Blodgrupps PCR Baver Bicer Fakultet Biovetenskapligt program Nivå/Högskolepoäng Handledarens namn Examinatorns namn Datum Löpnummer Sammanfattning Innehåll Sammanfattning .........................................................................................................................................................2 Inledning .....................................................................................................................................................................4 Teori ........................................................................................................................................................................4 ELISA ...................................................................................................................................................................4 Syfte ........................................................................................................................................................................4 Material och Metod ....................................................................................................................................................5 DNA extraktion .......................................................................................................................................................5 Första PCR körning .................................................................................................................................................5 Andra PCR körning ..................................................................................................................................................6 ELISA .......................................................................................................................................................................7 Resultat .......................................................................................................................................................................8 DNA koncentration .................................................................................................................................................8 Gelelektroforesen för prov vid andra PCR körningen ............................................................................................8 Resultat för ELISA från Bavers och Peters labbgrupp .............................................................................................9 Absorbansvärde efter 60 minuter inkubation ....................................................................................................9 Absorbansvärde efter 120 minuter inkubation ................................................................................................10 Resultat för ELISA från Hannes och Venus labbgrupp ..........................................................................................11 Absorbansvärde efter 3 timmar inkubation .....................................................................................................11 Resultat för ELISA från Julias och Nilufars labbgrupp ...........................................................................................12 Absorbansvärde efter 24 timmar inkubation ...................................................................................................12 Diskussion .................................................................................................................................................................13 Referenser ................................................................................................................................................................14 Appendix ......................................................................................................................................................................I Inledning Teori ELISA ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) är en metod där man använder en platta med 96 stycken brunnar. Vid direkt ELISA binder man fast antigen man vill analysera på brunnen. Därefter binder man antigenen med antikropp som är konjugerad med ett enzym. Man mäter därefter produkten som bildas när substratet reagerar med enzymet.1 Syfte Påvisa Rh D, C och c antigen hos tre olika givare med gelelektrofores och ELISA metoden. 1 https://www.bio-rad-antibodies.com/elisa-types-direct-indirect-sandwich-competition-elisa-formats.html 4 Material och Metod DNA extraktion Den är laborationen utfördes av tre labbgrupper. Blodprov togs från tre givare; Venus, Hanne och Peter. Det togs ett antikoaguleringsprovrör per givare. Varje givare var tidigare typade för D, C och c antigen. För DNA exktration användes DNeasy blood & tissue kit. 20 μL proteinase K pipetterades i varje eppendorfrör och totalt användes 3 eppendorfrör, en eppendorfrör till varje blodprov. 100 μL antikoagulerat blodprov från varje givare pipetterades i varsitt eppendorfrör och därefter 100 μL PBS pipetterades i varje eppendorfrör. 200 μL buffert AL pipetterades i varje eppendorfrör och omrördes i vortex under 5 sekunder. Därefter inkuberades proverna i 56°C under 10 minuter. 200 μL etanol (96%) pipetterades i varje eppendorfrör och omrördes i vortex under 5 sekunder. Varje prov pipetterades i varsitt DNeasy mini spin column med ett samlingsrör. Provet centrifugerades under 1 minut i 8000 rpm. Samlingsröret med lösning togs bort och ett nytt samlingsrör placerades till varje DNeasy mini spin column. 500 μL buffert AW1 pipetterades till varje DNeasy mini spin column och dessa centrifugerades under 1 minut i 8000 rpm. Samlingsröret med lösning togs bort och ett nytt samlingsrör placerades till varje DNeasy mini spin column. Därefter pipetterades 500 μL buffert AW2 pipetterades till varje DNeasy mini spin column och centrifugerades under 3 minut i 13400 rpm. Samlingsröret med lösning togs bort och ett nytt samlingsrör placerades till varje DNeasy mini spin column. DNeasy mini spin column placerades I varsitt eppendorfrör. 50 μL pipetterades i varje DNeasy mini spin column och inkuberades i rumstemperatur under 1 minut och därefter centrifugerades under 1 minut i 8000 rpm. Absorbansmätning utfördes för proverna. 2 μL DNA lösning från varje givare pipetterades i varsin position på plattläsaren. Absorbansmätningen utfördes vid 260 nm och 280 nm. 2 μL buffert AE pipetterades i en position på plattläsaren som negativ kontroll. Proverna sparades i frysen för användning. Första PCR körning Vid reaktionsblandningen till PCR körningen användes primer exon 5 primer 53 sense och 54 antisens för och beta-aktin primer 60 sense och 61 antisense. Dessa primerna spädes till 0,5μM. Det framställdes 20 μl total volym för varje PCR prov. Proverna pipetterades i PCR provrör enligt tabell 16 på appendix för proverna till exon 5 primer. Proverna för exon 5 primer gjordes det totalt 6 prover med totaltvolym 20 μl för varje prov. Prov 1 - 6 pipetterades 10 μl Hostar Taq plus Master Mix. Primer 53 (sense) och primer 54 (antisense) späddes till 0,5μM och för prov 1-6 pipetterades det 1μl primer 53 och 1μl primer 54. Prov 1,2,3 pipetterades det 2 μl nukleasfri vatten. Prov 1 – 6 pipetterades med 2 μl CoralLoad (10X). Prov 1,2,3 pipetterades 4 μl DNA prov från respektive givare. Prov 1 innehöll DNA prov från Venus, prov 2 innehöll DNA prov från Hanne och prov 3 innehöll DNA prov från Peter. Prov 4 pipetterades 6 μl från DNA prov Peter. Prov 6 pipetterades 4 μl från DNA prov Peter och 2 μl magnesium (20 mM). Prov 5 pipetterades enbart 6 μl nukleasfri vatten och ingen DNA prov. Prov 5 är negativ kontroll. Proverna pipetterades i PCR provrör enligt tabell 17 på appendix för proverna till beta-aktin primer. Proverna för beta-aktin primer gjordes det totalt 5 prover med totaltvolym 20 μl för varje prov. Proverna 1 - 5 pipetterades 10 μl Hostar Taq plus Master Mix. Primer 60 (sense) och primer 61 5 (antisense) späddes till 0,5μM och proverna 1 - 5 pipetterades 1μl primer 60 och 1μl primer 61. Prov 1,2,3 pipetterades det 2 μl nukleasfri vatten. Prov 1 - 5 pipetterades med 2 μl CoralLoad (10X). Prov 1,2,3 pipetterades 4 μl DNA prov från respektive givare. Prov 1 innehöll DNA prov från Venus, prov 2 innehöll DNA prov från Hanne och prov 3 innehöll DNA prov från Peter. Prov 4 pipetterades 6 μl från DNA prov Peter. Prov 5 pipetterades 4 μl DNA prov Peter och 2 μl magnesium (20 mM). Temperaturprogram som användes vid PCR körningen är: 95°C under 5 minuter vid denatureringstegen, 40 cyklar: 30 sekundär vid 94°C, 30 sekundär vid 54,9°C och 30 sekundär vid 72°C och elongeringstegen vid 72°C under 5 minuter. Därefter lagrades proverna i 4°C övernatt. 2% gel tillverkades för att köra PCR proverna i gelelektrofores. Felaktigt användes 2 gram agar istället för agaros vid tillverkningen av gelen. Därför kunde vi inte erhålla något resultat från första PCR körningen. All 20 μl PCR produkt pipetterades i varje brunn och därför kunde inte vi inte göra om gelelektroforesen. Det fanns inte tillräckligt med DNA prov kvar för att kunna köra om första PCR körningen utan att det räcker till andra PCR körningen. Därför utfördes andra PCR körningen utan något resultat från första PCR körningen. Andra PCR körning Vid andra PCR körningen används dUTP i Hostar Taq plus Master Mix. För tre labbgrupper behöves det bredas 280 μl Hostar Taq plus Master Mix med 6 μl dUTP (25nmol/25μl). Det var något fel på pipetten eftersom den pipetterade inte korrekt volym och det blev mindre mängd dUTP i Hostar Taq plus Master Mix. Våran grupp behövde 80 μl Hostar Taq plus Master Mix till våra 8 prover men vi fick bara 22 μl. Det fanns heller inte mer dUTP kvar för att göra en ny lösning av Hostar Taq plus Master Mix. Proverna pipetterades med Hostar Taq plus Master Mix med dUTP och Hostar Taq plus Master Mix utan dUTP för att uppnå totalvolym på 10 μl Hostar Taq plus Master Mix för varje prov. Tabell 18 och tabell 19 på appendix visar schemat över vilken mängd Hostar Taq plus Master Mix med dUTP och utan dUTP pipetterades för varje prov. Proverna pipetterades i PCR provrör enligt tabell 20 på appendix för proverna till exon 5 primer och tabell 21 på appendix för proverna till beta-aktin. Proverna pipetterades i PCR provrör enligt följande ordning: primer sense, primer antisense, DNA prov, Hostar Taq plus Master Mix med dUTP och Hostar Taq plus Master Mix utan dUTP och vatten. Primerna är späda till 0,5 μM. Temperaturprogram som användes vid PCR körningen är: 95°C under 5 minuter vid denatureringstegen, 40 cyklar: 30 sekundär vid 94°C, 30 sekundär vid 54,9°C och 30 sekundär vid 72°C och elongeringstegen vid 72°C under 5 minuter. Därefter lagrades proverna i 4°C. 2% agarosgel tillverkades för gelelektroforesen. 4 gram agaros och 200 ml (1X) TAE buffert hälldes i en bägare och värmdes i mikrovågsugn tills lösningen blev mer klarare. Lösningen hälldes i en gelform och kammare placerades tills lösningen stelnas till gel. 5 μl av varje PCR produkt pipetterdes i respektive brunn. PCR markör tillverkades genom att pipettera 1 μl ladder (300 ug/ml), 1 μl loading dye och 4 μl vatten. 5 μl av PCR markören pipetterades i brunnen. Gelelektroforesen kördes i 75 V tills blåa banden från loading dye hamna 3 cm ifrån kanten. Kvarvarande PCR produkt sparades i kylen inför ELISA. 6 ELISA 100 μl 100mM karbonatbuffert (pH 9,6) med 250 ng streptavidin pipetterades i brunnar som skall användas för ELISA och plattan inkuberas övernatt i kylskåp täckt med aluminiumfolie. Brunnarna tvättades 6ggr med 1 X PBS med 0,1% Tween (PBS-T) med en sprutflaska. Brunnarna pipetterades med 200 μl PBS-T med 0,25% casein. Därefter inkuberades plattan 1 timme i 37 °C under skak. Till 8 brunnar som skall användas till exon 5 PCR prov pipetterades det 100 μl PBS-T 0,25% casien med 20ng 48D5 biotin probe för varje brunn samt en brunn till blankprov. Till 8 brunnar som skall användas till beta-actin PCR prov pipetterades det 100 μl PBS-T 0,25% casien med 20 ng 126 beta actin probe för varje brunn samt en brunn till blandprov. Plattan inkuberades 1 timme i 37°C. Brunnarna tvättades 6ggr med 1XPBS-0,1% Tween (PBS-T) med en sprutflaska. För varje PCR prov pippetterades det i 2 brunnar, 2,5 μl för varje brunn. Därefter pipetterades det 47,5 μl PBS-T 0,25% casien i brunnar med PCR produkt samt de 2 brunnar som används som blank. 10 μl 1M NaOH pipetterades i brunnarna. Därefter inkuberades plattan 10 minuter i rumstemperatur. 30 μl 0,5M NaH2PO4 pipetterades i brunnarna. Plattan inkuberades i 37 °C under 1 timme. Brunnarna tvättades 6ggr med 1XPBS-0,1% Tween. Anti-digoxigenin-AP (150U/200 μl) späddes 1:2500 i PBS-T 0,25% casein och 100 μl av antikroppslösningen pipetterades i varje brunn. Plattan inkuberades 1 timme i 37 °C. Brunnarna tvättades 6ggr med 1XPBS-0,1% Tween. Substratlösning med 30mM pNpp, 50mM 2-amino-2-metyl-1-propanol och 1mM MgCl2 pipetterades i brunnarna, 100 μl för varje brunn. Plattan inkuberades i mörker och absorbansen analyserades vid olika tidpunkter: 15 minuter, 30 minuter, 60 minuter, 90 minuter samt 120 minuter. Därefter inkuberades plattan i kylskåp under 1 dygn och absorbansen mättes ytterligare en gång. 7 Resultat DNA koncentration Tabell 1 visar resultatet för absorbansen av proverna vid 260 nm och 280 nm. Vid absorbanmättningen för 280 nm ligger prover lågt och tyder på att proverna inte innehåller proteiner. Proverna mättes med absorbansen vid 260 nm för att beräkna DNA koncentrationen. Tabell 2 visar provernas DNA koncentration. Tabell 1 Resultatet för absorbansmätning av proverna vid 260 nm och 280 nm. Prov Prov Venus Prov Hanne Prov Peter Blandprov Absorbans vid 260 nm 0,0747 0,1065 0,1286 0,0698 Absorbans vid 280 nm 0,0623 0,0837 0,1039 0,0647 Tabell 2 Hur mycket DNA koncentration som proverna innehåller. Prov Prov Venus Prov Hanne Prov Peter DNA koncentration (μg/ml) 0,245 2,940 1,835 Gelelektroforesen för prov vid andra PCR körningen Vid körning av proverna för andra PCR körningen i gelelektroforesen syntes det bands vid proverna för beta-aktin: prov Venus, prov Hanne och prov Peter. Det syntes ingen band på proverna för exon 5 och det syntes heller inga band för markören. 8 Resultat för ELISA från Bavers och Peters labbgrupp Absorbansvärde efter 60 minuter inkubation Tabell 3 visar resultatet för absorbansmätningen av exon 5 proverna. Exon 5 proverna för prov Venus, prov Hanne och prov Peters är något högre än negativ kontroll, men eftersom negativa kontrollen inte har lika mycket dUTP går det inte jämföra exon 5 proverna med negativa kontrollen. Tabell 4 visar resultatet för absorbansmätningen av proverna för beta-aktin. Beta-aktin proverna för prov Venus och prov Hanne ligger högt i absorbans. Prov Peter har inget dUTP och därför är resultatet för prov Peter felaktigt. Negativ prov har inget dUTP och går inte att använda som kontroll för att jämföra med prov Venus och prov Hanne. Tabell 5 visar resultatet för absorbansen av blanka proverna och blanka proverna ligger lågt. Tabell 3 Absorbansvärden för exon 5 proverna och dess dubbelprov efter 60 minuter i inkubation vid rumstemperatur. Negativ kontroll har lägre mängd dUTP jämfört med de andra proverna och därför går det inte jämföra negativ kontroll. Prov exon 5 Prov Venus DNA Prov Hannes DNA Prov Peters DNA Negativ kontroll Absorbans första brunnen 0,5591 0,6436 0,7055 0,3020 Absorbans andra brunnen 0,7109 0,5683 0,4429 0,299 Tabell 4 Absorbansvärden för beta-aktin proverna och dess dubbelprov efter 60 minuter i inkubation vid rumstemperatur. Prov Peter samt negativ kontroll saknas dUTP för PCR proven och därför är resultatet felaktigt för dem. Prov beta-aktin Prov Venus DNA Prov Hannes DNA Prov Peters DNA Negativ kontroll Absorbans första brunnen 1,2525 1,5686 0,2790 0,2538 Absorbans andra brunnen 1,0722 0,7355 0,2515 0,2554 Tabell 5 Absorbansvärden för två blankprover efter 60 minuter i inkubation vid rumstemperatur. Prov Blankprov Absorbans första brunnen 0,2606 9 Absorbans andra brunnen 0,2465 Absorbansvärde efter 120 minuter inkubation Tabell 6 visar resultatet för absorbansen av proverna för exon 5. Proverna för exon 5 för prov Venus, prov Hanne och prov Peters är högre vid 120 minuter jämfört med 60 minuter vid inkubarion i rumstemperatur. Negativ kontroll har inte ökat för mycket vid 120 minuter jämfört med 60 minuter vid inkubation i rumstemperatur. Proverna för exon 5 för prov Venus, prov Hanne och prov Peter har hög absorbans och alla tre proverna är positiva för exon 5. Tabell 7 visar resultatet för absorbansen av proverna för beta-aktin. Proverna för beta-aktin för prov Venus och prov Hanne har ökat i absorbans vid 120 minuter jämfört med 60 minuter vid inkubation i rumstemperatur. Både prov Venus och prov Hanne visar positivt resultat för beta-aktin. Det finns en stor skillnad för absorbansen mellan dubbelproven för prov Hanne för beta-aktin. Prov Peter har inget dUTP och därför visar prov Peter felaktigt resultat. Negativ prov har inget dUTP och går inte att använda som kontroll för att jämföra med prov Venus och prov Hanne. Tabell 8 visar resultatet för absorbansen av blanka proverna. Blanka proverna ligger lågt i absorbansvärde efter 120 minuter vid inkubation i rumstemperatur. Tabell 6 Absorbansvärden för exon 5 proverna och dess dubbelprov efter 120 minuter i inkubation vid rumstemperatur. Negativ kontroll har lägre mängd dUTP jämfört med de andra proverna och därför går det inte jämföra negativ kontroll. Prov Venus, prov Hanne och Prov Peter visar positivt resultat för exon 5. Prov exon 5 Prov Venus Prov Hanne Prov Peter Negativ kontroll Absorbans första brunnen 0,9071 1,1138 1,2465 0,3645 Absorbans andra brunnen 1,2801 0,9772 0,7118 0,3625 Tabell 7 Absorbansvärden för beta-aktin proverna och dess dubbelprov efter 120 minuter i inkubation vid rumstemperatur. Prov Peter samt negativ kontroll saknas dUTP för PCR proven och därför är resultatet felaktigt för dem. Prov Venus och Prov Hanne visar positivt resultat för beta-aktin. Prov beta-aktin Prov Venus Prov Hanne Prov Peter Negativ kontroll Absorbans första brunnen 2,4584 3,0867 0,2792 0,2596 Absorbans andra brunnen 2,1395 1,3623 0,2566 0,2617 Tabell 8 Absorbansvärden för två blankprover efter 120 minuter i inkubation vid rumstemperatur. Blankproverna ligger lågt i absorbansvärde. Prov Blankprov Absorbans första brunnen 0,2603 10 Absorbans andra brunnen 0,2477 Resultat för ELISA från Hannes och Venus labbgrupp Absorbansvärde efter 3 timmar inkubation Tabell 9 visar resultatet av absorbansvärde för proverna för intron 2. Prov Venus, prov Peter och prov Hanne har hög absorbansvärde för intron 2 jämfört med negativ kontroll och proverna är positiva för intron 2. Tabell 10 visar resultatet av absorbansvärde för proverna för exon 2. Prov Hanne och prov Peter har hög absorbansvärde för exon 2 jämfört med negativ kontroll och proverna är positiva för exon 2. Prov Venus visar negativ för exon 2. Tabell 11 visar resultatet av absorbansvärde för proverna för HGH. Både prov Venus, prov Peter och prov Hanne har hög absorbansvärde jämfört med negativ kontroll och proverna visar positiv för HGH. Tabell 12 visar resultatet av absorbansvärde för blanka proverna och blanka proverna har lågt absorbansvärde. Tabell 9 Absorbansvärden för intron 2 proverna och dess dubbelprov efter 3 timmar iinkubation. Prov Venus, prov Hanne och prov Peter är positiva för intron 2. Prov intron 2 Prov Venus Prov Hanne Prov Peter Negativ kontroll Absorbans första brunnen 2,2974 1,6882 1,2250 0,2168 Absorbans andra brunnen 1,6376 2,1682 1,0566 0,2265 Tabell 10 Absorbansvärden för exon 2 proverna och dess dubbelprov efter 3 timmar inkubation. Prov Hanne och Prov Peter är positiva för exon 2 och prov Venus är negativ för exon 2. Prov exon 2 Prov Venus Prov Hanne Prov Peter Negativ kontroll Absorbans första brunnen 0,2934 0,8047 0,8921 0,2181 Absorbans andra brunnen 0,2262 0,7363 0,8173 0,2262 Tabell 11 Absorbansvärden för HGH proverna och dess dubbelprov efter 3 timmar inkubation. Prov Venus, prov Hanne och prov Peter är positiva för HGH. Prov HGH Prov Venus Prov Hanne Prov Peter Negativ kontroll Absorbans första brunnen 3,3539 2,5274 2,8426 0,1784 Absorbans andra brunnen 2,6791 2,4514 3,0035 0,2280 Tabell 12 Absorbansvärden för tre blankprover efter 3 timmar inkubation. Blankproverna ligger lågt i absorbansvärde. Prov Blankprov Absorbans första brunnen 0,2149 Absorbans andra brunnen 0,2110 11 Absorbans tredje brunnen 0,2037 Resultat för ELISA från Julias och Nilufars labbgrupp Absorbansvärde efter 24 timmar inkubation Tabell 13 visar resultatet av absorbansenmätningen av proverna för exon 9. Prov Venus visar svagt positivt för exon 9. Båda prov Hanne och prov Peter visar negativt resultat för exon 9. Tabell 14 visar resultatet av absorbansmätningen av proverna för beta-aktin. Prov Venus och prov Peter visar positivt för beta-aktin. Första brunnen för prov Hanne visar negativt för beta-aktin medan andra brunnen visar svagt positivt för beta-aktin. Tabell 15 visar resultatet för absorbansen av blanka proverna och blanka proverna ligger lågt i absorbansvärde. Tabell 13 Absorbansvärden för exon 9 proverna och dess dubbelprov efter 24 timmar inkubation. Prov Venus visar svagt positivt för exon 9. Pron Hanne och prov Peter visar negativt för exon 9. Prov Exon 9 Prov Venus Prov Hanne Prov Peter Negativ kontroll Absorbans första brunnen 1,2593 0,5333 0,9973 0,7350 Absorbans andra brunnen 1,2491 0,6704 1,1069 1,0150 Tabell 14 Absorbansvärden för beta-aktin proverna och dess dubbelprov efter 24 timmar inkubation. Dubbelproverna för negativ kontrollerna ligger för högt. Prov Venus och prov Peter visar positivt för beta-aktin. När det gäller prov Hanne får man negativ resultat för beta-aktin på första brunnen och svagt positivt för andra brunnen. Prov beta-aktin Prov Venus Prov Hanne Prov Peter Negativ kontroll Absorbans första brunnen 1,3433 0,8462 1,2320 0,7011 Absorbans andra brunnen 1,4821 1,0657 1,8581 0,8772 Tabell 15 Absorbansvärden för två blankproverna efter 24 timmar inkubation och blankproverna har ligger lågt i absorbansvärde. Prov Blankprov Absorbans första brunnen 0,2322 12 Absorbans andra brunnen 0,2402 Diskussion Givarna har tidigare varit typade för Rh D, C och c antigen. Venus är typad Rh D positiv, C positiv och c negativ. Hanne är typad Rh D positiv, C positiv och c positiv. Peter är typad Rh D positiv, C positiv och c positiv. Vid laborationen analyserade exon 5, exon 2, exon 9 och intron 2. Vid analys av exon 5 och exon 9 analyserar man D antigenen. Resultatet från ELISA gav oss att både Venus, Hanne och Peter är positiva för exon 5. Resultatet från ELISA stämmer bra eftersom alla tre givare var tidigare typad som D positiv. Resultatet för ELISA vid analys av exon 9 gav att Venus positiv för exon 9 och Hanne och Peter är negativ för exon 9. Vid analys av intron 2 analyserar man C antigenen. Resultatet från ELISA gav oss att både Venus, Hanne och Peter är positiva för intron 2. Vilket stämmer bra eftersom alla tre givare var tidigare typad som C positiv. Vid analys av exon 2 analyserar man c antigenen. Resultatet från ELISA gav oss att Hanne och Peter är positiv för exon 2 och Venus är negativ för exon 2. Vilket stämmer bra eftersom Hanne och Peter var tidigare typad som c positiv medan Venus vad typad som c negativ. Våran labbgrupp (Baver och Peters labbgrupp) fick på ELISA resultatet skillnad mellan absorbansen hos dubbelproverna för exon 5 proverna Venus, Hanne och Peter samt beta-aktin proverna Venus och Hanne. Skillnaden mellan dubbelproverna kan bero på att vid pipettering av 2,5 μl DNA från PCR produkten till respektive brunnarna. När man hanterar med så liten mängd är det lätt hänt att man inte får ner all mängd i brunnarna. När vi pipetterade gick vi inte ner med pipetten ner till brunnens botten och då blir det svårt att få med allt. När man hanterar men små mängder får man relativt stort procentuellt fel när man inte får med all DNA prov till brunnen. När man inte får lika mycket mängd DNA prov mellan dubbelproverna kan man få skillnad på resultatet för absorbansvärdet mellan dem. På gelelektroforesen kördes proverna för andra PCR körningen och man kunde se band för beta-aktin proverna: prov Venus, prov Hanne och prov Peter. Man det gick inte se någon band för exon 5 prover. Resultatet från gelelektroforesen och ELISA för exon 5 stämmer inte överens med varandra. Det gick att detektera givarna är positiva för exon 5 genom ELISA metoden och det verkar som ELISA är känsligare metod för att detektering av DNA jämfört med gelelektrofores. 13 Referenser 1. https://www.bio-rad-antibodies.com/elisa-types-direct-indirect-sandwich-competition-elisaformats.html 14 Appendix Tabell 16 Schema över pipettering av proverna nr 1-6 inför första PCR körningen med exon 5 primer. Prov till exon 5 Prov 1 Prov 2 Prov 3 Prov 4 Prov 5 Prov 6 Hotstar Taq plus Master Mix 10 μl 10 μl 10 μl 10 μl 10 μl 10 μl Primer 53 (sense) Primer 54 CoralLoad (antisense) (10X) DNA Nukleasefri MgCl2 vatten 1 μl 1 μl 1 μl 1 μl 1 μl 1 μl 1 μl 1 μl 1 μl 1 μl 1 μl 1 μl 4 μl 4 μl 4 μl 6 μl 0 μl 4 μl 2 μl 2 μl 2 μl 0 μl 6 μl 0 μl 2 μl 2 μl 2 μl 2 μl 2 μl 2 μl 0 μl 0 μl 0 μl 0 μl 0 μl 2 μl Tabell 17 Schema över pipettering av proverna nr 1-5 inför första PCR körningen med beta-aktin primer. Prov till betaaktin Prov 1 Prov 2 Prov 3 Prov 4 Prov 5 Hostar Taq plus Master Mix 10 μl 10 μl 10 μl 10 μl 10 μl Primer 60 (sense) Primer 61 (antisense) CoralLoad (10X) DNA Nukleasefri Magnesium vatten 1μl 1μl 1μl 1μl 1μl 1μl 1μl 1μl 1μl 1μl 2 μl 2 μl 2 μl 2 μl 2 μl 4 μl 4 μl 4 μl 6 μl 4 μl 2 μl 2 μl 2 μl 0 μl 4 μl 0 μl 0 μl 0 μl 0 μl 2 μl Tabell 18 Tabellen visar mängd Hostar Taq plus Master Mix med dUTP som pipetterades i proverna inför andra PCR körningen med exon 5 primers För att få totalvolym 10 μl Hostar Taq plus Master Mix pipetterades också Hostar Taq plus Master Mix utan dUTP. Negativ kontroll har lägre mängd dUTP. Prov till exon 5 Prov Venus DNA Prov Hannes DNA Prov Peters DNA Negativ kontroll Master Mix med dUTP 4 μl 4 μl 4 μl 2 μl Master Mix utan dUTP 6 μl 6 μl 6 μl 8 μl Tabell 19 Tabellen visar mängd Hostar Taq plus Master Mix med dUTP som pipetterades i proverna inför andra PCR körningen med betaaktin primers För att få totalvolym 10 μl Hostar Taq plus Master Mix pipetterades också Hostar Taq plus Master Mix utan dUTP. Negativ kontroll och prov med Peters DNA har ingen dUTP. Prov till beta-aktin Prov Venus DNA Prov Hannes DNA Prov Peters DNA Negativ kontroll Master Mix med dUTP 4 μl 4 μl 0 μl 0 μl I Master Mix med dNTP 6 μl 6 μl 10 μl 10 μl Tabell 20 Schema över pipettering av proverna inför andra PCR körningen med exon 5 primer. Prov till exon 5 Prov Venus DNA Prov Hannes DNA Prov Peters DNA Negativ kontroll Primer 53 (sense) 1 μl Primer 54 (antisense) 1 μl DNA Master Mix (utan dUTP) 6 μl Vatten 4 μl Master Mix (dUTP) 4 μl 1 μl 1 μl 4 μl 4 μl 6 μl 4 μl 1 μl 1 μl 4 μl 4 μl 6 μl 4 μl 1 μl 1 μl 0 μl 2 μl 8 μl 8 μl Master Mix (utan dUTP) 6 μl Vatten 4 μl Tabell 21 Schema över pipettering av proverna inför andra PCR körningen med beta-aktin primer. Prov till betaaktin Prov Venus DNA Prov Hannes DNA Prov Peters DNA Negativ kontroll Primer 60 (sense) 1 μl Primer 61 (antisense) 1 μl DNA 4 μl Master Mix (med dUTP) 4 μl 1 μl 1 μl 4 μl 4 μl 6 μl 4 μl 1 μl 1 μl 4 μl 0 μl 10 μl 4 μl 1 μl 1 μl 0 μl 0 μl 10 μl 8 μl II 4 μl
