INVESTIGACIÓN BÁSICA – TECNOLOGÍA El efecto del ultrasonido Protocolo de activación de regantes sobre la eliminación de una especie dual Biofilm de canales laterales artificiales ABSTRACTO Introducción: Los canales laterales son particularmente difíciles de limpiar y desinfectar. El objetivo de este estudio fue comparar la eficacia de eliminación de una biopelícula de doble especie de un modelo de canal lateral mediante diferentes protocolos de activación de irrigantes ultrasónicos in vitro. Métodos: Se hicieron modelos de conductos radiculares artificiales con 270 canales laterales simulados de polidimetilsiloxano. Se cultivó in vitro una biopelícula de dos especies (Streptococcus oralis y Actinomyces naeslundi) en los canales laterales utilizando un fermentador de película de profundidad constante. Se administró NaOCl o agua desmineralizada al dos por ciento mediante una jeringa y una aguja abierta durante 30 segundos y posteriormente se activó mediante una lima ultrasónica durante un tiempo de activación total de 30, 60 o 90 segundos dividido en 1 o 3 ciclos de activación consecutivos. En los grupos de control, se permitió que el irrigante descansara durante 30, 60 o 90 segundos. El volumen del biofilm en el canal lateral se evaluó antes y después del protocolo de irrigación final mediante tomografía de coherencia óptica. Los resultados se analizaron mediante análisis factorial de varianza de 3 vías (a5 0,05). Resultados: El riego con NaOCl en lugar de agua desmineralizada resultó en una eliminación más efectiva de la biopelícula del canal lateral (P, .001). Tres ciclos de activación ultrasónica intermitente fueron significativamente más efectivos que ninguna activación (P 5 .029). El tiempo total de contacto con el irrigante no afectó la eliminación del biofilm (P 5 .403). Conclusiones: El tipo de irrigante y el protocolo de activación ultrasónica afectaron la eliminación del biofilm de los canales laterales artificiales. Ninguno de los protocolos comparados fue capaz de erradicar la biopelícula. (J Endod 2022;48:775–780.) de biofilm intacto puede permanecer allí después de la preparación quimiomecánica 6,7. La infección persistente por biofilm en los canales laterales ha sido implicada en el fracaso del tratamiento del conducto radicular8. Se han propuesto numerosos métodos de agitación y activación de irrigantes para mejorar la limpieza y desinfección de las ramificaciones del canal, siendo la activación ultrasónica el más popular3. Una amplia variedad de protocolos de activación ultrasónica están actualmente en uso sin ningún consenso sobre el más efectivo9. La activación repetida de NaOCl durante períodos cortos conduce a una eliminación más efectiva de los restos de dentina de los surcos artificiales in vitro que un solo período de activación largo10-12. Sin probable que la eliminación de restos de dentina por NaOCl activado embargo, es sea un proceso predominantemente mecánico, por lo que no se tuvo en cuenta el consumo del cloro libre disponible, que puede afectar la eliminación de biopelículas13. Además, una biopelícula viscoelástica firmemente unida a la dentina 14 puede reaccionar de manera diferente a la presión oscilante y al esfuerzo cortante durante la activación15 en comparación con los restos de dentina más rígidos pero menos firmemente adheridos. Por lo tanto, los protocolos de activación que promueven la eliminación de restos de dentina pueden no ser tan efectivos contra la biopelícula. Se ha producido un biofilm denso de PALABRAS CLAVE dos especies (Streptococcus oralis Biofilm; canal lateral; tomografía de coherencia óptica; Activación ultrasónica del irrigante Actinomyces naeslundii) cultivado en y istmos artificiales transparentes y canales laterales utilizando un La eliminación de bacterias de un sistema de conductos radiculares infectado es uno de los principales objetivos del tratamiento del conducto radicular1. La irrigación con soluciones antimicrobianas se considera actualmente el principal medio de desinfección del conducto radicular2. Los irrigantes son administrados fermentador de película de profundidad constante (CDFF). Anastasios Retsas, DDS, MSc,* con mayor frecuencia por una jeringa y una aguja3, pero esta técnica es incapaz de crear un flujo adecuado dentro de áreas estrechas como canales laterales e istmos JOE Volumen 48, Número 9, junio 2022 775 4,5. Como resultado, una cantidad considerable Efecto antibiofilm de los protocolos de activación ultrasónica Rene J. B. Dijkstra, Ing,† Luc van der Sluis, DDS, PhD,† y Christos Boutsioukis, DDS, MSc, PhD* Del *Departamento de Endodoncia, Centro Académico de Odontología Ámsterdam (ACTA), Universidad de Ámsterdam y Vrije Universiteit Ámsterdam, Ámsterdam, Países Bajos; y †Centro de Odontología e Higiene Oral, Centro Médico Universitario de Groningen, Universidad de Groningen, Groningen, Países Bajos IMPORTANCIA Los canales laterales son particularmente difíciles de desinfectar. El riego con NaOCl y tres ciclos de activación ultrasónica pueden mejorar la eliminación de biopelículas de los canales laterales. Dirija las solicitudes de reimpresiones al Dr. Christos Boutsioukis, Departamento de Endodoncología, Centro Académico de Odontología de Ámsterdam (ACTA), Universidad de Amsterdam and Vrije Universiteit Amsterdam, Gustav Mahlerlaan 3004, 1081 LA, Amsterdam, Países Bajos. Dirección de correo electrónico: c.boutsioukis@acta.nl 0099-2399 Copyright © 2022 Los autores. Publicado por Elsevier Inc. en nombre de la Asociación Americana de Endodoncistas. Este es un artículo de acceso abierto bajo la licencia CC BY (http://creativecommons.org/ licenses/by/4.0/). https://doi.org/10.1016/ j.joen.2022.03.005 anteriormente utilizado para evaluar el rendimiento de diversos irrigantes y métodos de riego in vitro16-18. Esta biopelícula tiene propiedades viscoelásticas realistas19 y se asemeja naturalmente a la biopelícula de conducto radicular naturalmente rica en células formada bajo limitaciones de espacio 14,20–22. Además, ni el riego con jeringa ni la activación ultrasónica son capaces de eliminar este biofilm de los canales laterales artificiales16-18, por lo que podría servir como un desafío adecuado al comparar Diferentes protocolos de activación ultrasónica. La evaluación tridimensional in situ del volumen del biofilm antes y después del riego mediante tomografía de coherencia óptica (OCT) podría explicar la inevitable variabilidad de su volumen, incluso cuando se cultiva in vitro en condiciones estrictamente controladas14,21–23. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue comparar la eficacia de eliminación de una biopelícula de especie dual 776 Retsas et al. de un modelo de canal lateral artificial por NaOCl o agua desmineralizada. activado por ultrasonidos según diferentes protocolos. MATERIALES Y MÉTODOS Estimación del tamaño de la muestra Se realizó una estimación del tamaño de la muestra a priori utilizando G*Power 3.1.924, asumiendo un análisis factorial de varianza de tres vías. (f 5 0,25; a5 0,05; potencia 5 90%). El tamaño mínimo de muestra calculado de 14 muestras de biofilm por grupo se aumentó a 15 para compensar cualquier incertidumbre en estos supuestos. Sistemas de conductos radiculares artificiales Cincuenta y cuatro endodoncias artificiales transparentes (tamaño apical 35/.06 cono cónico, 18 mm de largo, sistema apicalmente cerrado) con huecos cilíndricos adecuados fueron fabricados a partir de polidimetilsiloxano (PDMS; Sylgard 184; DowCorning, Midland, MI, USA) como se describió anteriormente18. Se utilizaron moldes cilíndricos con pasadores metálicos delgados para crear 270 insertos PDMS con canales laterales cerrados simulados. (d 5 0,25 mm, l 5 1,5 mm, volumen 5 0,075 mm3) que se ajustaba al hueco cilíndrico de los modelos de conducto radicular (Fig. 1). El PDMS desgasificado se vertió en los moldes y se dejó curar durante 24 horas a temperatura ambiente para evitar el atrapamiento de burbujas. Cuando se ensamblaron los modelos, la entrada del canal lateral se ubicó a 2 mm del punto final apical del conducto radicular principal. Formación de biopelículas Se cultivó una biopelícula de dos especies densas ricas en células en estado estacionario en los canales laterales artificiales utilizando un CDFF, de manera similar a estudios anteriores16,18. Una sola colonia de cualquiera de los S. oralis J22 o A. naeslundi T14V-J1 se utilizó para inocular 10 ml de caldo de infusión cerebral JOE Volumen 48, Número 9, junio 2022 y cardíaca modificado (BHI; Oxoid Ltd, Basingstoke, Reino Unido), que se cultivó a 37C durante 24 horas en aire ambiente (S. orales) o en condiciones anaeróbicas (A. naeslundii). Estos precultivos se utilizaron para inocular 200 mL de BHI modificado, que se incubó a 37C durante 16 horas. Las bacterias fueron recolectadas por centrifugación (6500 ! g) y lavado dos veces en tampón de adhesión estéril (0,147 g/L CaCl 2, 0,174 g/L K2HPO4, 0,136 g/L KH2PO4, 3,728 g/L KCl, pH 6,8). La suspensión se sonicó intermitentemente en agua helada (3 ! 10 s) para romper las cadenas bacterianas. Las bacterias se contaron en un Cámara Burker-T€urk (Marienfeld-Superior,€ Lauda-Konigshofen, Alemania) y diluida en tampón de adhesión estéril diluido. La saliva entera humana estimulada fue recolectada de voluntarios de acuerdo con las directrices del Comité de Ética Institucional (carta de aprobación 06-02-2009). La saliva recolectada se agrupó, se centrifugó para eliminar las partículas de alimentos y las células, se estabilizó agregando un bloqueador de proteasa y se liofilizó para su almacenamiento. Inmediatamente antes de su uso, la saliva liofilizada se disolvió en tampón de adhesión (1,5 g / L), se agitó durante 2 horas y se centrifugó (10,000 ! g a 10C) durante 5 minutos para crear saliva entera humana reconstituida (RWS). RWS se pipeteó en cada inserto PDMS y se dejó intacto durante 14 horas a temperatura ambiente. El CDFF junto con los insertos y los medios de cultivo se esterilizó en autoclave durante 30 minutos a 121 C. Posteriormente, los insertos PDMS recubiertos con RWS se cargaron en la plataforma giratoria del CDFF, y la inoculación gota a gota con 100 ml de la suspensión bacteriana de doble especie (S. oralis 6 ! 108 bacterias/ml y A. Naeslundii 2 ! 108 bacterias/mL) durante 1 hora mientras el plato giratorio giraba lentamente. A continuación, se detuvo la rotación y se permitió que las bacterias JOE Volumen 48, Número 9, junio 2022 777 se adhirieran a los insertos durante 30 minutos. Luego se reanudó la rotación y se suministró continuamente BHI modificado (45 ml / h) para permitir que las biopelículas se desarrollaran durante las próximas 96 horas a 37C. Las cuchillas raspadoras fijas del CDFF aplicaron la presión necesaria para la compresión mecánica del biofilm y también distribuyeron nutrientes sobre los insertos. Los insertos llenos de biopelícula se almacenaron dentro de un frasco que contenía tampón de adhesión hasta su uso para prevenir la deshidratación y solo se colocaron en el hueco cilíndrico del conducto radicular artificial inmediatamente antes de los experimentos. Se garantizó un ajuste hermético. Tomografía de coherencia óptica La biopelícula fue escaneada en tres dimensiones por un escáner OCT de dominio espectral (Ganímedes II; Thorlabs, Newton, NJ, USA) con un haz de luz blanca de longitud de onda central de 930 nm usando un 5 ! 5 ! Campo de visión de 1,34 mm (1000 ! 1000 ! 500 píxeles) y un índice de refracción de 1,33 para el biofilm. La frecuencia de imagen fue de 30 kHz con una sensibilidad de 101 dB. Los escaneos se procesaron inicialmente con el software ThorImage OCT 5.5 (Thorlabs) y luego se exportaron a Fiji 1.50g25 como imágenes de 8 bits para calcular el volumen del canal lateral ocupado por la biopelícula después de la segmentación automática independiente del observador. No se hizo ningún intento de distinguir entre la bacteria y la sustancia polimérica extracelular. Experimentos de activación de irrigantes Los experimentos siguieron a un 2 ! 3 ! 3 Diseño factorial. Los insertos PDMS fueron asignados aleatoriamente (www.randomizer.org) a 18 grupos (n 5 15) que fueron irrigados con NaOCl o agua desmineralizada por el mismo operador. La activación ultrasónica tuvo lugar durante un tiempo total de 30, 60 o 90 segundos divididos en 1 o 3 ciclos. Tres grupos de control adicionales por irrigante no recibieron activación (0 ciclos), pero al irrigante se le permitió descansar durante 30, 60 o 90 segundos (Tabla 1). Se preparó una solución de NaOCl al 2% a partir de una solución madre al 12%-15% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, EUA). La concentración se verificó mediante titulación yodométrica. Se utilizó agua desmineralizada estéril como control para estudiar el efecto de limpieza mecánica pura de la activación ultrasónica. El irrigante se administró en cada muestra utilizando una jeringa de 12 ml (Terumo Europe, Lovaina, Bélgica) y una aguja abierta de 30G ( Navitip; Ultradent Products Inc, South Jordan, UT, EUA) insertado a 2 mm del punto final apical del conducto radicular a un caudal de 0,2 ml/s. El caudal se controlaba manualmente mediante un temporizador. Dependiendo del grupo, la entrega tuvo lugar durante 1!30 segundos (antes del período de descanso en los grupos de control o antes del ciclo de activación único) o 3!10 segundos (antes de cada uno de los 3 ciclos de activación). El volumen total de irrigante suministrado fue de 6 mL en todos los grupos. La activación ultrasónica se realizó utilizando un cono de tamaño 20/.00 y un archivo Irrisafe Satelec, de 21 mm (Acteon Merignac, Francia) conectado a un dispositivo de ultrasonido (P5 Newtron XS, Acteon Satelec). El ajuste de potencia fue de 9/20 (45%)26, la lima se colocó a 2 mm del punto final apical del conducto radicular y la pieza de mano se estabilizó utilizando un soporte personalizado para garantizar una dirección de oscilación estándar hacia el canal lateral. En los grupos de control, el archivo ultrasónico se insertó en el Efecto antibiofilm de los protocolos de activación ultrasónica FIGURA 1 – Dibujo esquemático del modelo de conducto radicular y el inserto PDMS con el canal lateral artificial. PDMS: polidimetilsiloxano. endodoncia, pero no se produjo ninguna activación (período de descanso). Se utilizó una nueva lima y un nuevo modelo de conducto radicular cada 5 muestras de conducto lateral. La biopelícula que quedaba en los canales laterales después del riego fue escaneada nuevamente por OCT. para calcular el porcentaje de biofilm eliminado de cada canal lateral. El efecto del tipo de irrigante, el número de ciclos de activación y el tiempo total de contacto con el irrigante se analizaron mediante análisis factorial de varianza de 3 vías. La normalidad se evaluó en las gráficas Q-Q, y la igualdad de las varianzas de error se evaluó mediante la prueba 778 Retsas et al. 1 ! 30 1 ! 30 — 30 60 3 ! 10 3 ! 10 — 30 60 1 ! 30 1 ! 60 — 60 90 3 ! 10 3 ! 20 — 60 90 1 ! 90 — 3 ! 10 3 ! 30 — 1 ! 30 — 30 1 ! 30 — 60 1 ! 30 — 90 de Levene. La hipótesis nula era que el tipo de Análisis estadístico La diferencia en el volumen de biofilm antes y irrigante, el número de después del riego se dividió con el volumen inicial TABLA 1 - Descripción general de los protocolos de administración de jeringas y activación ultrasónica utilizados en los grupos experimental y control Entrega de Activación Tiempo(s) Tiempo(s) Tiempo total jeringas ultrasónica (s) de total(es) de de contacto con Grupo descanso activación el irrigante Experimental Control 1 ! 30 Todos los experimentos se realizaron por duplicado utilizando NaOCl o agua desmineralizada como irrigante. Los ciclos de activación y el tiempo total de contacto con el irrigante no tienen un efecto significativo en el porcentaje de biopelícula que se eliminó. La prueba post hoc de diferencia honestamente significativa de Tukey se empleó para las comparaciones por pares. El nivel alfa se estableció en 0,05. La corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples se aplicó a este nivel, cuando correspondió. El análisis estadístico se realizó utilizando SPSS 27 (IBM Corp, Armonk, NY). JOE Volumen 48, Número 9, junio 2022 RESULTADOS El volumen medio inicial del biofilm fue de 0,042mm3 (desviación estándar 5 0,009 mm3), por lo que aproximadamente el 57% del canal lateral estaba ocupado en promedio. El riego resultó en una disminución media del 10,34% (desviación estándar 5 8,74%) en el volumen de biofilm, pero no se logró la eliminación total en ninguno de los especímenes (Fig. 2). Ninguna de las interacciones entre las variables independientes fue significativa (P . .4), por lo que se interpretaron los principales efectos. NaOCl redujo significativamente la cantidad de biofilm en comparación con el desmineralizado FIGURA 2 – Biofilm retirado de los canales laterales artificiales tras la activación ultrasónica de NaOCl o agua desmineralizada. La eliminación se expresa como el porcentaje promedio del volumen inicial de biopelícula. Los resultados se organizan de acuerdo con el tiempo total de activación/descanso y el número de ciclos de activación. Las barras de error indican la desviación estándar. agua (P , 0,001; intervalo de confianza del 95 %: 4,30–8,20 %). El número de ciclos de activación también tuvo un efecto significativo en el porcentaje de biofilm que se eliminó (P 5 .026). Las comparaciones post hoc indicaron que tres ciclos de activación fueron más efectivos que ninguna activación (P 5 0,029; intervalo de No se encontraron diferencias significativas entre ninguna activación y un ciclo de activación (P 5 .097) o entre tres ciclos de activación y un confianza del 95 %: 0,26–6,03 %). ciclo de activación (P 5 .874). El efecto del tiempo total de contacto con el irrigante no fue significativo (P 5.403). puedan llegar a estas áreas son indispensables5. El objetivo de este estudio fue determinar el protocolo óptimo de activación ultrasónica para la eliminación de biofilm de un canal lateral in vitro, un tema que no había sido abordado en la literatura. Los hallazgos reafirmaron la importancia de NaOCl y múltiples ciclos de activación para este proceso. Una gran parte de la eliminación de biopelícula observada se atribuyó al efecto químico disruptivo de NaOCl27, que parecía ser más importante que el efecto de limpieza mecánica pura de activación ultrasónica que se demostró en los grupos regados con agua desmineralizada. Sin embargo, es probable que la activación ultrasónica también fuera capaz de mejorar el efecto químico de NaOCl28,29. La agitación del NaOCl DISCUSIÓN Los canales laterales en el tercio medio y apical de la raíz son particularmente difíciles de limpiar el tratamiento no 6–8,20 quirúrgico , por lo que los métodos de activación irrigante que y desinfectar durante JOE Volumen 48, Número 9, junio 2022 779 en el canal principal podría haber mantenido un gradiente de concentración favorable que impulsa la difusión de moléculas e iones en el canal lateral4, donde podrían reaccionar con la biopelícula. Estudios previos han demostrado que la activación ultrasónica del irrigante puede mejorar la eliminación de restos de tejido pulpar, restos de dentina o biopelícula de canales laterales u otros cationes artificialesin el presente estudio se encontró una diferencia significativa en la eliminación de vitro17,30–32. En biopelículas de un canal lateral al comparar 3 ciclos de activación con ninguna activación, mientras que no se encontró ninguna diferencia entre un solo ciclo de activación y ninguna activación, cuando el tiempo total de contacto con el irrigante se mantuvo constante. Estos hallazgos estuvieron de acuerdo con informes anteriores sobre la eliminación de restos de dentina10-12. La principal ventaja de la activación intermitente por períodos cortos sobre la activación continua por un período más largo ha sido atribuida a la intensa transmisión producida durante la fase de arranque (primeros 50 ms) de la activación12. El tiempo total de contacto con el irrigante no afectó la eliminación de biopelículas en este modelo. Dado que el tiempo de contacto juega un papel crítico tanto en la difusión 4 como en las reacciones químicas que tienen lugar29, este hallazgo parece contradecir la importancia del efecto químico del NaOCl. Se Efecto antibiofilm de los protocolos de activación ultrasónica podría plantear la hipótesis de que los tiempos de contacto examinados en el presente estudio (60-120 s) no fueron lo suficientemente largos como para tener un efecto notable sobre la difusión o las reacciones químicas, dada la superficie de contacto limitada entre el irrigante y la biopelícula en el canal lateral. Un estudio previo indicó que la interrupción química de la biopelícula in vitro por difusión de NaOCl a través de una pequeña superficie de contacto se hizo notable solo después de un tiempo prolongado (300 s)21. Los tiempos de contacto más largos deben probarse en estudios futuros, pero debe tenerse en cuenta que la activación prolongada también puede conducir a la eliminación inadvertida de más dentina33. En condiciones ideales, el flujo irrigante puede penetrar en el canal lateral hasta una distancia del doble de su diámetro antes de que la difusión se convierta en el proceso de transporte dominante4. Esta distancia corresponde a un tercio de la longitud del canal lateral utilizado en el presente estudio, pero la biopelícula no se eliminó consistentemente de esta área. Es probable que el biofilm creara un obstáculo físico adicional para el flujo que no fue tenido en cuenta en los cálculos anteriores4. Además, aunque el irrigante patrón de flujo dentro de los canales laterales la eliminación de biopelícula in vitro vacíos parece correlacionarse bien con 18, la mera penetración del irrigante puede no ser suficiente para lograr la eliminación total de la biopelícula. El modelo in vitro actual tiene algunas limitaciones que deben tenerse en cuenta. Los conductos radiculares artificiales fueron hechos de PDMS para asegurar la precisión dimensional18 y permitir mediciones de alta resolución del volumen de biofilm por OCT. A pesar de que la biopelícula puede adherirse a PDMS y resistir la eliminación por un variedad de métodos de irrigación 16–18,34–36, no está claro si la adhesión al PDMS es similar a la adhesión de la biopelícula real del conducto radicular en dentina in vivo. Debido a dificultades técnicas, la longitud y el diámetro de los canales laterales simulados estaban dentro de los rangos de los canales laterales reales, sustancia polimérica. La microscopía de barrido láser confocal combinada con la tinción fluorescente del biofilm podría haber proporcionado tal información sobre el biofilm restante después del riego23, pero no habría podido determinar la condición inicial del biofilm en cada espécimen antes del riego. Estudios previos han validado el uso de OCT para la evaluación de una biopelícula rica en células de dos especies similares en comparación con la microscopía de barrido láser confocal 14,21,22. La eliminación de biopelículas en lugar de la muerte bacteriana también se ha sugerido como el resultado preferible en el tratamiento del conducto radicular porque varios componentes bacterianos aún pueden inducir inflamación periapical incluso después de que las bacterias mueren23. pero cerca de sus límites superiores37,38. Las condiciones pueden ser ligeramente diferentes en canales más pequeños. También debe enfatizarse que el efecto químico del NaOCl puede haber sido sobreestimado debido a la ausencia de dentina y restos de dentina acumulados que podrían haber consumido parcialmente el cloro disponible13 o impedido el acceso de los irrigantes al biofilm39. El ácido etilendiaminotetraacético no se utilizó en los experimentos para reducir el número de factores de confusión, a pesar de que puede desestabilizar la matriz de biopelícula14, por lo que podría haber facilitado la eliminación de biopelículas durante el riego posterior con NaOCl. La OCT es un método no invasivo para cuantificar la eliminación de biopelículas en tres dimensiones que permite mediciones repetidas en las mismas muestras antes y después del riego para tener en cuenta la variación inevitable en el volumen inicial de biopelícula. Sin embargo, no puede distinguir entre bacterias vivas y muertas o entre bacterias y extracelulares. CONCLUSIONES El riego con NaOCl en lugar de agua desmineralizada y 3 ciclos de activación ultrasónica intermitente en lugar de ninguna activación dieron como resultado una eliminación significativamente mayor de biopelícula del canal lateral simulado. El tiempo total de contacto con el irrigante no afectó la eliminación del biofilm. Ninguno de los protocolos probados fue capaz de erradicar la biopelícula. RECONOCIMIENTOS Los autores niegan cualquier conflicto de intereses relacionado con este estudio. REFERENCIAS 1. Mo€ller AJ, Fabricius L, Dahlen G, et al. 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