrícolas. Estos extractos gozan de mayor aceptación, pues el mercado de
productos biológicos está en crecimiento.
Sin embargo, un producto formulado a partir de un extracto vegetal para el control de
enfermedades debe cumplir una serie de requisitos y debe seguir varios pasos para llegar al
agricultor. Dos extractos vegetales obtenidos de la misma especie vegetal no tienen el mismo
comportamiento ni eficacia, pues ésta varía en función de los componentes de aquel. Una
especie vegetal tiene características especiales, en función del clima, suelo y manejo
agronómico. Los aditivos de la formulación otorgan al producto un desempeño diferenciado,
pues éstos pueden darle mayor humectación, mayor dispersión, menor volatilidad, mayor
vida en almacén y, por tanto, mayor eficacia. Los formulados con extractos vegetales deben
cumplir parámetros de calidad y controles de eficacia antes de salir al mercado.
El desarrollo de productos con extractos vegetales para controlar enfermedades agrícolas es
una actividad que invita a la investigación y al análisis de los diversos datos de las
investigaciones previas. Una vez elegido el extracto a trabajar se debe plantear el tipo de
formulación considerando el costo de producción, las características del extracto como
sustancia, la disponibilidad de los aditivos y las preferencias del cliente final. La formulación
en sí misma presenta los desafíos de entender qué componentes y en qué cantidad deben
incluirse en la formulación y su relación con el extracto vegetal que actúa como principio
activo. Luego, la evaluación de la eficacia en laboratorio y en campo permite determinar si
el producto es eficaz y en qué porcentaje, asimismo si es necesario un reajuste para mejorar
la eficacia u otra característica. La finalidad es formular un extracto vegetal que sea el
producto de referencia para el control de la enfermedad para el cual fue desarrollado.
ÍNDICE
I.
Introducción…………………….………………………….................. 1
II.
Objetivos……………………………………………………………..…. 3
III.
Revisión de literatura……………………………………………………. 4
Extractos vegetales……………………….………………………………. 4
3.1
3.1.1.
Principales familias botánicas de los extractos vegetales……..……... 6
3.1.1.1. Asteraceae…………………..…………………………………......... 6
3.1.1.2. Lamiaceae……………...…...…………………………….……........ 6
3.1.1.3. Rutaceae……………..…………………………………………........ 6
3.1.1.4. Poaceae……………….……………………………………….......... 7
3.1.2 Tipos de compuestos presentes en los
extractos vegetales………………………………………………………....... 7
3.1.2.1 Terpenos…………….……………………………...……………....... 7
3.1.2.2 Hidrocarburos…….…………...…………………………………....... 7
3.1.2.3 Alcoholes…….……………..……………………………………....... 8
3.1.2.4 Fenólicos……………..…...……………...………………………....... 8
3.1.2.5 Éteres……….………………………….…………………………...... 8
3.1.2.6 Aldehídos….……………………………….……………………….... 9
3.1.2.7 Cetonas ………….……………………….………………………...... 9
3.1.2.8 Ésteres……….……………………………………………………..... 9
3.1.2.9 Lactonas……..…………………………...…………………….......... 9
3.1.3
Propiedades antimicrobianas de los
extractos vegetales frente a fitopatógenos…………..……………................ 10
3.1.4 Factores que influyen en la composición de
extractos vegetales…………………………...……………………………..... 11
3.1.4.1 Factor genético……….……………...……………………………... 11
3.1.4.2 Condiciones medioambientales……...…………………………....... 12
3.1.4.3 Origen geográfico….…………………………...………………....... 12
3.1.4.4 Estado fenológico……………….……...………………………....... 13
3.1.4.5 Órgano vegetal……………….…………...………………........... 13
3.1.5 Mecanismos de acción…………..………………………………........ 14
3.1.5.1 Disrupción de la membrana celular e inhibición de
la formación de la pared celular………………………………..……....... 14
3.1.5.2 Disfunción de la mitocondria………………………………......... 15
3.1.5.3 Inhibición de las bombas de flujos…………………………......... 16
3.1.5.4 Producción de ROS……….……………………......……………. 16
3.2. Patógenos cuyo control por extractos vegetales
constituye una acción determinante ……………………................................ 17
3.2.1. Lasiodiplodia theobromae………………………..………........................ 17
3.2.2. Botrytis cinerea……...…........……………………………………….. 19
3.2.3. Cladosporium sp…..………....………………………………………. 21
3.2.4. Alternaria alternata……………………...……..…………………..... 23
3.3. Formulación de productos para el control de enfermedades……………... 24
3.3.1 Tipo de formulaciones………..……….…………………………........ 25
3.3.1.1. Concentrado soluble………………………….……..…….......... 24
3.3.1.2. Concentrado emulsionable…………………..……..…............... 25
3.3.1.3. Aceite en agua…………...…………………….………............. 25
IV. Desarrollo de la experiencia profesional…………………....……….…….. 26
4.1. Situación encontrada………………………….…………………………. 26
4.2. Contexto ……………………………………………………………….... 27
4.3. Proceso de selección del
Extracto vegetal potencial…………………………………………….…...... 30
4.4. Proceso de formulación del extracto vegetal……………………………. 35
4.4.1. Formulación…..………………………………………………......
35
4.4.2. Pruebas fisicoquímicas…..…. ..………………………………….… 37
4.5. Proceso de evaluación del ´
Principio activo como futuro prospecto……………….…………..……...... 38
4.5.1. Pruebas de eficacia …..……...……………..……………………….. 38
4.6. Problemática y desafíos……......……………………………………….. 43
4.7. Competencias y habilidades desarrolladas……………………………... 44
V. Conclusiones y recomendaciones………………....……….……………… 46
VI. Bibliografía………..………………………………….……..…………… 47
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Mecanismo de disrupción de la membrana
celular e inhibición de la formación de la pared celular
de hongos por los extractos vegetales…........................................................... 14
Figura 2. Ciclo de la enfermedad de Lasiodiplodia
theobromae….................................................................................................... 18
Figura 3. Ciclo de la enfermedad de Botrytis cinerea
en fresa….......................................................................................................... 20
Figura 4. Ciclo de la enfermedad de Alternaria alternata,
agente causal de la mancha marrón de los cítricos…………....................…… 24
Figura 5. Flujograma del proceso de formulación de extractos
vegetales hasta su llegada al consumidor final…………....................……….. 32
Figura 6. Factores que intervienen en la formulación
de productos para el control de enfermedades……………..…...........………. 36
Figura 7. Factores que intervienen en la formulación
de productos para el control de enfermedades……...……...…….................... 42
Figura 8. Prueba in vitro de extractos de citronela y
canela frente a Botrytis cinerea……………………...................................….. 43
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Resultados de la evaluación in vitro de
los extractos de citronela y canela frente a
Botrytis cinerea………..……………………………...................................... 42
I.
INTRODUCCIÓN
El Perú es un país agrícola, actividad desarrollada desde los primeros asentamientos
humanos en la costa y sierra, que tiene como cultivos tradicionales a la papa, maíz y las
hortalizas (Salaverry, 2012). Esta agricultura fue por muchas décadas familiar o de pequeños
agricultores; sin embargo, en las últimas décadas ha experimentado un crecimiento hacia
una agricultura intensiva y con mayor rentabilidad con cultivos como espárrago, mango,
cítricos, palto y uva, destinados a la exportación (Zegarra, 2019). Lo anterior se ve reflejado
en el valor de las ventas de agroexportaciones, con 275 millones de dólares en 1995 y 5 353
millones de dólares en 2016 (Larrea, Ugaz y Flórez, 2018; Zegarra, 2019). Este crecimiento
ha sido impulsado por la instalación de proyectos de irrigación a lo largo de la costa, la
implementación de tratados de libre comercio con otros países, la inversión privada, la Ley
de Promoción Agraria (Ley N°27360) y las características climáticas del Perú que encajan
con las ventanas comerciales de exportación. En el 2018, el Perú se ubicó en el decimotercer
lugar como agroexportador de frutas y hortalizas frescas, a diferencia del 2004, que se
hallaba en el trigésimo octavo lugar, reafirmando así el crecimiento de sector. La industria
agrícola peruana seguirá creciendo, pues las compañías locales e internacionales continúan
invirtiendo, aún hay proyectos de irrigación por concretar, la apertura de mercados y la
diversificación de cultivos (Ortiz, 2019).
La agricultura provee de alimentos a la población humana, pero ésta experimenta un rápido
crecimiento y se necesita implementar mayores áreas para satisfacer la demanda mundial.
Se estima que para el 2050 se necesitará aumentar en un 70 % la producción mundial de
alimentos para una demanda de 9.8 millones de personas y garantizar la seguridad
alimentaria (Naciones Unidas, 2017). Dentro de este marco, se hace necesario que los
productores mejoren la eficiencia de los recursos utilizados en sus procesos para que tengan
un menor impacto en el ambiente. Por otro lado, en la actualidad los consumidores exigen
alimentos producidos de forma sostenible y que no sean perjudiciales para su salud,
contribuyendo a que la industria tenga parámetros de producción y calidad más estrictos.
1
Desde mediados de 1940 el uso de plaguicidas de origen sintético ha ido en crecimiento,
dejando de lado al control biológico; sin embargo, esto ha conllevado al surgimiento de otros
problemas que afectan la salud humana y al ambiente. El uso frecuente de un plaguicida
origina la aparición de resistencia en los patógenos, se observa que cuando una dosis no es
útil, se incrementa y solo se consigue realizar una selección de la población resistente, hasta
que el activo no tiene efecto. Los plaguicidas químicos no solo tienen efecto contra el
patógeno objetivo, sino también contra la microbiota presente en el suelo o sobre la filosfera;
existe contaminación del entorno, como fuentes de agua y aire, lo cual afecta a la población
circundante; y finalmente, existe riesgo de la presencia de residuos de pesticidas en los
alimentos destinados al consumo, lo que implica un grave riesgo a la salud humana.
En relación a la problemática expuesta, el uso del control biológico como alternativa a la
aplicación de pesticidas de origen sintético, se erige como la mejor opción. El control
biológico utiliza microorganismos, sus metabolitos secundarios y extractos de plantas como
principios activos para el control de fitopatógenos. Se ha determinado que los extractos
vegetales pueden inhibir el crecimiento de bacterias y hongos en el área de alimentos,
medicina y agricultura. Los extractos de plantas contienen diversos compuestos que son
responsables, en mayor o menor medida, de la acción biocida, y estos compuestos están en
función a muchos factores como estado fenológico, lugar y parte de la planta de donde fue
extraído, por lo cual se hace necesario evaluar el potencial de cada extracto y constatar su
eficacia frente a un determinado fitopatógeno, antes de su aplicación en campo.
2
II.
3.1.
OBJETIVOS
Describir el proceso de formulación de un extracto vegetal con acción sobre
fitopatógenos.
3.1.1. Describir el proceso de selección del extracto vegetal potencial.
3.1.2. Describir el proceso de formulación de un extracto vegetal potencial.
3.1.3 Describir el proceso de evaluación de un extracto vegetal como futuro
prospecto.
3
III.
REVISIÓN DE LITERATURA
Las enfermedades agrícolas se presentan anualmente ocasionando pérdidas en los cultivos.
Para minimizar o evitar estas pérdidas se utilizan sustancias que eliminan o reducen el daño
de los patógenos asociados a estas enfermedades. Existen diversos métodos de control de
estos fitopatógenos y uno de ellos es el control biológico que ha despertado el interés de los
investigadores en los últimos años por la necesidad de reemplazar los pesticidas químicos.
El control biológico de enfermedades agrícolas tiene como finalidad reducir el inóculo o la
enfermedad producida por un fitopatógeno en su estado activo o latente mediante el uso de
organismos, sus derivados y productos de plantas (Choudhary, Arun, Jha y Rai, 2015). El
control biológico está dentro del control biorracional que se define como sustancias o
procesos que cuando se utilizan no tienen un efecto dañino a los organismos no objetivo pero
que tienen acción supresora o letal, modifican el comportamiento del organismo objetivo,
aumentando el control. Este enfoque a diferencia del control biológico, no tiene en cuenta el
origen de las sustancias, sino que prioriza las consecuencias de su aplicación en los
organismos y el medio ambiente, pudiendo incluirse aquí los productos químicos de acción
selectiva (Horowitz, Ellswoth y Ishaaya, 2009).
Los extractos vegetales son uno de los métodos de control biológico y biorracional que han
despertado el interés de los investigadores, pues las plantas son un gran reservorio de
compuestos que tienen propiedades antimicrobianas, siendo su principal ventaja que son
biodegradable y no tóxicos a mamíferos (Choudhary, Arun, Jha y Rai, 2015).
3.1 Extractos vegetales
Los extractos vegetales son productos obtenidos de distintas partes de la planta,
tallos, hojas, flores, corteza, etc. Éstos están compuestos por varias sustancias, de las
cuales son los compuestos aromáticos, lo que tienen las propiedades antimicrobianas
4
y se hallan en la fracción oleosa o aceites esenciales. Estos aceites se extraen
utilizando métodos como la destilación por arrastre de vapor, prendado en frío y
extracción mediante solventes (Herman et al., 2019; Tongnuanchan y Benjakul,
2014).
Los estudios acerca de la composición química de los extractos de plantas reportan
que existen uno, dos o tres sustancias predominantes y que le dan las propiedades
biológicas; sin embargo, las sustancias minoritarias influyen en el desempeño del
extracto vegetal, dado que pueden tener u efecto sinérgico o antagónico con las
mayoritarias (Bassolé y Juliani, 2012). Entre estas sustancias bioactivas reportadas
como mayoritariamente presentes, están el limoneno, timol, cinnamaldehído,
carvacrol y mentol (Shaaban, El-Ghorab, y Shibamoto, 2012), las cuales se producen
dentro de los órganos vegetales como productos de su metabolismo secundario y su
concentración depende de la parte de la planta, especie, estación, solventes utilizados
o método de extracción (Hyldgaard, Mygind y Meyer, 2012; Falleh, Ben Jeema,
Saada y Ksouri, 2020; Ait-Ouazzou et al., 2011). Además, estos compuestos se
agrupan según su naturaleza química en terpenos, carbohidratos, compuestos
fenólicos, éteres, cetonas, alcoholes y aldehídos (Tabassum y Vidyasagar, 2013).
Las propiedades antimicrobianas y antioxidantes de los extractos de plantas también
son de gran interés en la industria de alimentos. La Administración de Alimentos y
fármacos de Estados Unidos (FDA) ha catalogado a los aceites esenciales,
componentes de los extractos de plantas, como seguros por lo que se incorpora en los
alimentos para evitar la proliferación de microorganismos contaminantes (LlanaRuiz-Cabello et al., 2015; Manso, Pezo, Gómez-Lus y Nerín, 2014; Wrona, Bentayeb
y Nerín, 2015; Yildirim et al., 2018).
Otras industrias como la cosmética y cuidado personal, higiene y agricultura usan los
extractos naturales como parte de sus productos, ya que se consideran seguros
comparados con las sustancias químicas sintéticas (Shaaban et al., 2012).
5
3.1.1 Principales familias botánicas de los extractos vegetales
3.1.1.1 Asteraceae
Son plantas herbáceas, arbustivas o leñosas, que contienen compuestos de
lactona sesquiterpeno por lo cual es ampliamente estudiada, pues se relaciona
con la dermatitis alérgica por contacto; sin embargo, también es estudiada por
sus propiedades antifúngicas. El extracto de Chysanthemum coronarium
inhibe el crecimiento micelial en condiciones in vitro y su acción es por
contacto (Alvarez-Castellanos, Bishop y Pascual, 2001). La especie Artemisia
santonicum son potentes inhibidores del crecimiento de Fusarium
oxysporum, Alternaria alternata y Rhizoctonia solani (Kordali,Cakier, Mavi,
Kili y Yildirim, 2005).
3.1.1.2 Lamiceae
Las especies de esta familia tienen importancia, gastronómica, médica y
ornamental. La composición química de las plantas de esta familia es la razón
de su gran potencia antimicrobiana. El extracto de Lavandula stoecas inhibe
el crecimiento de Rhizoctonia solani y Fusarium oxysporum, pero es menos
efectivo frente a Aspergillus flavus (Argioni, Barra, Coroneo, Dessi y Cabras,
2006). Giordani et al., (2004) realizó comparativo del efecto de algunas
especies de esta familia, entre ellas Lavandula angustifolia, Thymus vulgaris,
Rosmarinus oficinales y Origanum vulgare sobre la levadura Candida
albicans y el mejor control lo tuvo Thymus vulgaris.
3.1.1.3
Rutaceae
A esta familia pertenecen los cítricos, que son de gran importancia agrícola
en las zonas de clima tropical y subtropical. Citrus sinensis tiene efecto
fungitóxico sobre patógenos postcosecha como Botrytis cinerea, Alternaria
alternata, Botryodiplodia theobromae y Cladosporium cladosporioides
(Sharma y Tripathi, 2006). El extracto de Haplophyllum tuberculatum inhibe
el crecimiento de Curvularia lunata y Fusarium oxysporum, mas no tiene
6
efecto sobre las conidias (Al-Burtamani, Fatope, Marwah, Onifade y AlSaidi, 2005).
3.1.1.4 Poaceae
La familia Poaceae está conformada por las gramíneas y están ampliamente
distribuidas alrededor del mundo. Los extractos de plantas de esta familia
presentan compuestos fungitóxicos como la especie Cymbopogon citratus que
controla el desarrollo de Cladosporium sp., Aspergillus niger y Mucor sp. (Sun
et al., 2007). El extracto de C. citratus o también llamado citronela es capaz de
inhibir el 80 % de hongos que afectan la piel de los humanos (Prasad, Anandi,
Balasubramanian y Pugalendi, 2004).
3.1.2 Tipos de compuestos presentes en los extractos vegetales
3.1.2.1 Terpenos
Los terpenos tienen una estructura en base a isopreno, una molécula formada
por cinco carbonos unidos. Estos compuestos tienen como precursor al
isopentenil difosfato (IPP), el cual forma una cadena según el tipo de terpeno
a sintetizar para luego formar el esqueleto del compuesto y finalmente, éste
sufre modificaciones secundarias mediante reacciones tipo redox para darle sus
propiedades funcionales. Los principales compuestos de este grupo son los
monoterpenos (C1) con dos isoprenos unidos como el limoneno, los
sesquiterpenos (C15) por su parte contienen tres unidades de isopreno, como
en caso de la zingiberina, y los terpenoides, que se diferencian por presentar
oxígeno en su estructura (Bhavaniramya, Vishnupriya, Al-Aboody,
Vijayakumar y Baskaran, 2019; Tisserand y Young, 2013).
3.1.2.2
Hidrocarburos
Los hidrocarburos son compuestos que están conformados por hidrógeno y
carbono. Se clasifican en alifáticos, alcanos e hidrocarburos aromáticos. Los
7
alifáticos son cadenas carbonadas lineales sin un anillo aromático. Éstos se
hallan en pequeñas cantidades, y son los responsables del olor característico
como en el aceite de cítricos. Los alcanos son cadenas de carbonos unidos por
enlace simple. Los hidrocarburos aromáticos tienen la característica de tener un
anillo de benceno en su estructura y otorgan un olor agradable en las plantas
(Naveed et al., 2013).
3.1.2.3 Alcoholes
Químicamente los alcoholes presentan un grupo funcional hidroxilo y el nombre
llevan la terminación “ol”. Los alcoholes monoterpenicos son antisépticos y el
mentol es un ejemplo de este grupo (Tisserand y Young, 2013).
3.1.2.4
Fenólicos
Los fenoles son sustancias que químicamente se caracterizan por tener un anillo
aromático, benceno, unido a uno o más grupos hidroxilo y una cola isopropil,
por lo cual es débilmente ácido y muy reactivo. Tienen solubilidad en agua y por
ello se encuentran en la vacuola celular (Tisserand and Young, 2013). En este
grupo de compuesto se hallan los fenilpropanoides, flavonoides, antocianinas,
flavones, flavonoles, taninos y quininas; y tienen funciones biológicas como
pigmentos de flores y frutos, antioxidantes y antimicrobianos. Su actividad
antioxidante se debe a sus propiedades redox, pues les permiten actuar con
agentes reductores. Además, actúan como antimicrobianos, debido a que inhiben
enzimas a través de la oxidación de compuestos. Eugenol, timol y carvacrol son
fenoles que se encuentran comúnmente en los extractos vegetales de clavo,
tomillo y orégano (Kothari, Shah, Gupta, Punjabi y Ranka, 2010).
3.1.2.5
Éteres
Son sustancias en la cual un átomo de oxígeno está ligado a dos carbonos en la
cadena o puede estar en forma cíclica como parte de un anillo. Existen dos tipos
8
de éteres cíclicos, los óxidos y los epóxidos. El 1,8-cineole es un ejemplo de
óxidos y metileugenol, de un epóxido (Tisserand y Young, 2013).
3.1.2.6
Aldehídos
Los aldehídos son compuestos que presentan un grupo funcional CHO, el cual
se halla al final de la cadena y se encuentra como un carbono unido a un oxígeno
por un doble enlace. Son alcoholes primarios parcialmente oxidados. Presentan
olor ligeramente afrutado como el comino aldehído (Tisserand y Young, 2013).
3.1.2.7 Cetonas
Son similares a los aldehídos, pues tienen un grupo carbonilo (C=O) y se
sintetizan a partir de alcoholes secundarios. Comúnmente se utilizan para tratar
enfermedades respiratorias como gripe, tos y asma. Estas sustancias se hallan en
las plantas de romero, cedro rojo y salvia; el carvone es una de las cetonas más
conocidas (Nazzaro et al., 2013; Tisserand y Young, 2013).
3.1.2.8 Ésteres
Son sustancias que se forman producto de una reacción de esterificación que se
produce por la unión de ácido y un alcohol. Estos compuestos presentan olores
afrutados como el acetato de linalilo que se encuentra en lavanda, bergamota y
salvia, pero hay otros que, además, presentan propiedades biocidas como los que
están en el extracto de geranio (Arumugam, Swamy y Sinniah, 2016; Lang y
Buchbauer, 2012).
3.1.2.9 Lactonas
Son ésteres cíclicos derivados de ácido láctico, en su estructura tienen un átomo
de oxígeno unido a un átomo de carbono mediante doble enlace, este carbono
está enlazado a otro oxígeno que es parte de un anillo aromático. Butilftalida y
sedanolida son lactonas presentes en apio (Marongiu et al., 2013), y otra lactona
9
es la cumarina, la cual tiene notas especiadas (Tisserand y Young, 2013). Los
nombres de las sustancias del grupo de las lactonas, usualmente terminan en
“lactona” o “ina” (Tisserand y Young, 2013).
3.1.3 Propiedades antimicrobianas de los extractos vegetales frente a
fitopatógenos
Estos compuestos bioactivos de origen vegetal han despertado gran interés en el
campo de la medicina y farmacología, principalmente debido a que las bacterias
patógenas han adquirido resistencia a varios antibióticos, lo cual hace difícil el
tratamiento de las enfermedades en humanos. De la misma manera en el campo de la
agricultura se observa resistencia de los fitopatógenos a los pesticidas tradicionales.
De allí, que los constituyentes de tales extractos surgen como una alternativa para
tratar las infecciones ocasionadas por estas bacterias multirresistentes (Raut y
Karuppayil, 2004; Tariq et al., 2019). Menta (Mentha piperita) y tomillo (Thymus
vulgaris) tienen actividad antimicrobiana contra bacterias gram negativa y gram
positivas (Reichling, 2018). Murbach, Nunes, da Silva y Fernandes (2013) estudiaron
el efecto inhibitorio contra bacterias y determinaron que Staphylococcus aereus fue
susceptible a Piper nigrum y Melaleuca alternifolia, Cinnamomun cassia y Syzygium
aromaticum contra Escherichia coli, y S. aromaticum contra Pseudomonas
aeruginosa. Por otro lado, también hay estudios sobre otras propiedades
farmacológicas, por ejemplo, Nieto (2017) realizó un estudio con algunas especies
de la familia Lamiaceae como Rosmarinus officinalis, Lavandula angustifolia,
Mentha haplocalyx, y halló que tienen propiedades antitumorales, antinflamatorias,
antimicrobianas y antioxidantes.
Las propiedades antimicrobianas de las plantas aromáticas frente a patógenos que
afectan la salud humana, llevaron al estudio de estas propiedades frente a patógenos
de cultivos, pues era muy probable que los buenos resultados se replicaran en el área
agrícola. Es así que, se ha evaluado el efecto fungitóxico de los metabolitos
secundarios de plantas, como carvacrol y timol, los cuales inhiben fuertemente el
crecimiento de Botrytis cinerea, ambos presentes en Origanum vulgare (Bouchra,
Achouri, Idrissi y Hmamouchi, 2003). Estos compuestos también están presentes en
10
Lavandula latifolia, L. angustifolia, Thymus vulgaris y Thymus serpyllum por lo que
son capaces de inhibir el crecimiento de Fusarium oxysporum (Tullio et al., 2007).
Syzygium aromaticum, una especie de la familia Mirtaceae, tiene actividad
antimicrobiana sobre el micelio de Botrytis cinerea (Sirirat, Wimolpun y Sanit,
2009). También, inhiben parcialmente el crecimiento de Aspergillus fumigatus y A.
acculeatus (Lambert, Skandamis, Coote y Nychas, 2001). Se ha reportado el fuerte
efecto de control de Tagetes patula sobre Botrytis cinerea y Penicllium digitatum,
pues inhibe completamente su crecimiento (Romagnoli et al., 2005).
El extracto de Punica granatum tiene efecto de control de algunos fitopatógenos
como Penicillium citrinum (roya de los cítricos) y Rhizopus oryzae (afecta a mango
y piña) (Dahham, Ali, Tabassum y Khan, 2010). La canela china (Cinnamomum
cassia) tiene efecto significativo de control sobre los patógenos fúngicos como
Botrytis cinerea, Fusarium monoliforme y Phyllosticta caricae (Lee, Chang, Su,
Huang y Jang, 2007). Ocimum gratissimum tiene efecto de inhibir la germinación de
conidias y el micelio de Botryodiplodia theobromae, Fusarium oxysporum y
Fusarium solani (Okigbo y Ogbonnaya, 2006).
3.1.4 Factores que influyen en la composición de extractos vegetales
La composición de los extractos vegetales es variable, inclusive dentro de la misma
especie vegetal, debido a factores propios de la estructura vegetal y a factores
externos.
3.1.4.1 Factor genético
La composición química de una planta está determinada por su genética, la
cual permanece constante a través del tiempo; sin embargo, puede haber
diferencias en el contenido de los metabolitos secundarios, dando como
11
resultados varios quimiotipos de una misma especie vegetal (Sadeghi et al.,
2015).
Un quimiotipo está definido por el metabolito secundario producido en mayor
cantidad por una planta, como consecuencia de factores externos e internos
del organismo y que no afectan sus características morfológicas. El tomillo
(Thymus vulgaris) tiene siete quimiotipos en función de la mayor presencia
de timol, carvacrol, linalool, geraniol, tuyanol, alfa terpineol o eucaliptol,
pero que en el aspecto morfológico son iguales (Keefover-Ring et al., 2009).
Es preciso señalar que, si bien un quimiotipo está definido por el principal
metabolito secundario, existen otros componentes en los extractos vegetales
que van a influenciar en el impacto que dicho extracto tendrá en los patógenos
(Keefover-Ring et al., 2009).
3.1.4.2 Condiciones medioambientales
La composición de los extractos vegetales influenciada por el entorno
determina la existencia de “ecotipos”. Las condiciones medioambientales que
influyen en las características son las condiciones climáticas (temperatura,
fotoperiodo y humedad) y las condiciones de cultivo (tipo de suelo, densidad
de cultivo, fertilización y riego) (Rioba, Itulya, Saidi, Dudai y Bernstein,
2015; Cavar Zeljković, Šolić y Maksimović, 2015; Pirbalouti, Hossayni y
Shirmandi, 2013).
Un estudio determinó que los monoterpenos 1,8 cineole, alfa y beta tujhone,
y camfor, presentes en las hojas jóvenes de Salvia officinalis dependen de la
temporada en la que se realiza el cultivo (Grausgruber-Groger, Schmiderer,
Steinborn, y Novak, 2012). También se observó que la cantidad de
monoterpenos oxigenados y sesquiterpenos oxigenados en los extractos de
12
Ocimum basilicum fueron de 80.9 % y disminuyeron a 74.3 %, en invierno
(Gazim et al, 2010).
3.1.4.3
Origen geográfico
La zona geográfica de cultivo de la planta está relacionada con la
composición de los extractos vegetales, pues la radiación, así como la altitud
inducen a diferencia en la cantidad y calidad de dichos componentes (Ćavar
Zeljkovic´, Šolić y Maksimović, 2015).
3.1.4.4
Estado Fenológico
La composición de los extractos vegetales está influenciada por el estado de
crecimiento de las plantas. El estado de crecimiento o estado fenológico de
una planta determina las modificaciones en su metabolismo secundario y en
su actividad enzimática, razón por la cual la producción de un compuesto
puede activarse, incrementarse, disminuir o detenerse dependiendo según la
etapa de crecimiento en la que se encuentre el cultivo (Ghani, Saharkhiz,
Hassanzadeh y Msaada, 2009).
Estudios realizados en Tagetes minuta y Ocuminum cyminum dieron como
resultado diferencias en la composición de sus extractos a diferentes etapas
fenológicas (Moghaddam, Pirbalouti, Mehdizadeh y Pirmoradi, 2015b;
Moghaddam, Miran, Pirbalouti, Mehdizadeh y Ghaderi, 2015a).
Por tanto, es importante relacionar la etapa de crecimiento del cultivo con
la mayor producción de compuestos químicos y la cosecha. En el caso de
Thymus capitatus, se observó que después de la floración, es la mejor etapa
para cosechar y obtener la mayor cantidad de compuestos fenólicos como
carvacrol, γ-terpinene y p-cymene (Casiglia, Bruno, Scandolera, Senatore y
Senatore, 2015).
13
3.1.4.5
Órgano vegetal
Los metabolitos secundarios están codificados por genes que determinan su
síntesis y estos genes, en algunos casos, se expresan solo en algunos órganos
de la planta. En estos órganos se sintetizan estaos compuestos porque tiene
la ruta metabólica de terpenoides (Niu et al., 2015). Un ejemplo son los
frutos de culantro, en el que se produce la mayor cantidad de aceite esencial
(Galata, Sarker y Mahmoud, 2014).
3.1.5 Mecanismos de acción
3.1.5.1 Disrupción de la membrana celular e inhibición de la formación de
la pared celular
La naturaleza lipofílica de la mayoría de los compuestos presentes en los
extractos vegetales y de los aceites esenciales, que es la fracción donde se hallan
estos principios activos, facilita su ingreso a la célula causando la ruptura de la
membrana plasmática y la salida de pérdida de iones, colapso de la bomba de
protones y la pérdida de ATP, lo que causa que haya un vaciado del contenido
celular (Figura 1) (Nazzaro, Fratiani, De Martino, Coppola y De Feo, 2013). El
extracto de Litsea cubeba, específicamente el metabolito secundario citral,
inhibe la biosíntesis del ergosterol en Candida albicans, lo cual resulta mortal
debido a que el ergosterol es esencial para los hongos, pues es su fuente de
esteroles (Rajput y karuppayil, 2013). La fluidez y permeabilidad de la
membrana plasmática de esta levadura se ve afectada por el extracto de
Melaleuca alternifolia (Hammer, Carson y Riley, 2004). La alteración de la
cantidad de ergosterol en la membrana por Coriandrum sativum altera el
metabolismo de la célula, lo que afecta la reproducción y la patogenicidad de los
hongos (Freires de Almeida et al., 2014).
14
Coagulación
Fuerza motriz del
protón
Vaciado de los
constituyentes
citoplasmáticos:
Citoplasma
metabolitos e
iones
Membrana
citoplasmática
Pared
celular
Proteínas de membrana
Figura 1. Mecanismo de disrupción de la membrana celular e inhibición de la formación de la pared
celular de hongos por los extractos vegetales. Adaptado de Sadaka et al. (2014).
La pared celular está conformada por polisacáridos como glucano, quitina y
mananos, que son esenciales para la sobrevivencia de los hongos (Wu, Cheng,
Sun y Lou, 2008). Algunos componentes de los extractos vegetales, como el
Trans-anethole del anís, inhiben la síntesis de quitina afectando la formación de
septas y de yemas como consecuencia de la alteración de la división celular
(Yutani et al., 2011). El limonene presente en los cítricos, causa la pérdida del
contenido citoplasmático de las hifas, inhibiendo el crecimiento de Aspergillus
niger (Gogoi, Baruah y Nath, 2008). El citral presente en Litsea cubeba daña la
pared celular al inhibir la síntesis de peptidoglucanos, inhibir parcialmente la
síntesis de ADN, ARN y proteínas de Alternaria alternata, Fusarium
monoliforme y F. solani (Freires de Almeida et al., 2014).
Nazzaro et al., (2013) indican que, la estructura de la pared celular de bacterias
estaría relacionada con el grado de resistencia a los extractos vegetales. Los
compuestos no entran tan rápidamente al interior de las bacterias gram negativas
comparado con las gram positivas, y esto se debe a que éstas poseen doble
membrana. Es importante señalar que la mayoría de las bacterias fitopatógenas
son gram negativas y es por ello que su control es difícil. Otro factor relacionado
15
con la resistencia a los antimicrobianos naturales es la capacidad de partición de
los lípidos de la membrana.
La inhibición de la producción de amilasa y proteasa, lo cual detiene la
producción de toxinas, el flujo de electrones y, por consiguiente, la coagulación
del citoplasma, es otro de los posibles mecanismos de antimicrobianos de los
extractos vegetales (Bakkali, Averbeck, Averbeck y Idaomar, 2008).
3.1.5.2 Disfunción de la Mitocondria de los hongos
Algunos extractos vegetales afectan el funcionamiento de la mitocondria, a
través de la inhibición de las enzimas que intervienen en la síntesis del ATP
como en el caso del extracto de Anethum graveolens. También se ha postulado
que los extractos inducen la producción de ROS como consecuencia de la
disminución del contenido de la mitocondria. Otros como el alcanfor
incrementan las mutaciones, ocasionando daños al organelo (Haque et al., 2016;
Chen et al., 2013; Bakkali et al., 2006).
3.1.5.3 Inhibición de bombas eflujo
La enzima H+-ATPasa tiene una función importante en la célula fúngica como
reguladora del gradiente electroquímico de protones a través de la membrana
celular, regula el pH interno de la célula y su crecimiento. Otro aspecto de esta
enzima es su rol en la patogenicidad de los hongos, ya que influye en la
acidificación del medio y consumo de nutrientes. El timol y eugenol ejercen su
actividad fungicida al inhibir a la enzima H+-ATPasa, lo cual trae como
consecuencia la acidificación del citoplasma y posterior muerte de la célula
(Haque et al., 2016; Ahmad, Khan y Manzoor, 2013).
16
3.1.5.4 Producción de ROS
Las bacterias sintetizan óxido nítrico para incrementar su resistencia a
antibióticos y los hongos también producen este óxido para proteger el micelio
del estrés oxidativo causado por el calor. Se ha determinado que diferentes
antibióticos destinados a eliminar bacterias, ocasionan la generación de especies
reactivas de oxígeno (ROS), pues estarían relacionadas con la muerte celular.
Los extractos vegetales tienen efecto antioxidante, ya que se observó que tiene
la capacidad de reducir el nivel de óxido nítrico, y disminuir la síntesis de
peróxido de hidrógeno (Kong, Huang, Chen, Zou y Zhang, 2012; Kohanski,
Dwyer, Hayete, Lawrence y Collins, 2007; Cotoras, Castro, Vivanco, Meo y
Mendoza, 2013). Un ejemplo es el timol presente en el extracto de orégano y
tomillo, que elimina la enfermedad ocasionada por Aspergillus flavus mediante
la generación de ROS y óxido nítrico en las esporas (Shen, Zhou, Li, hu y Mo,
2016).
3.2 Patógenos cuyo control por extractos vegetales constituye una acción
determinante
3.2.1
Lasiodiplodia theobromae (Pat.) Griffon & Maubl.
Lasiodiplodia theobromae (Pat.) Griffon & Maubl. es un patógeno oportunista
que se encuentra en zonas tropicales y subtropicales y ocasiona síntomas de
muerte regresiva, pudrición de raíces y pudrición de frutos (Hashem y Alamri,
2009; Abeywickrama, Wijerathna, Rajapaksha, Sarananda y Kannangara, 2012).
El género Lasiodiplodia causa enfermedades en cultivos tropicales como palto,
papaya, chirimoya, cacao, durazno y caña de azúcar (Picos-Muñoz, GarcíaEstrada, León-Félix, Sañido-Barajas y Allende-Molar, 2019).
Este patógeno es favorecido por los climas cálidos y húmedos, con temperaturas
medias de 24 °C (Rodríguez, 2010). En climas tropicales, la alta pluviosidad del
verano, la temperatura y la humedad del riego favorecen la esporulación y
dispersión de conidias de L. theobromae (Muhammad, 2009). Otros factores que
17
favorecen la infección de este hongo en árboles frutales es el estrés hídrico,
suelos con poca aireación, suelos salinos, nutrición deficiente, exceso de riego,
heridas a causa de la poda, alta humedad (Agustí, 2003).
Los síntomas que producen de manera externa incluyen hojas con bordes
necróticos, acortamiento de entrenudos, brotes débiles, y a medida que avanza
la infección se observa una afección general que lleva a la muerte de la planta.
Internamente, se observa con necrosis de tejido parenquimático de manera
discontinua en ramas y tallos (Oliveira et al., 2004). Valle-De la Paz et al. (2019)
describieron los síntomas que produce Lasiodiplodia theobromae en lima, los
que incluyen rajaduras de tallo, gomosis, cancros al pie de planta, follaje
amarillento, muerte regresiva de ramas y presencia de picnidios en las ramas.
El hongo ingresa de forma directa e indirecta, mediante heridas, siendo la última
la que ocasiona un desarrollo más rápido de la colonización. Las de
esporulaciones de picnidias que se encuentran en restos de fruta, restos de poda
en el campo y plantas enfermas constituyen el inóculo primario. Estas conidias
se esparcen a través del viento a todo el campo e inician la invasión del tejido
necrótico de una planta. La infección puede permanecer latente y cuando las
condiciones son favorables continúan su desarrollo. La infección de frutos
producida por L. theobromae se origina en el pedúnculo antes de la cosecha,
permanece latente, y se evidencia cuando el fruto madura después de la cosecha.
Inicialmente el fruto es firme, pero a medida que progresa la enfermedad, se
torna blando (Figura 2). El estado fisiológico del fruto y la velocidad de
crecimiento del patógeno influyen en la rapidez del desarrollo de la enfermedad
(Zhang, 2014).
18
Figura 2. Ciclo de la enfermedad de Lasiodiplodia theobromae (Rangel, 2016).
Los fungicidas recomendados para el control de este patógeno son tiofanate metil,
benomil, carbendazina, tiabendazol y los que contienen cobre de manera rotativa para
evitar la aparición de aislamiento resistentes a fungicidas (Tamayo, 2007). A nivel in
vitro
se
ha
determinado
que
los
fungicidas
procloraz,
tebuconazol,
piraclostrobin+boscalid y ciprodinil+fludioxonil inhiben al micelio de este patógeno
(Tovar et al., 2013). Los productos a base de cobre como oxicloruro de cobre se
aplican de manera preventiva y se recomiendan, también, aplicarlos a las heridas de
las podas (Varela,Orozco, Torres y Silva, 2013, Canales 2007).
3.2.2 Botrytis cinerea Pers.
Botrytis cinerea Pers. es un hongo filamentoso que ataca a muchos cultivos, en varios
estados fenológicos de las plantas, lo cual ocasiona muchas pérdidas económicas
alrededor del mundo (Dewey y Grant-Downton, 2016; Latorre, ElfarK y Ferrada,
2015).
19
Es un patógeno necrótrofo, pues infecta tejidos senescentes o dañados, llevándolos a
la muerte mediante la liberación de toxinas, a diferencia de las infecciones en tejidos
inmaduros, donde el daño es reducido y se forma una infección quiescente, la cual es
la infección primaria (Dewey y Grant-Downton, 2016). Las conidias son el inóculo
primario durante la floración y la madurez de la fruta, se diseminan a través del aire
y se halla en altas cantidades en días húmedos y cálidos (Mundy et al., 2012;
Leyronas y Nicot, 2013). Se presenta en climas húmedos y temperados (Acuña,
2010). El micelio y los esclerotes pueden sobrevivir hospedantes, residuos de plantas,
cultivos vecinos o malezas, también sobre restos de frutos y peciolos (Mundy, Agnew
y Wood, 2012).
Las conidias requieren de humedad libre y temperatura adecuada, 20-25°C, para
iniciar el proceso de germinación, normalmente ocurre luego de 3 horas. Luego de
depositarse sobre la superficie del hospedante, éstas emiten un tubo germinativo, se
adhieren con la ayuda del apresorio, el cual se forma al final del tubo germinativo, y
penetran el tejido mediante una hifa de penetración y la liberación de enzimas;
además puede infectar a través de heridas o aberturas naturales como estomas y
lenticelas (Figura 3) (Ciliberti, Fermand, Languasco y Rossi, 2015).
Figura 3. Ciclo de la enfermedad de Botrytis cinerea en fresa (Petrasch, Knapp, Van Kan y
Blanco-Ulate, 2019).
20
El control químico es una importante herramienta para la protección de los cultivos
de B. cinerea. Se realizan aplicaciones foliares para reducir las tasas de infección; sin
embargo, cada vez se restringe el uso de fungicidas debido a problemas ambientales
y de salud humana (La Torre y Torres, 2012). Actualmente se utilizan activos como
fudioxonil, ciprodinil, pirimetanil, boscalid, fenhexamid, fluazinam, azoxystrobin,
tebuconazole e iprodione contra B. cinerea (Latorre, Elfar y Ferrada, 2015). Es
debido a ello, que se considera a este patógeno como de alto riesgo de resistencia, ya
que se realizan un alto número de aplicaciones, produce abundantes conidias como
inóculo primario, tiene un amplio rango de hospedantes, eficiente diseminación y
alto grado de variabilidad genética. Se ha asociado la resistencia a fungicidas con el
uso de productos con el mismo modo de acción de manera reiterada en una campaña
y para evitarla, se sugiere alternar las aplicaciones con productos de distinto modo
de acción (Latorre y Torres, 2012, Cosseboom, Ivors, Schnabel, Bryson y Holmes,
2019).
A nivel postcosecha, B. cinerea causa muchas pérdidas, debido a que el inóculo
ingresa en campo y la infección se manifiesta durante el trayecto a su destino. Es así
que, con la finalidad de evitar estas pérdidas, se realizan aplicaciones antes de
cosecha para proteger a la fruta durante su almacenamiento y transporte, además se
utilizan atmósferas controladas, con baja cantidad de oxígeno y alta cantidad de
dióxido de carbono para reducir el metabolismo de la fruta y la proliferación de
hongos (Smilanick et al., 2010; Feliziani y Romanazzi, 2016).
3.2.3 Cladosporium sp.
El género Cladosporium está distribuido en diversos ambientes a nivel mundial.
Cladosporium se halla presente en el suelo y en tejido vegetal, donde se hallan como
saprófitos o patógenos secundarios, pues ingresa luego de que otro patógeno inicia
la infección en un determinado hospedante (Bensc, Braun, Goenenwald y Crous,
2012). También pueden estar presentes en las plantas como endófitos y al sufrir un
21
período de estrés por falta de agua o deficiencia nutricional, pasa a comportarse como
patógeno (Zhang et al., 2010).
Este patógeno afecta flores, ocasionando necrosis de la flor completa y sobre ella se
presenta un micelio de color gris o verde con abundante esporulación, los cuales son
dispersados por el viento (Nam, Park, Kim, Kim y Kim, 2015). En frutos de
mandarina causa manchas negras pequeñas durante el transporte, a destino en
empaques que favorecen la humedad, cuyo micelio se expande sobre la piel del fruto
y finalmente se observan manchas de mayor tamaño similares al hollín, cabe señalar
que las zonas adyacentes al micelio se tornan blancas (Tashiro, Noguchi, Ide y
Kuchiki, 2013). Los síntomas que se observan en hojas de tomate afectadas por este
patógeno, se observa lesiones amarillas de forma irregular en zona adaxial y
esporulaciones grisáceas debajo de las lesiones (Robles-Yerena et al., 2019). En
bayas de uva causa pudrición superficial con presencia de micelio esporulante de
color verde olivo (Briceño y Latorre, 2008). Briceño y Latorre (2008) determinaron
que Cladosporium cladosporioides y C. fulvum crecen en un rango de temperatura
de 0-30 °C y que su temperatura óptima de crecimiento es 20 ° C.
Ingresa a la planta a través de heridas, penetración directa o estomas, mediante el uso
de estructuras como los apresorios, que permiten su adherencia. Utilizan un complejo
enzimático para penetrar el tejido, entre las que encuentran hifrofobinas y proteínas
quinasas para la germinación de conidias y formación de apresorio; además utilizan
celulasas, pectinasas, peptidasas, entre otras, para degradar le pared celular
(Malinovsky, Fangel, y Willats, 2014; Yew, Chan, Ngeow y Toh, 2016).
Mengal et al. (2019) evaluaron en condiciones in vitro la inhibición del micelio de
Cladosporium cladosporioides, a la dosis de 200 ppm, y lo resultados muestra que
propineb inhibe 30.5 mm; fosetil de aluminio, 31.5 mm; Iprovalicarb+Propineb, 30.5
mm; Tiofanate metil, 33 mm y Metiram+Piraclostrobin, 36.5 mm. El crecimiento
máximo del testigo es 90 mm. Por otro lado, Serey, Torres y Latorre (2007) evaluaron
22
el desempeño de Hexaconazole (94.44 %), Ppropiconazole (81.53 %), Carbendazin
(84.93 %), Difenoconazole (75.97 %) y Tiofanate metil (51.21 %) frente a
Cladosporium.
3.2.4 Alternaria alternata (Fr.) Keissl.
El género Alternaria presenta especies patógenas y saprófitas de cultivos agrícolas.
Estas especies se hallan distribuidas a nivel mundial y se aíslan de diversas fuentes
como suelo, polvo materia orgánica y de plantas (Oviedo, 2012).
Estas especies ocasionan enfermedades foliares, causando manchas necróticas
mediante la producción de toxinas, que reducen el potencial fotosintético. Al afectar
la parte foliar, no suelen degradar los haces conductores, ni interferir con el transporte
de nutrientes y agua. Las esporas se diseminan hacia tejidos sanos a través del viento
y son las áreas debilitadas de la planta, las más susceptibles a la infección por
Alternaria spp. El micelio puede permanecer latente en restos de plantas esparcidos
por el campo hasta que se instale el hospedante. Otra característica importante, es la
producción de metabolitos secundarios, que sirven para para ayudar al proceso de
patogénesis, en la calidad y en la industria alimentaria (Pavón Moreno, 2012).
A nivel postcosecha, Alternaria spp, causa pudrición de frutos; sin embargo, existen
alternativas para evitar estos daños, como las películas a base de quitosano que
recubren el fruto, formando una barrera mecánica que lo protege de las infecciones
de levaduras, hongos y bacterias. El quitosano se adhiere a la plasmamembrana de
los hongos, favoreciendo las interacciones entre las cargas positivas de aquel y las
negativas de los fosfolípidos de éste, lo cual favorece su ingreso al citoplasma,
ocasiona la pérdida de la homeostasis de la célula, y finalmente, hay una pérdida de
cationes, lo que lleva a la muerte celular (Ramos-García et al., 2010).
23
El ciclo de Alternaria alternata se inicia con la infección de hojas de cítricos. Las
conidias, producidas sobre las manchas necróticas, se liberan favorecidas por la
lluvia o el rocío de la mañana, y se diseminan vía aérea. Una vez que llegan a la
superficie de hojas o frutos, germinan e inician la producción de la toxina, en
presencia de humedad, finalmente el patógeno ingresa al tejido vegetal por el estoma
o de forma directa (Figura 4) (Akimitsu, Peever y Timer, 2003).
Figura 4. Ciclo de la enfermedad de Alternaria alternata, agente causal de la mancha marrón de los
cítricos (Chung, 2012).
3.3 Formulación de productos para el control de enfermedades
3.3.1 Tipo de formulaciones
3.3.1.1 Concentrado soluble (SL)
Los concentrados solubles contienen ingredientes activos que son solubles en agua,
tienen partículas en suspensión y para que éstos humecten la superficie del follaje se
agregan surfactantes. El solvente de la formulación es el agua o sustancias solubles
en agua y tienen una apariencia clara. Estas formulaciones son muy estables y
presentan pocos problemas en almacén (Dipak, Karmakar, Poi, Bhattacharya y
Mondal, 2017).
24
3.3.1.2 Concentrado emulsionable (EC)
Los concentrados emulsionables son formulaciones cuyos ingredientes activos son
solubles en solventes no polares. Estos activos se formulan en solventes orgánicos y
emulsificantes, la cual tiene la apariencia final similar a un aceite y al entrar en
contacto con el agua emulsiona, dando como resultado una emulsión de apariencia
“lechosa” estable y sin separaciones de fases aceitosa o acuosa (Dipak, Karmakar,
Poi, Bhattacharya y Mondal, 2017).
3.3.1.2Emulsión aceite en agua (EW)
Estas formulaciones se basan en agua y presentan ventajas frente a los concentrados
emulsionables de no contener solventes orgánicos, disminución de costos, manejo
seguro durante la producción transporte, razones por las que este tipo de formulación
está siendo tomada en cuenta hoy en día frente a un concentrado emulsionable. El
principio activo tiene muy poca solubilidad en agua, por tanto, se disuelve en un
solvente inmiscible en agua (Hazra, 2015; Dipak, Karmakar, Poi, Bhattacharya y
Mondal, 2017).
25
IV.
4.1
DESARROLLO DE LA EXPERIENCIA PROFESIONAL
Situación encontrada
La empresa tenía pocos meses de haber iniciado la formulación local de plaguicidas y
fertilizantes y para ello había destinado un solo ambiente provisional para esta actividad,
dado que no existía un laboratorio construido para esta área. En cuanto a capital humano,
solo contaba con la presencia de un profesional del área química. Este laboratorio estaba
destinado solo a la formulación de productos de origen químico.
En este contexto, inicialmente se apoyó en la formulación de fertilizantes y luego de
plaguicidas químicos, a la par se trabajó en el desarrollo del primer producto en base a
extracto vegetal. Si bien no se contaba con la formación profesional para formular, las bases
que brinda la carrera de agronomía, como química y bioquímica, sirvieron de apoyo para
comprender el proceso y el análisis en el desarrollo de formulaciones. El conocimiento de
botánica sistemática y fisiología vegetal también contribuyeron al entendimiento de cómo
influyen las especies vegetales y manejo del cultivo en los extractos vegetales, así como
comprender la finalidad y funcionalidad en campo de las formulaciones que se realizaban.
También es importante señalar, que la formación profesional permitió ayudar a los
compañeros de otras carreras a entender mejor las características que deben presentar
algunos productos para un mejor desempeño en campo, ya que, si bien cuentan con la
experiencia en formulaciones, su conocimiento sobre las características de plantas, plagas y
enfermedades era limitado.
Acerca de la evaluación de eficacia de los productos desarrollados, se realizaban solo en
ensayos instalados en campo, puesto que no contaban con un profesional del área agrícola y
tampoco con un laboratorio de análisis de eficacia productos formulados. En ese sentido, las
evaluaciones en campo toman tiempo, implican el envío de muestras grandes, hay que
26
considerar que los insumos para el desarrollo de productos en algunos casos pueden ser
limitados, y son costosas, por lo cual se apoyó la idea de realizar evaluaciones en laboratorio,
previo al análisis de campo, pues permitía una evaluación rápida y menos costosa, además
de que se tendría mayor certeza del control sobre los patógenos, pues en campo, es difícil
evaluar la eficacia en algunos patógenos por su baja presencia.
Por otro lado, en lo referente a la propuesta de los proyectos, es decir los productos nuevos
a desarrollar en el laboratorio eran determinados por la gerencia técnica. Sin embargo,
debido a la formación profesional, se tenía conocimiento de la importancia que estaba
cobrando el control de enfermedades con productos biológicos, por otro lado, la cartera de
productos de la empresa contaba con muy pocos biológicos, por lo cual se incentivó a realizar
investigaciones con un mayor número de extractos para el desarrollo de las formulaciones,
y es así que se propuso trabajar con extracto de citronela, menta y canela.
4.2
Contexto
Los cultivos agrícolas son afectados por plagas y enfermedades que disminuyen los
rendimientos y la calidad de los productos cosechables. Los agentes que producen
infecciones son bacterias, virus, hongos y nematodos, disminuyendo su calidad, condiciones
organolépticas, condiciones nutritivas y vida postcosecha. Estas infecciones se producen a
lo largo de las diferentes etapas fenológicas del cultivo, incluso hasta la etapa de
almacenamiento. De allí, la importancia de estos microorganismos y de su control durante
el desarrollo de las plantas en campo y hasta su llegada al consumidor final.
Los hongos fitopatógenos constituyen los principales microorganismos que causan
enfermedades en el país, debido a que son responsables de la mayoría de epifitias de los
cultivos que se desarrollan en el Perú. Estos microrganismos afectan a varios frutales y
vegetales debido a que cuentan con numerosas enzimas que los facultan para romper los
polímeros que se encuentran en las células vegetales a moléculas más simples para ser
utilizados como fuente alimento. Por otro lado, los frutos y vegetales presentan
características como concentración de solutos, potencial de agua, pH y temperatura que los
hacen susceptibles al ataque de estos fitopatógenos.
27
Tradicionalmente se utilizan productos formulados con moléculas de origen sintético para
el manejo de estos fitopatógenos y, así proteger o disminuir las pérdidas de rendimiento del
cultivo. Sin embargo, estas moléculas presentan algunos problemas como los residuos
tóxicos en las plantas y que afectan la salud humana. Un ejemplo lo constituyen los triazoles
que son un grupo químico que inhibe la síntesis de ergosterol en la membrana celular de los
hongos; éstos evitan el crecimiento de hongos en plantas y en fruta, pero pueden permanecer
en el producto comestible hasta que éste llega al consumidor, si el periodo entre la cosecha
y la aplicación es corto.
Otro efecto perjudicial del uso de químicos sintéticos en el control de enfermedades es la
aparición de resistencia en los fitopatógenos. Esta generación de resistencia es producto del
abuso de las aplicaciones de la misma molécula que tiene efecto sobre el mismo proceso
fisiológico en los patógenos y que causa una selección de individuos que son tolerantes y
luego resistentes a la acción de éstos. En consecuencia, con el tiempo se observa que la dosis
de aplicación recomendada ya no es eficaz en el control de la enfermedad, por lo que se
incrementa y se continúa realizando una selección de individuos resistentes, esta vez a una
dosis mayor. Este tipo de manejo ocasiona que se generen poblaciones resistentes a los
fungicidas, que se dispersan a zonas aledañas y que, con el tiempo, se vuelve un problema a
nivel de región o país.
La manipulación de estos productos químicos por los seres humanos puede generar efectos
tóxicos cuando no se utiliza los equipos de protección personal y si es prolongado, con el
tiempo pueden aparecer efectos de infertilidad (Cavieres, 2004). De la misma forma,
ocasiona efectos de intoxicación a los seres humanos que se encuentra viviendo en zonas
aledañas a los campos de producción de cultivos, dado que las aplicaciones son arrastras por
el viento hacia zonas circundantes, según la dirección del viento.
Estos productos sintéticos permanecen por largo tiempo en el ecosistema, puesto que no se
degradan rápidamente, ocasionando problemas como la contaminación de fuentes de agua
28
y, en consecuencia, intoxicación de animales en ríos y mares; contaminación del suelo y del
aire.
Además, los productos químicos están limitados para su aplicación en etapas cercanas y
durante cosecha en campos de manejo convencional; y, se hallan restringidos para el uso en
agricultura orgánica. Este es un punto importante, en vista de que las grandes extensiones de
cultivos se destinan principalmente al mercado de exportación y son, precisamente estos
mercados, los que limitan la variedad de moléculas químicas disponibles.
Finalmente, las aplicaciones de estos productos sintéticos para el control de enfermedades
resultan costosos, pues se presumen que representan la quinta parte del costo total de
producción del cultivo.
Los perjuicios que ocasionan los pesticidas químicos se han realizado investigaciones para
hallar nuevas formas de control de las enfermedades de los cultivos. Estos métodos deben
incluir el uso de sustancias de origen natural para reemplazar a los productos químicos o
utilizarlos de forma alternada en los programas de manejo integrado de cultivos.
Las plantas son fuente de metabolitos secundarios, que no son esenciales para su desarrollo,
y son utilizados como medio de defensa naturales contra patógenos. Estos metabolitos tienen
efecto antimicrobiano, no son dañinos al medio ambiente, ni al ser humano, no contienen
metales pesados, no generan resistencia en los patógenos y no tienen efecto residual por
largo tiempo en las plantas. Otro punto a favor del uso de extractos de plantas, es que son
aceptados por los mercados de destino de exportación y que muchos de ellos, son utilizados
en la industria cosmética y alimentaria, demostrando así su carácter inocuo. Por lo tanto,
son una buena opción como alternativa para reemplazar el uso de pesticidas químicos.
29
4.3
Proceso de selección del extracto vegetal potencial
El desarrollo o formulación de productos destinados al uso agrícola consta de varios pasos a
través de los cuales se evalúa que éstos cumplan con las características deseadas dentro de
los parámetros de calidad para ofrecer al cliente un producto final óptimo (Figura 5).
Cada producto de uso agrícola que sale a la venta es el resultado final de un proyecto. Este
proyecto inicia para suplir la necesidad de control de un fitopatógeno que causa una
enfermedad en un cultivo determinado, con un producto de origen biológico, en este caso un
extracto vegetal.
Existe un amplio abanico de posibilidades en cuanto a especies vegetales que ofrecen
potenciales beneficios para el control de microorganismos patógenos, bacterias y hongos,
que han sido ampliamente estudiados en áreas de salud, alimentos, cosmética y agrícola.
Para realizar una adecuada elección de un extracto de determinada planta es importante
comprender qué es un extracto y cómo está compuesto. En esta línea, un extracto vegetal se
obtiene de raíces, hojas, tallos, flores, frutos y raíces mediante maceración con solventes.
Estos extractos pueden ser utilizados para evaluar su actividad antimicrobiana pero también
puede purificarse. La eliminación de la fracción acuosa del extracto crudo permite obtener
aceites esenciales que contienen los compuestos volátiles que se producen en los tricomas
de algunas plantas. De la misma forma, se pueden separar los compuestos presentes en los
aceites esenciales y obtener estas sustancias en su forma pura. Estos compuestos son los
metabolitos secundarios.
Los extractos vegetales están conformados por varios metabolitos secundarios en distintos
porcentajes, es así que, si bien dos extractos vegetales pueden tener los mismos metabolitos,
pero su porcentaje podría variar en relación al otro, en consecuencia, también sus
propiedades antioxidantes, antimicrobianas, etc. Sin embargo; siempre hay un metabolito
30
que se encuentra en mayor porcentaje, respecto a los demás, el cual va a determinar el
quimiotipo. Dicho de otro modo, el metalito secundario predominante es el quimiotipo.
Las propiedades antimicrobianas de un extracto vegetal son ejercidas por el conjunto de
sustancias que lo componen. Aunque la mayor responsabilidad del efecto es del quimiotipo,
los demás metabolitos también tienen influencia, pues puede haber un efecto sinérgico o,
también, antagónico entre ellos.
Entonces, al ser el metabolito mayoritario es el que va a ejercer el mayor efecto control sobre
el patógeno, es importante tener clara su identidad y el rango de porcentaje en el que debe
estar presente en el extracto. Estos metabolitos pueden estar presentes entre un 40-60 % o
60-80 % y el porcentaje restante lo componen otros metabolitos secundarios. Cabe señalar
que, el segundo compuesto en mayor presencia también puede impactar en el porcentaje de
control del patógeno. Debido a lo anterior, es importante tener claro la composición del
extracto que requerimos.
Otra alternativa es trabajar con el metabolito secundario puro ya que, al ser el responsable
en gran medida de la inhibición del fitopatógeno, resulta una alternativa. Aunque, es
importante analizar el costo-beneficio, pues estos suelen ser más costosos que un extracto
vegetal.
Otros factores que también influyen es la zona geográfica de origen, ya que la altitud y la
radiación influyen en la síntesis de los metabolitos secundarios. En relación a este punto,
también se debe tener claro el nombre científico de la especie vegetal, ya que en varios países
distintas existen distintas especies con el mismo nombre común, Un ejemplo de ello es el
orégano, que Perú es Origanum vulgare, pero en México se le llama orégano a Lippia
graveolens.
31
Selección del
extracto vegetal
Formulación del
extracto vegetal
¿Cumple los
requisitos de
calidad?
No
Realizar los ajustes
en la formulación
Sí
Pruebas de eficacia
¿Tiene la eficacia
deseada sobre el
patógeno?
No
Sí
Registro del producto
Producción en planta
Comercialización
Consumidor final
Figura 5. Flujograma del proceso de formulación de extractos vegetales hasta su llegada al consumidor final.
32
El órgano vegetal de donde se realiza el extracto tiene gran impacto en la composición de
sustancias metabólicas, pues se sintetizan solo o en mayor cantidad en ciertas zonas de la
planta. El caso del extracto de canela (Cinnamomum zeylanicum) es un ejemplo de la
importancia de determinar cuál es el órgano vegetal del cual se realiza la extracción; las
raíces de esta especie contienen en mayor cantidad alcanfor, las hojas contienen mayormente
eugenol y la madera contiene en mayor porcentaje cinnamaldehído. Finalmente, la etapa
fenológica también influye en la composición del extracto.
Una vez que se tiene claro las características del extracto vegetal que deseamos, se procede
a realizar cotizaciones con proveedores, a los cuales se debe indicar el nombre científico de
la planta, el componente que debe estar en mayor cantidad, por ello es importante saber el
grupo al que pertenece el metabolito porque hay nombres parecidos que solo se diferencian
en el sufijo, y en algunos casos indicar el órgano vegetal del cual debe provenir. Una forma
de evitar confusiones, por el hecho de que un proveedor tiene varias presentaciones de
extractos de una misma planta o los nombres de los metabolitos secundarios son muy
similares, es preferible manejar las características del extracto mediante número CAS, ya
que éste es único para cada sustancia existente. Éste es un paso importante porque el
potencial de un extracto vegetal no solo radica en sus características químicas o biológicas,
sino en su costo puesto en puerto nacional. Si bien un extracto puede tener el mejor
desempeño reportado por la literatura, y tener un proveedor que comercializa el extracto
según el quimiotipo deseado, pero resulta muy costoso, no tendría potencial para ser
utilizado para el control de enfermedades en el mercado peruano, ya que los clientes no lo
comprarían y no sería rentable para la empresa formuladora.
El análisis de costo tiene dos aspectos principales: el costo de los productos de referencia de
extractos vegetales en el mercado y el margen de ganancia que plantee el área comercial. El
estudio de mercado se realiza para determinar el precio de venta de los productos comerciales
de referencia y se saca un promedio, pues éste no debería ser mucho mayor al promedio
porque podría no ser aceptado por los clientes. El margen de ganancia del precio de venta,
se establece según el análisis del área comercial. Otro costo que influye en el precio del
33
producto formulado, es el costo de producción, el cual está en función de las horas hombre
por tipo de formulación del producto, de los costos de energía y del desgaste de la
maquinaria. El rango del costo de formulación propuesto es la diferencia del precio de venta
y el margen de ganancia. Éste usualmente incluye el costo del extracto vegetal, de los
aditivos, del frasco o bolsa, etiqueta, caja y horas hombre. Una vez que tenemos el rango de
precio de formulación podemos compararlo con el de las cotizaciones y evaluar si están
dentro de dicho rango, si fuera así sería un extracto vegetal potencial en cuanto a la
composición de metabolitos secundarios y precio.
Algunos de los proyectos trabajados, en una empresa del sector agrícola, incluyeron extracto
de canela, extracto de orégano, extracto de menta y extracto de citronella para el control de
Botrytis cinerea. Se eligieron estas especies vegetales porque existen muchos reportes
científicos sobre sus propiedades antimicrobianas (Dehghani, Afsharmanesh, Salarmoini, y
Ebrahimnejad, 2018; Huang, Xu, Liu, Zhanf y Hu, 2014; Hoang, Lee y Adukwu, 2020).
El carvacrol es un compuesto fenólico que tiene buen efecto antifúngico, reportado
ampliamente como antimicrobiana en estudios realizados en la industria alimentaria y
medicina, por lo que se decidió trabajar con él. Este metabolito secundario se halla presente
en orégano y tomillo, pero es predominante en la planta de orégano, y dentro de esta Lippia
graveolens y Origanum vulgare contiene este metabolito; no obstante, la especie O. vulgare
tiene mayor porcentaje, por lo que se decidió trabajar con esta especie.
En el caso del extracto de canela se decidió trabajar con la especie Cinnamomum cassia,
pues contenía un alto grado de cinnamaldehído comparado con el extracto de C. zeylanicum
proveniente de hojas, que era con el que contaba el proveedor consultado. Cabe señalar que,
el extracto de madera de C. zeylanicum contiene en mayor cantidad cinnamaldehído.
Existen varias especies de menta, no obstante, se eligió el extracto de Mentha pulegium por
los reportes revisados y cuyo mayor compuesto es una cetona, llamada pulegona. El extracto
34
de citronella también es frecuentemente nombrado en los estudios de extractos de plantas
con propiedades antimicrobianas por lo que se eligió trabajar con Cymbopogon sp., cuyo
mayor constituyente es un aldehído, el geranial.
4.4
Proceso de formulación del extracto vegetal potencial
Luego de elegir el extracto vegetal a trabajar, sigue la etapa en la que se realiza el desarrollo
de un producto biológico, cuyo ingrediente activo es dicho extracto, y que se comercializará
para el control de enfermedades agrícolas.
4.4.1 Formulación
La etapa de formulación del producto inicia cuando se tiene el principio activo, en
este caso el extracto vegetal, en el laboratorio (Figura 6). El paso inicial es elegir el
tipo de formulación a realizar, lo cual está en función a las propiedades
fisicoquímicas del extracto vegetal a utilizar, por ejemplo, si es un aceite esencial o
un compuesto fenólico, a la evaluación del costo y a las preferencias del cliente final,
que lo indica el área técnica, en ciertos casos.
Los extractos vegetales insolubles en agua se pueden formular como concentrados
emulsionables, concentrados solubles o emulsión aceite enagua. Esto dependerá de
la naturaleza del extracto, por ejemplo, si es un metabolito secundario puro como el
mentol, que es un alcohol, podría disolverse en un alcohol y en base a esto formularse
un aceite en agua; otro factor a considerar es la concentración del activo en el
producto final, por ejemplo, si se formula con un extracto mayor al 60 % podría
formularse como concentrado emulsionable porque habría que añadir los surfactantes
y emulsionante probablemente se llegaría a un 100 %. También se debe tener en
cuenta los costos del producto formulado, pues uno que lleve agua en su
composición, como una emulsión aceite en agua, será menos costoso que un
concentrado soluble, porque en la composición de éste, todos los aditivos tienen un
mayor costo que el agua. Además, el costo del extracto también influye en la elección
del tipo de formulación, ya que, si el activo tiene un costo alto, para disminuir los
35
costos, sería conveniente que la formulación lleve agua. En el caso de formular un
concentrado soluble, se puede realizar cuando el porcentaje del extracto en la
formulación es bajo, pues si bien no es soluble en agua, al estar en baja proporción,
con la ayuda de tensoactivos y al estar el agua en un porcentaje alto, se comporta
como un concentrado soluble al mezclarse para la aplicación.
Luego de elegir el tipo de formulación, se inician con los ensayos de las mezclas del
extracto vegetal con los aditivos hasta lograr estabilizar el producto. La estabilización
del producto se logra con tensoactivos que favorecen la mezcla de los extractos en
agua, favorecen en algunos casos la emulsión y la humectabilidad del producto sobre
el tejido vegetal. Finalmente, se deja en observación para determinar si hay
separación de los componentes del producto con el pasar de las horas, usualmente
durante 24 horas.
FACTORES A CONSIDERAR EN
LAS FORMULACIONES
PATÓGENO
OBJETIVO
TIPO DE
FORMULACIÓN/EQUIPO
COSTO
SUPERFICIE A SER
PROTEGIDA
Figura 6. Factores que intervienen en la formulación de productos para el control de enfermedades.
En función al costo se preparó el extracto de orégano como concentrado soluble (CS)
al 2.91 %; los extractos de citronella y canela se formularon al 30 % como
concentrados emulsionables (CE), se formularon por indicación directa de gerencia
técnica; y finalmente, el extracto de menta se formuló como emulsión aceite en agua
(EW) al 10 %, también en función a la evaluación del costo.
36
4.4.2 Pruebas fisicoquímicas
Las pruebas fisicoquímicas tienen el objetivo de evaluar el cumplimiento del
producto formulado con las características de calidad establecidas por la FAO para
un determinado tipo de formulación. Las evaluaciones de densidad, pH y pruebas de
almacenamiento son comunes a todos los productos formulados, pero existen otras
evaluaciones como viscosidad, estabilidad de la emulsión o solubilidad que se
emplean según el tipo de formulación del producto o solicitud del ente formulador o
requerido para realizar un control de calidad más exhaustivo. Estas pruebas se llevan
a cabo en el laboratorio de investigación y desarrollo. Es importante señalar que, el
análisis de ingrediente activo se realiza a todo tipo de formulaciones con la finalidad
de comprobar la identidad y lo realiza el área de control de calidad dado que contaban
con los equipos necesarios para esta evaluación, los mismos que utiliza para efectuar
el análisis del control de calidad a los lotes de producción.
Una vez que se ha realizado los controles fisicoquímicos y se tienen los datos se
procede a elaborar la documentación del producto, la cual se adjunta al expediente
que se ingresa a SENASA para iniciar el proceso de registro y para la evaluación que
se realiza a cada lote de producción por parte del área de control de calidad. Esta
documentación incluye especificación, certificado de composición, certificado de
análisis, certificado de análisis de metales pesados y certificado de estabilidad.
Las pruebas realizadas a la formulación con extracto de orégano, al ser un SL, fueron
estabilidad de la solución, pH y espuma persistente. En el caso de los extractos
formulados como CE, se realizaron medición de pH, estabilidad de la emulsión y reemulsión, y persistencia de la espuma. La emulsión aceite en agua (EW) se midió el
pH, capacidad de vertido y la estabilidad de la emulsión y re-emulsión. Todas las
evaluaciones se ejecutan a temperatura ambiente y en almacenamiento.
37
4.5
Proceso de evaluación de principio activo como futuro prospecto
Luego de tener el producto biológico formulado en base a un extracto vegetal, se debe
evaluar el nivel de control sobre el fitopatógeno causante de la enfermedad agrícola para el
cual se planteó su desarrollo en la etapa inicial (Figura 7).
4.5.1 Pruebas de eficacia
Las pruebas de eficacia de los productos formulados con extractos constituyen un paso
importante en su desarrollo, pues permiten definir el potencial del extracto vegetal en el
control de una enfermedad específica. Estas pruebas incluyen evaluaciones in vitro, in vivo
y en invernadero (Figura 6). Debe señalarse que se realizan en el orden indicado.
Las pruebas in vitro se realizan con patógenos que puedan cultivarse en medio de cultivo
sintético, esta característica corresponde a aquellos que son necrótrofos, pues se alimentan
de moléculas simples degradadas de polímeros presentes en los tejidos de las plantas. Por
consiguiente, para obtener el fitopatógeno en el laboratorio, deben de aislarse de muestras
traídas de campo con la sintomatología de la enfermedad.
Las muestras de campo se desinfestan y se siembran en medio de cultivo para que los
microorganismos presentes en la zona afectada del tejido desarrollen. Otra opción es realizar
cámaras húmedas con las muestras, ya que al otorgarle un medioambiente húmedo se
favorece el crecimiento de fitopatógeno. En cualquiera de los casos, se debe presentar la
esporulación para realizar la identificación, aislar y purificar el patógeno de interés para
utilizarlo como inóculo en las evaluaciones del producto.
Una vez, realizado el aislamiento del fitopatógeno se ejecutan los ensayos de eficacia in
vitro, ya sea con micelio o esporas. Las pruebas in vitro con micelio se realizan al mezclar
el medio de cultivo con el producto biológico, a la dosis a evaluar, agregarlo a la placa Petri
y cuando haya solidificado, se siembra un disco de agar que contiene el micelio en pleno
crecimiento del fitopatógeno en cuestión, en el centro de la placa. Estas placas se incuban a
38
la temperatura óptima de crecimiento para el patógeno, la cual está ligada a la estación en la
suele presentarse en campo, hasta que el testigo llene la placa. Se tiene un testigo, al cual no
se le añade ningún producto al medio de cultivo.
Para realizar las pruebas sobre esporas, se debe tener colonias con abundante esporulación
del patógeno, con las cuales se preparan una suspensión de esporas. Esta suspensión se
coloca sobre un medio de cultivo mezclado con el producto biológico a evaluar.
Aproximadamente después de 24-48 horas de la instalación, se realiza la observación para
determinar si han germinado o no y, por ende, si el producto inhibe la germinación.
Ambas evaluaciones son importantes para caracterizar el desempeño de los productos
biológicos formulados en base a extractos vegetales. Algunos extractos tienen efecto como
inhibidores del crecimiento de micelio y germinación de esporas, pero en otras ocasiones
tienen un mejor desempeño frente a esporas y no sobre micelio o viceversa.
Las pruebas in vitro permiten determinar el porcentaje de control del patógeno objetivo. El
control puede ser nulo, parcial o del 100 %. Cuando el control es nulo o muy bajo,
generalmente se descarta el producto formulado como opción de control para el patógeno
evaluado; no obstante, se puede evaluar su eficacia frente a otros fitopatógenos, pues es dable
que algunos extractos no presenten eficacia frente a ciertos fitopatógenos y frente a otros sí.
En otras ocasiones, el control está por encima del 50 %, en este escenario existe la opción
de concentrar el extracto en la formulación o aumentar la dosis, pero en este punto se debe
realizar una evaluación de cómo se vería afectado el costo del producto y del porcentaje que
se desee obtener con el producto formulado. Finalmente, si el control es del 100 %, se debe
conocer cuál es la dosis mínima a la que hay un control del 100 % y luego se inician las
evaluaciones en frutos o invernadero.
Los patógenos de importancia son aquellos que causan enfermedades en varios cultivos de
agroexportación, los cuales tienen como destino los mercados de USA, Europa y Japón, por
39
tal motivo tienen restringido el uso de pesticidas químicos para evitar los residuos en los
alimentos, es así que los productos biológicos son una alternativa para el manejo de las
enfermedades ocasionadas por tales patógenos. Se ha observado que los fitopatógenos que
están presentes en los cultivos destinados a los mercados extranjeros son Botrytis cinerea,
que afecta al arándano y uva de mesa; Lasiodiplodia theobromae causante de pudrición de
tejidos en el cultivo de palto, arándano y mango; Cladosporium sp., afecta mandarina y palto;
y finalmente, Alternaria alternata, que afecta a las mandarinas. Es por ello que, si un extracto
es eficaz o no para el fitopatógeno objetivo inicialmente, es importante evaluar el control
sobre otros patógenos de importancia, pues éstos afectan a cultivos con grandes áreas de
instalación.
Otro método de evaluación son las pruebas en frutos y para ello, se desarrolla la metodología
de inoculación del patógeno en los frutos a utilizar. Las evaluaciones se repiten por lo menos
3 veces para disminuir el error. Este tipo de prueba resulta útil cuando el producto formulado
controla al 100 % en las pruebas in vitro, ya que permite establecer diferencias en la eficacia
de las dosis o para casos en los que no se presenta la enfermedad en campo, o el inóculo es
muy bajo.
También se realizan pruebas en invernadero, luego de tener una dosis tentativa producto de
los ensayos realizados en la fase in vitro y en frutos. De la misma forma que en las pruebas
anteriores, se debe implementar una metodología de inoculación y evaluación del patógeno
objetivo en el cultivo a ensayar, para esto es necesario conocer en qué etapa del cultivo se
presenta el fitopatógeno, cuál la forma de infección y cuáles son las condiciones que
favorecen la infección. En este sentido se realizaron pruebas en fresa inoculando Botrytis
cinerea para la evaluación del extracto de orégano y canela. Se decidió trabajar con este
fitopatógeno, pues se quería evaluarlo en el cultivo de uva en campo; sin embargo, el
fitopatógeno no se presentaba en campo y tampoco, se realizó en el cultivo de fresa en campo
debido a que usualmente se realizan constantes aplicaciones de productos de origen químico
y se sospechaba que éstos podrían tener efecto residual e influir en los resultados del ensayo,
es así que se decide cultivar fresa en invernadero para realizar los ensayos.
40
Por último, se envía la muestra del producto formulado para los ensayos de campo. Estas
pruebas son el último filtro antes de iniciar el proceso de registro en el ente regulador del
producto y el que determinará si el potencial del extracto hallado en laboratorio se replica en
campo. En ese sentido, si los resultados de los ensayos en campo no muestran un control
esperado, usualmente por encima del 85 %, se opta por una reformulación, y se vuelve a
enviar a pruebas en campo ya que, en este punto, las evaluaciones in vitro tienen un control
alto y el filtro serían las evaluaciones en campo. La reformulación implica realizar una
mejora en el desempeño del producto, mediante la concentración del extracto en la fórmula,
cuando el precio lo permite, siendo éste el principal factor a analizar en este punto. En este
escenario, es importante que la reformulación cumpla los mismos parámetros de calidad que
los evaluados inicialmente.
Una vez logrado el control esperado en campo, se inicia el proceso de registro, dado que se
ha demostrado el potencial del extracto vegetal para el control de la enfermedad ocasionada
por el patógeno objetivo.
La importancia de las evaluaciones realizadas en laboratorio es que permiten determinar si
el extracto vegetal tiene potencial para ejercer control sobre una determinada enfermedad
y/o la dosis más efectiva, y así colaborar con la reducción de los ensayos de campo porque
se envía la muestra con una o dos dosis a evaluar, además permite reducir costo del producto,
pues se utiliza el mínimo porcentaje efectivo en la composición. Además, permiten la
evaluación de la eficacia frente a varios fitopatógenos al mismo tiempo, discriminar su
comportamiento frente al micelio y conidias, evaluar el tiempo de control y comparar el
efecto frente a diferentes aislamientos. En otras palabras, permiten caracterizar el desempeño
del producto formulado en base a un extracto vegetal de manera mas clara, comparado si es
que se enviaría directo a pruebas de campo, y a menor costo y tiempo.
41
PRUEBAS DE EFICACIA
IN VITRO
IN VIVO
INVERNADERO
CAMPO
Figura 7. Tipo de evaluaciones realizadas a los productos para el control de enfermedades durante su
desarrollo. Factores que intervienen en la formulación de productos para el control de enfermedades.
Como parte del análisis del potencial de los extractos trabajados, se realizaron pruebas in
vitro para determinar si la concentración a la que se trabajó tenía eficacia sobre el patógeno
objetivo, en este caso fue Botrytis cinerea (Tabla 1 y Figura 8).
Tabla 1. Resultados de la evaluación in vitro de los extractos de citronela y canela frente a Botrytis
cinerea.
CRECIMIENTO
(mm)
INHIBICIÓN
(%)
42.5
0
1 g/L
0
100
Citronella 30%
2.5 ml/L
0
100
Canela 30%
2.5 ml/L
0
100
TRAT.
PRODUCTO
I.A.
DOSIS
T1
Botrytis cinerea
Botrytis cinerea
T2
Cyprodinil +
Fludioxonil
Cyprodinil + Fludioxonil
T3
Extracto 1
T4
Extracto 2
Las pruebas realizadas en laboratorio mostraron que los extractos de citronela y canela, a la
concentración de 30 %, presentaban un control del 100 %, por lo cual se pasó al siguiente
paso, pruebas en frutos.
42
T1
T2
2
T3
T4
Figura 8. Prueba in vitro de extractos de citronela y canela frente a Botrytis cinerea.
4.6
Problemática y desafíos
Durante el desarrollo de labores se presentaron varios desafíos producto de las nuevas
labores que se implementaban en el área de I+D, los proyectos encomendados y los
relacionados al producto comercial.
El primer desafío fue el aprendizaje del proceso de formulación, dado que durante la
formación de la carrera de agronomía no imparten estos conocimientos, aunque los cursos
generales de química al inicio de carrera me sirvieron como punto de inicio. Asimismo, los
controles fisicoquímicos y la elaboración de la documentación de los productos formulados.
Otro desafío fue realizar los trabajos sin contar con un área para dicha actividad, ya que se
trabajó durante los primeros años en un espacio provisional y reducido. De allí se
implementó, en la medida de lo posible, las metodologías para realizar el aislamiento de
fitopatógenos, pruebas de eficacia en laboratorio y el proceso de formulación de productos.
43
También se presentó el desafío de diseñar las áreas destinadas a los trabajos de fitopatología,
en el proyecto de construcción de laboratorios de la empresa, para la evaluación de la eficacia
de los extractos vegetales, las cuales estarían dentro del laboratorio de investigación y
desarrollo agrícola. Estas áreas comprendían un área de aislamiento de patógenos, de
preparación y esterilización de medios, un invernadero y un área destinada a la crianza de
insectos.
Finalmente, el desafío de liderar el área de productos biológicos, es decir proponer los
nuevos extractos vegetales a partir de los cuales se formularían productos para el control de
enfermedades, la realización de las pruebas de eficacia de laboratorio, el costeo de materias
primas y producto final, así como el envío de muestras para ensayos en campo y la mejora
de la fórmula, según la retroalimentación de los ensayos de campo.
4.7
Competencias y habilidades desarrolladas
Durante el desempeño laboral se contribuye con los conocimientos y experiencia al
crecimiento del centro de labores, pero no es una relación unilateral, sino que hay un
beneficio mutuo, pues contribuye a la formación de competencias y habilidades, tales como
las intelectuales, personales, interpersonales y organizacionales, que son el producto de las
diferentes situaciones y desafíos a los que se hace frente.
Las competencias intelectuales se mejoran durante el ejercicio de las actividades diarias.
Estas competencias son la solución de problemas, la toma de decisiones y la creatividad. El
desarrollo de productos de uso agrícola plantea desafíos ante los cuales se debe tomar
decisiones para desarrollarlos y se requieren ideas creativas para solucionar los problemas
rápidamente y de manera eficaz.
Las competencias personales desarrolladas fueron la ética, la adaptación al cambio y la
inteligencia emocional. La investigación para la formulación con principios activos
novedosos o poco difundidos en el mercado nacional requiere un compromiso ético en
cuanto a discreción y manejo responsable de la información producida. Por otro lado, es
44
importante señalar que un área de investigación y desarrollo está conformada por un equipo
multidisciplinario, personas de distintos caracteres, con los cuales se busca crear una relación
armónica y de cooperación, para ello es importante el uso de la inteligencia emocional y la
adaptación al cambio.
Las competencias interpersonales que se adquirieron fueron el trabajo en equipo, la
resolución de conflictos, liderazgo y proactividad. El crecimiento de un área o una compañía
se sustenta en el trabajo realizado por los equipos que la conforman, de allí que se necesite
conocer a cada persona que conforma un equipo para poder liderarlos de manera efectiva y
lograr el máximo rendimiento del área en cuestión. No obstante, no solo es importante ejercer
el liderazgo del equipo, sino también la resolución de conflictos, pues la oposición de ideas
puede presentarse dentro del equipo o entre equipos y/o áreas.
Finalmente, las competencias organizacionales aprendidas fueron la gestión de recursos e
información, la orientación de servicio, la orientación a resultados y el aprendizaje a través
de experiencias laborales de otros. Uno de los componentes importantes del manejo de un
área es la apropiada gestión de los recursos, es decir, usarlos de manera eficiente para evitar
los gastos en vano y lograr el máximo beneficio, contribuyendo así a mejorar la
productividad del área. De la misma manera, la gestión de la información debe estar
orientada a la distribución de la data necesaria para que el personal y del área puedan cumplir
con sus funciones, así como proteger, la que sea confidencial. Las áreas dentro de una
organización están interconectadas, siendo proveedores y clientes internos de otras áreas,
por lo cual la orientación al servicio y resultados contribuye al logro de los objetivos, tanto
de unos como de los otros. Cabe señalar que en un equipo multidisciplinario existen muchas
experiencias que contribuyen a enriquecer el conocimiento y la capacidad de decisión de los
demás, por lo que hay que estar abierto a escuchar las experiencias laborales de los demás.
45
V. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1. El proceso de formulación de extractos vegetales con acción sobre fitopatógenos que
causan enfermedades agrícolas tiene dos etapas principales, la primera se refiere a
conocer qué extracto se va a trabajar y definir las características que debería de tener en
función a costo y componentes; y la segunda etapa es la formulación y evaluación de la
eficacia en laboratorio y/o invernadero, frente al fitopatógeno causante de la enfermedad
agrícola a controlar.
5.1.1. Las características que debe tener un extracto vegetal potencial para el control
de una enfermedad son: tener un precio menor al precio al cual se planea
comercializarlo, de tal manera que permita tener el porcentaje de rentabilidad
definida por el área comercial; y debe tener los metabolitos secundarios
característicos de la especie vegetal en un alto porcentaje para desempeñar un
control de o cercano al 100 %.
5.1.2 La formulación del extracto vegetal se basa en las características químicas de
sus componentes y en el tipo de formulación a realizar. Las características permiten
determinar solubilidad y afinidad con los aditivos. El tipo de formulación a realizar
se determina en función al costo y/o a la cantidad del extracto vegetal en el producto
final y sus características químicas.
5.1.3 El potencial de los extractos vegetales formulados se analiza en pruebas de
eficacia a nivel in vitro, in vivo y/o en invernadero frente al o a los patógenos
objetivos que originan las enfermedades agrícolas. Se considera que un extracto
vegetal formulado debe tener un control por encima del 85 % para considerar que
tiene potencial para un buen desempeño en campo.
46
VI.
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