*1강. 분자생물학 Introduction
1. Mendal의 유전법칙
- Segregation (분리의 법칙): 각각 부모로부터 분리되어 유전
자가 나옴
- Independent assortment (독립의 법칙): Size나 Color같이 독
립적으로 하나씩 가져옴
- dominance (우열의 법칙): 우성과 열성
- Genotype (유전형)은 Phenotype (표현형)을 결정한다
3.2 Avery 의 실험
2. 핵산 Nucleic acids
- 형질전환을 일으키는 물질이 DNA 임을 정확하게 밝혀냄.
Nucleic acid = (Nucleotide)n = polynucleotide (Nucleotide가
- 실험 과정
50개 이상 있을 때)
1. S 독성을 가진 폐렴균을 깨서 Centrifuge 진행
Nucleotide = Ribose (당) + Base (염기) + Phosphate (인산)
2. 열처리 또는 Ethanol 처리한 S 균에 단백질분해효소
Nucleoside = Ribose (당) + Base (염기)
(Proteinase)처리하여 DNA 를 제거하고 R 형과 섞어주었더니
형질전환은 일어남.
3. 다음에 열처리한 S 균에서 DNA 분해효소 (DNAse)
처리하고 DNA 를 제거하고 R 형과 섞어주니 형질전환이
일어나지 않음
4. 다음에 열처리한 S 균에서 RNA 분해효소 (RNAse)
처리하고 RAN 제거 후 R 형과 섞어주니 형질전환이 일어남
-> 이에 따라 DNA 가 유전물질인 것이 밝혀짐
3.3 Chargaff 의 Rule
2.0 Nucleic acid를 이루는 중요 Bond는 무엇일까?
- DS DNA 는 A=T, G=C 가 같은 농도를 가진다
- N-glycosidic Bond: 당+염기 이어주는 Bond (공유결합)
- DNA 에 규칙성이 있어 이로인해 DNA 가 유전물질이라는
- Phosphodiester Bond: 탈수반응에 의해 각 Nucleotide를
견해가 자리잡게 됨
이어주는 Bond (공유결합)
3.4 Watson – Crick 모델
2.1 Ribose (당)
- DNA 의 이중나선 구조 (Double helix)
- 핵산의 당은 5탄당으로 이루어져 있으며 5탄당의 2번 탄
- 두개의 나선은 평행이 반대 (Antiparallel)
소 산소의 유무에 따라 RNA와 DNA로 불리고 있음
- Adenine 과 Thymine 은 상보적 결합 (A-T)으로 Major
- DNA (Deoxyribonucleic acid) / RNA (Ribonucleic acid)
groove 임. 3 개의 Hydrogen bond 로 이루어져 있음
- Guanine 과 Cytosine 은 상보적 결합 (G-C)으로 Minor
2.2 Base (염기)
groove 임. 2 개의 Hydrogen bond 로 이루어져 있음
염기의 종류는 DNA의 구조라고 불리는 ATGC가 염기의 종
- A-T, G-C 는 서로 Hydrogen bond 로 수소결합
류이다. RNA는 AUGC
- Pyrimidine 염기: Thymine (T), Cytosine (C), Uracil (U)
- Purine 염기: Adenine (A), Guanine (G)
3. DNA 는 유전물질? (Hereditary material)
3.1 Fred Griffith 의 실험
- DNA 는 유전물질 이라는 것을 폐렴구균으로 밝혀냄.
-
실험
결과:
무독성
R
형이
독한
S 형으로
변하는
형질전환이 일어남 (무독성 R + 살균처리한 독성 S 균)
*2 강-1. 단백질 구조와 기능 (아미노산)
3.5 Gel electrophoresis (전기영동)***
1. α-Amino acid
- DNA 와 단백질을 분리할 때 자주 사용되는 분석법
- 아미노산은 D form 과 L form 두가지 타입이 있음. L 폼은
- 주로 SDS-PAGE 를 많이 함 (Sodium Dodecyl Sulfate-
단백질로의 높은 선택성을 가지고 있어 자연계에 존재하는
Polyacrylamide gel electrophoresis)
대다수 아미노산은 L 폼임.
- 로딩된 샘플 단백질이 이동되는 속도에 대한 조건은
- 아미노산의 구조는 다음과 같다.
Protein charge (양전하를 띌수록 빠름), Compact shape
(접힘구조가 적을수록), small size 세가지임
- SDS PAGE 의 단계
0. 단백질 분자량 Marker 를 로딩하여 표기해줌. (눈금 역할)
1. 접혀있는 단백질을 로딩하기 전에 SS Disulfide bond 를
끊어주어
- R 기에 따라 기능을 가지는데 20 종류에 따라 나뉨
단백질을
풀어주는
작업을
수행.
환원제
2-
mercaptoehanol 을 첨가해 이황화 결합을 Reducing 해줌.
단백질의 3 차구조를 선형으로 바꾸어 Shape 구조를 배제함.
2. Peptide Bond
-
아미노산은
서로
강한
공유결합
(Covalent
bond)로
연결되어 있는데, 이 결합을 Peptide bond 라고 부름.
2. SDS 는 음이온성 계면활성제로 단백질의 + charge 를
- 이 공유결합은 Carboxyl 기의 O-와 Amine 기의 H2 가
가지고있는 그룹을 코팅하여 모두 – charge 로 바꿔주는
만나 탈수반응이 생겨 공유결합이 발생됨.
역할을 함.
3. 두가지 처리 (Charge, shape 를 배제) 이후 단백질을
로딩하여 오로지 Size 로만 분리 정제함. 사이즈가 클수록
위에 쌓이게 됨.
- 이 Peptide bond 는 N term (Amine) -> C term (Carboxyl)
방향으로 읽음.
- 접미사 “-yl” 를 붙여가며 확장함
3. Protein Purification (단백질 정제 방법)
- Chrom 종류에는 크게 4 가지가 있음
3.1. 전하 Charge 에 따른 분류
- Anion exchange (AEX): Anion 을 잡는 크롬
- Cation exchange (CEX): Cation 을 잡는 크롬
3.2 크기 Size 에 따른 분류
- Gel 크롬
3.3 소수성 Hydrophobic 에 따른 분류
3.4 친화력 Affinity 에 따른 분류
- Affinity tag 를 이용해 단백질 정제
3-6 Edman Degradation (에드만 분해법)
- 펩타이드 아미노산 서열을 분석하는 방법 중 하나
- 과정
1. PITC (Phenylisothiocyanate)와 펩타이드를 반응시켜 Nterm (Amine 기)이 PITC 가 됨.
2.
PITC-아미노산을
강산의
조건으로
만들기
위해
Trifluoroacetic acid 를 첨가해 첫 번째 펩타이드 결합이
절단됨.
3.
절단된
PITC-아미노산을
Chrom
에
로딩해
어떤
아미노산인지 알 수 있게됨. 이에 따라 아미노산 배열
순서를 알 수 있음.
* 2 강-2. 단백질의 구조와 기능 (긴 서열분석)
- B truns: 수평하지 않은 두개의 B sheet 의 segment 의 끝
1. 단백질 분해효소 (Protease)
부분을 연결한 것. / 2 차 단백질의 유연성을 가지게해줌
-
특정
아미노산이
잘리는
특성을
이용해서
단백질을
분리해 분석할 수 있음
4.2. 3 차구조
- 잘린 Polypeptide 들을 중첩 분석해 단백질의 서열을 알 수
- 2 차구조 단백질이 결합된 3D 형태의 구조.
있음.
- 3 차구조의 변성 (Renaturation)
-> 약한 non-covalent bond 이 파괴되면 단백질의 활성을
잃게 되어 단백질이 변성되고 (Denaturation), 다시 접히게
되면 재 접힘이 일어나게 됨
- RNase A 에 의한 Denaturation 과 Renaturation 과정
2. DNA 서열 -> Protein 서열
- DNA 서열로 Protein 서열을 직접적인 해석이 불가능한
이유는 DNA 는 Exon 과 Intron 으로 구성되어있음.
- DNA->mRNA 로 전사될 때 필요없는 Intron 들이 없어지게
됨.
4.3 4 차구조 단백질 Immunoglobulin G 와 “Domain”
- IgG 는 Domain 이라고 불리는 것이 2 번 혹은 그 이상
접힌다.
- 종종 독립적으로도 접히기도 한다.
3. 단백질을 분석하는 방법? “Mass spectrometry 질량분석법”
- Particle mass (단백질+물+염) 시료에 고전압의 전자
- 단백질의 개개인으로 접히고 분리되더라도 각각 개개인의
기능을 유지하는 것이 Domain 의 특징이다.
Beem 을 쏴주어 이온화된 Particle 로 만들어줌.
- 자기장 Field 로 샘플을 로딩해 샘플이 자기장에 의해
휘어짐
- 휘는 정도는 전하에 비례하며, 이온의 질량에 반비례 함.
- 보통 단백질 질량분석에는 TOF MS 를 사용함 (MALDITime of flight MS)
4. 단백질의 구조
- 1 차구조 / 2 차구조 (서열) / 3 차구조 (α helix or turn) /
4 차구조 (완전 복잡한 구조)
- 2,3,4 차 구조의 단백질은 4 가지의 약한 결합에 의해
5. Enzymes 효소
- 반응을 촉진시켜주는 촉매제의 역할을 함
- 효소는 기질에 작용하며 / 반응을 위한 활성화 에너지를
낮추는 효과가 있음.
안정적인 구조를 띄고있음
Hydrogen bond / Ionic bond / Hydrophobic interaction
/ Van der waals interaction
4.1 2 차구조
단백질의 뼈대를 이루는 원자들 사이의 상호작용
- α helix: 카보닐 O 와 H 사이의 수소결합 / Right handed
- B sheet: Hydrogen bonding 이 지그제그로 서로 쌓인것
해석할 줄 알아야함 / 암기
5.1. Michaelis Constant (미하엘리스 상수)
- 효소의 친화도를 결정해주는 수치 값
- 높은 Km 값은 효소와 기질의 낮은 친화도를 나타냄
- 낮은 Km 값은 효소와 기질의 높은 친화도를 나타냄
5.2. Turnover number (턴오버상수) (Termed Kcat)
- 단위시간에 1 분자의 효소가 반응시킬 수 있는 기질분자의
수
- 효소의 반응촉매활성을 나타내는 지표의 하나
5.3. 효소의 모델은 2 가지가 있음
- Lock and key model / Induced fit model
- 대다수의 효소는 기질을 결합할 때 입체 구조를 바꿈
* 3 강. Nucleic Acid 구조 / 핵산의 구조
- DNA 복제를 위해 꼬아진 DS DNA 구조를 풀어주는 역할
1. DNA 사이즈와 특징
- 대부분의 Eukaryotic DNA (진핵)는 세포핵에 위치해 있다.
- Bacterial 나 Archaeal DNA 는 세포질에 위치해 있다.
- DNA 분자는 염기에 따라 다양한 사이즈로 분류 / 잘 깨짐
2. DNA Groove 의 특성
- A-tract (Adenine)이 많으면 18 도 정도 구부러진 형태이다.
- Minor groove 와 Major groove 로 나뉜다.
6. Topoisomerases DNA 회전효소 단백질
- DNA 전사나 복제과정에서 이중나선이 풀리는 복제 분기점
3. DNA 의 변성 (Denaturation, Renaturation)
앞에서 주형 가닥의 꼬임을 완화시킴
3-1. 변성을 측정하는 방법 UV260 absorbance
- 복제가 완료된 DNA 가 꼬임구조 때문에 서로 분리되지가
- 가장 간단한 방법으로 UV260mm absorbance 를 사용해
않음.
흡광도를 측정한다.
- 2 가지 타입이 있는데,
Type 1 의 경우 한 가닥을 절단한 후에 절단부위로 끊어진
가닥이 통과하고 다시 절단부위를 결합하는 기능
Type 2 는 두 가닥 모두 절단하며 ATP 를 사용함.
7. DNA 의 종류
- GC 의 경우 3pair 라 2 인 AT 에 비해 녹는 온도가 높아야함
- Base pair 사이에 Hydrogen bond 의 결합력에 따른 Tm 값
3-2. Base stacking
- “Van der waals force”와 “Hydrophobic interaction” 두가지
결합으로 일어남
- Base pair 사이의 Hydrogen bond 가 안정적인 구조를 도움
3-3. Ionic strength
- A-DNA: R hand double helix
- B-DNA: 살아있는 생명체 주로 대다수 R hand double helix
- Z-DNA: L hand double helix -> 짝이 잘못된 조건에서도
발현되는데 주로 높은 염농도 조건에서 발견된다
8. Palindrome
- 방향에 관계없이 똑같이 읽히는 구조
- DNA 구조에 영향이 미치는 것은 “이온 세기”
- DNA 의 인산기가 – charge 로 서로 밀어냄
- 만약 Salt 첨가시에 Na+가 서로를 밀어주려고 하는
성질을 낮춰주기 때문에, Nacl 농도에 따라 Tm 값이 올라감!
3-4. Denaturation 요소 3 가지
- Alkali: Phosphodiester bond 깨짐 없이 DNA strand 를 변성
- 고온: Phosphodiester 의 척추부분이 붕괴가 됨
- Acid: Acid 처리하면 Purine 계열 염기가 빠져나와 붕괴됨
3-5. DNA renaturation 또는 Re-annealing
- 3 가지 요소를 만족해야 일어남
- 온도 (20-25 도) / DNA Concentration / Time
4. Plasmid 원형의 DNA
- 원핵 Prokaryote 는 원형 DNA 구조 (Circular DS DNA)
- 진핵 Eukaryote 는 선형 DNA 구조 (DS DNA)
5. Helicases 효소단백질
9. RNA 구조는?
- Single strand 구조로 Palindrome 이 더 자주 발생할 수
있어 다양한 구조를 가지고 있다
10. RNA 가설
* 4 강. 분자생물학 실험기법
1. Gene Cloning 유전자 복제
- 유전자 Cloning 은 진핵생물 유전자를 작은 박테리아나
파지 DNA 에 연결하고 이 재조합 분자를 박테리아 숙주에
삽입
- Transfection: 외부 DNA 를 동물세포에 도입
- Transformation: 외부 DNA (Plasmid)를 Bacteria 에 도입
2. Nuclease 핵산분해효소
- Phosphodiester bond 결합을 절단해 Polynucleotide 를
5. Vectors, 유전자 운반체 (케리어 역할)
분해하는 효소 / 반대로 붙이는 효소는 Ligase
- 백터는 재조합 DNA 복제를 허용하는 DNA 전달체로서
- 3 가지로 분류 가능함 (DNase, RNase)
기능 / 크게 2 가지가 있는데 Plasmid 와 Pharge 가 있음
- DNases: 어떤것들은 DS DNA 에만 작용하고 특수하게 SS
- 삽입된 DNA 와 외부 DNA 는 DNA 복제가 시작되는
DNA 만 작용하는 것들도 있음
부위인 Origin of replication 이 없기 때문에 복제를 위한
벡터에 의존함
- 어느 부분을 자르냐에 따라 두가지로 분류 가능함
5-1. Plasmids 플라스미드
- Endonuclease: 핵산의 내부가 잘릴 때
- Exonuclease: 핵산의 끝부분을 자를 때
- Restriction endonuclease: 특정 유전자에만 자를 때
구성*
3. Restriction Endonuclease (제한 효소)
-1. Replication origin: 자가복제할때 처음 인식하는 부위
특정 유전자에만 자르는 효소
-2. Antibiotics Resistance gene: 항생제에 내성을 나타내어 /
- Type 2 제한효소는 Palindromic 인 경우에 적용 가능한데,
잡균이 자라는 것을 방지해 줌 (AmpR)
보통 4,6,8 개의 Sequence 를 가지고 있고, 잘리는 Type 에
-3. Multiple cloning site (MCS): Directional cloning 가능케
따른 명명법은 아래와 같음.
함 / MCS 에서 제한 효소 (Restriction enzyme)으로 일부
잘라서 원하는 유전자를 삽입
-4. LacZ’: MCS 를 통틀어 말함
5-2. Antibiotics resistance 항생제 저항성 (내성)
- 항생제 저항을 가질 수 있는 물질을 Plasmid 에 삽입해
- Cohesive end 의 경우 다시 붙일수있음 / 다만 척추부분
Phosphodiester bond 결합이 필요할때는 ligase 효소 필요
4. Restriction-Modification System (제한 변형 시스템)**
- 자신의 DNA 와 외래 DNA 를 식별해서 외래성 DNA 를
분해하기 위한 방어적 메틸화 (Methylation).
- Methylase (메틸화 효소)에 의해 세균 DNA 의 제한효소
자리에서
메틸화가
일어남
->
이때
세균이
생성하는
제한효소에 의해 자신의 DNA 가 분해됨을 막기 위함
선택적으로 배양 할 수 있다 (selection marker)(배양액에
해당 항생제를 투입해서 배양함)
5-3. Competent cell
- 외부 DNA 를 효과적으로 수용하기 위해 셀을 물렁하게
만드는 작업 / CaCl2 와 같은 화학적 처리 및 가열로 가능
5-4. Phage
- Bacteria 만 감염시키는 Virus
6. PCR (Polymerase Chain Reaction) **** 중요
- PCR 은 DNA 를 증폭하는데 사용되며, 클로닝을 위한 DNA
단편을 생성하는데 사용됨 / 고온에서도 활성을 잃지 않는
Taq Polymerase 사용이 핵심 / 보통 33 사이클 수행함
7. Nucleic Acid Hydridization
- 주변에 있는 다른 DNA 나 RNA 와 결합되는 상태
7-1. FISH (Fluorescence in situ hybridization)
- 표지 형광물질을 입혀 확인하고자 하는 물질을 탐색
- 복제되면서 염색체에 Probe 를 입히게됨
7-2. Autoradiography 자기방사법
- 방사선으로 농도별 분류 및 표지 가능
- 전기영동 후 -> X-ray 필름을 붙여 -> 자기방사사진촬영
7-3. Southern Blotting 서던블러팅
- DNA fragment 를 확인하는 방법
-1. 추출된 DNA 를 제한효소로 절단하고 DNA Fragment 를
- PCR 의 준비물과 과정은 크게 3 단계로 이루어지는데,
0. Preparation 준비물 준비
- DNA Template, Primer (Reverse, Formard), taq DNA
polymerase, dNTP, Buffer
1. Denaturing linear duplex DNA
- 95 도씨의 열처리로 ds DNA 을 단일가닥으로 분리
2. Annealing an oligonucleotide primer
- 55 도로 낮추게 되면 분리된 ss DNA 에 Primer 가 결합됨.
3. Extending the DNA primer with heat stable DNA pol.
- 70 도정도로 맞추게 되면 상보적 결합에 의해 새로운 DNA
가닥이 생성됨.
6-1. Real-Time PCR
- 실시간으로 PCR 을 확인하는 과정
얻어냄
-2. NaOH 와 같은 알칼리로 DNA 를 단일 가닥 상태로 만듬
-3. 모세관 현상으로 겔에서 Nitrocellulose 필터로 DNA 전이
-4. 탐지하고자 하는 DNA 와 상보적인 DNA Probe 를 제조
(발광할 수 있거나 방사선동위원소와 같은)
-5. 여과지와 Probe 를 충분한 시간동안 혼성화 진행
-6. X 선 필름에 여과지를 감광시켜 특정 DNA 존재 확인
7-4. Northern blot: RNA gel blot
7-5. Western Blot: Protein gel blot
8. DNA Fingerprinting (DNA Typing, DNA profiling)
- Nucleotide 의 특정한 배열순서를 인식하여 Restriction
enzyme 으로 잘라냄. 개체마다 Nucleotide 의 배열순서가
다르기 때문에 효소에 의해 잘리는 위치가 다르고, 잘려진
DNA 가닥의 길이가 달라지게 된다. 이를 길이에 따라
분리하여 나열한 것
- 피에서 DNA 뽑아 / 제한효소로 잘라내고 / 전기영동으로
분리하고 / Membrane 으로 Bloting 진행 / DNA Probe 로
Binding 해서 X-ray 찍고 나열해 이미지화 시킴
9. Genetic polymorphism 유전적 다양성
11-4. Nanopore DNA Sequence
9-1. Single Nucleotide Polymorphisms (SNP’s)
- 긴 DNA, RNA 조각을 실시간으로 분석할 수 있음. DNA 가
- DNA 염기서열에서 1000 개의 염기서열마다 하나의
Pore 로 들어갈 때 순차적으로 어떤것인지 즉각적으로 확인
염기서열(ATGC)가 차이를 보이는 유전적 변화 또는 변이
가능.
9-2. Tandem repeat polymorphisms
12. Site Directed Mutagenesis 위치 유도 돌연변이 법
- 특정 유전자가 반복되어 개인별 차이가 나타남
- 단백질의 특정 서열을 바꿀 때 쓰는 방법
- DNA 염기서열에서 특정 Nucleotide 를 의도한 새로운
9-3. Restriction fragment length polymorphisms (RFLPs)
Nucleotide 로 치환하거나 특정부위의 Nucleotide 를 삽입
- SNP 로 유전적 영역에 제한효소로 잘릴 수 있는 부위를
또는 변경
만들거나 제거함 (중간에 돌연변이로 바꿈)
- 이로인해 유전적 다양성을 갖게됨
- 메틸화된 ds DNA 를 가열처리해서 분리해
- 변이용 Primer (Mutagenic primer)를 달아 PCR 을 몇번
10. DNase Foot printing
돌려
- DNA 가 Working 을 하는지 확인하는 방법
- Plasmid 가 만들어지면 Dpnl 효소로 메틸이 붙어있는 쪽만
- Finger printing 과는 다름
잘라
- 단백질을 Binding 시켜 Binding 된 부분을 잘리지 않게해
단백질과 DNA 의 상호작용을 감지
- 3 가지 방법이 인기있음 / DNase, Dimethylsulfate, Hydroxyl
radical
11. DNA Sequencing DNA 서열 확인
- NTP: ATP, TTP, CTP, GTP (RNA 구성요소)
- dNTP: dATP, dTTP, dCTP, dGTP (DNA 구성요소)
- ddNTP (2,3 번 탄소 둘다 deoxy)
11-1. Sanger-Chain Termination Method: Sanger sequence
- Chain termination method 로 ddNTP 를 이용하여
염기서열을 탐색하는 방법
- PCR 중 DNA 합성과정에서 ddNTP 가 결합되면 합성이
중지되는 원리로 Sequence 분석 가능 (각 ddNTP 에
색상주입)
11-2. Shotgun Sequence
- DNA 를 기계적으로 깨뜨려서 DNA Fragment 들을 읽음
- 짧은 서열들이 누락되어 정확도가 별로임. 잘 안쓰임
11-3. Next-Generation Sequence (NGS)
- 수천개의 DNA 가닥을 심어서 한번에 순차적으로 읽음
- 금전적으로 괜찮아서 자주 사용됨
* 6 강. 분자생물학의 유전 분석
3. Prototroph 와 Auxotroph
1. 유전자 분석하기 좋은 3 가지 Organism
- Prototroph 는 최소한의 배지로 성장 가능한 애들. 적어도
Salt, nitrogen, carbon source 만 있으면 됨
1.1 Drosophila melanogaster (황색 초파리)
- Auxotroph 는 그 외 추가적인 영양분이 필요함
- Mice (쥐): 생식을 하는 속도가 느리고 (대략 3 주), 비싼
금액, 많은 개체수가 필요해 공간적인 부분이 필요함
4. Wild type & Mutant (자연타입과 돌연변이)
- Fruit fly (파리): 생식력이 좋고, Life cycle 이 짧음
- 돌연변이는 다양한 상황 환경에서 발생이 되는데, 예시로
(12 일정도), 공간이 좁아도 됨, 염색체가 4 개밖에 안됨,
온도, 특정 단백질을 가지고있는 경우 억압되어 번역과정을
젠더 구분이 쉬움.
거치지 못하는 경우 (Suppresor-sensitive mutation) 등이
있다
- 초파리의 유전자 결합이 일어날 때 Crossing over 라는
교차가 발생이 됨. 교차는 유전자 재조합 과정의 마지막
4-1. Mutant (돌연변이)
시기이며 주로 서로 맞는 두 염색체의 서로 맞는
- 돌연변이의 타입은 크게 네가지로 분류
부위들끼리 절단되어 다시 이어지며 일어남.
- 유전자의 한부분이 Point mutation (바뀜) / Deletion
(없어짐) / Insertion (삽입됨) / Revertant (다시 돌아옴)
- Morgan 은 이 Crossing over 을 통해 재조합 염색체의
길이가 증가됨을 밝힘
- Mutant 는 Original 과 비교했을 때 많은곳에 사용될 수
있음 /
2. Escherichia coli (E.coli, 대장균)
- 모든 박테리아는 membrane 으로 둘러 쌓여 있고
5. Conjugation (DNA 유전정보의 교환)
Peptidoglycan 으로 겹겹히 쌓여있어 단단한구조임.
- 영양 요구량이 다른 두 종류의 대장균에서 최소한의
- 박테리아는 이 Peptidoglycan 의 두께에 따라 두가지로
미디어에서 성장할 수 없었지만. 두가지를 섞고 배양하면
나뉨 / Gram 양성 (퍼플), Gram 음성 (핑크)
자랄 수 있는 레더버그와 테이텀의 실험에서 증명됨
-> 이에 따라 유전적 물질이 교환되었음
5-1. Conjugation 과정
- 일단 두가지 타입이 필요 Donor (male)/Recipient (Female)
- sex pilus 로 두 타입을 이어주고, SS DNA 가 전달이 되어,
Rolling circle replication 으로 복제가 일어남
2-1. Gram staining 과정
고정 – Crystal Violet 으로 염색 – Iodine Treatment –
Decolorisation (에탄올로 탈색) – Safranin 처리해서 대조염색
2-2. 대장균의 생장은 37 도씨의 배지에서 전형적인
성장곡선을 나타냄 Lag phase(유도기), Log phase (성장기),
Stationary phase (정지기), Death phase (사멸기)
2-3. Subculture 란? 배양된 미생물 증식을 위해 새로운
배지에서 대를 이어 계속 배양함 (계대배양)
- Colony type 은 보통 Single colony 로 배양하게 되는데
Spreading 타입과 Streaking 타입이 있음
- Single colony 로 배양하게 되면 오염 여부나, 미생물의
상태를 확인하고 갈 수 있음 (단체로 있음 확인 어려움)
5-2. Rolling circle replication
- 한 방향성 핵산 복제과정
5-3. Hfr & F- conjugation
- 이것도 동일하게 Hfr 은 재조합을 잘하기 때문에 Fplasmid 가 보통 따로 존재하지 않고 세균 DNA 에 재조합된
상태로 존재한다. 이경우 Hfr 세포가 F-plasmid 를 전달할 때
보통 F 유정자를 온전하게 전달하지 못하므로 수여세포는
계속 F 가 없는 F- 상태
6-1. Yeast Life cycle
5-4. F’ plasmid
- Hfr 균주로부터 F plasmid 를 비정상적으로 절제하면
인접한 DNA 영역을 제거 가능함. 이것이 F’plasmid
6. Saccharomyces cerevisiae 출아형 효모
- 생식 방법에는 두가지가 있음
- Binary fission
- Budding in yeast
* 7 강. Viruses in Molecular Biology 바이러스
1. Virus vs Virion
- Virus: 숙주에 들어가서 기생
- Virion: 숙주없이 Particle 로 떠다님
1-1. Virus 의 종류는 다양하게 있음
1-2. 핵산의 종류에 따른 분류
- RNA Virus: HIV, 일본뇌염, 사스, 홍역, 코로나
- DNA Virus: B 형간염, 포진 등
1-3. 기생장소에 따른 분류
- 동물성 Virus: 홍역, 광견병, 독감, 천연두, 소아마비, 뇌염
- 식물성 Virus: TMV, 감자 위축병 바이러스
- 세균성 Virus (박테리오파지): T2 파지, T4 파지 등
2. Baltimore classification scheme (바이러스의 분류)
- 핵산 종류에 따른 유전자를 발현하는 방식
6. Virulent phages (T-even phage)
-
3. Bacteriophage 박테리오파지
- 세균을 숙주세포로 하는 바이러스. 세균의 균체를 녹여서
증식하여 세균을 먹는다 라는 뜻.
3-1. 장점?
- 박테리오 파지를 이용한 치료 (환자를 공격하는 세균을
알아내어 세균을 먹는 파지를 이용해 환자를 치료)
- 세균을 진단하는 파지 (파지 내부에 형광물질을 삽입해
세균 존재 여부를 확인할 수 있음)
- 지카바이러스 이용한 암치료 (뇌를 공격하는 특성이 있어
뇌종양 치료연구에 이용)
4. Bacteriophage 의 생활사
4-1. Lytic life cycle (용해) 세포가 용해되어 죽음
-1. 파지가 박테리아 셀에 부착됨. 이때 부착된 꼬리를 통해
핵산이 들어감
-2. 이 핵산이 안에 박테리아 안의 박테리아 DNA 를
갉아먹고 증식을 하게됨.
-3. 증식된 파지에 의해 기존 세포가 용해됨
4-2. Lysogenic life cycle (용원) 조화롭게 살아감
-1. 파지가 박테리아 셀에 부착되고. 꼬리를 통해 핵산이
들어감
-2. 이 핵산이 안에있는 박테리아 DNA 에 삽입됨.
-3. 증식되어 같이 살아감
-4. 조화롭게 살아가다가 나중에 Lytic (용해)로 전환됨
4-3. Chronic infection life cycle (만성 감염)
세포 막이나 Membrane 을 깨지않고 Host 죽이지 않고 살아
- 길쭉하게 생긴 Inoviridae (filarmentous phage) 가 주로
박테리아와 공존해서 살아감
5. Bacteriophage Counting
- 숫자를 세기 위해서는 Host 가 있어야함 Bacterial law
(평판배양)
* 8-1. DNA Replication_Prokaryote
4. 용어 정리
1. DNA Replication 가설 3 가지
4-1. Bidirectional replication: Eukaryotic 이나 Bacterial
- Semi-conservative replication
DNA 는 두개의 방향성을 갖는 복제를 함.
- Conservative replication
4-2. Plasmid’s Copy number: Plasmid 마다 성능이 달라
- Dispersive replication
Number 를 붙임
5. DNA Polymerase
2. DNA Replication 가설을 어떻게 확인?
5-1. DNA Polymerase l
- Meselson and Stahl 실험
- DNA Polymerase l 의 역할은 DNA 복제간 상보적 결합을
할 수 있게 결합을 돕는다.
3. DNA 의 복제 과정****
- Template DNA 가 있어야 Base pairing 에 따라 염기가 붙음
- Primer 가 우선적으로 붙어야 Nucleotide 가 붙음.
- 5’->3’ 방향으로 Sequencing 됨
- 특수한 역할은, 정방향으로 복제가 되다가 잘못 붙은
염기를 3’->5’ 쪽으로 다시 돌아가 재 합성을 시킴 ->
이것이 “3’->5’ Exonuclease – Proofreading function” 명명
- 또 하나로는 중간에 잘못된 부분을 “5’->3’ exonuclease –
editing function” 으로 잘라줌
- 각각의 도메인의 역할이 있는데 (1 은 작고 2,3 은 큼),***
Domain l (5’->3’ exonuclease activity), Domain ll (3’->5’
Exonuclease activity), Domain lll (DNA Polymerase activity)
-1. ds DNA 가 먼저 Helicase 효소와 topoisomerases
ll 형에 의해 ss DNA 가 된다.
–2. 분리된 ss DNA 에 SSB (Single stranded DNA binding
protein)이 달라붙어 다시 결합하는 것을 막아준다
-3. Leading strand 에 DNA Polymerase lll 이 달라붙어, 5’-3’
방향으로 쭉 복제가 된다.
-4. Lagging strand 에는 DNA Polymerase l&lll 이 둘다
달라붙게 되는데, 이때 복제되는 방향과 분리되는
DNA 가닥이 반대이므로 지속적으로 Primer 가 붙어
부분부분 추가로 복제를 해주어야 한다.
이때 이 Primer 는 RNA 임!**
-5. 부분 부분 복제가 일어나고 인간의 경우 (In vivo)
RNA 인 Primer 를 분해하기 위해, RNase H 효소가 달라붙어
Primer 를 분해함. (이렇게 분해된 절편을 Okazaki
fragment 라고 명명함)
-6. 중간중간 끊어진 Back bone (Phosphodiester bond)을
DNA ligase 효소로 붙여준다.
3-1. Replisome 의 구성
DNA Polymerase, Primase (Primer 를 만드는 효소), Helicase,
Single stranded DNA binding protein (SSB), DNA Gyrase
(Topoisomerases Type ll), RNase H, DNA ligase
6. Replicon Model
- Prokaryote (원핵) 원형 DNA 는 Origin 이 하나여서 복제를
시작하는 지점이 하나임
- Eukaryote (진핵) 선형 DNA 는 Multiple origin 으로 복제를
시작하는 지점이 많아 동시 다발적으로 일어남
7. OriC (Origin of chromosomal replication)
- 대장균의 염색체 복제 시작은 “OriC”에서 시작됨 ->
이유는? A 와 T 가 많아 끊어지기 쉬움 (시작하기 좋은곳)
8. 용어 정리
- Elongation: 늘리는것 / 복제
- Sliding clamp: 이중나선 구조가 분리되는 것을 감싸고
복제에 더 도움이 됨, 단백질의 개수가 많으면 성능이 더
좋음
*8-2. DNA Replication_Eukaryote
1. Eukaryote DNA Replication
- Eukaryote 는 선형 DNA 구조 /특이점으로는 Multiple
origins 를 가지고 있어 복제 시작점이 많음
- Sliding clamp 또한 동일하게 필요함
- 주된 3 type 의 DNA Polymerase 를 필요로 함
2. End-Replication Problem
- 다만 Eukaryote 의 DNA 선형구조는 복제시에 문제가
있는데, 시작되는 지점에 RNA primer 가 RNase H 에 의해
분해되면 추가로 붙을 수 없기에 Gap 이 생김.
3. Telomere
- 선형 DNA 의 끝부분 gap 문제로 염색체의 끝부분이
노년기에 들어들 수 록 점점 소실되어감
4. Telomerase
- 수명, 노화의 원인으로 불리는데, Telomere 를 완화시켜줄
수 있는 효소는 “Telomerase”임
- Lagging strand 에서 Telomerase 에 의해 RNA 조각을
덧대어 조금이나마 회복할 수 있게 도와줌