PORTAFOLIO
JAZMIN MORALES
DIAGNÓSTICO HISTOQUIMICO
La histoquímica se enfoca en el estudio químico de los tejidos,
no tanto así como en su estructura y sustrato morfológico.
OBJETIVOS DQ

Localización y cuantificación

Especificidad

Sensibilidad

Integración
El objetivo de estos estudios es conocer la distribución celular
y subcelular de los tejidos, también conocer el sitio donde actúa
una macromolécula.
¿COMO PODEMOS IDENTIFICAR SUSTANCIAS QUIMICAS?
In situ es el método que se usa en el laboratorio, ya que permite
la localización y distribución de las macromoléculas. Los
reactivos usados deben interactuar con el tejido mediante
afinidad química y estas se dividen en dos: Reacción directa e
indirecta.
ÁCIDOS NUCLEICOS
Es indispensable que haya una fijación óptima del tejido para
así evitar que ocurra una solubilización.
Se debe usar idealmente fijadores coagulantes no aditivos, ya
que, estos no provocan cambios químicos en los tejidos.

FIJADOR IDEAL DNA:
base alcohólica como ► Carnoy
[ácido acético y alcohol] o Metacarno para proteínas o
fijadores ácidos ► acido pícrico.

Uso de Formaldehido tamponado a bajas t° [4°C], ayuda a prevenir la degradación del DNA.

Descalcificación con EDTA conserva mejor ácidos nucleicos [acción es mucho más lenta]

EVITAR:
el trióxido de cromo, el dicromato de potasio, el tetróxido de osmio y el glutaraldehído porque
reaccionan de manera irreversible con macromoléculas tisulares.

Ácidos inorgánicos fuertes (HCL, HNO3) y el fijador BOUIN [contraindicados]

Ácido fórmico provoca hidrolisis acida perdiendo el ácido nucleico.
METODOS DE ESTUDIO ÁCIDOS NUCLEICOS
► Radical fosfato

Colorantes cationicos [Hx tiñe, pero no se observan actividades nucleares importantes, uso de azul
de metileno con pH entre 3 a 4]
► Uso de colorantes fluorescentes: Intercalares - No
intercalares – Mixtos
► Azúcar/Pentosa: Feulgen [También conocida como
Feulgen - Schiff]
CURVA DE HIDROLISIS

Tiempo 0 min: Intensidad de coloración nula ►
DNA no posee aldehídos expuestos ►no hay
reacción con Schiff ►no hay coloración.

Tiempo 0’ a 60’ (ascenso): Ruptura puentes de
hidrogeno ►liberación progresiva de bases púricas
► se generan grupos aldehídos ► hay reacción con
Schiff ► se genera coloración.

Tiempo 60’ a 90’ (meseta): Liberación de todas las
bases purinicas y pirimicas ► gracias a hidrolisis
acida ►no hay despolimerización del DNA ► coloración bien intensa.

Tiempo 90’ a 120’ (descenso): Tiempo excesivo de exposición ► ruptura de uniones tipo ester de
pentosa ► por exceso de hidrolisis acida ► despolimerización del DNA.
PROTEINAS
Las proteínas están formadas por aminoácidos, los cuales forman parte de estructuras de proteínas. Para
tener una coloración especifica se debe realizar un control riguroso que logre bloquear todo lo demás y que
solo logre teñir las proteínas que queremos.
Fijación

Baja la reactividad por el enmascaramiento de proteínas

Fijación con alcohol deja insoluble a las proteínas y sin capacidad de reaccionar

La fijación con formaldehido provoca perdida de reactividad, ocultando secuencias de aminoácidos y
bloqueando los grupos funcionales.
Identificación histoquímica de proteínas

Proteínas simples: al someterlas a hidrolisis solo liberan aa [aminoácidos, tales como: albuminas,
globulinas, histonas, globinas].

Proteínas conjugadas: al someterlas a hidrólisis liberan cantidades apreciables de sustancias no
proteicas [nucleoproteínas, glicoproteínas, lipoproteínas, mucoproteinas].
Digestión enzimática aplicada al estudio histoquímica de proteínas
La digestión enzimática permite romper el enmascaramiento liberando los grupos funcionales.
Bloqueos químicos
Los bloqueos permiten extraer o reemplazar selectivamente determinados grupos funcionales

Acetilación y bezoilacion ► Desaminación ►Metilación ► Saponificación ►Sulfonación
Clasificación de métodos para identificar proteínas:
Reacciones Generales

Ninhidrina schiff: Es compleja. Produce una desaminación oxidativa de proteinas provocado por la
ninhidrina mediante el uso de nitrito de sodio, se oxida el tejido y donde se oxide se perderá el grupo
amino y se formaran grupos aldehídos.
Controles: Pueden aparecer falsos-positivos en caso de pre-existencia de grupos aldehídos en el tejido. Por
ello debe incluirse siempre una preparación sin desaminar por la ninhidrina que se tiñe exclusivamente con
el reactivo de Schiff.
Métodos de reacción en grupo: Azocopulacion
Sales de diazonio pueden copularse con compuestos aromáticos muy reactivos como fenoles y aminas
aromáticas para dar lugar a azocompuestos, muchos de los cuales son sustancias coloreadas que reciben la
denominación de colorantes azoicos.
Reacciones específicas: Identificación de grupos funcionales en aminoácidos. Permite identificar grupos
funcionales específicos de aa, útiles para determinar la composición exacta o secuencias mediante métodos
de coloración.
INMUNOHISTOQUÍMICA
Se utilizan anticuerpos marcados para la localización de antígenos celulares y tisulares ''in situ''.
Anticuerpos: Las inmunoglobulinas (Ig) o Ac son
glucoproteínas presentes en el suero producidas
por los linfocitos B en respuesta a una estimulación
antigénica.
ESTRUCTURA MOLECULAR

Paratopo: es lo que toma contacto con el
antígeno. Es un sitio de unión al antígeno.

Región
variable
[Parátopo]
&
Región
constante
Los anticuerpos se clasifican en dos grandes grupos:

Policlonales: Consiste en una mezcla de diferentes Ig/Ac frente a distintos epítopos de un mismo Ag
[Sensible]

Monoclonales: Puede unirse sólo a un solo epítopo en un antígeno específico [Altamente específico]
Fijación: Considerar estructura de la molécula de Ag ► Fijador ideal: en base a sales
Requisitos esenciales para un buen estudio de IHQ

Preservación del Ag [antígeno] en el contexto tisular [fijación]

Localización sin difusión [se habla de fijación de nuevo, ya que el fijador permite que se preserve la
estructura y localización de la estructura que vamos a estudiar].

Insolubilización del Ag y disponibilidad para su reacción con el Ac.

Tinciones específicas y sensibles
Visualización de AC

Inmunofluorescencia uso de fluorocromo
[tejido fresco]

Inmunometalicas
para
microscopia
electronica uso de oro coloidal

Inmunoenzimaticas uso de enzima
Montaje DAB es permanente, ya que es hidrófobo
AEC: amino metil carbasol, es de color rojo, no se
puede pasar por alcohol y xilol porque se pierde la
marcación que hizo, por eso el montaje es acuoso. Se
usa la misma enzima como conjugado, cambia el
cromógeno, el color y montaje. Montaje AEC es
semipermanente, ya que acuoso hidrofilico.
Avidina [Glicoproteina] – Biotina [Vitamina]. La unión entre
avidina y biotina es altamente específica e irreversible.
Sistema de detección ABC: complejo avidina biotina

METODO DIRECTO: Es una técnica que
reconoce un antígeno puntual.

METODO INDIRECTO: se aplica un
anticuerpo primero y secundario para ir
haciéndolo más sensible. [Más usado]
Pasos inmunohistoquímica indirecta

Paso 1: Incubación con el anticuerpo primario

Paso 2: Incubación con el anticuerpo secundario biotinilado

Paso 3: Incubación con complejo avidina – peroxidasa (LAB o LSAB)

Paso 4: Revelado
PANELES PRIMARIOS
Principales
anticuerpos
de
inmunohistoquimica:
antivimentina, anticitoqueratina, antiproteina S100
Bloqueo de Proteína: [Suero no inmune; Protein Block] Se usa este suero no inmune para bloquear las
proteínas y así tener una marcación más específica.
BLOQUEOS:

BLOQUEO DE PEROXIDASA

BLOQUEO DE PROTEINAS

BLOQUEO DE BIOTINA
AMILOIDE
Son depósitos formados por proteínas fibrilares beta plegadas, es una sustancia de origen proteico, insoluble
en agua y alcohol.
Uso de control negativo o positivo en amiloide AA con permanganato de potasio/KMN04 [hay aplanamiento
de proteínas beta plegadas, dejándolas solubles]
Propiedades físicas del Amiloide: Presenta birrefringencia y dicroismo especificos
Métodos de identificación de amiloide
Rojo Congo: es un colorante diazoico tetrazoado, tiñe estructuras
básicas. Tiñe de forma variable la colágena y fibras elásticas. Bajo luz
polarizada la sustancias amiloide muestra intensa birrefringencia verdemanzana
FUNDAMENTO
El RC se une al componente glúcido a través de la formación de
puentes de hidrogeno entre grupos OH y grupos NH2 del colorante, se
estabiliza por puentes de hidrogeno.
Cristal Violeta para Amiloide

Sirve como diagnóstico temprano

Tiñe de manera metacromatica el depósito de amiloide
Hidratos de carbono

Pueden ser simples [son solubles en agua como el glicógeno] o complejos [estructura compleja
pueden ser neutros, ácidos o muy ácidos según el grupo funcional]

Se identifican con reactivo de schiff y PAS

Para saber que método fijador usar se debe saber que se estudiara primero y que tipo de estudio
Fijador ideal: Bouin Alcohólico

PROTEOGLICANOS: Presentan carácter basófilo

MUCINAS: Origen epitelial, la carga neta dependerá de los grupos sulfatos, COOH y aldehídos.
Mucinas neutras: son PAS+

GLICOPROTEÍNAS:
Son
oligosacaridos
unidos
covalentemente
a
fragmentos
de
proteínapolipeptidos. Son receptores de adhesión celular

GLICOLIPIDOS: Mezcla de polisacaridos y acidos grasos complejos
TECNICAS DE IDENTIFICACION DE HIDRATOS DE CARBONO
METODO DE ACIDO PERIODICO DE SCHIFF [PAS]
Identifica de grupos aldehídos por oxidación de hidratos de carbono. Sirve para teñir muchos componentes
bioquímicos, membranas basales, pared de hongos, de vasos, glicógeno, entre otros... Puede hacerse
específica y selectiva utilizando controles. Se le agrega HCL para inhibir la re oxidación del colorante.
CONTROLES DE TECNICA PAS

Bloqueo de grupos aldehídos [dimedona], esta en conjunto al acido periódico oxidara los enlace 1-2
glicol y bloqueará a todos los aldehídos que no sean los de este enlace.

Bloqueo mediante acetilación en grupos 1-2Glicol

Bloqueo químico con ácido acético, acetilando grupo 1-2glicol para bloquear los grupos carboxilos y
por ello no se formará el carboxilo.

Bloqueo de CHO preexistentes los aldehídos dentro de nuestro organismo se forman de manera
transitoria por oxidación de hidratos de carbono y lípidos. Podemos utilizar un control no oxidando el
tejido, de esta forma, no se generaran aldehídos en el enlace 1-2glicol, solo teñirá los que estaban
antes de intervenir el tejido.
ALCIAN BLUE
Colorante
catiónico,
reconocer
grupos
negativos
de
los
mucopolisacáridos, sianomucinas y sulfomucinas. A pH 2.5 tiñe todos los
MPSA. Mientras menos pH haya se producira mayor selectividad en la
tinción. El pH más bajo 1 tiene fuerzas de atracción más débiles.
MÉTODO DEL MUCICARMIN
tiñe de color rojo, reconoce todas las glándulas pero no diferencia de las
sianomucinas de las sulfomucinas, depende de un metal (ALUMINIO) que
actúa como catión para hacerlo más básico y tenga afinidad por las
estructuras acidas, pero la tiñe indistintamente, todas por igual. Se realiza un
bloqueo químico como control [acetilación o metilación]
MÉTODO DEL HIERRO COLOIDAL
No es un colorante, es un ferrocianuro férrico y al unirse al ion férrico
forma un compuesto coloreado llamado azul de Prusia.
LÍPIDOS
Son insolubles en agua, son solubles en disolventes orgánicos. Baja
solubilidad es por su estructura química es fundamentalmente
hidrocarbonada, con gran cantidad de enlaces C-H y C-C. Se usan
colorantes lisocromicos para teñir los lipidos.
Lípidos compuestos: es una cadena de ácido graso y uno o más grupos como fósforo o nitrógeno. Se
localizan en cerebro y SNC. Se pueden conservar con una leve fijación.
Propiedades fisicoquímicas

La superficie de los lípidos determinará su permeabilidad

Hidrofobico

Hidrofilico: corte congelado, colorante a usar puede ser azul de nilo, schiff acuoso

Punto de fusión: es más bajo cuando la cadena es más larga, sirve de control negativo
Fijación

Ideal: fijación física mediante congelación.

Uso de formol calcio Se fija el corte solamente [10 minutos]
Controles

NEGATIVOS: Deslipidacion - Extracción con acetona

POSITIVOS: Se pueden conservar tejidos grasos a -70 grados
Métodos de identificación
Métodos físicos sin colorantes [Luz polarizada -No se usa clínicamente - los resultados son variables]
Métodos químicos para lípidos complejos [Identificación especifica de lípidos]
Métodos físicos con colorantes [Uso de colorantes solubles Lisocromos]

Oil Red: Actúa por disolución en el lípido, tiñe lípidos neutros

Sudán IV: actúa por coeficiente de reparto, tiñe lípidos neutros.

Sudán Negro: actúa por coeficiente de reparto, tiñe lípidos en
general.

Sulfato Azul de Nilo: No es una sustancia pura ya que posee
una Oxazina (colorante básico) y una oxazona (actúa como
lisocromo).
Lisocromos: método del Sudan negro (lison)
La muestra debe ser fijada
en Formol Calcio o Formol al
10%. Los lípidos identificados serán teñidos de color negro.
Aplicaciones diagnosticas [Oil red O y sudan Black B]

Se
puede
demostrar
grasas
en
localizaciones
inadecuadas tales como el riñon o el cerebro.

Cuando las células sufren cambios degenerativos, la membrana lipídica se desorienta y se hace afin a
los colorantes de grasas simples.
Puntos críticos
Uso ideal de alcohol de 70°, si se usa más no habrá coloración, porque no se podrá solubilizar el lípido, y se
perderá
BIBLIOGRAFIA

Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques. S. Kim Suvarna, Christopher Layton and
John D. Bancroft

CARACTERÍSTICAS TINTORIALES DE Neisseria gonorrhoeae POR LA TINCIÓN DIFERENCIAL DE
FLUORESCENCIA MODIFICADA. Evelin Margarita Flores Fernández, Susanny del Carmen Caraballo
Suniaga, Luzmila Sofía Albarado Ysasis