Инструкция по проведению гель-тромб теста Реактивы и Оборудование Нет необходимости в создании «чистых помещений». Нужно помещение с просторной поверхностью без вибраций, на которой будет размещено всё необходимое оборудование и материалы для проведения анализа. Все растворы реактивов и посуда должны быть стерильны и апирогенны, т.е. не содержать определяемое количество бактериальных эндотоксинов. 1. Лал-реактив Pyrotell производства Associates of Cape Cod, Inc 2. Контрольный стандарт эндотоксина КСЭ производства Associates of Cape Cod, Inc 3. Стерильные и апирогенные пробирки 10х75мм из натриевого стекла для проведения анализа 4. Стерильные и апирогенные пробирки 13х100мм из боросиликатного стекла для разведений 5. Штатив для пробирок 6. Вода для ЛАЛ-теста Pyroclear 7. Дозаторы и наконечники к дозаторам на 250 мкл и 1000 мкл 8. Термоблок или водяная баня без принудительной циркуляции воды, способные поддерживать температуру 37 +- 1 0С 9. Парафильм –М 10. Вихревая мешалка, типа вортекм 11. Образец для испытания (анализируемый образец) Каждая серия ЛАЛ-реактива и соответствующая ей серия КСЭ сопровождается Сертификатом анализа. Без такого сертификата невозможно использование Лалреактива и КСЭ для проведения контрольных анализов. Одна и та же серия КСЭ может проявлять различную активность при реакции с разными сериями ЛАЛреактива, поэтому активность КСЭ, указанная в Сертификате анализа, распространяется только на указанные в нём пару серий КСЭ и ЛАЛ-реактива. Для данных в опыте 500 нг/фл х 10 ЕЭ/нг = 5000ЕЭ/ флакон В сертификате анализа указана: Серии КСЭ и ЛАЛ-реактива Сроки годности реактивов Чувствительность ЛАЛ-реактива – 0,03 ЕЭ/мл Активность КСЭ, установленная с помощью данной серии ЛАЛ-реактива, равная 10ЕЭ/нг. Содержание эндотоксина в флаконе, выраженное в весовых единицах -500нг/фл. 500 нг/фл х 10 ЕЭ/нг = 5000ЕЭ/ флакон Объем воды, необходимый для растворения лиофилизированного КСЭ до концентрации 1000 ЕЭ/мл ИНСТРУКЦИЯ (PYROTELL) на бактериальные эндотоксины Восстановление лиофилизированного КСЭ и приготовление исходной концентрации КСЭ - 1000 ЕЭ/мл 1. Подписываем дату вскрытия реактива и воды на флаконе. Снимаем алюминиевый колпачок и резиновую пробку с флакона КСЭ. 2. Вносим во флакон (КСЭ) объем ЛАЛ-воды = 5 мл, в соответсвиии с сертификатом Анализа, для получения концентрации 1000ЕЭ/мл 3. Закрываем флакон пленкой Parafilm M 4. Перемешиваем флакон КСЭ на вортексе по схеме: каждые 5 минут перемешивания в течение 1 минуты на протяжении 30 минут, для восстановления КСЭ (6раз). При дальнейшем использовании уже разведенного КСЭ (в течение этих 28 суток) необходимо предварительно встряхнуть флакон 30 секунд и можно приступать к дальнейшим рабочим разведениям Срок хранения КСЭ: В разведенном виде – в течение 28 сутки при Т = 2-8 *С Замораживанию не подлежит Восстановление лиофилизированного ЛАЛ-реактива (Pyrotell) 1. Подписываем дату вскрытия на флаконе ЛАЛ-реактива 2. Снимаем алюминиевый колпачок и резиновую пробку с флакона при помощи апирогенного наконечника. ( P.S. Старайтесь не привнести загрязнений на горлышко флакона. Не протыкайте пробку иглой и не закрывайте вскрытый флакон пробкой.) 3. Вносим во флакон (ЛАЛ-реактива) 5мл ЛАЛ-воды 4. Закрываем флакон пленкой Parafilm (слой пленки под покровной бумагой может считаться «апирогенным») и отставляем в сторону. Свежеразведенный ЛАЛреактив обычно прозрачен, но может слегка опалесцировать. 5. Перед использование аккуратно перемешайте содержимое флакона для большей гомогенности. (Интенсивное перемешивание приводит к пенообразованию, что может сказаться на чувствительности теста) Срок хранения ЛАЛ-реактива: В разведенном виде – в течение 24 часов при Т= 2-8 *С. При однократном замораживании при Т= от - 20 *С - в течение 3 месяцев. Приготовление серий разведений КСЭ 1. Подготавливаем пробирки для разведений размером 13х100мм (вскрывать упаковку с того конца, где дно пробирок) 2. Достаем 3 пробирки и упаковку заворачиваем. 3. Подписываем пробирки в соответствии с разведениями 1000 ЕЭ/мл – 20 ЕЭ/мл1,25 ЕЭ/мл(40λ) – 0,0625ЕЭ/мл (2 λ) Продолжаем перемешивать разведенный КСЭ в течение 1 минуты каждые 5 минут 4. Вскрываем пробирки для проведения анализа 10х75мм из натриевого стекла, достаем 16 пробирок. 2 λ- λ- 1/2 λ- 1/4 λ 5. Вносим необходимое количество воды в пробирки для разведений КСЭ, в соответствии со схемой. 1000ЕЭ/мл 20 ЕЭ/мл – 60мкл (КСЭ) + 2940мкл (ЛАЛ-Вода) 1,25 ЕЭ/мл(40λ) – 200мкл (КСЭ) + 3000 мкл (ЛАЛ-Вода) 0,0625ЕЭ/мл (2 λ) - 100мкл (КСЭ) +1900мкл (ЛАЛ-Вода) 6. Вносим необходимое количество КСЭ, который закончили перемешивать на вортексе в течение 30 минут. 1000ЕЭ/мл 20 ЕЭ/мл – 60мкл (КСЭ) + 2940мкл (ЛАЛ-Вода), сбрасываем наконечник, перемешиваем пробирку 10 секунд 1,25 ЕЭ/мл(40λ) – 200мкл (Из пробирки 20 ЕЭ/мл) + 3000 мкл (ЛАЛ-Вода) сбрасываем наконечник, перемешиваем пробирку 10 секунд 0,0625ЕЭ/мл (2 λ) - 100мкл (Из пробирки 1,25 ЕЭ/мл(40λ) +1900мкл (ЛАЛ-Вода) сбрасываем наконечник, перемешиваем пробирку 10 секунд Подтверждение заявленной чувствительности ЛАЛ-реактива (Pyrotell) Приготовим серию двухкратных разведений на воде для ЛАЛ-теста. Разведения будем готовить в реакционных пробирках 10*75мм Добавляем по 100мкл ЛАЛ-воды в пробирки, промаркированные: λ- 1/2 λ- 1/4 λ и в пробирки с отрицательным контролем, кроме пробирок 2 λ В пробирки промаркированные 2 λ и λ добавляем по 100мкл КСЭ, концентрации 2 λ, приготовленную ранее, в пробирке λ концентрация эндотоксина стала λ за счет разведения ЛАЛ-водой в 2 раза, общий обьем в пробирке 200мкл Перемешиваем пробирку λ в течение 5-10 секуунд и переносим 100мкл в следующую пробирку 1/2 λ. В пробирке остается- 100мкл. Повторяем в 4 повторностях. Перемешиваем пробирку ½ λ в течение 5-10 секунд, и переносим 100мкл в следующую пробирку ¼ λ. В пробирке остается 100мкл. Повторяем в 4 повторностях. Перемешиваем пробирку ¼ λ в течение 5-10 секунд и удаляем 100 мкл из пробирки, чтобы в итоге в пробирке осталось 100мкл для реакции со 100мкл ЛАЛреактива. Повторяем в 4 повторностях. Добавляем к каждой пробирке по 100 мкл Лал-реактива(Pyrotell), начиная с отрицательного контроля, а затем от меньшей концентрации КСЭ к большей. Перемешиваем каждую пробирку в течение 1-2 секунд на вортексе. В случае большого количества пробирок перемешивайте содержимое пробирок, покачивая штатив с пробирками в течение 20-30 секунд. Помещаем пробирки в термоблок при температуре 37+- 1 0С на 60+- 2 минуты в той последовательности, с которой добавляли ЛАЛ-реактив. Процесс образования геля может быть необратимо нарушен из-за неосторожных толчков, ударов, вибрации, поэтому не следует трогать пробирки во время инкубирования и использовать водяные бани с принудительной циркуляцией воды. Тестирование образца (Качественный анализ). Способ проверки испытуемого образца, позволяющим определить соответствует/не соответствует образец установленному для него значению предельного содержания бактериальных эндотоксинов. Включает в себя: - положительный контроль (КСЭ в концентрации 2 λ ) подтверждает работоспособность ЛАЛ-реактива и КСЭ в условиях опыта) - отрицательный контроль (Вода для Лал-теста) подтверждает чистоту реактива и посуды - Контроль образца -Положительный контроль испытуемого образца (Раствор испытуемого образца с конечной концентрацией КСЭ 2 λ), подтверждает, что испытуемый образец не оказывает ингибирующего действия на ход реакции. Контроль образца : 100мкл(образца) +100 мкл ЛАЛреактива(pyrotell) Положительный контроль образца: 1. Добавить 200 мкл (ОБРАЗЦА) в пробирку для положительного контроля образца + 10 мкл (КСЭ 40 λ) 2. Перемешать и перенести 100мкл во вторую пробирку для положительного контроля образца. 3. В каждую пробирку добавить по 100 мкл ЛАЛ-реактива Положительный контроль: 100 мкл (КСЭ 2 λ) +100мкл ЛАЛ р-в (Pyrotell) Отрицательный контроль: 100 мкл (ЛАЛ-вода) + 100мкл ЛАЛ р-в (Pyrotell) Учет результатов По истечении указанного срока инкубации вынимаем пробирки по отдельности из термоблока в той последовательности как ставили, начиная с отрицательного контроля и по увеличению концентрации КСЭ. Визуально регистрируем результаты как положительные или отрицательные. За положительный результат принимается твердый гель, который не разрушается при однократном переворачивании пробирки на 180 градусов. Отрицательный результат характеризуется отсутствием такого геля. За результат реакции в каждой повторности принимается наименьшая концентрация эндотоксина, в которой получен положительный результат. Если во всех повторностях получены одинаковые значения, то это значение и принимается за результат опыта. В случае, когда получены разные результаты во всех повторностячх, рассчитываем среднее геометрическое значение чувствительности ЛАЛ-реактива во всех 4 повторностях. Тестирование образца (Качественный анализ). Способ проверки испытуемого образца, позволяющим определить соответствует/не соответствует образец установленному для него значению предельного содержания бактериальных эндотоксинов. Включает в себя: - положительный контроль (КСЭ в концентрации 2 λ ) подтверждает работоспособность ЛАЛ-реактива и КСЭ в условиях опыта) - отрицательный контроль (Вода для Лал-теста) подтверждает чистоту реактива и посуды - Контроль образца -Положительный контроль испытуемого образца (Раствор испытуемого образца с конечной концентрацией КСЭ 2 λ), подтверждает, что испытуемый образец не оказывает ингибирующего действия на ход реакции. Контроль образца : 100мкл(образца) +100 мкл ЛАЛреактива(pyrotell) Положительный контроль образца: 4. Добавить 200 мкл (ОБРАЗЦА) в пробирку для положительного контроля образца + 10 мкл (КСЭ 40 λ) 5. Перемешать и перенести 100мкл во вторую пробирку для положительного контроля образца. 6. В каждую пробирку добавить по 100 мкл ЛАЛ-реактива Положительный контроль: 100 мкл (КСЭ 2 λ) +100мкл ЛАЛ р-в (Pyrotell) Отрицательный контроль: 100 мкл (ЛАЛ-вода) + 100мкл ЛАЛ р-в (Pyrotell) Добавить в каждую пробирку 100мкл ЛАЛ р-в (Pyrotell), перемешиваем 1-2 секунды на вортексе, помещаем в термоблок 37 на 60 минут. Вынимаем пробирки в последовательности, как ставили.
