논문 순서 및 기초 생물학 관련 사이트 논문 종류: research article/review 논문 순서 Abstract : 초록, 전체적인 논문의 summary가 포함되어있다. 초록을 읽는 것만으로 도 논문 주제와 연구 내용을 이해할 수 있어야 한다. 그 이후 논문을 더 자세히 읽을 것인지 결정할 수 있다. 초록은 논문의 요점을 신속하게 확인 하고 전체 내용을 식별하는 데 큰 도움을 준다. Introduction : 서론, 이 실험이 시작하게 된 배경과 선행된 관련 실험들의 대한 내용이 포함되어 있다. 서론의 주요 목적은 독자에게 연구의 배경 정보를 더 자세 히 설명하는 것이다. 서론은 주제 영역에 새로운 이해를 더하기 위해 연구 가 필요한 이유를 전달하기 위해 작성되며, 참조하는 모든 출판물을 기재 해야 한다. Results : 결과, 모은 데이터에 대한 직접적인 description 및 정리된 내용을 포함 하고있다. Discussion : 고찰, Results 가 의미하는 바가 무엇인지를 해석하고 기존에 있던 연구와 어떤 연관이 있는지 비교하는 내용과 이후 진행되어야 할 실험에 대해 서술한다. Materials and methods : 실험 준비물 및 방법, 해당 논문에서 사용된 실험방법 및 기기에 대해 설명한다. References : 참고문헌 Endnote Program for insert reference Pubmed (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/) 논문 검색 site 상세 검색 방법 Atlas_(organ) Ex. https://portal.brain-map.org/ Search RNA and protein expression in tissues or cells Addgene (https://www.addgene.org/) Search plasmid, viral prep, bacterial strain, gene editing tools Non-profit purpose 다음주 준비사항 : sigma plot, graph prism 실험 제목 (Title) 실험 데이터의 통계처리 실험목적 (Purpose of experiments) 실험 데이터의 유의성 검정 실험 배경 (background of study) 실험을 통해 도출한 데이터를 통계적 분석을 통해 유의성 검정을 시행한다. 실험 디자인과 구성에 맞는 통계 방법을 사용하여 실험 결과의 유의성을 판단하고 통 계적 분석의 신뢰도를 높인다. 본 수업에서는 생물학 데이터의 통계 분석에 사용 되는 여러 방법 중 Student’s t-test, One-way ANOVA, Two-way ANOVA, Correlation analysis (Pearson’s correlation analysis)를 배우도록 한다. Student’s t-test : t-테스트 또는 t-검정 또는 Student’s t-테스트는 검정통계량이 귀무가설 하에서 t-분포를 따르는 통계적 가설 검정법이다. t-테스트는 일반적으로 검정통계량이 정 규 분포를 따르며 분포와 관련된 스케일링 변숫값들이 알려진 경우에 사용한다. One-way ANOVA : 일원 분산 분석, 통계에서 일원 분산 분석은 두 표본의 평균이 유의하게 다른지 여부를 비교하는 데 사용할 수 있는 기술이다. 이 기술은 수치 응답 데이터인 "Y"(보통 하나의 변수)와 수치 또는 범주형 입력 데이터인 "X"(항상 하나의 변수 이므로 "일방향")에만 사용할 수 있다. Two-way ANOVA : 이원산분산분석, 이원분산분석은 예를 들면, 종속 변수가 한 개이고 독립 변수 가 두 개인 실험 집단에서 집단 간 차이를 분석하는 기법을 가리킨다. 분산 분석 기법의 하나이다 Correlation analysis (Pearson’s correlation analysis) : 상관분석, 통계에서 상관 관계 또는 종속성은 인과 관계가 있든 없든 두 개의 무작위 변수 또는 이변량 데이터 사이의 모든 통계적 관계이다. 가장 넓은 의미 에서 상관관계는 통계적 연관성이지만 실제로는 한 쌍의 변수가 선형적으로 관련 되어 있는 정도를 나타낸다. 실험 준비물 Graph prism 실험 방법 각 조별 조원의 키, 성별, 손 크기를 측정 Q1) 성별에 따라 키 차이가 있는가? Q2) 키가 크면 손이 큰가? 키가 크면 발이 큰가? Q3) 안경을 쓰면 키가 큰가? Q4) 안경에 따라 키가 차이 나는 효과는 성별에 따라 다르게 나타나는가? 만일, 유의성 검정이 불가능하다면, 그 이유와 해결책은? 통계적 분석 방법 혹은 그래프 표기 방법을 다르게 한다면? 결과 (Results) 고찰 (Discussion) Mann-Whitney test’s에 조사하고 Student’s t-test와 비교 설명하시오. 실험 제목 (Title) 동물 세포의 이해 실험목적 (Purpose of experiments) 기본적인 동물세포 배양에 필요한 이론과 세포 수 측정 방법을 학습하고 동물세 포 배양을 수행한다. 실험 배경 (background of study) 배양세포는 동물, 식물의 조직에서 효소의 처리 등과 같이 인위적인 조작으로 세 포를 분리해 낸 후 인공적인 조건에서 배양한 세포를 말한다. 세포를 배양하기 위한 배양액, 즉 배지(cell culture media)의 조성은 상당히 복잡한데, 그 조성에는 다양한 아미노산, 비타민, 염류, 포도당 등 수많은 물질들로 이루어져 있다. 배지 는 세포의 종류 및 세포 배양의 목적 등에 따라 다양하게 선택된다. 배지에는 세 포의 분해를 막고 암모니아 및 노폐물의 축적을 방지하는 부수물들이 첨가되어 있으며, 세포 배양 동안 pH의 변화를 시각적으로 확인할 수 있는 phenol red 시 약이 포함된 배지도 존재한다. 특히, 추가적으로 소량의 혈청(주로 fetal bovine serum, FBS)을 첨가하는데, 혈청은 세포의 성장을 촉진하는 성장촉진인자들이 함 유되어 있으며, 세포의 생존 및 분열을 도와주는 인자들도 함유되어 있어 세포배 양을 도와주는 역할을 한다. 배양세포는 크게 1차 세포 혹은 세포 주 방법으로 나뉜다. 먼저 1차 세포 (primary cell)란 특정 조직이나 기관으로부터 분리하여 얻은 성숙한 즉, 분화된 세 포를 말한다. 이 세포는 신선한 배양액을 계속 교체해 주어도 오랜 기간 생존하 지 못하고 사멸하며 빠른 시일 내로 실험을 진행해야 한다. 다음으로 세포 주(cell line)란 외부에서 오랜 기간 동안 계대배양을 할 수 있도록 1차 세포를 죽지 않게 변형시키거나 혹은 암세포에서 추출한 세포를 말한다. 세포를 배양하는 데 있어 세포의 종류, 배양액 뿐만 아니라 외부 환경 조절도 중 요하다. 그중 이산화탄소(CO₂) 농도와 수소 이온 농도(pH) 조절이 대표적이다. 세 포를 배양할 때 세포배양기를 사용하며 일반적이 세포배양기의 조건은 ‘95%습도, 5% CO₂’로 세포가 생장하기 위한 적정한 온도, 습도 및 pH를 유지시켜주는 역할 을 한다. 세포 배양 시 사용하는 배양액에는 pH의 급격한 변화를 방지하기 위해 완충제가 첨가되는데, 이 역시 배양 후 생성되는 산 혹은 염기로 인해 적절한 세 포의 생장에 적절한 pH를 유지해준다. 배양 세포의 오염 혹은 돌연변이를 억제하고 장기간 보관 및 유지하기 위해서는 가장 활성이 좋은 세포를 이용하여 cell stock을 만들며, 필요 시 만들어 둔 cell stock을 해동한 후 배양한다, 만든 cell stock은 약 -80℃의 초저온에서 보관을 하 며, 해동을 할 때 필요한 양의 세포 수를 계산하여 세포 배양 접시에 분주한다. Cell counting은 격자관의 한정된 구간에 존재하는 세포들을 관찰하여 특정 부피 안에 포함된 세포 수를 측정할 수 있는 혈구계수기(hemocytometer)를 이용하여 세포 수를 계수한다. 이를 이용하여 최종적으로 액체 전체에 존재하는 세포의 수 를 계산할 수 있다. 혈구계수기는 가로, 세로 1 mm의 정사각형이 9개가 존재하며, 좌우 양쪽의 정사각형은 다시 16칸으로 나뉘는 형태를 띠고있다. 혈구계수기를 이용한 세포의 수를 측정하는 방법은 다양하다. 예를 들어, 네 모서리의 큰 정사 각형 4개를 관찰하는 방법으로 세포 수를 측정한다면, 정사각형의 선 안에 위치 하는 모든 세포 수를 다 세어야 하며, 만약 선 위에 세포가 걸쳐져 있을 경우에 는 각각의 사각형에 일관된 방법을 적용하여 세포 수를 측정하도록 한다. 실험 준비물 세포 주, DMEM 배지, FBS, 항생제, 1x PBS, 1x Trypsin-EDTA, Trypan blue, 마이크로 파이펫, 마이크로파이펫 팁, 15 ml tube, 원심분리기, 혈구계수기, 광학현미경, CO₂ 세포배양기, Cell stock tube, Cell stock container, 초저온냉장고 실험 방법 (procedure) Primary brain culture video 1. Primary astrocyte culture ① Dissect and place on ice cortices from pups (postnatal day 0 or 1 mice). ② Move tissue into medium (DMEM F12 containing 10% FBS) ③ Dissociate tissue with pipetting several times. ④ Plate the cells on poly-D-lysine (PDL, Sigma-Aldrich, P7405-5MG) coated T75 flasks; ⑤ Maintain cultures at 37 °C with 5% CO2. ⑥ Replace growth medium every 3-4 days 2. Cell subculture ① Wash plates with DPBS two times ② Apply Trypsin-EDTA and incubate 5 min at 37 °C with 5% CO2. ③ Detach cell with DMEM F12 containing 10% FBS ④ Count the cells with hemocytometer ⑤ Seeding the detached cells onto new plates and incubate 37 °C with 5% CO2 for further analysis 고찰 (discussion) Pros and cons of cell-line and primary cells Roles of medium ingredient Medium Fetal bovine serum Penicillin/streptomycin Glucose Etc. Proper condition of incubator (humidity, % of CO2, and pH) 실험 제목 (Title) 염증성 유발물질인 NO (nitric oxide)와 세포 독성 측정 실험 (MTT assay) 실험목적 (Purpose of experiments) 세포의 NO 및 MTT assay 를 진행한다. 실험 배경 (background of study) <NO assay> NO 는 염증반응으로 증가되고, 산화되어 활성 NO 로 변하게 되면, 단백질 및 지 질의 과산화를 유도하고 세포독성을 야기하는 강력한 산화제인 peroxynitrite (ONOO-)를 생산한다. NO 활성도는 대사산물인 nitrate (NO3-)와 nitrite (NO2-)의 생성 농도로 확인할 수 있으며 이를 그리스 반응 (Griess reaction)을 통해 확인한 다. 질산환원효소를 이용하여 NO3-를 NO2-로 환원 시키고 Griess 시약을 이용한 발색반응으로 NO2-의 농도를 측정한다. <MTT assay> 세포의 생존율 실험은 살아 있는 세포를 측정하여 세포의 증식 혹은 사멸 정도를 측정하기 위한 실험이다. 세포 생존율 실험은 특정 약물 및 처리 물질들의 세포 에 대한 독성을 가지는지 또는 독성을 가하는 정도를 확인할 수 있다. 세포의 생 존 및 사멸을 확인하기 위한 일반적인 세포 생존율 실험은 tetrazolium salt와 살아있는 세포의 미토콘드리아에 존재하는 환원효소, 탈수소효소 등의 효소와 화학적 반응을 통해 결과를 확인하는 실험이다. Tetrazolium salts는 MTT[3-(4,5dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide], WST-1[2-(4-iodophenyl)-3(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium sodium salt], XTT[sodium 3’(1-(phenylaminocarbonyl)-3,4-tetrazolium)-bis(4-methoxy6-nitro) benzene sulfonic acid hydrate] 등이 있으며 이들은 각각 고유한 색을 띠고 있다. 이러한 tetrazolium salts 가 살아 있는 세포의 NAD(P)H 의존적 환원효소와 반응하면 tetrazolium salt 의 고유한 색에 따라, 어두운 보라색 또는 빨간색 등의 색을 띠 는 formazan 이라는 비수용성 물질로 환원된다. Formazan은 일반적으로 DMSO 혹은 SDS와 같은 유기용매에 녹으며 흡광도 (500~600 nm의 파장을 이용)를 측 정하여 최종적으로 세포의 생존 및 사멸 정도를 확인한다. 실험 준비물 세포 주, DMEM배지, FBS, 항생제, 1x PBS, 1x Trypsin-EDTA, Trypan blue, MTT[3(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide], DMSO, 마이크로파이 펫, 마이크로파이펫 팁, 교반기, 96well cell culture plate, 15 ml tube, 원심분리기, 혈구계수기, 광학현미경, 분광광도계, CO₂ 세포배양기, LPS 실험 방법 (procedure) <NO assay> LPS : Inflammation 에 관련된 pathogen 으로 지방과 다당류의 복합체, 세균 특히 그람음성균의 외막이며 각종 생물학적 활성이 있는 것이 많음 Griess reagent : 아질산 및 아질산 이온의 검출·정량용 시약으로 홍색의 발색도는 아질산의 양에 비례함. Napthyl ethylenediamin dihydrochloride , Sulfanilamide 그 리고 NO2- 가 반응하여 Azo coupling 을 이루는데 이 두개의 링 형태가 540nm 의 파장에서 최대 흡광도 값을 가짐. 이 값을 측정하여 간접적으로 NO 의 생성 양을 정량 1. 상등액을 96 well에 옮긴 후 동량의 Griess reagent와 섞어서 반응시킨다. 2. 540 nm에서 흡광도를 측정한다. 3. standard curve를 이용하여 NO를 계산한다. <MTT assay> 1. MTT solution 100 μM로 처리한다. 2. 37℃, 5% CO₂ 세포배양기에서 차광하여 30분 동안 반응시킨다. 3. MTT solution을 제거한 후 DMSO로 formazan을 녹여준다. 4. 570 nm에서 흡광도를 측정한 후 대조군에 대한 상대값을 변환한다. 결과 (results) 고찰 (discussion) 실험 제목 (Title) 동물 조직의 관찰 실험목적 (Purpose of experiments) 현미경으로 관찰하기 위한 조직 표본을 만드는 과정을 이해한다. 실험 배경 (background of study) 조직학은 동물 및 식물의 세포와 조직에 대해 연구하는 현미해부학의 한 분야로 일반적으로 세포와 조직을 절편으로 만들어 염색한 것을 관찰한다. 조직학적 염 색 방법을 사용하면 조직의 현미경적 구조를 시각적으로 더욱 확실하게 볼 수 있 다. 관찰도구로는 광학현미경, 형광현미경이나 전자현미경이 사용된다. 조직학 연 구는 세포 배양을 통해 수행되기도 하며 생물학과 의학의 주요 도구이다. 실험 준비물 동물의 각 조직 section 실험 방법 (procedure) < 조직절편제작법 > 1. 동결절편제작법 (Cryosection) 병리진단에 있어서 조직의 병변과 조직내부의 단백질, DNA / RNA 의 존재 등을 알기 위해서는 세포나 조직의 형태를 그대로 보존한 시료를 현미경으로 관찰할 필요성이 있다. 이때 사용하는 표본제작방법 중 동결절편제작법은 표본을 낮은 온도에서 빠르게 동결시켜 블록을 만들어 사용하는 방법이다. 만들어놓은 동결 블록을 크라이오톰(Cryotome)이라고 하는 장치에 넣어 조직을 얇은 슬라이스로 잘라주어 관찰한다. 2. 파라핀절편제작법 (Paraffin section) 파라핀절편제작법은 동결절편제작법과는 다르게 조직을 동결시켜 블록을 만드는 방법이 아니라 파라핀을 사용하여 블록을 만드는 방법이다. 파라핀절편제작법은 일반적인 모든 검사에서 가장 많이 사용되는 방법이다. < 조직염색법 > 1. H&E 염색 (Hematoxylin and Eosin staining) H&E 염색 혹은 HE 염색은 조직학에서 이용되는 기본적인 염색 방법으로, H 는 헤마톡실린, E 는 에오신을 의미한다. 염색 기법은 헤마톡실린의 산화형인 헤마테인과 알루미늄 이온에서 형성된 복합체인 헤말룸(hemalum)과 연관이 있다. 헤말룸은 세포핵을 파란색으로 염색한다(그 외에 케라토하이알린 과립과 석회화된 물질도 염색한다). 핵 염색에 이어 에오신 Y 의 수용액이나 알코올 용액으로 대조염색을 한다. 에오신 Y 는 에오신친화성 구조를 붉은 계통, 분홍, 주황색 등으로 염색한다. 에오신 Y 는 산성 염료로 산성친화성(호산성) 구조에 붙어 적갈색으로 염색하고, 헤마톡실린은 염기성 염료로 염기성친화성(호염기성) 구조에 결합하여 파란색이 된다. 일반적으로는 헤말룸의 염료-금속 복합체가 핵에 있는 DNA 에 결합하여 염색이 이루어진다. 다른 방법으로는 조직에서 DNA 를 추출하여 염색하는 방법이 있다. 이 방법에서는 핵이 염기성(양이온성) 염료인 타이오닌(thionine)이나 톨루이딘 블루(toluidine blue)로 염색된다. 염기성 염료로는 헤말룸보다 산성이 덜한 용액에서만 염색할 수 있고, 핵산을 화학적으로 혹은 효소로 추출하면 염색이 억제된다. 헤말룸 복합체는 알루미늄과 헤마테인 사이의 결합과 유사한 배위 결합을 통하여 염색질에 있는 DNA 와 단백질의 카복시기에 결합한다. 에오신친화성 구조는 일반적으로 세포 내외의 단백질로, 루이소체와 에오신친화성이다. 말로리소체가 적혈구는 특히 이에 속한다. 붉은색으로 세포질 염색된다. 대부분은 호염기성이나 에오신친화성(호산성) 구조가 반드시 산성 혹은 염기성인 것은 아니다. 호염기성이나 에오신친화성 등의 용어는 염료에 대한 세포를 구성하는 요소의 친화성에 따른 것이다. 표본에는 내재적인 색소(멜라닌 등)로 인하여 노란색이나 갈색같은 다른 색도 나타날 수 있다. 어떤 구조는 염색이 잘 되지 않는다. 예를 들어 바닥판을 잘 관찰하여야 할 때에는 PAS 나 은으로 염색한다. 그물섬유도 은으로 염색한다. 지방이 많은 지방세포, 뉴런 축삭을 감싸고 있는 말이집, 골지체의 막 같은 소수성 구조도 염색이 되지 않는다. 2. 면역조직화학 (Immunohistochemistry) 면역조직화학은 면역 염색의 가장 일반적인 예시이다. 항체가 생물학적 조직의 항원에 특이적으로 결합하는 원리를 이용하여 조직 절편의 세포에서 항원을 선택적으로 식별하는 과정을 포함한다. 세포에 있는 펩타이드나 단백질 항원의 특정 항원 결정기에 붙는 항체를 이용한 실험 기법이다. 항원 결정기에 달라붙은 항체들은 이차적으로 여러 방법을 통해 인지할 수 있다. 이 방법으로 특정 항원이 대조군과 비교하여 실험군에 존재하는 지 여부를 알 수 있다. 더 나아가서 세포 내 어떤 특정 부분에 그 항원이 존재하는 지도 확인 할 수 있다. 결과 (results) 관찰한 조직의 그림 제출 고찰 (discussion) section 을 만드는 각 방법의 장, 단점 실험 제목 (Title) 동물 행동의 관찰 실험목적 (Purpose of experiments) 동물의 기억 능력을 측정하는 방법과 데이터를 해석하는 방법을 습득한다. 실험 배경 (background of study) 설치류를 활용하여 인지 기능 및 다양한 동물의 행동을 측정하고 분석한다. <반복 행동(Repetitive behavior)> 1. Self-Grooming Behavior : 모든 건강한 설치류는 몸의 털을 손질하는 데 시간을 보내는 자주 보이는 행동 중 하나이다. 그러나 자기 손질 행동이 더 높은 비율과 더 긴 자폐증(autism 시간 동안 spectrum 반복되면 disorder), 반복 행동으로 간주될 헌팅턴병(huntington's 수 있으며, disease), 프라이온병(prion disease) 포함하여 설치류 질병 모델의 자기 손질에 영향을 미치는 이상이 발견되어 설치류 자기 손질의 평가는 신경과학 연구에 있어 질병에 따라 어떻게 달라지는지 연구하는데 사용될 수 있다. 설치류 자기 손질 평가는 신경생물학에 대한 검토 및 자폐 및 강박장애 모델을 포함하여 신경 정신 장애의 설치류 모델에 대한 연구에 유용할 수 있다. < Self-Grooming > 2. Jumping Behavior : 설치류에서 관찰되는 또 다른 반복 행동은 Jumping Behavior 이다. 케이지 상단을 향한 반복적인 동작이며, 설치류는 팔다리를 사용하여 땅을 밀고 잠시 공중에 떠 있다. 높은 수준의 반복 점프는 설치류에서 일반적으로 관찰되는 반복 행동입니다. 과잉 행동 설치류 모델에서는 과도한 점프를 나타내는 비정상적인 반복 행동을 보인다. < Jumping Behavior > 실험 준비물 Cage, 쥐 실험 방법 (procedure) 1. Grooming behavior 설치류 자기 손질 행동은 순차적인 움직임 패턴으로 털 손질은 얼굴부터 시작되며 이는 한 쪽 또는 양쪽 발을 핥고 그 다음에 발로 얼굴을 문지른다. 얼굴이 완성되면 귀와 머리 뒷부분을 손질해 주는데 이 과정에서는 주기적으로 멈추면서 손질하게 된다. 그 다음으로는 배와 옆구리, 대개 꼬리 끝부분부터 꼬리 전체를 손질하게 된다. 실험 방법으로 10 분 동안 설치류가 자기 손질하는 횟수를 기록한다. 2. Jumping behavior 설치류의 반복적인 행동 유형으로 점프가 있으며, 점프는 설치류가 구석이나 벽을 따라 뒷다리로 서서 네 발이 동시에 땅에 떨어지도록 반복적으로 점프하는 것으로 정의하며, 케이지 벽면이나 모서리에 직립(Upright scrabbling) 하는 동작도 점프에 포함된다. Upright scrabbling 은 점프와 같이 벽이나 모서리에 기어오르는 것처럼 보이며, 설치류의 벽을 오르는 고정관념과 관련이 있다. 실험 방법으로 10 분 동안 설치류가 점프 및 벽면이나 모서리에 직립하는 횟수를 기록한다. 결과 (results) 고찰 (discussion) 동물의 사회성을 측정하는 방법 실험 제목 (Title) 형광현미경의 활용 실험목적 (Purpose of experiments) 형광현미경의 원리를 학습하고 현미경을 활용하여 세포를 관찰한다. 실험 배경 (background of study) <형광(fluorescence)에 대한 이해> 형광은 발광의 한 형태이다. 형광 분자가 자외선(ultra violet, UV)이나 가시광선(visible light) 영역의 빛을 흡수하게 되면, 바닥 상태(ground state)의 전자가 들뜬 상태(excited state)로 에너지 준위가 올라가게 된다. 이때 전자는 본래의 안정적인 상태의 바닥 상태로 돌아간다. 바닥 상태로 돌아가는 과정에서 흡수된 에너지가 방출되며, 이 과정에서 방출되는 에너지는 받았던 에너지보다 적으므로, 흡수된 파장보다 긴 파장의 빛이 방출되는데 이러한 현상을 형광이라고 한다. <형광현미경(fluorescence microscope)의 원리> 형광현미경은 형광물질이 포함되어 있는 특정 시료를 시각화할 수 있는 광학현미경이다. 형광현미경의 원리는 시료에 존재하는 형광물질이 흡수하는 특정 파장을 비추었을 때, 형광물질이 흡수한 빛이 형광 형태의 긴 파장의 빛을 방출할 때 이를 감지하여 시각화하는 것이다. 형광현미경은 제논, 수은, LED, 레이저 등과 같은 광원, 활성(excitation) 필터, 편광 거울 그리고 방출(emission) 필터로 이루어진다. 광원으로부터 나온 빛이 활성 필터를 통해 형광물질이 흡수할 수 있는 파장만이 지나가게 되고, 편광거울을 통해 시료에 빛을 비춘다. 형광물질이 포함된 시료가 특정 파장의 빛을 흡수하고, 형광의 형태로 긴 파장의 빛을 방출하는데, 이렇게 방출된 빛은 방출 필터를 통과하여 검출기를 통해 시각화된다. 형광현미경은 세포소기관 및 단백질 등을 시각화할 때 사용되며 공초점 현미경(confocal microscope)과 전반사형광현미경(total internal reflection fluorescence microscope) 등이 있다. <형광 시료의 준비> 형광현미경으로 시료를 관찰할 때는 형광물질이 포함되어 있어야 한다. 시료에 형광 물질을 포함시키는 방법은 세 가지가 있다. 첫 번째로는 생물학적 형광염색이다. 많은 형광염색물질이 생체분자에 염색되도록 만들어졌다. 예시로는 DNA 와 결합하는 형광물질은 DAPI, hoechst 등이 있다. 또한 작은 분자 물질인 fluoresceine, alexa fluors 등은 단백질 및 다른 생체분자를 표지하여 형광을 나타낸다. 두 번째는 면역형광법(immunofluorescence)이다. 면역형광법은 특정 단백질을 형광표지 하기 위해 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 방법이다. 시료가 되는 특정 단백질에 결합하는 1 차 항체에 형광물질을 표지하거나, 1 차 항체와 결합하는 2 차 항체에 형광물질을 표지하여 형광시료를 검출한다. 마지막으로, 형광단백질을 이용하는 방법이다. 유전자 재조합 기술을 이용하여 목표 단백질 유전자에 형광단백질의 유전자 서열을 연결한 후 세포 내에서 발현시켜 목표 단백질을 검출한다. 대표적인 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP)는 238 개의 아미노산으로 이루어진 단백질로, 자외선이 비추어졌을 때 녹색의 형광을 발광한다. 이를 기반으로 돌연변이를 일으켜 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein. YFP)과 같은 다양한 색의 형광단백질이 만들어졌고, 분자세포생물학적으로 단백질을 표지하는 데 많이 사용된다. 실험 준비물 형광현미경, 성상세포 실험 방법 (procedure) ① 수은 램프를 점화하고 필터 컨트롤러와 현미경 전원을 켠다. ② 형광물질이 포함되어 있는 시료를 재물대 위에 올려놓는다. ③ 재물대 조절 나사를 이용하여 시료를 대물렌즈로 관찰할 수 있는 위치로 이동한다. ④필터 컨트롤러를 이용하여 특정 파장의 빛이 나올 수 있도록 한다. 최초 상은 저배율에서 조동나사와 미동나사를 이용하여 찾는다. ⑤ 노스피스로 대물렌즈의 배율을 바꿔가며 저배율부터 고배율까지 관찰한다. 결과 (results) 고찰 (discussion) 미토콘드리아를 관찰하기 위한 각 방법의 원리와 장, 단점