현대생물학실험 II
TA Cloning & Transformation,
Mini-Prep, Restriction Enzyme Cut
과/분반
생명과학과/수요일
학번
20191423
이름
이수민
교수님
김성룡 교수님
조교님
백재현, 조예진, 임한아
Abstract
이번 실험은 PCR로 증폭시킨 gene을 cloning, transformation하고 mini-prep을 통해 추출하여
restriction enzyme으로 cut한 insert gene을 전기영동 기법으로 확인하는 것이다. Transformation이
성공적으로 일어난 colony를 selection 하기 위해 blue-white screening 기법이 이용되었다. lacZ
발현체계를 이용해 배지에 Xgal과 IPTG를 넣어주어 우리가 원하는 white colony를 찾아내는 것이
다. Mini-prep은 세균에서 plasmid만을 추출하는 방법이고, restriction enzyme은 세균 유래, 염기서
열 특이적 dsDNA 절단 효소이다. pGEM-T vector로 PCR한 gene을 TA cloning 하였고,
transformation 후 AmpR, X-gal, IPTG이 있는 고체배지로 lacZ selection하여 transformation된
white colony를 선별했다. Mini-prep을 한 후에는 그 결과를 전기영동으로 확인했다. Prep-DNA와
pET-21a vector에 HindIII와 NdeI 제한효소를 처리해 enzyme cut을 하였고, 전기영동으로 결과를
확인하였다. Mini-prep 전기영동 결과에서는 empty lane이 하나 나왔고, negative control과 유사한
lane이 하나 나왔다. Plasmid가 삽입되지 않은 colony를 고른 경우 이런 문제가 있을 수 있고, 더
높은 농도의 antibody를 처리하여 개선 가능하다. Negative control과 유사한 lane은 false positive
라고 추정하였다. Prep-DNA 전기영동에서는 3kbp와 750bp 부근에 band가 검출되었고, pET-21a
vector에서는 3kbp보다 큰 band가 나타났다. 그 이유는 HindIII와 NdeI 제한효소 절단부위의 간
격이 pET-21a의 경우 65bp 정도로 작아 절단부위가 gel을 빠져나갔기 때문이고 원래 size가
5kbp가 넘기 때문이며, prep-DNA에서는 insert DNA 근처인 750 bp정도 간격이 되기 때문이다.
Band를 포함하도록 gel을 잘라 purification한 후 nanodrop으로 흡광도를 측정해 농도와 순도를
계산하였다. pET-21a vector은 9.75 𝑛𝑔/𝑚𝑙, insert DNA는 6.5 𝑛𝑔/𝑚𝑙이 나왔다.
Introduction
Target gene을 vector DNA에 삽입하고 cell에 넣어 증폭시키는 것이 cloning 기법이다. 그 예로
는 제한효소 이용 cloning, TA cloning 등이 있다. 제한효소 이용 시에는 insert와 vector에 모두 제
한효소 처리를 해야 잘 삽입된다. 본 실험의 TA cloning은 Taq polymerase에 의해 생성된 PCR
product에
3’-A
overhang과
T
vector의
T
돌출부의
결합을
이용하였다.
Ligation은
T4
bacteriophage 유래의 T4 DNA ligase로 5’-P, 3’-OH 사이의 phosphodiester bond를 형성하는 것이
다. 반응은 3’-OH가 인산기의 P를 때리며 시작하고 DNA ligase가 2 ATP를 이용해 new
phosphodiester bond를 형성하며 일어난다. 순서는 free ATP에 의한 DNA ligase의 selfadenylation, adenyl group의 transfer, phosphodiester bond 형성 순으로 일어난다.
Transformation은 cell 내 외래 DNA 유입으로 유전형질의 변환이 일어나는 것이다.
LacZ selection은 lac operon의 lacZ 유전자에서 생성된 β-galactosidase(LacZ)의 분해 여부에 따
라 색이 달라지는 X-gal을 이용하여 colony를 selection 하는 방법이다. Isopropyl β-D-1thiogalactopyranoside (IPTG)는 allolactose의 analog로 lac operon의 inhibition을 저해하는데,
inhibitor과 결합하여 β-galactosidase가 생성될 수 있도록 한다. 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-Dgalactopyranoside (X-gal)는 lactose의 analog로 β-1,4 linkage가 분해되면 파란색, 분해되지 않으
면 하얀 색이 된다. Ampicillin 처리와 X-gal과 IPTG 처리를 통해서 recombinant gene이 포함된
plasmid (antibiotics resistance gene)이 있는 colony만 골라낼 수 있다.
배지에 ampicillin 처리 시 plasmid가 없으면 colony를 형성할 수 없고, plasmid는 있으나
recombinant gene이 plasmid에 없으면 blue colony가 형성된다. Recombinant gene 포함 plasmid
가 있는 Escherichia coli (E. coli)는 white colony를 형성한다. 이번 실험에서는 pGEM-T vector을 사
용했으며, lacZ selection이 가능하고 3000bp size이다.
Mini-prep은 mini-scale preparation of plasmid DNA의 약자로 이번 실험에서는 alkaline lysis를
이용하였다. 1979년 Birnboim과 Doly가 최초로 개발하였으며, pH 12.0 – 12.5의 alkaline 조건에서
covalently closed circular DNA (plasmid DNA)와 linear DNA가 서로 다른 정도의 denaturation이 일
어남을 이용해 plasmid DNA만을 분리해내는 방법이다.
Resuspension step, lysis & denaturation step, neutralization & renaturation step, EtOH,
Isopropanol precipitation step으로 이루어진다. Resuspension step에서는 EDTA와 glucose를 처리하
여 E. coli의 cell wall과 cell membrane을 약하게 한다. EDTA는 Mg2+ chelator로 전기적 균형을 저
해해 cell membrane과 cell wall을 약하게 하며 DNase에 의한 DNA 분해를 방지한다. Glucose는
cell membrane 파괴를 막기 위해 삼투압을 조절하고, pH 8.0을 완충하는 tris buffer과 RNA 분해를
막는 RNase A도 들어간다.
Lysis를 위해서 NaOH와 sodium dodecyl sulfate (SDS)를 넣어 alkaline 상태를 만들면 DNA
denaturation이 일어난다. 이때 NaOH는 pH 12.0~12.5 조건을 만들기 위해 들어가 chromosomal
DNA를 완전히 denaturation 시키고 plasmid DNA를 interlocked 형태로 denaturation 시킨다. SDS
는 세포막 phospholipid를 파괴하는 detergent로 cellular protein 또한 denaturation 시킨다.
Neutralization step에서는 pH를 중성으로 만들어 renature 된 plasmid DNA를 얻고, 고분자 물
질을 침전시킨다. Potassium acetate가 protein, denatured chromosomal DNA, cell wall parts와 엉
긴 SDS에 결합해 침전시키고, centrifuge를 통해 흰 pellet으로 분리한다. Acetic acid는 높아졌던
pH를 중성으로 낮추어 plasmid DNA의 renaturation을 유발한다. 이때 genomic DNA는 완전히
renaturation 되지 않아 엉긴 상태가 된다.
EtOH, Isopropanol precipitation step에서는 iso-propanol과 100% EtOH로 plasmid DNA를 침전
시키고 70% EtOH로 salt 등의 불순물을 제거해 plasmid DNA만을 추출한다. EtOH로 DNA를 분리
하는 원리는 EtOH가 DNA와 salt를 둘러싼 H2O 분자를 빼앗고 salt가 DNA phosphate backbone
과 결합해 안정적으로 이온 결합 형성이 일어나 침전한다.
Mini prep 과정을 살펴보면 cell lysis 과정에서 chromosomal DNA가 linear form으로 잘리고,
denaturation 과정에서 염기성 용액의 double strand DNA가 denaturation 된다. 이때 circular DNA
인 plasmid는 linear form인 경우와 denature 되는 정도가 다르며 chromosomal DNA의 경우
plasmid DNA보다 훨씬 size가 크기 때문에 renaturation 되지 않는다. 이번 실험에 이용한
vector은 pET-21a(+) vector로 5443bp size를 가지며 Hind III(173), Nde I(238)의 제한효소 절단부위,
ori(3227)을 갖는다.
제한효소란 4~6bp 정도의 특이적인 DNA 염기 서열을 인식하고 해당 부위 혹은 근처의 특정
부위 dsDNA를 절단하는 효소이다. 제한효소는 원래 세균 cell 내로 침입한 외부 DNA 제거를 위
한 방어기작에서 사용되는 DNA 절단효소이며, 방어기작은 restriction modification system이라고
부른다. 세균 cell은 가지고 있는 제한효소 인식부위와 동일한 DNA 서열 부분이 methylation 되
어 있어 제한효소로 절단되지 않는다. 제한효소에 따라서 인식 염기의 개수, 절단 부위, 인식하는
서열이 다르다. Endonuclease로서 phosphodiester 결합을 끊어 DNA를 절단한다. 해당 제한효소를
생산하는 균의 속명의 가장 앞 1문자, 종명의 가장 앞 2문자, strain 명을 붙여 쓰는 방식으로 이
름을 붙인다. 같은 균주가 여러 제한효소를 생산하는 경우 순차적으로 로마숫자를 뒤에 참가한다.
제한효소는 Type I, Type II, Type III로 분류할 수 있다. Type I 제한효소는 인식 염기서열에서 최대
1000bp 떨어진 염기를 절단하며, 절단 부위가 불규칙적이다. Type II 제한효소의 경우 인식 염기서
열 혹은 그 주위 DNA를 절단하며, 절단 부위가 정확하게 정해져 있다. Type III의 경우 인식 염기
서열에서 20~30bp 떨어진 서열을 자르며 절단이 거의 완전하게 일어나지 않고, 절단이 일어나려
면 인식된 염기서열 반대로 또다른 인식부위가 있어야만 한다. 따라서 cloning 실험에는 type II
제한효소가 이용된다. 이때 제한효소가 인식하는 염기서열은 두 사슬의 3’에서 5’ 방향으로 동일
한 염기서열을 가지는 회문구조라는 특징이 있다. 제한효소의 절단부위 종류에는 blunt end와
sticky end가 있다. Blunt end는 대칭축 위치로 두 가닥의 같은 부분에서 절단이 일어나 단일사슬
이 돌출되지 않고 절단된 형태이며 Sticky end는 절단부위에 single strand가 돌출된 형태이다.
이번 실험에 이용한 제한효소는 Hind III와 NdeI으로 각각 5’…A/AGCTT…3', 5’…CA/TATG…3’로 인
식서열을 가지며 sticky end로 잘라낸다. Hind III는 Haemophilus influenzae에서 발견되었으며,
NdeI은 Neisseria denitrificans에서 발견되었다. NdeI은 start codon인 ATG가 인식부위에 들어있어
해당 지점을 기준으로 유전자가 발현된다.
제한효소의 활성조건을 만족시켜주기 위해서 buffer을 넣는데, 효소마다 최적 조건이 다르다.
Restriction enzyme reaction buffer은 pH를 유지하는 Tris-HCl, cofactor로 작용하는 Mg2+를 제공하
는 MgCl2, salt인 NaCl과 KCl, Free sulfhydryl groups가 있는 enzyme의 안정성을 보조하는 DTT가
들어간다. 반응조건이 달라지면 제한효소의 비특이적 인식과 절단이 일어나는 star activity가 나타
날 수 있다. 여러 제한효소 이용 시에는 범용 buffer을 사용하여 전반적인 효소 활성을 도모한다.
Spectrophotometer로 absorbance, 즉 optical density (O.D.)를 측정해 DNA 농도를 구할 수 있다.
흡광도는 Absorbance (A) = -log(It/I0)의 식을 만족하고, Beer-Lambert Law에 따라 A = ε(몰흡광계
수)*C(시약 농도)*l (cuvette 길이) 식에 넣어 시약의 농도를 구할 수 있다. OD260 에서 Double
strand DNA의 몰흡광계수는 0.02 (μg/ml)-1cm-1이다. Nanodrop은 1~2μl 정도 미량의 핵산 혹은
단백질 sample의 흡광도와 순도를 측정하는 spectrophotometer이다. 표면장력으로 고정시키며,
몇 초 내에 측정 가능하다.
Materials & Methods E. coli 풀네임 앞에 적기
TA cloning 을 하기 위해 시약을 e-tube 에 아래의 표와 같이 넣는다.
Table 01 2x ligase buffer 조성
Table 02 TA cloning reagent 조성
60mM Tris-HCl pH 7.8
2x ligase buffer
10μl
20mM MgCl2
Pure PCR Product (133.2ng/μl)
0.28μl
20mM DTT
T4 DNA ligase
1μl
2mM ATP
T vector (pGEM) (50ng/μl)
1μl
DIW
Up to 20μl
기포가 생기는 것에 주의하며 넣고 pipetting 으로 잘 섞은 다음 RT, 1hr 배양하고 ice 에 둔다.
Transformation 을 위해 rt 에서 배양 시 LB Agar (AmpR ) plate 에 IPTG (0.1M) 40 ㎕와 X-Gal (40
mg/ml) 30 ㎕를 분주한 후 spreading 한 후 37℃에서 말린다. 이 과정은 알코올 램프 앞에서
진행하고, competent cell 을 ice 에 두어 녹인다. 20 ㎕의 ligation reaction mixture 을 DH5α 수용성
세포 100 ㎕에 넣고 tapping 한 후 30 min, ice 조건으로 배양한다. 42℃ water bath 에서 90 sec
heat shock 하고 ice, 2 min 식힌다. E-tube 에 LB 용액 900 ㎕를 넣은 다음 37℃ shaking
incubator(225rpm)에 1hr 배양한다. 13000rpm, RT, 1 min 조건으로 centrifuge 한 후 상층액을
버린다. 침전물을 남은 LB 로 풀어준다. LB Agar (AmpR+X-gal+IPTG) plate 에 분주하고 spreading 한
후 뒤집어서 37℃에서 over night 배양한다. white/blue colony 를 확인하고 다음 실험에 이용할
white colony 는 표시해둔 후 4℃에서 보관한다. Mini-prep 실험 실시 1 일 전에 표시해둔 white
colony 를 white tip 으로 떠서 tip 을 LB test tube(3 mL/Amp 50)에 넣어 inoculation 한다. 37℃
shaking incubator, overnight 조건으로 배양한다. 이때 조별로 2 개의 colony 를 inoculation 한다.
Mini-Prep 을 위해서 아래 세 개의 표와 같이 시약을 넣어 solution 1 인 resuspension buffer,
solution 2 인 lysis buffer, solution 3 인 neutralization buffer 를 만든다.
Table 03 Resuspension buffer 조성
Table 04 Lysis buffer 조성
Final con.
Table 05 Neutralization buffer 조성
Final con.
1M Glucose
50mM
5M NaOH
0.2M
1M Tris-HCl pH8.0
25mM
10% SDS
1%
0.5M EDTA pH8.0
10mM
Final con.
5M potassium
3M
acetate
Glacial acetic
11.5%
acid
하루 전에 picking 한 E. coli colony 1.5 ml 을 centrifuge 하기 위해 micro centrifuge tube 로 옮겨
13000 rpm, RT, 1 min 조건으로 centrifuge 하고 상층액을 제거한다. Solution 1 에 10 mg/ml RNase
A 를 최종 농도 100 μg/ml 넣고 solution 1 을 100 ㎕ 따서 micro centrifuge tube 에 넣고
pipetting 을 통해 resuspension 한다. Solution 2 를 200 ㎕ pipette 으로 넣고 5 회 inverting 한다.
Lysis buffer 을 넣은 후나 neutralization buffer 을 넣은 후에는 절대로 vortexing 하지 않는다.
Solution 3 를 150 ㎕ 넣고 5 회 inverting 하고 ice, 5 min 둔다. 4 ℃, 13,000 rpm, 10 min 조건으로
원심분리를 돌린다. isopropanol 300 ㎕가 들어있는 e-tube 에 1:1 비율이 되도록 상층액 300 ㎕
취해 넣고 vortexing 하여 섞는다. 4 ℃, 13,000 rpm, 10 min 조건으로 centrifuge 한다. Pellet 이
제거되지 않도록 조심하면서 상층액을 제거하고 70% EtOH 500 ㎕ 넣은 다음 5 회 조심스럽게
inverting 한다. 4 ℃, 13,000 rpm, 10 min 조건으로 centrifuge 한다. 상층액을 최대한 천천히
제거하여 벽면의 에탄올이 가능한 적게 남도록 한다. 뚜껑을 열고 잘 말려서 pellet 이 투명해질
때까지 기다린다. DIW 를 30 ㎕ 넣고 DNA 를 DIW 에 녹인다. 새 tube 에 6 X DNA loading dye 1
㎕, mini prep 한 plasmid DNA 5 ㎕를 넣어 섞고 0.8 % gel 에 6 ㎕의 DNA size marker 와 함께
loading 하고 180 V 에서 20 min 정도 전기영동한다.
Plasmid DNA 를 제한효소로 자르기 위해서는 아래의 표와 같이 용액을 넣어준다.
Table 06 Enzyme cut mixture 조성
Prep-DNA
(1000ng/ml)
Uncut
pET-21a
(1000ng/ml)
(1000ng/ml)
Plsmid DNA(2μg)
2 µl
2 µl
2 µl
HindIII(15units/μl)
1 µl
0 µl
1 µl
NdeI(10units/μl)
1 µl
0 µl
1 µl
10X buffer
2 µl
2 µl
2 µl
Up to 20 µl
Up to 20 µl
Up to 20 µl
DIW
37℃ Water bath, 1 hr 조건으로 incubation 한다. 300 ml 삼각플라스크에 agarose 0.5g, 1X TAE 50
ml 을 넣고 50 ml 의 1% agarose gel 을 만든다. 전자레인지에 뚜껑을 랩으로 막고 구멍을 뚫은
플라스크를 넣고 1.5 min 녹인 후 60℃ 정도로 식히고 EtBr 을 5 ㎕ 넣어주어 10000X 희석이
되도록 한 후 살살 흔든다. Gel box 에 부은 후 gel comb 를 바로 끼운다. 이때 기포가 생기지 않게
주의해야 하고, RT 에 15 min 정도 두어 gel 이 완전히 굳게 한다. Comb 를 제거한 다음 gel 을
전기영동장치에 넣고 1 mm 정도 더 높이 전기영동 buffer 인 1x TAE buffer 을 넣는다.
DNA gel extraction 을 위해 반응이 끝난 시료에 6X loading buffer 을 넣어 24 ㎕ 시료 전부를
agarose gel 에 loading 하고 180V, 30 min 동안 전기영동한다. UV lamp 에서 DNA band 를 확인하고
band 가 포함되도록 gel 조각을 잘라서 microfuge-tube 에 넣는다. 원래 GB buffer 을 gel 무게의
3 배 e-tube 에 넣어야 하지만, 500 ㎕ 넣는다. E-tube 를 10 min, 50 ℃ water bath 에 10 min 두어
gel 조각을 완전히 녹인다. E-tube 안의 시료를 전부 spin column 으로 옮기고 13000 rpm, 1min
조건으로 centrifuge 한다. Flow through 를 버리고 collection tube 를 다시 삽입한다. NW buffer
750 ㎕를 넣고 13000rpm, 1min centrifuge 후 flow through 를 버리고 collection tube 를 다시
삽입한다. 13000rpm, 3min centrifuge 하고 spin column 을 microfuge-tube 로 옮긴다. DIW 를 20 ㎕
넣고 2 min 동안 세워둔다. 13000 rpm, 1 min centrifuge 하여 purified DNA 를 추출하고 DNA
농도를 측정한다. Insert DNA 의 경우 DNA 10 ㎕, DIW 90 ㎕을 넣고 vector DNA 의 경우 DNA 20
㎕, DIW 80 ㎕ 넣어 spectrophotometer 로 OD260 값을 측정한다. DIW 로 blank 를 잡는다. 나머지
DNA 는 -20℃에 보관한다.
Results
Figure 01 TA cloning 후 LacZ selection 한 결과; Inoculation 한 white colony를 붉은 원으로 표시
하였다.
Table 02의 insert DNA volume의 계산 과정은 다음과 같다.
𝑖𝑛𝑠𝑒𝑟𝑡 𝑠𝑖𝑧𝑒
𝑖𝑛𝑠𝑒𝑟𝑡 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 = (
) × 𝑣𝑒𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑚𝑎𝑠𝑠 × 3 ÷ 𝑖𝑛𝑠𝑒𝑟𝑡 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛
𝑣𝑒𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑠𝑖𝑧𝑒
≈ 750𝑏𝑝
=(
) × 50𝑛𝑔 × 3 ÷ 133.2𝑛𝑔/𝜇𝑙 ≈ 0.28𝜇𝑙
3000𝑏𝑝
Figure 02 TA cloning product를 mini-prep 한 후에 전기영동 한 결과; band가 2k와 3k 사이에 나
타난 것과, 3k보다 큰 band가 하나 있다.
Figure 03 mini-prep DNA와 insert DNA가 삽입된 pET21a vector을 제한효소로 절단하여 전기영
동 한 결과; mini-prep DNA lane은 band가 uncut과 비슷하게 3k와 2k 사이에 하나 나타났으며,
약 750bp에 하나 존재한다. pET-21a vector lane은 band가 3k 위쪽에 하나 나타났다.
dsDNA concentration = 50
𝜇𝑔
× 𝑂𝐷260 × 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟
𝑚𝑙
Figure 03 에서 전기영동 한 mini-prep DNA lane 의 insert DNA band, 그리고 pET-21a vector
lane 의 vector DNA band 를 각각 gel purification 을 진행하고 nanodrop spectrophotometer 로
260nm
의
흡광도와
순도(A260/A280)를
측정하였다.
𝐴260 × 50𝜇𝑔/𝑚𝑙 × 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟
식으로
계산하여 농도를 구한 결과는 다음과 같다.
𝑖𝑛𝑠𝑒𝑟𝑡 𝐷𝑁𝐴: 0.013 × 50𝜇𝑔/𝑚𝑙 × 10 = 6.5 𝑝𝐸𝑇21𝑎 𝑣𝑒𝑐𝑡𝑜𝑟 𝐷𝑁𝐴: 0.039 × 50𝜇𝑔/𝑚𝑙 × 5 = 9.75
Insert DNA 의 경우 농도는 6.5 𝑛𝑔/𝑚𝑙, pET21a vector DNA 의 경우 농도는 9.75 𝑛𝑔/𝑚𝑙 이다.
Discussion
우선 figure 01을 보면 여러 white colony와 blue colony가 모두 잘 나타난 것을 확인할 수 있다.
여기에서 나온 white colony 두 개를 따서 mini-prep 하여 DNA만을 분리해낸 후 figure 02에 있
는 전기영동 실험에 이용하였다.
Figure 02에서 우선 positive control과 negative control을 보면 각 lane에 두개의 band가 관찰되
며, ladder로 크기를 가늠해 보면 두 band 모두 positive control의 band가 더 위에 있다는 것을
확인할 수 있다. 가장 아래에 있는 band는 PC는 2.5kb 근처에, NC는 2kb 근처에서 확인할 수 있
다. PC는 TA cloning 결과 insert gene이 삽입된 vector DNA를 의미하고, NC는 삽입되지 않은
vector을 의미한다. Insert DNA가 약 750bp이므로 약 500bp 정도의 차이가 나는 것을 확인할 수
있다.
두 개의 위치에 band가 나타나는 이유는 plasmid의 경우 circular DNA이기 때문에 supercoiled
DNA인지, nicked DNA인지에 따라서 agarose gel을 통과하는 속도가 다르기 때문이다. 같은 크기
의 plasmid이더라도 supercoiled DNA는 전기영동 결과 더 size가 작다고 나타나고, nicked DNA는
더 크다고 나타난다.
3조의 실험결과를 보면 NC와 동일한 위치의 두 개의 band가 나타난 lane이 있고 아무런 DNA가
검출되지 않은 lane이 있다. NC와 동일한 위치의 band가 나타난 lane은 false positive를 의미할
것이다. False positive란 선별 과정에서 양성 (이 경우 white colony가 형성) 결과를 나타내었으나,
실질적으로는 선별하고자 했던 대상이 아닌 경우를 의미한다.
3조의 또 다른 lane에는 아무 band도 나타나지 않았다. Selected colony에 plasmid가 없었다고 볼
수 있다. 그 원인으로는 antibiotic level used가 너무 낮았거나 satellite colony가 selected 때문일
수 있다. Antibiotic level이 너무 낮으면 antibiotic resistant gene이 있는 plasmid 없이도 일부
colony가 생장할 수 있기 때문이다. 이를 방지하려면 더 높은 농도의 antibody를 처리해주면 된
다. Satellite colony가 selected 되었을 수 있다. 이를 방지하기 위해선 크고, 잘 성장한 colony를
선택해서 실험에 이용해야 한다. 이번 실험에서 empty lane은 이러한 이유로 생겼다고 볼 수 있
다.
Figure 03에서 mini-prep DNA cut lane에는 pZEM-T vector (3000bp)와 PCR product인 750 bp gene
이 연결된 상태에서 제한효소를 처리한 후 전기영동 한 결과이다. pZEM-T vector은 Nde I 제한효
소 절단부위와 Hind III 절단부위가 insert DNA 양쪽 끝 부분에 있어서 insert DNA와 비슷한 크기
로 분리된다. Figure 03에서도 이를 확인할 수 있는데, mini-prep DNA lane에 3kbp 부근에 band
하나, 750 근처에 band 하나가 나타난 것을 확인할 수 있다. pET21a는 5443bp size를 가지며
Hind III(173), Nde I(238)의 제한효소 절단부위를 가지기 때문에 두 제한효소를 처리한 결과 3k 보
다 위쪽에 band가 형성된 것을 볼 수 있다. 제한효소 절단부위가 65bp 정도로 작기 때문에 DNA
ladder을 보면 아래로 빠져나갔을 것임을 확인할 수 있다.
Figure 03에서 band가 일부 smearing 된 것을 볼 수 있는데, 이는 전기영동 시에 일부 restriction
enzyme이 DNA와 binding 되었을 경우 나타날 수 있다. 더 적은 양의 제한효소를 처리해 문제를
개선하거나, buffer에 SDS를 추가해 단백질인 제한효소를 DNA로부터 분리하여 smearing 현상을
개선할 수 있다. 이외에도 buffer이나 DNA contamination 때문에 문제가 될 수 있으므로 순수한
buffer과 정제 DNA를 이용해야 한다.
전기영동 실험에서 UV lamp를 이용해 band를 관찰하기 위해서 EtBr을 이용했는데, EtBr은 ssDNA,
ssRNA 뿐만 아니라 dsDNA의 염기에도 들어갈 수 있어 강력한 발암물질이므로 사용 시 주의가
필요하다. EtBr 사용 시 장점은 sensitivity가 높다는 것인데, 최근에는 안전성을 보완한 dye도 여럿
존재한다. SYBR gold, Gel red, SYBR green 등을 이용하면 실험의 위험성을 줄일 수 있을 것이다.
References
Michael M. Cox, Jennifer A. Doundna, Michael O’Donnell (2012), Molecular Biology: principles and
practice 1st ed, pp. 165-173
T.A. Brown (2003), Gene Cloning and DNA Analysis: an introduction 4th ed, Blackwell Publishing
Ltd, pp.178-193
Richard J. Roberts & Kenneth Murray (1976) Restriction Endonuclease, CRC Critical Reviews in
Biochemistry, 4:2, 123-164,
Pingoud A, Alves J, Geiger R (1993). "Chapter 8: Restriction Enzymes". In Burrell M (ed.). Enzymes
of Molecular Biology. Methods of Molecular Biology. Vol. 16. Totowa, NJ: Humana Press. pp. 107–
200.
Bouchard, Roland; et al. (2010). Laboratory Methods in Microbiology. Universal Scientific. pp. 119–
126.