12. Restriction Enzyme & Digestion
8조
발표
201834236 류희승
PPT
201839424 조민기
자료조사, 보고서
202034705 권연정
목
차
1. 실험 제목
2. 실험 목적
3. 실험 이론
가. 제한 효소(Restriction Enzyme)
나. 제한 효소(Restriction enzyme)를 이용한 DNA의 절단
다. EcoRI
라. plasmid DNA
마. T-vector
바. 유전자 재조합 기술
4. 실험 기구 및 시약
가. 실험 기구
나. 실험 시약
5. 실험 방법
가. 실험 방법
6. 참고사항 및 주의사항
가. 참고사항
1) 전기 영동
2) buffer
3) BSA
4) ligation
나. 주의사항
7. 참고 문헌 및 출처
1. 실험 제목 : Restriction Enzyme & Digestion
2. 실험 목적
- (EcoRI) 제한효소를 사용하여 T-vector insert DNA에 가 들어 있는지 확인할 수 있다.
- DNA 제한 효소를 이용한 DNA의 절단 및 이를 이용한 재조합 DNA의 제조 원리를 알 수
있다.
- 제한효소에 의한 Cell digestion은 Colony, Colony-PCR 색 판별 과 함께 형질전환을 확
인할 수 있는 방법이다.
- T-vector에 ligation되어 있는 insert DNA (HPRT1 gene)에는 제한효소부위가 없고,
insert DNA 양 끝단 가까이에 EcoRI 절단부위가 있어, digestion 후 이들을 전기 영동하
면, insert DNA와 insert DNA + T-vector를 분리할 수 있다.
3. 실험 이론
가. 제한효소
- 제한 효소란 이중 가닥 DNA분자의 특정한 염기서열을 인식하여 그 부분이나 그 주변을
절단하는 것을 촉매 하는 효소를 지칭한다. 대부분의 제한 효소는 특수한 염기서열을 가
진 위치에서 DNA를 절단한다. 원래 제한 효소는 세균이 박테리오파지라는 바이러스의
공격을 받으면 생산하는 효소로 바이러스의 침입으로부터 자신을 방어하는 역할을 한다.
제한 효소가 인식하는 부위는 palimdrome 이라는 특수한 서열을 가진다. 양 사슬의 5'
에서 3'방향으로 똑같은 염기서열을 인식 자리로 나타내는데 예를 들어 EcoR1은 DNA
이중나선에서 GAATTC라는 염기서열을 만날 때만 DNA를 절단하여 5'-돌출점착말단을
형성한다.
- 현재까지 발견된 제한효소는 반응에 필수적인 인자와 절단부위의 특성 등에 따라 다음의
3가지로 구분한다.
분류
반응 필수 인자
ATP, Mg2＋
Type I
S-adenosyl
methionine
Type II
Mg2＋
Type III
ATP, Mg2＋
절단부위
인식부위와 절단부위가 다르고 절단
부위도 일정치 않음
인식부위 내 또는 그 근방의 특정부위를
절단
인식부위와 절단부위는 다르나 특정
부위를 절단
효소 예
EcoB, EcoK
EcoR I, BamH I
EcoP I, Hinf III
1) Type I restriction enzyme
- 제한 효소와 메틸화효소가 뭉쳐져 있고 인식 자리와 제한 자리가 서로 다르다, 염기 서
- 1 -
열을 특이적으로 인식하지만, 인식 자리에서 약 1000개 염기 정도 떨어진 곳에서 비특
이적으로 DNA를 자른다. DNA 절단 위치의 특이성이 없어 실험 목적으로 사용되지 않
는다.
2) Type II restriction enzyme
- 인식자리가 특이적이고 제한 자리 또한 주변의 염기로 특이적으로 작용하기 때문에 Ⅲ
형 제한효소가 두 개의 단일가닥을 자를 때 두 가지 형태의 잘린 단편이 나타난다.
① 대칭면의 중심이 잘리는 경우 (blunt end, flush end)
② 대칭면의 주위가 잘리는 경우 (sticky end, cohesive end, 5'-overhang end)
- 대부분의 type II 제한효소는 4개, 5개, 또는 6개의 염기서열을 인식하는데, 이에 따라 DNA 상에 인
식부위가 나타나는 빈도가 달라지게 된다. 실험에서 사용되는 EcoR1은 주변의 모든 GAATTC
서열을 자르며 Plasmid DNA의 MCS(Multiple Cloning Site)에 포함된 제한 부위를 인
식하면서도, HRPT1 gene을 자르지 않는다. EcoR1에 의한 DNA 절단 결과는 다음 그림
과 같다.
Figure 1. 제한 효소
5’-GAATTC-3’ -> 5’-G/AATTC-3’ , 3’-CTTAAG-5’ -> 3’-CTTAA/G-5’
(/는 절단되는
부분)
3) Type III restriction enzyme
- Ⅰ형과 마찬가지로 제한효소와 메틸화효소가 합쳐져 있고 완전 절단이 거의 일어나지
않는 특징이 있다. DNA를 자르기 위해서는 DNA 분자 반대 방향으로 놓여 있는 또 다
른 인식 염기서열이 필요하다.
- 2 -
나. 제한효소(Restriction enzyme)를 이용한 DNA의 절단
- 제한효소 1 unit는 1 μg의 DNA를 최적 온도에서 한 시간에 절단할 수 있는 양이다. 제
한 효소를 이용해 DNA를 절단하려면 절단하려는 DNA, 반응완충용액, 제한 효소가 필요하다. 각각의
성분에 대하여 다음과 같은 점들을 고려해야 한다.
① DNA 내에 제한효소로 잘리는 부위가 몇 개가 되는지 파악한다. 같은 양의 DNA에 있는
제한효소 절단부위 수에 따라 같은 양의 효소 작용을 기대할 수 없지만 보통 실험에서는
계산된 양보다 더 많은 효소를 넣어주는 것이 좋다.
② Linear DNA의 끝부분을 자를 때는, 효소에 따라서 인식서열에 몇 개의 염기가 더 붙어
있어야만 잘리는 것들이 있음을 주의한다. 이는 plasmid vector의 multiple cloning
site를 두 가지 효소로 자르는 경우에도 고려해야한다. 또한 PCR primer에 제한효소 인
식부위를 넣어 design할 경우에도 반드시 고려해야 한다.
③ DNA의 purity는 제한효소 처리 효율에 중요하다. DNA 용액 내에 단백질이 남아있는
경우는 보다 많은 양의 효소가 필요하다. Phenol과 같은 유기용매가 남은 경우는 제한
효소에 잘리지 않는 DNA가 남는 경우가 많다.
④ 각각의 제한효소는 최적온도, 반응완충용액(reaction buffer)의 조성 및 불활성화 온도
등 각각에 알맞은 반응 조건이 있으며, 제조회사의 안내서에 이 내용이 잘 기록되어 있
으므로 잘 읽어보고 사용해야 한다.
⑤ 반응 조건이 최적이 아닌 경우에는 더 많은 양의 효소를 사용해야 한다. 이는 두 가지
이상의 효소로 자르는 경우 (효소들의 최적 조건이 다를 때)에 중요하다. 때에 따라서는
이런 경우에 star activity라 불리는 현상(비특이적으로 아무 곳이나 다 잘리는 현상)이
나타날 수도 있으므로 주의해야 한다.
⑥ 효소가 인식부위를 자르는 데에 있어서 같은 인식부위라도 주위 염기서열에 따라 그 활
성도가 다를 수 있다. 그러므로, 앞서 언급한 것처럼 DNA 양으로 계산한 효소 양보다
조금 더 많이 넣어주는 것이 좋다.
다. EcoRI
- EcoRI은 DNA 이중 나선을 특정 부위의 단편으로 절단하는 제한효소이다. ‘Eco’ 부분은
E.coli 종으로부터 유래됐고, ‘R’은 특정 균주(RY13)를 나타내며, ‘I’는 균주에서 분리된
최초의 효소라는 것을 나타낸다. 이번 실험에서 Plasmid DNA의 MCS(Multiple Cloning
Site)에 포함된 제한 부위를 인식하면서도, HRPT1 gene을 자르지 않는 제한 효소이다.
MCS는 여러 restriction site를 포함하고 있는데 제한 효소가 인식하고 절단할 수 있는
DNA 부위이다. EcoRI는 DNA 이중나선에서 염기서열 “GAATTC”를 만날 때만 DNA를
절단하는데, DNA의 이중 가닥 중 한 가닥이 돌출된 5'-돌출 점착말단(5'-overhang
sticky end)을 형성한다.
라. plasmid DNA
- 유전공학 도구로 사용되기 시작하여 vector DNA라고도 불려진다. 이상적인 vector
- 3 -
DNA로써의 구조적 특징들이 존재한다. 1. 숙주세포 DNA 합성 효소들이 결합되어 DNA
복제를 개시하는 특정 서열인 복제 기점 ori를 가지고 있다. 따라서 박테리아 염색체와
관계 없이 자체적으로 사본을 만들 수 있는 능력이 존재한다. 2. 항생제 저항성 유전자
(Antibiotics marker)를 가지고 있다. 3. 다중 제한 효소 클로닝 부위(Multi cloning
site, MCS)가 존재하는데 이는 Insert DNA를 절단 또는 삽입하기 쉽도록 여러가지 제
한 효소의 인식 서열을 Plasmid DNA의 일정 부위에 인위적으로 모아 놓은 부위이다.
Figure 2. plasmid DNA
마. T-vector
- PCR을 마친 후 증폭된 DNA의 절편을 보관이나 다른 용도에 편하게 쓸 수 있도록 만든
것이다. T-Vector cloning은 PCR 산물을 cloning하는 방법 중 가장 많이 이용 된다.
PCR에 사용되는 Taq polymerase는 증폭한 DNA의 3’말단에 dA를 부가하는 성질이 있
어 PCR 산물 대부분은 그 3’말단에 dA 돌출 염기를 갖고 있다. T-Vector는 self
ligation하지 않으므로 탈 인산화 할 필요가 없다. T-Vector의 5’인산을 ligation에 이용
할 수 있어, 삽입하는 PCR 산물을 인산화 조작할 필요가 없다.
바. 유전자 재조합 기술
Figure 3. 유전자 재조합 과정 1
- 4 -
- 특정 세포에서 얻은 유전자나 합성하여 만든 유전자의 일부분을 다른 유전자에 결합시켜
새로운 유전자를 만드는 것으로, 바이오테크놀로지의 핵심 기술이라고 할 수 있다. 현재
사용되고 있는 기술은 1973년 미국 스탠퍼드대학교의 S. 코헨 박사 연구진이 처음으로
사용했다. 이 기술은 종(種)이 서로 다른 생물체의 한계도 뛰어넘을 수 있는 분자 생물학
의 기초 연구뿐만 아니라, 의학 · 농업 · 공업 등 광범위한 분야에도 시도되고 있다.
Figure 4. 유전자 재조합 과정 2
DNA 재조합 과정은 다음과 같다.
1) 리소자임과 세제를 이용해 세포벽을 파괴한 후, 원심 분리기를 이용해 플라스미드와 DNA
를 얻는다.
2) 표적유전자가 포함된 DNA와 세균(대장균)의 플라스미드를 같은 제한 효소로 자른다.
3) DNA 결합효소를 이용해 플라스미드와 목적 유전자 결합시킨다.
4) 재조합된 플라스미드를 숙주 세포에 처리하여 배양시킨다.
- 5 -
4. 실험 기구 및 시약
가. 실험 기구
Microcentrifuge
Tube(0.2mL)
Incubator
Microcentrifuge
Plasmid DNA
EcoRI
나. 시약
BSA
RE10xbuffer
D.W
5. 실험 방법
① EcoRI 을 희석시킨다(10배 희석).
② 아래 표에 따라 부피를 설정한다.
③ 물, buffer, BSA, DNA 순으로 혼합(pipetting)
④ EcoRI 첨가, tapping, spin down 후 37°C에서 2시간 incubation
⑤ 기다리는 동안 agarose gel 제조 후 전기영동(20μl product + 4μl 6x loading buffer)
sterile, deionized water
16.3μl
RE 10X Buffer
2μl
Acetylated BSA, 10μg/μl
0.2μl
DNA, 1μg/μl
1 μl
Pipetting
Restriction Enzyme, 10u/μl
0.5μl
final volume
20μl
- 6 -
6. 참고사항 및 주의사항
가. 참고사항
1) 전기 영동
- 전극 사이의 전기장 하에서 용액 속의 전하가 반대 방향의 전극을 향하여 이동하는 화
학현상이다. 용액 내에 존재하는 입자들에 전기장을 가하면, 이들은 전기적인 인력에 의
해 자신과 반대의 전하를 가진 전극의 방향으로 힘을 받아 움직이게 된다. 이때 주변의
용액에 의해 이동하는 입자들은 마찰력을 받게 되고, 이로 인해 속도의 감쇄가 일어난
다. 입자의 전하량, 형태 등의 요소에 따라 해당 용액 내에서 각각의 입자가 받는 마찰
력은 달라지고, 따라서 입자 간 이동 속도 차이로 인해 용액 속에 혼합되어 있는 다양한
종류의 화합물들이 분리되게 된다. 이를 특정한 표지를 통해 확인하여 화합물의 분자량,
전하량 등의 요소를 확인할 수 있다.
➀ 겔 전기영동
- 두 가지 속성 즉 크기와 전하에 따라서 작은 생물학적 분자를 분류하고 시각화하는 데
도움이 되는 방법이다. 그물 구조의 다공성 지지판(GEL)에서 DNA Sample loading 후
전기를 걸어 DNA를 이동시키는 원리이다. 사용되는 gel의 종류에 따라 Agarose gel
전기 영동과 Acrylamide gel 전기 영동으로 나뉜다. DNA의 경우 너무 작거나
(1~300bp) 너무 크지 않은 이상(>40kb) 주로 Agarose gel을 사용한다. DNA나 RNA
그리고 Protein은 각각 고유의 전하를 띄어 전기를 통해 이동시킬 수 있다. 이를 통해
고분자 물질들을 분리하고 분석할 수 있다. DNA의 구성 성분 중 인산기(PO4-)가 음전
하를 가지고 있기 때문에 DNA는 수용액 상태에서 음전하 상태를 띄게 된다. 전류는 전
기영동 완충액을 통하여 겔까지 전도되기 때문에 시료는 양극(+)쪽으로 이동한다. 이런
성질을 이용해서 DNA를 크기에 따라 분리할 수 있다.
Figure 5. 젤 전기영동
- 이때 분자의 이동 통로인 겔은 중합체로 구성되어 있다. 사용되는 중합체의 유형은 적용
대상에 따라 달라지지만, DNA 또는 RNA 분자를 분리하기 위해서 일반적으로 아가로스
라고 불리는 해초에 존재하는 다당류(복합당)가 사용된다. 이 다당류는 수많은 구멍이 있
는 다공성 기질을 형성한다. 사용되는 아가로스의 농도에 따라서 기질이 얼마나 촘촘하게
- 7 -
직조되느냐가 결정되며, 그 결과로서 분자의 이동 통로인 구멍의 크기가 결정된다.
➁ Agarose gel
- 아가로스는 다당류이며 아가 또는 아가 함유 해양 조류(다시마)에서 분리되어 정제된다.
구조적으로는 천연 폴리머이며, 아가로비오스(Agarobiose)의 β-D-갈락토스 및 3,6-안
하이드로-L-갈락토스가 교대로 있는 단위로 구성되어 있다. 선형 아가로스 폴리머는 사
슬을 형성하여 유연한 섬유를 생성하며, 사용된 아가로스의 양에 따라서 50nm에서
200nm 사이의 직경을 가진 채널망을 형성한다. 아가로즈 겔은 적당한 완충용액(TAE
buffer)에 녹여서 원하는 크기의 틀에 부어지며, 겔이 굳은 후에 사용된다. 겔이 굳는
동안 아가로즈는 지지체(matrix) 형태가 되며, 그 밀도는 아가로오스의 농도(%)에 따라
정해진다. 이러한 겔에 전기장이 주어지면, 음전하를 띠는DNA는 양극으로 이동한다. 아
가로스는 다양한 성질 및 사양을 가지고 있으며, 핵산 전기 영동, 면역 확산 기법, 조직
배양에서 세포를 위한 겔 플레이트 또는 오버레이, 세포 배양 배지, 겔 크로마토그래피,
친화 크로마토그래피 및 이온교환 크로마토그래피와 같은 다양한 애플리케이션에서 겔
화 제제로 유용하게 사용 된다.
③ Agarose gel 전기영동에서 DNA 이동에 영향을 주는 요인들
- DNA 분자의 크기가 클수록 느리게 이동한다.
- Agarose의 농도가 높을수록 느리게 이동한다.
- DNA 형태(구조)에 따라 이동속도가 다르다. 일반적으로 supercoiled DNA가 가장 빨
리,
그다음 linear DNA, open circular DNA의 순으로 빠르게 이동한다.
- 부하되는 전압이 높을수록 이동속도가 빠르다.
- 전기장의 방향도 이동속도에 영향을 미친다.
- Ethidium bromide는 DNA 이동속도를 15% 정도 감소시킨다.
- 전기영동 완충용액의 성분과 이온강도도 전기영동 속도에 영향을 준다.
2) buffer
- buffer는 전기영동에서 DNase를 억제하여 시료가 분해되는 것을 막아주고, 금속류의
양이온을 막아 DNA의 (-)charge를 유지시킨다. 크게 두 개의 buffer가 DNA 전기영동
에 사용되는데, TAE buffer에 비해 TBE buffer가 더 높은 resolution(해상도)을 부여
한다. 따라서 1000bp이하의 작은 시료를 분해하거나, DNA sequencing(염기서열 분석,
보통 Polyachrylamide gel 사용) 때는 TBE buffer를 쓰는 것이 좋다.
➀ TAE buffer(Tris-Acetate-EDTA)에는 Tris, Acetate, EDTA라는 세가지 성분이 들어
있는데, Tris는 양이온을 공급하여 (-)charge를 띠고 있는 DNA를 끌어주는 역할을 한
다. 그러나 Tris는 pH가 11에 가까울 정도로 높기 때문에 DNA가 해리될 수 있다. 따
라서 이 높은 pH를 낮추기 위해 Acetate가 들어간다. EDTA는 1. DNase inhibition
에 의한 DNA 분해 방지 2. 전기영동에 필요한 DNA의 (-) charge 유지 두 가지의 역
할을 한다.
- 8 -
➁ TBE buffer(Tris-Boric acid-EDTA)에는 Tris-borate-EDTA 세가지 성분이 들어있
다. 일반적으로 TBE 버퍼가 TAE 버퍼 보다 Gel에서의 Resolution이 좋기 때문에
TAE 버퍼는 DNA 분자량이 큰 agarose electrophorsis에서 주로 사용되고 TBE는
DNA 분자량이 작은 경우에 쓰이며 주로 DNA sequencing 할 때 사용된다.
3) BSA(소 혈청 알부민)
- 소 혈청 알부민은 소로부터 유래 된 혈청 알부민 단백질이다. 실험실 실험에서 종종 단백
질 농도 표준으로 사용된다. BSA는 작고 안정적이고 중간 정도의 비 반응성 단백질이기
때문에 면역 조직 화학에서 차단제로 종종 사용된다. BSA는 또한 세포 및 미생물 배양
에서 영양소로 사용된다. 제한 소화에서 BSA는 DNA 소화 동안 일부 효소를 안정화시
키고 반응 튜브, 피펫 팁 및 기타 용기에 효소의 부착을 방지하기 위해 사용된다. 이 단
백질은 안정화에 필요하지 않은 다른 효소 에는 영향을 미치지 않는다. BSA는 미지의
양의 단백질을 알려진 양의 BSA와 비교함으로써 다른 단백질의 양을 결정하는데 일반
적으로 사용된다. BSA는 분석에서 신호를 증가시키는 능력, 많은 생화학 반응에서 효과
가 부족하고 비용이 저렴하기 때문에 사용된다. 이는 대량의 소가 가축 산업의 부산물인
소 혈액에서 쉽게 정제 될 수 있기 때문이다. BSA의 또 다른 용도는 필요한 효소의 활
성을 차단하는 물질을 일시적으로 분리하여 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 방해하는 데
사용될 수 있다는 것이다.
4) Ligation
- 원하는 Insert DNA를 PCR을 통해 얻고, 이 insert DNA를 숙주로 옮겨줄 vector를
plasmid 형태로 붙어줘야 한다. 제한 효소를 한 가지만 사용하게 되면, 각 말단이 서로
상보적인 sequence를 가지기 때문에 말단끼리 붙어버리는 self ligation이 일어나는 경
우가 많다. 그렇게 되면 , 원하는 재조합 DNA가 만들어지지 않는다. 이러한 self
ligation을 막기 위해 두 개의 제한 효소로 double cut을 하게 된다. 그러면 insert와
vector가 서로 상보적인 말단을 가지게 되고, Base간의 수소결합으로 붙을 수 있게 된
다.
하지만
이
결합만으로는
불안정하기
때문에
두
개의
큰
DNA
분자가
Phosphodiester bond로 단단히 결합할 수 있도록 Ligase라는 효소를 사용한다.
Ligase는 원래 세포 내에서 DNA가 복제되는 동안 발생하는 DNA 파손 혹은 결손 시에
이를 복구하려는 효소이다. Ligase는 방향에 관계 없이 비특이적으로 반응하여 DNA를
복구시키거나 결합시킨다. DNA 이중가닥 중 한 가닥의 Phosphodiester bond가 결손
되었을 경우 이 불연속적인 부분을 연결해주거나 두 개의 DNA 이중가닥이 있을 경우
이 두 분자를 결합시킨다. 이 과정에서 ligase는 효소의 활성을 위해 보조인자
(Cofactor)를 필요로 한다.
나. 주의사항
- 실험 중 항상 실험복과 니트릴 글러브를 착용한다.
- 각 제한효소는 모두 -20℃ 에서 보존한다.
- 전기영동에 사용되는 EtBr등의 화학물질은 몸에 좋지 않으므로 사용에 주의하여야 한다.
- 9 -
- 전기영동 장지는 고압의 전기를 발생시키는 경우가 많으므로 항상 감전되지 않도록 주의를
기울여야 한다.
7. 참고 문헌 및 출처
위키백과 ‘전기영동’
https://ko.wikipedia.org/wiki/%EC%A0%84%EA%B8%B0%EC%98%81%EB%8F%99
도서관 카탈로그 > 생명 공학의 도구 및 기술들 : 겔 전기 영동 (Gel electrophoresis)
https://www.labxchange.org/
화학 및 생화학 물질 > BiochemicalsAgarose
https://www.sigmaaldrich.com
https://local.koreasci.com/download/manual/101_kor.pdf
도서관 카탈로그 > 유전 공학 입문 : 재조합 플라스미드
https://www.labxchange.org/library/pathway/lx-pathway:8e6622fb-4091-4451-9950-4
658a7694045/items/lx-pb:8e6622fb-4091-4451-9950-4658a7694045:html:2e268eff
PCR 산물의cloning
http://cms.takara.co.kr/file/lsnb/21_h_1.pdf
https://takara.co.kr/file/manual/D190718_1.htm
서린바이오사이언스 https://blog.naver.com/seoulinbio/222162767944
https://www.attokorea.co.kr/polyacrylamide-gel-electrophoresis-page/
https://gozar-de-la-vida.tistory.com/395
- 실험 기구 및 시약 사진 출처
https://ko.wikipedia.org/wiki/%EC%86%8C_%ED%98%88%EC%B2%AD_%EC%95%8C%EB%B6
%80%EB%AF%BC#top-page
https://www.istockphoto.com/kr/%EC%82%AC%EC%A7%84/%ED%94%8C%EB%9D%BC%EC%
8A%A4%EB%AF%B8%EB%93%9C-dna-gm466235130-59690248
https://international.neb.com/products/r0101-ecori
https://www.iba-lifesciences.com/media/2a/a5/60/1635328195/imported-2-1002-100.jpg
https://assets.fishersci.com/TFS-Assets/CCG/product-images/F73443~p.eps-650.jpg
https://www.carlroth.com/com/en/incubators/incubator-in-inplus-series-in-series-models/p/ty
31.1
https://www.labmark.eu/myfuge-5-microcentrifuge
플라스미드
- 10 -
https://sg.idtdna.com/pages/education/decoded/article/cohesive-end-cloning
전기영동의 원리와 실험 https://local.koreasci.com › manual › 101_kor
https://blog.naver.com/PostView.naver?blogId=sanigen&logNo=222437057580&categoryNo
=0&parentCategoryNo=0&viewDate=&currentPage=1&postListTopCurrentPage=1&from=p
ostView
[네이버 지식백과] 유전자 재조합 (Basic 중학생을 위한 기술·가정 용어사전, 2007. 8. 10., 기
술사랑연구회)
https://terms.naver.com/entry.naver?docId=923442&cid=47326&categoryId=47326
- 11 -