ES / iPS cell culture
Revised by TWL 20180509
1. HES Medium recipe
Table 1.
HES Medium
Gredients
Voulume
DMEM/F12
405ml
15% KOSR
75ml
100X NEAA
5ml
100X P/S
5ml(add to DMEM/F12 previously)
100X L-Glu
5ml
Sodium Biocarbonate
8ml
Sodium Pryrurate
2.5ml
beta ME(55mM)
909ul
bFGF(100ng/ul stock)
50ul
2. Cell passage
（2.1）Coating plate with Matrigel
①准备好预冷的移液管和 dish，以及 1：6 的 Matrigel;（Matrigel 性质：附录 1）
②取 1-2ml 稀释后的 Matrigel，铺到一孔中并晃动平板使其覆盖皿底，使其底部形成 Matrigel 覆盖的一层
膜。吸走孔中的 Matrigel,转移至下一孔重复操作，最后剩余的 Matrigel 液回收;（注意不要将孔内 Matrigel
液完全吸净，残留一点）
③dish 在冰上放置 30min;（水平放置）
④吸尽剩余的 Matrigel，在 37℃恒温培养箱中放置 30min。
（2.2）Preparation of feeder cells (MEFs)
①从液氮中取出 MEF，快速在 37℃水浴锅中融解（速融慢冻）
；
②MEF 融化至剩余小冰块时，从水浴锅中取出，室温融化完全，转移至 15ml 离心管中，加入 IMDM;（尽
量加满，加液时前 2mL 逐滴加入，防止渗透压急剧变化损伤细胞）
③1400rpm 离心 3min，吸弃上清；
④加入 1mL HES 培养液，重悬混匀细胞；
⑤细胞稀释计数：取 10uL 细胞悬液 + 90uL 台盼蓝，吹打混匀后取 10uL 进行细胞计数；
⑥取出 Matrigel-coated plate，接种 0.15M/well or 0.7-0.9M/10cm x dish，十字交叉摇匀;（前后晃动次数
要和左右晃动次数相同）
⑦放置在 37℃培养箱中 5-6h，使细胞贴壁。
（2.3）ES/iPS cell passage
①吸弃原培养液，用 2-3ml/well of 6-well-plate or 8ml/10 cm x dish IMDM 洗涤一次；
②TrypLE 酶消化：根据需要取一定量的 TrypLE 酶与离心管中，在 37℃水浴锅预热。加入 1mL/well or
4mL/10cm×dish TrypLE，放置在 37℃培养箱中消化约 1-3 min，于显微镜下观察细胞形态;（严格控制细
胞在酶中的时间在 3min 以内，且消化较好的状态：细胞边缘变透亮，回缩变圆）
③吸弃 TrypLE 酶，加入 2-3ml/well of 6-well-plate or 8ml/10 cm x dish IMDM，轻轻摇晃后吸弃 IMDM；
④加入 1ml/well or 4ml/10cm×dish HES 培养液，用软刮子刮下细胞，收集到离心管中轻柔的吹打混匀;（刮
完后在显微镜下观察平板是否刮干净，且吹打要轻柔，避免吹打成单个细胞，细胞传代最好的状态是五六
细胞成团）
⑤补充适量 HES，并将细胞接种到细胞板中。
（6 孔板 = 2mL/well ;10cm×dish = 10mL/dish）
3. Cell cryopreservation and reviving
①消化细胞制备成细胞悬液同上（根据冻存管数计算需要的细胞悬液体积）
；
②配制细胞冻存液：18%DMSO + 82%FBS（根据冻存管数计算需要的冻存液）
；
③细胞冻存比例：400uL 细胞悬液 + 600uL 冻存液，每管冻存 1mL 左右。
④细胞复苏与 MEF 细胞复苏步骤相同（PSC 无需计数）
【注意事项】
1.
IMDM 洗涤：2-3ml/well of 6-well-plate or 8ml/10 cm x dish IMDM；
2.
用 IMDM 将 Matrigel 原液按照 1:6 稀释（如：取 0.5ml Matrigel 加 2.5ml IMDM）
；
3.
细胞计数另一种方式就是直接计数，不用台盼蓝稀释；(细胞稀释计数：取 10uL 细胞悬液 + 90uL 台
盼蓝，吹打混匀后取 10uL 进行细胞计数)
4.
ES/iPS 细胞处理过程中不可使用移液枪，要使用移液管，且吹打要轻柔，避免吹打成单个细胞，细胞
传代最好的状态是五六成团；
5.
传代时，为使细胞更好的贴壁，可以使用 6 孔板 = 1mL/well ； 10cm×dish = 5mL/dish。