Idee per
il tuo futuro
Fabio Fanti
Biologia,
microbiologia
e biotecnologie
Biotecnologie
di controllo sanitario
SCIENZE
Fabio Fanti
Biologia,
microbiologia
e biotecnologie
Biotecnologie
di controllo sanitario
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di qualsiasi tipo (inclusi magnetici e ottici), di riproduzione e di adattamento totale o parziale
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e di traduzione sono riservati per tutti i paesi. L’acquisto della presente copia dell’opera
non implica il trasferimento dei suddetti diritti né li esaurisce.
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l’autorizzazione a riprodurre un numero di pagine non superiore al 15% delle pagine
del presente volume. Le richieste per tale tipo di riproduzione vanno inoltrate a
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20122 Milano
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considerarsi rare le opere di cui esiste, nel catalogo dell’editore, una successiva edizione, le opere presenti
in cataloghi di altri editori o le opere antologiche. Nei contratti di cessione è esclusa, per biblioteche,
istituti di istruzione, musei ed archivi, la facoltà di cui all’art. 71 - ter legge diritto d’autore.
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Realizzazione editoriale:
– Coordinamento redazionale: Elena Bacchilega, Simona Vannini
– Redazione: Epitesto, Milano
– Segreteria di redazione: Deborah Lorenzini
– Progetto grafico: 46XY, Milano
– Impaginazione: pre&stampa, Segrate MI
– Ricerca iconografica, disegni e indice analitico: Epitesto, Milano
– Disegni: Giuseppe Maserati, Riccardo Vercesi
– Fotografie al microscopio elettronico: © Dennis Kunkel Mycroscopy, Inc.
– Idee per il tuo futuro: Laura Mancuso (testi), Barbara Di Gennaro (redazione), Miguel Sal & C., Bologna
(progetto grafico e impaginazione), Sara Colaone (disegni)
L’Autore ringrazia la professoressa Anna Rita Musa per la preziosa collaborazione.
Copertina:
– Progetto grafico: Miguel Sal & C., Bologna
– Realizzazione: Roberto Marchetti
– Immagine di copertina: cellule di Candida albicans, un saccaromicete che vive nel cavo orale, nel tratto
gastrointestinale e nell’apparato riproduttore femminile; questo fungo può diventare patogeno e provocare
una malattia detta candidosi. © Science Photo Library/TIPS.
Prima edizione: febbraio 2013
L’impegno a mantenere invariato il contenuto di questo volume per un quinquennio (art. 5 legge n. 169/2008)
è comunicato nel catalogo Zanichelli, disponibile anche online sul sito www.zanichelli.it, ai sensi del DM 41
dell’8 aprile 2009, All. 1/B.
Zanichelli garantisce che le risorse digitali di questo volume sotto il suo controllo saranno accessibili,
a partire dall’acquisto dell’esemplare nuovo, per tutta la durata della normale utilizzazione didattica
dell’opera. Passato questo periodo, alcune o tutte le risorse potrebbero non essere più accessibili
o disponibili: per maggiori informazioni, leggi my.zanichelli.it/fuoricatalogo
File per diversamente abili
L’editore mette a disposizione degli studenti non vedenti, ipovedenti, disabili motori o con disturbi
specifici di apprendimento i file pdf in cui sono memorizzate le pagine di questo libro. Il formato
del file permette l’ingrandimento dei caratteri del testo e la lettura mediante software screen reader.
Le informazioni su come ottenere i file sono sul sito www.zanichelli.it/diversamenteabili
Suggerimenti e segnalazione degli errori
Realizzare un libro è un’operazione complessa, che richiede numerosi controlli: sul testo, sulle immagini
e sulle relazioni che si stabiliscono tra essi. L’esperienza suggerisce che è praticamente impossibile pubblicare
un libro privo di errori. Saremo quindi grati ai lettori che vorranno segnalarceli.
Per segnalazioni o suggerimenti relativi a questo libro scrivere al seguente indirizzo:
lineaquattro@zanichelli.it
Le correzioni di eventuali errori presenti nel testo sono pubblicate nel sito www.zanichelli.it/aggiornamenti
Zanichelli editore S.p.A. opera con sistema qualità
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SCIENZE
Idee per
il tuo futuro
CHE COSA FARÒ DA GRANDE
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Sei alla fine del tuo percorso scolastico. Che cosa fare adesso? Iscriversi a un
corso universitario? Fare uno stage o un corso professionalizzante? Cercare di
entrare subito nel mondo del lavoro? Studiare e al contempo lavorare?
Per aiutarti nella scelta ti proponiamo alcuni dati relativi al 2009-2011. È impossibile dire come saranno le cose tra qualche anno, i tempi recenti ci hanno
abituati a cambiamenti anche repentini.
La laurea “paga”. Una recente ricerca Isfol 1 ha mostrato che chi è laureato ha più possibilità di trovare un’occupazione e in media riceve uno stipendio più alto rispetto a chi
possiede soltanto un diploma.
Dal momento che i diplomati entrano nel mondo del lavoro prima dei laureati, inizialmente il tasso di occupazione per i primi è superiore rispetto a quello dei secondi,
ma già prima del compimento dei 30 anni chi possiede una laurea ha più possibilità
di trovare lavoro, per arrivare nella fascia 34-44 anni, dove il tasso di occupazione dei
laureati supera del 7% quello dei diplomati.
In media, tra 25 e 64 anni è occupato il 73,1% dei diplomati e il 79,2% dei laureati. Però,
secondo uno studio OCSE del 2011, i giovani laureati subiscono di più gli effetti della
recente crisi economica rispetto ai loro coetanei con istruzione secondaria inferiore2.
Quali lauree valgono un lavoro? Le lauree “brevi” servono? Le lauree triennali si rivelano molto utili ai fini dell’occupazione: a un anno dal termine degli studi il 42,1% dei
laureati triennali lavora, con picchi dell’81,7% per le professioni sanitarie. Tirocini e
stages sono determinanti per formare e inserire questi laureati nel mondo del lavoro.
I tassi di occupazione più alti si hanno tra i medici, seguiti dai laureati in chimica farmaceutica e ingegneria. In generale, sono le discipline di tipo scientifico – sia a livello
di diploma sia a livello di laurea – le più spendibili nel mondo del lavoro, mentre le
discipline umanistiche condannano a una difficile collocazione sul mercato, anche a
fronte di un eccesso di offerta di laureati in questi ambiti.
A Nord c’è più lavoro, ma… A livello nazionale il tasso di disoccupazione è 7,8%, che
sale a 27,4% se si considerano solo i giovani (15-24 anni): più alto al Sud (39,2%), meno
al Centro (25,3%), più basso al Nord (19,0%). La situazione per le ragazze è più critica:
il tasso della disoccupazione femminile, nella fascia 15-24 anni, supera di circa 8 punti
percentuali quello maschile (32,3% per le donne, 23,9% per gli uomini), forbice che si
mantiene simile nelle diverse zone geografiche: al Nord il tasso è 22,7% per le donne e
16,4% per gli uomini; al Centro è 34,8% per le donne e 18,7% per gli uomini e a Sud è di
44,0% per le donne e 36,0% per gli uomini.
Tuttavia, i dati della disoccupazione giovanile non devono scoraggiare chi cerca lavoro: se la disoccupazione giovanile è del 27,4%, vuol dire che una parte non piccola
dei giovani che hanno cercato lavoro (il 72,6%) lo ha trovato3. Inoltre i dati variano molto da luogo a luogo e anche all’interno di una stessa regione può esservi una grande varietà di situazioni. L’Emilia-Romagna è tra le regioni in cui la disoccupazione giovanile
incide meno, ma con grandi differenze tra le province: se Bologna nel 2010 raggiunge
un tasso di disoccupazione di 29,2%, a Piacenza il valore è più che dimezzato (13,6%)4.
1 Tutti i dati sono tratti
da una ricerca Isfol
con dati relativi al
2010, (l’Isfol, Istituto
per lo Sviluppo
della Formazione
Professionale dei
Lavoratori è un ente
pubblico di ricerca), e
ISTAT del II Trimestre
2011.
2 Rapporto OCSE
Education at a Glance
2011.
3 Dati ISTAT del II
Trimestre 2011.
4 Dati Confartigianato
Imprese EmiliaRomagna, 2010.
V
Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
COME FUNZIONA L’UNIVERSITÀ
L’Università italiana offre corsi di studio organizzati in tre cicli:
laurea, di durata triennale (180 crediti formativi in un massimo di 20 esami), al termine della quale si consegue il titolo di Dottore; ad esempio laurea in Tecniche di
radiologia medica o in Scienze del comportamento e delle relazioni sociali.
POSSO ISCRIVERMI
ALL’UNIVERSITÀ?
Laurea magistrale, di durata biennale (120 crediti in un massimo di 12 esami), al
termine della quale si consegue il titolo di Dottore magistrale; ad esempio laurea in
Biotecnologie mediche o in Psicologia clinica.
Per iscriversi
all’Università è
necessario il diploma di
maturità quinquennale
oppure quello
quadriennale con un
anno integrativo o, in
alternativa, un obbligo
formativo aggiuntivo
da assolvere durante il
primo anno di corso.
Dottorato di ricerca e Scuola di specializzazione.
Esistono anche corsi di laurea magistrali a ciclo unico, della durata di 5 (300 crediti in
un massimo di 30 esami) o 6 anni (360 crediti in un massimo di 36 esami); ad esempio
Medicina e Chirurgia.
Per approfondire gli studi si può accedere a master di 1° e di 2° livello e ai corsi di
alta formazione.
Quanto costa
l’Università?
www.
ideeperiltuofuturo.it
Il mio diploma è
riconosciuto in Europa?
http://www.enicnaric.net/
Vorrei studiare negli
USA
www.
ideeperiltuofuturo.it
I crediti formativi universitari (CFU) misurano il carico di lavoro dello studente
(1 CFU = 25 ore di impegno; 60 CFU = 1 anno di impegno universitario), compresi lo
studio individuale ed eventuali esperienze di apprendistato5. Sono stati introdotti per
facilitare il confronto tra i sistemi e i programmi di differenti corsi e Atenei italiani ed
europei, e quindi il passaggio da un corso di studio a un altro, oppure da un’Università
a un’altra, anche straniera: i CFU sono trasferibili in ECTS (European Credit Transfer
and Accumulation System) e quindi riconosciuti nelle Università di tutta Europa.
Tramite i CFU è possibile valutare ai fini della laurea anche esperienze quali stages e
tirocini. Infine i CFU permettono di semplificare la determinazione dei piani di studio
individuali (PSI) che ciascuno studente può modulare su se stesso. In alcuni casi è
possibile personalizzare il proprio percorso di studi, inserendo nel piano degli esami
da sostenere alcuni corsi non previsti dal piano di studi istituzionale.
Quando si presenta il PSI bisogna rispettare il minimo di crediti obbligatori per
ciascun ambito disciplinare previsti dal proprio corso di laurea.
Vorrei studiare in Europa. I cittadini dell’Unione europea (UE) possono studiare, dalla
scuola primaria al dottorato di ricerca, in uno dei paesi UE.
Per facilitare questi scambi è stato creato Ploteus, il portale delle opportunità di
apprendimento (www.europa.eu/ploteus): programmi di scambio, borse di studio,
descrizioni dei sistemi di istruzione e apprendimento dei vari paesi europei, nonché
indicazioni dei siti web degli istituti di istruzione superiore, i database dei corsi di formazione, le scuole... Attraverso Ploteus è possibile anche avere notizie pratiche, ad
esempio su come raggiungere la località e dove alloggiare, sul costo della vita, le tasse,
i servizi cui si può accedere.
5 Regolamento recante
norme concernenti
l’autonomia didattica
degli atenei, Decreto
Ministeriale 3 novembre
1999, n.509
VI
Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
I TEST DI AMMISSIONE
L’accesso ad alcuni corsi di laurea è filtrato da una prova di ammissione, per iscriversi alla quale occorre versare un importo (attorno ai 60 euro): sono Medicina e
Chirurgia, Odontoiatria e Protesi Dentaria, Medicina Veterinaria, le lauree a ciclo
unico finalizzate alla formazione in altre professioni sanitarie e in architettura.
Il numero programmato è reso obbligatorio dal Ministero dell’istruzione dell’Università e della ricerca (MIUR) per alcuni corsi di laurea, mentre in altri casi è il singolo
Ateneo a decidere (a Bologna, ad esempio, vi sono 44 corsi di laurea a numero programmato). Le prove d’ingresso comprendono 80 quesiti, cui rispondere in due ore di tempo
(15 minuti in più per architettura); ogni risposta corretta fa guadagnare un punto, le
risposte sbagliate fanno perdere 0,25 punti, mentre le risposte non date valgono 0. I
test comprendono quesiti di “cultura generale e ragionamento logico”, oltre a domande
sulle materie caratterizzanti i diversi indirizzi universitari.
Ad esempio, per essere ammessi a Medicina bisogna rispondere a 40 quesiti di “cultura generale e ragionamento logico”, 18 di biologia, 11 di chimica e 11 di fisica e matematica. Di seguito trovi una selezione di test di biologia tratti da alcune prove di ammissione ai corsi di laurea in Medicina e Chirurgia e in Odontoiatria e Protesi Dentaria;
queste domande riguardano argomenti di microbiologia.
01
“Uno scienziato, nel suo laboratorio di St.
Martin, a Londra, verificando lo stato di una
coltura di batteri, vi trovò una copertura di
muffa. Questo evento non aveva nulla di straordinario, poiché situazioni del genere erano
normali nei laboratori. La cosa eccezionale
fu invece il fatto che questa muffa aveva
annientato tutti i batteri circostanti. La scoperta fu casuale: se si fosse trattato di uno
scienziato più distratto, probabilmente tutto
sarebbe passato inosservato...”
Il brano riportato si riferisce alla scoperta:
a
d
dell’aspirina
b del virus HIV
c
e
03
a
b
c
d
e
della penicillina
del vaccino del vaiolo
Qui trovi tante
informazioni in più e
le prove assegnate
negli ultimi anni
http://
accessoprogrammato.
miur.it.
Qui trovi tante
informazioni in più e
degli esempi di test
www.cisiaonline.it.
Dall’osservazione al microscopio ottico di
una cellula si nota che in essa sono presenti
mitocondri e ribosomi insieme ad altri organuli. Si può sicuramente escludere che si
tratti:
di una cellula vegetale con attività fotosintetica
di un batterio in forte attività metabolica
del micelio di un fungo del terreno
di una cellula di calamaro gigante
della cellula di un lievito usato per la panificazione
[dalla prova di ammissione al corso di laurea in Odontoiatria e
Protesi Dentaria, anno 2008-2009]
degli anticorpi
[dalla prova di ammissione al corso di laurea in Medicina
e Chirurgia, anno 2005-2006]
02
a
b
c
d
e
04
Individuare l’unica affermazione del tutto
corretta:
tutte le cellule utilizzano ossigeno per le proprie
attività metaboliche
tutte le cellule posseggono più cromosomi
tutte le cellule presentano mitocondri
tutte le cellule possono riprodursi
tutte le cellule traggono origine da altre cellule
[dalla prova di ammissione al corso di laurea in Medicina
e Chirurgia, anno 2008-2009]
a
Indica quale di queste affermazioni sui virus è corretta:
i virus non infettano i batteri
b i virus contengono entrambi gli acidi nuc
cleici
i virus si replicano solo all’interno della
cellula
d i virus infettano solo cellule animali
e
i virus provocano solo malattie incurabili
[dalla prova di ammissione al corso di laurea in Medicina e Chirurgia, anno 2009-2010]
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VII
DOVE SI STUDIA ...
All’Università potrai studiare la Microbiologia in molti corsi di laurea in ambito
medico, biologico-ambientale, agrario e farmaceutico; riportiamo qui di seguito
solo alcuni esempi
Scienze biologiche
Biotecnologie
Scienze e tecnologie agrarie
Scienze e tecnologie alimentari
Viticoltura ed enologia
Farmacia
Chimica e tecnologia farmaceutiche
Scienze ambientali
Scienze del territorio e dell’ambiente agro-forestale
Per saperne di più
Ingegneria per l’ambiente e il territorio
www.
ideeperiltuofuturo.it
Medicina e chirurgia
Odontoiatria e protesi dentaria
Corsi di laurea abilitanti alle professioni sanitarie
Medicina veterinaria
Acquacoltura e igiene delle produzioni ittiche
Produzioni animali e controllo della fauna selvatica
Ci sono poi diversi altri corsi di laurea (per esempio Scienze delle attività motorie e
sportive) che prevedono esami di igiene, comprendenti una parte molto vasta dedicata alla microbiologia.
VIII
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VERSO IL LAVORO
Vorresti trovare lavoro? Nelle pagine che seguono trovi informazioni su come e
dove cercare lavoro, cos’è lo stage, come scrivere un curriculum e una lettera di
accompagnamento, come sostenere un colloquio. Sul sito www.ideeperiltuofuturo.it trovi tante informazioni utili e dettagliate in più per aiutarti nella tua ricerca
in Italia e all’estero: i centri per l’impiego e i Career days, siti internazionali, una
panoramica dei contratti di lavoro e altro ancora.
Vuoi cercare lavoro
all’estero?
www.
ideeperiltuofuturo.it
La ricerca di lavoro in Italia. Per mettere in contatto domanda e offerta di lavoro esistono in Italia numerosi soggetti, sia pubblici sia privati, autorizzati dallo Stato a svolgere
servizi di intermediazione e collocamento. Sono i Centri per l’impiego (CIP), le Agenzie per il lavoro, la Borsa continua nazionale del lavoro (BCNL) e il portale «Cliclavoro». Anche le scuole secondarie di secondo grado, le Università, i comuni, le associazioni dei datori di lavoro e dei lavoratori, i patronati, i gestori di siti internet possono
svolgere attività di intermediazione, purché non abbiano fini di lucro.
Cercare lavoro tra le pagine dei giornali. Un canale tradizionale ma sempre valido per
chi cerca annunci di lavoro è rappresentato da supplementi e inserti delle maggiori
testate a diffusione nazionale e dai giornali specializzati; ne segnaliamo alcuni fra i
principali:
il supplemento «Tutto Lavoro» del lunedì della «Stampa»;
le pagine dedicate al lavoro il giovedì dalla «Repubblica»;
il supplemento «Corriere lavoro», con la sezione «Trovo Lavoro», del «Corriere della
Sera» del venerdì;
il supplemento «Carriere&Lavoro» del «Sole 24Ore» del venerdì tocca tematiche
relative al nuovo mercato del lavoro attraverso inchieste e dossier, e fornisce strumenti e notizie utili per cambiare mestiere e migliorare la propria carriera.
Fra i giornali specializzati:
il settimanale «Trova Lavoro» con annunci dall’Italia e dall’estero e una selezione
dei concorsi tratti dalla Gazzetta Ufficiale;
«Walk on Job» , un bimestrale distribuito gratuitamente in 41 città italiane, che dà
spazio al mondo del lavoro e della formazione, con inchieste, interviste, notizie e
opportunità prima e dopo la laurea;
il mensile «Bollettino del Lavoro».
Cercare lavoro online. Accanto alla versione cartacea dei supplementi dei giornali, si
trova anche la versione online, col vantaggio di consentire un aggiornamento continuo
degli annunci, l’inserimento immediato del proprio curriculum in apposite banche
dati, di inviare direttamente la propria candidatura in risposta alle offerte di lavoro, di
ricevere gli annunci sulla propria e-mail.
Tra le versioni online segnaliamo «Job24» del «Sole 24Ore» e «MioJob» della «Repubblica». Tra i più importanti (e seri) siti per la ricerca di lavoro indichiamo Monster
(www.monster.it) e Infojobs (www.infojobs.it). Da consultare è anche il sito www.concorsi.it, che informa sui concorsi pubblici banditi in Italia. Per quanto riguarda i social
network professionali si segnalano Linkedin (www.linkedin.com) e Xing (www.xing.
com) che, oltre a funzionalità come “find job”, offrono la possibilità di entrare a far
parte di gruppi di discussione utili alla crescita professionale.
LA TOP TEN DEI LAVORI
IN ITALIA
Non hai un’idea
precisa di cosa vorresti
fare? Alcune figure
professionali sono molto
ricercate in Italia, ecco
la top ten dei profili
lavorativi più ricercati in
Italia nel 2011, secondo
il quotidiano “Il Sole 24
Ore”.
1) Farmacista
2) Progettista settore
metalmeccanico
3) Infermiere
4) Addetto consulenza
fiscale
5) Sviluppatore software
6) Progettista meccanico
7) Educatore
professionale
8) Addetto logistica
9) Disegnatore tecnico
Cad-Cam
10) Fisioterapista
(Fonte: Union CamereExcelsior 2011)
IX
Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
CURRICULUM VITAE E LETTERA DI ACCOMPAGNAMENTO
Scarica il CV
Europass
www.europassitalia.it
Il Curriculum Vitae. Quando si è alla ricerca di un lavoro, prima o poi arriva il momento di inviare (per posta ordinaria o per e-mail) il proprio Curriculum Vitae (CV) e una
lettera di accompagnamento alle aziende per le quali si desidera lavorare, sperando di
essere chiamati per un colloquio.
Il CV è la carta di identità professionale del candidato e deve indicare l’iter formativo, le conoscenze e le competenze di chi si propone per ottenere un impiego.
Si comincia sempre dai dati anagrafici, per un’inquadratura iniziale, e dai contatti
(indirizzo, numero di telefono, cellulare, e-mail...), per poi passare in rassegna le precedenti esperienze lavorative e le varie tappe della propria istruzione/formazione, dalla
più recente alla più lontana nel tempo.
Altre informazioni indispensabili riguardano la padronanza di una o più lingue straniere e le competenze tecniche; conviene anche mettere in rilievo le capacità relazionali e organizzative, se si posseggono.
Per quanto riguarda altre informazioni personali, è meglio inserire solo quelle che
possono essere apprezzate dalla specifica azienda cui è indirizzato il CV.
Infine, non bisogna mai dimenticare di autorizzare il trattamento dei dati personali,
facendo riferimento al d. lg. 196/2003.
Un CV efficace sarà completo, chiaro e soprattutto breve (due pagine di solito sono
sufficienti): bisogna tenere conto che chi lo legge è abituato a valutarne decine tutti i
giorni e apprezzerà il fatto di trovare subito le informazioni che gli interessano.
Meglio selezionare solo le aziende che più si avvicinano al proprio profilo professionale e scrivere per ciascuna una lettera di accompagnamento mirata.
I portali che si occupano di selezione del personale solitamente danno
la possibilità di compilare CV online, secondo modelli prestabiliti; oppure
si può preparare da soli il CV e poi caricarlo sul sito su cui ci si vuole proporre.
La lettera di accompagnamento (o cover letter ) va preparata con molta
attenzione perché serve a convincere il selezionatore a prendere in
considerazione l’offerta di lavoro e quindi a esaminare il CV.
La forma deve essere curata e corretta, per dimostrare un buon
livello di istruzione.
La lettera di accompagnamento è una e-mail (o una lettera)
dalla quale devono emergere in maniera sintetica (dieci
righe al massimo) le motivazioni del candidato, le competenze, i titoli, le esperienze che rendono la persona
adatta per quel posto di lavoro.
Sintetici sì, ma non vaghi o generici: l’impegno nello
scrivere la lettera sta proprio nel risultare sinceri, con le
idee chiare ma anche aperti a varie possibilità.
La lettera deve far capire che si conosce, anche se dal
di fuori, l’azienda e che se ne comprendono le necessità.
Per avere queste informazioni è necessario visitarne il sito
internet ma anche, ad esempio, cercare e, se si può, sperimentare, i prodotti di quell’azienda. In questo modo sarà
più facile mettersi dal punto di vista dell’azienda stessa,
capire quali competenze potrebbero essere utili e puntare su quelle.
X
Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
CURRICULUM VITAE E LETTERA DI ACCOMPAGNAMENTO
Le possibilità di essere valutati crescono se la busta che contiene lettera e CV, o l’email, è indirizzata al direttore del settore nel quale vorremmo lavorare e non genericamente all’impresa o, ad esempio, all’ufficio delle risorse umane. In questo caso bisogna
fare accurati controlli per essere certi di scrivere correttamente il nome, il titolo di studio, la posizione che ricopre la persona a cui indirizziamo la lettera ed essere sicuri che
effettivamente lavori ancora lì.
Una lettera di accompagnamento. Carla è diplomata in Servizi per l’agricoltura e
lo sviluppo rurale. Ha sfruttato un periodo di lavoro part-time in un call center per
avere il tempo di cercare un corso di formazione che faccia al caso suo. Dopo ha
frequentato un corso della Regione di 180 ore in
Sicurezza alimentare.
Nel frattempo visita i siti di varie
aziende della zona in cui abita e ne individua alcune cui decide di inviare il CV.
ELDQFRODWWH#ODPR]]DUHOODLW
La ditta dove vorrebbe lavorare è “La
Mozzarella”, che produce latte e deriva2IIHUWDGLFROODERUD]LRQH
ti. Nel sito si insiste sulla qualità dei prodotti unita al rispetto dell’ambiente.
Egr. dott. Biancolatte,
A chi vuole lavorare per “La Mozho frequentato l’Istituto professionale per i Servizi per l’agricoltura e lo sviluppo rurale
di A… diplomandomi con 96/100. Di recente ho seguito un corso di specializzazione
zarella” è richiesta personalità, grinta
della Regione B… in Sicurezza alimentare, che verteva sulle moderne tecniche di analisi
e condivisione dei valori dell’azienda.
degli alimenti.
Con una telefonata Carla verifica che il
,OYRVWURQRPHFKHFRQRVFRVLQGDSLFFRODSHUPHqVLQRQLPRGLVHULHWjHDI¿GDELOLWj
responsabile della sicurezza alimentare
HFRQGLYLGRO¶RELHWWLYRGLSXQWDUHVXOODTXDOLWjHODVRVWHQLELOLWjGHOODSURGX]LRQHH
VXOULVSHWWRSHUO¶DPELHQWHPLqVHPSUHSLDFLXWDO¶LGHDGLODYRUDUHQHOO¶DUHDGHOOD
è il dott. Biancolatte.
produzione e del controllo alimentare, e in particolare nella produzione dei latticini
Ecco la lettera di accompagnamento
che apprezzo molto, pertanto vi chiedo gentilmente di informarmi riguardo alla vostra
scritta da Carla.
GLVSRQLELOLWj
Le porgo i miei più cordiali saluti,
Carla Bianchi
XI
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IL COLLOQUIO E LO STAGE
E se mi fanno una
domanda assurda?
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Il colloquio. La strategia per la buona riuscita di un colloquio di lavoro comincia nel
momento in cui si viene contattati. Innanzitutto è importante rispondere subito e con
gentilezza alla convocazione (che sia arrivata per telefono, lettera o e-mail) e presentarsi puntuali all’appuntamento.
Per evitare ritardi, conviene informarsi bene su come raggiungere la sede del colloquio e partire con largo anticipo, così da non arrivare trafelati all’incontro.
Il successo di un colloquio dipende anche da una serie di informazioni che sarà
stato possibile raccogliere sull’azienda e utilizzare a proprio vantaggio. Ad esempio,
per decidere quale sia l’abbigliamento più adatto, uno sguardo allo stile dell’azienda
è consigliato. Basterà poi adattare questo stile al proprio e alla posizione alla quale si
aspira. Se, ad esempio, cerchiamo lavoro in banca potrebbe essere una buona idea non
mettere i jeans, se si tratta di un’azienda di grafica che ha uno stile giovane e casual i
jeans andranno benissimo. Conoscere l’azienda per la quale si desidera lavorare è
importante anche per mostrare in maniera mirata le competenze di cui si dispone,
nonché interesse e sintonia con quella specifica linea imprenditoriale.
Quando ci si trova di fronte alla persona incaricata della selezione, bisogna mostrarsi sicuri e determinati senza essere spavaldi o sbruffoni. Non conviene mentire a proposito delle esperienze lavorative precedenti o essere disonesti riguardo alle proprie
capacità: prima o poi si verrà scoperti, magari nel momento meno opportuno... È invece importante mostrarsi positivi, disponibili a imparare e a risolvere problemi.
I reclutatori rivolgono al candidato una serie di domande, a volte prevedibili, che
possono riguardare la sfera personale (ad esempio “Da quanto tempo cerca lavoro?”...)
o la sfera professionale: sia sulle esperienze passate (ad esempio: “Mi parli del suo curriculum”, “Perché ha scelto proprio quel corso di studi?”...), sia sul lavoro per cui si è
a colloquio (ad esempio “Cosa sa della nostra azienda?”, o anche “Perché dovremmo
assumerla?”).
Alcune aziende preparano un colloquio di gruppo, per osservare in che modo i candidati interagiscono tra loro, collaborano, affrontano alcune situazioni critiche che simulano quelle reali. In questi casi il consiglio è di non essere eccessivi: la cosa migliore
è mostrare senso pratico e capacità di mediare e partecipare o guidare il gruppo verso
la soluzione del problema.
Lo stage (tirocinio formativo o internship). Si tratta di un’esperienza professionale utile
per chi si avvicina al mondo del lavoro per la prima volta, per accrescere le proprie
competenze e arricchire il Curriculum Vitae, anche perché è difficile trovare un impiego senza avere precedenti esperienze.
Lo stage non rientra nelle tipologie di lavoro subordinato poiché è obbligatoria per il
tirocinante solo un’assicurazione in caso di infortunio (e non lo stipendio).
Per quantificare l’utilità dello stage è stato creato il sistema dei crediti
formativi, ossia un punteggio che il giovane studente guadagna nel corso del suo tirocinio e che può spendere ai fini
formativi: di diploma, per gli studenti del quinto anno
di scuola media superiore; di esame o di laurea, per gli
universitari.
Un’esperienza di stage può anche arrivare a sostituire un esame universitario: è sufficiente certificare
che l’esperienza svolta durante lo stage va a integrare le conoscenze acquisite nell’arco degli studi,
completandole e arricchendole.
XII
Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
SOMMARIO
2.11
Capitolo 1
METABOLISMO ED ENERGIA
1.1
1.2
1.3
Energia dal metabolismo
Strategie metaboliche
per la produzione di energia
Le fermentazioni
2
4
6
Capitolo 2
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7
2.8
2.9
2.10
Biotecnologie tradizionali
e innovative
Biotecnologie microbiche
Biocatalizzatori molecolari: gli enzimi
Composizione
Classificazione
Meccanismo d’azione degli enzimi
Specificità degli enzimi
Coenzimi e cofattori
Isoenzimi
Cinetica e attività enzimatica
Fattori che influenzano la velocità
di reazione
Concentrazione dell’enzima
Concentrazione del substrato
Temperatura
pH
Inibizione enzimatica
Regolazione della sintesi degli enzimi
Induzione
Repressione
Biocatalizzatori cellulari:
i microrganismi
Le tecniche di selezione
dei ceppi microbici
Strategie di screening
24
25
26
27
27
28
28
Capitolo 3
BIOTECNOLOGIE MICROBICHE
2.1
Selezione dei ceppi alto-produttori
Mutazioni
Ricombinazione naturale di geni
Ibridazione di lieviti
Fusione di protoplasti
Elettroporazione
DNA ricombinante (ingegneria genetica)
I PROCESSI BIOTECNOLOGICI
10
11
11
11
12
13
13
13
14
14
16
16
16
17
17
18
19
19
20
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
21
3.7
3.8
3.9
21
23
3.10
3.11
Substrati e prodotti
I terreni di coltura per la microbiologia
industriale
Fonti di carbonio
Fonti di azoto
Fonti di vitamine
Minerali
Agenti antischiuma
Sistemi tampone
Precursori
I prodotti
Fasi produttive: preparazione
dell’inoculo
Lo scale-up
I fermentatori o bioreattori
Classificazione dei bioreattori in base
alla tipologia costruttiva
Classificazione in base al sistema
di aerazione/agitazione
Sterilizzazione
Processi batch, continui, fed-batch
Immobilizzazione
dei biocatalizzatori
I sistemi di controllo
Il recupero dei prodotti (downstream)
30
31
33
34
35
35
36
36
37
37
39
39
40
41
42
43
44
46
47
49
XIII
Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
SOMMARIO
Capitolo 4
PRODOTTI OTTENUTI DA
PROCESSI BIOTECNOLOGICI
4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
4.6
Biomasse microbiche
Single cell proteins
Lievito per panificazione
Colture insetticide da Bacillus
Colture di Rhizobium
Acido poli-beta-idrossibutirrico
e poli-idrossi-alcanoati da biomasse
Acidi organici
Acido lattico (fermentazione anaerobia)
Acido citrico (fermentazione aerobia)
Acido gluconico
Etanolo
Aminoacidi
Produzione di L-lisina
Produzione di acido glutammico
Enzimi
Vitamine
54
54
55
56
57
58
58
59
60
61
61
64
64
65
65
67
5.9
5.10
5.1
5.2
5.3
5.4
5.5
5.6
5.7
5.8
Produzione biotecnologica di proteine
umane
Sistemi di espressione
Sistemi di coltura, mezzi colturali
e contaminanti
Purificazione
Sterilità
Eliminazione dei pirogeni
Eccipienti impiegati nei farmaci proteici
biotecnologici
Liofilizzazione delle proteine
Vie di somministrazione e assorbimento
La produzione industriale: lo scale-up
Produzione di vaccini
Vaccini ricombinanti
Produzione di anticorpi monoclonali
Produzione di interferoni
Produzione di ormoni
Ormoni polipeptidici
Bioconversioni
Produzione di vitamina C
Bioconversione di ormoni steroidi
Produzione di antibiotici
Classi strutturali e meccanismo d’azione
degli antibiotici
6.1
6.4
6.5
6.6
70
71
72
72
73
74
74
74
74
75
75
77
79
80
81
81
84
86
86
86
87
88
88
89
89
89
90
90
91
PRODUZIONI BIOTECNOLOGICHE
ALIMENTARI
6.3
PROTEINE UMANE
RICOMBINANTI, ORMONI E
ANTIBIOTICI
87
88
Capitolo 6
6.2
Capitolo 5
Antibiotici che inibiscono la sintesi
della parete cellulare batterica
Antibiotici che bloccano la sintesi proteica
Antibiotici che alterano le funzioni della
membrana cellulare
Antibiotici che interferiscono
con la sintesi degli acidi nucleici
Produzione di penicilline e cefalosporine
Produzione di penicillina
Penicilline naturali
Penicilline semisintetiche
Cefalosporine
Statine e altre molecole di impiego
medico e zootecnico
6.7
Il vino
Alterazioni microbiche del vino
L’aceto
Aceto balsamico
La birra
Alterazioni della birra
Il pane e i prodotti da forno
a lievitazione naturale
Lo yogurt
I vegetali fermentati
Crauti
Olive
Cetrioli
Esopolisaccaridi
Xantano
Destrano
Alginato
93
95
95
96
97
99
99
100
101
101
102
102
102
103
103
104
Capitolo 7
BIOTECNOLOGIE IN CAMPO
AGRARIO, ZOOTECNICO
E SANITARIO
7.1
7.2
7.3
7.4
Biotecnologie in campo agrario
Tecniche di trasformazione
Sistemi diretti
Sistemi indiretti
Identificazione delle cellule trasformate
Piante transgeniche
Piante transgeniche che fissano l’azoto
atmosferico
Piante transgeniche resistenti agli insetti
Piante transgeniche resistenti al gelo
XIV
Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
106
107
107
108
108
109
109
109
109
SOMMARIO
7.5
7.6
7.7
7.8
7.9
7.10
7.11
7.12
7.13
La micropropagazione
Aspetti legislativi
Biotecnologie nel settore veterinario
e zootecnico
Il sessaggio del seme in zootecnia
La tracciabilità genetica
Applicazione delle biotecnologie
in campo biomedico e farmacologico
Prodotti farmaceutici e diagnostici
Principi attivi per uso farmaceutico
da piante superiori
La terapia genica
Vettori di geni
Vettori retrovirali
110
111
111
112
113
9.3
9.4
113
113
115
115
116
116
Conservazione con mezzi chimici
Salagione, zuccheraggio
Conservazione con aceto o con olio
Conservazione con alcol
Conservazione mediante fermentazione
Impiego di additivi e conservanti
Conservanti ad azione antimicrobica
Conservanti secondari
Antiossidanti
Addensanti
Emulsionanti
Esaltatori di sapidità
Coloranti
Edulcoloranti
Coadiuvanti tecnologici
139
139
139
139
139
140
140
141
142
142
142
142
143
143
143
Capitolo 10
Capitolo 8
CONTAMINAZIONI
MICROBIOLOGICHE E CHIMICHE
DEGLI ALIMENTI
8.1
8.2
8.3
8.4
8.5
8.6
Qualità e igiene degli alimenti
118
Contaminazione microbica
degli alimenti
119
Processi di degradazione microbica
119
I microrganismi indicatori
120
I microrganismi indicatori di sicurezza
120
Microrganismi indicatori di igiene
di processo
121
Microrganismi indicatori di qualità
o shelf-life
121
I fattori che condizionano
la microbiologia degli alimenti
123
Contaminazione chimica degli alimenti 126
Contaminazione da pesticidi
126
Impiego di ormoni anabolizzanti e antibiotici 127
Contaminazione da contenitori
127
Contaminazione da coadiuvanti tecnologici 127
Contaminazione da metalli pesanti
128
Capitolo 9
LA CONSERVAZIONE
DEGLI ALIMENTI
9.1
9.2
La conservazione degli alimenti
Conservazione con mezzi fisici
Alte temperature
Basse temperature
Irradiazione
Affumicatura
Disidratazione/essiccamento
Liofilizzazione
130
131
131
135
137
138
138
138
NORMATIVE E CONTROLLI PER
LA SICUREZZA E LA QUALITÀ
ALIMENTARE
10.1
10.2
10.3
10.4
10.5
Sicurezza degli alimenti: normative
e certificazioni
Il “pacchetto igiene”
Il sistema HACCP nell’industria
alimentare
La shelf-life degli alimenti
Il challenge test
145
146
148
149
150
Capitolo 11
MALATTIE TRASMESSE
CON GLI ALIMENTI
11.1
11.2
11.3
11.4
11.5
11.6
11.7
11.8
11.9
11.10
11.11
11.12
11.13
11.14
11.15
Infezioni, intossicazioni, tossinfezioni
152
Intossicazione da stafilococchi patogeni 153
Tossinfezione da Escherichia coli
154
Shigellosi
154
Salmonellosi
155
Tifo e paratifo
156
Tossinfezione da Yersinia enterocolitica 156
Intossicazione da Clostridium botulinum 156
Tossinfezione da Clostridium
perfringens
157
Infezione da Bacillus cereus
e altri bacilli
157
Infezione da Vibrio parahaemolyticus
158
Colera
158
Listeriosi
158
Brucellosi
159
Tossinfezione da Campylobacter
159
XV
Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
SOMMARIO
11.16 Micotossicosi
11.17 Epatite infettiva (epatite A)
11.18 Infezione da Entamoeba histolytica
159
160
160
13.4
13.5
Capitolo 12
CONTROLLO MICROBIOLOGICO
DEGLI ALIMENTI
12.1
12.2
12.3
12.4
12.5
12.6
12.7
12.8
12.9
12.10
12.11
12.12
12.13
12.14
12.15
Tecniche analitiche tradizionali
e innovative
162
Criteri microbiologici
164
I piani di campionamento
164
Microrganismi indicatori
165
Le frodi alimentari
165
Le carni
166
Carni fresche e refrigerate
166
Carni congelate
168
Carne di pollo
169
Carni salate
170
Conserve e semiconserve in recipienti
a chiusura ermetica (prodotti in scatola) 171
Carni in scatola
172
I salumi
172
Salumi non insaccati
174
Latte e derivati
174
Il latte
174
Aspetti microbiologici
175
La crema o panna di latte
177
Il burro
177
I formaggi
178
Yogurt e latti fermentati
179
Yogurt
179
Latti fermentati probiotici
182
Kefir
183
I gelati
184
Uova e derivati
184
Prodotti d’uovo
185
Prodotti della pesca
185
Miele
186
Paste alimentari
188
13.6
13.7
Capitolo 14
LE CELLULE STAMINALI
14.1
14.2
14.3
14.4
14.5
14.6
14.7
14.8
15.1
15.2
15.3
15.4
15.5
13.3
190
194
194
196
202
204
205
207
207
209
209
210
INQUINANTI XENOBIOTICI E
MUTAGENESI AMBIENTALE
SPERIMENTAZIONE DI NUOVI
FARMACI, COMPOSTI GUIDA E
FARMACOVIGILANZA
Alcune definizioni
Come nasce un farmaco
Il percorso di un farmaco
La fase di ricerca preclinica (fase 0)
Le prime fasi di sviluppo dell’embrione:
il differenziamento cellulare
Le cellule staminali
Cellule staminali emopoietiche
Cellule staminali emopoietiche
dal sangue del cordone ombelicale
Trapianti di cellule staminali
emopoietiche (TCSE)
Patologie in cui è ritenuto valido
l’impiego di cellule staminali
Recenti acquisizioni: staminali
pluripotenti indotte (iPS)
Riprogrammazione cellulare tramite
REAC
Capitolo 15
Capitolo 13
13.1
13.2
La sperimentazione clinica
(clinical trials)
196
Le tre fasi dei clinical trials
197
Lo studio preliminare (fase I)
197
Lo studio terapeutico pilota (fase II)
198
Lo studio terapeutico su larga scala (fase III)198
La registrazione del farmaco
e l’immissione in commercio
199
Farmacovigilanza
199
Genotossicità e cancerogenesi
Le mutazioni: alcune nozioni
indispensabili
Mutageni fisici
Radiazioni
Fonti di radiazioni
Radiazioni ionizzanti
Radiazioni non ionizzanti
Danni biologici delle radiazioni
Mutageni chimici
Mutageni diretti
Promutageni
Mutageni indiretti
Fonti di esposizione a sostanze
chimiche
Ambiente esterno
Esposizione professionale
Ambiente confinato
Alimentazione
XVI
Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
212
213
214
214
214
215
216
216
217
217
217
218
218
218
219
219
219
SOMMARIO
Meccanismi di riparazione
del DNA
15.7 Destino degli xenobiotici
nell’organismo
15.8 Metabolismo degli xenobiotici
Reazioni di fase I
Reazioni di fase II
15.9 Tossicogenetica e polimorfismi
metabolici
15.10 Esempi di attivazione metabolica
Metabolismo del benzene
Metabolismo degli IPA
Metabolismo delle ammine aromatiche
15.11 Controlli di genotossicità
su matrici ambientali
Aria
Acqua
Suolo
Classificazione degli agenti mutageni
234
Linee guida comunitarie per la valutazione
degli effetti mutageni
235
Classificazione delle sostanze cancerogene 235
15.6
220
220
222
222
223
223
224
224
225
226
226
226
227
228
Capitolo 16
ESPOSIZIONE PROFESSIONALE
E VALUTAZIONE DEL DANNO DA
XENOBIOTICI
16.1
16.2
16.3
Esposizione professionale
e biomarcatori
Biomarcatori
Biomarcatori di esposizione
Biomarcatori di effetto biologico
Biomarcatori di suscettibilità
Aspetti normativi e linee guida
comunitarie
231
232
232
233
234
234
Capitolo 17
BIODEGRADAZIONE
DEI COMPOSTI ORGANICI
NATURALI E DI SINTESI
17.1
17.2
17.3
Biodegradabilità e fattori condizionanti 237
Biodegradazione dei derivati del petrolio 239
Biodegradazione aerobica
degli idrocarburi
240
17.4 Biodegradazione aerobica dello xilene 241
17.5 Biodegradazione degli idrocarburi
policiclici aromatici (IPA)
241
17.6 Biodegradazione anaerobica degli
idrocarburi
241
17.7 Biodegradazione degli xenobiotici
242
17.8 Biodegradazione dei composti
organici alogenati
244
17.9 Biodegradazione dei PCB
244
17.10 Aspetti genetici del metabolismo
biodegradativo
244
Bibliografia
246
Indice analitico
247
XVII
Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
BIOTECNOLOGIE
DI CONTROLLO SANITARIO
Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
1
METABOLISMO
ED ENERGIA
1.1 Energia dal metabolismo
1.2 Strategie metaboliche
per la produzione di energia
1.3 Le fermentazioni
Tutti gli esseri viventi utilizzano sistemi per convertire
l’energia disponibile nell’ambiente (luminosa per i fototrofi, chimica per i chemiotriofi) in energia utile per
le cellule. I meccanismi di trasformazione consistono
in reazioni redox in cui elettroni vengono trasferiti da
un donatore iniziale a un accettore finale. Il donatore
di elettroni è un substrato nutritivo per i chemiotrofi o
una molecola d’acqua (in seguito alla sua fotolisi) per
i fotoautotrofi; l’accettore finale può essere l’ossigeno o
un altro composto ossidato. Generalmente le reazioni di
ossidoriduzione dei substrati energetici nei chemiotrofi comportano la mobilizzazione di atomi di idrogeno
(elettroni e ioni idrogeno) che sono trasferiti ai coenzimi NAD+ e NADP+, generando “potere riducente”
cellulare sotto forma di NADH e NAPH. Questo verrà
utilizzato con modalità diverse per la sintesi di ATP, la
molecola che rappresenta la fondamentale riserva energetica della cellula.
1.1 Energia dal metabolismo
Fermentazione del mosto (Shutterstock Images, LLC).
Il metabolismo cellulare risponde in primo luogo
all’esigenza fondamentale di produrre energia. I processi metabolici nel loro insieme si compongono di
trasformazioni cataboliche da cui le cellule ricavano
energia e di reazioni anaboliche che la riutilizzano
(figure 1.1-1.2). Il catabolismo infatti comprende reazioni di demolizione di molecole nutritive complesse
(tipicamente carboidrati, ma non solo) fino a composti semplici: durante alcune di queste reazioni viene
liberata una certa quantità di energia (reazioni esoer-
2
Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
METABOLISMO ED ENERGIA
1
Aminoacidi
Energia
A n a bolis
Glucosio
mo
Proteine
C at a boli s m
o
Rifiuti (CO2, H2O)
Figura 1.1 Energia e metabolismo. L’energia funge da anello di congiunzione tra catabolismo e anabolismo.
goniche) che la cellula deposita, sotto forma di energia di legame, in composti di “riserva energetica” quali
l’ATP (adenosintrifosfato) o altri nucleotidi fosfati
(UTP, CTP, GTP) (figura 1.3). L’energia immagazzinata in queste molecole viene resa disponibile per
rispondere alle diverse richieste cellulari, inerenti sia
alla costruzione di molecole complesse per la crescita (processi endoergonici dell’anabolismo) che a tutte
le altre molteplici esigenze vitali. Ciò si realizza con la
rottura dei legami ad alta energia fra il gruppo fosfato e la parte restante della molecola: si formano così i
nucleotidi difosfati (adenosindifosfato) e monofosfati
(adenosinmonofosfato):
ATP
ADP + P + E
ADP
AMP + P + E
È evidente che le riserve di energia si esaurirebbero
se non venissero continuamente ricostituite attraverso
un processo di fosforilazione che forma nuovamente
ATP associando nuovo fosfato inorganico all’ADP (più
raramente partendo da AMP) (figura 1.4). Per la formazione di ogni nuovo legame altamente energetico è richiesta naturalmente una quota di energia pari a quella
fornita dalla sua rottura.
La fosforilazione può avvenire in seguito a:
r reazioni di ossidazione di composti organici (fosforilazione ossidativa)
r trasferimento diretto sull’ADP di un fosfato ad alta
energia proveniente da altri composti fosforilati (fosforilazione a livello del substrato come nella glicolisi)
r fotofosforilazione come nella fotosintesi.
La demolizione di ogni legame ad alta energia porta alla liberazione di 30,56 kJ/mole (7,3 kcal); l’idrolisi dell’AMP libera un minor quantitativo di energia
(14,24 kJ/mole).
Fase catabolica
E n e rg i a
Fase anabolica
Figura 1.2 La fase catabolica produce energia che viene
consumata nella fase anabolica.
Figura 1.3 Accoppiamento energetico. L’energia prodotta
dalle reazioni esoergoniche all’interno della cellula viene
utilizzata per la sintesi di ATP a partire da ADP e fosfato;
l’idrolisi dell’ATP ad ADP e fosfato produce a sua volta energia
utilizzata per le reazioni endoergoniche.
3
Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
1
METABOLISMO ED ENERGIA
Adenina
H
H
CARBONIO COME FONTE DI ENERGIA
N
N
N
H
N
N
–O
O–
O–
O–
P~O
P~O
P
O
O
O
CH2
Ribosio
O
O
OH
OH
Adenosina
AMP = Adenosina monofosfato
ADP = Adenosina difosfato
ATP = Adenosina trifosfato
Figura 1.4 Struttura dell’ATP. L’ATP, come l’ADP, è una
molecola ad alta energia. L’idrolisi dei legami P—O è, infatti,
una reazione altamente esoergonica, mentre l’idrolisi dell’ADP
libera una minor quantità di energia dovuta alla rottura di un
legame estere e non anidride fra il gruppo fosforico e il ribosio.
Gli organismi fototrofi infatti ricavano energia per la formazione di ATP dalla luce solare attraverso la fotosintesi,
quelli chemiotrofi la ottengono dall’ossidazione di composti chimici.
Gli organismi che non possono utilizzare l’energia
luminosa come fanno gli autotrofi, la ricavano dalla
demolizione dei substrati nutritivi. Questo processo
avviene per progressiva rimozione di elettroni (ossidazione o deidrogenazione) da composti ridotti organici o inorganici.
È interessante notare come questa energia non sia
resa disponibile immediatamente al momento in cui
queste reazioni si verificano, ma solo in un secondo
tempo e con un processo graduale.
Elettroni e idrogeno rimossi dai substrati vengono
infatti temporaneamente “caricati” su coenzimi trasportatori ossidati (NAD+, NADP+, FAD+) che in questo
modo passano nella loro forma ridotta (NADH, NADPH, FADH).
L’energia verrà liberata solo quando i coenzimi ridotti verranno riossidati dagli accettori finali di elettroni e idrogeno.
La riduzione del NAD+ comporta l’acquisto di due
elettroni e un solo protone: il secondo protone rimane
Tenendo conto anche della sorgente di carbonio, si
possono tracciare schematicamente le seguenti distinzioni fra gli organismi viventi:
r fotoautotrofi o fotolitotrofi: luce solare come
sorgente di energia; CO2 come fonte di carbonio
(piante, cianobatteri, batteri solfurei rossi e verdi)
r fotoeterotrofi o fotorganotrofi: luce solare come
sorgente di energia e carbonio organico come fonte
di questo elemento (batteri rossi non solfurei)
r chemioautotrofi o chemiolitotrofi: ossidazione
di sostanze inorganiche come sorgente di energia
e CO2 come fonte di carbonio (batteri nitrificanti,
solfobatteri incolori, ferrobatteri, idrogenobatteri)
r chemioeterotrofi o chemiorganotrofi: ossidazione di sostanze organiche come sorgente di
energia e fonte di carbonio (la maggior parte degli
organismi: protozoi, batteri, funghi, animali. Fra i
microrganismi, il batterio Beggiatoa ossida sostanze inorganiche).
infatti in soluzione. La forma ridotta del NAD viene solitamente indicata come NADH, ma in realtà la si dovrebbe indicare come NADH + H+.
1.2 Strategie metaboliche
per la produzione di energia
Gli organismi viventi possono disporre di tre tipi di strategie metaboliche per ricavare energia:
r respirazione aerobia
r respirazione anaerobia
r fermentazione.
La respirazione aerobia è la strategia più redditizia in
termini di energia: il substrato nutritivo organico viene
completamente ossidato prima nella glicolisi, quindi
nel ciclo di Krebs; gli elettroni e l’idrogeno, trasportati
da coenzimi trasportatori (NAD, FAD, citocromi) lungo la catena respiratoria mitocondriale in un’ordinata
successione di ossidoriduzioni, arrivano all’ossigeno
che ne rappresenta l’accettore finale riducendosi ad acqua (figura 1.5). In tre di questi passaggi si libera energia
sufficiente alla produzione di ATP. I prodotti sono quin-
4
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1
METABOLISMO ED ENERGIA
Spazio intermembrana
H+
H+
H+
H+
2e–
Cyt c1
FeS
FeS
Cyt bL
Cyt b560
FeS
2e–
FeS
H
Cyt a Cu
Q
2e–
NADH + H+
Cyt c
+
NAD+
Cyt bH
H
FADH2
+
Cyt a3
F0
Cu
2e–
1/2 O2 + 2H+
H+
H2O
FAD
F1
Matrice mitocondriale
ADP + Pi
H+
ATP
Figura 1.5 Catena di trasporto degli elettroni nei mitocondri. Sono visualizzati i quattro complessi enzimatici e l’ATP sintetasi. I
complessi I e II ricevono gli elettroni dal NADH e dal FADH2 e li inviano all’O2. I complessi I, III e IV pompano i protoni nello spazio
intermembrana. L’energia associata al riflusso dei protoni nella matrice, attraverso l’ATP sintetasi, è utilizzata per la sintesi dell’ATP.
di anidride carbonica, acqua e una considerevole quota
di ATP. L’equazione complessiva può essere schematizzata nel modo seguente:
C6H12O6 + 6O2
6H2O + 6 CO2 + energia
(686 kcal/mole = 2870,224 kJ/mole)
1 caloria = 4,184 joule
Il bilancio energetico complessivo tiene conto, per
ogni molecola di glucosio respirato:
r della produzione netta di 2 ATP nella glicolisi
r di 2 ATP prodotti nel ciclo di Krebs (da una molecola di glucosio se ne ottengono 2 di acido piruvico)
r della riossidazione dei coenzimi ridotti (NADH e
FADH2) nella catena respiratoria (3 ATP per ogni
NADH e 2 ATP per ogni FADH2).
Si ha quindi, a un guadagno netto di 38 ATP per mole di
glucosio. Nelle cellule eucariotiche la glicolisi ha luogo
nel citoplasma, le reazioni del ciclo di Krebs e della catena respiratoria nei mitocondri, mentre nei batteri queste reazioni si svolgono nel citoplasma e nei mesosomi,
particolari organuli o annessi della membrana cellulare
dove si trovano gli enzimi di catene respiratorie particolari.
La respirazione anaerobia non prevede l’ossigeno molecolare come accettore finale degli elettroni e
dell’idrogeno provenienti dall’ossidazione dei substrati nutritivi organici o inorganici. Il ruolo di accettore è
svolto in questo caso da composti inorganici quali, per
esempio, il nitrato, il solfato, lo zolfo elementare, la CO2.
C6H12O6 + 12NO3–
6H2O + 6CO2 + 12NO2–
+ energia (2058,528 kJ/mole)
La respirazione anaerobia viene effettuata da batteri sia
aerobi/anaerobi facoltativi che anaerobi. Nel caso dei
batteri anaerobi facoltativi (Campylobacter, Alcaligenes,
Thiobacillus ecc.) il metabolismo viene indirizzato verso
la respirazione anaerobia quando nel mezzo sia presente
un composto ossidante diverso dall’ossigeno che promuove la produzione di specifici enzimi o quando l’ossigeno sia stato consumato completamente da processi
aerobi.
Per i batteri anaerobi un esempio è rappresentato
dai batteri metanogeni (Methanosarcina, Methanococcus,
Methanobacterium); l’accettore di idrogeno ed elettroni è in questo caso la CO2 che viene ridotta a metano
dall’idrogeno molecolare:
4H2 + CO2
CH4 + 2H2O
5
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1
METABOLISMO ED ENERGIA
1.3 Le fermentazioni
Il significato del termine fermentazione, in relazione
all’ambito in cui è usato, può essere inteso con sfumature
diverse:
r in ambito tradizionale le fermentazioni comprendono processi chimici che avvengono naturalmente
e sono accompagnati da sviluppo di effervescenza
(l’etimologia del termine rimanda al latino fervere,
cioè bollire), come avviene, per esempio, nella fermentazione del mosto o in conserve alimentari avariate, in cui si nota sviluppo di gas
r in microbiologia industriale le fermentazioni indicano processi che utilizzano, in aerobiosi o in
anaerobiosi, ceppi selezionati di microrganismi e
che portano a ottenere prodotti utili in condizioni
controllate, dagli alimenti (prodotti da forno, yogurt
e latti fermentati, lievito alimentare) alle bevande
(vino, birra), a composti chimici particolari (etanolo, acido citrico), ai farmaci (antibiotici, ormoni).
È opportuno tenere presente che tutte le fermentazioni industriali (quindi anche quelle tipicamente
anaerobie) richiedono almeno in una prima fase la
presenza di ossigeno, indispensabile per l’aumento
della biomassa, cioè per consentire una veloce riproduzione dei microrganismi e quindi, in ultima analisi, aumentare la resa del processo
r dal punto di vista biochimico/metabolico le fermentazioni sono processi biotecnologici in cui
intervengono successioni ordinate di reazioni chimiche di degradazione operate da microrganismi,
che le utilizzano per la produzione dell’energia necessaria alla loro sopravvivenza, trasformando le
sostanze di cui si nutrono in prodotti più semplici.
Si tratta di processi anaerobi di demolizione parziale di carboidrati o altri composti organici (aminoacidi, basi azotate) senza intervento di catene di
trasporto di elettroni né di ossigeno, che utilizzano
sostanze organiche provenienti dalla demolizione
dei substrati nutritivi come accettori finali di elettroni.
Dal punto di vista microbico l’obiettivo fondamentale della fermentazione è la produzione di energia per la
formazione di ATP ancorché in quantità estremamente
ridotta rispetto alla resa energetica del metabolismo respiratorio.
Glucosio
Fruttosio-1,6-difosfato
2-Gliceraldeide-3-fosfato
2-Acido piruvico
Vie fermentative
Figura 1.6 Schema riassuntivo delle reazioni della glicolisi.
Il prodotto delle fermentazioni è un composto organico con un contenuto di energia non molto inferiore a
quello del composto che viene utilizzato come substrato da demolire: la resa energetica delle fermentazioni è
quindi molto più bassa rispetto a quella del metabolismo respiratorio aerobio.
C6H12O6
2C2H5OH + 2CO2 + energia
(225,936 kJ/mole)
Dalla fermentazione di una molecola di glucosio si ottengono infatti 2 ATP, contro i 38 ATP prodotti nella respirazione aerobia.
La via metabolica fermentativa più comune è la glicolisi o via EMP (Embden-Meyerhof-Parnas) che dal
glucosio (esoso, C6) porta alla formazione di due molecole di acido piruvico (trioso, C3) secondo lo schema
riassuntivo di figura 1.6.
Il composto iniziale viene progressivamente demolito attraverso reazioni di ossidazione in cui la rimozione
di elettroni e idrogeno dal substrato nutritivo si accompagna alla riduzione dei coenzimi trasportatori (NAD,
FAD). Su questi coenzimi si accumula quindi potere
riducente, che si annulla quando gli stessi vengono riossidati, cedendo idrogeno ed elettroni a un composto
accettore finale.
È proprio la natura di questo accettore finale a rappresentare la discriminante sostanziale fra fermentazione e respirazione:
r nel metabolismo respiratorio l’accettore finale di
idrogeno ed elettroni è una molecola inorganica:
6
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METABOLISMO ED ENERGIA
O
O–
O
O–
C
C
C O + NADH + H+
HO C H + NAD+
Lattato
deidrogenasi
CH3
Piruvato
CH3
Lattato
C6H12O6 + 2Pi + 2ADP
2CH3CHOHCOOH + 2ATP
Glucosio
Acido lattico
Figura 1.7 Fermentazione omolattica. In figura è
rappresentata la sequenza terminale delle reazioni della
fermentazione omolattica con la reazione generale.
l’ossigeno in quella aerobia; nitrato o solfato o zolfo
elementare o CO2 in quella anaerobia
r nelle fermentazioni l’accettore finale è un composto
organico derivato dalla demolizione del glucosio:
l’acido piruvico o un suo derivato. L’esempio tipico è offerto dalla fermentazione lattica, in cui l’acido
piruvico viene direttamente ridotto ad acido lattico
(figura 1.7).
L’acido piruvico rappresenta il substrato comune da
cui derivano i prodotti che danno il nome alle rispettive
fermentazioni (figura 1.8):
1
r alcolica, tipica di lieviti e alcuni batteri; produce alcol etilico e CO2
r omolattica, tipica dei batteri lattici; produce acido
lattico
r eterolattica, produce acido lattico insieme con altre sostanze (CO2, etanolo), tipica di alcuni batteri
lattici (Leuconostoc, alcune specie di Lactobacillus)
r propionica, tipica dei propionobatteri, con produzione di acido propionico, acido acetico e CO2
r acido-mista, tipica di enterobatteri e vibrioni; produce acido acetico, succinico, lattico, formico, etanolo, CO2, H2
r butandiolica, tipica di Enterobacter, Serratia, Erwinia e sviluppa, oltre ai prodotti tipici della fermentazione acido-mista, acetoina, acido 2,3-butandiolo
e CO2
r butirrica, tipica dei clostridi, sviluppa acido butirrico, alcol isopropilico, acido acetico, acetone, alcol
butilico, CO2, H2.
Il ruolo dell’acido piruvico come intermedio centrale
del metabolismo è importante non solo nelle fermentazioni: la glicolisi non è che la prima fase della degradazione aerobia del glucosio (che si completa con il ciclo
degli acidi tricarbossilici o di Krebs e con la catena respi-
Acido
lattico
Acido
acetico
Acido
piruvico
Alcol
etilico
Acetil
coezima A
Figura 1.8 L’acido piruvico è un substrato comune di una serie di fermentazioni.
7
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METABOLISMO ED ENERGIA
ratoria) in cui l’acido piruvico viene decarbossilato per
entrare nel ciclo di Krebs come acetil-CoA.
Glucosio
ATP
ADP
Glucosio-6-fosfato
Altre vie metaboliche fermentative sono:
r via dei pentoso-fosfati o shunt dell’esomonofosfato: costituisce per il glucosio-6P una via alternativa
a quella glicolitica. Viene utilizzata per la demolizione del glucosio in anaerobiosi da alcuni batteri
lattici (Leuconostoc, alcune specie di Lactobacillus)
e porta alla formazione di acido lattico, etanolo e
CO2 (fermentazione eterolattica). Si tratta di una via
costantemente operante nei batteri accanto a quella
glicolitica, in quanto è l’unica che porta a ribulosio5C e eritrosio-4C, importanti per la sintesi di acidi
nucleici e di aminoacidi
r via di Entner-Doudoroff: utilizzata da batteri privi
dell’enzima fosfofruttochinasi per la sintesi di fruttosio 1,6-difosfato. Porta allo sviluppo di acido piruvico e CO2 (Pseudomonas, Rhizobium) attraverso
intermedi come il chetodeossifosfogluconato. Zymomonas utilizza questa via fermentativa per la produzione di etanolo (figura 1.9)
r via dell’esosofosfato: produce acido acetico e acido
lattico (bifidobatteri intestinali).
+
NADP
Comune al ciclo
dei pentafosfati
NADPH
6-Fosfogluconato
Enolasi
H 2O
2-Cheto-3-deossi-6-fosfogluconato (KDPG)
Aldolasi
Piruvato
Gliceraldeide-3-fosfato (3PGA)
NAD
+
NADH
Pi
1,3-Difosfoglicerato
ADP
ATP
3-Fosfoglicerato
2-Fosfoglicerato
H 2O
Fosfoenolpiruvato
ADP
ATP
Piruvato
Figura 1.9 Via di Entner-Doudoroff.
8
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Comune
alla glicolisi
ESERCIZI DI VERIFICA
1. Rispondi alle seguenti domande:
Che cosa si intende per metabolismo?
Quali sono le reazioni metaboliche che consumano energia?
Quali sono le strategie adottate dagli esseri viventi per ottenere energia?
Quali sono le differenze sostanziali fra respirazione e fermentazione?
In che cosa consiste la glicolisi?
2. Le reazioni di sintesi consistono nella trasformazione di:
A composti semplici in altri a struttura più
complessa
B sostanze complesse in altre più semplici
C sostanze inorganiche al fine di ottenere
energia
3. La resa energetica delle fermentazioni risulta:
A paragonabile a quella dei processi respiratori
B molto inferiore a quella dei processi respiratori
C superiore a quella dei processi respiratori
4. Con il termine di fosforilazione si intende:
A il trasferimento di un gruppo fosforico sull’ATP
B l’allontanamento di un gruppo fosforico dall’ATP
C il trasferimento di un gruppo fosforico sull’AMP o sull’ADP
5. La fosforilazione è un processo:
A endoergonico
B esoergonico
C che avviene spontaneamente nella respirazione ma non nei processi fermentativi
6. La glicolisi è un processo:
A caratteristico della fermentazione
B comune a fermentazione e respirazione
C che avviene solo nella respirazione del glucosio
7. La resa energetica della glicolisi risulta di:
A 36 molecole di ATP
B 2 molecole di ATP
C 4 molecole di ATP
8. Nella fermentazione, la produzione di ATP si
ha:
A nella glicolisi
B nel ciclo di Krebs
C nella fosforilazione ossidativa
9. Negli aerobi la massima parte dell’ATP si
produce:
A nella glicolisi
B nella catena di trasporto degli elettroni (catena respiratoria)
C nel ciclo di Krebs
10. Un substrato può essere definito come:
A il prodotto finale di una reazione metabolica
B una sostanza organica che i microrganismi
trasformano
C il prodotto che si vuole ottenere dalle attività
metaboliche dei batteri modificati geneticamente
11. La catena respiratoria è:
A una sequenza di reazioni di ossidoriduzione
B l’insieme dei processi di ossidazione del
glucosio
C un sistema di ancoraggio dei batteri al substrato
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BIOTECNOLOGIE
MICROBICHE
2.1 Biotecnologie tradizionali e innovative
2.2 Le biotecnologie microbiche
2.3 Biocatalizzatori molecolari: gli enzimi
2.4 Cinetica e attività enzimatica
2.5 Fattori che influenzano la velocità
di reazione
L’attività fermentativa dei microrganismi è stata inconsapevolmente sfruttata dall’uomo fin dalle epoche più antiche per ottenere prodotti utili (alimenti), gratificanti (bevande alcoliche) o per curare malattie e infezioni (muffe
o estratti di muffe). La fermentazione del succo d’uva, la
preparazione di bevande molto simili alla birra, i formaggi,
i tanti tipi di yogurt ottenuti dal latte fermentato, il pane
prodotto dalla lievitazione di impasti di acqua e farina
sono altrettanti esempi di processi tramandati empiricamente di generazione in generazione per migliaia di anni.
2.6 Inibizione enzimatica
2.7 Regolazione della sintesi degli enzimi
2.8 Biocatalizzatori cellulari: i microrganismi
2.9 Le tecniche di selezione dei ceppi
microbici
2.10 Strategie di screening
2.11 Selezione dei ceppi alto-produttori
2.1 Biotecnologie tradizionali
e innovative
Il termine biotecnologie microbiche si riferisce ai processi in cui le materie prime vengono trasformate in prodotti utili a opera di microrganismi o enzimi.
Nel XIX secolo gli studi compiuti da L. Pasteur sulla
fermentazione alcolica e lattica e la scoperta del ruolo dei
microrganismi in questi processi hanno segnato il passaggio da un ambito esclusivamente empirico a tecniche basate su presupposti scientifici, dando inizio alla microbiologia industriale. Da allora la microbiologia applicata ha
avuto sviluppi straordinari, dalla scoperta degli antibiotici
(A. Fleming, 1929) alla produzione di metaboliti microbici come vitamine, aminoacidi, enzimi, ormoni steroidi.
In anni più recenti, a partire dagli ultimi decenni del
1900, le tecniche del DNA ricombinante e dell’ingegneria genetica hanno dato ai ricercatori la possibilità di inserire geni estranei nei microrganismi, trasformandoli in
produttori specializzati di molecole di importanza spes-
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Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
BIOTECNOLOGIE MICROBICHE
so strategica. Le applicazioni delle biotecnologie microbiche offrono oggi un ampio ventaglio di possibilità. In
campo alimentare vengono impiegate per ottenere prodotti di qualità costante controllando o modificando le
trasformazioni degli alimenti; in ambito ecologico intervengono nella depurazione delle acque reflue, nel compostaggio dei rifiuti, nei processi di disinquinamento e
biorisanamento; in campo medico la produzione di antibiotici, ormoni (insulina, eritropoietina, HGH), vitamine, anticorpi monoclonali, vaccini, interferone sono solo
alcuni esempi dei loro possibili impieghi; nel settore della
chimica si utilizzano per la produzione mirata di nuove
molecole non inquinanti come i biopolimeri o per nuove
forme di energia quali il bietanolo e il biodiesel.
Anche se ogni distinzione pone limiti e confini che
spesso non trovano giustificazione, sembra opportuno
indicare come biotecnologie innovative quelle basate
sulle tecniche del DNA ricombinante e dell’ingegneria
genetica, per distinguerle dalle biotecnologie tradizionali di più antica origine.
2.2 Biotecnologie microbiche
A prescindere dalle diverse vie metaboliche e dalla varietà
dei microrganismi interessati, le biotecnologie microbiche hanno come protagonisti fondamentali:
r gli enzimi, molecole ad attività catalitica prodotte
dalle cellule, che permettono lo svolgersi ordinato
delle reazioni metaboliche rendendole energeticamente possibili
r le cellule microbiche, al cui interno gli enzimi operano, che possiedono le informazioni genetiche per
la loro sintesi e ne regolano l’attività. I microrganismi possono quindi essere considerati veri e propri
“laboratori” in cui vengono prodotte o trasformate
molecole di elevato interesse in campo biomedico,
alimentare, industriale, agrario, zootecnico, ecologico-ambientale. In molti casi gli enzimi possono essere
estratti dalle cellule che li producono e utilizzati come
tali in diversi processi produttivi, il più delle volte
dopo averli “immobilizzati” su supporti artificiali per
migliorarne efficienza catalitica e produttività
r i prodotti metabolici cellulari (metaboliti). Dal punto di vista biochimico è possibile distinguere reazioni omofermentative, che danno origine a un unico
prodotto finale, ed eterofermentative, che danno
2
origine a più prodotti. Le tecnologie disponibili per
l’utilizzo industriale di microrganismi consentono di
ottenere un’ampia gamma di prodotti: accanto ai prodotti delle fermentazioni tradizionali ottenuti dall’attività microbica degradativa dei substrati nutritivi si
sono sviluppate in tempi molto più recenti tecnologie
che sfruttano non le vie cataboliche dei microrganismi, ma piuttosto alcune loro vie anaboliche per la
sintesi di acidi organici, antibiotici, ormoni, anticorpi.
2.3 Biocatalizzatori molecolari:
gli enzimi
In microbiologia industriale vengono spesso indicati con
il termine unico di biocatalizzatori sia i microrganismi
(biocatalizzatori cellulari) che gli enzimi (biocatalizzatori
molecolari) (figura 2.1).
Gli enzimi costituiscono un esempio fra i più importanti della versatilità funzionale delle proteine. Prodotti
dalla cellula come una delle espressioni dell’informazione
genetica (biosintesi proteica), gli enzimi regolano praticamente ogni passaggio delle molteplici sequenze ordinate
di reazioni che costituiscono il metabolismo cellulare.
Composizione
Gli enzimi sono proteine ad attività catalitica, grazie
alle quali le reazioni biochimiche avvengono in tempi
Figura 2.1 Struttura tridimensionale di un enzima di E. coli.
L’enzima glutammato-cisteina ligasi di E. coli è costituito da un
tetramero.
11
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BIOTECNOLOGIE MICROBICHE
Enzima
Enzima
Catalisi
Molecola A
(substrato)
Complesso
enzima-substrato
Complesso
enzima-substrato
Molecola B
(prodotto)
Figura 2.3 Rappresentazione modello dell’attività
enzimatica.
Meccanismo d’azione degli enzimi
L’attività catalitica degli enzimi è basata sulla creazione
di un complesso intermedio enzima-substrato (ES). Gli
schemi assai semplificati che mettono in confronto due
reazioni, una non catalizzata (a) e un’altra catalizzata
dall’intervento di un enzima (b), possono essere indicati come segue:
S (Substrato)
P (Prodotto)
a) reazione non catalizzata
S+E
ES
P+E
b) reazione catalizzata da enzima, dove S è il substrato da
trasformare, E è l’enzima, P il prodotto di reazione ed ES
il complesso intermedio (figura 2.3).
Gli enzimi abbassano l’energia di attivazione giungendo allo stesso risultato della reazione non catalizzata ma
percorrendo una via diversa, costituita da una serie di intermedi e più facile sotto il profilo energetico (figura 2.4).
Specificità degli enzimi
La caratteristica fondamentale degli enzimi è la loro elevata specificità, cioè la capacità di reagire solo su di un
substrato o su un ristretto numero di substrati assai simili
tra di loro. Essi risultano inoltre altamente specifici per un
solo tipo di reazione e sono inattivi su altre reazioni che
coinvolgono gli stessi substrati.
La specificità è da attribuire anche al sito attivo, cioè
quella parte della molecola enzimatica con cui interagisce il substrato. Il sito attivo ha una conformazione tridimensionale specifica tale che il substrato vi si può inserire con un meccanismo di chiave-serratura: in questo
modo, per esempio, un enzima agisce solo sull’isomero
d di un composto, ma non su quello l.
Energia potenziale
Sito attivo
Energia di
attivazione
senza
catalizzatore
Energia di
attivazione con
catalizzatore
Reagenti
Prodotti
Coordinata di reazione
Figura 2.4 Enzimi e reazioni. Gli enzimi agiscono abbassando
l’energia richiesta perché una reazione avvenga.
Teorie diverse spiegano il meccanismo dell’attività
enzimatica ipotizzando una sorta di adattamento indotto, in cui il sito attivo subisce una parziale modificazione assumendo una forma complementare a quella
del substrato (figura 2.5).
Coenzimi e cofattori
Molti enzimi richiedono per la loro attività catalitica
l’intervento di frazioni non proteiche, indicate come
coenzimi oppure (se si tratta di ioni metallici) come
cofattori o attivatori. I coenzimi funzionano come trasportatori di particolari gruppi chimici funzionali che
l’enzima vero e proprio rimuove da uno specifico substrato. Molti coenzimi rappresentano la forma attiva di
altrettante vitamine. Per esempio, il coenzima NAD+
Substrato
a
+
a
c
b
c
b
Complesso ES
Enzima
Figura 2.5 Adattamento indotto. Il sito attivo dell’enzima
assume una forma complementare a quella del substrato con
cui viene a contatto.
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BIOTECNOLOGIE MICROBICHE
NADH + H+
O
HH
ziano per:
r diversa distribuzione nei tessuti
r diversa mobilità elettroforetica
r differente affinità nei confronti del substrato.
C
H
NH2 + H+
H
H
N
Un esempio è fornito dai 5 isoenzimi della lattico deidrogenasi (LDH) caratterizzati dalla diversa combinazione
di 4 subunità di due tipi diversi (M e H). L’aumento della concentrazione ematica di uno di questi isoenzimi è
di altissimo valore diagnostico in relazione alle patologie
dell’organo di provenienza (vedi scheda).
R
2 H (2 H+ + 2 e–)
Ossidato
Ridotto
NAD+
H
C
Nicotinamide H
NH2
+
N
H
O
O
H
L’attività di un enzima è in funzione della sua velocità di
reazione, intesa come la quantità di substrato trasformato nell’unità di tempo, in altre parole è la velocità con cui
il substrato viene trasformato in prodotto
O
HO P O CH2
Ribosio
OH
O
N
HO P O
O
NH2
OH
O
CH2
Ribosio
OH
N
H
N
2.4 Cinetica e attività enzimatica
N
E
S
H
Adenina
OH
Figura 2.6 NADH e NAD+.
(nicotinamide adenindinucleotide, forma attiva della
vitamina PP) è un coenzima trasportatore di idrogeno
associato a molte deidrogenasi: il coenzima accetta idrogeno per poi cederlo a un accettore, passando alternativamente dalla forma ossidata a quella ridotta e viceversa
(figura 2.6).
Il piridossalfosfato (forma attiva della vitamina B6)
partecipa a importantissime reazioni di trasferimento
di gruppi amminici nel metabolismo degli aminoacidi,
in associazione con gli enzimi transaminasi glutammico ossalacetica (GOT o AST) e glutammico piruvica
(GPT o ALT) che agiscono soprattutto a livello epatico.
Fra i cofattori, gli ioni calcio, magnesio, zinco, rame risultano indispensabili in numerose reazioni enzimatiche.
a)
b)
[S]
[S]
[S]
2
[S]
2
t1/2
Isoenzimi
Gli isoenzimi sono forme molecolari diverse di uno stesso
enzima, che catalizzano la stessa reazione ma si differen-
P
La velocità di reazione viene misurata valutando la diminuzione della concentrazione del substrato in un tempo
prestabilito, ma può essere ovviamente dedotta anche
in base alla quantità di prodotto ottenuto nell’unità di
tempo.
L’andamento della reazione si può rappresentare ponendo in un sistema di assi cartesiani in ascissa il tempo
e in ordinata la concentrazione del substrato, osservando cioè come varia la concentrazione del substrato [S]
in funzione del tempo t (figura 2.7).
In questa funzione (di tipo esponenziale decrescente) assume particolare rilievo il punto di dimezzamento (t1/2) corrispondente al tempo necessario al dimezzamento della concentrazione del substrato. Da dati
t
t1/2
7t1/2
t
Figura 2.7 a) Variazione della concentrazione di substrato
[S] in funzione del tempo t. b) Il valore 7t1/2 corrisponde
praticamente al tempo totale di reazione; le tangenti sulla curva
indicano le variazioni della velocità in funzione del tempo.
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ENZIMI E DIAGNOSTICA CLINICA
Gli enzimi metabolici agiscono nell’ambiente endocellulare. La loro presenza nel sangue in condizioni fisiologiche è dovuta al normale turnover cellulare per cui la
concentrazione ematica degli enzimi si mantiene in un
range di “valori normali”. Processi infiammatori o patologici portano all’aumento del tasso di mortalità cellulare, per cui dalle cellule in necrosi gli enzimi si riversano nel plasma in quantità superiore alla norma. Poiché
ogni tessuto possiede un proprio “corredo enzimatico”
caratteristico, è piuttosto semplice risalire dall’aumento
della concentrazione plasmatica di uno o più enzimi
all’organo danneggiato. Per esempio, l’aumento delle
transaminasi GOT (AST) e GPT (ALT) è conseguenza di un danno a livello epatico; l’aumento della
GOT si ha anche nel caso di infarto del miocardio. La
creatina fosfochinasi (CPK) è un altro enzima che aumenta nel siero nelle prime ore successive all’infarto per
tornare piuttosto rapidamente a valori normali (figura
2.8); l’aumento della fosfatasi alcalina è legato a lesioni
del sistema scheletrico o all’ostruzione delle vie biliari;
un aumento dell’α-amilasi a una probabile pancreatite. Quando un enzima esiste in più forme molecolari
(isoenzimi), generalmente ognuna di queste, pur catalizzando la medesima reazione, presenta una concentrazione maggiore in un certo tessuto, espressione della più
o meno spiccata attività e dell’affinità per determinati
substrati. La determinazione della concentrazione plasmatica di uno specifico isoenzima consente di risalire
all’organo da cui l’isoenzima proviene, permettendo una
diagnosi clinica specifica, altrimenti problematica con il
solo dosaggio dell’enzima in toto, espressione di una necrosi cellulare generica. Nel caso dell’LDH è possibile
discriminare fra patologie di origine epatica e cardiaca:
l’aumento degli isoenzimi LDH-1 e LDH-2 dipende
da un danno specifico al tessuto cardiaco dove queste
forme molecolari sono più abbondanti; si registra un
aumento marcato dell’isoenzima 1, con rapporto LDH1/LDH-2 maggiore di 1. Questi isoenzimi aumentano
entro 24 h dall’episodio infartuale tornando a valori
normali in 5-6 giorni. L’aumento plasmatico dell’isoenzima LDH-5 è conseguente piuttosto a danno epatico
o della muscolatura scheletrica. Il mezzo migliore per
determinarne la concentrazione degli enzimi consiste
nel misurare l’intensità della reazione da essi catalizzata. Viene quindi determinata la velocità di reazione, in
Aumento dell’attività enzimatica
BIOTECNOLOGIE MICROBICHE
2
CPK
HBDH
LDH
1
2
Dolore
toracico
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16
Giorni dopo l’episodio
Figura 2.8 Quadro enzimatico in caso di infarto del
miocardio. Il grafico mostra i tempi di comparsa nel siero dei
diversi enzimi liberati da cellule miocardiche infartuate.
CPK = creatina fosfochinasi; LDH = lattico deidrogenasi;
HBDH = isoenzima della lattico deidrogenasi.
pratica la quantità di substrato consumata nell’unità di
tempo. Quando infatti i parametri fondamentali di reazione (pH, temperatura, concentrazione del substrato)
risultano ottimali, la velocità di reazione dipende dalla
concentrazione dell’enzima. Diversamente dalle determinazioni colorimetriche “a termine”, in cui la concentrazione di una sostanza viene dedotta dall’intensità
di sviluppo di un cromogeno come prodotto finale di
reazione, la misura della concentrazione di un enzima
viene effettuata in cinetica, valutando nel tempo l’azione dell’enzima su di uno specifico substrato. Quando
uno dei reagenti presenta una specifica banda di assorbimento, se ne può valutare la variazione di estinzione
per minuto (ΔE/min). È il caso dei coenzimi NAD+
e NADP+, che nella forma ridotta (NADH, NADPH)
hanno un massimo di assorbimento a 340 nm, mentre
nella forma ossidata alla medesima lunghezza d’onda
non mostrano alcun assorbimento. L’attività delle deidrogenasi NAD-dipendenti può quindi essere determinata dal decremento di estinzione del NADH a 340 nm.
Le stesse reazioni possono essere accoppiate in qualità
di “sistemi indicatori” ad altre reazioni, che non hanno il
NAD come coenzima, per valutare la concentrazione di
prodotto della prima reazione (test ottico accoppiato).
L’attività enzimatica viene determinata nei primi
momenti di reazione: la velocità iniziale è infatti l’unica
che mostra proporzionalità fra concentrazione di enzima e di substrato consumato. L’unità di attività enzimatica è la quantità di enzima in grado di trasformare in 1
minuto, in condizioni ottimali, una μmole di substrato a
25 o 30 °C.
15
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BIOTECNOLOGIE MICROBICHE
sperimentali risulta che moltiplicando per 7 tale valore
si ottiene con buona approssimazione il tempo totale
di reazione, che è in sostanza quello necessario a ridurre la concentrazione di substrato a livelli trascurabili
(consumo completo di S).
La velocità di una reazione enzimatica diminuisce
con il procedere della reazione in quanto diminuisce la
concentrazione del substrato; possono inoltre verificarsi
fenomeni di inibizione enzimatica da parte dei prodotti di reazione o per azione di fattori ambientali diversi,
quali il pH e la temperatura.
Per questi motivi gli studi di cinetica enzimatica
prendono solitamente in esame la velocità iniziale della reazione, in quanto è l’unica fase in cui i parametri
fondamentali sono esattamente noti (concentrazione
dell’enzima e del substrato, pH del mezzo ecc.).
L’attività degli enzimi viene espressa in Unità Internazionali (UI): quantità di enzima in grado di idrolizzare 1 μmole di substrato in 1 minuto in condizioni
standard.
2.5 Fattori che influenzano
la velocità di reazione
I fattori che influenzano la velocità di reazione sono soprattutto:
r concentrazione dell’enzima
r concentrazione del substrato
r pH
r temperatura
r presenza di inibitori.
Per poter avere dati attendibili gli studi di cinetica vengono eseguiti variando di volta in volta un singolo parametro e mantenendo costanti tutti gli altri.
Concentrazione dell’enzima
La velocità di una reazione enzimatica è direttamente proporzionale alla concentrazione dell’enzima (figura 2.9), in
relazione alla quantità di siti attivi disponibili:
V = K [E]
dove K è la costante di proporzionalità.
V
[E]
Figura 2.9 Grafico velocità-concentrazione. Il grafico mostra
la variazione della velocità di reazione V in funzione della
concentrazione di enzima [E].
Concentrazione del substrato
Mantenendo costante la concentrazione dell’enzima e
quella degli altri parametri, la velocità di reazione aumenta in modo direttamente proporzionale a quella
del substrato, dapprima in modo rapido, poi sempre più
lentamente fino a raggiungere una velocità massima indicata con Vmax, al di là della quale essa rimane costante
e dipendente non più dalla concentrazione del substrato, ma esclusivamente da quella dell’enzima. La spiegazione di tale comportamento si basa sulla formazione
del complesso intermedio Enzima-Substrato (ES)
che si forma quando il substrato aderisce al sito attivo
dell’enzima per essere degradato. Se la concentrazione
del substrato è bassa, i siti attivi degli enzimi non sono
tutti saturati, l’enzima non è in grado di esprimere per
intero la propria potenzialità e la velocità di reazione
risulta proporzionale alla concentrazione del substrato. Se la concentrazione del substrato continua ad aumentare, i siti attivi vengono progressivamente saturati
fino a raggiungere il massimo dell’attività catalitica per
quella data concentrazione di enzima. Un ulteriore aumento della quantità di substrato non ha alcun effetto:
Vmax indica quindi la velocità massima di reazione per
una certa concentrazione di enzima (figura 2.11a). In
realtà si fa riferimento alla metà di questo valore, indicato come 1/2 Vmax: per ogni enzima esiste una particolare concentrazione di substrato a cui la velocità di
reazione è pari alla metà di quella massima. Tale concentrazione di substrato viene definita costante di Michaelis-Menten indicata con Km ed esprime in pratica
l’affinità di un enzima per uno specifico substrato:
16
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BIOTECNOLOGIE MICROBICHE
se 1/2 Vmax si raggiunge con basse concentrazioni del
substrato, ciò significa che l’enzima possiede un’alta
affinità per il substrato, cioè esprime in modo ottimale la propria potenzialità anche in presenza di modeste
quantità di substrato; una Km elevata depone invece per
un enzima che ha bisogno di un’alta concentrazione di
substrato per svolgere l’azione catalitica ad alte velocità.
Questa caratteristica diventa strategicamente importante in molte situazioni.
Un esempio è offerto da due enzimi che catalizzano
la stessa reazione di fosforilazione del glucosio a glucosio-6P (indispensabile per l’utilizzo cellulare del carboidrato) in tessuti diversi e con differenti Km:
r esochinasi, presente nel cervello e nel muscolo
r glucochinasi che catalizza la stessa reazione e si trova nel fegato.
L’esochinasi presenta una Km molto più bassa, cioè
un’affinità molto alta per il glucosio: cento volte maggiore rispetto alla glucochinasi epatica. La concentrazione normale di glucosio nel sangue è circa 45 volte
più grande dell’affinità dell’esochinasi per il glucosio nel
tessuto cerebrale. In pratica, questa maggiore affinità si
traduce nella possibilità di utilizzare il glucosio (quindi
di ricavare energia) anche se la concentrazione del carboidrato nell’organismo è relativamente bassa. In queste
condizioni nelle cellule muscolari e nervose l’esochinasi
è ancora saturata e lavora sempre alla velocità massima,
riuscendo a sfruttare per intero le risorse energetiche
disponibili e destinandole alle cellule più importanti.
La glucochinasi epatica entra invece in funzione solo
quando il glucosio in questa sede raggiunge livelli alti,
per esempio dopo i pasti, e indirizza l’eccesso di glucosio verso la sintesi di glicogeno. In altre parole l’alta Km
della glucochinasi permette a muscoli e cervello (dove
agisce l’esochinasi) di utilizzare il poco glucosio disponibile (per es. nel digiuno) con un criterio di assoluta
priorità (figura 2.10).
Temperatura
Ogni enzima presenta un proprio optimum di temperatura in corrispondenza del quale la velocità di reazione
è massima. A questo valore lo stato di agitazione termica dei componenti la reazione è massima, rendendo
più frequenti e probabili le interazioni molecolari e fa-
Concentrazione normale
di glucosio nel sangue
100
Esochinasi
Km = 100 μM
Glucochinasi
Km = 10 mM
50
5
10
Concentrazione di glucosio, mM
Figura 2.10 L’esochinasi catalizza la fosforilazione
del glucosio a glucosio-6-fosfato. Il confronto fra la Km
dell’esochinasi (0,1 mM) e della glucochinasi o esochinasi
epatica (10 mM) mette in evidenza che l’esochinasi ha
un’affinità per il glucosio 100 volte maggiore rispetto alla
glucochinasi, che catalizza la stessa reazione nel fegato.
A valori normali di glicemia (80-100 mg/dL) l’esochinasi è
saturata e lavora costantemente alla massima velocità.
vorendo la formazione del complesso enzima-substrato
con l’abbassamento dell’energia di attivazione. D’altra
parte gli enzimi sono proteine e in quanto tali subiscono alterazioni consistenti, fino alla loro denaturazione,
se esposti a temperature troppo elevate. Temperature
inferiori a quelle ottimali rallentano l’azione catalitica
anche se l’enzima mantiene più a lungo la propria attività. Nella figura 2.11b si può notare come in un primo
tratto della curva l’attività enzimatica aumenti progressivamente con l’aumentare della temperatura fino a un
valore massimo, dopodiché l’attività decresce rapidamente per progressiva denaturazione dell’enzima fino
a un valore in cui l’attività enzimatica cessa completamente in seguito a denaturazione irreversibile dell’enzima.
pH
Analogamente a quanto visto per la temperatura, anche
per il pH del mezzo esiste un valore ottimale, sopra e
sotto al quale la velocità di reazione decresce rapidamente (figura 2.11c). Ciò è attribuibile al fatto che enzima e substrato sono composti ionizzabili caratterizzati
da gruppi acidi e basici, per cui esiste un preciso valore
di pH in corrispondenza del quale si ha l’interazione
massima possibile (la maggiore affinità) fra enzima e
substrato in relazione a un particolare grado di dissociazione dei rispettivi diversi gruppi funzionali. È mol17
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2
Velocità di reazione
V
Vmax
Vmax
2
a)
Km
Concentrazione
del substrato [S]
Denaturazione
Velocità di reazione
BIOTECNOLOGIE MICROBICHE
pH
Temperatura
b)
pH ottimale
c)
Figura 2.11 Fattori che agiscono sull’attività degli enzimi.
to interessante notare, a conferma di quanto detto sopra, che generalmente il pH ottimale non coincide con
il punto isoelettrico (che corrisponde al valore di pH al
quale la molecola ha un’eguale distribuzione di cariche
negative e positive, quindi con carica netta pari a zero
e un minimo grado di dissociazione). Se il pH ottimale si trova sopra o sotto al punto isoelettrico significa
evidentemente che un enzima ha bisogno di avere un
certo numero di gruppi funzionali ionizzati per esplicare al massimo la propria attività. Il pH assume dunque
un ruolo decisivo nella regolazione dell’attività enzimatica.
a)
b)
Enzima
Inibitore
non competitivo
Enzima
Substrato
Substrato
Enzima
con inibitore
competitivo
Substrato
Enzima con
inibitore non
competitivo
Substrato
Figura 2.12 Reazioni enzimatiche in presenza di un inibitore
competitivo (a) e non competitivo (b).
2.6 Inibizione enzimatica
Sono definiti inibitori enzimatici quelle sostanze che
provocano un blocco reversibile dell’attività enzimatica e vengono distinti in competitivi e non competitivi.
Sono invece definite inattivattori le sostanze che determinano un blocco irreversibile dell’attività.
Nell’inibizione competitiva si registra una competizione fra substrato e inibitore, e il grado di inibizione
dipende dalle concentrazioni relative dei due competitori. Se si aumenta la concentrazione del substrato si
può arrivare ad annullare l’effetto dell’inibitore. Generalmente la competizione si verifica quando l’inibitore e
il substrato sono strutturalmente simili (inibizione per
analogia di struttura) ed entrambi competono per occupare il sito attivo dell’enzima.
L’inibizione si definisce non competitiva quando
l’inibitore si unisce all’enzima non nel sito attivo ma in
una posizione diversa (sito allosterico). In realtà il sito
allosterico può ospitare anche molecole effettrici, per cui
in questi enzimi (enzimi allosterici) la modificazione del
sito attivo da parte di quello allosterico può avere effetti
modulatori di inibizione o di attivazione (figura 2.12).
L’inibizione enzimatica si può realizzare anche con
un meccanismo a retroazione (feedback). Ciò si verifica per esempio nel caso di una reazione biochimica a
più stadi, mediati ciascuno da enzimi specifici, che porti
alla sintesi di un metabolita terminale (prodotto finale).
Quando la concentrazione del prodotto finale raggiunge una concentrazione critica, tale da causare a livello
cellulare l’attivazione di un meccanismo di regolazione,
questo si realizza con l’intervento dello stesso prodotto
finale che funziona come inibitore allosterico “a retroazione” sul primo degli enzimi coinvolti. La produzione
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BIOTECNOLOGIE MICROBICHE
Enzima E1
(allosterico)
Enzima E2
2
Enzima E3
Prodotto finale
Substrato
Blocco
della via
Intermedio
2
Intermedio
1
Inibizione
di E1
Figura 2.13 Modello di inibizione a feedback.
riprende se il metabolita terminale viene consumato e la
sua concentrazione decresce (figura 2.13).
Operone
DNA
Promotore Operatore
Gene strutturale
Figura 2.14 Struttura di un operone.
2.7 Regolazione della sintesi
degli enzimi
Poiché gli enzimi sono proteine, i meccanismi di regolazione della loro produzione sono in pratica quelli della
sintesi proteica. È necessario ricordare che esistono enzimi inducibili, destinati alla degradazione di substrati
nutritivi diversi (amilasi, proteasi ecc.) e la cui sintesi
viene attivata dalla presenza del substrato che funziona
come induttore, mentre altri enzimi (costitutivi, come
quelli della glicolisi) sono prodotti da geni continuamente attivi.
Nei procarioti i sistemi di regolazione si realizzano attraverso i meccanismi di induzione e repressione,
controllati a livello genetico da vari segmenti di DNA
che nel loro insieme formano un operone. Un operone
è costituito da geni strutturali (che codificano per le
proteine) e da geni adiacenti, denominati gene operatore e gene promotore (figura 2.14). Non direttamente
a contatto con i precedenti esiste un altro gene chiamato
regolatore. Regolatore, promotore e operatore hanno
funzioni di regolazione del processo di sintesi, mentre
i geni strutturali trascrivono sull’RNA messaggero l’informazione per la sintesi delle rispettive proteine:
r il gene regolatore produce un repressore, che può
essere attivo o inattivo
r per questo repressore il gene operatore presenta un
sito di legame specifico
r il gene promotore “promuove” la sintesi di RNA
messaggero: per svolgere questo compito deve combinarsi con la RNA polimerasi, per la quale possiede uno specifico sito di legame.
Induzione
In assenza del substrato (induttore) da degradare, il repressore prodotto dal gene regolatore si associa all’operatore: in tal caso viene contemporaneamente impedito
all’RNA polimerasi di legarsi al gene promotore. Non è
quindi possibile avviare la trascrizione dell’mRNA e la
sintesi proteica.
La presenza di substrato dà luogo al complesso induttore-repressore, che non può più legarsi al sito specifico sul gene operatore, lasciando contemporaneamente
libero anche il sito per l’RNA polimerasi sul gene promotore: in tal caso la sintesi proteica può procedere.
Nell’operone-lac di E. coli in assenza del lattosio
(substrato induttore) la produzione in sequenza degli
enzimi β-galattosidasi, permeasi e transacetilasi (necessari per la degradazione del lattosio) viene inibita dal repressore che può legarsi all’operatore e bloccare la RNA
polimerasi. Introducendo nel terreno di coltura solo il
lattosio come unica fonte di carbonio, questo si lega al
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2
BIOTECNOLOGIE MICROBICHE
Figura 2.15 L’operone lattosio. L’operone lattosio è un
esempio di sistema inducibile: il lattosio funge, infatti, da
induttore permettendo la sintesi degli enzimi coinvolti nella sua
stessa via metabolica attraverso l’inibizione del legame della
proteina repressore con l’operatore.
repressore bloccandone l’azione. L’RNA polimerasi può
occupare il proprio sito specifico sul gene promotore e
indurre la sintesi degli enzimi per la degradazione del
substrato (figura 2.15).
Repressione
Un esempio che può illustrare il fenomeno della repressione (co-repressione) si verifica nell’inibizione
a feedback (repressione da prodotto finale) in cui un
metabolita terminale, che viene normalmente prodotto perché il repressore è originariamente inattivo, una
volta raggiunta una concentrazione critica si lega come
Figura 2.16 L’operone triptofano. L’operone triptofano è un
esempio di sistema reprimibile: se il triptofano è assente, il
repressore è inattivo e non può legarsi all’operatore. Quando
il triptofano è presente, funge da corepressore, attivando il
repressore; quest’ultimo si lega all’operatore e blocca la sintesi
dell’operone.
co-repressore al repressore inattivo trasformandolo in
attivo, ponendo di conseguenza termine alla produzione del metabolita. Tale sistema si registra nell’operone
triptofano (figura 2.16).
20
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BIOTECNOLOGIE MICROBICHE
2.8 Biocatalizzatori cellulari:
i microrganismi
I processi biotecnologici industriali impiegano microrganismi selezionati in funzione del prodotto che si vuole ottenere. In questo senso le moderne tecnologie si
differenziano da quelle tradizionali: per ottimizzare un
processo e migliorare le rese produttive è indispensabile
una conoscenza approfondita della fisiologia, delle reazioni biochimiche cellulari e delle caratteristiche genetiche dei microrganismi. Occorre quindi fare affidamento
su colture microbiche pure e attentamente selezionate,
frutto di un lungo e paziente lavoro di screening.
I microrganismi che interessano le produzioni biotecnologiche (o fermentazioni industriali tradizionalmente intese) sono:
r batteri: procarioti
r lieviti e funghi filamentosi (muffe): eucarioti.
L’elenco che segue, lungi dall’essere esaustivo, ha esclusivamente valore di rassegna sintetica di alcuni dei microrganismi impiegati nelle più note fermentazioni industriali.
Fra i batteri, Escherichia coli è indubbiamente la specie meglio conosciuta. Il suo utilizzo nella microbiologia
industriale tradizionalmente intesa è indubbiamente secondario rispetto ad altri microrganismi, ma è innegabile
che le nuove frontiere della tecnologia del DNA ricombinante e dell’ingegneria genetica lo vedono assoluto protagonista. Praticamente tutte le manipolazioni genetiche
su altri procarioti lo utilizzano come ospite intermedio e
ne fanno il batterio più adatto e gestibile nelle tecniche di
biologia molecolare per la produzione di enzimi.
Altro genere rilevante è Bacillus, ad ampia diffusione ambientale e impiegato nella produzione di antibiotici, enzimi e bioinsetticidi (B. thuringiensis).
Da batteri del genere Zymomonas si ottengono
acetone e alcol etilico, prodotto anche da Clostridium,
mentre Corynebacterium glutamicum è in grado di produrre acido glutammico.
Lactobacillus e Streptococcus sono i generi più
rappresentativi fra i batteri lattici, agenti della fermentazione lattica (produzione di acido lattico e industria
lattiero-casearia).
Molti antibiotici sono prodotti da batteri appartenenti al genere Streptomyces.
Batteri appartenenti ai generi Arthrobacter, Ace-
2
tobacter, Mycobacterium ed eucarioti come la muffa Rhizopus vengono impiegati nelle bioconversioni
(biotrasformazioni) per la produzione degli ormoni
steroidi.
Fra i microrganismi eucarioti una grande varietà di
funghi filamentosi (muffe) è utilizzata nella produzione
di molecole bioattive (antibiotici, farmaci diversi), metaboliti primari (acido citrico) ed enzimi.
I lieviti (funghi unicellulari) con il genere Saccharomyces rappresentano sicuramente i microrganismi
più noti per le trasformazioni biotecnologiche in campo alimentare (produzione di vino, birra, lievitazione
del pane e dei prodotti da forno). Vengono coltivati
anche come integratori alimentari e fonte di proteine
(SCP, single cell proteins). I lieviti sono però estremamente importanti anche perché, fra gli eucarioti, sono
microrganismi-modello per le manipolazioni genetiche
e vengono utilizzati anche per la produzione di metaboliti primari e proteine ricombinanti.
L’avvento delle biotecnologie avanzate e il perfezionamento delle tecniche di ingegneria genetica per il
trasferimento di geni hanno consentito la creazione di
microrganismi geneticamente modificati (MGM)
allo scopo di ottenere prodotti specifici. L’impiego degli
MGM viene condizionato dalla legislazione specifica in
vigore nei vari Paesi.
Nel campo delle produzioni alimentari si impiegano microrganismi non modificati classificati dalla FDA
(Food and Drug Administration) come GRAS (generally recognized as safe, tabella 2.2).
I microrganismi utilizzati nelle produzioni industriali e nella ricerca sono conservati in collezioni nazionali,
alcune delle quali sono riportate in tabella 2.3.
2.9 Tecniche di selezione
dei ceppi microbici
La ricerca nel campo delle biotecnologie microbiche tende costantemente alla scoperta di nuovi metaboliti microbici. Le strategie impiegate a questo fine possono essere
diverse (tabella 2.4).
Una ricerca può avere come scopo quello di ottenere
un nuovo prodotto, mettere a punto un processo innovativo rispetto a quello attualmente in uso, o la combinazione dei due obiettivi.
Il più delle volte il punto di partenza in questo tipo
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BIOTECNOLOGIE MICROBICHE
Tabella 2.2 Alcuni microrganismi classificati GRAS
BATTERI
PRODOTTO/SETTORE DI IMPIEGO
Bacillus subtilis
Pectina liasi e proteasi per il settore alimentare
Bacillus licheniformis
Proteasi per il settore alimentare
Geobacillus stearothermophilus
α-amilasi per la produzione di maltodestrine da amido
Gluconobacter oxydans
Sorbosio per uso alimentare
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
Produzione di yogurt
Lactococcus lactis
Nisina, antibiotico impiegabile nei formaggi pastorizzati, aminopeptidasi
per lo sviluppo di aroma nel formaggio cheddar
Leuconostoc mesenteroides
Destrano per uso alimentare
Streptococcus thermophilus
Produzione di yogurt
Streptomyces griseus
Vitamina B12
Xantomonas campestris
Xantano
LIEVITI
Candida utilis
Mangimistica
Kluyveromyces lactis
β-galattosidasi per la produzione di latte delattosato
Saccharomyces cerevisiae
Lievito per panificazione, lievito per uso dietetico, estratti proteici
Yarrowia lipolytica
Produzione di acido citrico
MUFFE
Aspergillus niger
Cellulasi per il trattamento di molluschi e crostacei
Aspergillus oryzae
α-amilasi da addizionare alle farine
Endothia parasitica
Caseificazione
Penicillium roqueforti
Caseificazione
Rhizopus niveus
Amiloglucosidasi per l’idrolisi dell’amido, lipasi per reazioni
di interesterificazione in grassi e oli
Rhizopus oryzae
Amilasi per la produzione di destrosio da amido
Rhizomucor miehei
Caseificazione (rennina): esterasi-lipasi con ruolo sulla sapidità dei formaggi
Rhizomucor pusillus
Caseificazione
Tabella 2.3 Principali collezioni di microrganismi
COLLEZIONE
MICRORGANISMO
American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, USA)
Tutti
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) (Braunschweig, Germania)
Tutti
Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) (Parigi, Francia)
Tutti
CABI Bioscience Genetic Resource Collection (formalmente International Mycological Institute,
IMI) (Egham, UK)
Tutti
Czechoslovak Collection of Microorganisms (CCM) (Brno, Repubblica Ceca)
Tutti
Culture Collection of the Institut for Fermentation (IFa) (Osaka, Giappone)
Tutti
Japan Collection of Microorganisms (JCM) (Saitama, Giappone)
Tutti
Collection de l’Institut Pasteur (CIP) (Parigi, Francia)
Batteri
National Collection of Industrial, Food and Marine Bacteria (NCIB , NCIMB , NCFB) (Aberdeen, UK)
Batteri
National Collection of Yeast Cultures (NCYC) (Norwich, UK)
Lieviti
Centraal Bureau voor Schimmelcultures (CBS) (Baarn, Olanda)
Lieviti e muffe
Canadian Collection of Fungal Cultures (CCFC) (Ottawa, Canada)
Muffe
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Tabella 2.4 Strategie per l’ottenimento di nuovi metaboliti microbici
STRATEGIE
tIsolamento di ceppi microbici per la produzione di nuovi metaboliti
tModificazione chimica di molecole già note
tBiotrasformazioni a opera di microrganismi o enzimi per la modifica di molecole ottenute per via chimica
o microbiologica
tFusione di protoplasti interspecifica per la ricombinazione di informazioni genetiche fra ceppi produttori,
ragionevolmente correlati
tClonaggio di geni per il trasferimento di informazioni genetiche fra ceppi non correlati
di ricerche consiste nell’individuazione, su varie matrici ambientali, di un elevato numero di generi e specie
microbiche diverse fra cui selezionare ceppi microbici
più efficienti o in grado di produrre nuovi metaboliti.
Questo procedimento prende il nome di screening
(vagliare, setacciare); ad esso seguono o si affiancano
anche tecniche di mutagenesi (induzione di mutazioni
sui microrganismi selvatici o “wild”) allo scopo di ottenere ceppi alto-produttori. Nelle biotecnologie microbiche lo screening può avere come obiettivo la ricerca
di:
r un ceppo microbico
r un enzima
r una molecola.
I microrganismi, per le loro dimensioni microscopiche, per la rapida crescita, per l’enorme varietà, sono
“campioni” ideali da vagliare per scoprire ceppi dotati
di particolari attività metaboliche, in grado di produrre
determinati enzimi o nuove molecole suscettibili di applicazioni interessanti.
Il fattore tempo e quello economico hanno importanza primaria, per cui il target ideale si rivela essere
quello di saggiare molti campioni in un tempo breve.
Questo è solo il primo passo (ma già di per sé complesso) di una procedura lunga e impegnativa che porta
alla realizzazione di un impianto-pilota (generalmente
un piccolo fermentatore da laboratorio di capacità non
superiore a 20 L), alla messa a punto dei parametri biochimici e microbiologici del processo e alla valutazione
finale del prodotto ottenuto. Se l’operazione risulta conveniente anche sul piano economico, si può passare dalla fase sperimentale alla progettazione dell’impianto per
la produzione industriale vera e propria.
2.10 Strategie di screening
Se l’obiettivo è la produzione di un nuovo metabolita,
occorre intervenire sul metabolismo microbico individuando la via biochimica in cui la molecola-target è
coinvolta, intervenire sui sistemi di regolazione e indirizzare o deviare il metabolismo microbico verso la
molecola di interesse.
I sistemi di controllo principali su cui intervenire
sono relativi alla sintesi degli enzimi coinvolti nella via
biochimica specifica e, per quanto riguarda le sostanze
escrete nell’ambiente extracellulare, alla regolazione
della permeabilità cellulare. In questo ambito l’intervento delle tecnologie del DNA ricombinante che hanno
reso possibile il trasferimento e l’espressione controllata
di geni hanno consentito progressi prima inimmaginabili: basti pensare all’inserimento di geni codificanti per
la produzione di ormoni umani in ceppi batterici (insulina da E. coli).
Lo screening per ottenere nuove molecole si svolge in più fasi, con la selezione di ceppi microbici, l’effettuazione di saggi di attività e di prove preliminari
in fermentatori su piccola scala. Successivamente si
affrontano indagini di tipo più strettamente chimico,
quali l’estrazione e la caratterizzazione delle proprietà
della molecola ottenuta. Questi procedimenti vengono
schematizzati come screening primario e screening
secondario, ciascuno composto da diverse fasi (tabella 2.5).
La fase di screening primario comprende:
r isolamento di colture. Esistono collezioni ufficiali
di colture microbiche a cui ci si può rivolgere, ma
l’individuazione di nuovi ceppi di interesse parte
generalmente con la ricerca nei substrati più diver23
Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
2
BIOTECNOLOGIE MICROBICHE
SCREENING: TERMINOLOGIA
Programma di screening: operazioni mirate alla scoperta di un prodotto.
Campione: elemento da saggiare nello screening.
Library (libreria): insieme dei campioni disponibili per
lo screening.
Proprietà: attività biologica che è richiesta al campione.
Test: saggio che viene impiegato per valutare se qualche campione della library possiede la proprietà desiderata. Si distinguono test primari, cui vengono sottoposti
tutti i campioni, e test secondari che vengono eseguiti
solo sui campioni positivi ai test primari.
Algoritmo di screening: definisce i criteri di positività
e negatività dei test che un campione deve superare per
essere classificato interessante, con proprietà che vale la
pena indagare ulteriormente. Un simile campione viene
chiamato hit.
Tipologie di library
Una library può essere formata, a seconda degli obiettivi, da microrganismi, da enzimi, da DNA, da metaboliti.
Caratteristiche primarie di una library sono la diversità,
il grado di novità, la dimensione. Minori sono la diversità e la novità, maggiore dovrà essere la dimensione di
una library. Viceversa, maggiori sono le novità, minore
si (acqua, suolo, vegetali ecc.) mediante l’impiego
di terreni prima generici e poi selettivi a seconda
dell’obiettivo che si intende perseguire. È ovvio che
la premessa indispensabile per poter proseguire le
indagini con criteri di razionalità consiste nell’ottenere colture pure
r saggi di attività. Comprendono vari test (per es. di
efficacia antimicrobica della nuova molecola) da effettuarsi su terreni solidi o liquidi sui vari ceppi microbici isolati
r analisi cromatografica dei campioni del filtrato
colturale. Viene eseguita per l’individuazione e la
classificazione chimica preliminare del composto
di interesse presente nel terreno liquido di coltura.
Se il prodotto ricercato è in massima parte inglobato nelle cellule, occorrono procedure mirate di
estrazione.
potrà essere la dimensione della library. Gli aspetti innovativi di uno screening consentono di prendere in esame
elementi non precedentemente esaminati da altri ricercatori: per esempio utilizzando nuovi campioni, perfezionando o modificando i test per identificare nuovi
elementi interessanti (nuovi hit).
Library di microrganismi: viene utilizzata quando interessa in primo luogo il microrganismo nella sua integrità
piuttosto che uno dei suoi prodotti. È composta generalmente di microrganismi simili, che vanno sottoposti
a screening in condizioni di omogeneità, possibilmente
utilizzando lo stesso terreno, la medesima temperatura
di incubazione ecc.
Library di geni: si utilizza quando si vuole ricercare il
prodotto di uno o più geni, cioè una proteina; ma anche
il prodotto dell’azione catalitica di più enzimi codificati
da geni diversi.
Library di enzimi: per identificare nuovi enzimi si possono utilizzare lisati cellulari o il mezzo di coltura. In genere si tratta di miscele complesse di proteine.
Library di metaboliti: per l’identificazione di una nuova
molecola bioattiva, ci si basa sulla capacità dei microrganismi di produrre metaboliti secondari. Si procede con
l’ottenere estratti dai terreni di coltura, quindi si perfeziona la ricerca con tecniche diverse per eliminare possibili interferenze.
Lo screening secondario viene avviato quando la fase
primaria ha dato risultati positivi, si è cioè arrivati con
successo all’isolamento di ceppi in grado di produrre la
sostanza di interesse. A questo punto diventa sostanziale
la necessità di migliorare le rese produttive cercando di
ottenere ceppi microbici alto-produttori e di ottimizzare
le condizioni colturali.
2.11 Selezione dei ceppi
alto-produttori
La selezione dei ceppi alto-produttori viene effettuata
impiegando tecnologie genetiche basate sul verificarsi di:
r fenomeni naturali: mutazioni spontanee, ricombinazioni
r eventi provocati: mutazioni indotte, fusione di protoplasti, ibridazione fra cellule, ingegneria genetica.
24
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2
BIOTECNOLOGIE MICROBICHE
Tabella 2.5 Fasi che costituiscono una procedura di ricerca e sviluppo applicata alla messa a punto di nuove molecole ad
attività biologica
FASI
SOTTOPASSAGGI
Screening primario
t3BDDPMUBEJDBNQJPOJFJTPMBNFOUPEFMMFDPMUVSF
t&WFOUVBMFTBHHJPQSFMJNJOBSFEJBUUJWJUËJOTPMJEP
t4BHHJEJWBMVUB[JPOFEJBUUJWJUËJOMJRVJEP DBNQJPOJEJýMUSBUPDPMUVSBMF
t4BHHJEJJOJCJ[JPOFFO[JNBUJDB
t$BSBUUFSJ[[B[JPOFEFMDFQQPQSPEVUUPSF FEFWFOUVBMFCSFWFUUB[JPOF
di microrganismo e processo
Screening secondario
Selezione di ceppi alto-produttori
t*NQJFHPEFMMFUFDOJDIFNVUBHFOFFPHFOFUJDIF
t4FMF[JPOFEFJDFQQJ
Messa a punto delle condizioni colturali
t.FTTBBQVOUPEFMMBGPSNVMB[JPOFEFMUFSSFOPDPMUVSBMF QSPEVUUJWJUË
in rapporto al costo)
t"OBMJTJEF*MJOþVFO[BEFMMFWBSJBCJMJEJGFSNFOUB[JPOF
t4UVEJPEFMMFDJOFUJDIFEJGFSNFOUB[JPOF
t4WJMVQQPCJPUFDOPMPHJDPEFMQSPDFTTP scale-up): laboratorio pilota-impianto
Isolamento e valutazione della sostanza
isolata
t&TUSB[JPOFEBJDBNQJPOJEJýMUSBUPDPMUVSBMFFQVSJýDB[JPOF
t$BSBUUFSJ[[B[JPOFDIJNJDPýTJDBFTUVEJPEFMNFDDBOJTNPEB[JPOF
t"UUJWJUËFTUBCJMJUËin vitro e in vivo
t4UVEJPEFMMBCJPHFOFTJ
t1SPWFEJUPTTJDJUË
Analisi dei costi
t7BMVUB[JPOFHMPCBMFEFJDPTUJEJQSPEV[JPOF
-JEFOUJýDB[JPOFUBTTPOPNJDBEFMDFQQPQSPEVUUPSF DJPÒJMTVPSJDPOPTDJNFOUPEJBQQBSUFOFO[BBVOBTQFDJFHJËDMBTTJýDBUBPBVOBTQFDJFOVPWB può essere effettuata in uno stadio della ricerca più avanzato, cioè quando l’interesse per il prodotto ottenibile sia ben dimostrato.
Mutazioni
Si può fare affidamento sulla comparsa nel ceppo in esame di mutazioni spontanee potenzialmente utili, ma,
per la bassa frequenza con cui queste si manifestano,
risulta senz’altro più conveniente un approccio rivolto
alla creazione di mutazioni indotte (figura 2.17). Si impiegano allo scopo agenti mutageni fisici quali radiazioni ionizzanti (raggi X e γ) o non ionizzanti (raggi UV)
o mutageni chimici come analoghi delle basi, acridina,
agenti alchilanti, enzimi che interferiscono con la sintesi del DNA. Gli effetti delle radiazioni UV possono
essere in certa misura annullati dall’esposizione dei
mutanti alla luce visibile (reversione per foto riattivazione). L’azione dei raggi X e γ è molto più intensa e
penetrante e causa la formazione di radicali liberi altamente reattivi che inattivano gli acidi nucleici e altre
macromolecole cellulari. Gli analoghi delle basi vengono incorporati nel DNA e ne alterano il meccanismo
di replicazione. Le acridine (arancio di acridina e bro-
muro di etidio) sono agenti intercalanti che si inseriscono fra le coppie di basi del DNA, producendo mutazioni da scivolamento (frameshift) nello schema di lettura
del codice genetico e provocandone di conseguenza il
completo stravolgimento. Le tecniche di mutagenesi
si sono rivelate molto efficaci nel miglioramento della
produttività di processo, anche se in molti casi si preferisce impiegare le tecnologie del DNA ricombinante
attualmente disponibili.
Gli agenti mutageni, trattati in modo più approfondito nel capitolo 15, possono agire a livello molecolare
in modi diversi, provocando mutazioni:
r geniche: consistono in variazioni di basi all’interno
di un gene e si verificano per sostituzione, delezione, inserzione di base. Tali mutazioni vengono dette
puntiformi se riguardano una sola base
r cromosomiche: coinvolgono uno o più cromosomi. Sono alterazioni piuttosto estese riguardanti
segmenti di DNA che si possono spezzare e ricongiungere. Si possono avere cambiamenti di posizio25
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2
BIOTECNOLOGIE MICROBICHE
Figura 2.17 Mutazioni spontanee e mutazioni indotte. a) La forma rara della citosina può appaiarsi con una base diversa.
b) Alcune sostanze chimiche, grazie alla loro azione mutagena, possono indurre modificazioni nelle basi. c) In entrambi i tipi di
mutazioni si arriva a un cambiamento della sequenza di DNA dopo la duplicazione.
ne (traslocazione), eliminazioni (delezioni) o duplicazioni
r genomiche: modificazioni del numero di cromosomi presenti in un individuo, in più o in meno rispetto
alla norma. La mutazione modifica l’intero cariotipo.
Una volta ottenuti i mutanti, sia spontanei che indotti, la fase successiva risulta lunga e indaginosa, poiché
l’individuazione di microrganismi potenzialmente utili comporta l’analisi di un elevato numero di ceppi fra
quelli sopravvissuti all’evento mutageno. L’operazione
può essere eseguita affidandosi alla selezione casuale
o piuttosto all’isolamento selettivo, in condizioni che
permettono di individuare solo i ceppi che rispondono a
determinate caratteristiche (resistenza a inibitori o antimetaboliti, ceppi auxotrofi che richiedono l’integrazione nel mezzo colturale di un particolare nutriente ecc.).
Ricombinazione naturale di geni
La ricombinazione naturale di geni si verifica sia nei
procarioti che negli eucarioti. I batteri, pur non avendo
una riproduzione sessuale, possono scambiare materiale
genetico cromosomico o plasmidico con tre modalità:
❖ coniugazione: trasferimento di DNA plasmidico o
parti di cromosoma batterico da una cellula donatrice
a una ricevente attraverso il “pilum F” (figura 2.18)
❖ trasformazione: acquisizione da parte di una cellula
ricevente di frammenti di DNA dall’ambiente o dal
substrato colturale
❖ trasduzione: inserimento di materiale genetico proveniente da un batterio donatore in una cellula ricevente con l’intervento di un vettore virale.
Negli eucarioti che si riproducono sessualmente la ricombinazione genetica naturale si verifica nella meiosi
con il crossing-over, fenomeno che è all’origine dell’infinita variabilità genetica originata dalla riproduzione
sessuale.
In muffe di interesse industriale quali Aspergillus e
Penicillium due diversi ceppi aploidi possono fondere le
loro ife formando un micelio che contiene i nuclei di entrambi i ceppi (eterocarion), dando origine a individui
con caratteri ricombinati.
26
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BIOTECNOLOGIE MICROBICHE
F+
Integrazione del
fattore F al
cromosoma
F--
Trasferimento del
DNA plasmidico
F+
F+
Hfr
Trasferimento del
DNA cromosomiale
Hfr
F+ ricombinante
2
Figura 2.18 Trasferimento del DNA per coniugazione. La cellula donatrice (F+) entra in contatto con una cellula ricevente (F–)
attraverso il pilum. Il DNA del donatore entra nella cellula ricevente e al termine del processo le due cellule hanno una copia
completa di DNA.
Ibridazione di lieviti
Nei lieviti è possibile procedere all’ibridazione dei caratteri di due ceppi diversi ma compatibili. L’operazione
viene eseguita tramite un micromanipolatore con cui due
ascospore, ciascuna delle quali derivante da un ceppo,
vengono messe a contatto e coniugano fondendo i rispettivi genomi.
Ne risulta uno zigote ibrido con corredo cromosomico diploide dotato dei caratteri ricombinati dei singoli ceppi, da cui si ottiene un clone cellulare coltivabile su
adatto terreno di propagazione.
Fusione di protoplasti
In alcune cellule eucariotiche, come lieviti o cellule vegetali, è possibile ottenere varianti genetiche attraverso
la fusione dei protoplasti.
I protoplasti sono cellule private della parete cellulare in seguito a opportuni trattamenti con enzimi litici
in ambiente osmoticamente controllato: soluzioni ec-
Protoplasti
+
Parete cellulare
Figura 2.19 Fusione di protoplasti. In condizioni di fusione due
protoplasti mescolano i loro materiali genetici; al ripristino delle
condizioni naturali ogni protoplasto riforma la propria parete
cellulare.
27
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2
BIOTECNOLOGIE MICROBICHE
Membrana citoplasmatica
DNAr
Membrana
DNAr
Citoplasma
Nucleo
Citoplasma
Cellula
Scarica
elettrica
Entrata
del DNAr
Rilassamento
Figura 2.20 Elettroporazione. La scarica elettrica crea dei pori nella membrana citoplasmatica permettendo l’ingresso di DNA
esogeno.
cessivamente ipotoniche potrebbero infatti provocare
danni irreversibili alla membrana plasmatica, l’unico
involucro cellulare superstite.
Il successivo trattamento con polietilenglicol permette la fusione dei due protoplasti, provenienti ciascuno da ceppi affini ma geneticamente diversi. Il DNA
delle due cellule progenitrici viene quindi ricombinato
negli ibridi risultanti che ricostituiscono poi la parete
cellulare (figura 2.19).
Elettroporazione
Un’altra tecnica per inserire molecole di DNA esogeno
in cellule riceventi è l’elettroporazione. Questa metodica consiste nel sottoporre la cellula ricevente a ripetute scariche elettriche a intervalli regolari che hanno il
potere di allargare i pori della membrana cellulare (figura 2.20).
DNA ricombinante (ingegneria genetica)
La tecnologia del DNA ricombinante offre indubbiamente il più ampio ventaglio possibile di ricombinazioni genetiche, permettendo il passaggio di materiale
genetico da un organismo a un altro attraverso specifici
vettori. Un frammento di DNA può essere facilmente
clonato in un vettore, quindi inserito nell’ospite adatto. Un aspetto particolarmente problematico riguarda
l’espressione nell’ospite, nei confronti del quale il DNA
esogeno rappresenta pur sempre un gene estraneo. Per
questo devono essere inserite nell’ospite, insieme al
gene che codifica per la proteina di interesse (il prodotto che si vuole ottenere), specifiche sequenze di attivazione, nonché marker, per poter riconoscere le cellule
ospite trasformate, distinguendole da quelle che non
hanno incorporato il DNA esogeno. La trasformazione
della cellula ospite e l’effettiva espressione del gene esogeno trasferito sono infatti eventi probabili e non sicuri.
28
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ESERCIZI DI VERIFICA
1. Gli enzimi sono:
A proteine con attività catabolica
B proteine con attività catalitica
C molecole inorganiche con attività catalitica
2. I coenzimi sono:
A forme diverse di uno stesso enzima
B molecole organiche che partecipano all’attività catalitica con funzione di trasporto
C enzimi che agiscono contemporaneamente
su di uno stesso substrato
3. Il coenzima NAD funziona come:
A catalizzatore
B trasportatore
C inibitore
D repressore
E corepressore
4. La retroregolazione (feedback) esercita un
controllo sulle attività metaboliche di:
A biosintesi
B degradazione (catabolismo)
C respirazione
D fermentazione
5. Nel meccanismo di regolazione a retroazione della sintesi proteica il gene regolatore
produce:
A un repressore attivo
B un repressore inattivo
C un corepressore
6. Nel meccanismo di regolazione degli enzimi
inducibili il gene regolatore produce:
A un repressore attivo
B un repressore inattivo
C un induttore
7. Lo scopo della fusione di protoplasti è quello di:
A ottenere cellule più grandi
B ottenere ibridi con caratteri ricombinati
C ottenere un numero maggiore di cellule per
la produzione industriale di sostanze
8. Completa le seguenti frasi:
Con la ricombinazione genetica si ottengono
...........................................................................
...........................................................................
...........................................................................
Il trasferimento di plasmidi consente di ............
...........................................................................
...........................................................................
Gli isoenzimi sono ..........................................
..………..…….. e catalizzano ............................
ma si differenziano per ......................................
Tenendo conto della natura chimica degli enzimi, la loro attività può essere bloccata da un
...........................................................................
.............., in quanto ciò ne provoca la ..............
................................
Gli enzimi che vengono sintetizzati solo in presenza di un substrato specifico si dicono..........
....................................................., mentre quelli
che non seguono questa regola sono chiamati
............................................... Esempio del primo gruppo è l’enzima .......................................
.............., esempi del secondo gruppo sono gli
enzimi che intervengono nella ...........................
..........................
29
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3
I PROCESSI
BIOTECNOLOGICI
3.1 Substrati e prodotti
3.2 I terreni di coltura per la microbiologia
industriale
3.3 I prodotti
3.4 Fasi produttive: preparazione dell’inoculo
3.5 Lo scale-up
3.6 I fermentatori o bioreattori
3.7 Sterilizzazione
3.8 Processi batch, continui, fed-batch
3.9 Immobilizzazione dei biocatalizzatori
3.10 I sistemi di controllo
3.11 Il recupero dei prodotti (downstream)
I processi biotecnologici si basano sull’impiego di enzimi
o di cellule microbiche, spesso indicati con il termine unico di biocatalizzatori: gli enzimi possono essere estratti
dalla cellula, isolati e utilizzati come tali. I processi che
portano a prodotti ottenuti in questo modo, cioè con l’utilizzo dell’attività catalitica dei soli enzimi, sono detti anche
conversioni o bioconversioni e trasformano semplicemente il substrato nel prodotto desiderato. Quando invece il prodotto è ottenuto dall’attività della cellula in toto si
tratta piuttosto di fermentazioni vere e proprie: in questo
caso le cellule microbiche sono chiamate sia a realizzare
non solo le vie metaboliche che portano alla formazione
del prodotto, ma anche quelle necessarie alla sintesi degli enzimi coinvolti nella produzione. Le cellule vengono
utilizzate in sospensione nel mezzo colturale, mentre gli
enzimi vengono solubilizzati nel sistema di reazione. Sia
le cellule che gli enzimi possono inoltre essere fissati (immobilizzati) su particolari supporti. L’impiego di microrganismi aumenta la complessità dei sistemi di reazione,
per l’imprevedibilità degli equilibri propria delle cellule
viventi: tutti i parametri in gioco devono quindi essere rigidamente controllati e ottimizzati non solo per assicurare
alle cellule le migliori condizioni di sopravvivenza e operatività, ma anche per ottenere le massime rese produttive.
3.1 Substrati e prodotti
I processi biotecnologici presentano indubbiamente diversi vantaggi rispetto a quelli chimico-industriali:
r impiego di materie prime naturali, rinnovabili e che
spesso sono residui di altre lavorazioni o anche so30
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I PROCESSI BIOTECNOLOGICI
stanze non altrimenti riciclabili (fanghi di depurazione o residui di idrocarburi)
r minor consumo di energia nella conduzione del processo
r prodotti ecologicamente compatibili
r prodotti di scarto riciclabili.
Nelle produzioni biotecnologiche si distinguono due diverse fasi:
❖ upstream di biotrasformazione in cui microrganismi
o enzimi elaborano il prodotto
❖ downstream di estrazione e isolamento del prodotto
desiderato.
Insieme con la scelta del microrganismo più efficiente
e produttivo, quella del substrato più adatto ad ottenere il prodotto desiderato è altrettanto fondamentale in
qualsiasi processo fermentativo. Un aspetto di primaria
importanza nell’economia di produzione è rappresentato dal rapporto fra costi e resa del processo: per questo
motivo l’industria preferisce sfruttare per quanto possibile come materie prime i prodotti di scarto o i surplus
residuati da altri processi o da attività agricole, come
melasso, farina di soia, corn-steep liquor. Caratteristica
principale di un qualsiasi substrato è quella di rispondere in modo ottimale ma compatibile con l’economia
di processo alle esigenze nutritive dei microrganismi e
di contribuire nel migliore dei modi alla sintesi del prodotto. Quest’ultimo può essere il microrganismo stesso
(biomassa cellulare: per es. cellule di lievito nella produzione del lievito alimentare o per la panificazione) o un
composto chimico di particolare interesse prodotto dal
metabolismo microbico.
I criteri su cui basare la scelta dei substrati più opportuni sono essenzialmente:
r costo
r disponibilità per quanto possibile continua
r scarsa incidenza di problemi logistici di trasporto e
stoccaggio
r stabilità alle temperature di sterilizzazione
r caratteristiche chimico-fisiche tali da non incidere
negativamente sul processo produttivo (formazione
di schiuma o altri effetti indesiderati)
r alte rese
r scarsa produzione di prodotti secondari
r assenza di problemi di sicurezza e igienico-sanitari.
3
In conclusione, la redditività economica di un prodotto
è la risultante di una somma di fattori fra cui hanno un
ruolo decisivo la resa di processo, la convenienza economica delle materie prime da utilizzare e la complessità degli impianti di estrazione e purificazione, naturalmente in
relazione al valore aggiunto del prodotto.
3.2 I terreni di coltura
per la microbiologia industriale
La composizione dei terreni colturali deve essere commisurata alle esigenze dei microrganismi impiegati nei processi di produzione biotecnologica. Nelle fermentazioni
industriali la formulazione dei terreni di coltura e le condizioni operative risultano il più delle volte non equiparabili a quelle osservate in laboratorio: per ottimizzare le
condizioni colturali allo scopo di ottenere un determinato
prodotto a volte è necessario fornire alcune sostanze nutritive in eccesso per indurre i microrganismi a percorrere vie metaboliche alternative a quelle abituali. Si può allestire, per esempio, un terreno sbilanciato con un eccesso
di carbonio rispetto al contenuto in azoto per indurre la
produzione di polisaccaridi. In altri casi, invece, si ricorre
a condizioni di carenza nutrizionale: Corynebacterium
glutamicum aumenta la produttività di acido glutammico
se mantenuto in carenza di biotina, mentre Aspergillus niger produce alte concentrazioni di acido citrico quando il
terreno di coltura è carente di ferro.
Se si impiegano mutanti auxotrofi, risulta indispensabile la conoscenza approfondita delle specifiche
esigenze nutrizionali, fornendo i componenti che i microrganismi non sono più in grado di sintetizzare autonomamente. In altri casi si richiede un mezzo colturale
privo di uno specifico cofattore per causare il blocco
dell’attività di un enzima con punto di intervento immediatamente a valle del metabolita che si vuole ottenere.
In questo modo il metabolita si accumula nel terreno di
coltura e può essere recuperato. Un simile fenomeno si
verifica, per esempio, nella produzione dell’acido citrico
con il blocco programmato dell’enzima aconitasi che lo
trasformerebbe, se lasciato libero di agire, in acido cisaconitico (figura 3.1).
La valutazione dell’impatto dei parametri ambientali in cui viene condotta la fermentazione (temperatura,
pH, condizioni di aerazione ecc.) è un altro punto fondamentale nella gestione e nell’ottimizzazione del pro31
Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
3
I PROCESSI BIOTECNOLOGICI
Tabella 3.1 Rapporti dei microrganismi con l’ossigeno
in relazione al metabolismo
Glucosio
Fruttosio-6-fosfato
PFK
Fruttosio-1,6-difosfato
Piruvato
CO2
Piruvato
carbossilasi
GRUPPO
METABOLISMO
ESIGENZE DI O2
Aerobi
Obbligati
Respirazione
Esigenti. Si sviluppano
in presenza di O2 atmosferico (circa 20%)
Microareofili Respirazione
Esigenti. Richiedono
livelli di O2 del 2-10%
Facoltativi
Respirazione
aerobica e anaerobica
Fermentazione
Non esigenti. Si sviluppano meglio in presenza
di O2
Respirazione
anaerobica o
fermentazione
Non tollerano la presenza
di O2
Fermentazione
Non esigenti. Si sviluppano meglio in assenza
di O2
Acetil-CoA
CoA
Anaerobi
Obbligati
Ossalacetato
Citrato
Aconitasi
TCA
cis-Aconitato
Aerotolleranti
Isocitrato
Tabella 3.2 Composizione (g/L o mg/L) di terreni colturali
impiegati per la produzione di alcuni metaboliti
Figura 3.1 Inibizione dell’aconitasi. Lo schema mostra come
il blocco dell’enzima aconitasi induce un accumulo di acido
citrico.
cesso produttivo. Occorre quindi studiare sistemi di termostatazione per il controllo costante della temperatura
e tamponare eventuali variazioni del pH.
È fondamentale mettere a punto strumenti per mantenere la concentrazione dell’ossigeno disciolto sopra a
determinati valori-soglia. Le condizioni di aerazione
del sistema rivestono infatti importanza strategica: la
quantità di ossigeno da introdurre nel sistema di reazione è commisurata alle esigenze dei microrganismi impiegati (tabella 3.1), ma non sono rari i casi in cui risulta
opportuno aumentarne la disponibilità per incrementare le rese produttive.
Altri parametri di primaria importanza sono quelli
relativi alla cinetica di fermentazione, cioè alla relazione fra la fase della curva di crescita microbica (logaritmica, stazionaria ecc.) e quella in cui si ha la massima
resa produttiva. Poiché non esiste una corrispondenza
fissa fra la fase di sviluppo e quella di massima biosintesi,
alcuni metaboliti vengono sintetizzati nella fase di cre-
Acido glutammico
Glucosio
270
NH4H2PO4
2
(NH4)2HPO4
2
K2SO4
2
MgSO4 · 7H2O
0,5
MnSO4 · 7H2O
0,04
FeSO4 · 7H2O
0,02
Polietilenglicole
0,3
Biotina
0,01 mg
Penicillina
0,01 mg
Vitamina B12
Melasso di canna
100
Estratto di lievito
2
(NH4)2HPO4
5
MgSO4 · 7H2O
3
MnSO4 · 7H2O
0,2
Co(NO3)2 · 6H2O
0,19
Dimetilbenzimidazolo 25 mg
ZnSO4 · 7H2O
20 mg
Na2MoO4 · 2H2O
5 mg
Riboflavina
Glucosio
Caseina
K2HPO4
Olio di soia
Glicerolo
Corn steep
Penicillina
Glucosio
Corn steep
Acido fenilacetico
Olio vegetale
20
12
1
20
12
12
100
40
5-8
5
scita logaritmica, mentre altri in quella stazionaria. Ciò
si ripercuote nella scelta della tecnologia di processo più
opportuna (a lotti, in continuo, fed-batch) a seconda
dell’obiettivo specifico di produzione.
32
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3
I PROCESSI BIOTECNOLOGICI
Nelle produzioni industriali si impiegano generalmente terreni complessi, che contengono in larga
misura materie prime grezze: farine animali o vegetali,
sottoprodotti di altre lavorazioni come l’acqua di macerazione del mais (corn-steep liquor) e melasso, residuo della lavorazione della canna da zucchero o delle
barbabietole. Le materie prime grezze, vantaggiose
dal punto di vista economico, richiedono comunque
pretrattamenti di idrolisi dei polimeri (come nel caso
di amido e cellulosa) o di chiarificazione (corn-steep
liquor). Esempi di composizione di terreni di coltura
impiegati in microbiologia industriale sono riportati in
tabella 3.2.
Fonti di carbonio
Possono essere impiegati carboidrati in forma pura
come lattosio o glucosio, forniti anche come sciroppi
ottenuti dall’idrolisi enzimatica dell’amido (sciroppo di
glucosio). Più spesso vengono però impiegati carboidrati in forma grezza (tabella 3.3):
r melassi: sottoprodotti dell’industria saccarifera, residui dell’estrazione del saccarosio da barbabietole e
canna da zucchero (figura 3.2). Si presentano come
una sorta di sciroppi densi ad alta viscosità, di colore
scuro, e oltre che una fonte di carboidrati sono ricchi di importanti fattori di crescita come inositolo,
acido pantotenico e biotina, il cui contenuto è sensibilmente più alto nel melasso derivato dalla canna.
Vengono impropriamente indicati come “melas-
Figura 3.2 Melasso.
CH2OH
O
OH
H
O
OH
OH
n
α-1,4
2 < n < 20
Figura 3.3 Unità costituente delle maltodestrine.
si” anche residui di estrazione di zuccheri (diversi
dal saccarosio) come il glucosio da amido di mais
(corn molasse o hydrol) o l’high-test molasse ottenuto
dallo sciroppo di canna, che contiene saccarosio e
zucchero invertito (miscela di glucosio e fruttosio,
ottenuta per azione dell’enzima invertasi)
r liscivio solfitico: residuo della lavorazione della cellulosa del legname. Con opportuni trattamenti chimici dal legno si ottiene la solubilizzazione della lignina, con produzione della pasta di cellulosa e di un
liscivio solfitico che viene separato per filtrazione e
quindi pretrattato per eliminare i residui di anidride
solforosa. È un liquido che contiene il 20% circa di
carboidrati (esosi e pentosi come xilosio e arabinosio) utilizzabile come substrato nutritivo per lieviti
come Saccharomyces, che utilizza gli esosi, e Candida,
in grado di metabolizzare anche i pentosi
r estratto di malto: impiegato anche in laboratorio
come ingrediente di molti terreni di coltura per
miceti, deriva dalla maltizzazione dell’orzo, processo basilare anche nella produzione della birra
(capitolo 6). L’ammollamento dell’orzo in acqua
ne provoca la germinazione, con liberazione delle
amilasi contenute nel seme e idrolisi dell’amido.
Dopo essiccamento e successivo ammostamento si
ottiene un estratto ricco di carboidrati e con il 5%
circa di sostanze azotate (soprattutto aminoacidi),
che viene commercializzato come sciroppo o in
forma solida
r siero di latte: è il principale sottoprodotto dell’industria lattiero-casearia, residuo della coagulazione
della caseina (principale proteina del latte) nella
produzione dei formaggi. Può essere impiegato nella
produzione di ricotta e nell’alimentazione animale.
33
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3
I PROCESSI BIOTECNOLOGICI
Tabella 3.3 Fonti di carbonio in forma grezza
INGREDIENTE
ORIGINE
CARATTERISTICHE
Melasso
Residuo del processo di cristallizzazione
del saccarosio
Barbabietola:
circa il 50% di saccarosio; ricco di fattori
di crescita (tiamina, riboflavina, acido folico ecc.)
Canna:
30% di saccarosio e 20-30% di zucchero invertito; più
elevato contenuto di biotina
Altri “melassi”
Da sciroppo di canna
Residuo del processo di estrazione
dell’amido da mais
High-test molasse:
15-30% di saccarosio e 40-60%
di zucchero invertito
Corn molasse o hydrol:
60% di zuccheri, limitato contenuto proteico, alta
concentrazione salina
Liscivio solfitico
Residuo del processo di produzione
di cellulosa da legname
Orzo maltizzato
Spent sulfite liquor o sulfite waste liquor:
10-12% di s.s., di cui il 20% esosi
(glucosio, mannosio e galattosio) e pentosi (xilosio
e arabinosio)
Richiede pretrattamento per eliminare l’eccesso
di anidride solforosa
Sweet wort:
15% di zuccheri (maltosio e destrine)
Siero di latte
Residuo del processo di caseificazione
Contiene lattosio (4-5%)
Fonte di carbonio diluita
Cellulosa
Residuo agro-industriale
Formata da unità di glucosio legate con legame β
Utilizzabile tal quale da un limitato numero
di microrganismi
Contiene il 5% circa di lattosio e viene utilizzato in
microbiologia industriale come substrato nutritivo
nella produzione di etanolo, acidi organici e biomasse microbiche
r amido e maltodestrine: l’amido viene ottenuto soprattutto da patate e mais, e risulta poco idrosolubile. Le maltodestrine (catene polimeriche di glucosio
con legame α-1,4-glicosidico e lunghezza variabile
da 3 a 17 unità di glucosio) si ottengono per idrolisi dell’amido dei cereali e delle patate in ambiente
acido e sono solubili in acqua: sono impiegate nei
substrati nutritivi per la produzione di antibiotici.
Le maltodestrine trovano impiego nell’alimentazione degli sportivi come supplemento e integratore
energetico per la pronta assimilazione e la facile digeribilità, dovuta alla labilità del legame glicosidico
fra le unità di glucosio (figura 3.3)
r fonti di carbonio non da carboidrati: si possono
utilizzare polialcoli come glicerolo, mannitolo e
sorbitolo; alcani come le paraffine, oli vegetali (da
semi di lino, mais, soia, cotone) e animali (olio di
lardo). Gli oli sono impiegati anche come agenti
antischiuma.
Poiché i principali carboidrati impiegati come substrato
nutritivo sono oligo- e polisaccaridi come il saccarosio,
l’amido, la cellulosa, nelle produzioni biotecnologiche è
indispensabile sottoporre tali polimeri glucidici a trattamenti specifici affinché siano mobilizzati i monosaccaridi utilizzabili dai microrganismi.
Fonti di azoto
L’azoto può essere ottenuto da (tabella 3.4):
r composti inorganici (sali di ammonio) e organici
(aminoacidi e proteine, urea)
r acqua di macerazione del mais. Sottoprodotto
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I PROCESSI BIOTECNOLOGICI
SORGENTI DI CARBONIO E RELATIVO
TRATTAMENTO
Le materie prime utilizzate nelle produzioni biotecnologiche come fonte di carbonio sono generalmente di
provenienza agricola e contengono saccarosio, amido
o cellulosa. Per poter rendere disponibile il glucosio
contenuto in questi materiali occorre procedere a pretrattamenti che hanno lo scopo di liberarlo dalle forme
polimeriche in cui è presente.
Il saccarosio è un disaccaride formato da glucosio
e fruttosio. Microrganismi come Saccharomyces cerevisiae e Zymomonas mobilis sono in grado di utilizzare
questo disaccaride poiché possiedono l’enzima invertasi che libera i due monosaccaridi componenti: con
questi microrganismi è quindi possibile impiegare direttamente barbabietole, canna da zucchero, melassi.
L’amido è costituito da amilosio e amilopectina:
il primo è un polimero lineare del glucosio (legame
α-1,4-glicosidico), l’amilopectina è un polimero simile
ma a struttura ramificata dovuta alla presenza di legami α-1,6 ogni 20-25 molecole di glucosio. Per ottenere
glucosio dall’amido si utilizza un trattamento che si
svolge in due fasi successive:
dell’estrazione di amido dal mais è sorgente, oltre che
di sostanze azotate, anche di vitamine del gruppo B. È
fornito in forma liquida concentrata o in polvere
r farina di semi di soia e di cotone. La soia viene coltivata per la produzione dell’olio dai semi, che dopo
il processo di estrazione forniscono come residuo
una farina ad alto contenuto proteico (50%) impiegata nell’alimentazione animale e come ingrediente
di substrati colturali in microbiologia industriale.
Derivati dei semi del cotone sono impiegati nei terreni per la produzione di antibiotici
r borlande di distilleria. Sono così chiamati i residui
della produzione di etanolo. Contengono terreno
esausto e cellule di lievito e forniscono proteine e
vitamine del gruppo B.
Fonti di vitamine
3
r gelatinizzazione e liquefazione, attraverso idratazione dell’amido e trattamento con α-amilasi.
Vengono idrolizzati i legami α-1,4 e si ottiene una
miscela di maltodestrine
r idrolisi delle maltodestrine, che si ottiene a pH
4,5 e a 60 °C ad opera di due enzimi: la glucoamilasi, che scinde i legami α-1,4 e α-1,6, e la pullulanasi,
che scinde solo quelli α-1,6.
I materiali legnosi contengono i polimeri del glucosio
cellulosa, emicellulosa e lignina. La cellulosa è formata da catene di glucosio unite da legami β-1,4-glicosidici
in catena lineare. L’emicellulosa è un polimero ramificato che contiene esosi (glucosio, galattosio, mannosio) e
pentosi (xilosio e arabinosio). I trattamenti per rendere
disponibili i carboidrati fermentabili comprendono un
trattamento fisico seguito da uno enzimatico, che utilizza le cellulasi endo-β-1,4-glucanasi, eso-β-1,4-glucanasi
che liberano cellobioso (dimero del β-glucosio) e quindi
le β-glucosidasi che idrolizzano il cellobioso a glucosio.
La lignina è un composto fenolico ad alto peso
molecolare, polimero composto da unità monomeriche fenilpropiliche.
di lievito, in quanto si può ottenere per la naturale
azione litica degli enzimi endocellulari dei lieviti in
condizioni controllate. L’estratto è ricco di aminoacidi, vitamine del gruppo B, glucosio e polisaccaridi
(glicogeno)
r peptoni: si ottengono per idrolisi di materiali proteici animali, quali carne, latte, caseina, e vegetali
(soia). Ingredienti pressoché universali dei terreni di
coltura in laboratorio, sono poco utilizzati in microbiologia industriale per i costi elevati.
Minerali
I minerali sono in genere forniti in quantità sufficiente
dall’acqua e dalle materie prime impiegate nella preparazione dei terreni colturali. Se necessario si possono
aggiungere sali di calcio, fosforo, potassio, cloro, magnesio.
Le fonti di vitamine possono provenire da (tabella 3.4):
r estratto di lievito: è denominato anche autolisato
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I PROCESSI BIOTECNOLOGICI
Tabella 3.4 Fonti di azoto in forma grezza, di vitamine e fattori di crescita
INGREDIENTE
ORIGINE
CARATTERISTICHE
Corn steep liquor
Acque
di macerazione
Sottoprodotto del processo di estrazione
dell’amido dal mais
Residuo acquoso in cui è stato immerso il mais
(pH 4 a 45-50 °C, per 48 h, in presenza di anidride solforosa). Si ha solubilizzazione delle sostanze azotate e
fermentazione lattica. Concentrazione fino al 50% s.s.
Fonte di sostanze azotate, minerali, vitamine (gruppo B)
Composizione variabile:
tUJQPEJNBJT
tUJQPEJþPSBMBUUJDBFJOUFOTJUËGFSNFOUB[JPOF
tUFNQPEJFTUSB[JPOF
tUFNQFSBUVSBEJFTUSB[JPOF
Svantaggio: conferisce forte acidità al terreno colturale
Si addiziona carbonato di Ca
Farine vegetali
Semi di soia
Residuo proteico ottenuto dal processo di estrazione
dell’olio (usato anche in mangimistica)
Contenuto di proteine 45-55%
Molto usate nelle fermentazioni industriali
Semi di cotone
(Proflo® e Pharmamedia®)
Residuo proteico sottoprodotto del processo
di estrazione di olio
Contenuto di proteine 50-55%
Farina impiegata in particolare per la produzione
di tetracicline
Dal processo di distillazione dell’etanolo
Contiene vitamine (niacina e inositolo),
proteine derivanti dal lievito e i nutrienti del terreno
colturale non utilizzati
Contenuto di proteine 25%
Residuo solubile
di distillazione (borlande)
Ingredienti particolari impiegabili prevalentemente quali fonti di vitamine e fattori di crescita
Estratto di lievito
In polvere o pasta, ottenuto per lisi delle cellule
di lievito; costi elevati
Ricco di fattori di crescita; impiegato in quantità
moderata
Idrolizzato
di caseina
Ottenuto per idrolisi acida o enzimatica; costi variabili
Impiegato per microrganismi esigenti
Azoto totale 8-13%; azoto amminico 6-7%
NaCl: i. acido 38%; i. enzimatico 3%
Ceneri: i. acido 40%; i. enzimatico 6%
Agenti antischiuma
Sistemi tampone
Sono sostanze ad azione tensioattiva che riducono la
tensione superficiale limitando la formazione di schiuma. Si impiegano oli naturali (che figurano già fra gli
ingredienti di normale impiego come sorgente di carbonio) o sintetici come il silicone o il polipropilenglicol, di costo elevato ma inerti dal punto di vista biologico.
I terreni colturali sono il più delle volte forniti di propri sistemi tampone, ma possono venire addizionati sali
inorganici per la correzione del pH, parametro di fondamentale importanza per la crescita dei microrganismi e la
migliore resa produttiva. I più comuni sono il carbonato
di calcio, se il sistema tende verso l’acidità, oppure i fosfati
se, al contrario, il substrato è troppo alcalino.
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I PROCESSI BIOTECNOLOGICI
Precursori
Si tratta di sostanze che vengono incorporate dai microrganismi e che andranno a formare parti della molecola
che il microrganismo è chiamato a produrre. In questo
modo la resa è altamente potenziata. L’esempio più noto
è costituito dall’acido fenilacetico precursore della molecola di penicillina G o dall’acido fenossiacetico, precursore della penicillina V.
3.3 I prodotti
I prodotti dell’attività microbica, compresi quelli ottenuti per bioconversione in cui i microrganismi svolgono
solo alcuni passaggi biosintetici, sono distinguibili in
metaboliti primari, metaboliti secondari, biomasse microbiche, enzimi, alimenti (prodotti complessi):
r metaboliti primari: essenziali per la vita delle cellule, vengono sintetizzati trasformando le sostanze
nutritive fonti di carbonio ed energia in molecole
indispensabili alle più svariate funzioni metaboliche,
lungo le vie biosintetiche e cataboliche del metabolismo centrale. La produzione di metaboliti primari
infatti si verifica soprattutto nella prima fase di crescita dei microrganismi (trofofase), in cui consumo
di substrato, di energia e crescita risultano strettamente associati, come nel caso della produzione di
etanolo, acido lattico e alcuni aminoacidi. Altri metaboliti primari come gli acidi citrico e fumarico vengono invece prodotti nella fase successiva a quella di
crescita (fase stazionaria o idiofase), in quantità generalmente proporzionale alla biomassa microbica
3
r metaboliti secondari: non risultano essenziali per
la vita delle cellule microbiche e non mostrano una
relazione diretta con la loro crescita. Sono il risultato
di biosintesi che si verificano nella fase di crescita rallentata o stazionaria e sono particolarmente diffusi
nei microrganismi del suolo e dei sedimenti (attinomiceti, batteri del genere Bacillus, funghi filamentosi). In alcuni casi i metaboliti secondari vengono
prodotti a partire da quelli primari, per cui spesso
risulta difficile tracciare una netta differenziazione,
così come non è chiaro dal punto di vista microbico
il significato della loro produzione. Possono svolgere funzioni di protezione da agenti fisici, agire come
segnali di comunicazione (quorum sensing) fra le cellule, o di antagonismo nei confronti di altri microrganismi. Molti metaboliti secondari hanno infatti
attività antimicrobica: in primo luogo gli antibiotici
prodotti dal metabolismo di muffe e batteri filamentosi (attinomiceti). Alcuni metaboliti secondari inibiscono specifiche attività enzimatiche, altri trovano
impiego come farmaci antitumorali, antivirali, antimicotici, antiparassitari, immunosoppressori, insetticidi, erbicidi (tabella 3.5)
r biomasse microbiche: sono rappresentate dai microrganismi stessi. L’aumento della biomassa (cioè
il promuovere al massimo la velocità di riproduzione microbica) costituisce in questo caso lo scopo
del processo in cui il prodotto si identifica con il
produttore. Il prodotto è il risultato di una intensa
attività catabolica di substrati nutritivi ad alta resa
energetica che forniscono l’energia necessaria alla
fase anabolica per la produzione di nuove cellule. Le biomasse microbiche vengono prodotte in
Tabella 3.5 Alcuni esempi di metaboliti secondari con applicazioni biotecnologiche
ATTIVITÀ
MOLECOLA
Antibatterica
Penicillina, tetraciclina, eritromicina, vancomicina, daptomicina
Antitumorale
Daunomicina, bleomicina, calicheamicina, mitomicina
Antifungina
Amfotericina, echinocandina
Immunosoppressiva
Ciclosporina, tacrolimus, rapamicina
Farmacologica
Lovastatina, acarbosio
Veterinaria
Avermectina, monensina
Agronomica
Poliossina, bialafos, blasticidina, spinosina
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I PROCESSI BIOTECNOLOGICI
Tabella 3.6 Esempi di prodotti complessi ottenibili per intervento microbico
PREPARAZIONI ALIMENTARI
CONSERVAZIONI ALIMENTARI
LAVORAZIONI DIVERSE
t#FWBOEFBMDPMJDIF
t7FHFUBMJGFSNFOUBUJ
(crauti, olive ecc.)
t.BDFSB[JPOFEJýCSFUFTTJMJ
(canapa, lino, iuta)
t"DFUP
t'PSBHHJJOTJMBUJ
t5SBUUBNFOUPEJSJýVUJMJRVJEJFTPMJEJ
t5JQJEJMBUUFGFSNFOUBUP
t4UBHJPOBUVSBEJDBSOJJOTBDDBUF
t1SPEPUUJDBTFBSJ
t$JCJPSJFOUBMJGFSNFOUBUJ
t5JQJEJMBUUFGFSNFOUBUP
quanto utilizzabili come tali in funzione del loro
contenuto o per la loro attività su alcuni substrati.
Nel primo caso ciò che interessa è il loro contenuto proteico e/o vitaminico e il loro utilizzo in questo senso è quello di integratori alimentari o veri e
propri sostituti di fonti nutritive temporaneamente
non disponibili (vedi per es. la produzione di SCP,
capitolo 4). Per estrazione si possono ottenere enzimi, lipidi, miscele proteico-vitaminiche, RNA. Nel
secondo caso, biomasse di saccaromiceti (Saccharomyces cerevisiae) vengono prodotte per essere utilizzate per la lievitazione naturale nel settore della
panificazione e dei prodotti da forno. Altri esempi
sono costituiti dai lieviti selezionati impiegati in
enologia e dalle colture starter di fermenti lattici
(in questo caso non si tratta di lieviti ma di batteri)
nell’industria lattiero-casearia. In campo ambientale è importante la produzione di colture di batteri azotofissatori (Rhizobacter, Azotobacter) per il
biorisanamento (ceppi di Pseudomonas in grado di
degradare gli idrocarburi), per la produzione di bioinsetticidi (endotossine ad azione antiparassitaria da
colture di Bacillus thuringiensis), per la depurazione
delle acque reflue con i fanghi attivi (concentrati di
aggregazioni flocculari polimicrobiche ad alta attività degradativa sulla materia organica)
r enzimi: costituiscono una parte importante dei
prodotti biotecnologici ottenibili dai microrganismi. Nel processo produttivo occorre tenere presente che diversi enzimi (microbici e non) sono
normalmente repressi e altri risultano inducibili,
cioè vengono sintetizzati esclusivamente in presenza dello specifico substrato. Gli enzimi prodot-
ti dai microrganismi sono numerosi e formano un
raggruppamento eterogeneo. Da E. coli si ottiene la
penicillina acilasi, da Bacillus amilasi e proteasi, da
Saccharomyces cerevisiae si ricava l’invertasi. In questo ambito le biotecnologie hanno aperto nuove e
ampie possibilità con le tecniche del DNA ricombinante che ha permesso il trasferimento di geni da
un organismo a un altro. Per esempio, enzimi termostabili alle alte temperature, prodotti in origine
da batteri termofili estremi di difficile coltivazione,
vengono ottenuti da ceppi mesofili nei quali è stato trapiantato lo specifico gene codificante: uno dei
batteri di più largo impiego in questi casi è E. coli.
Altri esempi sono forniti da enzimi amilolitici, da
lipasi e proteasi, dalla chimosina ottenuta da ceppi
ricombinanti di E. coli
r prodotti alimentari: in questi casi tutta la massa di
substrato si trasforma nel prodotto in cui, con l’eccezione delle bevande alcoliche, sono presenti anche i microrganismi responsabili (esempio tipico è
lo yogurt). Bevande e alimenti ottenuti per via biotecnologica vengono indicati anche come prodotti
complessi
r bioconversioni: non si tratta di un prodotto vero e
proprio quanto piuttosto di una modalità di utilizzo
di alcuni microrganismi, che possono essere vantaggiosamente impiegati facendo loro svolgere alcune
reazioni in processi che per la parte rimanente utilizzano sintesi chimiche. Ciò avviene per esempio
nella bioconversione degli steroidi (paragrafo 4.11)
e della vitamina C (paragrafo 4.7), prodotti ottenuti
mediante la combinazione di tecnologie chimiche e
microbiologiche.
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I PROCESSI BIOTECNOLOGICI
3
Tabella 3.7 Prodotti ottenibili da biomasse microbiche
PREPARAZIONI ALIMENTARI
Impiego
integrale
t'VOHIJTVQFSJPSJ
commestibili
t#JPNBTTFQFSEJFUFUJDB
t"MHIF
t#JPNBTTFQSPUFJDIF
per mangimistica
Impiego per t-JTBUJEJMJFWJUJ
estrazione t&TUSBUUJQSPUFJDPWJUBNJOJDJ
t-JQJEJ
t&O[JNJ
t3/"FEFSJWBUJ
LAVORAZIONI DIVERSE
Substrati
o ambienti complessi
t-JFWJUPQFSQBOJýDB[JPOF
t4UBSUFS
t'FSNFOUJMBUUJDJ
t$PMUVSFB[PUPýTTBUSJDJ
t$PMUVSFJOTFUUJDJEF
t7BDDJOJ
t$PMUVSFQFSGBOHIJBUUJWJ
Molecole particolari
t#JPNBTTFJNQJFHBCJMJJOCJPUSBTGPSNB[JPOJ
3.4 Fasi produttive: preparazione
dell’inoculo
In ogni processo definibile come biotecnologico intervengono almeno due componenti fondamentali: la materia prima che costituisce il substrato e i biocatalizzatori
con cui questo viene inoculato.
Le cellule, o gli estratti cellulari (biocatalizzatori),
hanno la funzione di trasformare, con la loro attività metabolica o catalitica, la materia prima e dare origine al
prodotto desiderato. Nel caso dell’impiego di cellule microbiche deve trattarsi di colture selezionate (ceppi microbici e colture pure) o rispondere, se si tratta di estratti
cellulari, a criteri di elevata purezza.
Le caratteristiche fondamentali di un ceppo microbico da impiegare in una produzione biotecnologica
sono:
r facilità di coltivazione e manipolazione
r assenza di qualsiasi carattere di patogenicità
r alta velocità di riproduzione
r elevata capacità produttiva (ceppo alto-produttore)
r stabilità genetica (bassa frequenza di mutazione).
Le sorgenti dei ceppi microbici sono le matrici ambientali (aria, acqua, suolo) oppure i materiali più disparati,
dovunque si presuma possano trovarsi sostanze nutritive utilizzabili da parte dei microrganismi. La natura del
substrato o della matrice da cui si opera il prelievo indirizza di per sé a una selezione dei ceppi microbici che vi
si potranno presumibilmente trovare: materiali ricchi di
zuccheri potranno fornire lieviti; ambienti anossici con
potenziale redox basso o negativo saranno popolati preferibilmente da batteri anaerobi; se si ricercano batteri in
grado di utilizzare idrocarburi sarà più probabile reperirli
presso pozzi petroliferi o impianti per la raffinazione del
petrolio. Le tecniche impiegate per la selezione (screening) di nuovi ceppi microbici o di varianti alto-produttive di ceppi noti vengono descritte nel paragrafo 2.9.
Una volta ottenuti i ceppi desiderati, questi possono
essere conservati per futuri utilizzi con la liofilizzazione
o il congelamento in azoto liquido a −178 °C, sistemi
che consentono una conservazione a lungo termine. Altre tecniche in uso per una conservazione a più breve
scadenza prevedono l’uso di colture in provetta ricoperte di olio di paraffina e conservate a 0-2 °C.
Dalle colture conservate con queste o altre tecniche
si preleva all’occorrenza un’aliquota da inoculare solitamente in provetta (slant), utilizzando un terreno agarizzato di composizione appositamente studiata e bilanciata e incubando la coltura in condizioni chimico-fisiche
ottimali. Da qui, attraverso successivi passaggi, prenderà
le mosse la preparazione dell’inoculo da utilizzare per la
semina nel fermentatore (scale-up).
3.5 Lo scale-up
Il trasferimento della coltura-starter da un microambiente come quello di una provetta da laboratorio a
contenitori della capacità di centinaia di migliaia di litri
utilizzati per la produzione industriale non può avvenire
troppo repentinamente, ma deve svolgersi in tappe suc39
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I PROCESSI BIOTECNOLOGICI
cessive nelle quali l’inoculo è trasferito in contenitori di
volume progressivamente maggiore. Ogni trasferimento è intervallato da un periodo di incubazione in condizioni accuratamente controllate. Una simile procedura
viene adottata per prevenire traumi nei meccanismi biochimici e fisiologici cellulari dovuti all’enorme differenza fra i due ambienti, che si potrebbero ripercuotere nel
ritardato avvio della crescita microbica, in un suo rallentamento o in un vero e proprio arresto. Il volume assai
elevato del fermentatore finale di produzione costringe
infatti le cellule microbiche a parametri vitali e di attività
ad alta disomogeneità, cui devono essere progressivamente abituate.
La procedura di scale-up si articola in più fasi (figura
3.4):
r la coltura selezionata viene seminata su slant (becco
di clarino)
Preparazione dell’inoculo e scale-up
Coltura
liofilizzata
Coltura in
provetta
Coltura liquida
da ∼ 5L
Fermentatore
vegetativo
Fermentazione
Acqua e
nutriente
Fermentatore
di produzione
Figura 3.4 Schema di scale-up e trasferimento
in fermentatore di produzione.
r la coltura viene trasferita dallo slant in altre provette
di terreno, questa volta liquido
r si semina quindi in contenitori di capacità più elevata, fino a travasare la brodocoltura in recipienti e
in condizioni operative equivalenti al fermentatore
finale ma di capacità non superiore al migliaio di litri
(minifermentatori)
r l’ultima fase prevede il trasferimento dal minifermentatore al bioreattore di produzione.
3.6 I fermentatori o bioreattori
I processi fermentativi vengono generalmente effettuati in coltura sommersa, cioè con biocatalizzatori in sospensione o in soluzione in un mezzo di coltura liquido.
I fermentatori o bioreattori sono generalmente di grandi
dimensioni, costruiti in acciaio inossidabile elettrolucidato, hanno forma cilindrica con aperture di ingresso e di
uscita asservite da valvole e sono dotati di numerosi sistemi di controllo (figura 3.5). Devono essere sterilizzabili e
poter operare in condizioni di asepsi interna durante l’intero processo produttivo. I fermentatori vengono riempiti
fino a circa 2/3 del proprio volume con la brodocoltura,
costituita dalle cellule microbiche e dal terreno di coltura,
oppure dagli enzimi e dal substrato. Devono essere dotati
di un sistema di agitazione meccanica o pneumatica per
un’ottimale omogeneizzazione del contenuto e un’uniforme distribuzione della temperatura. I bioreattori destinati alle trasformazioni aerobiche sono forniti di sistemi
di aerazione allo scopo di fornire la quantità di ossigeno
necessaria a mantenere a livelli elevati gli scambi fra aria e
fase liquida. I sistemi ad agitazione pneumatica permettono, con l’immissione di aria, sia di garantire un ambiente
aerobico che l’omogeneizzazione della brodocoltura.
La temperatura interna viene controllata e mantenuta costante attraverso sistemi di termostatazione,
ottenuti generalmente per mezzo della circolazione di
acqua calda o fredda in intercapedini che circondano il
reattore, oppure in serpentine immerse direttamente nel
terreno di coltura.
Le valvole che regolano ingressi e uscite possono essere di tipo automatico o manuale, per rispondere nel
modo più pratico alle necessità che si possono presentare nel corso del processo produttivo: immissione di
sostanze nutrienti dopo l’inoculo delle colture starter;
aggiunta di precursori, di sostanze tampone per la cor-
40
Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
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I PROCESSI BIOTECNOLOGICI
Motore
Nutrienti
Rivestimento di
raffreddamento
Agitatore
Prodotto
Figura 3.5 Schema di fermentatore ad agitazione
meccanica e relativi componenti.
rezione del pH; di sostanze antischiuma. Sui condotti
di uscita dei gas sono presenti inoltre valvole e manometri per il controllo della pressione interna del bioreattore. È previsto un condotto di uscita con valvola per
a)
l’eventuale prelievo di materiale allo scopo di effettuare
in itinere gli opportuni controlli sulle condizioni microbiologiche e biochimiche della brodocoltura. Il controllo on-line dei vari parametri di processo (temperatura,
pH, ossigeno disciolto, velocità di agitazione, pressione
interna, livello di schiuma, flusso di gas) viene effettuato per mezzo di appositi sensori, spesso immersi direttamente nel mezzo colturale, che confrontano i valori
dei parametri con quelli considerati ottimali e prefissati
(set point) facendo eventualmente intervenire le azioni
correttive.
I bioreattori possono essere classificati secondo criteri diversi:
r in base alla tipologia costruttiva
r in base ai sistemi di aerazione e di agitazione
r in base alle tecniche produttive (sistemi continui o
batch, discontinui, fed-batch).
Classificazione dei bioreattori in base
alla tipologia costruttiva
Un fermentatore viene detto monofasico se i costituenti
sono tutti in fase acquosa, multifasico se almeno uno di
questi è presente anche in fase solida o gassosa.
I bioreattori a letto fisso e a letto fluido sono detti
bifasici perché presentano una fase acquosa ed una fase
solida. Il bioreattore a letto fisso consta di una colonna
di materiale inerte su cui è stato immobilizzato il biocatalizzatore, e in cui la materia prima viene immessa
Terreno di coltura
b)
Letto fisso impaccato
Prodotti
Figura 3.6 Reattore a letto fisso. a) A riciclo totale; b) a flusso continuo.
41
Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
3
I PROCESSI BIOTECNOLOGICI
Come noto, le cellule microbiche vegetative vengono generalmente eliminate a temperature comprese fra i
50 e 60 °C per una decina di minuti; la distruzione delle
spore richiede invece una temperatura di 121 °C per 15
min. È opportuno ricordare che il concetto di sterilità a
volte non viene inteso in microbiologia industriale con
il significato assoluto di completa assenza di microrganismi, quanto con quello della massima riduzione possibile della flora microbica contaminante compatibilmente
con le esigenze operative di produzione. Il numero di
cellule e di spore che può teoricamente sopravvivere
diminuisce progressivamente con l’aumentare della
temperatura di trattamento: l’efficienza della sterilizzazione viene valutata come “probabilità di fallimento” e
di norma si opera su livelli pari a 10−3 o 10−4, cioè si definisce accettabile una procedura se un lotto ogni 1000 o
10 000 può risultare contaminato.
La sterilizzazione del terreno di coltura e quella del
fermentatore possono essere eseguite contemporaneamente oppure in due fasi separate. Nel primo caso si
procede alla sterilizzazione del fermentatore contenente il terreno di coltura impiegando vapore ad alta temperatura immesso indirettamente in un sistema chiuso
(intercapedine o serpentina) o direttamente nella brodocoltura. Il terreno va mantenuto in continua agitazione per consentire un uniforme scambio del calore. La
figura 3.9 mostra la relazione fra tempo di trattamento e
temperatura impiegata in relazione alle dimensioni del
fermentatore, sia per la fase di riscaldamento che per
quella successiva di raffreddamento.
La sterilizzazione separata prevede il trattamento
termico del fermentatore (vuoto) con immissione di
vapore ad alta temperatura. A sua volta il terreno viene
1 2
3
4
90
70
50
I processi di produzione biotecnologica sono riconducibili a tre tipologie principali:
r a lotti (fermentazione discontinua o batch)
r continui
r semicontinui (fed-batch).
Nei processi produttivi a lotti la coltura discontinua o
batch prevede il progressivo scale-up dell’inoculo iniziale
fino alla semina nel reattore di produzione, il mantenimento della coltura per un tempo prefissato e calcolato
per la massima resa produttiva, l’interruzione del processo e il recupero dei prodotti.
Il terreno di coltura viene sterilizzato separatamente,
quindi introdotto nel fermentatore già sterilizzato insieme con la coltura microbica selezionata per la produzione o con il catalizzatore biologico. Il processo viene
avviato e monitorato nelle variabili fondamentali per
1 → 200 L
2 → 500 L
3 → 5000 L
4 → 50 000 L
90
70
1
2
3
4
50
0
a)
3.8 Processi batch, continui,
fed-batch
110
Temperatura (°C)
Temperatura (°C)
110
sterilizzato nel serbatoio in cui è stato preparato, quindi inviato al fermentatore sterile. La tecnica di sterilizzazione maggiormente impiegata è quella HTST (high
temperature short time), che prevede il riscaldamento del
terreno di coltura fino a 135-150 °C per alcuni minuti,
quindi il suo raffreddamento a 60 °C e infine l’immissione nel bioreattore precedentemente sterilizzato.
L’aria deve essere sterilizzata prima di essere immessa nel bioreattore: vengono utilizzati filtri a captazione
in materiale fibroso (lana di vetro) oppure a cartuccia in
materiale polimerico come polipropilene o poliamide.
20
40
60
80
Tempo (min)
Fase riscaldamento
100
0
b)
20
40
60
80
100
Tempo (min)
Fase raffreddamento
Figura 3.9 Temperature e tempi di sterilizzazione in relazione alle dimensioni del fermentatore. a) Andamento della fase di
riscaldamento; b) andamento della fase di raffreddamento.
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I PROCESSI BIOTECNOLOGICI
controllare il regolare svolgersi della reazione (temperatura, pH, presenza di schiuma, regime del flusso d’aria
nei processi aerobi). Quando il prodotto ha raggiunto
la concentrazione prevista, il processo viene arrestato, si
eliminano il terreno esaurito e il biocatalizzatore (cellule microbiche o enzimi) e si recupera il prodotto finale.
Naturalmente, nel caso sia la biomassa ciò che interessa,
avviene il contrario. Si dà quindi inizio al nuovo lotto di
produzione. È ovvio che in questo caso il biocatalizzatore va rinnovato ad ogni nuovo ciclo produttivo. È il
sistema più diffuso, sia per la relativa semplicità delle
apparecchiature che per l’ottimizzazione che tale tecnica ha subìto nel tempo. La resa in un processo batch è
rappresentata dalla percentuale di substrato trasformata
in biomassa e/o in prodotto, e può essere valutata solo al
termine del processo. Il coefficiente di resa (Y) indica
la quantità di cellule o di prodotto per unità di peso di
substrato.
I processi in continuo vengono condotti rifornendo
il sistema di reazione di sostanze nutritive in modo continuo con una velocità accuratamente programmata per
ottimizzare l’efficacia delle reazioni metaboliche dei microrganismi. Nello stesso modo vengono prelevati i prodotti della reazione. Queste tecniche prevedono quindi
il rifornimento continuo di nutrienti e la sottrazione di
prodotto, mentre al contrario il biocatalizzatore viene
conservato e rimane sempre all’interno del fermentatore. Ciò rappresenta un vantaggio ma ha la contropartita
di un probabile progressivo deterioramento di qualità
ed efficienza del biocatalizzatore, che si cerca di salvaguardare tramite riciclaggio o immobilizzazione. Con
il riciclaggio il biocatalizzatore può essere recuperato
ma risulta difficile separarlo dalla massa complessiva del
prodotto. L’immobilizzazione rappresenta perciò il più
delle volte la scelta preferenziale (paragrafo 3.9).
Le colture continue (definite anche sistemi aperti) permettono di annullare pressoché completamente
i tempi morti tipici dei sistemi batch (sistemi chiusi),
di utilizzare reattori di capacità inferiore e quindi di più
agevole controllo, nonché di studiare l’influenza di singoli componenti del terreno di coltura. Per avere maggiore produttività si può passare da impianti monostadio, che utilizzano un unico reattore, alla realizzazione
di impianti multistadio, costituiti da più reattori in cascata. Un ulteriore vantaggio dei sistemi multistadio è
dato dalla possibilità di utilizzare reattori di volume e
con tempi di residenza progressivamente maggiori, cia-
3
scuno operante con flora microbica specializzata: sistemi simili vengono impiegati nel trattamento biologico
di reflui industriali di difficile depurazione come quelli
provenienti da raffinerie.
I sistemi continui possono essere classificati in due
diverse tipologie a seconda dei sistemi tecnologici di
controllo, che sui fermentatori di questo tipo possono
essere effettuati in ingresso all’impianto, in uscita, oppure sia in ingresso che in uscita:
r nel primo caso (controlli in ingresso) il fermentatore prende il nome di chemiostato, un tipo di
reattore in cui la velocità di crescita è controllata
dall’esterno dalla velocità di immissione nel sistema
di reazione di un substrato limitante (generalmente
la fonte di carbonio). Un apposito strumento determina (mediante misura della densità ottica) la concentrazione del nutriente che agisce come fattore
limitante, mentre le altre sostanze vengono immesse
in eccesso. Il prototipo di questa tecnologia è costituito dal chemiostato monostadio. Un simile impianto però porta alla fuoriuscita, insieme al prodotto finale, di una notevole concentrazione di sostanze
nutrienti non utilizzate (quelle immesse in eccesso)
che andrebbero perciò perdute. Queste possono essere recuperate predisponendo un sistema multistadio. Un chemiostato quindi esercita un controllo in
ingresso sui nutrienti (figura 3.10a)
r nel turbidostato non sono previsti substrati limitanti e tutti i nutrienti sono forniti in eccesso. Il
bioreattore è dotato di uno strumento che misura la
torbidità del flusso in uscita, indice della riproduzione microbica (biomassa cellulare). Il turbidostato
effettua quindi un controllo in uscita sulla biomassa
(figura 3.10b).
Un sistema con funzionamento semicontinuo (fedbatch) si differenzia dal sistema batch in quanto, se in
quest’ultimo tutto il substrato nutritivo viene immesso
nel fermentatore prima dell’inizio del processo, nel sistema fed-batch il terreno di coltura viene introdotto in
un primo tempo in quantità limitata, indicata con V0 e
pari a circa 1/10 del volume massimo (Vm). Raggiunta
la fase logaritmica della curva di accrescimento, viene
immesso un flusso costante di terreno fresco senza però
procedere parallelamente allo scarico di materiale. Raggiunto un volume di riempimento prestabilito, si procede allo svuotamento che può essere totale (fed-batch a
45
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I PROCESSI BIOTECNOLOGICI
mero in forma solubile, quindi si provoca la gelificazione
del polimero che ingloba le cellule. Si può procedere con
modificazioni ioniche o termiche. Per esempio, l’alginato è un polimero solubile in acqua come sodio alginato
ma gelifica in presenza di cationi bivalenti o trivalenti.
L’agarosio è liquido a 80 °C, gelifica a 45 °C.
Gli enzimi vengono immobilizzati con tre tecniche
principali:
r legandoli a un supporto
r aggregandoli fra di loro (enzimi crosslinked)
r con l’intrappolamento.
3.10 I sistemi di controllo
I processi microbiologici, coinvolgendo organismi viventi, sfuggono il più delle volte a una standardizzazione matematica che ne possa esprimere compiutamente l’andamento, tante e tanto diverse sono le variabili e i parametri
in gioco. In microbiologia industriale uno degli aspetti
fondamentali è rappresentato dalla standardizzazione e
ripetitività dei processi per ottenere caratteristiche costanti del prodotto finale, condizione che si può realizzare
esclusivamente esercitando un continuo controllo nonché opportuni interventi di regolazione dei parametri in
gioco. Quelli di importanza strategica sono:
r la temperatura
3
r l’immissione di aria, la sua concentrazione e la sua
pressione
r la concentrazione di ossigeno disciolto nella brodocoltura
r la concentrazione di CO2
r il pH.
Accanto a questi, altre variabili vengono monitorate ed
eventualmente corrette quando se ne ravvisi la necessità,
relativamente alle caratteristiche dello specifico processo
produttivo:
r la formazione di schiuma
r la viscosità della brodocoltura
r la concentrazione dei nutrienti
r la concentrazione dei prodotti del metabolismo microbico
r la concentrazione della biomassa.
I controlli vengono effettuati con tecnologie più o meno
sofisticate in modalità off-line e on-line.
I controlli off-line, relativi soprattutto al controllo
dei parametri biologici (concentrazione della biomassa), vengono effettuati all’esterno del fermentatore in
ambiente non sterile e si rivelano utili per la conferma
dei dati desunti dalle misure in situ (tabella 3.8).
Le misure on-line riguardano in particolare temperatura, pH, concentrazione di ossigeno, di CO2 e di
Tabella 3.8 Metodi off-line per la determinazione della biomassa
METODO
TIPO DI MISURAZIONE
COMMENTI
Sedimento cellulare
Altezza del sedimento in un volume noto
Veloce ma approssimativo
Peso secco
Peso del materiale in sospensione
in un volume noto dopo essiccamento
Non utilizzabile in terreni contenenti particelle solide
Densità ottica
5PSCJEJUË
Necessità di diluizioni e non utilizzabile in
terreni contenenti solidi
Microscopia
Conta diretta delle cellule in apposite camere
Elevato impegno degli operatori,
possibilità di automazione mediante analisi
d’immagine
Coulter counter
Numero di particelle che attraversano un
capillare
Distribuzione anche volumetrica delle
cellule, non utilizzabile con organismi filamentosi o a cellule molto piccole
Metodi chimici
e fluorescenti
Misurazione della quantità di componenti della
CJPNBTTB %/" 3/" QSPUFJOF "51 /"%FDD
Conta su piastra
Numero di colonie che si sviluppano dopo
apposite diluizioni
Misura delle sole cellule in grado
di riprodursi, lunghi tempi di incubazione
47
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3
I PROCESSI BIOTECNOLOGICI
Tabella 3.9 Esempi di applicazioni on-line della flow injection analysis (FIA)
COMPOSTO
SISTEMA DI ANALISI
RILEVAZIONE
Glucosio
Glucosio ossidasi (membrana)
Glucosio ossidasi (cartuccia)
Elettrodo H2O2/O2
Chemioluminescenza (rilevazione H2O2 con Luminol)
Glucosio ossidasi + catalasi
Perossidasi (cartuccia)
Saggio enzimatico
Fotometro
Glucosio deidrogenasi
+ mutarotasi + indicatore redox
Fotometro
β-galattosidasi
Glucosio ossidasi (cartuccia)
Elettrodo O2
Lattosio
Lattato
Lattato ossidasi (cartuccia)
Elettrodo O2
Ammonio
/B0)&%5" NFNCSBOF
5SBUUBNFOUJDIJNJDJ
Gas-sensori di NH3
Fotometro
Urea
Ureasi (cartuccia)
Gas-sensori di NH3
Fosfato
5SBUUBNFOUJDIJNJDJ
Fotometro
Penicillina G e V
Penicillinasi (cartuccia)
Penicillina amidasi (cartuccia)
Saggio enzimatico, elettrodo pH
Saggio enzimatico
Proteine
Biureto, bradford
Fotometro
Aminoacidi
5SBUUBNFOUJDIJNJDJ
Fluorimetro
alcuni ioni che devono essere misurati direttamente
con sistemi in situ o che permettono il prelievo sterile
di campioni. I controlli on-line sono effettuati in tempo
reale per mezzo di rivelatori a diretto contatto con la biomassa, spesso realizzati con biosensori.
I biosensori sono costituiti da supporti su cui vengono immobilizzati cellule, enzimi, biomolecole. Sono
sistemi di controllo funzionanti in base all’integrazione
di una componente biologica con una componente
elettronica impiegata come trasduttore di segnale. La
componente biologica può essere costituita da enzimi,
antigeni, anticorpi, cellule, biomolecole, che devono in
ogni caso essere fissate (immobilizzate) su di un supporto inerte (silicio, polimeri particolari, silicone ecc.).
I trasduttori possono essere costituiti da elettrodi, transistor, fibre ottiche, cristalli piezoelettrici. Se il componente biologico subisce modificazioni biochimiche intervenute in seguito a particolari reazioni, queste sono
captate dal trasduttore che, a seconda della propria natura, reagisce segnalando in qualche modo la variazione
intervenuta. Si distinguono biosensori elettrochimici
(impiegati per rilevare variazioni di potenziale redox)
termici (rivelano variazioni di temperatura), elettronici (realizzati con semiconduttori, registrano variazioni
di proprietà elettroniche successive a reazioni enzimati-
che), fotonici (sensibili a variazioni dell’intensità luminosa in seguito a reazioni fotochimiche).
La regolazione di una variabile viene effettuata in
modo continuo o discontinuo. La regolazione continua
è quella più efficace, poiché è quantitativamente dosabile in risposta all’entità della variazione che subisce la
variabile. La regolazione discontinua è invece più grossolana e consiste in interventi di stop and go, off-on,
apri-chiudi da effettuarsi quando il valore controllato si
allontana da quello ottimale.
La metodologia FIA (flow injection analysis) è ampiamente utilizzata nei controlli on-line e off-line, e consiste nel prelievo di campioni liquidi che vengono inviati
a sistemi automatici di misurazione di parametri su prodotti e substrati (tabella 3.9).
La formazione di schiuma può causare problemi
anche seri di inquinamento, perdita di materiale per risalita nel condotto di scarico dei gas, diminuzione della resa di processo. Sensori appositamente progettati
con sonde e galleggianti inviano un segnale di allarme
quando la schiuma raggiunge il livello critico: si attiva
così un sistema di pompa che immette nel bioreattore
la quantità necessaria di agente antischiuma. Per eliminare la schiuma si possono usare sistemi chimico-fisici o
meccanici. Nel primo caso vengono immessi nel siste-
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I PROCESSI BIOTECNOLOGICI
ma sostanze in grado di ridurre la tensione superficiale
come oli o siliconi sterili. I sistemi meccanici si basano
sull’azione di agitatori che centrifugano la schiuma. La
regolazione della temperatura, estremamente importante nei processi microbiologici, si può realizzare con
intercapedini esterne dove viene fatto circolare il liquido
che serve per la termoregolazione oppure con serpentine interne. Un metodo più sofisticato prevede la circolazione della brodocoltura in uno scambiatore a piastre
esterno al fermentatore.
3.11 Il recupero dei prodotti
(downstream)
Ai fini delle modalità di recupero, i prodotti delle
trasformazioni biotecnologiche possono essere distinti in:
r biomasse microbiche
r metaboliti extracellulari (molti antibiotici, alcuni enzimi, acidi organici, acido citrico, etanolo, polisaccaridi, aminoacidi)
r metaboliti intracellulari (acidi nucleici, vitamine, enzimi, alcuni antibiotici).
Le procedure per isolare i prodotti ottenuti dalle trasformazioni microbiche sono più o meno complesse
in funzione della tipologia del metabolita che si vuole
recuperare, e influenzano in modo consistente le rese di
processo.
In linea schematica, al termine di un processo mediato da microrganismi si avrà una brodocoltura in cui si
trovano sia le cellule microbiche che il terreno di coltura
ormai esaurito. Si deve procedere quindi in primo luogo
alla separazione della biomassa dal brodo di coltura residuo. La separazione delle cellule si può effettuare per
centrifugazione o per filtrazione: il primo metodo è
preferibile per i microrganismi unicellulari, il secondo
per quelli filamentosi.
Quando l’obiettivo del processo è il recupero della
biomassa, la separazione delle cellule costituisce l’evento finale e lascia come prodotto residuo da eliminare il
terreno di coltura esaurito. In questo caso risultano generalmente sufficienti semplici operazioni di separazione e lavaggio. Per i prodotti alimentari come lo yogurt
non è necessario in genere procedere alla separazione
del prodotto, che costituisce un tutto unico con il sub-
3
strato modificato dall’attività microbica. Nel caso delle
bevande alcoliche si procede invece alla separazione e
all’allontanamento della biomassa.
Quando invece l’obiettivo è rappresentato dal recupero di metaboliti, naturalmente è la biomassa che viene eliminata (o piuttosto utilizzata come sottoprodotto
in altre linee produttive) per procedere poi alla separazione e purificazione dal filtrato colturale, utilizzando
tecniche diverse. Nel caso degli antibiotici molto spesso i prodotti naturali vengono ulteriormente modificati
chimicamente (antibiotici semisintetici).
È inoltre opportuno distinguere fra metaboliti intraed extracellulari, in quanto naturalmente le strategie di
recupero dei prodotti devono in questo caso tenere conto della loro localizzazione:
r nel caso dei metaboliti extracellulari primari (per
es. acido lattico o acido citrico) o secondari (antibiotici), o dei prodotti che si ottengono per biotrasformazione (per es. acido gluconico), si procede alla
separazione del filtrato contenente il prodotto dalle
cellule e dagli altri residui insolubili, quindi all’estrazione, concentrazione e purificazione del prodotto.
Gli enzimi extracellulari, prodotti dai microrganismi
ed escreti nel mezzo colturale, si recuperano agevolmente dal terreno di coltura come frazione delle proteine presenti
r nel caso dei metaboliti endocellulari (enzimi e acidi nucleici) occorre naturalmente procedere preventivamente alla rottura degli involucri cellulari.
Il recupero dei metaboliti endocellulari può essere effettuato in modi diversi, in relazione alle caratteristiche
delle cellule e a quelle del metabolita che si intende recuperare. Le sostanze a basso peso molecolare vengono
fatte fuoriuscire dagli involucri cellulari con trattamenti
acidi o basici o con solventi idrosolubili. I metaboliti
macromolecolari non riescono in ogni caso a fuoriuscire, quindi si deve procedere alla rottura delle cellule. Le
metodologie impiegate posso essere diverse:
r le tecniche meccaniche impiegano ultrasuoni, sferette di materiale rigido, presse, omogeneizzatori (figura 3.12)
r i mezzi fisici impiegano cicli ripetuti di congelamento e scongelamento o la disidratazione
r i metodi biologici utilizzano enzimi e antibiotici
che inibiscono la sintesi della parete cellulare. Gli
enzimi impiegati si differenziano in base al tipo di
49
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3
I PROCESSI BIOTECNOLOGICI
Cellule
disintegrate
cellule: nel caso di batteri si impiegano lisozima,
glicosidasi, endopeptidasi e proteasi; con i lieviti si
utilizzano miscele enzimatiche di glucanasi, proteasi
e mannanasi
r i mezzi chimici consistono nello shock osmotico,
nell’uso di acidi e basi, di solventi e detergenti.
Sospensione
cellulare
Non è comunque possibile riunire in uno schema valido
per tutti i processi biotecnologici le fasi operative per il
recupero e la purificazione dei prodotti, né organizzarle
in una sequenza preordinata: non sempre tutte le fasi si
rivelano necessarie e non sempre si svolgono nella stessa
Figura 3.12 Omogeneizzatore per la disintegrazione
di cellule.
FLOCCULAZIONE, FLOTTAZIONE
E PROCESSI A MEMBRANA
La flocculazione consiste nella formazione di aggregati
cellulari che sedimentano o rendono più facile la filtrazione. Diversi ceppi microbici tendono naturalmente a
flocculare (è un caratteristica di alcuni lieviti), ma il processo può essere accelerato modificando il pH, aggiungendo elettroliti che annullano o diminuiscono la forza
di repulsione fra cellule, polimeri sintetici (acrilammide) o naturali (amido, cellulosa, alginati).
La flottazione è un processo che permette di separare particelle in sospensione in un liquido quando
vengono messe a contatto con un gas (aria). Se si immette aria in una brodocoltura i microrganismi vengono adsorbiti sulle bolle di gas e risalgono in superficie.
In questo modo la biomassa risale verso la parte alta
del fermentatore insieme con la schiuma, che viene
poi allontanata (figura 3.13). La flottazione può essere
favorita dall’addizione di acidi grassi a lunga catena e
ammine. Nella produzione della birra, i ceppi di lieviti ad alta fermentazione flottano spontaneamente. Un
altro esempio di flottazione riguarda la rimozione dei
fanghi superficiali nella depurazione delle acque reflue.
I processi a membrana separano i componenti di
una miscela facendoli passare attraverso una membrana selettiva che separa il retentato (fase trattenuta) dal
permeato (fase che riesce ad attraversare la membrana). La forza responsabile della separazione può essere
meccanica (pressione idrostatica) o l’applicazione di
un campo elettrico; il diametro dei pori e la direzione
del flusso (ortogonale o tangenziale) differenziano le
varie tipologie di progetto.
Alimentazione
Raschiatore
Uscita liquido
Ricircolo
Coadiuvante
Aria
compressa
Spurgo
Materiale
flottato
Serbatoio di
pressurizzazione
Acqua
pressurizzata
Figura 3.13 Schema di un flottatore.
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I PROCESSI BIOTECNOLOGICI
successione. L’elenco seguente ha quindi solo carattere
orientativo. Si procede generalmente con (figura 3.14):
r trattamenti preliminari: consistono, per esempio,
nel provocare lisi cellulare per il recupero di metaboliti endocellulari
r separazione solido-liquido: si effettua per separare
la biomassa e le sostanze solide eventualmente presenti dal substrato colturale. Vengono impiegate a
questo scopo tecniche di centrifugazione, sedimentazione, filtrazione, flocculazione e flottazione
r concentrazione/purificazione: il prodotto desiderato viene separato da altre componenti con caratteristiche grossolanamente diverse dal punto di vista
chimico-fisico. Le tecniche di più comune impiego
sono la precipitazione, l’evaporazione, i processi a
membrana
r purificazione mirata ad alta risoluzione: permette
di isolare il prodotto da altre sostanze molto simili.
Si impiegano tecniche cromatografiche ed elettroforetiche
r formulazione finale: risponde a esigenze di commercializzazione del prodotto, che può venire per
esempio liofilizzato, essiccato o cristallizzato.
Isolamento del prodotto
Filtrazione o centrifugazione
Brodo
Biomassa
Separazione tramite
precipitazione, adsorbimento
o estrazione
Lavaggio
Prodotto
grezzo
Brodo
esausto
Essiccamento
Prodotto
finito
Smaltimento
dopo la
depurazione
Alimento
o mangime
Figura 3.14 Schema di isolamento del prodotto finale.
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ESERCIZI DI VERIFICA
1. Rispondi alle seguenti domande:
In un processo biotecnologico cosa indicano i
termini upstream e downstream?
Quali sono i criteri per la scelta di un substrato?
Cosa sono i mutanti auxotrofi e quale problema
fondamentale deriva dal loro utilizzo?
Quali sostanze si usano generalmente in microbiologia industriale come fonte di carbonio?
Cosa sono i precursori? Sei in grado di fare
qualche esempio?
Qual è la differenza fra metaboliti primari e secondari?
Cosa si intende per scale-up?
Che cosa si intende per bioreattore a letto fluido?
Sei in grado di illustrare la differenza fra un sistema continuo, a lotti e fed-batch?
Come si possono immobilizzare i biocatalizzatori?
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PRODOTTI OTTENUTI DA
PROCESSI BIOTECNOLOGICI
4.1 Biomasse microbiche
4.2 Acidi organici
4.3 Etanolo
4.4 Aminoacidi
4.5 Enzimi
4.6 Vitamine
In questo capitolo vengono trattati alcuni dei prodotti ottenuti da trasformazioni biotecnologiche:
r biomasse microbiche, impiegate integralmente per
il loro contenuto oppure in funzione della loro attività su specifici substrati
r derivati dal metabolismo primario, cioè prodotti
intermedi o finali del metabolismo energetico fermentativo o ossidativo: acidi organici (lattico, acetico, citrico), alcoli e polialcoli (etanolo, glicerolo),
aminoacidi, vitamine ed enzimi
r antibiotici, derivati dal metabolismo secondario o
di biosintesi, accumulati prevalentemente nella fase
stazionaria di crescita microbica.
Altre produzioni biotecnologiche sono trattate nel capitolo 5:
r prodotti da ricombinazione genetica (insulina, interferone, eritropoietina, HGH, somatostatina, vaccini,
anticorpi monoclonali)
r prodotti ottenuti da bioconversioni (ormoni steroidi)
r molecole di elevato interesse nei settori medico-farmacologico, agrario e zootecnico.
Tabella 4.1 Esempi di metaboliti primari
Acidi organici (lattico, butirrico, propionico, acetico, citrico, fumarico
ecc.)
Aminoacidi e loro intermedi
(acido glutammico, lisina ecc.)
Alcoli (etanolo)
Polialcol (glicerolo, mannitolo ecc.)
Carboidrati
Vitamine
Nucleotidi e acidi
nucleici
Lipidi
Proteine
Colonia del lievito Saccharomyces cerevisiae (Dennis Kunkel
Microscopy, Inc.).
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PRODOTTI OTTENUTI DA PROCESSI BIOTECNOLOGICI
Sono trattate nel capitolo 6 le produzioni biotecnologiche alimentari, note anche come prodotti complessi.
4.1 Biomasse microbiche
Il termine biomasse microbiche indica colture di microrganismi che costituiscono esse stesse il prodotto del
processo biotecnologico. Sono ottenute per essere utilizzate come tali in funzione del loro contenuto come
fonte alternativa di proteine e vitamine, nell’alimentazione umana e animale. Gli studi per l’impiego alimentare di Saccharomyces cerevisiae risalgono all’epoca
della seconda guerra mondiale, quando alcuni Paesi dovettero far fronte alle difficoltà di approvvigionamento
di fondamentali derrate alimentari.
Le biomasse microbiche trovano un altro importante campo di impiego, in funzione della loro attività,
come colture selezionate e starter nella produzione del
pane e dei prodotti da forno, nell’industria enologica e
delle bevande alcoliche, nel disinquinamento ambientale, come colture insetticide. Biomasse microbiche vengono anche utilizzate per l’estrazione di componenti
chimici quali enzimi, vitamine, acidi nucleici, lipidi. Le
biotecnologie del DNA ricombinante hanno dato notevole impulso a questi specifici settori di ricerca.
Biomasse microbiche possono essere ottenute da
batteri, lieviti e muffe, in relazione agli obiettivi che si
vogliono perseguire e ad altre considerazioni econo-
miche e di ordine igienico-sanitario. In genere i batteri
possono fornire un discreto contenuto in aminoacidi; i
lieviti forniscono un buon contenuto proteico e in vitamine del gruppo B; le muffe hanno un buon contenuto
proteico, ma alcuni ceppi producono micotossine.
Single cell proteins
Le biomasse ad elevato contenuto proteico rappresentano una produzione biotecnologica di particolare interesse. Il termine SCP (single cell proteins) indica microrganismi unicellulari impiegati come fonte proteica. L’idea
di utilizzare i lieviti come fonte alternativa di proteine
nell’alimentazione umana risale agli anni del secondo
conflitto mondiale, ma solo negli anni ’60 del XX secolo
furono condotte ricerche mirate per ottenere proteine da
microrganismi, allora molto costose, da fonti a quel tempo economicamente convenienti come il petrolio o altri
idrocarburi. Furono progettati e realizzati impianti per la
loro produzione ma il mutamento delle condizioni economiche e i forti dubbi di ordine tossicologico sollevati
dall’impiego dei derivati del petrolio hanno fatto sì che
simili tecnologie rimanessero in gran parte allo stadio pilota. La tabella 4.2 elenca alcuni di questi processi.
Come si può notare dalla tabella 4.3, è possibile utilizzare tipi diversi di microrganismi per la produzione di
SCP, ognuno dei quali presenta aspetti più o meno vantaggiosi.
Tabella 4.2 Processi per la produzione di SCP
PROCESSO
E NAZIONALITÀ
MATERIA PRIMA
MICRORGANISMO
Pruteen (GB)
(batteri)
Metanolo
Methylophylus methylotrophus
Bio Protein (N)
(batteri)
Metano
Methylococcus capsulatus
Protibel (F)
(lieviti)
Siero di latte
Kluvieromyces lactis
Kluvieromyces marxianus
Symba (S)
(lieviti)
Residui amilacei dalle patate
Saccharomycopsis fibuligera
Candida utilis
Pekylo (FL)
(muffe)
Residui lavorazione legname, addizionato
di melasso o siero di latte
Paecilomyces variotii
Giappone, Messico, Taiwan
(alghe)
Terreno sintetico (acqua, CO2, sali minerali)
in ambiente a elevata illuminazione
Spirulina, Chlorella
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Tabella 4.3 Vantaggi e svantaggi nell’impiego di microrganismi diversi per la produzione di SCP
MICRORGANISMI
VANTAGGI
SVANTAGGI
Alghe
Autotrofia
Facile reperibilità delle materie prime
Condizioni ambientali particolari
(acqua, luce)
Difficoltà di estrazione dall’ambiente
Contenuto proteico basso
Batteri
Facile reperibilità delle materie prime
Facilità di adattamento
Elevata velocità di riproduzione
Elevato contenuto proteico
Elevato contenuto di acidi nucleici
Produzione di sostanze tossiche
Lieviti
Buon contenuto proteico
Elevato contenuto di vitamine
Facilità di separazione
Limitata velocità di riproduzione
Muffe
Facilità di accrescimento
Buon contenuto proteico
Bassa velocità di riproduzione
L’impiego di batteri dà origine a biomasse ad alto
contenuto proteico (fino all’80%) ma contemporaneamente anche ad acidi nucleici, con il pericolo di problemi metabolici nell’alimentazione umana e animale.
L’ampio range di pH nella coltivazione dei batteri (5-7)
può inoltre facilitare le contaminazioni.
Le biomasse ottenute da lieviti corrono rischi inferiori di contaminazione per l’azione selettiva del pH
(3,5-5) e sono recuperabili con minore difficoltà rispetto ai batteri, che hanno dimensioni notevolmente inferiori. Hanno un buon contenuto proteico (fino al 60%)
e una percentuale di acidi nucleici inferiore a quella delle biomasse batteriche. Sono anche un’ottima fonte di
vitamine.
Le muffe richiedono tempi di sviluppo più lunghi e
si sviluppano in un ampio intervallo di pH; in genere si
opera a pH inferiore a 5 per evitare contaminazioni batteriche. Il contenuto proteico è buono (fino al 50%) ma
nella parete cellulare può essere presente la chitina, che
risulta di digestione assai difficile. Poiché diverse muffe
producono micotossine, occorre porre attenzione nella
scelta del ceppo da selezionare. Come substrati colturali
possono essere utilizzati il metano, gli alcani, il metanolo, l’etanolo, il siero di latte, il melasso da barbabietole
e canna da zucchero, residui della lavorazione di riso e
mais e delle cartiere.
L’utilizzo delle n-paraffine che residuano dalla raffinazione del greggio potrebbe rappresentare una soluzione al loro riciclaggio ma, nella biomassa, possono essere
presenti residui cancerogeni e tossici. Vengono quindi
utilizzati soprattutto siero di latte, melassi e gli alcoli etilico e metilico.
L’impiego di SCP riguarda soprattutto l’integrazione
proteica nell’alimentazione umana e animale.
Lievito per panificazione
Il microrganismo utilizzato per la panificazione è il lievito Saccharomyces cerevisiae. I lieviti possono attuare sia
un metabolismo fermentativo che respiratorio: il metabolismo ossidativo (figura 4.1) porta alla produzione di
biomassa (la più alta resa energetica incentiva la riproduzione cellulare) che poi viene utilizzata nell’industria
dei prodotti da forno per ottenere la lievitazione naturale dell’impasto di farina e acqua, con produzione di
CO2 e modeste quantità di etanolo che evapora durante
la cottura. Un parametro di cui occorre tenere conto in
questo tipo di produzione è rappresentato dalla concentrazione del substrato nutritivo zuccherino che deve risultare inferiore a 50 g/L per non incorrere in un effetto
inibitore noto come effetto Crabtree: in condizioni di
aerobiosi il metabolismo respiratorio-ossidativo viene
inibito da concentrazioni zuccherine superiori a 50 g/L.
A tali concentrazioni il substrato stesso esplica un’azione di repressione della sintesi degli enzimi del ciclo di
Krebs o ne blocca l’attività. Se anche si fornisce ossigeno, prevale comunque il metabolismo fermentativo con
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Saccarosio
(melasso)
Glucosio-6-fosfato
Coltura di laboratorio in agar malto
Fruttosio-6-fosfato
Coltura in liquido 5 L
Piruvato
Fermentatore 100 L
Ossigeno
CO2
CICLO DI KREBS
CO2
ATP
BIOMASSA
CELLULARE
Prestadi successivi (rapporto 1/5-1/10)
i primi stadi in parziale anaerobiosi
gli ultimi in aerobiosi
Figura 4.1 Biochimismo della produzione di lievito.
la riossidazione per via fermentativa del NADH formato
nella glicolisi.
La produzione di lievito per panificazione avviene in
più stadi (figura 4.2), di cui i primi sono in condizioni di
semi-anaerobiosi allo scopo di non deprimere la capacità fermentativa per repressione degli enzimi responsabili. Occorre infatti tenere conto che le condizioni che
garantirebbero un’elevata produttività di biomassa non
sempre danno origine a cellule dotate di buona capacità fermentativa, che è la caratteristica richiesta per una
buona lievitazione dell’impasto. Gli stadi finali sono invece in aerobiosi, cui segue una sosta di un paio d’ore per
la “maturazione” delle cellule: in questo lasso di tempo
rallentano le sintesi proteiche e si raggiunge una sorta di
stabilizzazione fisiologica delle cellule che ne garantisce
anche una più lunga conservabilità. La fonte di carbonio
è costituita da melasso (saccarosio) che fornisce anche
vitamine (biotina), mentre l’azoto è fornito da sali di
ammonio e urea. Nitrati e nitriti non vengono utilizzati
dal lievito. Vengono aggiunti fosfato di sodio e solfato
di magnesio. La temperatura viene mantenuta intorno
ai 30 °C, il pH non deve allontanarsi da valori di 4-4,5.
Il lievito per panificazione viene commercializzato
sotto diverse forme:
r lievito compresso (shelf-life di circa 30 giorni a 4 °C)
r lievito essiccato e confezionato sottovuoto (shelf-life
di un anno a temperatura ambiente)
r lievito liofilizzato come integratore alimentare (fonte di vitamine del gruppo B e sali minerali).
Per il significato del termine shelf-life vedi il capitolo 10.
Stadio finale 250-450 m3 (melasso in feed)
resa fermentazione 60 g s.s./L
Y = 0,5
Sosta 2 h (maturazione cellule)
Separazione per centrifugazione
lavaggio cellule
crema (17-18% s.s.)
Filtrazione sottovuoto in presenza di NaCl (0,5%)
lievito compreso (28% s.s.)
Bilancio: 240-250 g melasso/L
60 g biomassa/L
Confezionamento
Figura 4.2 Schema del processo di produzione del lievito
per panificazione.
Colture insetticide da Bacillus
I pesticidi, molecole di impiego universale in agricoltura
per il controllo e l’eliminazione dei parassiti dannosi, pongono gravi problemi legati alla loro scarsa o assente biodegradabilità e alla conseguente persistenza nel suolo e nelle
acque, matrici ambientali da cui poi entrano nelle catene
alimentari fino all’uomo. Queste considerazioni hanno
dato notevole impulso alla lotta biologica, con l’obiettivo
di ottenere dai microrganismi molecole attive contro gli
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Tossine in forma cristallina
Spore
Batteri normalmente
presenti nel digerente
passano attraverso
l’epitelio danneggiato
Morte della larva
Figura 4.3 Meccanismo d’azione della δ-endotossina
di Bacillus thuringiensis.
4
co rendendolo disponibile per la pianta, che a sua volta
fornisce al batterio carbonio. Altri batteri azotofissatori
vivono liberi nel terreno. La produzione prevede una
prima fase colturale in aerobiosi per favorire la riproduzione cellulare, cui segue una seconda fase in carenza di
ossigeno per favorire lo sviluppo di nitrogenasi, enzima
ossigeno-labile responsabile della fissazione dell’azoto.
La brodocoltura di Rhizobium viene miscelata con torba
sterile e quindi con i semi delle leguminose da “infettare”, rispettando la specie-specificità come da tabella 4.4.
La reazione di fissazione dell’azoto è schematizzabile
come segue:
Nitrogenasi
insetti dannosi. Fra i pregi di tali sostanze si annoverano
l’assenza di effetti dannosi dei loro eventuali residui in
ambiente, la loro biodegradabilità, il costo economicamente conveniente rispetto agli insetticidi chimici. Vengono impiegate in agricoltura tossine ottenute da specie
di Bacillus e colture di Bacillus thuringiensis.
Le colture di Bacillus thuringiensis si ottengono su terreno colturale contenente corn-steep liquor, amido, idrolisato di caseina. La sporificazione, che avviene in condizioni di media aerazione alla temperatura di circa 30 °C e
pH prossimo alla neutralità, è associata alla produzione di
una tossina (δ-endotossina) che non è tossica per l’uomo
e gli animali poiché è inattivata a livello gastrointestinale.
Il trattamento a base di biotossina (figura 4.3) deve essere
effettuato come per i prodotti chimici, poiché il bacillo
non persiste in ambiente e non si sviluppa in quantità
tali da rappresentare una costante attività insetticida. Gli
effetti della tossina si hanno dopo l’ingestione da parte
delle larve, che muoiono in seguito alla necrosi cellulare
dell’apparato digerente. L’attività di tali bacilli si esplica
nei confronti di bruchi e larve di farfalle e falene (Bacillus
thuringiensis serovar kurstaki), zanzare e moscerini (serovar israelensis), coleotteri (serovar san diego e tenebrionis).
Altri microrganismi impiegati come insetticidi sono Bacillus (Paenibacillus) popiliae e Bacillus sphaericus.
Colture di Rhizobium
Lo sviluppo dei vegetali è strettamente dipendente, oltre che da altri elementi, dalla disponibilità di azoto.
Rhizobium è un batterio endosimbionte delle radici
delle leguminose, in grado di fissare l’azoto atmosferi-
N2 + 8H+ + 8e– + 16ATP
2NH3 + H2 + 16ADP + 16Pi
La nitrogenasi è molto sensibile all’ossigeno, da cui viene facilmente inattivata. I noduli o tubercoli radicali formati in seguito all’infezione da Rhizobium contengono
leg-emogobina, molecola dotata di un’elevata affinità
con l’ossigeno. La produzione di leg-emoglobina è estremamente importante, in quanto questa molecola si lega
all’ossigeno libero abbassandone considerevolmente la
concentrazione. Il microrganismo produce inoltre esopolisaccaridi che hanno anch’essi un ruolo nel limitare la
diffusione dell’ossigeno.
La formazione dei tubercoli radicali si svolge in varie
fasi (figura 4.4):
r i batteri invadono i peli radicali formando il “filamento di infezione”
r i rizobi penetrano nel citoplasma delle cellule radicali
r inizia a formarsi un nodulo radicale
r i rizobi assumono forme irregolari formando i batteroidi che fissano l’azoto atmosferico, convertendolo
in ammoniaca o nitrati.
Tabella 4.4 Relazioni tra rizobi e leguminose
SPECIE MICROBICA
LEGUMINOSA
R. galegae
R. loti
R. meliloti
R. leguminosarum
biovar. phaseoli
biovar. trifolii
biovar. viceae
Bradyrhizobium japonicum
Capraggine
Fagiolo, ginestrino
Erba medica
Fagiolo (piselli, veccia)
Trifoglio (piselli, veccia, siratro)
Piselli, veccia (trifoglio)
Soia, siratro
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Pianta di
leguminosa
Pelo radicale
Rilascio
dei flavonoidi
Formazione dei
noduli radicali
Nodulo
Batteroidi
Tubulo
d’infezione
I rizobi si trasformano
in batteroidi
Rizobi
Incurvamento
del pelo radicale
e penetrazione
dei rizobi
Figura 4.4 Formazione dei noduli radicali. I rizobi instaurano simbiosi con diverse specie di leguminose attraverso un processo
d’infezione delle cellule radicali che porta alla formazione di noduli radicali.
Acido poli-beta-idrossibutirrico
e poli-idrossi-alcanoati da biomasse
L’acido poli-beta-idrossibutirrico (PHB) è una sostanza di riserva batterica che alcuni microrganismi
come Alcaligenes eutrophus accumulano in quantità notevole all’interno della cellula.
Con questo composto si ottiene un materiale plastico
biodegradabile lavorabile in fogli e forme cave con cui si
ottengono bottiglie e bicchieri. Altri composti simili, per
esempio poliidrossialcanoati (PHA), sono impiegati
per la produzione di plastiche biodegradabili ottenute da
ceppi di E. coli ingegnerizzati in cui sono stati trasferiti i
geni di Alcaligenes eutrophus che codificano per il PHA.
4.2 Acidi organici
Molti acidi organici si possono ottenere in modo economicamente conveniente dal metabolismo microbico, sia aerobio che anaerobio (figura 4.5).
Intermedi primari del metabolismo aerobio sono,
per esempio, gli acidi del ciclo di Krebs (acido citrico):
non si accumulano spontaneamente ma devono essere
ottenuti con interventi sui meccanismi biochimici di regolazione del metabolismo microbico.
Altri acidi, come il lattico, l’acetico, il butirrico e
il propionico, derivano da vere fermentazioni anaerobiche. Questi ultimi sono prodotti finali del metabolismo microbico, che si accumulano in seguito allo
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Acidi organici ottenibili dal metabolismo AEROBIO
Intermedi
ciclo di Krebs
Glucosio
Ossidazione
Ac. fumarico
Ac. citrico
Altri intermedi
Ac. malico
Ac. succinico
Ac. ossalacetico
Ac. cis-aconitico
Ac. gluconico
Ac. itaconico
Acidi organici ottenibili dal metabolismo ANAEROBIO
Ac. piruvico
Lattici
Ac. lattico
Propionici
Ac. propionico
Glicerolo
Clostridi
Ac. butirrico
Clostridi
Ac. acetico
Figura 4.5 Schema della via di produzione di acidi organici. In figura sono riportati gli acidi organici che derivano dal
metabolismo aerobio e anaerobio.
sviluppo del microrganismo produttore.
L’acido gluconico infine è un esempio di bioconversione in quanto viene ottenuto per ossidazione diretta
del glucosio.
Acido lattico (fermentazione anaerobia)
L’acido lattico viene utilizzato nell’industria farmaceutica e alimentare come acidificante e conservante,
in zootecnia come ammonio lattato per l’alimentazione
animale, come mordente nella concia delle pelli e per la
produzione di polimeri biodegradabili (acido polilattico). La produzione è effettuata impiegando batteri lattici omofermentanti, in quanto gli eterofermentanti (che
ugualmente lo producono) liberano anche altre sostanze
indesiderate: ciò porta a una diminuzione nella resa del
processo, che invece in questo modo può avvicinarsi (almeno teoricamente) al 100%.
Il microrganismo maggiormente utilizzato è il Lactobacillus delbrueckii (subsp. bulgaricus) omofermentativo, anaerobio facoltativo e asporigeno, coltivato in
tecnica batch su di un substrato costituito da glucosio
nella concentrazione di 150 g/L, 0,25% circa di (NH4)2
HPO4, malto, vari fattori di crescita, oltre al 10% circa
di CaCO3 che ha lo scopo di tamponare l’eccessivo abbassamento del pH. L’aggiunta di Ca(OH)2 interviene
trasformando l’acido lattico in lattato di calcio.
La temperatura viene mantenuta intorno ai 45-50 °C
(il microrganismo impiegato è un termofilo) con pH
prossimo a 6.
L. delbrueckii è piuttosto esigente dal punto di vista
nutrizionale, come del resto tutti i lattobacilli, e non produce amilasi: per questo è necessario un pretrattamento per mobilizzare gli zuccheri semplici contenuti nella
materia prima (melasso, siero di latte, prodotti amidacei) in forma polimerica.
Dal punto di vista biochimico il processo coincide
con la glicolisi (via EMP), con la successiva riduzione
dell’acido piruvico da parte del NADH liberato dalle
reazioni di glicolisi e formazione di acido lattico (figura
4.6). Si tratta della tipica fermentazione lattica, con accumulo spontaneo del prodotto finale desiderato senza necessità d’intervento di blocco metabolico come avviene
nella produzione di acido citrico.
Il terreno di coltura non richiede trattamento di ste59
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Glucosio
Fruttosio-difosfato
2ATP
2ADP
2-Fosfoglicerato
2-Trioso-fosfato
2NADH + H+
2ATP
2ADP
2-Piruvato
2NAD+
2-Lattato
Figura 4.6 Schema della fermentazione lattica.
rilizzazione per l’azione inibente di L. delbrueckii sugli
altri microrganismi, relativamente sia al pH che alla temperature di processo. Terminata la fermentazione, la biomassa viene trattata a 80 °C per eliminare i microrganismi, segue una decantazione o filtrazione per recuperare
la fase liquida. Questa viene poi chiarificata su carboni
attivi, purificata e concentrata. Dopo precipitazione di
CaSO4 con acido solforico si ottiene una soluzione di
acido lattico che va ulteriormente purificata e concentrata per evaporazione.
L’acido lattico viene utilizzato per la sintesi di polimeri biodegradabili (bioplastiche o biopolimeri) che
sostituiscono i materiali di origine petrolchimica, con
evidente riduzione dell’impatto ambientale, dell’impiego di risorse fossili e delle emissioni di anidride carbonica. L’acido polilattico (PLA) è un poliestere termoplastico biodegradabile molto resistente e utilizzabile in
vari impieghi: dalla produzione di bottiglie per le acque
minerali a quella di piatti, bicchieri e posate monouso, con doti di resistenza assolutamente paragonabili a
quelle delle plastiche tradizionali.
Oltre che per via biotecnologica il lattato può essere
prodotto anche per via chimica dal lattonitrile, residuo
della produzione di acrilonitrile (composto usato nella
sintesi di materie plastiche).
Acido citrico (fermentazione aerobia)
L’acido citrico è impiegato nell’industria alimentare
come acidulante e antiossidante (bevande, caramelle),
come veicolante del ferro nelle preparazioni farmaceutiche per la sua capacità di complessare i metalli, nella preparazione di detergenti come sostituto dei fosfati, nell’industria chimica per la produzione di materie plastiche e
vernici, per ridurre la durezza dell’acqua in quanto complessante di ioni Mg++ e Ca++. Il microrganismo maggior-
mente utilizzato è la muffa Aspergillus niger, impiegando
come substrati il saccarosio da melasso di barbabietola
e il glucosio da amido di mais. Il fatto che la muffa possieda la capacità di produrre amilasi facilita l’impiego di
polisaccaridi complessi. Altri microrganismi in grado di
produrre acido citrico sono i lieviti Candida (Yarrowia)
lipolytica e Candida guilliermondii, ma con rese inferiori.
La produzione biotecnologica ha ormai completamente
soppiantato la tecnica di estrazione diretta dagli agrumi. I
microrganismi utilizzati sono aerobi stretti e mesofili.
L’acido citrico è un metabolita intermedio del ciclo
di Krebs (ciclo degli acidi tricarbossilici) sintetizzato
attraverso la reazione di condensazione dell’acetil-CoA
con l’acido ossalacetico, quindi non si accumula spontaneamente come prodotto finale come nel caso dell’acido lattico. Occorre perciò intervenire “dall’esterno”
bloccando l’azione dell’enzima aconitasi, che nel ciclo
di Krebs agisce a valle dell’acido citrico trasformandolo
in acido cis-aconitico.
L’attività dell’aconitasi è soggetta all’influenza di
vari fattori. È necessario un attento controllo degli ioni
ferro e manganese, che a concentrazioni relativamente
alte favoriscono l’attività dell’aconitasi: per questo è necessario il pretrattamento del melasso con ferrocianuro
che precipita i metalli pesanti. Anche l’acqua impiegata
nell’impianto deve essere controllata per il suo possibile
alto contenuto di ferro. L’aconitasi è invece inibita dalla
presenza di ioni rame, con azione positiva sull’accumulo di acido citrico. Occorre però contemporaneamente
tenere conto della possibile inibizione a feedback della
fosfofruttochinasi nella seconda reazione della via glicolitica da parte dello stesso acido citrico accumulato (figura 3.1): questo si ottiene in carenza di ioni manganese
e abbondanza di ioni ammonio.
Fosfofruttochinasi
Fruttosio-6-P
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Fruttosio-1,6-PP
4
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O–
O
C
C O
CH3
TTP,
Mg2+
CO2
NADH+H+
NAD+
C
Piruvato
decarbossilasi
Piruvato
H
O
OH
CH2
CH3
Alcol
deidrogenasi
Acetaldeide
CH3
Etanolo
Figura 4.8 Fermentazione alcolica. In figura sono riportati i passaggi finali, da piruvato a etanolo, della fermentazione alcolica.
de alcoliche a quella cosmetica e delle essenze; è utilizzato come solvente e come combustibile (bioetanolo).
Rappresenta un importante precursore di altri tre composti industrialmente importanti: acido acetico, etilene,
acetaldeide. A loro volta questi composti sono alla base
della produzione di beni di largo consumo come polimeri dell’etilene, acetati di cellulosa ecc.
Crisi energetica e progressivo esaurimento delle fonti energetiche non rinnovabili (petrolifere e di gas naturale) hanno spinto la ricerca verso l’utilizzo di etanolo
come combustibile e l’incremento della sua produzione
da materiali cellulosici oltre che dalle tradizionali fonti di saccarosio e amido. L’etanolo può essere ottenuto
sia per via chimica che fermentativa: quest’ultima viene
preferita, oltre che per convenienza economica, soprattutto perché consente di utilizzare residui ed eccedenze
di varie produzioni agricole e industriali.
La produzione di alcol etilico per la preparazione di
bevande alcoliche è un processo che risale a tempi remoti. La fermentazione alcolica si può realizzare partendo
da una gran varietà di materie prime contenenti zuccheri anche complessi (polisaccaridi) previa la loro idrolisi.
Molti microrganismi sono infatti in grado di produrre
alcol etilico da substrati zuccherini, amidi, scarti della
lavorazione del legno e cellulosa (tabella 4.5).
I microrganismi impiegati sono in primo luogo i
lieviti Saccharomyces cerevisiae, S. carlbergensis, S. elipsoideus, ma anche batteri come Zymomonas mobilis (anaerobio facoltativo, Gram-negativo). Alcune specie dei
generi Bacillus e Thermomonospora sono in grado di effettuare l’idrolisi e la fermentazione della cellulosa.
I saccaromiceti (lieviti microaerofili e comunque
facoltativi) sono soggetti, per quanto riguarda le loro
possibilità metaboliche, all’effetto Crabtree (paragrafo
4.1) e a quello Pasteur. Per l’effetto Pasteur il lievito in
condizioni di carenza di ossigeno devia il proprio metabolismo da respiratorio-ossidativo a fermentativo con
la produzione di alcol etilico. In condizioni di aerobiosi
è invece privilegiata la via respiratoria con aumento di
biomassa.
La concentrazione di etanolo può portare a fenomeni di inibizione a feedback: l’alcol-tolleranza è infatti
una delle caratteristiche ricercate nella selezione dei lieviti per l’impiego industriale. Tale carattere sembra essere legato alla composizione in lipidi della membrana
cellulare, con particolare riferimento alla presenza più
Tabella 4.5 Nella produzione biotecnologica dell’etanolo il rendimento di alcol etilico dipende dalla fonte
di carboidrati utilizzata
MATERIA PRIMA
CARBOIDRATI
% IN ZUCCHERI
RENDIMENTO (L/t)
Frutta
Glucosio, fruttosio
Variabile
Variabile
Canna da zucchero
Saccarosio
16
70
Barbabietola
Saccarosio
16
100
Patata
Amido
75
110
Grano
Amido
70
340
Granturco
Amido
70
360
Paglia, residui da lavorazione Cellulosa, emicellulosa,
del legno e della carta
lignina
Bassa
Basso
Residui erbacei
Bassa
Basso
Cellulosa, emicellulosa
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o meno abbondante di acidi grassi insaturi. L’alcol può
diffondere liberamente attraverso la membrana cellulare alterandone la permeabilità e i delicati meccanismi
di equilibrio osmotico, con la fuoriuscita del materiale
citoplasmatico e la morte della cellula. L’abbondante
presenza di acidi grassi insaturi e di opanoidi (molecole simili agli steroli) nella membrana cellulare di Zymomonas mobilis può spiegare perché questo batterio
possa produrre etanolo più velocemente e con una resa
(97% di quella teorica massima) anche superiore a Saccharomyces cerevisiae (92%), anche se la gamma di fonti
di carbonio assimilabili risulta meno ampia rispetto ai
saccaromiceti. Ceppi ingegnerizzati di questo batterio,
che utilizza per degradare il glucosio la via di EntnerDoudoroff (ED) invece che quella glicolitica di Embden-Meyerhoff-Parnas (EMP) (capitolo 1), vengono
progettati per allargare la gamma di substrati assimilabili
a pentosi come xilosio e arabinosio e per metabolizzare
direttamente cellulosa ed emicellulosa.
Nella produzione industriale l’etanolo si ottiene prevalentemente da:
r melasso (da barbabietola o canna da zucchero)
r amido (da patate e cereali, previa idrolisi)
r cellulosa e materiali cellulosici (anche in questo caso
previa idrolisi)
r siero di latte
r residui della preparazione dei succhi di frutta.
Il melasso (costituito praticamente da saccarosio) deriva
da processi di estrazione a caldo in acqua da barbabietola
e canna da zucchero (figura 4.9). Il disaccaride deve poi
essere scisso nei monosaccaridi componenti (glucosio
e fruttosio) dando così origine a zucchero invertito, così
detto perché la miscela dei due monosaccaridi inverte il
potere rotatorio della luce polarizzata rispetto al disaccaride d’origine.
Grano, granturco (che devono essere prima macinati) e patate vengono sottoposti a cottura e liberano una
gelatina amidacea da cui si ottiene glucosio per azione
idrolitica delle amilasi e della maltasi: questi enzimi vengono addizionati come tali ma può essere convenientemente impiegato anche malto (orzo germinato).
La cellulosa si può ricavare dai residui della lavorazione del legno e della carta, da paglia e residui erbacei.
Anche se il costo di partenza è indubbiamente inferiore
ad altre materie prime, i pretrattamenti che tali materiali
devono subire non rendono l’impiego di cellulosa par-
4
Melasso
Diluizione del melasso
Mosto
Inoculo del mosto
Fermentazione
Fuseloil
Prodotti
Glicerina
Etanolo
Figura 4.9 Schema della produzione di etanolo dal melasso.
ticolarmente conveniente dal punto di vista economico. La degradazione della cellulosa e dei materiali che
la contengono può essere eseguita per via chimica per
mezzo di trattamento con acidi forti o per via biochimica per mezzo di enzimi (cellulasi) prodotti da microrganismi (Trichoderma rosei, Aspergillus niger, Cellulomonas
spp., Clostridium thermosaccharolyticum). Il pretrattamento è sempre necessario e consiste nella triturazione del materiale utilizzato fino a ridurlo in frammenti
estremamente piccoli. Il miscuglio che si ottiene ha un
aspetto colloidale e su di esso vengono inoculati i microrganismi produttori di cellulasi, dopo aver subìto una
preincubazione su terreni colturali arricchiti per ottenere una notevole quantità di biomassa.
I substrati impiegati per la fermentazione alcolica
vengono anche indicati complessivamente con il nome
di mosto, che viene portato a un pH prossimo a 4,5, addizionato di fosfato e ammonio per ottimizzare l’attività
metabolica dei microrganismi di fermentazione e mantenuto alla temperatura di circa 20 °C.
L’inoculo, a partire dal ceppo selezionato in coltura
pura in provetta, viene preparato con successivi passaggi
di scale-up fino ad ottenere il cosiddetto “lievito madre”
con cui si procede all’inoculo del mosto in ragione del
5% circa in volume. La fermentazione viene condotta
in anaerobiosi in bioreattori in discontinuo STR a temperatura compresa generalmente fra 25 e 30 °C. Produ63
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zioni più efficienti si ottengono utilizzando fermentatori
di tipo continuo CSTR (continuous stirred tank reactor)
e altri a torre a letto fluido. Entrambi prevedono l’immobilizzazione dei microrganismi in sospensione o su
supporti a letto fisso.
L’etanolo viene separato tramite distillazione dagli
altri prodotti di fermentazione, fra cui il fuseloil e la glicerina. Il primo è una miscela di alcoli superiori (amilico, isobutilico ecc.), acidi organici, esteri e aldeidi che
può rimanere in piccola percentuale in diverse bevande
alcoliche.
La resa teorica della conversione zucchero/alcol si
ricava dall’equazione:
C6H12O6 (pm 180)
2C2H5OH
(pm 46 × 2 = 92) + 2CO2 (pm 44 × 2 = 88) + ATP
da cui:
180 : 92 = 100 : x
x = 51,1
quindi da 100 g di substrato si ottengono 51,1 g di etanolo
e 48,9 g di CO2 con un fattore di conversione di 0,51. La
resa reale è inferiore a quella teorica, per cui da 100 g di
substrato si ottengono circa 48 g di etanolo, 47 g di CO2,
3 g di glicerolo, 1 g di biomassa, 1 g di altre sostanze.
Volendo misurare l’alcol in volumi, poiché
V = massa/densità
COOH
H2N
C
COOH
H
H
C
R
R
L-aminoacido
D-aminoacido
NH2
Figura 4.10 L e D aminoacidi. In figura sono mostrati
aminoacidi generici in conformazione L e D.
si ottengono miscele racemiche delle forme l ed r (figura
4.10). Poiché l’organismo umano non è in grado di sintetizzare otto aminoacidi (aminoacidi essenziali), la microbiologia industriale ha indirizzato i propri sforzi verso la
loro produzione.
Gli aminoacidi vengono estratti per idrolisi dalle
proteine, per fermentazione, per bioconversione enzimatica, per sintesi chimica.
Per le produzioni biotecnologiche il substrato maggiormente utilizzato è il melasso, integrato da composti azotati organici e inorganici. Per i processi di sintesi
chimica si utilizzano sostanze organiche, mentre se gli
aminoacidi vengono estratti da proteine si utilizzano
materiali proteici di scarto.
Il microrganismo più utilizzato è Corynebacterium
glutamicum, ma vengono impiegati o almeno studiati
anche Brevibacterium flavum, E. coli, Bacillus licheniformis, oltre ai lieviti Candida humicola e Saccharomyces
cerevisiae.
e la densità dell’alcol puro è 0,79, si avrà:
0,51/0,79 = 0,64 (coefficiente teorico
di conversione zucchero-alcol).
4.4 Aminoacidi
Gli aminoacidi trovano impiego nell’alimentazione umana e animale come integratori, sia quando l’organismo
non può sintetizzarli sia quando si deve sopperire a carenze nutrizionali in diete povere di proteine. La produzione
biologica presenta diversi vantaggi rispetto a quella chimica, anche e soprattutto perché microrganismi ed enzimi di derivazione cellulare sono specifici per la produzione di l-aminoacidi (la forma biologicamente attiva, con
l’unica eccezione della metionina per la quale entrambe
le forme d e l sono attive), mentre con la sintesi chimica
Produzione di L-lisina
La lisina è un aminoacido essenziale impiegato come
integratore nell’alimentazione umana e animale. La produzione di lisina si può effettuare anche per via sinteticochimica, ormai sostituita da quella biologica per ragioni
economiche. La via biotecnologica si basa sull’utilizzo
di due intermedi metabolici dei microrganismi: acido
piruvico e semialdeide aspartica. Questi due composti
reagiscono per condensazione formando l’acido 2,6-diidropicolinico da cui, attraverso la formazione di acido
diaminopimelico, si ottiene l-lisina.
C. glutamicum metabolizza il glucosio producendo
oltre alla l-lisina, anche l-treonina e l-metionina. La
presenza contemporanea di lisina e treonina può portare a inibizione a feed-back della produzione di semi-
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PRODOTTI OTTENUTI DA PROCESSI BIOTECNOLOGICI
aldeide aspartica e quindi, in ultima analisi, a quella di
l-lisina. Si cerca perciò di utilizzare ceppi batterici privi
della capacità di produrre gli enzimi coinvolti nella sintesi di treonina. Quantità minime di treonina e metionina devono in ogni caso essere fornite nel terreno di
coltura per permettere la sintesi delle proteine e di conseguenza la riproduzione cellulare.
Per l’impianto di produzione si utilizzano fermentatori di tipo STR con agitazione air-lift in coltura sommersa, a pH compreso fra 6 e 8. Per la purificazione del
prodotto finale, che deve essere molto spinta, si utilizzano centrifugazione e filtrazione seguite da trattamenti con resine a scambio ionico. La soluzione ottenuta
viene concentrata e ulteriormente filtrata; si procede
quindi alla cristallizzazione ed essiccazione dell’aminoacido.
Produzione di acido glutammico
L’acido glutammico, prodotto anch’esso da colture di
Corynebacterium glutamicum, viene utilizzato nell’induGlucosio
Fruttosio-6-fosfato
Fruttosio-1,6-difosfato
CO2
Acetil-CoA
CoA
Citrato
TCA
Succinato
KDH
cis-Aconitato
Isocitrato
α-chetoglutarato
stria alimentare come esaltatore di sapidità. Viene sintetizzato dall’acido α-chetoglutarico, un intermedio del
ciclo di Krebs, e accumulato come metabolita endocellulare (figura 4.11). L’accumulo di acido glutammico è
regolato dagli enzimi:
r l-glutammato deidrogenasi (GDH), che catalizza la
trasformazione di α-chetoglutarato in l-glutammato
r α-chetoglutarato deidrogenasi (KDH), che catalizza
la trasformazione di α-chetoglutarato in succinato.
Nel processo industriale viene inibita la KDH e favorita
l’azione della GDH con conseguente accumulo di prodotto. Il possibile effetto feedback da alti livelli endocellulari di glutammato si previene aumentando la permeabilità cellulare, per cui il prodotto viene accumulato in
ambiente extracellulare. I ceppi produttori di acido glutammico sono molto esigenti in biotina, che deve essere
presente in concentrazione subottimale nel terreno di
coltura come cofattore dell’enzima acetil-CoA carbossilasi. Una concentrazione di biotina superiore a 5 mg/L
favorisce la formazione regolare della membrana cellulare, condizione che impedisce la fuoriuscita di glutammato dalla membrana e l’effetto di inibizione a feedback
sulla sua sintesi. Concentrazioni inferiori portano a carenza di fosfolipidi di membrana e aumentata permeabilità con fuoriuscita del prodotto.
4.5 Enzimi
Piruvato
Ossalacetato
4
GDH
Glutammato
Figura 4.11 Schema della via di sintesi dell’acido
glutammico.
Gli enzimi, proteine ad azione catalitica coinvolti nelle
reazioni del metabolismo cellulare, sono impiegati in
molti settori, da quello alimentare a quello medico-diagnostico, farmacologico, industriale (tabella 4.6).
La produzione biotecnologica degli enzimi ha sostituito pressoché totalmente quella basata sulla loro
estrazione dalle cellule in cui hanno origine. I microrganismi impiegati nella loro produzione appartengono
a ceppi selezionati, o ingegnerizzati con la tecnologia
del DNA ricombinante per rispondere a specifiche esigenze industriali. L’ingegneria genetica contribuisce in
modo determinante e con ampie prospettive di successo
alla creazione di ceppi microbici modificati in cui viene
inserito il gene per la produzione di uno specifico enzima insieme con quello relativo alla sua espressione. I
microrganismi modificati (soprattutto batteri del genere
Bacillus e muffe appartenenti al genere Aspergillus) ven65
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Tabella 4.6 Enzimi prodotti per via biotecnologica e settori
di applicazione
ENZIMA
CAMPO DI APPLICAZIONE
Glucosiossidasi
(GOD)
Ricerca diagnostica del glucosio
Perossidasi (POD)
Ricerca diagnostica del glucosio
Ureasi
Determinazione dell’urea
Rennina
Industria lattiero-casearia
Amilasi
Industria della birra
Proteasi
Industria di detergenti
Asparaginasi
Terapia dei tumori
Tripsina
Industria farmaceutica
gono poi coltivati in condizioni che ne permettono un
veloce accrescimento e un’elevata produttività.
I terreni di coltura utilizzati contengono generalmente substrati amidacei o comunque fonti diverse di
carboidrati, fattori di crescita, sali minerali, fonti di azoto (urea o sali d’ammonio) e dipendono ovviamente sia
dalle esigenze specifiche del microrganismo da coltivare
che dalle caratteristiche biochimiche dell’enzima che si
vuole ottenere. Uno schema generale della produzione
di enzimi è riportato in figura 4.12.
Una suddivisione degli enzimi microbici distingue
tra:
❖ enzimi endocellulari, il cui utilizzo richiede la
preventiva lisi delle cellule produttrici. Alcuni sono
idrolitici, come la penicillina-acilasi da E. coli, altri
sono non idrolitici come la catalasi e la glucosioossidasi da Aspergillus niger
❖ enzimi extracellulari, facilmente recuperabili dalla
filtrazione della brodocoltura. Sono prevalentemente idrolitici (idrolasi), impiegati per la degradazione
di polimeri (polisaccaridi, cellulosa, emicellulose,
pectine, proteine, lipidi)
❖ enzimi di superficie, come le disaccaridasi (maltasi,
invertasi, lattasi, cellobiasi) presenti soprattutto nella parete cellulare dei lieviti, che infatti non possono
utilizzare direttamente i polimeri ma (oltre ai monosaccaridi) solo di- e trisaccaridi.
Le amilasi sono enzimi esocellulari presenti naturalmente nel malto d’orzo (orzo germinato) in grado di
scindere il legame 1,4-glicosidico che tiene legate le
molecole dei monosaccaridi nell’amido e in altri polisaccaridi. Vengono liberate in primo luogo le destrine
(polimeri a corta catena) quindi i disaccaridi e infine
il glucosio. La α-amilasi dà origine a glucosio e maltosio, mentre la β-amilasi solamente a maltosio. Si impiegano prevalentemente le α-amilasi di origine batterica
prodotte da ceppi selezionati di Bacillus licheniformis
e B. amyloliquefaciens o dalla muffa Aspergillus oryzae.
Esempi del loro utilizzo industriale sono la produzione
di sciroppi di glucosio e fruttosio da materiali amilacei,
l’impiego nei prodotti da forno lievitati per il miglioramento della crosta superficiale, la rimozione dell’amido
nei detergenti biologici.
La β-galattosidasi o lattasi, ottenuta soprattutto da
ceppi di Kluyveromyces, viene impiegata per la scissione
del lattosio negli alimenti destinati ai soggetti intolleranti al disaccaride, e nella produzione di gelati per prevenire la granulosità dovuta alla presenza di lattosio.
La , (prodotta da Aspergillus, Corynebacterium e Micrococcus) viene usata fra l’altro nel trattamento delle
lenti a contatto.
L’asparaginasi è di grande importanza in medicina
per la sua azione antitumorale nella terapia di alcune
forme di leucemia in cui si assiste a una proliferazione
incontrollata di globuli bianchi. Tali cellule tumorali richiedono l-asparagina, che invece viene scissa dall’enzima asparaginasi in ammoniaca e acido aspartico.
I microrganismi impiegati per la produzione di asparaginasi sono alcuni ceppi mutanti di E. coli e Serratia
marcescens, ottenuti da mutazioni spontanee o indotte o
anche con la tecnologia del DNA ricombinante.
Le lipasi catalizzano l’idrolisi dei trigliceridi in glicerolo e acidi grassi e sono prodotte da funghi. Vengono
impiegate nei detersivi per lavatrici e lavastoviglie, settore in cui la ricerca è rivolta alla produzione di lipasi
termostabili per trattamenti a temperature elevate.
Proteasi alcaline sono prodotte da B. amyloliquefaciens e vengono impiegate nei detersivi per rimuovere
grassi e sostanze proteiche dai tessuti. Nell’industria casearia il caglio di origine naturale estratto dall’abomaso
(IV stomaco) dei ruminanti viene sostituito da proteasi
acide (rennina) prodotte dalla muffa Rhizomucor pusillus o da chimosina ricombinante ottenuta dal lievito
Kluyveromyces lactis.
Enzimi pectinolitici vengono utilizzati per l’estrazione di succhi vegetali o a scopo chiarificante in molte
bevande.
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Cellule
Coltura semisolida
Enzima
extracellulare
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PREPARAZIONE
LIQUIDA
Separazione
Standardizzazione
Surnatante
MICRORGANISMO
Stabilizzazione
Coltura in liquido
Enzima
extracellulare
Enzima
intracellulare
Concentrazione
Surnatante
Rottura cellule
Purificazione
Essiccamento
Standardizzazione
Residui
cellulari
PREPARAZIONE
IN POLVERE
Figura 4.12 Enzimi microbici. Schema di produzione degli enzimi microbici con coltura liquida o semisolida.
La penicillina acilasi prodotta da ceppi mutanti di
E. coli viene utilizzata per ottenere acido penicillanico,
precursore delle penicilline.
Anche la Taq polimerasi e la DNA polimerasi, utilizzate nella PCR vengono ottenute da processi fermentativi.
Gli enzimi vengono utilizzati il più delle volte dopo
la loro immobilizzazione su una matrice di supporto.
4.6 Vitamine
Le vitamine sono sostanze organiche indispensabili alla
vita degli organismi. Svolgono funzioni di mantenimento dell’integrità delle membrane biologiche e di bioregolazione metabolica: molti coenzimi rappresentano la
forma attiva di altrettante vitamine (tabella 4.7). Vengono suddivise in due gruppi:
❖ vitamine idrosolubili (B1, B2, B12, C), solubili in acqua
❖ vitamine liposolubili (A, D, E, K), solubili nei solventi dei grassi.
La vitamina B12 (cianocobalamina) ha una formula
complessa in cui si individuano tre frazioni diverse: un
sistema ad anello simile a quello porfirinico dell’emoglobina (ma con al centro uno ione cobalto), una deossiadenosina e un ribonucleotide (figura 4.13).
I microrganismi utilizzati per la produzione della
vitamina B12 sono Propionibacterium shermanii, Propionibacterium freudenreichii, Streptomyces olivaceus, Pseudomonas. La produzione avviene in coltura sommersa a
pH 7 su terreni contenenti substrati nutritivi zuccherini,
oltre a sali di cobalto e ioni cianuro.
Le fasi della produzione risultano piuttosto complesse. Il ceppo produttore, selezionato e isolato su terreno agarizzato, subisce un processo di scale-up colturale per trapianti successivi in terreni liquidi di volume
sempre maggiore, fino ai fermentatori di vegetazione. La
percentuale dell’inoculo viene mantenuta costante, intorno al 5% del volume della biomassa nel fermentatore
di produzione. I bioreattori sono generalmente di tipo
STR con agitazione meccanica. La produzione viene effettuata in aerobiosi a una temperatura di circa 26 °C,
cui segue la morte delle cellule in concomitanza del progressivo esaurimento delle sostanze nutritive. L’estrazione del prodotto comprende diverse fasi, che prevedono
l’ebollizione della brodocoltura, quindi il suo raffreddamento e filtrazione, più fasi di estrazione con alcol,
precipitazione con miscela acetone/etere, estrazione su
colonna e cristallizzazione.
Gli impieghi principali della vitamina B12 sono quello di integratore per l’alimentazione animale (mangimi)
e quello farmaceutico. Per l’impiego farmaceutico è naturalmente richiesto un elevatissimo grado di purezza
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Tabella 4.7 Vitamine come coenzimi
VITAMINA
COENZIMA
SIGLA
Tiamina
Tiamina pirofosfato
TPP
Decarbossilazione
Riboflavina
Flavinmononucleotide
Flavinadenindinucleotide
FMN
FAD
Trasporto di idrogeno
Niacina
Nicotinamide adenindinucleotide
Nicotinamide adenindinucleotide fosfato
NAD+
NADP+
Trasporto di idrogeno
Biotina
Biocitina
Bt
Trasporto di carbossile
Piridossina
Piridossalfosfato
PLP
Transaminazione e decarbossilazione
degli aminoacidi
Acido pantotenico
Coenzima A
CoA
Trasporto di gruppo acilico
R
CH3
H3C CH2CONH2
NH2COCH2CH2
NH2COCH2
CH2CH2CONH2
H3C
N
H3C
N
Co+
N
N
CH3
NH2COCH2
CH3
NHCOCH2CH2
CH3 H3C
CH2CH2CONH2
CH2
CH
O
O-
N
CH3
N
CH3
O
O
O
OH
H
H
H
HOCH2
O
Vitamina B12
(cobalamina)
H
FUNZIONE
del prodotto, che si ottiene in primo luogo con l’utilizzo
di ceppi batterici selezionati di Pseudomonas, che come
prodotto metabolico forniscono pressoché esclusivamente la vitamina (mentre altri batteri producono, insieme con la cianocobalamina, anche antibiotici), quindi con più complessi sistemi di estrazione, purificazione
con tecniche cromatografiche e successiva cristallizzazione.
La vitamina B2 (riboflavina) viene prodotta dal fungo filamentoso Eremothecium gossypii impiegando una
via metabolica complessa che parte dall’acetil-CoA derivato dalla β-ossidazione degli acidi grassi.
I carotenoidi (precursori della vitamina A) sono
impiegati come coloranti alimentari, come integratori
nella prevenzione delle malattie cardiovascolari e come
antitumorali per la loro spiccata azione antiossidante.
Vengono estratti dai vegetali o prodotti per sintesi chimica, ma sono prodotti anche per via fermentativa dal
fungo filamentoso Blakeslea.
La vitamina C è invece un esempio di bioconversione (paragrafo 5.6).
Figura 4.13 Formula della vitamina B12.
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ESERCIZI DI VERIFICA
1. L’informazione genetica per la produzione
di vitamine:
A deve essere introdotta nel microrganismo
B è contenuta completamente nel microrganismo
C è presente nel microrganismo solo in parte
2. Le biomasse microbiche vengono utilizzate
per:
A il loro contenuto
B la loro attività
C entrambe queste funzioni
3. L’acronimo SCP indica:
A cellule eucariotiche o procariotiche
B solo cellule di mammifero
C solo cellule procariotiche
4. L’effetto Crabtree che si verifica nei lieviti
consiste:
A nell’inibizione del metabolismo fermentativo
B nell’inibizione del metabolismo ossidativo
respiratorio
C nel blocco della sporificazione
5. La tossina di Bacillus thuringiensis:
A viene inattivata a livello gastrico nelle larve
B blocca la riproduzione degli insetti parassiti
C elimina le larve degli insetti causando la necrosi dell’apparato digerente
6. L’acido poli-beta-idrossibutirrico è prodotto
da:
A lieviti
B alcune alghe
C batteri del genere Pseudomonas
D batteri del genere Alcaligenes
7. L’effetto Pasteur che si registra nei lieviti
saccaromiceti consiste nel passaggio da:
A metabolismo respiratorio a fermentativo se
manca ossigeno
B metabolismo fermentativo a ossidativo se
manca ossigeno
C metabolismo ossidativo a fermentativo in
presenza di abbondante aerazione
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PROTEINE UMANE
RICOMBINANTI,
ORMONI E ANTIBIOTICI
5.1 Produzione biotecnologica
di proteine umane
5.2 Produzione di vaccini
5.3 Produzione di anticorpi monoclonali
5.4 Produzione di interferoni
5.5 Produzione di ormoni
5.6 Bioconversioni
5.7 Produzione di antibiotici
5.8 Classi strutturali e meccanismo
d’azione degli antibiotici
5.9 Produzione di penicilline
e cefalosporine
5.10 Statine e altre molecole di impiego
medico e zootecnico
I meccanismi alla base dell’espressione in proteine delle
informazioni contenute nel genoma sono noti da tempo. I progressi della tecnologia del DNA ricombinante,
relativamente più recenti, hanno reso possibile il trasferimento dei geni codificanti per proteine di interesse e la
loro espressione in ospiti diversi da quelli originari. Tale
processo può essere indicato come produzione di proteine ricombinanti, che si accumulano nelle cellule ospiti in
quantità significativa. Poiché tali cellule sono prevalentemente microrganismi, la loro coltura e la loro manipolazione risulta agevole ed economicamente conveniente.
I vaccini ricombinanti, gli anticorpi monoclonali, gli
interferoni sono esempi di proteine di interesse medicofarmacologico prodotte in questo modo. La produzione
di antibiotici occupa un ruolo di primissimo piano nella
terapia delle malattie infettive, mentre le bioconversioni
sono un esempio di come i microrganismi possono sostituire o affiancare la chimica svolgendo alcune reazioni in
modo più rapido e conveniente.
5.1 Produzione biotecnologica
di proteine umane
Uno dei settori in più rapido sviluppo in campo biotecnologico è indubbiamente quello delle biotecnologie farmaceutiche. Fra i prodotti biotecnologici che interessano il
settore farmaceutico, la produzione di proteine umane ha
registrato uno sviluppo straordinario dall’avvento delle
tecniche del DNA ricombinante. La preparazione, la caratterizzazione, la somministrazione e la farmacocinetica
di questi composti biotecnologici ad alto peso molecolare
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PROTEINE UMANE RICOMBINANTI, ORMONI E ANTIBIOTICI
Gene
Vettore di
espressione
Trasformazione
delle cellule ospiti
Espressione
Purificazione
Proteine
ricombinanti
Altre
proteine
r in primo luogo occorre individuare la sequenza nucleotidica o il gene che contiene l’informazione per
la sintesi della proteina di interesse
r la sequenza nucleotidica (gene) ottenuta, insieme con le sequenze nucleotidiche che ne regolano
l’espressione, viene inserita tramite un vettore in una
cellula coltivabile
r questa cellula diventa il “sistema di espressione” che
si incaricherà di fabbricare la proteina
r la proteina una volta prodotta deve essere estratta dal
sistema di coltura e purificata, operazione che deve
essere svolta in modo da raggiungere la massima purezza possibile del prodotto.
Secrezione
Sistemi di espressione
Figura 5.1 Passaggi della produzione biotecnologica
di proteine.
sono aspetti che spesso differiscono sostanzialmente da
quelli tipicamente relativi ai prodotti convenzionali a più
basso peso molecolare.
Si ricordano schematicamente i punti basilari della
produzione biotecnologica delle proteine (figura 5.1):
LA GLICOSILAZIONE DELLE PROTEINE
La maggior parte delle proteine d’impiego farmacologico ottenute con la tecnologia del DNA ricombinante
sono glicoproteine, caratterizzate cioè dalla presenza
di catene laterali oligosaccaridiche (figura 5.2). Questa
loro caratteristica ne influenza molte proprietà, come
la solubilità, la stabilità e il tempo di dimezzamento.
La glicosilazione di una proteina non è determinata direttamente dalla sequenza del DNA, ma è un processo
enzimatico che avviene in una fase successiva alla sua
produzione (traduzione), dipendente in buona misura dall’ambiente cellulare in cui la proteina viene sintetizzata. Risulta quindi piuttosto difficile controllare
l’intero processo, poiché struttura e composizione dei
carboidrati nelle proteine ricombinanti risultano a volte
diverse da quelle delle molecole originali, in quanto gli
enzimi indispensabili alla sintesi differiscono al variare
dei sistemi di espressione: ne sono esempi l’interleuchi-
Le proteine di impiego terapeutico vengono prodotte
utilizzando come sistemi di espressione cellule procariotiche (batteri) o eucariotiche (cellule di lievito o animali).
Teoricamente, un organismo manipolato geneticamente
è in grado di produrre qualsivoglia proteina, ma in molti casi ciò non è possibile: i procarioti, per esempio, per
la natura dei loro sistemi di espressione che sono diversi
da quelli degli eucarioti, possono produrre proteine più o
meno degradate; inoltre i batteri non possono produrre
proteine glicosilate, che ne rappresentano spesso la forna 4, la gonadotropina corionica, l’eritropoietina o l’attivatore tissutale del plasminogeno.
- NH2
Proteina
- COOH
Asn
N-acetilglucosammina
Catena
laterale
Mannosio
Di solito
un’asparagina
Glucosio
Figura 5.2 Glicosilazione delle proteine.
71
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PROTEINE UMANE RICOMBINANTI, ORMONI E ANTIBIOTICI
ma biologicamente più attiva. Per la produzione si deve
perciò ricorrere a cellule di mammifero, che possiedono naturalmente il corredo informazionale per produrre
proteine bioattive, assolutamente paragonabili a quelle
umane. Alcuni esempi di cellule animali che producono
proteine di interesse farmacologico sono:
r cellule tumorali linfoblastoidi per la produzione di
interferone
r cellule di melanoma per la produzione di attivatore
del plasminogeno
r cellule tumorali ibridate per la produzione di anticorpi monoclonali.
Sistemi di coltura, mezzi colturali
e contaminanti
Le colture cellulari si effettuano in fermentatori o bioreattori ad agitazione meccanica o pneumatica (air-lift), a
perfusione a fibre cave, a letto fisso, con tecnica continua,
discontinua, discontinua con rifornimento (feed-batch).
La composizione dei terreni di coltura per la coltivazione di cellule animali le condizioni ambientali (temperatura, pH, tensione di ossigeno) devono essere accuratamente controllate per apportare tutti gli elementi
nutritivi indispensabili (ormoni, fattori di crescita, carboidrati, aminoacidi, elettroliti, vitamine ecc.). Le cellule animali devono essere esenti da qualsiasi tipo di contaminazione, si deve quindi agire in un regime di assoluta
sterilità e verificare l’assenza di contaminanti quali virus,
batteri, DNA cellulare. Contaminanti particolarmente
Tabella 5.1 Operazioni fondamentali di purificazione
di una macromolecola di interesse farmacologico
PASSAGGI DI PURIFICAZIONE
Eliminazione del particolato
Concentrazione
Cattura/Purificazione iniziale
Purificazione intermedia
Purificazione finale
Sterilizzazione/Formulazione
pericolosi sono i virus, che tendono per natura a parassitare cellule superiori. Vengono generalmente apportati
con il mezzo colturale e il componente più frequentemente responsabile è il siero animale. Particolarmente
rischiosa è la contaminazione da pirogeni (endotossine
batteriche) cui l’uomo è sensibile a concentrazioni anche estremamente basse. Anche la presenza di proteine
estranee in un prodotto farmaceutico può rivelarsi assai
pericolosa: il loro riconoscimento come antigeni da parte del sistema immunitario del paziente che assume il
farmaco può scatenare una violenta reazione anafilattica
nel caso (che è il più frequente) di assunzione ripetuta.
Purificazione
La qualità finale di un prodotto farmaceutico si misura
in termini di purezza: ne consegue che rivestono capitale importanza le tecniche che permettono di portare un
Tabella 5.2 Processi di separazione di impiego frequente e loro fondamento fisico
TECNICA DI SEPARAZIONE
MODALITÀ/PRINCIPIO
SEPARAZIONE BASATA SU
Separazione su membrana
Microfiltrazione
Ultrafiltrazione
Dialisi
Dimensione
Dimensione
Dimensione
Configurazione
Frazionamento isopicnico
Precipitazione in condizioni di non equilibrio
Densità
Densità
Estrazione
Estrazione in fase liquida
Estrazione liquido/liquido
Solubilità
Ripartizione, cambiamento di solubilità
Precipitazione
Precipitazione frazionata
Cambiamento di solubilità
Cromatografia
Scambio ionico
Filtrazione su gel
Affinità
Interazioni idrofobe
Adsorbimento
Carica
Dimensione
Interazione specifica ligando-substrato
Idrofobicità
Legame covalente e non
72
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PROTEINE UMANE RICOMBINANTI, ORMONI E ANTIBIOTICI
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Tabella 5.3 Componenti di formulazioni parenterali
di prodotti biotecnologici. Non necessariamente sono tutti
presenti in una particolare formulazione proteica
t*OHSFEJFOUFBUUJWP
t4PMVCJMJ[[BOUJ
t"HFOUJBOUJBETPSCJNFOUPFBOUJBHHSFHB[JPOF
t5BNQPOJ
t$POTFSWBOUJFBOUJPTTJEBOUJ
t-JPQSPUFUUPSJBHHMPNFSBOUJ
t"HFOUJPTNPUJDJ
t4JTUFNBWFUUPSF
composto al massimo grado di purezza. La conoscenza
approfondita dei meccanismi di reazione e dei fattori
condizionanti consente di monitorarli e governarli più
agevolmente, con l’obiettivo di ottenere un prodotto finale che risponda alle caratteristiche specifiche di registrazione e agli standard di qualità propri del progetto. Un
elevato grado di purezza è assolutamente richiesto dalle
norme stabilite dagli enti preposti alla vigilanza (EMEA,
FDA) per evitare che il prodotto possa ancora contenere
tracce di sostanze chimiche (per es. solventi) in grado di
scatenare nei pazienti reazioni indesiderate o tossiche. I
limiti di tollerabilità di eventuali impurezze vengono indicati per ogni farmaco tenendo conto anche della via di
somministrazione. Le linee-guida previste dalle Good
Manufactoring Practices (GMP), che permettono di poter immettere sul mercato prodotti rispondenti ai requisiti richiesti, rispondono a criteri molto severi.
Il processo di purificazione è strutturato in diverse
fasi, riassunte schematicamente in tabella 5.1.
L’esempio di figura 5.3 riporta il trattamento di purificazione dell’interferone ricombinante glicosilato e
risulta decisamente complesso.
I processi più utilizzati per la separazione delle proteine sono elencati in tabella 5.2.
Sterilità
Figura 5.3 Passaggi di purificazione dell’interferone.
Le proteine sono generalmente termolabili e, poiché ai
fini della loro somministrazione (che avviene solitamente
per via parenterale) devono naturalmente essere sterili,
non è possibile utilizzare alte temperature, ma nemmeno
il gas o le radiazioni ionizzanti. In definitiva, poiché non
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si può sterilizzare il prodotto finale, l’unica soluzione è
quella di lavorare in ambiente asettico nelle varie fasi della
preparazione del farmaco.
Apparecchiature ed eccipienti vengono quindi sterilizzati separatamente in autoclave, sottoposti all’azione
dei raggi γ, a trattamenti chimici oppure sterilizzati a
secco con temperature superiori a 160 °C. Si utilizzano
inoltre sistemi di microfiltrazione prima di immettere il
preparato nelle fiale, con l’impiego di filtri con pori del
diametro di 0,2 μm. L’assemblaggio viene quindi effettuato in camera sterile a flusso laminare d’aria filtrata
con sistema HEPA, da parte di personale appositamente
addestrato provvisto di adeguati indumenti protettivi. Il
regolare periodico ricambio dei filtri HEPA, la perfetta
pulizia dei locali e dell’intero apparato rappresentano altrettanti fattori essenziali per il successo delle operazioni.
Eliminazione dei pirogeni
I pirogeni sono sostanze che inducono nell’organismo
una reazione febbrile. Sono detti esogeni se provengono
dall’esterno dell’organismo, cioè da microrganismi come
batteri, miceti e virus. Sono di particolare importanza i
pirogeni batterici, identificabili nelle endotossine prodotte dai Gram-negativi, in pratica il lipide A situato nello
strato esterno lipopolisaccaridico (strato LPS) della parete cellulare di questi batteri. Le endotossine non vengono
eliminate con il trattamento a calore umido dell’autoclave, ma sono inattivate dal calore secco a temperature superiori ai 160 °C. I recipienti per confezionare il farmaco
vengono per questo trattati a 250 °C per 30 min al calore
secco. Anche gli eccipienti (componenti di un farmaco
diversi dal principio attivo, tabella 5.3) devono essere
esenti da endotossine e vengono trattati con la distillazione se si tratta di soluzioni, mentre l’acqua per le iniezioni
si produce con tecniche di osmosi inversa, che utilizzano
membrane che non lasciano passare le endotossine. Viene utilizzato anche il carbone attivo.
Eccipienti impiegati nei farmaci proteici
biotecnologici
Gli eccipienti sono rappresentati da:
r agenti che migliorano la solubilità: vengono aggiunti al fine di prevenire fenomeni di aggregazione
delle proteine con la loro conseguente precipitazione. Si impiegano in genere aminoacidi (arginina e lisina) e tensioattivi come il sodio dodecilsolfato
r tamponi: il controllo del pH è un fattore decisivo,
dal momento che caratteristiche fondamentali delle
proteine quali la stabilità e la solubilità dipendono
dal pH; si impiegano quindi i sistemi tampone fosfato, acetato, citrato
r conservanti e antiossidanti: molte proteine contengono aminoacidi facilmente soggetti a ossidazione come metionina, triptofano, istidina, cisteina e
tirosina. Per prevenirne l’ossidazione si può sostituire l’ossigeno nelle fiale con un gas inerte, o anche
aggiungere antiossidanti come acido ascorbico o
sodio formaldeide solfossilato. Nel caso di preparati da somministrare in più volte, occorre limitare
il pericolo di contaminazione microbica durante la
conservazione: si impiegano a questo scopo sostanze
conservanti come l’acido p-idrossibenzoico, l’alcol
benzilico, il cloro butanolo.
Liofilizzazione delle proteine
La liofilizzazione consiste nell’allontanamento dell’acqua
per sublimazione (passaggio diretto dallo stato liquido a
quello solido). Il processo si svolge in tre fasi:
r congelamento, in cui la temperatura viene portata a
livelli estremamente bassi, tali da provocare la cristallizzazione dell’acqua libera allo stato fluido (−40 °C)
r essiccamento I, in cui l’acqua cristallizzata e non legata viene allontanata per sublimazione abbassando
la pressione
r essiccamento II, in cui si elimina l’acqua legata a
proteine ed eccipienti. La temperatura viene gradualmente portata a 20 °C.
Vie di somministrazione
e assorbimento
Viene definita via di somministrazione parenterale
quella che si effettua tramite ago: iniezione endovena,
sottocutanea, intramuscolo, intraperitoneale. Il tempo
di dimezzamento dei prodotti biotecnologici nel sistema
circolatorio risulta essere assai variabile: per l’attivatore
del plasminogeno è di pochi minuti, mentre per gli an-
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ticorpi monoclonali è di diversi giorni. Per aumentare il
tempo di dimezzamento del farmaco (e quindi quello di
permanenza nel sangue) si può passare alla somministrazione intramuscolare o sottocutanea piuttosto che a quella endovena, anche se ciò porta a modificazioni relative
alla sua eliminazione e agli effetti terapeutici specifici. La
somministrazione per via orale delle proteine ricombinanti ad attività terapeutica incontra alcuni ostacoli,
primo fra tutti la naturale attività degradativa dell’apparato gastrointestinale nei confronti delle proteine, che vengono rapidamente demolite a peptidi a corta catena e ad
aminoacidi. Risulta inoltre praticamente impossibile l’assorbimento passivo (per diffusione) di sostanze ad alto
peso molecolare, quali le proteine, attraverso l’epitelio
intestinale. Quando è necessario avere una biodisponibilità elevata e costante di proteine ad attività terapeutica
la via orale di somministrazione non è perciò praticabile.
Un’importante eccezione è peraltro costituita dai vaccini
orali: in questo caso è sufficiente che ai siti-bersaglio arrivi una quantità anche minima di antigene proteico (la
proteina ricombinante) per sensibilizzare il sistema immunocompetente e indurre la risposta immunitaria.
Tabella 5.4 Categorie di vaccini prodotti per uso umano
e malattie contro le quali proteggono
TIPO DI VACCINO
MALATTIA/PATOGENO
Ucciso batterico
Salmonella typhi
Pertosse
Colera
Ucciso virale
Rabbia
Poliomielite
Influenza
Encefalite giapponese
Epatite A
Vivo attenuato batterico
5VCFSDPMPTJ
Colera
Salmonella typhi
Vivo attenuato virale
Vaiolo
Rabbia
Febbre gialla
Poliomielite
Influenza
Morbillo
Parotite
Rosolia
Varicella
Rotavirus
Encefalite giapponese
Polisaccaridico
Salmonella typhi
Meningococco
Pneumococco
Haemophilus influenzae tipo b
Ricombinante batterico
Pertosse
Malattia di Lyme
La produzione industriale: lo scale-up
Nella messa a punto di un farmaco assume importanza
strategica l’individuazione della migliore formulazione
e della via di somministrazione più appropriata. Un’altra
fase critica è l’avvio della produzione su scala industriale
della molecola prescelta che, come avviene per le produzioni biotecnologiche di microbiologia industriale, richiede il passaggio da dimensioni relativamente ridotte
(milligrammi o grammi) a una scala di ordine enormemente maggiore (anche tonnellate). Ciò significa ottimizzare la sintesi di enormi quantità di principio attivo,
tenendo sotto controllo tutti gli svariati parametri coinvolti nel processo di sintesi (temperatura, reazione del
mezzo, solventi impiegati, tempi di reazione, formazione
di sottoprodotti e loro eliminazione ecc.). Al contrario
di quanto possa sembrare, trasferire reazioni complesse
su scala più ampia (scale-up) non è mai un’operazione
semplice: aumenti consistenti delle quantità di prodotto comportano considerevoli variazioni delle condizioni
di reazione. Occorre quindi procedere con passaggi in
fermentatori di dimensioni progressivamente maggiori
(paragrafo 3.5).
5
Ricombinante virale
Epatite B
Virus-like particles (VLP)
Papilloma
5PTTPJEF
Difterite
5FUBOP
Pertosse
5.2 Produzione di vaccini
I vaccini sono sostanze antigeniche che inducono
nell’organismo in cui sono introdotte una reazione
immunitaria specifica, in grado di prevenire le conseguenze di un’ulteriore aggressione da parte degli stessi
antigeni contro cui ci si è vaccinati: sono quindi impiegati a scopo profilattico (tabella 5.4). Il presupposto
imprescindibile nella preparazione di un vaccino è l’annullamento del suo potere patogeno (virulenza propria
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Batteri attenuati
Batteri
60 °C
Virus attenuati
Vaccino
Virus
Trattamento ad alta
temperatura
Batteri uccisi
Trattamento
chimico
Virus uccisi
Vaccino
Figura 5.4 Preparazione di vaccini uccisi e attenuati.
dell’antigene da cui deriva) mantenendo intatta la capacità immunogena, cioè la capacità di indurre nell’organismo una risposta immunitaria. I vaccini si possono
ottenere da:
r microrganismi vivi ma attenuati. L’attenuazione del potere patogeno si effettua con mezzi fisici
o chimici come la nitroso guanidina o con ripetuti
passaggi in vitro del ceppo selvatico. In questo modo
la loro virulenza viene considerevolmente ridotta o
annullata. Si tratta in genere di vaccini antivirali,
contro malattie quali il morbillo, la rosolia, la varicella, la febbre gialla, la tubercolosi, la poliomielite
(vaccino orale di Sabin). Possono permanere alcuni
rischi legati alla manipolazione di microrganismi
vitali, come nel caso di ritorno dei ceppi attenuati
alla forma selvatica patogena. Nel caso del vaccino
antipolio di Sabin ciò può verificarsi in 1 caso su 3
milioni
r microrganismi uccisi o inattivati. L’impiego di microrganismi uccisi elimina del tutto la quota di rischio
del caso precedente: la contropartita consiste nella
possibile attenuazione anche della proprietà immunogena (figura 5.4). Questi vaccini, perciò, devono
essere somministrati in dosi ripetute. Esempi sono il
vaccino antipolio di Salk, quelli contro la rabbia, l’influenza, l’epatite A, il colera, la peste, la pertosse
r anatossine o tossoidi. Sono tossine microbiche di natura proteica o altre sostanze private del potere patogeno (figura 5.5). La detossificazione viene effettuata
con formolo o con tecniche di purificazione. I vaccini
contro la difterite e il tetano sono esempi di tossoidi
r vaccini polisaccaridici. Si ottengono per purificazione dei polisaccaridi della capsula batterica, che
vengono poi coniugati con un antigene proteico
(vaccini contro Streptococcus pneumoniae e Neisseria
meningitidis).
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Polisaccaridici
Polisaccaride
Batteri
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
Coniugato
O
O
Vaccino
O
Tossoidi
Trattamento
chimico
Tossina
Tossina
inattiva
Vaccino
Figura 5.5 Vaccini polisaccaridici e tossoidi.
Vaccini ricombinanti
Nel campo della preparazione dei vaccini le tecniche di
biologia molecolare e del trasferimento di geni hanno
raggiunto traguardi significativi. Uno degli aspetti più
importanti è rappresentato dalla possibilità di ottenere
proteine immunogene in forma pura e assolutamente prive di attività patogena. Le procedure si basano
sull’identificazione dei geni codificanti per gli specifici
fattori di virulenza dei microrganismi patogeni, sulla
loro manipolazione e sul loro trasferimento in cellule
che siano in grado di esprimerli.
L’ingegneria genetica si avvale di diverse tecniche,
tra cui:
r impiego di un vettore innocuo per l’organismo
umano, utilizzato per introdurre nell’organismo geni
in grado di indurre la produzione di anticorpi contro
una malattia infettiva. Si possono utilizzare vettori
plasmidici o virali come il virus del vaiolo. Il gene
responsabile dell’immunizzazione contro il vaiolo
viene sostituito dal gene desiderato. Con questa tecnica si possono inserire più geni diversi, ottenendo
un multivaccino
r con la tecnica del DNA ricombinante vengono sintetizzate proteine immunogene proprie del microrganismo responsabile della malattia e che quindi
sono in grado di sensibilizzare il sistema immunocompetente. L’impiego di frazioni proteiche e non
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di interi microrganismi elimina il rischio di effetti
collaterali indesiderati
r l’ingegneria genetica permette anche di attenuare la
virulenza dei microrganismi modificando i geni responsabili della patogenicità senza interferire con
quelli responsabili dell’immunogenicità. Il rischio è
rappresentato da possibili mutazioni “di ritorno” (reversioni) che riportano il genoma microbico nella
condizione di esprimere la patogenicità originaria.
Soprattutto nel caso dei vaccini contro alcune malattie
virali, le biotecnologie avanzate e la tecnica del DNA ricombinante hanno consentito notevoli progressi, come
la messa a punto del vaccino ricombinante contro
l’epatite B (HBV) (figura 5.6). In questo caso il vaccino
è preparato utilizzando l’antigene di superficie del virus
(HBsAg) trasferito ed espresso in cellule di lievito e
quindi sottoposto a purificazione.
Il primo vaccino ricombinante batterico contro la
pertosse (figura 5.6) risale al 1993. Bordetella pertussis produce una tossina formata da 5 subunità, ciascuna
delle quali sotto il controllo di un gene specifico. Tali
geni sono stati sostituiti nel genoma di Bordetella da
geni modificati, tali da indurre la produzione nello stesso batterio di una tossina mutata priva di tossicità (cioè
un tossoide) ma dotata dell’originale immunogenicità.
Un simile approccio di detossificazione genetica è stato in seguito applicato alla tossina colerica e a quella
Epatite B
Clonaggio del gene in
un plasmide di espressione
Virus
Vaccino
Lievito
Pertosse
Gene
Gene
mutato
Batterio
ricombinante
Batterio
Mutagenesi
sito diretta
S1
Vaccino
Figura 5.6 Vaccini ricombinanti. La figura illustra i passaggi per la produzione di vaccini ricombinanti per epatite B e pertosse. Nel
vaccino della pertosse la subunità S1, responsabile della tossicità, viene resa non tossica per mutagenesi.
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LT di E. coli. La tossina LT è termolabile e antigenica,
con un’attività simile alla tossina colerica; E. coli produce anche un’altra tossina, termostabile e priva di potere
antigenico. Un altro vaccino ricombinante è stato messo
a punto contro la malattia di Lyme (infezione da Borrelia) utilizzando una lipoproteina batterica (OspA) ottenuta trasferendo e facendo esprimere in E. coli il gene
che la codifica.
5.3 Produzione di anticorpi
monoclonali
Si tratta di anticorpi prodotti da un unico clone cellulare. Gli anticorpi si legano in modo selettivo e specifico
ai corrispondenti antigeni, molecole non-self (estranee
all’organismo) che ne hanno indotto la produzione in
seguito alla sensibilizzazione del sistema immunocompetente (reazione immunitaria). In questo modo gli
anticorpi, insieme con le cellule dell’immunità cellulare, svolgono la loro missione di difesa contro gli agenti
estranei nella più ampia accezione del termine (antigeni
batterici, virali, chimici ecc.).
La reazione fra antigene e anticorpo offre molte possibilità di sfruttamento e applicazione proprio per la sua
estrema specificità: viene impiegata in diagnostica clinica per individuare uno dei due componenti quando è
noto il complementare (ricerca di anticorpi nel siero del
paziente cimentando il siero con gli antigeni corrispondenti; ricerca degli antigeni con l’impiego di anticorpi
specifici). Più in generale gli anticorpi possono essere
impiegati per individuare, isolare ed estrarre molecole o
cellule da un substrato. Per la loro capacità di legarsi in
modo assolutamente selettivo alle corrispondenti molecole bersaglio, si è pensato di impiegare gli anticorpi
come veri e propri agenti terapeutici in molte patologie.
Un’applicazione importante può essere quella di impiegarli come vettori specifici di farmaci a localizzazione
elettiva o come arma estremamente precisa e mirata
contro cellule tumorali.
Gli anticorpi vengono prodotti dai linfociti B, quindi
sembra ovvia la possibilità di ottenerne quantità significative dalla coltura di linfociti. Purtroppo coltivare in vitro i linfociti B umani risulta assai difficile: essi muoiono
infatti dopo poche generazioni, insufficienti a produrre
il quantitativo sufficiente di linfociti, e quindi di anticorpi, necessario a un qualsiasi intervento terapeutico.
5
Il problema ha trovato soluzione nel 1975, quando si
pensò di utilizzare cellule tumorali di mieloma che in
condizioni adatte hanno la proprietà di riprodursi pressoché all’infinito e linfociti B dalla milza, produttori di
anticorpi. Le due linee cellulari, provenienti entrambe
da topi, furono indotte a fondersi dando luogo a un ibridoma. Tale ibrido mantiene le caratteristiche desiderate
di entrambe le linee cellulari d’origine: capacità di riproduzione pressoché illimitata e produzione di anticorpi.
Si induce quindi nel topo un mieloma; l’animale viene
inoltre immunizzato con l’antigene (o gli antigeni) verso cui si vogliono ottenere gli anticorpi. Si prelevano separatamente sia i linfociti B che le cellule tumorali, che
vengono poi riunite in condizioni controllate formando
gli ibridomi.
Ogni ibridoma viene fatto riprodurre dando origine
così ad altrettanti cloni cellulari che producono anticorpi tutti dello stesso tipo, appunto anticorpi monoclonali (figura 5.7).
La fusione delle due diverse linee cellulari che formano l’ibridoma si realizza annullando la selettività delle rispettive membrane cellulari per mezzo di sostanze
chimiche come il polietilenglicol (PEG) o applicando
campi elettrici. Il materiale citoplasmatico di entrambe
le cellule si fonde e si crea un unico corpo cellulare.
La coltivazione degli ibridomi avviene in condizioni
di temperatura (37 °C), pH (7,2-7,4), tensione di ossigeno e pressione osmotica rigidamente controllate. Tutti gli altri parametri ottimali per la vita cellulare devono
essere mantenuti il più possibile simili alle condizioni
naturali. Il terreno di coltura (liquido) deve quindi contenere in precise concentrazioni aminoacidi, glucosio,
vitamine, sali minerali e siero, oltre ad antibiotici per
evitare possibili infezioni.
La coltivazione viene effettuata generalmente all’interno di un bioreattore a fibre cave (figura 5.8).
Si tratta di un cilindro in materiale plastico attraversato nel senso della lunghezza da un gran numero
di capillari (fibre cave) di alcuni millimetri di spessore,
costruiti con materiale microporoso e disposti orizzontalmente, che fungono da supporto semipermeabile per
le cellule (che si trovano quindi negli spazi extracapillari), mentre il terreno liquido di coltura viene inviato e
fatto circolare all’interno dei capillari (spazi intracapillari). La permeabilità dei capillari permette il passaggio
dei nutrienti e dei cataboliti, realizzando così un vero e
proprio sistema a perfusione. All’interno delle fibre
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PROTEINE UMANE RICOMBINANTI, ORMONI E ANTIBIOTICI
Antigene con
determinanti diversi
Permeato
Alimentazione
Immunizzazione
nel topo
Linfociti B
diversi per
differenti
determinanti
antigenici
Cellule di
mieloma
Fusione
Miscela di cellule
ibride e non fuse
Distribuzione in terreni
selettivi che inibiscono
le cellule non ibridate
Clonaggio
degli ibridomi
e verifica
della produzione
degli anticorpi
Retentato
Figura 5.8 Bioreattore a fibre cave.
terreno extracapillare contenente il prodotto desiderato,
che viene recuperato e purificato con tecniche di cromatografia a scambio ionico e per immunoaffinità.
Gli anticorpi monoclonali sono impiegati:
r come mezzo diagnostico, tecnica che prevede la
marcatura dell’anticorpo monoclonale con reagenti
che sviluppano luminescenza, radioattività, reazioni cromatiche. È possibile l’identificazione rapida
di antigeni virali o batterici e di cellule tumorali con
tecniche ELISA e di immunofluorescenza
r come sistema di separazione dei componenti di una
miscela (immunoseparazione)
r come vettori di farmaci verso cellule tumorali, nei
confronti delle quali è stata creata specificità di combinazione.
Anticorpi monoclonali
Figura 5.7 Anticorpi monoclonali. La figura illustra i passaggi
per la produzione di anticorpi monoclonali.
viene introdotta aria che filtra attraverso i micropori dei
capillari e arriva alle cellule. Aumentando la pressione
del terreno di coltura liquido negli spazi intracapillari,
le sostanze nutritive attraversano le fibre cave e vengono inviate alle cellule; diminuendo poi la pressione il
liquido rientra all’interno delle fibre portando con sé i
cataboliti di rifiuto. L’alternanza di questi cicli permette
una miscelazione ottimale del terreno. In queste condizioni la riproduzione cellulare è massima così come la
produzione di anticorpi monoclonali, che può perdurare per circa 30 giorni. A intervalli prefissati si preleva il
5.4 Produzione di interferoni
Gli interferoni (IFN) sono proteine specie-specifiche
prodotte dall’organismo in risposta a un’infezione virale.
Appartengono alle citochine, insieme con altri fattori solubili che attivano o inibiscono le complesse interazioni
cellulari nella risposta immunitaria: interleuchine, CSF
(fattore stimolante la formazione di colonie cellulari),
TNF (fattore di necrosi tumorale), TGF (fattore di crescita trasformante). La scoperta degli interferoni risale
alla seconda metà del secolo scorso e ha destato un alto
interesse per le possibili applicazioni di queste molecole
nella terapia di molte patologie e dei tumori. I costi di
produzione degli interferoni da cellule umane, all’inizio
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PROTEINE UMANE RICOMBINANTI, ORMONI E ANTIBIOTICI
5
sibile produrre interferone ricombinante inserendo e facendo esprimere il gene umano che codifica per la loro
sintesi in cellule di E. coli.
5.5 Produzione di ormoni
Figura 5.9 Struttura dell’interferone γ umano.
proibitivi, si sono progressivamente ridotti pur rimanendo elevati; parallelamente l’atteggiamento di medici e
ricercatori sulle prospettive di successo del loro impiego è divenuto molto più cauto, anche se rappresentano
comunque un’importante arma farmacologica. Nell’organismo umano vengono prodotti gli interferoni α, β, γ,
rispettivamente da leucociti, fibroblasti e linfociti T attivati dall’antigene (figura 5.9). La produzione industriale
riguarda soprattutto il tipo α, ottenuto dal clonaggio di
linee cellulari specifiche, oppure utilizzando microrganismi geneticamente modificati. La coltivazione di cellule
umane presenta sempre molte criticità per la loro natura
eucariotica estremamente complessa rispetto alla relativa
semplicità dei procarioti, per cui si preferisce in ogni caso
impiegare batteri o lieviti (fra gli eucarioti).
La coltivazione delle cellule di mammifero richiede
una prima fase in cui il tessuto prescelto viene trattato
con enzimi o sottoposto ad azione meccanica al fine di
staccare le une dalle altre le cellule, che poi vengono meglio separate con una centrifugazione molto delicata. Le
singole cellule vengono poi coltivate in bottiglie di vetro
schiacciate (Roux) e disposte su di un piano orizzontale
mantenuto in agitazione. Si passa quindi alla coltivazione su scala più grande, in bioreattori STR con agitazione
air-lift onde evitare eccessiva turbolenza della massa. Il
terreno di coltura liquido e tutti i parametri di coltivazione (temperatura, pH, tensione di ossigeno ecc.) devono
essere mantenuti rigidamente e costantemente sotto controllo. Il terreno viene sterilizzato tramite filtrazione su
membrana. L’interferone prodotto viene prima estratto
dalle cellule per filtrazione, quindi ulteriormente separato
dalla soluzione tramite cromatografia con tecnica HPLC.
Impiegando le tecniche di ingegneria genetica è pos-
Gli ormoni sono sostanze prodotte dalle ghiandole endocrine, che riversano il loro prodotto direttamente nel
sangue. Attraverso il circolo ematico gli ormoni raggiungono gli organi-bersaglio dove esercitano la loro azione
regolatrice su molte funzioni fisiologiche. Dal punto di
vista chimico si distinguono ormoni polipeptidici e ormoni steroidei. La carenza, la mancata o eccessiva produzione di un ormone si ripercuote sui delicati equilibri
fisiologici dell’organismo, generando quadri patologici
anche molto gravi o perfino incompatibili con la vita. È
quindi facilmente comprensibile come la biochimica e la
ricerca farmacologica abbiano da molto tempo concentrato i loro sforzi sulla possibilità di ricreare in laboratorio
queste molecole, nell’intento di poter curare le numerose
malattie da carenza ormonale. Il primo ormone sintetizzato artificialmente è stato la somatostatina (1977),
seguita poco tempo dopo dall’insulina, che ha permesso di curare nel mondo milioni di persone affette da diabete mellito. Il diabete è una complessa patologia causata
dall’insufficiente produzione di insulina da parte del pancreas con conseguente aumento della glicemia. Anche
nel campo della produzione di ormoni le biotecnologie
offrono la possibilità di creare ceppi batterici modificati
con l’inserimento dei geni che codificano per la sintesi
dell’ormone richiesto.
Ormoni polipeptidici
La somatostatina, l’insulina, l’eritropoietina, l’ormone
della crescita o somatotropina (HGH, human growth
hormon) sono i più importanti ormoni proteici prodotti
industrialmente. Gli ormoni proteici vengono prodotti in
bioreattori di tipo STR con agitazione meccanica e sistema di insufflazione d’aria. La separazione del prodotto di
interesse dalla biomassa richiede tecniche sofisticate quali
la cromatografia HPLC su resine a scambio ionico. Segue
una fase di eluizione con adatto solvente, la concentrazione e la cristallizzazione, da cui si ottiene il prodotto purificato.
81
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PROTEINE UMANE RICOMBINANTI, ORMONI E ANTIBIOTICI
Somatostatina
La somatostatina è un ormone proteico costituito da una
catena di appena 14 aminoacidi. Viene secreta dall’ipotalamo e regola la produzione di altri ormoni fra cui l’insulina e l’HGH. L’ormone si ottiene con la tecnologia del
DNA ricombinante. Una volta nota la sequenza nucleotidica della somatostatina, si è costruita “a ritroso” la sequenza genica artificiale, inserita poi nel plasmide batterico pBR322. Insieme a questo gene, è stato inserito nello
stesso plasmide quello che codifica per la sintesi dell’enzima β-galattosidasi, insieme con la regione di controllo
(operone lac). Tale enzima si è rivelato indispensabile
perché senza la sua sintesi E. coli non riconoscerebbe
come propria la somatostatina, che verrebbe aggredita e
distrutta. Il plasmide ricombinante con entrambi i geni
(somatostatina e β-galattosidasi) è quindi stato inserito
in E. coli che provvede alla sintesi dell’ormone. Si calcola
che in condizioni standard si possa arrivare a rese dell’ordine di decine di migliaia di molecole di somatostatina
per ogni cellula di E. coli coltivata in fermentatore.
Insulina
L’insulina è un ormone ipoglicemizzante, secreto dalle
cellule β delle isole di Langerhans della frazione endocrina del pancreas. La sua funzione è quella di permettere il trasferimento del glucosio dal sangue all’interno
delle cellule, dove viene utilizzato per produrre energia.
Una carenza di insulina provoca quindi un innalzamento della glicemia (tasso di glucosio nel sangue), diabete
e una serie di complesse patologie correlate. La struttura
chimica dell’insulina è costituita da due catene polipeptidiche, denominate A (21 aminoacidi) e B (30 aminoacidi), unite da ponti disolfuro. L’ormone viene secreto
come pro-insulina, forma che comprende anche una
terza catena proteica (C) che non ha alcuna attività nei
confronti del glucosio ma che serve a connettere fra di
loro le altre due catene, da cui in seguito si separa.
L’insulina è stata per lungo tempo estratta dal pancreas di bovini e suini prima di essere prodotta da microrganismi geneticamente modificati. In effetti l’ormone derivato da animali (non perfettamente identico
a quello umano) può spesso creare nei soggetti trattati
allergie e intolleranze. L’insulina ottenuta per via biotecnologica è invece assolutamente identica a quella umana. I microrganismi utilizzati e in cui è stato introdotto
il gene umano che controlla la sintesi di insulina non
DNA umano per la
sintesi della catena A
DNA umano per la
sintesi della catena B
Inserimento del DNA
nel plasmide munito
di regione di controllo
DNAr
DNAr
Inserimento del DNAr
nel batterio
Sintesi della catena A
Sintesi della catena B
Fusione delle catene A e B
(formazione dei ponti -S-S-)
Insulina umana
Figura 5.10 Insulina. In figura sono schematizzati i passaggi
per la sintesi dell’insulina. DNAr = DNA ricombinante.
sono però in grado di procedere al distacco del peptide
C dalla pro-insulina: questo inconveniente porta all’impossibilità di utilizzare la pro-insulina come farmaco.
Per superare questo inconveniente si producono separatamente le due catene A e B, per ricomporre in seguito
la catena completa (figura 5.10).
Si procede quindi a partire dalle sequenze aminoacidiche delle singole catene e si assemblano le corrispondenti sequenze nucleotidiche (i geni), che vengono inserite in due plasmidi separati insieme con il gene della
β-galattosidasi e della regione di controllo. I geni vengono introdotti separatamente in cellule di E. coli, da cui si
sviluppano cloni cellulari separati coltivati in bioreattori
distinti. In ciascun clone viene prodotta la catena A o la
catena B. Ciascuno di questi complessi molecolari viene estratto dalle miscele di reazione, purificato e trattato
per allontanare la β-galattosidasi. Le due catene A e B
vengono ulteriormente purificate e riunite chimicamente con la formazione dei ponti disolfuro.
HGH
L’ormone proteico somatotropina, formato da una catena di 121 aminoacidi, viene secreto dal lobo anteriore
dell’ipofisi e regola l’accrescimento corporeo agendo in
modo specifico sull’allungamento delle ossa lunghe. La
82
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5
PROTEINE UMANE RICOMBINANTI, ORMONI E ANTIBIOTICI
Vettore di espressione batterico
cDNA clonato di ormone della crescita umana
Codone d’inizio
Codone di stop
Ormone della crescita
ricombinante
Trasformazione
di E. coli
Taglio con enzimi
di restrizione
(e altre manipolazioni in vitro)
Sequenza codificante
l’ormone della crescita
Promotore
batterico
Purificazione dell’ormone
della crescita
NH2
Inserimento del gene
nel vettore di espressione
COOH
La sequenza proteica è identica a
quella dell’ormone della crescita naturale
Figura 5.11 Schema di produzione dell’ormone della crescita.
sua carente produzione in età prepuberale porta al nanismo ipofisario. Al termine dell’ossificazione (età postpuberale) un’eccessiva secrezione di ormone della crescita
conduce all’acromegalia, che si manifesta con un accrescimento non armonico delle ossa, un loro allungamento anomalo e conseguenti deformazioni. Poiché questo
ormone è specie-specifico non è mai stato possibile, contrariamente a quanto avvenuto per l’insulina, utilizzare in
terapia la somatotropina di origine animale. Si è perciò
proceduto con l’estrazione di HGH dai cadaveri e se ne
è anche tentata la sintesi chimica: nel primo caso con notevoli rischi di effetti collaterali, nel secondo con efficacia
molto ridotta rispetto all’ormone naturale. L’ingegneria
genetica in associazione con i tradizionali metodi di sintesi chimica (via biotecnologica integrata) ha permesso
di ottenere HGH in notevoli quantità, per rispondere alle
esigenze terapeutiche, allargate anche al trattamento di altre patologie (osteoporosi). Il ricorso parziale alla sintesi
chimica è necessario in quanto non si è riusciti a produrre
HGH a partire dallo specifico mRNA. La sua produzione
si può schematizzare nel modo seguente (figura 5.11):
r estrazione dall’ipofisi umana del mRNA
r azione dell’endonucleasi di restrizione
r stampo di cDNA con l’enzima trascrittasi inversa che
codifica per una sequenza della catena pari all’87%
dell’intera molecola
r la parte rimanente della catena proteica viene ottenuta
per sintesi chimica producendo una sequenza polinucleotidica che codifica per gli aminoacidi mancanti
r i due frammenti sono purificati e poi riuniti con la
DNA ligasi nel gene completo. Questo viene inserito nel plasmide pBR322 insieme con il gene per la
β-galattosidasi e la regione di controllo (lac)
r il plasmide viene inserito in E. coli che inizia a produrre HGH e β-galattosidasi
r dopo separazione tra HGH ed enzima, l’ormone viene estratto e purificato.
Eritropoietina
L’eritropoietina è un ormone secreto dai reni con funzione di eritropoiesi, promuove cioè nel midollo osseo
la formazione e la maturazione delle cellule staminali
eritropoietiche (pro-eritroblasti) in globuli rossi (eritrociti). Verificata l’importanza terapeutica dell’impiego di eritropoietina su pazienti sottoposti a dialisi e in
casi di insufficiente produzione di globuli rossi, sono
stati messi a punto metodi per la produzione industriale
dell’ormone, impiegando microrganismi geneticamente
modificati e linee cellulari eucariotiche (cellule dell’ovaio di criceto). La produzione di eritropoietina si articola
in diverse fasi:
r a partire dall’eritropoietina umana, estratta dal rene,
se ne stabilisce la sequenza aminoacidica da cui si ricava la corrispondente sequenza nucleotidica (DNA)
r questo DNA viene marcato per essere impiegato
come sonda (DNA probe) per la ricerca del gene
corrispondente
r il DNA umano viene frammentato in tante sequenze
nucleotidiche, ciascuna delle quali, tramite un virus
vettore, viene introdotta in altrettante cellule batteriche coltivate separatamente
r il DNA sonda viene introdotto nel mezzo di coltura
dove rivelerà in quali cellule si trova il gene ricercato
83
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5
PROTEINE UMANE RICOMBINANTI, ORMONI E ANTIBIOTICI
r MFDFMMVMFUSBTGPSNBUFWFOHPOPBNQMJėDBUFJODPMUVSB
r JMHFOFDPTÑBNQMJėDBUPWJFOFFTUSBĨPFNBSDBUPQFS
GVO[JPOBSFEBOVPWBTPOEB
r DPORVFTUP%/"TPOEBJOUSPEPĨPJOVOBNJTDFMBEJ
DFMMVMF EFM SFOF VNBOP TJ SJDFSDB JM DPSSJTQPOEFOUF
N3/"
r DPO RVFTUP N3/" TJ PĨJFOF DPO MB USBTDSJĨBTJ JOWFSTB JMDPSSJTQPOEFOUFD%/"*MD%/" HFOFQFS
MBTJOUFTJEJFSJUSPQPJFUJOBVNBOB WJFOFJOUSPEPĨP
JOVOQMBTNJEF
r JMQMBTNJEFWJFOFJOUSPEPĨPJODFMMVMFCBĨFSJDIFQFS
FTTFSFDMPOBUP
r JM HFOF DMPOBUP WJFOF JOTFSJUP JO DFMMVMF EJ PWBJP EJ
DSJDFUPDIFWFOHPOPQPJJOUSPEPĨFJOVOCJPSFBĨPSF
r M̮FSJUSPQPJFUJOBQSPEPĨBWJFOFFTUSBĨBFQVSJėDBUB
-̮FSJUSPQPJFUJOBFNFSHFQFSJPEJDBNFOUFBHMJPOPSJEFMMB
DSPOBDBQFSJMTVPVTPJNQSPQSJPDPNFsostanza dopante *O NPMUF EJTDJQMJOF TQPSUJWF TPQSBĨVĨP RVFMMF DIF
SJDIJFEPOPTGPS[JJOUFOTJFQSPMVOHBUJDPNFJMDJDMJTNP MBNBSDJBPMBDPSTBTVMVOHIFEJTUBO[F TJJNQJFHBJMMFDJUBNFOUFRVFTUPPSNPOFQFSBVNFOUBSFMBDPODFOUSB[JPOFEJHMPCVMJSPTTJOFMTBOHVF*MEPQJOHÍTWFMBCJMFDPO
l’ematocrito Ht VO̮BOBMJTJFNBUPMPHJDBDIFSJWFMBJM
CHO
HO
HO
5.6 Bioconversioni
1FSbioconversione BWPMUFJOEJDBUBBODIFDPNFCJPUSBTGPSNB[JPOF TJJOUFOEFVOBTJOUFTJDIJNJDBSFTBQJÜ
WFMPDF EBMM̮JOUFSWFOUP EJ CJPDBUBMJ[[BUPSJ 5BMF EFėOJ[JPOF JO SFBMUÆ BQQBSF FTUSFNBNFOUF HFOFSJDB UVĨF MF
QSPEV[JPOJCJPUFDOPMPHJDIFQPTTPOPFTTFSFDPOTJEFSBUF
USBTGPSNB[JPOJ CJPMPHJDIF EJ VO TVCTUSBUP DIF QVÖ SFBMJ[[BSTJ DPO M̮JOUFSWFOUP EJ FO[JNJ JTPMBUJ P EJ DFMMVMF
NJDSPCJDIF in toto -B HSBO QBSUF EFMMF CJPDPOWFSTJPOJ SJHVBSEB QFSÖ MP TWJMVQQP EJ sintesi chemio-enzi-
CH 2 OH
H2 /cat
HO
HO
OH
HO
WPMVNFQFSDFOUVBMFPDDVQBUPEBHMJFSJUSPDJUJOFMTBOHVF
7BMPSJOPSNBMJEJFNBUPDSJUPPTDJMMBOPOFMM̮VPNPGSBJM
FJM OFMMBEPOOBGSBJMFJM7BMPSJNPMUP
QJÜBMUJ RVBMJTJSJMFWBOPOFJDBNQJPOJFNBUJDJDIFSJTVMUBOPQPTJUJWJBJDPOUSPMMJ SFOEPOPPWWJBNFOUFJMTBOHVF
BTTBJNFOPĚVJEPDPOVOFMFWBUPSJTDIJPQFSGPSNB[JPOF
EJUSPNCJ DPBHVMB[JPOFJOUSBWBTBMF FHSBWJEBOOJSFOBMJ
UVĨP JM TBOHVF WJFOF DPOUJOVBNFOUF NJDSPėMUSBUP OFJ
HMPNFSVMJ SFOBMJ M̮FDDFTTJWB DPODFOUSB[JPOF EJ HMPCVMJ
SPTTJOPOQFSNFĨFJMSFHPMBSFGVO[JPOBNFOUPEFJOFGSPOJ MFVOJUÆGVO[JPOBMJEFJSFOJ CH 2 OH
O
Acetobacter suboxydans HO
OH
OH
HO
CH 2 OH
D-glucosio
HO
CH 2 OH
CH 2 OH
D-sorbitolo
L-sorbosio
5 passaggi sintetici
O
O
HO
Acido ascorbico HO
(vitamina C)
HO
CH 2 OH
Figura 5.12 Vitamina C. Schema della sintesi della vitamina C con il processo Reichstein.
84
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PROTEINE UMANE RICOMBINANTI, ORMONI E ANTIBIOTICI
Glucocorticoidi
O
O
CH2OH
CH3
OH
O
HO
Cortisone
CH2OH
CH3
Corticosterone
CH3
CH3
O
O
O
Mineralcorticoidi
HO
CH2OH
CHO
Aldosterone
CH3
O
Androgeni
CH3
O
OH
CH3
Testosterone
Androsterone
CH3
CH3
HO
O
Estrogeni
CH3
OH
CH3
O
Estrone
OH
CH3
Estradiolo
OH
Estriolo
CH3
HO
OH
HO
O
Progestinici
CH3
CH3
Progesterone
CH3
O
Figura 5.13 Ormoni steroidei. In figura è riportata una classificazione degli ormoni maggiormente utilizzati in campo
farmacologico.
85
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5
PROTEINE UMANE RICOMBINANTI, ORMONI E ANTIBIOTICI
matiche, in cui cioè compaiono sia reazioni chimiche
tradizionalmente intese che trasformazioni biologiche.
Alcuni microrganismi si sono in effetti dimostrati in grado di intervenire nel processo produttivo di determinate sostanze sostituendosi in alcuni passaggi alla sintesi
chimica. Uno dei vantaggi offerti dalle bioconversioni
consiste nell’alta specificità e selettività della reazione
biocatalizzata: in particolare risulta molto vantaggiosa la
stereoselettività, cioè l’azione su uno solo dei possibili
stereoisomeri di una molecola. Bioconversioni intervengono, per esempio, nella produzione della vitamina C e
in quella degli ormoni steroidi.
Produzione di vitamina C
La vitamina C viene prodotta utilizzando 5 step di sintesi chimica ma anche con l’intervento del microrganismo
Gluconobacter oxydans (Acetobacter suboxydans) che
effettua la bioconversione selettiva di ossidazione del dsorbitolo a l-sorbosio (processo Reichstein). Lo schema
di sintesi è riportato sommariamente in figura 5.12.
Bioconversione di ormoni steroidi
Gli ormoni steroidi presentano una formula di base comune, riconducibile al ciclopentanoperidrofenantrene.
La diversa tipologia e funzionalità degli ormoni steroidi è
da attribuirsi ai vari sostituenti dell’anello.
Una schematica classificazione degli ormoni steroidi
li suddivide in (figura 5.13):
r glucocorticoidi
r mineralcorticoidi
r androgeni
r estrogeni
r progestinici.
I glucocorticoidi comprendono fra gli altri il cortisone e
il corticosterone, sono secreti dalla corteccia surrenale e
la loro concentrazione ematica aumenta in condizioni di
stress. Hanno azione antinfiammatoria e immunodepressiva; influenzano il metabolismo glucidico.
I mineralcorticoidi, fra cui l’aldosterone, sono
anch’essi secreti dalla corteccia surrenale e regolano a
livello renale l’escrezione e il riassorbimento degli ioni
sodio e potassio e dell’acqua.
Gli androgeni, fra cui il testosterone e l’androsterone, sono secreti dal tessuto interstiziale dei testicoli e
dalla corteccia surrenale. Il testosterone influenza la produzione di spermatozoi e, insieme con gli altri androgeni, è responsabile dello sviluppo dei caratteri sessuali
secondari nel maschio. Questi ormoni steroidi hanno
anche una spiccata azione anabolizzante.
Gli estrogeni più importanti sono l’estrone, l’estradiolo e l’estriolo. Vengono prodotti dagli organi sessuali
secondari femminili (ovaie e corpo luteo), regolano il
ciclo mestruale e lo sviluppo dei caratteri sessuali secondari femminili. I progestinici sono rappresentati
soprattutto dal progesterone, secreto dal corpo luteo.
Regolano il ciclo mestruale inibendo la produzione delle gonadotropine ipofisarie (LH e FSH) che promuovono la maturazione dell’ovulo. Sono quindi ormoni con
attività contraccettiva.
Dal punto di vista industriale l’importanza di questi
ormoni è legata al loro impiego in campo farmacologico
come antinfiammatori, anabolizzanti e contraccettivi.
Per la loro produzione si utilizzano substrati rappresentati da altri steroidi animali o vegetali che vengono
modificati in parte da microrganismi (bioconversione)
e per il resto chimicamente. Molti steroli sono estratti
da vegetali e impiegati come substrati-base per ottenere molecole di elevato interesse farmacologico: vegetali
come il barbasco (nome che indica alcune piante del
genere Dioscorea) e la soia forniscono, rispettivamente,
substrati quali la diosgenina e lo stigmasterolo, molecole impiegate per la produzione di progesterone e
altri steroli. Alcuni microrganismi impiegati in reazioni
di bioconversione sono Gluconobacter oxydans, Mycobacterium fortuitum, Rhizopus arrhizus e Arthrobacter
simplex. Le modificazioni operate da tali microrganismi
(idrossilazione, degradazione selettiva di catene laterali,
introduzione di doppi legami, deidrogenazioni, ossidazioni ecc.) richiederebbero, se effettuate chimicamente,
reazioni più complesse con un maggior numero di passaggi e condizioni operative più critiche.
5.7 Produzione di antibiotici
Gli antibiotici sono molecole prodotte da microrganismi, attive nei confronti di altri microrganismi di cui
inibiscono lo sviluppo. L’azione antimicrobica di un antibiotico può esprimersi come eliminazione dei micror-
86
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PROTEINE UMANE RICOMBINANTI, ORMONI E ANTIBIOTICI
ganismi (effetto microbicida) o come blocco della loro
riproduzione (effetto microbiostatico). La produzione
di antibiotici, iniziata negli anni ’40 del secolo scorso,
diversi anni dopo la scoperta della penicillina da parte di Fleming (1928), ha avuto da allora un incessante
sviluppo, con la progressiva scoperta e messa a punto di
nuove molecole, più efficaci e contemporaneamente più
tollerate dall’organismo. Le ricerche ricevono continuo
impulso dalla constatazione del costante diffondersi
dei fenomeni di resistenza microbica: si assiste quindi
al continuo sforzo per la sintesi di nuove molecole, che
però dopo qualche tempo risultano molto meno efficaci per le sopravvenute resistenze. Un più ampio ventaglio di possibilità alla ricerca farmacologica è offerto
dall’avvento delle biotecnologie, con la possibilità di
modificare geneticamente i microrganismi produttori
di antibiotici indirizzando il loro metabolismo verso la
produzione di molecole in grado di aggirare le resistenze
batteriche. Si calcola che si conoscano diverse migliaia
di sostanze ad azione antimicrobica, delle quali però
solo una quota relativamente modesta (un centinaio circa) trova impiego nella terapia antimicrobica. Altre vengono utilizzate come farmaci antitumorali, quando si è
disposti a tollerare una serie di effetti collaterali anche
pesanti pur di allungare la sopravvivenza del paziente.
Per la produzione di antibiotici su scala industriale si
utilizzano substrati colturali che in genere provengono
da scarti di altre lavorazioni: residui agricoli della lavorazione di barbabietole da zucchero, mais, graminacee
e dell’industria lattiero-casearia. I terreni di coltura devono in ogni caso contenere fonti di carbonio organico
(amido, polisaccaridi, monosaccaridi) e di azoto come
proteine e aminoacidi ricavati da estratti di carne, farine
animali o vegetali, latte e derivati. Sono indispensabili
sali minerali, vitamine, fattori di crescita. Nella produzione industriale degli antibiotici si distinguono fasi di
sporificazione, germinazione e vegetazione condotte nei
germinatoi e fasi di produzione all’interno dei fermentatori: per ognuna di queste si utilizzano terreni diversi,
arricchiti con le componenti nutritive più appropriate a
seconda degli obiettivi specifici (per es. indurre la formazione di spore, la crescita cellulare o la produzione
del metabolita desiderato).
Come metaboliti secondari gli antibiotici vengono
prodotti dai microrganismi nella fase stazionaria di sviluppo; la loro sintesi è sotto il controllo di più di un gene,
per cui risulta piuttosto difficoltoso intervenire sul DNA
5
microbico: spesso si preferisce procedere con tecniche
mutazionali nel tentativo di creare e selezionare ceppi
alto-produttivi e ottenere molecole in grado di aggirare
le resistenze batteriche.
Accanto agli antibiotici naturali è possibile ottenere antibiotici semisintetici, che derivano da modificazioni del prodotto microbico originario effettuate artificialmente in laboratorio, sostituendo gruppi chimici o
catene laterali nella molecola di base.
I microrganismi più impiegati per la produzione di
antibiotici sono le muffe (Aspergillus, Penicillium), i batteri filamentosi (Streptomyces), altri batteri non filamentosi (Bacillus). Si noti che il solo genere Streptomyces
produce da solo oltre la metà delle sostanze antimicrobiche.
5.8 Classi strutturali e meccanismo
d’azione degli antibiotici
Gli antibiotici possono essere classificati in base alla loro
struttura chimica e/o al loro meccanismo d’azione.
Antibiotici che inibiscono la sintesi
della parete cellulare batterica
Gli antibiotici β-lattamici agiscono bloccando le fasi
finali della sintesi della parete cellulare, con bersagli
d’azione molecolari negli enzimi transpeptidasi e carbossipeptidasi. Sono rappresentati da penicilline, ottenute da Penicillium chrysogenum, e cefalosporine,
prodotte da Cephalosporium acremonium (Acremonium
chrysogenum). Devono il loro nome alla presenza di
un anello caratteristico a 4 atomi di carbonio (anello
β-lattamico). Questa caratteristica ne costituisce anche
il punto debole, dal momento che molti microrganismi
producono l’enzima β-lattamasi, in grado di rompere
l’anello inattivando l’antibiotico (figura 5.14). Gli antibiotici β-lattamici semisintetici sono generalmente più
resistenti.
Questi antibiotici sono fra quelli più frequentemente impiegati nella terapia delle infezioni batteriche: per
la loro efficacia, la bassa tossicità e lo spettro d’azione
piuttosto ampio costituiscono da soli circa la metà degli
antibiotici oggi utilizzati. Il problema dell’antibioticoresistenza ad opera delle β-lattamasi batteriche viene su87
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5
PROTEINE UMANE RICOMBINANTI, ORMONI E ANTIBIOTICI
O
R
C
S
NH
CH3
CH
CH
C
C
N
CH
R4
R3 R2
CH3
COOH
H
R1
H
N(CH3)2
OH
OH O OH O
O
CONH
R5
Tetraciclina
Penicillasi
O
R
C
S
NH
O
CH3
CH
CH
C
C
N
H
CH
CH3
COOH
HO
Figura 5.14 Penicillasi. La figura illustra il meccanismo
d’azione della penicillasi, enzima che rompe l’anello β-lattamico
delle penicilline.
O
CH3
H2O
H2O
HO
N CH3
OH HO
OH CH
H2O
3
H
C
H2O
O
O 3
O
O
O
CH3
CH3
O CH
3
O
CH3
H2O OH
Eritromicina
perato associando all’antibiotico un’altra molecola priva
di attività antimicrobica, ma in grado di inibire l’azione
dell’enzima formando con esso un legame covalente irreversibile: l’acido clavulanico, prodotto da batteri del
genere Streptomyces, in particolare dallo Streptomyces
clavoligerus. L’augmentin, uno degli antibiotici più noti,
è infatti un’associazione di ampicillina e acido clavulanico. È da sottolineare che l’acido clavulanico funziona
come inibitore delle β-lattamasi prodotte da stafilococchi e da gran parte dei Gram-negativi, ma risulta praticamente inefficace su quelle prodotte da Pseudomonas.
Figura 5.15 Formule dell’eritromicina e della tetraciclina.
Il gruppo degli aminoglicosidici è molto vasto e
comprende antibiotici prodotti soprattutto da attinomiceti appartenenti ai generi Streptomyces e Micromonospora. Streptomicina, kanamicina, gentamicina e neomicina, carboidrati con gruppi aminici come sostituenti,
sono fra i più noti. Agiscono inibendo la sintesi proteica
legandosi alla frazione 16S della subunità ribosomiale 30S. Alcuni derivati semisintetici come l’amicacina
sono attivi anche nei confronti di batteri resistenti agli
altri aminoglicosidici.
Antibiotici che bloccano la sintesi
proteica
Appartengono a questo gruppo tetracicline, macrolidi e
aminoglicosidici.
Le tetracicline hanno una molecola costituita da
quattro anelli condensati linearmente (figura 5.15a).
Questi antibiotici agiscono inibendo la sintesi proteica
legandosi alla subunità ribosomiale 30S e impedendo il
legame fra tRNA e ribosoma.
I macrolidi sono costituiti da un anello macrolattonico a 12-16 atomi di carbonio. Vi appartengono
l’eritromicina prodotta da Saccharopolyspora erythraea
(figura 5.15b), l’azitromicina e la claritromicina. Agiscono inibendo la sintesi proteica: si legano con la frazione
23S della subunità ribosomiale 50S, con un meccanismo d’azione specifico che blocca il rilascio dei peptidi
neoformati dai ribosomi.
Antibiotici che alterano le funzioni della
membrana cellulare
I polipeptidici, fra cui bacitracina (da Bacillus subtilis) e
polimixina (da Paenibacillus polymixa), agiscono interferendo con la funzionalità della membrana cellulare batterica, provocandone la lisi.
Antibiotici che interferiscono
con la sintesi degli acidi nucleici
La novobiocina agisce sulla topoisomerasi 2 batterica,
coinvolta nella sintesi del DNA; le rifamicine bloccano
la sintesi dell’RNA inattivando l’RNA polimerasi batterica.
88
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5
PROTEINE UMANE RICOMBINANTI, ORMONI E ANTIBIOTICI
O
5.9 Produzione di penicilline
e cefalosporine
S
CH2
C
CH3
NH
CH3
N
La produzione industriale degli antibiotici prevede una
trofofase (stadio vegetativo per lo sviluppo di biomassa) e una idiofase (fase biosintetica di produzione) in
cui il metabolita batterico, cioè l’antibiotico, viene prodotto. Nella trofofase, o stadio vegetativo, il terreno di
coltura è particolarmente arricchito ed è messo a punto
con l’unico obiettivo di avere il massimo sviluppo cellulare. Lo sviluppo avviene su scala ridotta, in fermentatori semplici e di piccole dimensioni. La produzione avviene con tecnologia fed-batch in reattori STR in acciaio
inox di dimensioni non eccessive (30-200 m3) per minimizzare il rischio di inquinamento microbico, pericolo
frequente per il pH non selettivo del mezzo colturale,
l’aggiunta progressiva di nutrienti, i tempi relativamente
lunghi del processo.
Penicillina G o Benzilpenicillina
O
S
L’unione fra anello tiazolidinico e anello β-lattamico dà
origine all’acido 6-aminopenicillanico (6-APA), molecola base delle penicilline semisintetiche (figura 5.17).
È soprattutto la composizione della catena laterale
C
CH3
NH
CH3
N
COOH
O
Penicillina V o Fenossimetilpenicillina
O
S
CH
C
CH3
NH
CH3
N
NH2
COOH
O
Ampicillina
O
S
Oxacillina
Gli antibiotici β-lattamici vengono sintetizzati partendo
da aminoacidi e sono caratterizzati da:
r anello β-lattamico (indispensabile per l’attività antimicrobica)
r anello tiazolidinico (dagli aminoacidi valina e cisteina)
r catena laterale, la cui struttura differenzia le varie
penicilline.
CH2
O
Produzione di penicillina
La penicillina viene prodotta da colture di Penicillium
chrysogenum. Le penicilline ottenute vengono impiegate
sia in farmacologia umana e veterinaria, sia come molecole-base per ottenere le penicilline semisintetiche. È possibile distinguere diversi tipi di penicilline:
r naturali (G e V) (figura 5.16)
r semisintetiche (ampicillina, amoxicillina)
r resistenti alla β-lattamasi (meticillina, cloxacillina,
oxacillina)
r ad ampio spettro, attive anche su Pseudomonas (carbenicillina, meziocillina, piperacillina).
COOH
O
C
C
N
C
O
C
NH
N
O
CH3
CH3
COOH
CH3
Figura 5.16 Caratteristiche delle penicilline naturali. La
struttura comune di tutte le penicilline è composta da un anello
β-lattamico e un nucleo tiazolidinico.
a influenzare le proprietà dell’intera molecola quanto a
resistenza in ambiente acido, spettro antimicrobico, sensibilità alla β-lattamasi e ad altre proprietà farmacologiche. L’acido fenilacetico e fenossiacetico devono essere
aggiunti come precursori delle catene laterali delle penicilline G e V. Impiegando precursori diversi è possibile
ottenere un numero elevato di molecole, delle quali solo
alcune possiedono attività antimicrobica e sono utilizzabili in farmacologia.
Penicilline naturali
Sono di origine naturale la penicillina G (benzilpenicillina) e V (fenossimetilpenicillina). Il microrganismo
coinvolto nella loro sintesi è Penicillium chrysogenum
(Fleming aveva impiegato il Penicillium notatum), che
dopo innumerevoli processi di mutagenesi e ricombinazione genetica può produrre penicillina con una buona
resa (50 g/L). La produzione ha luogo in coltura som89
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5
PROTEINE UMANE RICOMBINANTI, ORMONI E ANTIBIOTICI
mersa, alla temperatura di 25-27 °C. La produzione si
suddivide in due fasi successive:
r fase I o di sviluppo (trofofase): utilizza un terreno
di coltura composto da saccarosio o glucosio (fonti
di C), oli vegetali in funzione di antischiuma, corn
steep liquor (fonte di N), fattori vari di crescita. Il pH
viene mantenuto su valori di 6-7, controllando che
il corn-steep liquor non provochi eccessiva acidità nel
substrato.
r fase II o di produzione (idiofase): il terreno di
coltura utilizza lattosio o glucosio, con un pH mantenuto intorno a 7-7,2. Accorgimenti di particolare
importanza da adottare per non abbassare la resa
produttiva consistono nell’evitare di fornire un eccesso di fonti di carbonio e di azoto che potrebbero innescare fenomeni di inibizione a feedback. Per
questo si utilizza il rifornimento di carbonio in fedbatch, tarando la velocità di rifornimento su quella di
utilizzazione e mantenendo la concentrazione di C
inferiore a quella che produce inibizione. È preferibile inoltre impiegare fonti complesse di N (e C) che
per loro natura vengono metabolizzate lentamente.
Devono essere aggiunti acido fenilacetico e fenossiacetico come precursori delle catene laterali. La penicillina viene isolata per estrazione in controcorrente
con acetato di amile.
più resistenti alla β-lattamasi e presentano un più ampio
spettro di attività antimicrobica.
Cefalosporine
La loro scoperta in ceppi di Cephalosporium chrysogenum si deve al ricercatore italiano G. Botzu (1945) mentre al 1964 risale l’introduzione sul mercato della prima
cefalosporina semisintetica. Le cefalosporine hanno
uno spettro d’azione più ampio delle penicilline, nonché un minor grado di tossicità. Quelle utilizzabili in
farmacologia si sono succedute nel corso del tempo in
varie generazioni:
r I generazione: attive soprattutto sui Gram-positivi
r II generazione: attive soprattutto sui Gram-negativi,
meno sui Gram-positivi; discretamente resistenti
alla β-lattamasi
r III generazione: molto attive nei confronti dei Gramnegativi, buona resistenza alla β-lattamasi, miglior
farmacocinetica
Produzione di cefalosporine a partire dalla penicillina
Penicillina G
Substrato di partenza
Espansione anello tiazolidinico
Penicilline semisintetiche
Cefalosporina
Vengono prodotte a partire da penicillina G (raramente
V) previo distacco della catena laterale ad opera dell’enzima penicillina acilasi (generalmente ottenuto da ceppi mutanti di E. coli) con formazione di 6-APA (figura
5.17). Viene poi aggiunta per sintesi chimica una diversa
catena laterale. Le penicilline semisintetiche presentano
un grado di stabilità più elevato in ambiente acido, sono
Catena laterale
7-ACA
Inserimento catena laterale
Cefalosporina
di semisintesi
Espansione dell’anello tiazolidinico
S
S
Acido 6-aminopenicillanico (6-APA)
H2N
O
H H
S
CH3
R
+ catena
N
CH3 laterale
R
H
CO2H
Distacco catena laterale
con penicillina aciliasi
HN
H H
N
O
S
CH3
CH3
H
CO2H
Figura 5.17 Preparazione di penicilline semisintetiche
e attività delle penicilline.
N
O
N
O
6-APA
7-ACA
Figura 5.18 Produzione di cefalosporine e di 7-ACA
partendo da 6-APA.
90
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PROTEINE UMANE RICOMBINANTI, ORMONI E ANTIBIOTICI
r IV generazione: ampio spettro d’azione sia su
Gram-positivi che su Gram-negativi, resistenti alla
β-lattamasi.
La produzione delle cefalosporine naturali (cefalosporina C o CPC) avviene con una procedura analoga
a quella delle penicilline naturali, con la dovuta attenzione anche in questo caso ai fenomeni di inibizione
da feedback in presenza di sorgenti di C e N a pronta
assimilazione. Le cefalosporine semisintetiche vengono prodotte da cefalosporina C o anche da penicillina
G e V.
In entrambi i casi l’acido 7-aminocefalosporanico (7ACA), ottenuto dalla molecola di CPC dopo il distacco
della catena laterale, rappresenta il composto chiave a
cui vengono aggiunte catene laterali diverse, così come
avviene per l’acido 6-aminopenicillanico (6-APA) nella
produzione delle penicilline. Il distacco della catena laterale originaria viene effettuato per via enzimatica con
una acilasi ottenuta da E. coli.
Partendo da penicillina, in particolare da penicillina G, si procede dapprima con l’espansione dell’anello
tiazolidinico (figura 5.18), quindi con il distacco della
catena laterale.
5
5.10 Statine e altre molecole di
impiego medico e zootecnico
Altre importanti molecole sono prodotte da microrganismi; fra queste le statine sono molecole impiegate per
la terapia della ipercolesterolemia. Esse agiscono infatti
inibendo a livello epatico la sintesi di colesterolo. Anche
se alcune fra le principali statine sono prodotte per sintesi chimica, altre sono naturali o semisintetiche come la
lovastatina, la pravastatina e la simvastatina prodotte da
Aspergillus terreus, Monascus ruber, Penicillium spp.
Doxorubicina (adriamicina), bleomicina e mitomicina sono (antibiotici) antitumorali prodotti da alcuni
streptomiceti. L’epotilone è un altro antitumorale prodotto da un micobatterio, con meccanismo d’azione
simile al taxolo, originariamente estratto da Taxus brevifolia, ma che può anche essere prodotto da un fungo
endofitico.
Fra le sostanze ad azione immunosoppressiva, la
ciclosporina A, prodotta da Tolypocladium inflatum è la
molecola più nota; altri immunosoppressori sono l’acido micofenolico e il brenidin, prodotti, rispettivamente,
da Penicillium e da Eupenicillium.
Sostanze come le avermectine, prodotte da Streptomyces avermitilis, sono ampiamente usate come antiparassitari contro nematodi e artropodi nei bovini,
ovini e maiali. Altre sostanze ad azione antibiotica (polieteri) sono impiegate contro i coccidi nel pollame.
91
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ESERCIZI DI VERIFICA
1. Le penicilline e le cefalosporine agiscono:
A impedendo la sintesi della membrana cellulare
B interferendo con la sintesi proteica
C impedendo la formazione di legami del peptidoglicano
D inibendo la funzionalità della membrana cellulare
2. Per tossicità selettiva di un antibiotico si
intende la capacità di essere:
A dannoso per una specie batterica e non per
altre
B dannoso per i batteri e non per i tessuti
dell’ospite
C tossico per le specie batteriche selezionate
con l’antibiogramma
3. Gli antibiotici β-lattamici sono:
A penicilline e cefalosporine
B tetracicline
C aminoglicosidici
4. La β-lattamasi è un enzima prodotto:
A dagli antibiotici β-lattamici
B da alcuni batteri
C dai microrganismi sensibili alle penicilline
5. L’acido clavulanico è un:
A antibiotico β-lattamico
B inibitore della β-lattamasi
C un prodotto secondario nella produzione
delle penicilline e delle cefalosporine
6. La biosintesi mutazionale o mutasintesi è
una tecnica che consente di:
A creare antibiotici resistenti
B creare microrganismi incapaci di sintetizzare determinati precursori molecolari
C selezionare microrganismi in grado di produrre mutazioni particolari
8. La produzione di penicillina è massima:
A nella fase di crescita stazionaria
B nella fase di crescita logaritmica
C quando le cellule non si riproducono più e
svolgono solo attività metabolica
9. Lo spettro d’azione di un antibiotico è:
A la varietà di microrganismi su cui è efficace
B la capacità di essere tossico per i batteri e
non per gli organismi superiori
C la possibilità di agire in vari modi sui microrganismi
10. Il testosterone è un ormone:
A femminile
B maschile
C antinfiammatorio
11. Gli ormoni sono prodotti da:
A ghiandole endocrine
B ghiandole esocrine
C proteine circolanti nel sangue
D midollo osseo
E ghiandole che riversano il loro contenuto indirettamente all’esterno del corpo
12. L’insulina è formata da:
A tre catene polipeptidiche
B due catene polipeptidiche
C quattro catene polipeptidiche uguali due a
due
13. Gli anticorpi monoclonali sono:
A anticorpi in grado di inattivare solo un clone
di cellule antigeniche
B anticorpi che derivano da uno stesso clone
di cellule
C linfociti B tutti uguali fra di loro
7. La penicillina è prodotta mediante colture:
A anaerobie sommerse
B aerobie sommerse
C aerobie su terreno solido
92
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6
PRODUZIONI
BIOTECNOLOGICHE
ALIMENTARI
6.1 Il vino
6.2 L’aceto
6.3 La birra
6.4 Il pane e i prodotti da forno
a lievitazione naturale
6.5 Lo yogurt
6.6 I vegetali fermentati
6.7 Esopolisaccaridi
Le biotecnologie tradizionali per la produzione di alimenti e bevande si sono tramandate per millenni; la nascita
della microbiologa e in tempi molto più recenti quella
delle tecnologie del DNA ricombinante hanno poi permesso di gestire questi processi, utilizzati prima in modo
inconsapevole, secondo criteri scientificamente più corretti, a tutto vantaggio della qualità del prodotto e della
sicurezza del consumatore.
Tutti i processi fermentativi utilizzati prima che si conoscessero i microrganismi possono essere interpretati
come tecniche empiriche di conservazione o di utilizzo
diversificato di risorse alimentari evitandone lo spreco:
così il latte si “conserva” più a lungo se trasformato in yogurt o ancora di più in formaggio; i vegetali si conservano
se fermentati; il vino può essere un modo di conservare
l’uva, bevande come la birra hanno indubbiamente caratteristiche più piacevoli e meno pericolose dal punto di
vista microbiologico di un’acqua di dubbia provenienza.
6.1 Il vino
Il batterio Leuconostoc (© Dennis Kunkel Microscopy, Inc.).
La produzione del vino, così come quella di altre bevande alcoliche, risale a tempi molto antichi, effettuata tradizionalmente con metodi empirici. Solo quando ci si rese
conto che erano microrganismi (i lieviti) i veri artefici della trasformazione del succo d’uva in vino si è passati lentamente dalla produzione artigianale (che comunque perdura tuttora, figura 6.1a) a quella di impronta industriale,
basata sull’impiego di tecnologie avanzate e su conoscenze biochimiche e microbiologiche approfondite (figura
6.1b). L’odierna produzione di vini di qualità impiega
93
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PRODUZIONI BIOTECNOLOGICHE ALIMENTARI
ces ellipsoideus. I lieviti apiculati sono gli iniziatori della
fermentazione e sono caratterizzati da basso potere fermentativo e scarsa alcol-tolleranza (max 6-8%). Vengono ben presto sostituiti dagli ellittici che mostrano una
più elevata tolleranza all’etanolo fino a una concentrazione di alcol prossima al 16%.
La produzione industriale si avvale di colture di
lieviti selezionati, che vengono inoculati nel mosto dopo
una sua pastorizzazione. L’inoculo viene generalmente
eseguito inizialmente con colture di Saccharomyces rosei
come starter, quindi con S. cerevisiae in grado di portare
la produzione di alcol fino al 13% circa ed eventualmente
con S. bayanus che, fermentando tutto lo zucchero presente, può arrivare a produrre fino al 16% di alcol etilico.
La fermentazione alcolica è indubbiamente la trasformazione biochimica principale nella produzione del
vino, con un coefficiente di resa effettiva pari a circa 0,6
in volume di alcol etilico (capitolo 4):
C6H12O6
2 C2H5OH + 2CO2
Accanto a questa reazione se ne verificano altre, in quella che si può definire, nel complesso, “fermentazione
vinaria” e che porta allo sviluppo di numerose sostanze
chimiche che nel loro insieme contribuiscono al caratteristico “bouquet” di un certo tipo di vino. Tali reazioni
sono, fra le altre:
r la trasformazione del diidrossiacetonfosfato in glicerina
r la fermentazione di aminoacidi, che porta alla liberazione di alcoli superiori
r la fermentazione malolattica, che consiste nella trasformazione di acido malico in acido lattico ad opera
di lattobacilli. Questa fermentazione porta alla diminuzione dell’acidità del vino e alla maturazione del
prodotto e risulta particolarmente importante nei vini
rossi, cui conferisce corpo e rotondità (figura 6.2).
COOH
6
Nel processo produttivo si devono poi registrare altri
processi di tipo fisico-chimico, come precipitazione di
sostanze insolubili, decantazioni e solubilizzazione di coloranti presenti nella buccia.
Alterazioni microbiche del vino
Il vino può andare incontro ad alterazioni di origine microbica, anche se si tratta di eventi piuttosto rari in quanto
facilmente prevenibili con la pastorizzazione e la solfitazione dei mosti durante la fermentazione:
r lo sviluppo di batteri acetici (Gluconobacter e Acetobater) causa spunto e acescenza, che conducono alla
trasformazione dell’alcol in aceto
r i batteri lattici (Lactobacillus, Leuconostoc e Pediococcus) danno origine a diverse alterazioni, fra cui
l’agrodolce (sviluppo di acido lattico, acido acetico
e mannite), il filante (vino di consistenza mucillaginosa), l’amaro, il girato (intensa torbidità e sviluppo
di CO2)
r la fioretta è dovuta allo sviluppo di lieviti (Candida,
Pichia, Hansenula) che provocano la formazione di
un velo biancastro superficiale quando il vino viene
lasciato a contatto con l’aria.
6.2 L’aceto
L’aceto di vino è prodotto da ceppi di Acetobacter e Gluconobacter in grado di ossidare l’alcol etilico ad acido acetico. Si tratta quindi di un’ossidazione e non di una fermentazione. Il processo biochimico presenta una fase in cui
un’alcol-deidrogenasi catalizza la formazione di acetaldeide, subito deidrogenata ad acido acetico da un’aldeidedeidrogenasi in presenza di NAD+. Elettroni e idrogeno
COOH
CHOH
CHOH
+
CO2
Malicodecarbossilasi
CH2
CH3
COOH
Acido malico
Acido lattico
Figura 6.2 Fermentazione malolattica.
95
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6
PRODUZIONI BIOTECNOLOGICHE ALIMENTARI
r essiccazione/torrefazione, in cui l’orzo germinato
viene riscaldato fino a circa 70 °C per l’essiccazione
della radichetta che viene eliminata. Il malto così ottenuto si utilizza per la produzione della birra chiara,
mentre per ottenere quella scura occorre raggiungere i 105 °C, temperatura alla quale si ha una parziale
caramellizzazione degli zuccheri.
L’aggiunta di altri cereali richiede una loro preventiva
macinazione e riduzione in farina.
A queste operazioni segue l’ammostamento o saccarificazione, che ha lo scopo di ottenere un mosto zuccherino fermentabile e che consiste nella macinazione
del malto e nella sua miscelazione con la farina di cereali e acqua, poi riscaldata per diverse ore a temperature
comprese fra 45 e 73 °C. Le temperature vanno scelte
in funzione dell’attività enzimatica di amilasi e proteasi,
che devono degradare i polisaccaridi e le proteine per
fornire ai lieviti monomeri utilizzabili. La saccarificazione prevede una prima fase di infusione (riscaldamento della miscela a 65 °C attraverso l’infusione di acqua
calda e successiva filtrazione per eliminare i residui in
sospensione o trebbie) e quindi la decozione, in cui il
mosto viene addizionato di luppolo e portato all’ebollizione per circa tre ore, per estrarne le sostanze aromatiche e sterilizzare il tutto.
Il mosto viene a questo punto raffreddato fino a
6 °C, filtrato e inoculato con i lieviti prescelti, quindi
viene immessa una certa quota di ossigeno per attivare
la riproduzione dei saccaromiceti. Si verifica una prima
fermentazione tumultuosa (per circa 6-7 giorni), al
termine della quale la birra viene separata dalle cellule
e travasata in contenitori chiusi dove avviene la fermentazione lenta con sviluppo di CO2. Come nel caso del
vino, anche per la birra la fermentazione alcolica non
rappresenta che uno solo degli eventi biochimici che
Preparazione del malto
Macerazione in
acqua dell’orzo
Macinazione
Germinazione
Essiccazione
Orzo
Farina di
orzo maltato
Separazione
delle trebbie
Luppolo
Mosto
Raffreddamento
Filtrazione
Bollitura del mosto
Riscaldamento
a ~ 65 °C
Inoculo
di lievito
Birra
Fermentazione
primaria
Maturazione
o fermentazione
secondaria
Filtrazione
Confezionamento
Figura 6.6 Schema generale dei passaggi di produzione della birra.
98
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Miscelazione
con acqua
PRODUZIONI BIOTECNOLOGICHE ALIMENTARI
portano al prodotto finito: accanto all’alcol etilico si
forma infatti una serie di composti come acidi organici,
esteri, alcoli superiori, vitamine del gruppo B, sostanze
amaricanti e aromi vari, che contribuiscono alla definizione delle caratteristiche organolettiche.
Con la filtrazione si allontanano dalla birra residui solidi come cellule di lievito e resine coagulate. Si procede
infine alla pastorizzazione, con cui si inattivano gli enzimi e i microrganismi presenti al fine di conferire stabilità
al prodotto: si può effettuare a 60 °C per 20 min oppure a
70 °C per 1-1,5 min. Segue il confezionamento.
Alterazioni della birra
Durante le varie fasi di produzione la birra può andare
incontro a contaminazioni dovute a microrganismi presenti negli impianti, nelle materie prime, nell’ambiente.
Il rischio aumenta quando si utilizzano lieviti residui da
lavorazioni precedenti, in cui possono essere presenti lieviti selvaggi, batteri lattici e bacilli. I lattobacilli (in particolare Lactobacillus brevis, Pediococcus damnosus, Lactococcus lactis) sono responsabili di ossidazioni e sviluppo
di acetoino e diacetile, sostanze che causano torbidità e
cambiamenti apprezzabili di colore e sapore. La contaminazione da enterobatteri (Hafnia, Enterobacter, Klebsiella,
Citrobacter) provoca formazione di dimetilsolfuro e conferisce alla birra aromi di frutta o di latte.
6.4 Il pane e i prodotti da forno
a lievitazione naturale
La produzione di pane e prodotti da forno è collegata a
quella dei lieviti, che sono gli artefici della lievitazione
dell’impasto composto di farina e acqua. Alla trasformazione possono concorrere anche batteri, in particolare
lattobacilli o batteri lattici in genere, che svolgono prevalentemente un’azione acidificante che favorisce il potere
lievitante di saccaromiceti. Anche la produzione di pane,
molto probabilmente una scoperta del tutto casuale, si fa
risalire a tempi assai remoti. È opportuno ricordare che
per la preparazione di alcuni prodotti da forno è impiegato lievito chimico (bicarbonato di sodio e acido tartarico), che nulla ha a che fare con il processo di lievitazione
naturale svolto dai saccaromiceti.
Il microrganismo d’elezione è il Saccharomyces cere-
6
visiae, che provoca la lievitazione dell’impasto formato
da farina, acqua e sale. Nella farina sono contenuti carboidrati (amido) e gli enzimi α- e β-amilasi, che vengono attivati dall’acqua aggiunta per formare l’impasto. Le
amilasi degradano l’amido a zuccheri semplici (monosaccaridi) che vengono metabolizzati dai saccaromiceti
attraverso la via fermentativa glicolitica (EMP, capitolo
1), con la produzione di alcol etilico, CO2 e altre sostanze secondarie.
C6H12O6
2 C2H5OH + 2CO2
Nel corso della fermentazione l’anidride carbonica che
si libera durante la fermentazione sotto forma di bolle fa
rigonfiare (lievitare) l’impasto di farina e acqua, rendendolo più soffice, spugnoso e digeribile. L’alcol etilico sviluppato in modesta quantità evapora durante la cottura,
mentre altri prodotti secondari della fermentazione, come
acido succinico, acido lattico e glicerina, conferiscono al
pane aromi e caratteristiche organolettiche tipiche, anche
in relazione al tipo di farina impiegato per l’impasto.
La lievitazione dell’impasto di farina e acqua si fa av-
LA CELIACHIA (INTOLLERANZA
AL GLUTINE)
Alcuni soggetti (in Italia circa una persona su cento, anche se molti adulti non sanno di esserlo) sono
permanentemente intolleranti al glutine per predisposizione genetica: attualmente l’unica terapia è
la completa e assoluta esclusione del glutine dalla
dieta, pena l’atrofia dei villi intestinali con gravi alterazioni nell’assorbimento delle sostanze nutritive.
Spesso la sintomatologia (dolore e gonfiore addominale, dissenteria o stipsi, dimagrimento, anemia,
affaticamento; nei bambini è frequente una facile
irritabilità) è confusa con più comuni affezioni intestinali (varie forme di colite ecc.) e a volte negli
adulti è anche asintomatica, pur portando nel lungo periodo a conseguenze da malnutrizione. La
celiachia può essere diagnosticata con la ricerca nel
sangue degli anticorpi anti-transglutaminasi (tTG),
anti-gliadina (AGA) e anti-endomisio (EMA). La
conferma definitiva viene fatta con una biopsia intestinale (duodeno) per valutare le lesioni e il grado
di atrofia dei villi.
99
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6
PRODUZIONI BIOTECNOLOGICHE ALIMENTARI
SEMOLE E FARINE
Dalle cariossidi di frumento (o grano) si ottengono gli
sfarinati con le operazioni di pulitura, macinazione e
abburattamento o setacciatura. Quest’ultima non viene eseguita nella preparazione delle farine integrali, che
quindi contengono anche frammenti delle parti periferiche delle cariossidi (crusca).
Le specie di frumento attualmente coltivate sono
soprattutto quello duro (Triticum durum, figura 6.7)
e quello tenero (Triticum vulgare). Dalla macinazione
del grano duro si ottengono semole e semolati a grana
grossa e di colore ambrato, dal grano tenero si ottiene la
farina, a grana fine o finissima e di colore bianco. Le semole e i semolati si utilizzano normalmente per la produzione della pasta; la farina, impastata con acqua e lieviti, viene impiegata per la preparazione del pane e dei
prodotti da forno, nonché per quella di paste fresche.
Le farine di grano tenero si possono suddividere a
seconda del grado di raffinazione nelle classi 00, 0, 1, 2
venire anche per fermentazione acida, in cui l’impasto
è lasciato acidificare in modo naturale (pasta madre),
per utilizzarne poi una parte per inoculare un successivo impasto. L’acidificazione è effettuata in primo luogo
dai batteri lattici omofermentanti, che però non sono in
grado di apportare al prodotto finale gli aromi caratteristici, effetto che invece si attribuisce ai batteri lattici eterofermentanti in quanto produttori di acido propionico,
valerico, isovalerico, isobutilico.
Componenti fondamentali della farina di frumento,
oltre all’amido, sono due proteine (gliadina e glutenina) presenti nelle cariossidi dei cereali come frumento,
farro, segale, kamut, orzo, avena, spelta e tricale che, in
presenza di acqua, vanno a formare il glutine, una lipoproteina che conferisce all’impasto maggior coesione,
elasticità e viscosità. Il glutine subisce prima modificazioni strutturali durante l’azione meccanica dell’impasto, quindi anche chimiche per opera dei lieviti che
liberano cisteina e glutatione per rottura di ponti disolfuro: ciò contribuisce a rendere il pane più digeribile.
Nella preparazione del pane vengono adottate condizioni operative variabili soprattutto in fase di cottura,
che comunque prevedono la formazione di una crosta
superficiale dovuta alla caramellizzazione della parte
in base al “tasso di abburratamento” (t), cioè alla resa
finale in kg di sfarinato per 100 kg di frumento. Il tasso
di abburratamento è più alto per le farine poco raffinate. Per esempio, la farina 00 ha un valore t pari al 50%,
quella 0 ha un t = 72%.
Figura 6.7 Triticum durum (fonte: www.wikipedia.com).
più esterna dell’impasto, che assolve anche al compito
di prolungare la conservabilità del prodotto.
6.5 Lo yogurt
Ottenuti in origine dalla fermentazione spontanea del
latte a temperature comprese fra 40 e 45 °C, lo yogurt
e altri prodotti simili vengono ottenuti industrialmente
con l’impiego di colture starter di fermenti lattici selezionati che, aggiunti al latte fresco, ne provocano la trasformazione per la fermentazione del lattosio e la produzione di acido lattico.
Lo yogurt tradizionalmente inteso, ottenuto dall’azione fermentativa di batteri quali Lactobacillus bulgaricus e Streptococcus thermophilus, è il prototipo di altri
prodotti simili, che si differenziano per il tipo di latte, i
microrganismi impiegati e le tecnologie produttive, ma
che dal punto di vista biochimico hanno sostanzialmente la stessa origine. Si tratta di prodotti con una storia
molto antica:
r il kefir, ottenuto in origine in Turchia dal latte di capra con l’intervento di lieviti che producono anche
una piccola quota di alcol etilico (2%)
100
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PRODUZIONI BIOTECNOLOGICHE ALIMENTARI
r il toette, di origini scandinave, di consistenza vischiosa
r l’acidophilus milk (diffuso negli USA e in Germania)
r il gioddu o miciurato, prodotto tipico della Sardegna e con una piccola percentuale di alcol per la presenza di lieviti
r il mazun, prodotto in Armenia con il latte di capra,
pecora o bufala
r il kumis, prodotto di origine russa ottenuto con latte
di giumenta
r il leben, tipico di Egitto, Siria e Paesi nordafricani
r il kos, prodotto in Albania da latte ovino o di vacca.
L’argomento è trattato in modo più approfondito nel capitolo 12.
6.6 I vegetali fermentati
La conservazione di alimenti vegetali tramite fermentazione è un altro aspetto della microbiologia industriale
che ha radici molto antiche. La produzione industriale
di vegetali fermentati riguarda soprattutto cetrioli, olive
e crauti (cavoli acidi); in misura minore carote, cipolle,
cavolfiore. I microrganismi responsabili delle trasformazioni fermentative sono soprattutto lattobacilli. Questi,
insieme ad altri batteri anaerobi o facoltativi, prendono
ben presto il sopravvento sugli aerobi, una volta esaurito l’ossigeno a disposizione dopo l’introduzione dei
vegetali negli appositi recipienti (tini di fermentazione). Si avvia quindi la fermentazione lattica ad opera
di batteri omo- ed eterofermentanti, con produzione
di acidi organici (lattico e acetico), CO2, etanolo. L’ambiente acido creatosi agisce a questo punto come fattore
di selezione e permette la sopravvivenza e lo sviluppo
esclusivamente dei batteri acido-tolleranti microaerofili
e relativamente alofili, data la concentrazione salina che
nei crauti può arrivare fino al 2,5%. I microrganismi che
sviluppano in un simile ambiente sono batteri appartenenti ai generi Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus e
alcuni lieviti appartenenti ai generi Candida, Debaromyces, Saccharomyces, Pichia, Zygosaccharomyces. I lieviti
producono sostanze aromatiche (acetoino e diacetile),
etanolo, CO2 e dalla loro lisi si liberano nutrienti (peptidi, aminoacidi, vitamine) utilizzati dai batteri. I lieviti
possono però provocare anche alterazioni o fenomeni
6
indesiderati, quali il rammollimento del prodotto o lo
sviluppo di gas.
In ultima analisi, quindi, la conservabilità di questi
prodotti e i loro caratteri organolettici sono da attribuire
all’acidità del mezzo che impedisce lo sviluppo di batteri
putrefattivi, allo sviluppo di sostanze chimiche diverse
(prodotti organici volatili provenienti da attività fermentativa) nonché a reazioni enzimatiche interne dei
tessuti vegetali.
Crauti
Si ottengono per fermentazione di cavolo cappuccio
(Brassica oleracea var. capitata, figura 6.8). I cavoli subiscono un pretrattamento che consiste nel taglio a piccole strisce. Segue la salatura, lo stoccaggio in barili e la
pressatura. I contenitori vengono chiusi con coperchi
(in legno come i barili) su cui si pongono pesi. Dai coperchi deve poter fuoriuscire il gas che si sviluppa nella
fermentazione. La pressatura porta alla fuoriuscita dai
tessuti vegetali di essudato, che rappresenta il mezzo colturale in cui si sviluppano i microrganismi. Può essere
aggiunta una piccola quantità di zucchero che favorisce
lo sviluppo microbico. Sulla superficie della salamoia si
sviluppa generalmente un film di lieviti (fioretta) che
viene eliminato, ma che comunque risulta importante
per evitare lo sviluppo di muffe produttrici di sapori e
odori sgradevoli o sostanze tossiche (micotossine).
Figura 6.8 Brassica oleracea var. capitata.
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PRODUZIONI BIOTECNOLOGICHE ALIMENTARI
La produzione industriale, che deve fare ricorso a
starter di inoculazione selezionati e costituiti da una
comunità ben precisa di microrganismi per ottenere un
prodotto con caratteristiche standard, si articola schematicamente in tre fasi successive, per un tempo totale
di circa 6-7 settimane:
r in una prima fase, della durata di circa 3 giorni, si
sviluppano e agiscono batteri aerobi e anaerobi facoltativi (Acinetobacter, Gluconobacter, Acetobacter,
Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pseudomonas, che
operano dapprima un metabolismo ossidativo e poi
fermentativo.
r in una fase successiva, esaurito l’ossigeno disponibile, si sviluppano i batteri lattici soprattutto eterofermentanti (Leuconostoc mesenteroides)
r nella fase finale (che inizia dopo circa 6 giorni) l’acidità raggiunta è tale da inibire tutti i microrganismi
tranne Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis e
Pediococcus.
Olive
Si possono preparare con olive verdi oppure con olive
mature o nere. I microrganismi presenti normalmente
sulle olive, nell’acqua impiegata e sugli strumenti di lavoro rappresentano la flora microbica fermentante. Si
tratta di batteri (lattici e non), lieviti e muffe (tabella 6.1).
La preparazione delle olive viene eseguita con il metodo sivigliano o con quello naturale. Nel primo caso
si impiegano olive raccolte al giusto punto di maturazione, nel secondo si possono utilizzare sia olive mature
che verdi. Le olive vengono deamarizzate con NaOH
(allontanamento per idrolisi dell’oleuperina di sapore
amaro), quindi lavate e poi immerse in salamoia al 7%:
ciò provoca la fuoriuscita dalla drupa di zuccheri, vitamine, sostanze azotate, sali minerali. La fermentazione
è operata da batteri lattici (Streptococcus, Lactobacillus,
Pediococcus) fino a raggiungere i valori ottimali di acidità
(pH < 5), con una concentrazione di acido lattico pari
allo 0,5-0,6%. Si sviluppano in tali condizioni pressoché
esclusivamente lieviti (Debaromyces, Candida, Hansenula, Rhodotorula) che producono vitamine e fattori nutrizionali utilizzati dai lattobacilli. La fermentazione è
completata in due mesi circa, con pH finale di 4 e acido
lattico all’1%, in una salamoia al 6% di NaCl. Il prodotto
può venire anche pastorizzato.
La tecnica di preparazione naturale non contempla
la fase di deamarizzazione, che in realtà avviene spontaneamente nel corso della fermentazione, per solubilizzazione delle sostanze amare. La fermentazione anche
in questo caso è compiuta da batteri lattici: in superficie
nella salamoia si crea una membrana costituita da lieviti (Pichia, Hansenula, Debaromyces, Candida), muffe
(Rhizopus, Aspergillus, Penicillium, Alternaria) e batteri
(Micrococcus e Bacillus). Anche se i microrganismi sono
ossidanti e tendono ad innalzare il pH, la membrana
microbica è indispensabile per la disacidificazione della
salamoia e la produzione degli aromi. L’intero processo dura generalmente 7-9 mesi. Il confezionamento per
Tabella 6.1 Microrganismi nelle olive
BATTERI LATTICI
BATTERI NON LATTICI
LIEVITI E MUFFE
Lactobacillus brevis
Pseudomonas
Saccharomyces
Lactobacillus plantarum
Achromobacter
Torulopsis (Candida)
Lactobacillus casei subsp. casei
Serratia
Hansenula
Lactobacillus casei subsp. pseudoplamarum
Flavobacterium
Candida
Enterococcus faecium
Xantomonas
Rhodotorula
Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris
Sarcina
Pichia
Leuconostoc paramesenteroides
Enterobacter
Pediococchi
Propionobatteri
Fusarium
Bacillus
Aspergillus
Clostridium
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PRODUZIONI BIOTECNOLOGICHE ALIMENTARI
Tabella 6.2 Funzioni, applicazioni e settori di impiego dello xantano
ALIMENTARE
NON-ALIMENTARE
Emulsionante in salse (per es. maionese)
Stabilizzante dei colori
Incapsulazione di aromi in polvere
Carrier di fertilizzanti ed erbicidi
Formazione di film
Addensante dei coloranti tessili
Stabilizzante (gelati e salse)
Produzione di carta di alta qualità
Inibitore di sineresi (formaggi e alimenti congelati)
Recupero terziario nell’industria petrolifera
Addensante (marmellate, succhi, sciroppi)
Facilita il movimento di materiale pastoso (per es. dentifricio)
Stabilizzante di schiuma (birra)
la vendita avviene in contenitori di piccole dimensioni,
con rinnovo della salamoia al 7-8% di sale e chiusura a
tenuta d’aria che garantisce l’anaerobiosi. Si può procedere anche alla pastorizzazione.
extracellulari, di origine capsulare, che vengono liberati
nel mezzo colturale. I principali polisaccaridi di origine
microbica sono xantano, destrano, alginato.
Xantano
Cetrioli
I cetrioli vengono raccolti maturi e introdotti in recipienti con una salamoia al 5-8% di NaCl e spezie varie,
aneto e droghe (per spezie si intendono le piante speziate essiccate e in polvere, le droghe sono le essenze
delle spezie). La fermentazione che segue è simile a
quella dei crauti, fino al raggiungimento di un pH di
circa 3,5. Nella preparazione industriale si utilizzano
anche colture starter di Lactobacillus plantarum. Alla
fine della fermentazione i cetrioli sono immersi in salamoia (3,5%) e aceto in presenza di sorbati come conservanti.
6.7 Esopolisaccaridi
Molti polisaccaridi sono ottenuti tradizionalmente
da piante superiori o alghe, come l’alginato, la gomma
arabica, la carragenina, l’agar-agar e impiegati come gelificanti, addensanti, emulsionanti, stabilizzanti. Diversi microrganismi, a seconda del loro patrimonio genetico e delle caratteristiche del mezzo colturale, sono
però in grado di produrre polisaccaridi che possono
sostituire vantaggiosamente quelli di origine vegetale,
con il vantaggio di avere una composizione standard.
Sono di interesse industriale soprattutto i polisaccaridi
Conosciuto nei Paesi europei come addensante E415,
viene prodotto da Xantomonas campestris.
È un eteropolisaccaride ramificato (figura 6.9) dotato
di interessanti proprietà: facilmente solubile dà soluzioni viscose anche a bassa concentrazione; in soluzione ha
un comportamento pseudoplastico; può interagire con
altri polimeri. Trova numerosi campi d’impiego, sia in
campo alimentare che in altri settori (tabella 6.2).
Per la produzione di xantano si impiegano substrati come amido, melasso, glucosio, saccarosio, siero di
latte. L’azoto è fornito da corn-steep, idrolizzati di soia o
caseina, peptoni, sali ammoniacali, urea. La produzione
4 Gluc 1
4 Gluc 1
Mann*
Ac. gluc
* gruppo acetile
** piruvato
Mann**
Figura 6.9 Struttura dello xantano. È un eteropolisaccaride
ramificato, costituito da un’unità pentasaccaridica ripetuta:
D-glucosio, D-mannosio, acido D-glucuronico, in rapporto 2:2:1.
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PRODUZIONI BIOTECNOLOGICHE ALIMENTARI
Destrano
È un importante polisaccaride di origine microbica, impiegato inizialmente come sostituto del plasma sanguigno e per altri scopi clinici, ma anche come componente
di resine chimiche separatrici (Sephadex) e nel settore
alimentare. È un omopolisaccaride lineare, prodotto da
microrganismi quali Leuconostoc mesenteroides e Leuconostoc destranicum. Il substrato utilizzato è il saccarosio, trasformato dall’enzima destransaccarasi in destrano (che
incorpora il glucosio) e fruttosio, liberato nel substrato.
Figura 6.10 Pseudomonas aeruginosa. L’immagine mostra il
batterio P. aeruginosa, usato industrialmente per la produzione
di alginato, al microscopio elettronico (fonte: CDC/Janice Carr).
avviene in coltura sommersa a pH 7, alla temperatura di
28-30 °C. L’elevata viscosità del polisaccaride può causare problemi in sede di separazione dalle cellule, estrazione e recupero del prodotto.
Alginato
Questo polisaccaride, presente naturalmente in alcune alghe rosse (Gelidium), viene prodotto industrialmente da
ceppi di Pseudomonas aeruginosa (figura 6.10) e Azotobacter vinelandii. L’alginato è costituito da acido mannuronico e acido glucuronico. L’impiego maggiore è in campo
alimentare, ma viene utilizzato anche come supporto per
l’immobilizzazione di microrganismi e per la preparazione di resine a scambio ionico.
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ESERCIZI DI VERIFICA
1. La lievitazione produce:
A anidride carbonica e acqua
B anidride carbonica
C anidride carbonica e alcol etilico
D anidride carbonica, acqua e alcol etilico
7. La fermentazione vinaria è operata da:
A lieviti
B lieviti e batteri
C lieviti e muffe
D batteri
2. Il glutine è una:
A proteina del luppolo
B proteina del frumento
C delle proteine presenti nel mais
8. Il malto è:
A un monosaccaride contenuto nel luppolo
B un polisaccaride contenuto nell’orzo
C orzo germinato
D orzo trattato con luppolo
3. I microrganismi responsabili della formazione dello yogurt sono:
A streptococchi ed enterobatteri
B lattobacilli e streptococchi
C Staphylococcus lactis e Lactococcus termophilus
9. Nella preparazione della birra il lievito è
aggiunto al:
A mosto cotto
B mosto prima della cottura
C malto tal quale
4. I destrani sono:
A polisaccaridi
B monosaccaridi gelatinosi
C resine poliviniliche
10. La melassa deriva da:
A lavorazione di carni bovine
B barbabietola e canna da zucchero
C fermentazione del glucosio
5. I destrani si ottengono da:
A Propionibacter cauloparvum
B Leuconostoc mesenteroides
C Escherichia coli var. dexii
D Pedosporum cruzei
11. Nella riproduzione di lieviti un eccesso di
carboidrati può spostare le reazioni verso:
A l’anaerobiosi
B una maggior velocità di riproduzione
C un aumento di biomassa
6. I destrani sono impiegati come:
A antibatterici
B antitumorali
C sostituti del plasma nelle trasfusioni
12. L’amilopectina è un polimero del:
A D-glucosio
B L-glucosio
C maltosio
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BIOTECNOLOGIE IN CAMPO
AGRARIO, ZOOTECNICO
E SANITARIO
7.1 Biotecnologie in campo agrario
7.2 Tecniche di trasformazione
7.3 Identificazione delle cellule trasformate
7.4 Piante transgeniche
7.5 La micropropagazione
7.6 Aspetti legislativi
7.7 Biotecnologie nel settore veterinario e
zootecnico
Il panorama delle biotecnologie nei settori dell’agricoltura, della zootecnia e in ambito medico-farmacologico è
estremamente variegato e in continua evoluzione. Come
descritto più in dettaglio in altri capitoli, grazie alle biotecnologie si ottengono farmaci, vaccini, ormoni, anticorpi.
La terapia genica di gravi malattie è uno degli obiettivi
cui tende la ricerca biomedica. La tecnologia del DNA ricombinante in agricoltura può sostituire, agendo direttamente a livello genetico, i tradizionali metodi di incrocio e
selezione delle specie vegetali. Tramite il trasferimento di
geni si possono ottenere piante ingegnerizzate resistenti
ai parassiti e cereali con proprietà nutrizionali potenziate.
Al pari delle piante, sono stati creati anche animali transgenici, allo scopo di produrre, per esempio nel loro latte,
proteine di interesse farmacologico.
7.8 Il sessaggio del seme in zootecnia
7.9 La tracciabilità genetica
7.10 Applicazione delle biotecnologie
in campo biomedico e farmacologico
7.11 Principi attivi per uso farmaceutico
da piante superiori
7.12 La terapia genica
7.13 Vettori di geni
7.1 Biotecnologie in campo agrario
Il settore agrario è fra quelli che più hanno tratto vantaggio dai progressi delle biotecnologie. Si sono così potute
ottenere rese considerevolmente più elevate di prodotto,
miglioramenti nella qualità e nel potere nutritivo degli alimenti. È possibile aumentare la resistenza delle piante alle
malattie e ai parassiti con una parallela diminuzione del
ricorso all’impiego di sostanze chimiche sul campo. Un
aspetto applicativo di estremo interesse è la produzione di
molecole farmacologicamente attive da parte di molte
piante superiori. La tutela dell’ambiente e la diminuzione
dei rischi per la salute dei consumatori sono due importanti conquiste delle biotecnologie applicate in questo
settore.
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BIOTECNOLOGIE IN CAMPO AGRARIO, ZOOTECNICO E SANITARIO
Gli enormi progressi delle biotecnologie hanno portato alla possibilità di inserire nelle piante specifici geni
di interesse (transgeni) codificanti per alcuni caratteri
desiderati. Queste piante vengono indicate come PGM
(piante geneticamente modificate) o transgeniche,
in grado di trasferire alla discendenza il gene introdotto artificialmente, che può teoricamente provenire da
qualsiasi specie vivente. Il processo è la risultante della
combinazione fra la coltura in vitro dei tessuti vegetali
e la tecnologia del DNA ricombinante. La possibilità
di coltivare piante in vitro a partire da cellule vegetali
meristematiche totipotenti offre un ampio ventaglio
di possibili applicazioni. Nei vegetali, coltura in vitro e
clonazione sono realizzabili senza troppe difficoltà per
perseguire obiettivi di miglioramento genetico, produrre piante immuni da infezioni virali o da micoplasmi,
per la conservazione del germoplasma e la propagazione clonale o per riprodurre una pianta intera da cellule
geneticamente modificate.
Le cellule vegetali presentano una caratteristica molto interessante: sono in grado di passare da uno stadio
differenziato a uno indifferenziato e viceversa. Nei vegetali la differenziazione cellulare e la conseguente specializzazione di forma e funzioni nei diversi tessuti sono
caratteristiche dipendenti dalle concentrazioni relative
di ormoni specifici. La dimostrazione pratica di questo
fenomeno si verifica in natura quando, per esempio, una
pianta subisce una ferita: in corrispondenza dei tessuti
lesi si forma infatti un nuovo tessuto cicatriziale indifferenziato (callo cicatriziale) che rimargina la lesione
(figura 7.1). In seguito queste cellule indifferenziate subiscono il differenziamento evolvendo in vasi conduttori,
tessuti corticali ecc.
7.2 Tecniche di trasformazione
A prescindere dalle tecniche impiegate per ottenerle, le
piante transgeniche rappresentano il risultato di eventi
di ricombinazione genetica, fenomeno che peraltro si
verifica normalmente fra cromosomi omologhi nella riproduzione sessuale (crossing-over). I sistemi per creare
piante transgeniche possono essere suddivisi in diretti e
indiretti.
Sistemi diretti
Trasformazione con batteri
La più nota tecnica di trasferimento di geni impiega il
batterio Agrobacterium tumefaciens, che è in grado
di inserire naturalmente propri geni nel nucleo delle
cellule vegetali, in particolare nelle dicotiledoni. L’ingresso del batterio è in sostanza una vera e propria infezione: Agrobacterium, che si trova nel terreno, entra
attraverso ferite nella zona del colletto in risposta a
sostanze emesse dai tessuti vegetali lesi, che stimolano
l’attività di specifici geni di virulenza (vir) presenti nel
plasmide batterico Ti (tumor inducing). L’infezione
provoca nelle piante la formazione del “tumore del colletto” e la produzione di opine, aminoacidi modificati
utilizzati dalle cellule batteriche come fonte di carbonio ed energia. Introducendo geni estranei per mezzo
del plasmide è possibile modificare il DNA delle piante (figura 7.2).
Cellula vegetale
Transgene BT
Geni vir
Ori
Mais BT
Figura 7.1 Callo cicatriziale.
Figura 7.2 Utilizzo di Agrobacterium tumefaciens
per produrre piante geneticamente modificate.
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BIOTECNOLOGIE IN CAMPO AGRARIO, ZOOTECNICO E SANITARIO
Sistemi indiretti
Trasformazione con cannone
a microsfere
Un “cannone” particolare è in grado di trasformare cellule vegetali sparando letteralmente all’interno dei tessuti vegetali microparticelle di oro o tungsteno (0,4-1
micron) ricoperte di DNA. In questo modo si hanno
ragionevoli probabilità che il DNA esogeno venga incorporato nel genoma della pianta “bombardata”. Questa tecnica trova applicazione nella trasformazione di
numerose monocotiledoni: si possono, per esempio,
trattare embrioni immaturi di riso. Tali embrioni sono
successivamente stimolati a produrre calli, da cui si
originano germogli e radici. Segue il trasferimento in
terra.
l’ingresso di DNA plasmidico esogeno destinato a
integrarsi nel genoma della cellula. I protoplasti trasformati e mantenuti in idonei substrati e condizioni
colturali riformano la parete cellulare e danno origine
a colonie cellulari e a calli da cui si originano piante
trasformate.
Due protoplasti provenienti da specie diverse e incompatibili in natura (che cioè non si possono incrociare naturalmente) possono essere indotti a fondersi dando origine a un ibrido somatico (fusione di protoplasti
ottenuti da cellule somatiche, capitolo 2). Il più delle
volte questi ibridi sono però sterili. Durante la proliferazione dei calli derivati da tale fusione in genere uno dei
nuclei può venire eliminato. Un’applicazione di questa
procedura è rappresentata dal trasferimento di geni di
resistenza da specie selvatiche alle corrispondenti specie coltivate di interesse agrario.
Elettroporazione
Consiste nell’impiego di una corrente elettrica per indurre la penetrazione di DNA esogeno in protoplasti
vegetali (capitolo 2).
Trasformazione con protoplasti
Cellule vegetali private della parete con enzimi cellulosolitici diventano protoplasti (figura 7.3). L’ulteriore
trattamento con polietilenglicol causa l’aumento di
permeabilità della membrana cellulare permettendo
Figura 7.3 Protoplasti. Cellule vegetali trattate con cellulasi
e pectinasi diventano protoplasti.
7.3 Identificazione delle cellule
trasformate
Le tecniche precedentemente descritte prevedono obbligatoriamente una fase in cui le cellule trasformate devono essere identificate e quindi separate da quelle che
non hanno acquisito il gene d’interesse: la trasformazione è sempre un evento possibile per somma di probabilità. Inoltre una cellula ospite può venire trasformata,
ma il gene può non venire espresso. Struttura e configurazione del gene trasferito condizionano notevolmente
la possibilità della sua integrazione e della sua espressione nell’ospite. Diventa quindi fondamentale la scelta
del gene promotore, cioè la sequenza di DNA deputata
alla trascrizione dei geni strutturali. Uno di questi geni è
indicato con la sigla 35S (CaMV) del virus del mosaico
del cavolfiore.
Per rendere possibile la selezione vengono inseriti,
insieme con il gene di interesse, alcuni geni marcatori (marker o reporter) che codificano per proprietà
facilmente identificabili, quali la resistenza ad antibiotici, la produzione di luciferasi o la sintesi di enzimi.
È diffuso l’impiego del gene di E. coli che codifica per
la sintesi dell’enzima β-glucoronidasi (GUS): questo
enzima catalizza l’idrolisi di glucuronidi formando un
composto di colore azzurro/blu visibile nei tessuti
delle piante che hanno subìto la trasformazione (figura 7.4).
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BIOTECNOLOGIE IN CAMPO AGRARIO, ZOOTECNICO E SANITARIO
Figura 7.4 β-glucuronidasi. La figura mostra piante con colorazione blu data dalla reazione catalizzata dalla β-glucuronidasi.
7.4 Piante transgeniche
Piante transgeniche che fissano l’azoto
atmosferico
L’introduzione di geni NIF (nitrogen fixation) nelle
radici di piante permette a queste ultime di fissare direttamente l’azoto atmosferico convertendolo in nitrati. Il
possesso di tali geni è prerogativa di batteri appartenenti
ai generi Rhizobium, Azotobacter e Clostridium, dei quali il primo è simbionte delle radici delle leguminose, gli
altri vivono liberi nel suolo. L’ingegneria genetica può
trovare il modo di inserire tali geni nelle piante, indipendentemente dall’infezione batterica.
Piante transgeniche resistenti
agli insetti
Bacillus thuringiensis (figura 7.5) è un batterio che
produce una tossina nociva per larve e insetti fitopatogeni, ma innocua per le piante e l’uomo. Tale
composto, di origine naturale, è inoltre facilmente degradabile e non si accumula nell’ambiente. Il gene responsabile viene prelevato dal batterio, inserito in un
plasmide vettore e trasferito nella pianta, che diventa
così in grado di secernere autonomamente la sostanza
tossica nei propri tessuti. Nell’apparato digerente dei
parassiti che si cibano della pianta, tale sostanza viene
convertita nella forma tossica e ne provoca la morte.
La produzione di insetticidi naturali è una delle più
promettenti applicazioni della biotecnologia per la
Figura 7.5 Bacillus thuringiensis (Dennis Kunkel Microscopy,
Inc.).
salvaguardia dell’ambiente con l’obiettivo di ridurre
l’impiego di pesticidi.
Piante transgeniche resistenti al gelo
La formazione di cristalli di ghiaccio sulle piante è legata al contemporaneo sviluppo di batteri appartenenti ai
generi Pseudomonas, Xantomonas ed Erwinia. Tali batteri
(ice+) possiedono geni inaZ e inaW che codificano per
la sintesi di una proteina superficiale che favorisce la diffusione dei cristalli di ghiaccio su tutta la pianta. Se si
inoculano le piante con concentrazioni elevate di batteri
ice− privati di questi geni, essi inibiscono competitiva109
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BIOTECNOLOGIE IN CAMPO AGRARIO, ZOOTECNICO E SANITARIO
mente lo sviluppo degli ice+ prevenendo la formazione
di ghiaccio.
7.5 La micropropagazione
La riproduzione di piante da meristema o micropropagazione rappresenta un importante settore delle biotecnologie agrarie e ha una notevole rilevanza economica. Tale sistema consiste nel riprodurre piante partendo
da piccolissime parti, anche singole cellule, prelevate da
espianti caulinari (del fusto), come le gemme ascellari o
apicali. Le piante così ottenute sono dei cloni della pianta
madre. La micropropagazione si realizza in diverse fasi:
r reperimento e sterilizzazione degli espianti
r impianto
r proliferazione e allungamento dei germogli
r radicazione
r acclimatazione.
L’espianto è di solito costituito da tessuto meristematico o dall’apice vegetativo di un germoglio o di una
gemma. La sterilizzazione dell’espianto è premessa
indispensabile per il successo dell’intera operazione:
si effettua tramite immersione in alcol 80% e quindi in
NaClO al 10% per 30 min. Si procede quindi al lavaggio
con acqua sterile; tutte le operazioni vanno effettuate
sotto cappa a flusso laminare. La sterilizzazione si effettua in autoclave per i contenitori e il mezzo colturale. Gli
espianti sterili vengono posti in coltura in provette per
un periodo di circa 30 giorni, quindi posti in camera di
crescita con fotoperiodismo controllato. I germogli iniziano a proliferare, quindi vengono prelevati e trasferiti
in nuovo terreno colturale per ottenere altre piantine (figura 7.6). La formazione di nuovi germogli è collegata
all’alto contenuto di citochinine nel terreno di coltura. Il
cambiamento della concentrazione di ormoni (aumento
delle auxine e riduzione o eliminazione delle citochinine), induce la radicazione degli espianti. La fase di
acclimatazione al substrato in cui gli espianti radicati
vengono infine trasferiti è molto delicata e richiede un
attento e costante controllo di tutti i parametri che ne
condizionano la sopravvivenza nelle condizioni naturali.
Per coltivare in vitro i tessuti vegetali sono necessari
terreni colturali di particolare e complessa composizione, contenenti un’ampia gamma di sali minerali, miscele di vitamine e una fonte di carboidrati (saccarosio).
Figura 7.6 Micropropagazione di piante in vitro.
Componenti indispensabili sono inoltre gli ormoni vegetali auxine e citochinine, che hanno ruoli fondamentali nella rigenerazione dei tessuti vegetali. Questi ormoni, che influenzano la produzione dei germogli o quella
delle radici, devono essere somministrati in proporzione
bilanciata e in rapporti ponderali precisi, a seconda della
direzione verso cui si vuole indirizzare lo sviluppo (germogli o radice): le auxine stimolano la radicazione; le citochinine stimolano la divisione cellulare. Altri ormoni
necessari sono le gibberelline, la cui attività di allungamento degli internodi varia anche in relazione al tipo di
pianta e del tessuto vegetale che si intendono coltivare. I
terreni di coltura hanno pH oscillante fra 5 e 6, vengono
solidificati con agar e sterilizzati come i normali terreni
per microbiologia (20 min a 121 °C). La coltivazione in
vitro o micropropagazione ha avuto un notevole sviluppo e viene usata soprattutto per la riproduzione di piante
da frutto, da fiore e per le colture orticole.
Un fenomeno particolarmente interessante che si
verifica con una discreta frequenza nei cloni in vitro è
la variabilità somatica clonale (somaclonale), che si
manifesta con l’apparizione di cloni diversi dalle linee
parentali. Si tratta di mutazioni che si verificano nelle
cellule meristematiche e che interessano caratteri morfologici. Il fenomeno viene indagato al fine di poter eliminare tali mutanti se si vuole mantenere la purezza genetica delle piante, ma anche per poter sfruttare queste
mutazioni per introdurre una maggior variabilità genetica da cui poter ottenere piante nuove e/o migliori. Pompelmo rosa, mandarancio, pesca nettarina insieme con
molte varietà di piante per la floricoltura sono altrettanti
esempi di varianti somatiche coltivate.
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BIOTECNOLOGIE IN CAMPO AGRARIO, ZOOTECNICO E SANITARIO
7.6 Aspetti legislativi
Piante e sementi geneticamente modificate vengono prodotte in molte parti del mondo. L’Europa e l’Italia sono
al momento attuale apertamente contrarie all’impiego
di sementi e alla coltivazione di piante OGM, almeno in
attesa di dati sicuri in merito alla loro innocuità. In effetti
emergono almeno tre ordini di preoccupazioni:
r la possibile propagazione incontrollata e non governabile di caratteri genetici nuovi ad altri organismi,
con la conseguente alterazione di delicati equilibri
ambientali e della biodiversità
r i timori in merito ai pericoli per la salute umana derivanti dal consumo di piante transgeniche
r implicazioni di carattere politico-economico derivanti dai brevetti su sementi e innovazioni biotecnologiche. Ciò porterebbe al trasferimento del
controllo del settore agroalimentare, strategicamente rilevante nell’economia di un Paese, dall’ambito
pubblico a quello privato detentore dei brevetti.
Norme comunitarie e nazionali vietano al momento
l’introduzione di sementi non incluse nel “registro
nazionale delle sementi” a cui non è iscritta nessuna varietà OGM (legge 1096/71 mod. dal D. Lgs.
212/2001). La legge prevede quindi una sorta di
tolleranza zero, anche se a causa dell’impollinazione crociata il mantenimento della purezza assoluta
all’interno delle specie risulta in pratica irraggiungibile.
7.7 Biotecnologie nel settore
veterinario e zootecnico
L’aumento della popolazione mondiale fa emergere sempre di più la necessità di una aumento delle produzioni
animali oltre che di quelle vegetali. L’incremento delle
produzioni animali dipende dal miglioramento delle condizioni ambientali, delle tecniche di gestione degli allevamenti, dal miglioramento genetico. In quest’ultimo caso
le biotecnologie sono ampiamente utilizzate e si traducono in:
r incremento delle possibilità riproduttive
r miglioramento della qualità dei prodotti
r migliore utilizzo dei nutrienti nell’alimentazione degli animali
r più efficace controllo delle loro condizioni di salute
7
r più elevato grado di sicurezza alimentare, attraverso
un’ampia disponibilità di strumenti diagnostici per
la tracciabilità e il controllo di qualità degli alimenti.
Applicazioni biotecnologiche particolarmente importanti in campo zootecnico riguardano:
r genomica strutturale e funzionale
r sessaggio del seme
r tracciabilità genetica.
La genomica si occupa dell’analisi, dell’identificazione
e dell’espressione dei geni. La genomica strutturale
riguarda l’analisi della struttura del genoma, più in particolare l’individuazione della localizzazione dei geni,
mentre la genomica funzionale indaga l’espressione
dei geni come proteine, in altre parole la proteomica.
I due approcci di ricerca integrano metodi e obiettivi al fine di identificare loci genetici che presiedono
all’espressione di caratteri particolarmente interessanti
dal punto di vista economico-produttivo. Per esempio, si possono indagare i geni in grado di influenzare
il carattere “tenerezza della carne”, parametro particolarmente apprezzato e controllato, oltre che da fattori
ambientali, di allevamento e nutrizionali, anche a livello genetico.
La tenerezza della carne dipende infatti dalla natura e dal tipo delle fibre muscolari, dalle caratteristiche
del collagene e dal grasso intramuscolare. Le ricerche
hanno permesso di identificare particolari e specifiche
regioni cromosomiche deputate o comunque associate
all’espressione di questi caratteri all’interno delle masse
muscolari dell’animale. La selezione dei caratteri desiderati viene effettuata con l’impiego di marcatori o direttamente sul gene regolatore responsabile.
Applicazioni importanti sono rappresentate inoltre
dalle ricerche di paternità, basate sul confronto fra il genoma di un individuo e quello dei genitori. Tali tecniche
sono basate sulla ricerca di “loci marcatori”, cioè microsatelliti ad alto grado di polimorfismo e abbondantemente distribuiti all’interno del genoma.
La genomica animale trova importante applicazione
anche nello studio delle differenze genetiche fra razze. Ciò permette di studiare e comprendere le relazioni di affinità o parentela fra razze diverse, appurarne le
eventuali origini comuni, valutare il grado di variabilità
genetica all’interno delle popolazioni. Si possono così
avviare e mettere a punto programmi di conservazione
111
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BIOTECNOLOGIE IN CAMPO AGRARIO, ZOOTECNICO E SANITARIO
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pregio per la produzione della carne. Si ha anche vantaggio economico dalla maggior produzione di vitelli meticci: le vacche non destinate a produrre rimonta (cioè
la quota di ricambio generazionale fra le fattrici di una
mandria) vengono fecondate da tori da carne per avere
vitelli meticci di valore economico più elevato rispetto
ai vitelli maschi di razze pure da latte.
iti dal formaggio francese “Beaufort” (da razze Tarantaise
e Abondance) e dall’italiano Fontina, prodotto esclusivamente con latte di vacche di razza Valdostana.
7.9 La tracciabilità genetica
Le applicazioni delle biotecnologie nel settore biomedico sono numerose e di estrema rilevanza: le tecnologie
del DNA ricombinante hanno reso possibile la produzione su scala industriale di molecole terapeutiche un
tempo non disponibili o ottenibili con difficoltà e in
scarsa quantità.
Nel sistema di certificazione ISO 8420 viene data la seguente definizione di tracciabilità: “possibilità (attitudine) di risalire a storia, utilizzazione o localizzazione
di un prodotto attraverso identificazioni registrate”. Nel
settore alimentare ci si riferisce all’acquisizione di informazioni sull’origine del prodotto, sulle materie prime
utilizzate, sulle tecniche di produzione. In zootecnia la
tracciabilità consiste nella possibilità di risalire all’identità degli animali e all’origine dei prodotti attraverso
tutta la filiera, dall’allevamento alla vendita al consumo. I casi di BSE e di altre pericolose patologie o contaminazioni microbiche o chimiche delle carni hanno
evidenziato l’importanza di poter disporre di adeguate
informazioni su origine, provenienza, luogo di macellazione e trattamento dei prodotti. La preferenza da parte dei consumatori per i prodotti locali o comunque di
origine nazionale, ottenuti da allevamenti improntati al
benessere dell’animale e al rispetto dell’ambiente, così
come le produzioni derivate da agricoltura biologica, ne
sono un chiaro esempio. A tutto ciò si aggiunge l’avversione (giustificata o meno) per i prodotti geneticamente
modificati (OGM). La tracciabilità, in ultima analisi, si
traduce in una garanzia di qualità per il consumatore,
ma anche di identificazione e di tutela per il produttore.
La tracciabilità genetica si fonda sull’identificazione del
DNA, possibile in tutte le parti dell’animale, e sulla possibilità di risalire alla sua origine confrontando il profilo
genetico ottenuto dalla carne con un database che contiene i profili di tutti gli animali.
Il profilo genetico è utilizzato per le carni, ma può essere trasferito in altri settori alimentari, per esempio nel campo dei prodotti lattiero-caseari. Nel caso di formaggi tipici
che si fregiano di indicazioni di origine protetta e prodotti
con il latte di vacche di una sola razza, diventa possibile verificare se la provenienza del latte utilizzato corrisponde o
meno a quella dichiarata. Esempi in tal senso sono costitu-
7.10 Applicazione delle
biotecnologie in campo
biomedico e farmacologico
Prodotti farmaceutici e diagnostici
La produzione di vaccini, proteine ricombinanti, ormoni, antibiotici, sonde molecolari per impiego diagnostico, anticorpi monoclonali costituisce l’esempio
più significativo dei risultati ottenuti in campo farmacologico dalle biotecnologie:
r proteine ricombinanti: eritropoietina, insulina, somatotropina, somatostatina, interferoni, interleuchine, fattore VIII della coagulazione, attivatore tissutale del plasminogeno (t-PA), fattore di crescita per i
granulociti polimorfonucleati (GM-CSF), fattore di
crescita epidermico (EGF) sono esempi di proteine
ottenute da batteri ingegnerizzati (capitolo 5)
r farmaci antineoplastici: il DNA ricombinante ha
reso possibile la sintesi di molecole che agiscono
bloccando proteine indispensabili alla crescita delle
cellule tumorali. Per esempio, l’imatinib è un farmaco impiegato nella terapia della leucemia mieloide cronica, causata da una proteina anomala sintetizzata da un gene presente nei malati portatori di
un’anomalia cromosomica particolare (cromosoma
Filadelfia, vedi scheda)
r anticorpi monoclonali, ottenuti dalla coltura in vitro di cellule di mieloma di topo ibridate con linfociti
umani produttori di anticorpi (capitolo 5)
r antigeni ricombinanti per la produzione di vaccini: la tecnologia del DNA ricombinante permette di sintetizzare antigeni proteici specifici della
superficie di molti virus patogeni, indipendente113
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BIOTECNOLOGIE IN CAMPO AGRARIO, ZOOTECNICO E SANITARIO
1 Si isolano il DNA
Cellula batterica
Gene lacZ
Cellula umana
plasmidico e quello
umano
Sito di
restrizione
2 Si tagliano entrambi
i campioni di DNA
con lo stesso enzima di
restrizione
3 Si mescolano i DNA:
R
Plasmide
gene amp
(resistenza
batterico
all’ampicillina)
essi si uniscono attraverso
appaiamento di basi.
I prodotti comprendono
molti plasmidi non ricombinanti e alcuni ricombinanti
Gene di
interesse
“sticky ends”:
estremità adesive
Gene
dell’insulina
4 Si introduce il DNA
in cellule batteriche
che hanno una mutazione del
gene lacZ che permette di
distinguere la cellula
trasformata dalle altre
Plasmidi ricombinanti
5 I microrganismi ricombinati
vengono posti in bioreattori
dove producono insulina
Figura 7.8 Schema di produzione dell’insulina umana con tecniche del DNA ricombinante.
LA LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA
La leucemia mieloide cronica è caratterizzata dalla
crescita incontrollata di globuli bianchi (leucociti)
causata da un’anomalia genetica acquisita (quindi non
ereditaria) presente nel cromosoma 22, che appare più
corto del normale. Questo cromosoma è denominato
“Filadelfia” e scambia alcuni tratti con il cromosoma 9:
il frammento che si stacca dal cromosoma 9 a livello di
un gene denominato Abelson (ABL) si sposta sul 22,
mentre un frammento del 22 (dove la rottura si verifica in corrispondenza del gene BCR (breakpoint cluster
region) va sul 9. Questo fenomeno è un esempio di traslocazione bilanciata. Ne deriva la formazione di un
mente dalle rimanenti frazioni virali. I geni virali
che codificano per tali proteine vengono clonati ed
espressi in batteri (E. coli) e lieviti (Saccharomyces
cerevisiae), ottenendo così i vaccini ricombinanti
(capitolo 5)
gene ibrido “di fusione” (BCR-ABL) che codifica per
una proteina anomala, principale responsabile della
trasformazione delle cellule staminali emopoietiche
in cellule leucemiche. Il fenomeno riguarda esclusivamente le cellule staminali del midollo emopoietico e di
conseguenza tutte le cellule del sangue, che dal midollo hanno origine. Le cellule dei tessuti mostrano invece
un cariotipo non alterato.
Gli studi di biologia molecolare con la scoperta del
gene ibrido BCR-ABL e della proteina anomala prodotta, insieme con le possibilità offerte dalla tecnologia del DNA ricombinante, hanno permesso la sintesi
di inibitori dell’oncogène e/o della proteina anomala
(inibitori della tirosina-chinasi).
r sonde geniche con le quali, con tecniche come Northern e Southern blotting, sono possibili numerose
applicazioni in associazione alla PCR: dall’identificazione di microrganismi, a quella di geni mutanti, al
DNA fingerprinting.
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lanata (figura 7.9): alcune linee cellulari di questa specie
sono in grado di convertire la β-metildigitossina (ottenuta chimicamente dalla digitossina) in β-metildigossina impiegata in cardiologia.
7.12 La terapia genica
Figura 7.9 Digitalis lanata.
7.11 Principi attivi per uso
farmaceutico da piante
superiori
Molte sostanze chimiche farmacologicamente attive
vengono ottenute da piante superiori: si può stimare
che circa un quarto dei farmaci contenga principi attivi
di derivazione vegetale. Per superare le difficoltà legate
alla coltivazione in campo di queste piante e per la necessità di svincolare la produzione dei farmaci da variabili non controllabili dall’uomo, quali la disponibilità e
le caratteristiche del terreno da destinare alla coltivazione, il clima ecc., la ricerca si è rivolta alla coltivazione
diretta in vitro delle cellule vegetali per disporre di una
fonte alternativa, che potesse garantire caratteristiche di
qualità e produzione costanti, da cui estrarre i principi
attivi utili in farmacologia.
Un esempio di utilizzo di cellule vegetali analogo a
quello di cellule microbiche nella bioconversione degli
ormoni steroidi (capitolo 5) si ha nella trasformazione
della digitossina, un glicoside scarsamente impiegato
come tale in cardiologia per l’elevata tossicità, in digossina. La digitossina viene estratta da foglie di Digitalis
L’individuazione anche precoce di anomalie genetiche
con test che rilevano mutazioni per mezzo di sonde a
DNA e tecniche di ibridazione rappresenta uno dei
progressi più straordinari della medicina. La cura delle
anomalie geniche è a volte possibile tramite la terapia
genica con il trapianto di geni sani negli individui malati,
almeno nei casi in cui l’alterazione è a carico di un singolo gene: l’inserimento del gene normale corregge l’anomalia. Ciò avviene con l’utilizzo di un vettore che solitamente è un retrovirus, e prevede l’inserimento diretto
dei geni o il prelievo dal paziente delle cellule malate, la
loro coltivazione e trasformazione con il gene normale e
la loro reintroduzione nel paziente.
La terapia genica può essere effettuata in due modi:
❖ in vivo, quando i geni clonati vengono inseriti direttamente nelle cellule del paziente. Si impiega
questa tecnica se le cellule non possono essere prelevate, coltivate, trasformate e reimpiantate oppure
non è possibile farlo con quantitativi sufficienti di
cellule
❖ ex vivo, quando le cellule possono essere prelevate
dal paziente, coltivate e trasformate in vitro e reimpiantate (per es. le cellule del midollo emopoietico
e quelle epiteliali).
Uno dei problemi centrali della terapia genica è riuscire
a inserire il gene normale nelle cellule dell’organismo in
modo stabile, facendo cioè in modo che anche la discendenza esprima il gene trapiantato. Un simile risultato è
ottenibile se si opera su cellule che non hanno ancora
completato il loro differenziamento: in altri termini, si
tratta di operare su cellule staminali o embrionali. Le
cellule staminali del midollo osseo emopoietico danno origine a tutti i tipi di cellule del sangue, compresi i
linfociti dell’immunità. Nella sindrome da immunodeficienza combinata grave (SCID) le cellule del midollo
osseo emopoietico di bambini colpiti dalla malattia non
possono produrre l’enzima ADA (adenosina deaminasi)
per la presenza di una mutazione. Il deficit immunitario
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BIOTECNOLOGIE IN CAMPO AGRARIO, ZOOTECNICO E SANITARIO
che ne consegue è estremamente grave: con la terapia
genica un virus vettore trasporta il gene corretto all’interno del linfociti periferici, che sono così in grado di
produrre regolarmente l’enzima.
La terapia genica, di cui non si conoscono ancora
tutte le possibili incognite, presenta comunque diversi
rischi: il retrovirus utilizzato come vettore potrebbe per
esempio inserirsi in prossimità di oncogèni (geni normalmente silenti che codificano per proteine tumorali)
e indurne l’attivazione. Oltre a ciò sono note le perplessità di ordine etico-morale e le esplicite contrarietà da
parte di molti in merito all’impiego di queste tecniche
sull’uomo.
7.13 Vettori di geni
L’introduzione di DNA esogeno in una cellula bersaglio
richiede la presenza di un vettore in grado di trasportarlo al suo interno. Tali vettori possono essere non virali
(DNA legato a molecole che facilitano l’attraversamento
della membrana plasmatica) oppure virali. I virus infatti,
nella loro condizione di parassiti endocellulari obbligati,
hanno la peculiare caratteristica di introdurre il loro genoma nella cellula parassitata.
I vettori virali attualmente utilizzati sono retrovirus, adenovirus e herpes virus. Alcuni (retrovirus) sono
in grado di integrare il loro genoma in quello della cellula ospite, altri (adenovirus e virus erpetici) non lo fanno.
L’assemblaggio di un vettore virale prevede come operazione fondamentale l’eliminazione dei geni responsabili
dell’attività patogena del virus: ciò fra l’altro consente di disporre di più spazio per l’inserimento, insieme al transgene,
di un packaging di espressione, cioè di una sequenza
nucleotidica che permetta l’espressione del gene trasferito.
Vettori retrovirali
Si tratta di virus a RNA, in cui l’enzima trascrittasi inversa opera la sintesi di una molecola di DNA complementare che può integrarsi con il DNA cellulare. Più in
particolare, il virus vettore che trasporta il transgene attraversa la membrana plasmatica della cellula bersaglio,
quindi il genoma virale a RNA viene retrotrascritto in
DNA a doppia catena, che entra nel nucleo e si integra
nel DNA della cellula ospite. Come ogni altro gene cellulare, il transgene viene a questo punto prima trascritto
in mRNA e poi tradotto in proteina, quindi espresso.
I vettori derivati da retrovirus possono ospitare inserti di DNA lunghi fino a 8 kb. Fra i vantaggi dei vettori retrovirali sono soprattutto importanti la capacità
di integrazione stabile anche nella discendenza, che si
traduce nella possibilità di terapia genica prolungata
nel tempo. L’integrazione e l’espressione esclusivamente in cellule proliferanti ne permette inoltre l’attività
su tumori localizzati in tessuti non proliferanti, in cui
solo le cellule tumorali invece si dividono: l’infezione
è quindi limitata e selettiva, e non interessa in genere i
tessuti limitrofi. Il rovescio della medaglia è rappresentato dalla non applicabilità in tessuti con attività replicativa ridotta o assente, come il tessuto nervoso, e dalla
non applicabilità alla terapia genica in vivo per l’azione
di killing operata dal sistema immunitario sulle cellule
trasformate.
L’impiego di questi vettori ha diverse incognite, fra
cui l’eventualità che l’integrazione nel genoma cellulare
avvenga in modo non controllato, al punto da determinare mutagenesi inserzionale: può avvenire in pratica
che l’inserzione del transgene si verifichi all’interno di
geni essenziali per la vita e le funzioni delle cellule ospiti,
al punto da causarne la morte. L’inserzione può inoltre
avvenire all’interno di geni oncosoppressori inattivandoli, oppure di oncogèni silenti causandone l’attivazione. Si ricorda che i geni oncosoppressori sono geni che
reprimono l’espressione di geni potenzialmente oncògeni, mentre gli oncogèni sono geni tumorali normalmente silenti, cioè inattivi. L’attivazione di questi ultimi
può in effetti avvenire per azione di sostanze chimiche,
radiazioni, infezioni virali ecc.
Si possono inoltre verificare altre possibili conseguenze indesiderate: variazioni nelle capacità e modalità
di risposta cellulare nei confronti di fattori di crescita,
ormoni, citochine e conseguente possibile acquisizione
di oncogenicità; o ancora la riattivazione di virus latenti
(Herpes virus, Virus di Epstein-Barr, Citomegalovirus).
Occorre quindi prendere in attenta considerazione tale
eventualità sia nella selezione dei soggetti da sottoporre
a trattamento sia nel monitoraggio post-terapia.
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ESERCIZI DI VERIFICA
1. Rispondi alle seguenti domande:
Come avviene il trasferimento di geni nelle piante con il batterio Agrobacterium tumefaciens?
Cosa sono i protoplasti?
Come si realizza la micropropagazione?
Descrivi il funzionamento degli ormoni auxine,
citochine e gibberelline.
Cosa si intende per “sessaggio del seme” in zootecnia?
Che cos’è e quali vantaggi porta la tracciabilità
genetica nei prodotti alimentari?
Cosa sono le proteine ricombinanti? Spiega
come si ottengono e illustra qualche esempio.
Spiega cosa si intende per terapia genica in vivo
ed ex vivo.
Cosa sono i retrovirus?
Quali rischi comporta l’impiego dei vettori retrovirali nella terapia genica?
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8
CONTAMINAZIONI
MICROBIOLOGICHE E
CHIMICHE DEGLI ALIMENTI
8.1 Qualità e igiene degli alimenti
8.2 Contaminazione microbica
degli alimenti
8.3 Processi di degradazione microbica
8.4 I microrganismi indicatori
8.5 I fattori che condizionano
la microbiologia degli alimenti
8.6 Contaminazione chimica
degli alimenti
Da molto tempo l’alimentazione umana fa un uso
sempre più massiccio di alimenti preparati industrialmente, per ragioni facilmente comprensibili legate alle
consuetudini e ai ritmi attuali di vita. In un simile contesto assume un’importanza fondamentale l’igiene dei
processi produttivi, sia per assicurare il mantenimento
delle caratteristiche organolettiche e nutrizionali degli
alimenti, sia per prevenire la diffusione di malattie (infezioni, intossicazioni, tossinfezioni) legate al consumo
di alimenti contaminati da microrganismi, da tossine o
da sostanze chimiche pericolose. D’altronde è noto che
anche le preparazioni casalinghe e i tradizionali metodi
di preparazione e di conservazione dei cibi possono nascondere insidie per la salute.
8.1 Qualità e igiene degli alimenti
Muffa su cibo (fonte: www.wikipedia.com).
La qualità di un alimento, intesa nella più ampia accezione del termine, deriva dall’interazione di un insieme
di fattori diversi. Concorrono infatti alla definizione di
“qualità totale” le seguenti caratteristiche:
r nutrizionali: riguardano gli elementi nutritivi presenti in un alimento rendendolo più o meno pregiato.
Le tecnologie di preparazione e trasformazione degli
alimenti possono influenzarne le qualità nutrizionali,
come nel caso delle vitamine, che vengono parzialmente o totalmente eliminate dai trattamenti termici
r organolettiche: consistono in aspetti apprezzabili
quali il colore, l’odore, il sapore, la consistenza e altri
ancora, che vengono ben presto modificati dall’attacco dei microrganismi. Per ogni alimento esistono
118
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CONTAMINAZIONI MICROBIOLOGICHE E CHIMICHE DEGLI ALIMENTI
qualità organolettiche “standard”, la cui variazione è
indice di fenomeni alterativi
r microbiologiche: la qualità microbiologica è in
relazione alla presenza/assenza di microrganismi
alteranti, di microrganismi patogeni, all’osservanza
delle “buone pratiche di produzione”, all’adozione di
efficaci trattamenti di sanitizzazione. La qualità microbiologica comprende aspetti legati alle fasi produttive, cioè all’igiene del personale e degli ambienti
di produzione che nel loro insieme condizionano la
conservabilità dell’alimento (qualità igienica), e altri legati all’assenza di rischi per la salute pubblica,
rappresentati da microrganismi patogeni o loro tossine (qualità sanitaria)
r tecnologiche: sono in stretta relazione con la qualità delle materie prime impiegate nella preparazione
dell’alimento. Nel caso delle carni è possibile valutare la loro qualità ricorrendo a specifiche indagini di
laboratorio, quali il controllo del pH, la conducibilità
elettrica, la capacità di trattenere l’acqua, l’aspetto e
la consistenza delle masse muscolari
r chimiche: sono legate alla composizione chimica
dell’alimento e alla possibile presenza di sostanze
tossiche o comunque dannose, come residui di pesticidi, metalli pesanti ecc.
8.2 Contaminazione microbica
degli alimenti
La distinzione fra qualità igienica e sanitaria è basata
sulla considerazione che negli alimenti è possibile rinvenire anche un numero relativamente elevato di microrganismi senza che ciò costituisca un pregiudizio per la
sicurezza in termini di rischio biologico: si può trattare,
in altri termini, di germi banali o saprofiti, la cui presenza
può causare fenomeni alterativi che rendono l’alimento non adatto al consumo in seguito alla modificazione
delle qualità organolettiche/sensoriali. Gli aspetti sanitari sono invece legati alla presenza di germi patogeni
in grado di provocare infezioni, intossicazioni o infezioni
alimentari (capitolo 11).
Le contaminazioni microbiche si possono realizzare
a livelli diversi:
r la contaminazione primaria si verifica nella fase
di produzione ad opera di microrganismi presenti
nell’acqua, nell’aria, nel suolo (particolarmente im-
8
Figura 8.1 Norme di sicurezza igienica in stabilimenti
di produzione alimentare (Shutterstock Images LLC).
portante per gli alimenti di origine vegetale), nell’animale produttore; è legata alla qualità delle materie
prime impiegate nella preparazione
r la contaminazione secondaria riguarda l’igiene
all’interno dello stabilimento di trasformazione e
quello degli addetti alla lavorazione (figura 8.1)
r la contaminazione terziaria si può verificare a livello del punto vendita (per es. nel caso di interruzione
della catena del freddo)
r la contaminazione quaternaria è quella che si
realizza al momento della preparazione del cibo per
il consumo, sia in ambiente domestico che nella ristorazione collettiva.
Una suddivisione più semplice distingue solo fra una
contaminazione primaria, legata alle materie prime, e una
secondaria, raggruppando in quest’ultima tutte le altre
possibili fonti di contaminazione sopra elencate.
8.3 Processi di degradazione
microbica
Gli alimenti sono composti principalmente da proteine, lipidi, carboidrati, insieme con una percentuale più
o meno elevata di acqua e di altri elementi: i microrganismi, disponendo di un’ampia versatilità metabolica,
possono utilizzare sostanze molto diverse come substrati nutritivi per il loro accrescimento. Schematicamente,
è possibile elencare le seguenti possibilità (tabella 8.1):
r l’attacco delle sostanze proteiche da parte dei microrganismi proteolitici è noto come putrefazione
119
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CONTAMINAZIONI MICROBIOLOGICHE E CHIMICHE DEGLI ALIMENTI
Tabella 8.1 Alimenti come substrati nutritivi
per i microrganismi
ALIMENTI
MICRORGANISMI
PRODOTTI
Proteici
Proteolitici
Aminoacidi,
ammine, ammoniaca,
acido solfidrico
Ricchi in
carboidrati
Fermentanti
Acidi, alcol, gas
Lipidici
Lipolitici
Acidi grassi, glicerolo
r sui substrati di natura prevalentemente glucidica si
verifica in particolare l’attività fermentativa dei microrganismi, con la produzione di un’ampia varietà
di prodotti metabolici. Vengono generalmente prodotti acidi, alcol e gas
r il risultato dell’azione microbica sulla componente
lipidica degli alimenti provoca rancidità, causata
peraltro anche dall’azione della luce e dell’aria con
produzione di acidi grassi e glicerolo.
Conseguenze di questi fenomeni di alterazione microbica
sono:
r sviluppo di sapori e odori sgradevoli
r variazioni di colore
r rammollimenti
r marciumi
r produzione di mucillagini (da batteri e/o lieviti)
r ammuffimenti superficiali (da muffe).
Poiché spesso gli alimenti non presentano una composizione uniforme ma sono costituiti da una miscela
eterogenea di ingredienti, alterazioni e degradazioni
microbiche di natura e tipo diversi possono verificarsi
contemporaneamente o in rapida successione, determinando modificazioni biologiche e chimiche spesso
irreversibili. Nel primo caso, le alterazioni sono dovute
all’attività metabolica dei microrganismi o a quella degli
enzimi presenti nell’alimento, nel secondo risulta decisiva l’azione della luce, della temperatura, dell’ossigeno: è
noto per esempio che luce e ossigeno causano l’inattivazione di molte vitamine. Temperature di conservazione
superiori a quelle prescritte possono favorire lo sviluppo
di molti microrganismi, mentre sono sufficienti percentuali anche molto basse di umidità per lo sviluppo delle
muffe.
A seconda della loro suscettibilità ad andare incontro ad alterazione, gli alimenti possono essere distinti in
almeno tre categorie diverse:
r alimenti deperibili, che subiscono facilmente l’attacco dei microrganismi e possono di conseguenza
essere conservati per un periodo molto breve (per
es. il latte crudo)
r alimenti semideperibili, il cui periodo di conservabilità è relativamente più lungo, anche in relazione
alle tecniche di conservazione adottate
r alimenti stabili, che difficilmente sono soggetti ad
alterazioni microbiche.
8.4 I microrganismi indicatori
Per la valutazione della qualità microbiologica degli alimenti ci si può avvalere della ricerca di microrganismi indicatori di sicurezza, indicatori di processo e indicatori
di qualità o shelf-life.
I microrganismi indicatori di sicurezza
Comprendono i microrganismi e i relativi prodotti metabolici la cui concentrazione (quantificabile, rispettivamente, in UFC/g o mL e in mg/kg) possono rappresentare un pericolo per la salute del consumatore. Si tratta di
microrganismi patogeni e tossine responsabili di malattie anche gravi (capitolo 11). È ovvio che condizioni che
permettono la proliferazione dei microrganismi nell’alimento aumentano il rischio, mentre opportuni trattamenti tecnologici che li distruggono lo diminuiscono in
modo significativo. Il pericolo per il consumatore è reso
più insidioso dalla constatazione che raramente la presenza dei microrganismi e dei prodotti metabolici indicatori di sicurezza causa alterazioni visibili nell’alimento.
Il regolamento CE 2073/2005 riporta come indicatori di sicurezza per l’accettabilità dei prodotti alimentari microrganismi responsabili di infezioni, tossinfezioni
e intossicazioni alimentari: in particolare Salmonella (figura 8.2) e Listeria monocytogenes, nonché Enterobacter
sakazakii limitatamente ai prodotti destinati alla prima
infanzia; le enterotossine stafilococciche nei prodotti lattiero-caseari; la presenza di istamina nei prodotti
della pesca. Per le acque destinate al consumo umano
(Direttiva 98/83 CE) vengono utilizzati microrganismi
120
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CONTAMINAZIONI MICROBIOLOGICHE E CHIMICHE DEGLI ALIMENTI
8
dei funghi (micotossine) sono in genere composti
eterociclici; le tossine di pesci e molluschi sono prodotte da alghe di cui questi organismi si cibano
r le tossinfezioni alimentari si verificano in seguito
all’ingestione di alimenti contaminati da microrganismi che, una volta penetrati nell’organismo, elaborano tossine. Tipico è il caso di tossinfezioni da batteri sporigeni quali Clostridium perfringens e Bacillus
cereus, le cui spore, resistenti all’ambiente acido dello
stomaco, germinano a livello intestinale producendo
e liberando le tossine.
Microrganismi indicatori di igiene
di processo
Figura 8.2 Salmonella. Immagine al microscopio elettronico
del batterio Salmonella, responsabile di alcune tossinfezioni
alimentari (Dennis Kunkel Microscopy, Inc.).
indicatori di contaminazione fecale (Escherichia coli, Enterococcus) per il loro habitat intestinale e per la sicura
corrispondenza fra il loro rinvenimento nei campioni
e la possibile concomitante presenza di microrganismi
patogeni di origine fecale. Gli indicatori di contaminazione fecale nel loro complesso (coliformi, E. coli, enterococchi, clostridi solfitoriduttori) possono comunque
essere tradizionalmente considerati indicatori di qualità
in tutti gli alimenti. I germi patogeni trovano negli alimenti e nelle bevande un veicolo di trasmissione ideale,
rendendosi responsabili di:
r infezioni alimentari: causate dalla penetrazione
e dalla riproduzione dei microrganismi all’interno
dell’ospite, come nel caso di infezioni da Salmonella
e Listeria monocytogenes, che sono anche gli indicatori di sicurezza più frequentemente ricercati negli
alimenti
r intossicazioni alimentari: sono dovute all’ingestione di alimenti contenenti tossine liberate dai
microrganismi nell’alimento prima del consumo. Al
momento del consumo la presenza delle tossine può
risultare indipendente da quella dei microrganismi:
i microrganismi infatti possono essere stati eliminati ma le tossine risultare ancora presenti. Esempi di
intossicazioni sono quelle causate dall’ingestione di
tossina stafilococcica e botulinica: quest’ultima è
un’intossicazione di estrema gravità con conseguenze spesso letali (tabella 8.2). Le tossine batteriche
sono di natura proteica o lipopolisaccaridica; quelle
Gli indicatori di processo testimoniano lo stato igienico in uno o più punti della filiera produttiva, dalla
materia prima al prodotto finito. Il regolamento CE
2073/2005 riporta come indicatori di igiene di processo le seguenti ricerche:
r per la carne e derivati: carica mesofila aerobia, Enterobacteriaceae, E. coli
r per il latte e derivati: Enterobacteriaceae, E. coli e stafilococchi coagulasi positivi
r per i prodotti a base d’uovo: Enterobacteriaceae
r per i prodotti ittici: E. coli e stafilococchi coagulasi
positivi
r ortaggi, frutta e derivati: E. coli.
Escherichia coli è considerato indicatore di inquinamento
di origine fecale; Staphylococcus aureus è un indicatore di
manipolazione umana igienicamente scorretta.
Microrganismi indicatori di qualità
o shelf-life
La qualità di un alimento decade in un lasso di tempo
più o meno lungo durante la sua conservazione per cause
dovute in gran parte all’attività di microrganismi contaminanti, anche in relazione a fattori fisici e ambientali.
Un alimento viene considerato alterato quando si siano
verificate al suo interno modificazioni sostanziali che lo
rendono inaccettabile e non adatto al consumo. Le alterazioni sono ascrivibili in gran parte all’azione di enzimi
idrolitici prodotti dai microrganismi contaminanti e li121
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CONTAMINAZIONI MICROBIOLOGICHE E CHIMICHE DEGLI ALIMENTI
Tabella 8.2 Microrganismi responsabili di intossicazioni alimentari
TIPO
GENERE
O SPECIE
MALATTIA
SINTOMI
ALIMENTI MAGGIORMENTE
COINVOLTI
Batterio
Gram-positivo
Clostridium
botulinum
Botulismo,
botulismo
infantile
Vomito, debolezza, vertigini, disturbi della visione,
difficoltà di respirazione,
paralisi
Conserve e semiconserve
di carne e di pesce, conserve
di verdure e di funghi, alimenti non
acidi condizionati in assenza di aria
Staphylococcus
aureus
Gastroenterite
Nausea, vomito, dolori
addominali, debolezza
e diarrea
Latte e derivati, uova e ovoprodotti, preparazioni a base di carne,
piatti pronti di gastronomia, alimenti preparati con manipolazione,
pasticceria alla crema
Aspergillus flavus,
A. parasiticus
Aflatossicosi
(aflatossine)
Ittero, edema agli arti
inferiori, cirrosi epatica,
cancro al fegato
Cereali e derivati, semi oleaginosi, mangimi, frutta secca, latte e
derivati
Aspergillus
versicolor
Micotossicosi
(sterigmatocistina)
Ittero, edema agli arti
inferiori, cirrosi epatica,
cancro al fegato
Cereali e derivati, semi oleaginosi,
mangimi, frutta secca, caffè, cacao
Aspergillus ochra- Ocratossicosi
ceus
(ocratossina A)
Penicillium
verrucosum
Anemia, poliuria, nefrite
Cereali e derivati, mangimi, caffè,
latte e derivati, carne suina, vino,
birra
Fusarium
graminearum
Micotossicosi
(zearalenone)
Vomito, diarrea, cefalea
Cereali e derivati
Fusarium
moniliformis
Micotossicosi
(fumonisina)
Vomito, diarrea, cefalea
Cereali e derivati
Penicillium
patalum,
P. expansum
Micotossicosi
(patulina)
Nausea, vomito, dolori
addominali
Frutta e derivati, frutta secca,
succhi di frutta
Muffa
berati nel substrato oppure direttamente al metabolismo
microbico. È indispensabile considerare che l’entità e la
velocità delle alterazioni sono determinate o comunque
influenzate da una serie di fattori, quali:
r la natura dell’alimento e gli enzimi presenti naturalmente al suo interno, i processi subiti dall’alimento
(congelamento, scongelamento, essiccamento ecc.)
r eventuali danni subiti durante la lavorazione, il trasporto, lo stoccaggio sia delle materie prime che dei
prodotti finiti
r modificazioni delle condizioni ambientali (pH, temperatura, potenziale redox, aw)
r eventuali infestazioni da parte di insetti o roditori.
I microrganismi indicatori di qualità o shelf-life (letteralmente “vita di scaffale”, cioè stabilità di un prodotto
durante la sua conservazione; capitolo 10) determinano
la conservabilità del prodotto, poiché ne condizionano le
caratteristiche organolettiche di qualità. Una loro eventuale moltiplicazione durante la conservazione del prodotto può pregiudicarne l’accettabilità. Questi microrganismi devono essere facilmente rilevabili, la loro presenza
e concentrazione e quella dei loro metaboliti deve avere
relazione diretta con le alterazioni subite dall’alimento;
devono inoltre essere rinvenuti con elevata frequenza.
Una dato di fatto ampiamente accettato è che, anche se
la contaminazione iniziale è nella maggior parte dei casi polimicrobica, la responsabilità finale dell’alterazione è ascrivibile solo a pochi microrganismi o a uno solo in particolare,
in grado di riprodursi con un ritmo più veloce dei “concorrenti” perché ha trovato le condizioni ambientali ottimali.
In questo contesto assumono particolare importanza due parametri (figura 8.3):
r il limite di accettabilità, in pratica la concentrazione minima di microrganismi che determina l’inaccettabilità dell’alimento
122
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CONTAMINAZIONI MICROBIOLOGICHE E CHIMICHE DEGLI ALIMENTI
9
8.5 I fattori che condizionano
la microbiologia degli alimenti
Le variabili in grado di condizionare il tipo e l’entità della contaminazione microbica di un alimento riguardano
soprattutto:
r il tipo di microrganismi: batteri, lieviti, muffe hanno esigenze nutritive e ambientali (temperatura, pH,
aw ecc.) diverse per cui, a seconda delle condizioni
in cui si trova l’alimento e della sua composizione,
si avrà lo sviluppo preferenziale dell’uno o dell’altro
tipo microbico. Spesso la contaminazione è dovuta
inizialmente a un tipo di microrganismo, il cui metabolismo provoca nel substrato variazioni che in seguito si rivelano più favorevoli ad altri tipi microbici
che prendono quindi il sopravvento
r la carica microbica: una carica microbica saprofitica relativamente alta già all’origine causa nell’alimento un rapido decadimento in termini di caratteristiche organolettiche e di valore nutritivo, fino a
provocare alterazioni che lo rendono inutilizzabile.
Se poi si verifica contaminazione da parte di batteri
patogeni, il problema assume aspetti preoccupanti o
gravi anche dal punto di vista sanitario
r la composizione dell’alimento, che condiziona il
tipo di microrganismi che vi si possono preferibilmente sviluppare
r le modalità di conservazione: tecniche di conservazione che non tengono conto delle caratteristiche
dell’alimento e dei rischi legati alla sua manipolazione possono comprometterne irreparabilmente la
qualità igienica e la sicurezza.
8
Log UFC/g
Data la varietà della loro composizione, è logico attendersi che a prodotti diversi corrispondano in linea di
massima microrganismi alteranti diversi. Per ogni tipologia di prodotto si possono quindi individuare microrganismi o loro metaboliti che ne causano di preferenza
l’alterazione, perché in quell’alimento trovano condizioni adatte al loro sviluppo. Questi microrganismi possono venire impiegati come specifici indicatori di qualità
(tabella 8.3).
9
Popolazione microbica totale
Microrganismo alterante
Metabolita alterante
8
7
7
6
6
5
5
4
4
3
3
2
2
1
Limite di
accettabilità
mg/kg
r l’indice chimico di alterazione (chemical spoilage
index): la concentrazione minima di metabolita che
determina l’inaccettabilità dell’alimento.
Chemical
spoilage
index
1
Shelf-life
0
0
0
2
4
6
Tempo
8
10
Figura 8.3 Andamento di alcuni parametri di alterazione
microbica.
I fattori che condizionano la sopravvivenza dei microrganismi su un alimento coincidono in pratica con quelli che
influiscono sullo sviluppo microbico in generale:
r presenza di acqua: come tutti gli organismi viventi,
i microrganismi necessitano di acqua, presente negli
alimenti in concentrazione variabile. L’acqua di cui
i microrganismi possono disporre rappresenta solo
una parte del quantitativo totale presente in un alimento: è la quota detta acqua libera, che cioè non
risulta impegnata in legami con altre sostanze e viene
indicata con il simbolo aw (attività dell’acqua o activity water). Ogni microrganismo presenta un proACTIVITY WATER
Il parametro aw si ricava dal rapporto
P/P0
fra tensione di vapore P dell’acqua nel mezzo (substrato, in questo caso l’alimento) e tensione di vapore
dell’acqua pura (P0) nelle stesse condizioni di temperatura e pressione. Nell’acqua pura P0 = 1 e P = P0.
L’aggiunta di soluti nell’acqua pura (che in questo
modo diventa in pratica equivalente al substrato)
abbassa la sua tensione di vapore, per cui il rapporto
P/P0 diventa inferiore all’unità. Per tensione o pressione di vapore s’intende la pressione esercitata in
condizioni di equilibrio (fra molecole che sfuggono
dalla superficie e molecole che vi ricadono) dal vapore che sovrasta un liquido in un contenitore chiuso, a
una determinata temperatura.
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CONTAMINAZIONI MICROBIOLOGICHE E CHIMICHE DEGLI ALIMENTI
Tabella 8.3 Microrganismi e metaboliti di origine microbica indicatori di qualità
INDICATORE
PRODOTTO
GRUPPO O GENERE MICROBICO
Carica batterica
standard o carica
mesofila aerobia
Tutti gli alimenti
Batteri mesofili aerobi
Batteri psicrotrofi
Latte pastorizzato
Bacilli, Enterococcus
Burro, formaggi freschi non acidi, carne fresca
Pseudomonadaceae
Enterobacteriaceae, Enterococcus
Pesce fresco e altri prodotti ittici
Pseudomonadaceae, Bacillus, Erwinia,
Enterobacter, Leuconostoc
Latte UHT e sterile in bottiglia, panna UHT, bibite
analcoliche pastorizzate o UHT, conserve vegetali
e animali, pane e prodotti da forno lievitati, spezie
Bacillus spp.
Latte destinato a caseificazione di formaggi
a lunga stagionatura
Clostridium spp.
Batteri acidificanti
Piatti pronti di gastronomia, carne fresca in
atmosfera modificata, salumi (prosciutto cotto,
mortadella), ricotta fresca
Batteri lattici, coliformi, Enterococcus,
Carnobacterium, Brochothrix
Batteri pectinolitici
Ortaggi e frutta fresca, ortaggi pronti all’uso
refrigerati, semiconserve vegetali
Pseudomonadaceae, Bacillus, Erwinia,
Clostridium
Batteri alotolleranti
Pesce, molluschi, crostacei, carne salata, prodotti
in salamoia (fino al 12% di sale)
Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxella,
Shewanella, Vibrio, Clostridium, Micrococcus, Staphylococcus, Enterococcus
Batteri alofili
Pesce sotto sale
Halobacterium, Halococcus
Microrganismi lipolitici
Formaggi, burro, grassi vegetali, carne e derivati,
salumi
Batteri: Pseudomonas, Alcaligenes,
Micrococcaceae
Formaggi, burro, grassi vegetali, carne e derivati,
salumi, cacao, semi oleaginosi, spezie
Miceti: Aspergillus, Mucor, Penicillium,
Rhizopus, Candida, Hansenula,
Rhodotorula, Yarrowia
Yogurt, burro, formaggi freschi, marmellate,
puree e preparati a base frutta, succhi di frutta,
bibite analcoliche, ortaggi e frutta fresca
Lieviti e muffe
Latte in polvere, cereali, farine e sfarinati, pane e
prodotti da forno lievitati, marmellate e confetture, legumi, cacao, caffè, spezie, semi oleaginosi,
alimenti a ridotta aw
Muffe
Muffe termoresistenti
Conserve vegetali a base di frutta
Byssochlamys
Malattie del vino e della
birra
Vino, birra, sidro
Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus,
batteri acetici
Batteri sporigeni
Eumiceti
prio valore di aw, cioè un contenuto minimo di acqua
libera che deve essere disponibile nel substrato: al di
sotto di tale soglia il microrganismo non può sopravvivere (tabella 8.4). Esistono microrganismi adattati
a vivere in ambienti estremamente poveri di acqua
come le muffe xerofile; i lieviti sono mediamente più
esigenti, mentre i batteri sono i microrganismi che
mostrano maggiori esigenze in fatto di acqua. Queste considerazioni sono alla base delle tecniche di
conservazione degli alimenti basati sulla sottrazione
di acqua: la congelazione (che la trasforma in ghiaccio), l’essiccamento, l’alta concentrazione di sale (sa-
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CONTAMINAZIONI MICROBIOLOGICHE E CHIMICHE DEGLI ALIMENTI
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Tabella 8.4 Valori minimi di aw per alcuni microrganismi
lamoie) o zucchero (marmellate) che toglie acqua
alle cellule microbiche
r temperatura: i microrganismi richiedono per la
loro sopravvivenza valori ottimali di temperatura diversi e possono essere suddivisi in mesofili, termofili
e psicrofili (figura 8.4). La conoscenza di questi parametri è importante nella scelta dei trattamenti e delle
modalità di conservazione
r potenziale redox: questo parametro è un indice
della tendenza di un substrato a cedere o acquistare
elettroni, il cui passaggio determina una differenza
di potenziale (ddp) misurabile in mV (millivolt).
Quando un substrato cede elettroni si ossida e presenta un potenziale redox positivo (Eh positivo);
nel caso contrario subisce una riduzione, con la formazione di un potenziale redox negativo (Eh negativo). Lo sviluppo dei germi aerobi è favorito da
ambienti ossidati con valori positivi di Eh, mentre
quello degli anaerobi richiede preferibilmente valori
di Eh negativi. Alimenti freschi come i vegetali presentano valori positivi di Eh, per cui si svilupperanno
su di essi preferibilmente germi aerobi; le carni invece mostrano di solito un potenziale redox negativo,
con tendenza a favorire lo sviluppo di microrganismi
anaerobi. Le carni macinate e quelle appena macellate rappresentano un’eccezione, in quanto hanno di
solito valori positivi di Eh
r pH del substrato: rappresenta un parametro molto
importante e in grado di svolgere azione discriminante nei confronti della sopravvivenza dei microrganismi. Anche se la gran parte dei microrganismi
vive in ambiente con pH prossimo alla neutralità,
molte specie rilevanti in campo alimentare e/o sani-
MICRORGANISMI
VALORI DI aw
Batteri
0,91
Lieviti
0,88
Muffe
0,80
Muffe batteri alofili
0,75
Muffe xerofile
0,65
Lieviti osmofili
0,60
tario sopportano o prediligono ambienti acidi (per
es. i batteri lattici) o sono in grado di sopravvivere
anche a valori di pH decisamente alcalini (come i
vibrioni). Le muffe vivono su substrati con un ampio intervallo di valori di pH, mentre i lieviti preferiscono ambienti piuttosto acidi. Queste particolari
esigenze in fatto di pH vengono sfruttate per la coltivazione selettiva dei microrganismi in laboratorio.
Un importante aspetto legato al pH è costituito dalla
possibilità di sviluppo e di elaborazione della tossina
botulinica da parte di Clostridium botulinum. Questo
batterio anaerobio non è in grado di produrre la sua
potentissima neurotossina se il pH del mezzo è inferiore a 4,5, a prescindere da tutte le altre condizioni.
Le conserve di pomodoro (che potrebbero essere un
substrato ideale) hanno un pH intorno a 3, quindi
sono “sicure”. Se nell’alimento però si sviluppano
muffe che alzano il pH, ecco che la situazione può
diventare molto pericolosa.
Psicrofili
Termofili
Mesofili
Ipertermofili
Animali e piante
Microrganismi eucariotici
Bacteria e Archaea
-12
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
Temperatura di crescita (°C)
Figura 8.4 Intervalli di temperatura ottimale dei viventi.
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CONTAMINAZIONI MICROBIOLOGICHE E CHIMICHE DEGLI ALIMENTI
8.6 Contaminazione chimica
degli alimenti
La contaminazione chimica degli alimenti può derivare
da residui di sostanze presenti in quantità anche molto
piccole (ppm: parti per milione; ppb: parti per miliardo)
provenienti da:
r pratiche agronomiche (pesticidi/fertilizzanti)
r attività zootecniche (ormoni/tireostatici/antibiotici)
r cessione da parte di macchinari e contenitori
PARAMETRI TOSSICOLOGICI
L’impiego su larga scala dei pesticidi e degli xenobiotici in generale provoca problemi di inquinamento ambientale nei vegetali, nel suolo, nelle acque; alterazione
degli equilibri ecologici, fenomeni di tossicità acuta e
cronica negli animali e nell’uomo.
La tossicità acuta consiste nella capacità di una
sostanza di provocare sintomi tossici entro breve tempo. Si esprime come DL50 (quantità di sostanza in grado di uccidere la metà degli animali da esperimento su
cui è saggiata). Più il valore DL50 è basso, ovviamente
maggiore è la tossicità della sostanza.
La tossicità cronica è conseguente all’assunzione
della sostanza per lungo tempo in dosi anche minime.
La concentrazione soglia o dose soglia di una sostanza corrisponde a quella al di sotto della quale, in
base all’esame di specifiche curve dose/risposta (figura 8.5), non si evidenziano effetti negativi dovuti alla
sua assunzione negli animali da esperimento: immediatamente al di sotto di tale valore si colloca la NOEL
(no observable effects level), cioè la dose più elevata di
una sostanza che può essere assunta senza conseguenze negative. In pratica, i due concetti si equivalgono
e vengono spesso usati in modo intercambiabile. La
NOEL viene espressa non solo in base al peso corporeo, ma anche in base alla quantità di assunzione giornaliera, cioè in mg/kg/die, soprattutto quando si tratta
di valutare il rischio legato a un’assunzione o esposizione cronica allo xenobiotico. Nel trasferire all’uomo i dati della sperimentazione sugli animali il valore
NOEL viene prudenzialmente diviso per un fattore di
sicurezza (safety factor, SF) di 100. Il valore risultante costituisce la dose ADI (accettable daily intake) o
r coadiuvanti tecnologici impiegati nelle produzioni
alimentari
r inquinamento ambientale di origine umana e industriale.
Contaminazione da pesticidi
I pesticidi sono sostanze utilizzate in agricoltura per eliminare organismi dannosi per le colture.
Dose Giornaliera Ammessa (DGA), definita come
la quantità che può essere assunta senza conseguenze
per la salute, espressa in mg/kg di peso/die.
ADI (DGA) = NOEL/100
Secondo l’opinione di molti tossicologi sarebbe consigliabile abbassare ulteriormente il valore ADI fino a
NOEL/1000.
Nell’impiego dei pesticidi è fondamentale rispettare il “tempo di decadimento” (tempo occorrente
alla pianta per metabolizzare e, per quanto possibile,
degradare il composto chimico) in base al quale viene
stabilito un intervallo di sicurezza, cioè il tempo che
deve obbligatoriamente intercorrere fra il momento
del trattamento e quello della raccolta del prodotto
trattato.
100
Risposta %
8
50
0
A
B
DL50
C
Log dose
Figura 8.5 Curva dose-risposta. A-B-C rappresentano tre
diverse concentrazioni di una stessa sostanza, mentre la DL50
è la dose di sostanza capace di uccidere il 50% degli animali
a cui è stata somministrata.
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Tabella 8.5 Prodotti organici di sintesi
CLASSE
PRODOTTI
Clororganici
DDT, PCB
Fosforganici
Parathion, malathion
(esteri fosforici)
Azotorganici
Carbammati, ditiocarbammati
Azotosolforganici Atrazina, simazina
In base al loro impiego i pesticidi possono essere
classificati in:
r insetticidi: agiscono per contatto, inalazione o ingestione
r fungicidi o anticrittogamici: impiegati contro le
crittogame, cioè le muffe e i funghi in genere
r diserbanti
r fitormoni/fitoregolatori: agiscono interferendo
nei processi fisiologici delle piante.
In base alla composizione chimica si distinguono:
r prodotti inorganici: composti di rame e zolfo, fosfoderivati, clorati, composti arsenicali
r prodotti organici naturali (nicotina, piretro)
r prodotti organici di sintesi (tabella 8.5).
Impiego di ormoni anabolizzanti
e antibiotici
In molti Paesi è consentito l’impiego di ormoni e antibiotici per promuovere un più rapido sviluppo ponderale
degli animali d’allevamento. L’uso di queste sostanze è
vietato in Italia.
Gli anabolizzanti ormonali sono derivati da ormoni sessuali, che agiscono accelerando la crescita dell’animale. Si tratta di sostanze di origine:
r naturale (estrogeni, progesterone, androgeni)
r artificiale, quali lo stilbestrolo e derivati, con un’attività anche superiore a quella degli estrogeni naturali.
Gli estrogeni agiscono influenzando altri ormoni che
intervengono nel metabolismo: ormone della crescita,
insulina, ormoni della tiroide. Gli androgeni agiscono
direttamente sulle fibre muscolari e indirettamente su
altri ormoni metabolici. In sostanza, androgeni ed estro-
8
geni in associazione promuovono un più alto accumulo
di proteine a livello muscolare.
Gli antibiotici per uso veterinario vengono largamente impiegati per igienizzare gli allevamenti e a scopo terapeutico, ma anche illecitamente come promotori
della crescita, azione peraltro di efficacia non sempre
provata. L’impiego incontrollato di antibiotici nell’alimentazione animale ha diverse conseguenze: dai falsi
negativi nell’esame batteriologico delle carni, all’insorgenza di fenomeni allergici e di ceppi batterici antibiotico-resistenti negli stessi animali e nell’uomo.
Contaminazione da contenitori
I contenitori impiegati nell’industria alimentare sono di
varia natura:
r metallo: l’acciaio inox ha ottime caratteristiche; l’alluminio deve essere anodizzato o altrimenti protetto; la banda stagnata richiede un’ulteriore protezione con vernici
r ceramica: ha l’inconveniente della possibile presenza di ossidi di piombo e cadmio che vengono portati
in soluzione da alimenti acidi
r vetro: è un ottimo materiale per il confezionamento
dei cibi
r carta/cartone: vengono impiegati per i “brick”
dopo l’aggiunta di cera, paraffina o altri materiali impermeabilizzanti
r materie plastiche: la gamma di materie plastiche
utilizzate nei contenitori per alimenti è molto ampia
(tabella 8.6).
La ricerca ha messo a punto “plastiche verdi”, ottenute
cioè da carboidrati di origine vegetale, per esempio dal
mais, dall’acido polilattico o da altre sostanze, che presentano buoni valori di biodegradabilità. In laboratorio
si effettuano prove di migrazione globale e di migrazione specifica (per singoli contaminanti) dai contenitori
ai cibi contenuti al loro interno.
Contaminazione da coadiuvanti
tecnologici
Vengono definiti come “sostanze non consumate come
ingredienti alimentari in sé, utilizzate nella trasformazione
127
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CONTAMINAZIONI MICROBIOLOGICHE E CHIMICHE DEGLI ALIMENTI
Tabella 8.6 Materie plastiche impiegate per la fabbricazione di contenitori per alimenti
MATERIA
UTILIZZO
PE (polietilene)
Costituisce più del 60% di tutta la plastica. Impiegato per sacchetti, pellicole, accoppiato
con carta o alluminio in contenitori di vario tipo
PP (polipropilene)
Contenitori, pellicole
PVC (polivinil cloruro)
Bottiglie (no gas). Il monomero di base (CVM, cloruro di vinile monomero) è sicuramente
cancerogeno. Limiti di migrazione specifica: CVM = 0,01 pp; PVC = 1 ppm
PS (polistirolo)
Contenitori per yogurt e gelati
PTFE (teflon)
Utilizzato per utensili da cucina
PET (polietilentereftalato)
Bottiglie per bevande anche gasate
PA (poliammide/nylon)
Film per imballaggio; oggettistica
PC (policarbonato)
Contenitori di pregio
di materie prime, prodotti alimentari o loro ingredienti, al
fine di rispettare un determinato obiettivo tecnologico in
fase di lavorazione o trasformazione”. Esse comprendono:
r enzimi: la papaina è un enzima proteolitico usato
per l’intenerimento delle carni; il caglio è utilizzato nella produzione dei formaggi. Si ottengono per
mezzo di microrganismi geneticamente modificati
r solventi: esano, per l’estrazione di oli di semi e sanse; acetato di etile impiegato per la decaffeinizzazione del caffè
r chiarificanti: gelatina, caseina, bentonite, silice impiegati in enologia
r demetallizzanti: il potassio ferrocianuro allontana
il ferro dal vino
r decoloranti: carbone attivo per la rettifica degli oli
r agenti di distacco: silicone, oli minerali, polietilenglicol impiegati in pasticceria e nei prodotti da forno
r lubrificanti: impiegati nei macchinari e negli impianti
r detergenti e disinfettanti: ipoclorito e clorammine
sono utilizzati nella pulizia delle carcasse di animali;
acidi, alcali e tensioattivi nella pulizia di impianti e
contenitori.
Contaminazione da metalli pesanti
Il meccanismo d’azione dei metalli pesanti è basato sulla
loro reazione con i gruppi −SH di proteine ed enzimi, con
conseguente danno cellulare sia a livello strutturale che
metabolico.
I metalli pesanti, al pari dei pesticidi, si accumulano
negli strati superficiali del suolo, vengono assorbiti dalle
radici e contaminano gli alimenti di origine vegetale.
Nei mari e negli oceani il mercurio subisce prima
una bioconcentrazione nei tessuti dei pesci, quindi una
biomagnificazione lungo la catena alimentare fino ai
grandi predatori marini e da questi all’uomo: il 95% del
mercurio ingerito deriva dai prodotti ittici. Fra i composti del mercurio, quello dotato di maggior tossicità per
l’uomo è il metilmercurio: l’intossicazione provoca
gravi alterazioni del sistema nervoso, anemia, danni renali, atrofia muscolare; il mercurio inoltre può attraversare la barriera placentare e raggiungere il feto.
L’intossicazione da piombo (saturnismo) è una
malattia professionale, ma tutta la popolazione è ormai
sottoposta a inalazione di microdosi da inquinamento
ambientale. Il piombo si accumula nei depositi di grasso
e nelle ossa, da cui può passare a fegato, reni, muscoli e
cervello. Conseguenze dell’intossicazione cronica sono,
fra le altre, cirrosi epatica e danni cerebrali.
Il cadmio è impiegato nell’industria metallurgica
per la fabbricazione di leghe speciali, nella produzione
delle vernici e della plastica. Arriva all’uomo da alimenti
come i molluschi, i crostacei, i visceri dei vertebrati, oltre che dall’acqua e dal fumo di tabacco. Provoca osteoporosi, danni ai reni e al sistema nervoso.
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ESERCIZI DI VERIFICA
1. Le qualità nutrizionali degli alimenti comprendono elementi:
A sensibili ai metodi di conservazione
B apprezzabili attraverso i sensi
C possibili cause di malattia
2. Elenca almeno quattro categorie di sostanze chimiche che influiscono sulla qualità
degli alimenti:
...........................................................................
...........................................................................
...........................................................................
...........................................................................
3. Le qualità nutrizionali di un alimento:
A sono analoghe per tutti gli organismi
B devono tenere conto di intolleranze o allergie dei singoli casi
C devono tenere conto anche dell’aspetto del
cibo
4. Le qualità organolettiche comprendono:
A Le sostanze organiche presenti negli ingredienti
B Elementi che rendono un alimento più o
meno gradito
C Elementi che influiscono sulla digeribilità
dell’alimento
5. Una conservazione non idonea può influire
su:
A qualità organolettiche
B qualità nutrizionali
C entrambi i parametri indicati
6. Le qualità tecnologiche di un alimento riguardano
A i metodi di conservazione
B le caratteristiche delle materie prime impiegate
C la presenza di vitamine e proteine
7. La putrefazione si verifica su alimenti:
A proteici
B ricchi di vitamine e lipidi
C vegetali
8. La principale fonte di mercurio introdotta
con gli alimenti è costituita da:
A carne
B pesci
C uova
D latte e latticini
9. La contaminazione da metalli pesanti negli
organismi viventi è:
A maggiore in quelli di grande taglia per il fenomeno del bioaccumulo
B più elevata in quelli piccoli perché i metalli
pesanti sono più concentrati
C indipendente dalle dimensioni dell’organismo
10. I coadiuvanti tecnologici alimentari sono:
A sostanze vietate per legge
B integratori per l’alimentazione umana e animale
C sostanze impiegate per dare al prodotto
precise caratteristiche
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9
LA CONSERVAZIONE
DEGLI ALIMENTI
9.1 La conservazione degli alimenti
9.2 Conservazione con mezzi fisici
9.3 Conservazione con mezzi chimici
9.4 Impiego di additivi e conservanti
Gli alimenti lasciati a sé vanno naturalmente incontro a
una progressiva degradazione a opera di microrganismi,
enzimi, agenti fisici e chimici, che rendono ben presto
gli alimenti inutilizzabili o ne fanno veicoli di infezioni,
intossicazioni o tossinfezioni (capitolo 11). Fin dai tempi
antichi l’uomo ha cercato di prevenire il deterioramento
dei cibi per poterne disporre anche a distanza di tempo. Le modificazioni socio-economiche che dall’inizio
dell’Ottocento hanno portato, con la nascita della civiltà
industriale e dei grandi centri urbani, al progressivo spopolamento delle campagne e all’allontanamento dai luoghi di produzione di gran parte dei consumatori, hanno
determinato un rapido sviluppo delle industrie di preparazione, trasformazione e conservazione degli alimenti.
Ciò è stato possibile grazie al parallelo progresso delle
conoscenze scientifiche e all’affinamento delle capacità
tecnologiche che consentono oggi di disporre di alimenti sicuri e di qualità anche a notevole distanza di tempo
dalla loro preparazione e dal loro confezionamento.
9.1 La conservazione degli alimenti
Impianto di pastorizzazione del latte.
I fattori responsabili delle alterazioni degli alimenti sono
riconducibili all’azione di un’ampia varietà di microrganismi e di loro prodotti metabolici, all’azione di numerosi enzimi, dell’ossigeno, della luce e alla presenza
di acqua libera. I microrganismi responsabili delle più
comuni alterazioni sono rappresentati soprattutto da
batteri, muffe e lieviti (tabella 9.1).
Gli obiettivi perseguiti nelle tecniche di conservazione degli alimenti consistono essenzialmente nel blocca-
130
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9
LA CONSERVAZIONE DEGLI ALIMENTI
Tabella 9.1 Microrganismi alterativi in vari settori alimentari
SETTORE
RISCHIO DA BATTERI
RISCHIO DA MUFFE E LIEVITI
Lattiero-caseario
Listeria monocytogenes,
Staphylococcus aureus
Mucor, Penicillium chrysogenum
Yogurt e formaggi freschi
Cladosporium, Candida
Salumificio
Listeria monocytogenes, E. coli
Macelleria
Listeria monocytogenes, E. coli
Ristorazione collettiva
Listeria monocytogenes, Salmonella
Prodotti da forno
Salmonella, E. coli
Aspergillus niger, Wallemia sebi
Dolciario
Staphylococcus
Penicillium chrysogenum
Bevande, succhi di frutta
Penicillium expansum, Aspergillus glaucus
Penicillium expansum, micotossine
Cereali, magazzini di insilamento
Salmonella
Aspergillus fumigatus
Conservazione frutta
e vegetali
Erwinia carotovora
Botrytis, Penicillium expansum
Pollame, uova
Salmonella, Enterococcus hirae
Aspergillus fumigatus, Cladosporium
Allevamento animale
Salmonella
Aspergillus fumigatus, Aspergillus corymbifera
re l’attività degli enzimi, nell’eliminare i microrganismi
eventualmente presenti o comunque arrestarne la riproduzione. Le tecniche di conservazione possono essere
le più diverse: la scelta viene effettuata, in ottemperanza
alla vigente normativa, in base a fattori quali la natura
dell’alimento, la necessità di mantenere inalterate le sue
caratteristiche organolettiche e di impiegare trattamenti
o sostanze non dannosi per il consumatore.
I trattamenti possono essere effettuati a più livelli:
r sulle materie prime, sugli ingredienti, sul loro immagazzinamento e stoccaggio
r nei riguardi del personale addetto al trasporto, alla
manipolazione, alla lavorazione e al confezionamento di materie prime e ingredienti, che deve essere
convenientemente preparato e sensibilizzato riguardo all’inderogabile necessità della più scrupolosa osservanza delle norme igieniche
r nei locali di trasformazione, con particolare riguardo
alla temperatura (che non deve superare i 12-14 °C)
e allo stato igienico dell’aria ambiente
r sulle attrezzature e superfici di lavoro, di cui è fondamentale controllare periodicamente la carica microbica ed escludere la presenza di patogeni.
È possibile distinguere fra trattamenti fisici e trattamenti
chimici.
9.2 Conservazione con mezzi fisici
I trattamenti con mezzi fisici comprendono: impiego di
alte o basse temperature, disidratazione, liofilizzazione,
irradiazione, atmosfera controllata e modificata, affumicatura.
Alte temperature
Le alte temperature hanno azione battericida e inattivano gli enzimi per denaturazione. Il trattamento può
essere energico fino a giungere alla sterilizzazione del
prodotto, ma con la contropartita di un decadimento
notevole delle caratteristiche organolettiche, in particolare dei principi nutritivi. La scelta viene quindi
effettuata in base alla natura dell’alimento e all’obiettivo da raggiungere, con un compromesso fra sicurezza
igienico-sanitaria (assenza di rischi per il consumatore)
e salvaguardia delle caratteristiche organolettiche. Le
diverse combinazioni di tempi e temperature di trattamento vengono scelte in base alle esigenze produttive e
alla termoresistenza dei microrganismi che ci si propone
di eliminare.
La crescita microbica può, salvo casi di microrganismi “estremi”, avvenire fra i −5 °C e i +90 °C; in gene131
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9
LA CONSERVAZIONE DEGLI ALIMENTI
TERMORESISTENZA DEI MICRORGANISMI
Il calore uccide i microrganismi inattivando gli enzimi
cellulari. I vari microrganismi mostrano livelli diversi
di resistenza alle alte temperature, anche in relazione a
molteplici fattori ambientali: una conoscenza particolarmente approfondita di questi fenomeni è richiesta a
chi si occupa della lotta ai microrganismi a livello industriale, per esempio nella preparazione e nella conservazione di alimenti (carne, pesce, legumi in scatola) e bevande (latte pastorizzato e UHT, succhi di frutta).
In microbiologia industriale si tiene conto di alcuni
parametri, importanti per decidere a quale temperatura e per quanto tempo trattare un campione per ottenere gli obiettivi desiderati.
I parametri principali sono:
r il Punto di Morte Termica (TDP = thermal death
point): indica la temperatura minima necessaria per
eliminare in 10 min tutti i batteri in una sospensione liquida con una concentrazione standard di 105
cellule/mL
Tabella 9.2 TDT di alcuni microrganismi trattati con calore
umido
MICRORGANISMO
TEMPERATURA
(°C)
TEMPO
(min)
Batteri non sporigeni
Salmonella typhosa
Staphylococcus aureus
Escherichia coli
Lactobacillus bulgaricus
60
60
60
71
4,3
18,8
20-30
30
Batteri sporigeni
Bacillus anthracis
Bacillus subtilis
Clostridium sporigenes
Clostridium botulinum
100
100
100
100
1,7
15-20
60-120
120-360
r il Tempo di Morte Termica (TDT = thermal
death time): indica il tempo necessario per eliminare tutti i batteri in una sospensione liquida con
una concentrazione standard di 105 cellule/mL in
condizioni di temperatura e ambientali prefissate
(tabella 9.2)
r il Tempo D o di riduzione decimale: corrisponde
al tempo necessario per ridurre del 90% (o al 10%
del valore iniziale) il numero di batteri presenti in
una sospensione a una temperatura prefissata (tabella 9.3)
r il valore Z: indica la temperatura in gradi centigradi necessaria per eliminare il 90% dei microrganismi presenti in una sospensione.
I valori D e Z dei microrganismi più pericolosi sono
noti, per cui, dopo aver pianificato le condizioni entro
cui operare e gli obiettivi da raggiungere in termini di sicurezza alimentare (ragionevole certezza che l’alimento
non rappresenti rischio biologico per il consumatore),
si potranno scegliere le più opportune combinazioni fra
tempo e temperatura di trattamento per garantire, da
una parte, la sicurezza microbiologica del prodotto e,
dall’altra, la migliore conservazione delle sue caratteristiche organolettiche.
Tabella 9.3 Valore D di alcuni microrganismi
MICRORGANISMO
TEMPERATURA
(°C)
D
(min)
Staphylococcus aureus
70
0,2-2
Salmonella spp.
65,5
0,02-0,25
Lieviti e muffe
(forme vegetative)
65,5
0,5-3
Spore di Bacillus subtilis
100
11
Notare che non tutte le spore batteriche hanno la stessa resistenza al calore.
re comunque si verifica nell’intervallo fra 0 °C e 60 °C
(figura 9.1). Ogni specie microbica ha, comunque, un
proprio intervallo ottimale di sopravvivenza, così come
varia la temperatura necessaria per uccidere i microrganismi: in genere i Gram-positivi sono più resistenti dei
Gram-negativi; le muffe, i lieviti e le loro spore sono
piuttosto sensibili al calore, al contrario di quelle batte-
riche che mostrano un’elevata resistenza alle alte temperature.
L’effetto delle alte temperature sui microrganismi è
condizionato da diversi fattori, fra cui:
r la fase di sviluppo microbico: i batteri in fase di accrescimento logaritmico mostrano una sensibilità
più elevata di quelli in fase di quiescenza
132
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9
LA CONSERVAZIONE DEGLI ALIMENTI
4
4
2
Figura 9.1 Temperatura e tempi di generazione microbica
per mesofili e psicrofili.
Entrata
fluido
freddo
r la carica microbica dell’alimento: quanto più è elevata, tanto più energico deve essere il trattamento
termico
r il pH dell’alimento: un substrato acido aumenta l’efficacia del trattamento termico
r il contenuto di acqua libera (aw) dell’alimento: valori bassi di aw aumentano la termoresistenza dei microrganismi
r la presenza di sostanze ad azione antimicrobica (per
es. nitriti).
Uscita
fluido freddo
Le modalità di trasmissione del calore sono:
r conduzione: passaggio del calore per contatto da
un corpo più caldo a uno più freddo tra due superfici solide o all’interno di un solido per effetto della
trasmissione dei moti di oscillazione delle molecole
r convezione: si verifica in un fluido per effetto dello
spostamento delle molecole dalle zone più calde a
quelle più fredde
r irraggiamento: il calore si propaga da un corpo riscaldato attraverso radiazioni elettromagnetiche che
vengono assorbite da un corpo più freddo e convertite in calore. L’irraggiamento si può verificare anche
nel vuoto (cioè in assenza di materia); le radiazioni
infrarosse sono quelle più facilmente assorbite e
convertite in calore. Le microonde agiscono su sostanze che contengono molecole d’acqua o che hanno struttura polare.
Fattori importanti in un trattamento termico sono la
conducibilità termica dell’alimento e del contenito-
3
4
1
4
2
a)
Uscita
fluido
caldo
Entrata
fluido caldo
b)
Figura 9.2 Scambiatori di calore a piastre e a tubi.
(a) Scambiatore a tubi: il fluido passante per i tubi scambia
calore con il fluido esterno; 1) diaframma che rallenta la velocità
del fluido esterno e sostiene i tubi; 2) piastre di fissaggio
dei tubi; 3) involucro esterno; 4) bocche di alimentazione e
deflusso. (b) Scambiatore a piastra: le piastre sono sagomate
con scannellature trasversali e longitudinali.
re e la velocità di penetrazione del calore. Il prodotto non viene riscaldato contemporaneamente in tutte
le sue parti: occorre tener conto del fatto che affinché
la temperatura voluta raggiunga anche la parte centrale, definita “punto freddo”, è necessario un tempo di
trattamento più lungo. Natura, tipo e dimensioni dei
contenitori influenzano in modo significativo i tempi
di esposizione necessari a garantire l’efficacia del trattamento termico.
Nell’industria alimentare il riscaldamento diretto
per iniezione di vapore si effettua raramente: vengono
solitamente impiegati scambiatori di calore, sia per
fornire che per sottrarre calore. Si tratta di sistemi in
cui una parete metallica separa il fluido scaldante o
refrigerante dal prodotto da trattare; le tipologie più
frequentemente utilizzate sono scambiatori di calore
a piastre o a tubi (figura 9.2) costruiti solitamente in
acciaio inox a garanzia di una maggiore igiene e facilità
di pulizia.
L’utilizzo delle alte temperature in campo alimentare è una tecnica assai diffusa e comprende pastorizzazione e sterilizzazione.
133
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9
LA CONSERVAZIONE DEGLI ALIMENTI
Pastorizzazione
La pastorizzazione è un trattamento termico di sanitizzazione che ha l’obiettivo di eliminare i batteri patogeni,
buona parte della flora microbica saprofita nonché di
disattivare gli enzimi, mantenendo inalterate le caratteristiche organolettiche dell’alimento. La pastorizzazione
viene impiegata soprattutto per latte, vino, birra, succhi
di frutta: quella del latte si effettua generalmente a 7275 °C per 15 s con il trattamento rapido HTST (high
temperature short time), che ha sostituito quello lento a
65 °C per 30 min. Poiché le temperature raggiunte non
CONSERVE E SEMICONSERVE
Le conserve e le semiconserve sono alimenti trattati
termicamente dopo essere stati chiusi in contenitore
ermetico. Le conserve sono portate a temperatura di
sterilizzazione (121 °C) dopo il confezionamento; le
semiconserve, per la natura e composizione degli alimenti, non possono essere sottoposte a sterilizzazione.
Presentano di conseguenza un certo contenuto microbico, tenuto sotto controllo (impossibilità di riproduzione) dal pH acido dell’alimento, da additivi ad azione
batteriostatica o dalla bassa temperatura di conservazione, che comunque è garantita solo per un breve periodo
(in genere alcuni mesi).
La conservazione in contenitori sigillati è stata
ideata dal francese Appert (da cui il nome di appertizzazione con cui è nota) agli inizi del XIX secolo, poi
perfezionata successivamente con l’uso dell’autoclave, che permette trattamenti a temperature superiori
a 100 °C. Questa tecnica viene impiegata per la conservazione di alimenti vegetali e animali (carne bovina, suina, prodotti della pesca), di sughi e minestre e
altri prodotti simili. Le procedure prevedono una prima preparazione del prodotto (cernita, lavaggio, taglio
ecc.), un pretrattamento termico (precottura o scottatura), il confezionamento (sigillando i contenitori
con l’alimento caldo e poi lasciando raffreddare per
eliminare l’aria), infine il trattamento termico vero e
proprio che si differenzia per gli alimenti con pH < 4,5
e quelli con pH > 4,5.
L’obiettivo principale è infatti scongiurare la possibile presenza di Clostridium botulinum (figura 9.3) e
eliminano i microrganismi termofili e nemmeno le spore, il prodotto pastorizzato va conservato in ambiente
refrigerato per un periodo di tempo limitato a qualche
giorno, onde limitarne o quanto meno rallentarne lo sviluppo. La pastorizzazione è di solito seguita da un rapido
raffreddamento; i prodotti pastorizzati possono essere
definiti semiconserve.
Nel caso del latte sono impiegati attualmente anche
trattamenti termici ripetuti o più energici (latte pastorizzato a temperatura elevata: 80-135 °C) o di microfiltrazione (capitolo 12).
il pH rappresenta un fattore di grande importanza: valori di pH inferiori a 4,5 impediscono la germinazione
delle spore del Clostridium botulinum. Nelle conserve
definite acide (pH < 4,5) quindi sopravvivono solo
germi acidofili, uccisi a temperature comprese fra 60
e 100 °C. Questa caratteristica è sfruttata nella preparazione delle conserve casalinghe di frutta o di verdura
(naturalmente acide o acidificate con aceto o altri acidificanti) per le quali è possibile utilizzare l’immersione in acqua bollente (100 °C) per tempi sufficientemente lunghi.
Le conserve con un minor grado di acidità (pH superiore o uguale a 4,5) devono invece subire una vera
e propria sterilizzazione fra 100 e 121 °C per un tempo
variabile. Dopo il raffreddamento e l’eventuale periodo
di maturazione (nel caso del pesce l’olio e il sale devono penetrare uniformemente nei tessuti) le confezioni
in scatola si possono conservare anche per alcuni anni.
Figura 9.3 Clostridium botulinum (fonte: CDC/Dr. Holdeman).
134
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LA CONSERVAZIONE DEGLI ALIMENTI
9
Sterilizzazione
Refrigerazione
Per definizione, la sterilizzazione elimina da un substrato ogni forma microbica, incluse le spore batteriche, notoriamente le forme più resistenti. Una sterilizzazione efficace si realizza con un trattamento a 121 °C
per 20 min, ma nel settore alimentare si può attribuire
a questo termine un significato più “elastico”. Si può
parlare infatti di sterilizzazione commerciale, intesa
come trattamento termico impiegato per distruggere i
microrganismi che si possono riprodurre nell’alimento
durante lo stoccaggio e la distribuzione. Si può accettare quindi la presenza di spore nell’alimento in scatola,
ma a condizione che queste non siano in grado di germinare.
Una sterilizzazione completa comporterebbe, per le
alte temperature impiegate e i lunghi tempi di esposizione, gravi alterazioni delle caratteristiche organolettiche
e dei principi nutritivi degli alimenti.
Si possono effettuare dunque trattamenti che impiegano temperature fra i 115 e i 150 °C circa, per periodi
di tempo diversi ma dell’ordine dei secondi, in base alle
caratteristiche dell’alimento da trattare e degli obiettivi
che si intendono perseguire. Nel caso del latte a lunga
conservazione, per esempio, il trattamento UHT (uperizzazione) prevede temperature di 140/150 °C mantenute per 1 o 2 s.
Con questa tecnica l’alimento viene raffreddato e mantenuto a temperature fra 0 e +6 °C, anche sottovuoto o
in atmosfera controllata (vedi oltre). Si tratta di una tecnica ad amplissima diffusione, utilizzata per le materie
prime, per i semilavorati e per la distribuzione e conservazione di una grande varietà di prodotti alimentari nella ristorazione collettiva e domestica. La refrigerazione
non può impedire lo sviluppo di tutti i microrganismi:
ne consegue che la conservabilità di un prodotto refrigerato è limitata nel tempo e l’entità della contaminazione microbica delle materie prime impiegate assume
rilevanza fondamentale. Trattandosi di ambiente refrigerato, particolare rilievo assume la presenza di germi
psicrofili in grado di resistere e proliferare alle basse
temperature: ciò risulta particolarmente evidente nella conservazione dei prodotti ittici, che mostrano una
conservabilità più ridotta rispetto alle carni, in quanto
contaminati da germi acquatici, naturalmente tendenti
alla psicrofilia. In ogni caso si può affermare che più bassa è la temperatura di refrigerazione (prossima quindi a
0 °C) tanto più lunga sarà la conservabilità dell’alimento. In un simile contesto è importante sottolineare che
estremamente dannosi risultano gli sbalzi di temperatura: una volta che i microrganismi hanno ripreso a riprodursi per un improvviso aumento della temperatura, il
processo in genere non si arresta quando la temperatura viene riportata ai livelli di partenza. Fra i fattori che
possono condizionare la conservabilità di un prodotto
refrigerato vengono inclusi soprattutto:
r il tipo di microrganismi contaminanti
r la velocità di penetrazione del freddo (quanto più
elevata, tanto più lunga risulta la conservabilità)
r l’umidità presente nel prodotto, in particolare quella
superficiale.
Basse temperature
Le basse temperature hanno un effetto batteriostatico,
agiscono cioè bloccando la riproduzione dei microrganismi, in quanto non permettono il regolare svolgimento delle reazioni enzimatiche cellulari. In molti casi,
quando la temperatura scende a livelli estremamente
bassi, sopravviene la morte delle cellule microbiche
(effetto battericida), anche se l’effetto prevalente del
freddo rimane comunque quello di un rallentamento
dello sviluppo.
L’impiego del freddo ha avuto un notevole sviluppo
in seguito alla diffusa commercializzazione dei prodotti
alimentari trasformati industrialmente, che necessitano
di una ininterrotta catena del freddo per tutto il periodo
della loro conservazione fino al momento del consumo.
A seconda dell’esigenza di una conservazione protratta
per periodi di tempo più o meno lunghi vengono impiegate temperature di trattamento diverse.
Si tenga presente che diversi germi sono in grado di sopravvivere all’interno delle celle frigorifere: è quindi opportuno che gli alimenti non vengano a contatto con le
superfici interne delle celle o con altri prodotti che vi stazionano già da molto tempo.
La refrigerazione può essere accompagnata dal confezionamento del prodotto in atmosfera protettiva,
sostituendo la normale atmosfera con una miscela di
gas a diversa composizione. Si può realizzare con due
tecniche diverse:
r atmosfera controllata, all’interno di celle frigorife135
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9
LA CONSERVAZIONE DEGLI ALIMENTI
re stagne per la conservazione di frutta (per es. pere e
mele) e fiori. In questo caso la composizione risulta
essere mediamente la seguente:
azoto 92/95% − anidride carbonica 2/4% −
ossigeno 3/4%
e viene costantemente tenuta sotto controllo per tutto
il periodo di conservazione
r atmosfera modificata, all’interno di confezioni
sigillate e pronte alla vendita, con miscele di gas in
proporzioni variabili:
Figura 9.4 Conservazione dei cibi sottovuoto.
anidride carbonica/ossigeno
CO2/azoto
CO2/N/O
La CO2 è un discreto antimicrobico, in particolare se
associata all’impiego di basse temperature; l’azoto rallenta l’irrancidimento dei grassi e possiede allo stesso
tempo una certa azione antisettica; la percentuale di
ossigeno presente impedisce lo sviluppo di germi anaerobi e mantiene più a lungo il colore rosso delle carni.
La composizione dell’atmosfera modificata non viene
ulteriormente controllata durante la conservazione, e
può subire variazioni conseguenti all’assorbimento o
all’emissione di gas per la non perfetta tenuta del contenitore, in genere un film plastico, e la “respirazione” del
prodotto. In questi casi si realizza piuttosto un’atmosfera modificata in equilibrio, soprattutto nelle confezioni di frutta e vegetali in genere.
Le tecniche di conservazione in atmosfera protettiva hanno consentito di superare i limiti tecnologici del
confezionamento sottovuoto, che come noto consiste
nell’introdurre il prodotto in sacchetti di plastica per
poi togliere l’aria presente al suo interno (figura 9.4).
Questa tecnica, che viene convenientemente impiegata
per diversi prodotti (caffè, riso ecc.) e che ha il vantaggio innegabile di impedire lo sviluppo dei germi aerobi
più frequentemente responsabili delle alterazioni degli
alimenti (Pseudomonas, Bacillus, muffe ecc.), non può
essere estesa indiscriminatamente a tutti i prodotti, in
particolare a quelli freschi o precucinati, per ragioni legate alla tipologia del prodotto e alla sua presentazione
commerciale.
Congelamento
Il congelamento fa penetrare il freddo all’interno dell’alimento fino a portarlo a temperature intorno ai −40 °C.
La penetrazione del freddo non deve obbligatoriamente
avvenire in modo veloce (ciò che differenzia il congelamento dalla surgelazione). La lentezza del processo
penalizza le caratteristiche organolettiche dell’alimento
così trattato, in quanto porta alla formazione di cristalli
di ghiaccio di dimensioni tali da danneggiare l’integrità
di cellule e tessuti. La conservazione dei prodotti congelati si prolunga fino a diversi mesi, ma si deve sottolineare che molti enzimi, tossine e spore non vengono
completamente eliminati.
Surgelazione
Prevede che il freddo venga fatto penetrare molto velocemente nell’alimento, che deve essere preventivamente
confezionato in contenitore sigillato. Devono essere raggiunti i −18 °C in profondità entro un tempo massimo
di 4 h, con una velocità di penetrazione del freddo pari a
2 cm/h. La temperatura di −18 °C deve essere mantenuta ininterrottamente fino al momento della vendita del
prodotto e per tutto il periodo di conservazione fino al
consumo. La surgelazione è qualitativamente superiore
al congelamento, in quanto cellule e tessuti non subiscono danni rilevanti: ciò è dovuto soprattutto alla formazione di cristalli di ghiaccio di piccole dimensioni e alla
contemporanea congelazione di tutti i liquidi presenti,
sia quelli endocellulari che quelli interstiziali. Le caratteristiche organolettiche originali del prodotto vengono
in tal modo preservate in maniera pressoché ottimale.
136
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LA CONSERVAZIONE DEGLI ALIMENTI
LO SCONGELAMENTO DEGLI ALIMENTI
Congelati e surgelati si conservano in freezer a −18 °C
fino alla data di scadenza. La qualità di un surgelato dipende, oltre che dalle condizioni igieniche di partenza,
dal mantenimento ininterrotto della catena del freddo.
Sono da scartare surgelati ricoperti di brina o in blocchi compatti, che potrebbero indicare un precedente
parziale scongelamento. Ortaggi come piselli o fagiolini devono infatti apparire ben separati gli uni dagli altri
all’interno delle confezioni. Etichette particolari che
cambiano colore in caso di scongelamento accidentale
in magazzino o sul banco vendita segnalano la trasformazione di ghiaccio in acqua.
Lo scongelamento dei cibi surgelati o congelati è
un’operazione da effettuarsi con accortezza, per dare
modo all’acqua di ritornare in soluzione e nei sistemi colloidali ed evitare la perdita di liquidi interstiziali (tabella
9.4). A livello domestico si può lasciare l’alimento a temperatura ambiente o in frigorifero oppure utilizzare le microonde. È da evitare l’impiego di acqua calda o fredda.
Le microonde sono onde elettromagnetiche con
frequenza da 300 MHz a 300 GHz. Nell’industria e nei
forni domestici si impiegano due frequenze: 915 MHz
(λ = 33 cm) e 2450 MHz (λ = 12 cm). Le microonde
causano una violenta agitazione delle molecole polari
(in primo luogo l’acqua) con aumento dell’energia cinetica e produzione di calore. Poiché la radiazione penetra nel substrato, viene immediatamente convertita
in calore: i tempi di trattamento sono molto più brevi
rispetto ai sistemi tradizionali. L’industria conserviera
utilizza le microonde per diversi scopi: per scongelare
surgelati e congelati (il processo avviene in modo più
uniforme e pratico), per l’essiccamento e la liofilizzazione, per trattamenti di pastorizzazione e sterilizzazione, per la cottura degli alimenti.
Pesce, carne, prodotti da forno, frutta, verdura da
consumare cruda, piatti precucinati devono essere
scongelati completamente. Gli ortaggi e la frutta da
cuocere possono essere scongelati a metà. Alcuni ortaggi, carni o pesce impanati e pronti per la frittura possono essere cucinati senza scongelarli.
Una volta scongelato, il prodotto va subito utilizzato e non deve essere ulteriormente congelato, pena il
consistente decadimento delle proprietà organolettiche per formazione di macrocristalli.
Tabella 9.4 Scheda comparativa tra alimenti congelati e surgelati
ALIMENTI CONGELATI
ALIMENTI SURGELATI
t$POHFMBNFOUPVMUSBSBQJEPPSBQJEP
t$POHFMBNFOPVMUSBSBQJEP
t5FNQFSBUVSBBMiDVPSFwEFMMBMJNFOUPWBSJBCJMF JOHFOFSF t5FNQFSBUVSBBMiDVPSFwEFMMBMJNFOUPOPOTVQFSJPSFB
OPOJOGFSJPSFBo¡$$POTFSWB[JPOFFUSBTQPSUP
o¡$EBMNPNFOUPEFMMBQSPEV[JPOFýOPBMMBWFOEJUB
BUFNQFSBUVSBõo¡$ õo¡$QFSJMQFTDF
QFSJMDPOTVNP
t/POÒPCCMJHBUPSJBMBDPOGF[JPOFPSJHJOBMF*MQSPEPUUP
QVÛFTTFSFBODIFWFOEVUPBUBHMJP
t0CCMJHPEFMMBDPOGF[JPOFPSJHJOBMFBQSJCJMFTPMPEBM
DPOTVNBUPSF QFSJQSPEPUUJEFTUJOBUJBMDPOTVNPEJSFUUP
t1SPEPUUJEFTUJOBUJBMDPOTVNPEJSFUUPFTPQSBUUVUUPBMMF
JOEVTUSJFEJUSBTGPSNB[JPOF
t1SPEPUUJEFTUJOBUJBMDPOTVNPEJSFUUPFOPO
Irradiazione
Si tratta di una tecnica che prevede l’impiego di radiazioni
(onde elettromagnetiche che trasportano energia), il cui
assorbimento da parte della materia vivente comporta
nelle molecole l’espulsione di elettroni o la loro eccitazione facendo compiere agli elettroni salti di livello energetico. Si distinguono radiazioni ionizzanti, come i raggi
γ generati da isotopi radioattivi (cobalto 60) e i raggi X
(fasci di elettroni ad alta energia), e radiazioni non ionizzanti come i raggi ultravioletti (UV).
Le radiazioni ionizzanti hanno un elevato contenuto
energetico e provocano la ionizzazione di atomi e molecole, in particolare di quelle dell’acqua da cui si formano radicali liberi Hr e OHr con forte azione ossidante.
Agiscono direttamente sulle molecole biologiche “ber137
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9
LA CONSERVAZIONE DEGLI ALIMENTI
saglio” oppure indirettamente attraverso i radicali liberi
che si formano dalle molecole dell’acqua e che interagiscono con le molecole bersaglio. Queste sono rappresentate dalle macromolecole biologiche e in particolare
dal DNA.
Le radiazioni ultraviolette (a lunghezza d’onda maggiore cui corrisponde un minore contenuto energetico)
causano alterazioni nel DNA con la formazione di dimeri timina-timina o timina-citosina.
Nell’industria alimentare l’impiego delle radiazioni
per la conservazione degli alimenti desta molto interesse poiché provoca la morte dei microrganismi contaminanti senza alterare le caratteristiche organolettiche.
Non tutti gli alimenti possono essere trattati con le radiazioni ionizzanti; il loro impiego è limitato, almeno
nel nostro Paese, al trattamento di patate e aglio come
antigermogliante, erbe aromatiche essiccate, spezie,
condimenti vegetali, mentre in altri Paesi vengono utilizzate in modo meno restrittivo. La materia è disciplinata a livello internazionale dal Codex Alimentarius
della FAO/WHO (Food and Agricoltural Organization,
World Health Organization), mentre a livello nazionale
si fa riferimento al D. Lgs. 94/2001.
Le perplessità relative all’impiego delle radiazioni ionizzanti in campo alimentare riguardano naturalmente
la possibile radioattività indotta negli alimenti, pur non
essendo emerse fino ad ora risultanze relative a effetti
negativi sulla salute. Le organizzazioni sopra ricordate
indicano in ogni caso le dosi massime di energia da non
superare nei trattamenti.
Disidratazione/essiccamento
Sottrarre l’acqua disponibile (aw) ai microrganismi
contaminanti rappresenta un ottimo mezzo per la conservazione dei cibi. Molti alimenti di origine vegetale o
animale esposti per un periodo più o meno lungo all’aria
secca e al sole perdono gran parte del loro contenuto di
acqua e possono venire conservati a lungo. È il caso per
esempio di funghi e pomodori fra i vegetali e dello stoccafisso fra il pesce. Lo stoccafisso (figura 9.5) è il merluzzo essiccato all’aria fredda e con scarsissima umidità
delle coste norvegesi (isole Lofoten e Westeralen). A
livello industriale il processo viene effettuato negli essiccatoi ad aria calda, con la polverizzazione in camera di
essiccamento o con l’essiccamento sottovuoto.
Liofilizzazione
Questo procedimento consiste nel trattare l’alimento,
preventivamente congelato, in una camera di sublima-
Affumicatura
La lenta combustione di alcuni tipi di legname libera un
fumo contenente aldeidi, eteri e acidi a cui vengono esposti cibi come carni e pesce. Tali sostanze hanno un effetto
conservante, ma anche aromatizzante e conferiscono al
cibo sapore e odore particolari e lo rendono in alcuni casi
anche particolarmente pregiato. Il trattamento di affumicatura può essere condotto a caldo fra i 60 e i 100 °C (in
prossimità della fonte di calore e con una blanda cottura
dell’alimento) oppure a freddo a una temperatura di circa 25 °C e con un’esposizione più prolungata al fumo. Il
trattamento non risulta molto efficace per alcuni batteri,
fra cui Listeria e alcuni batteri lattici, ma agisce su enterobatteri e alcune specie del genere Bacillus.
Figura 9.5 Essiccazione dello stoccafisso. Il merluzzo
OFMMFDPTUFOPSWFHFTJWJFOJFTTJDDBUPBMMBSJBGSFEEBFDPO
scarsissima umidità (fonte: www.wikipedia.com).
138
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LA CONSERVAZIONE DEGLI ALIMENTI
zione, per cui l’acqua presente passa direttamente dallo
stato solido a quello di vapore (freeze drying). Gli alimenti liofilizzati mantengono le proprietà nutritive inalterate rispetto a quelli freschi e si conservano per anni,
riacquistando le loro tipiche caratteristiche organolettiche con la semplice aggiunta di acqua (per es. caffè o
preparati per zuppe o minestre).
9.3 Conservazione con mezzi
chimici
I trattamenti che impiegano mezzi chimici comprendono salagione, zuccheraggio, conservazione con aceto o
con olio, con alcol, mediante fermentazione, con l’impiego di additivi e conservanti.
Salagione, zuccheraggio
Una delle tecniche più antiche per la conservazione dei
cibi è la salagione, che porta alla creazione di un ambiente osmoticamente sfavorevole alla sopravvivenza dei
germi provocando la fuoriuscita di acqua dalle loro cellule. I microrganismi alofili sono comunque in grado di
sopportare concentrazioni saline piuttosto elevate e possono quindi sopravvivere facilmente rappresentando un
pericolo. La salagione può essere effettuata in due modi:
r a secco, come nel caso dei prosciutti che vengono
accuratamente cosparsi di sale in superficie per sfregamento; oppure alternando strati di sale e di carne
o pesce come nel caso del baccalà (merluzzo salato)
o di altri tipi di pesce
r a umido per mezzo di salamoie con concentrazioni di NaCl dal 10 al 30% circa. Il trattamento viene
effettuato con l’immersione diretta dell’alimento
nella soluzione salina oppure con l’iniezione della
salamoia nella massa dell’alimento. La composizione della salamoia può subire variazioni nel tempo
per lo sviluppo di sostanze secondarie (ammoniaca
e acidi diversi), per cui deve essere periodicamente
rinnovata.
L’aggiunta di zucchero in concentrazioni del 60% circa
permette di conservare alimenti diversi (per es. marmellate e gelatine di frutta) sulla base dello stesso principio
della salagione.
9
Conservazione con aceto o con olio
L’olio impedisce il contatto dei cibi con l’ossigeno,
quindi questa modalità di conservazione non si basa su
alcun effetto battericida. I germi anaerobi (soprattutto il
pericoloso Clostridium botulinum) riescono perciò agevolmente a sopravvivere, le loro spore a germinare (se si
tratta di germi sporigeni e se il pH non è troppo acido:
per il botulino deve essere uguale o superiore a 4,5) e
a produrre tossine. L’impiego dell’olio è quindi sicuro
solo se abbinato ad altri procedimenti: pastorizzazione,
sterilizzazione, acidificazione con aceto, salagione. Molti vegetali conservati sott’olio devono preventivamente
essere cotti in aceto; il tonno viene cotto e inscatolato
con olio d’oliva, quindi le scatolette vengono sigillate,
lavate e sterilizzate a 121 °C.
Le conserve sott’aceto vengono impiegate per
alcuni ortaggi e per certi tipi di pesce. L’ambiente acido impedisce od ostacola fortemente la proliferazione
della maggior parte dei microrganismi potenzialmente
contaminanti, ma è comunque opportuno sbollentare
preventivamente l’alimento per poi conservarlo in un
contenitore non a contatto con l’aria.
Conservazione con alcol
L’alcol etilico al 70% è un buon conservante, anche se
inefficace nei confronti delle spore batteriche. Viene
impiegato per la conservazione di ciliegie e uva; agisce
solubilizzando i lipidi di membrana e, per la sua azione
disidratante e denaturante, sulle proteine.
Conservazione mediante fermentazione
La creazione di un ambiente acido (inospitale per gran
parte dei microrganismi) conseguente all’attività fermentativa di particolari microrganismi è una tecnica
antica ed efficace. La trasformazione del latte in prodotti
acidi (yogurt e latti fermentati) ad opera di batteri lattici
e la conservazione di cavoli, cetrioli e olive sono esempi molto comuni. Anche gli insaccati (salami) vengono
preparati e conservati aggiungendo fermenti lattici; i
foraggi vengono conservati per mezzo dell’insilamento con la creazione di ambiente acido che impedisce la
putrefazione del fieno. Un presupposto imprescindibile
139
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LA CONSERVAZIONE DEGLI ALIMENTI
per questo tipo di conservazione è rappresentato dalla
comune esigenza di sottoporre gli alimenti (la materia
prima) a un pretrattamento: così per la preparazione di
salami e altri insaccati le carni devono essere macinate,
mentre i foraggi vanno trinciati prima di immagazzinarli in un silos. L’azione acidificante può essere provocata
da microrganismi presenti naturalmente nell’alimento
o dall’inoculazione di ceppi selezionati, come avviene
comunemente nelle preparazioni industriali (insaccati,
yogurt, formaggi). Questi argomenti sono trattati nei
capitoli 6 e 12.
9.4 Impiego di additivi e
conservanti
Vengono definiti additivi alimentari quelle sostanze
non utilizzate come ingredienti e aggiunte intenzionalmente agli alimenti per un fine tecnologico nelle diverse fasi della filiera produttiva. Si tratta, in altre parole, di
sostanze che hanno lo scopo di prolungare la conservabilità di un alimento, preservarne la qualità, migliorarne
l’aspetto e la consistenza: renderlo cioè più accettabile
e ricercato dal consumatore. In alcuni alimenti non è
consentito l’impiego di additivi: olio vergine d’oliva,
latte fresco pastorizzato, yogurt naturale, zucchero,
miele, paste secche alimentari. Per ogni additivo impiegato deve essere valutata la tossicità acuta, quella a
breve (15-30 giorni) e a medio termine (30-90 giorni),
nonché la tossicità cronica. È necessario stabilire inoltre la “dose giornaliera ammessa” (DGA). Gli additivi
impiegati devono risultare in etichetta, con la denominazione della categoria di appartenenza, del nome o del
numero CE.
Conservanti ad azione antimicrobica
Acido benzoico (E 210) e i suoi sali di Na (E 211), di
K (E 212) e di Ca (E 213). Insieme all’acido sorbico e
al PHB si trova in marmellate, gelatine, gomme da masticare, salse e minestre, maionese, merendine di cereali,
bibite analcoliche. Ha massima efficacia in ambiente acido, mentre risulta inattivo a pH neutro o basico. Viene
eliminato con le urine come acido ippurico legato alla
glicina.
Esteri dell’acido p-idrossibenzoico (PHB, E214E219). Sono addizionati alle gelatine nei prodotti a base
di carne, agli snack a base di cereali e patate, agli integratori alimentari liquidi. Il loro uso è fortemente limitato
dalle alterazioni che possono provocare nel sapore degli
alimenti.
Acido sorbico (E200) (figura 9.6) e suoi sali di K (E202)
e Ca (E203). È aggiunto ai prodotti da forno, nel pane in
cassetta, nella margarina, nei grassi, nei formaggi, nella
maionese, nelle olive. È efficace fino a pH 6, non è adatto
per la conservazione degli alimenti basici. Viene metabolizzato come un acido grasso naturale, quindi risulta
innocuo se impiegato entro i limiti di legge. Poiché non
altera i sapori, i colori naturali e le vitamine degli alimenti, è uno dei conservanti più impiegati.
Anidride solforosa (E220) e suoi derivati: solfito di sodio (E221), bisolfito di Na (E222) e altri (E223-E228).
È attiva contro muffe e batteri; impiegata in enologia
come agente selettivo tollerato da saccaromiceti a concentrazioni proibitive per gli altri microrganismi. La
SO2 viene aggiunta oltre che nei mosti anche all’aceto,
ai succhi di frutta, alla birra e alle bevande analcoliche, a
marmellate e gelatine di frutta. Può provocare allergie e
deve essere dichiarata in etichetta insieme agli altri solfiti se la sua concentrazione è superiore a 10 mg/L.
Difenile (E230), fenilfenolo (E231) e fenilfenato di Na
(E232): sono utilizzati per il trattamento della buccia
degli agrumi.
Nisina (E234). È un antibiotico prodotto naturalmente da Streptococcus lactis e S. cremoris e si trova nei prodotti caseari. Può essere impiegato nei formaggi, nelle
conserve vegetali e nelle creme di pasticceria. È il solo
antibiotico che può essere immesso nella massa dell’alimento.
H3C
OH
O
Figura 9.6 Acido sorbico.
140
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9
LA CONSERVAZIONE DEGLI ALIMENTI
Conservanti secondari
R1
O
Sono additivi usati in origine per scopi diversi ma che
hanno comunque un effetto antimicrobico.
N
N
R2
Anidride carbonica (E290). Usata come acidulante
e per gasare acqua, vino e bevande analcoliche, ha una
blanda azione antisettica e conservante.
Acido lattico (E270) e suoi sali di Na (E325), di K
(E326) e di Ca (E327). È presente naturalmente nello
yogurt e nel vino e viene addizionato come acidulante
agli impasti per la panificazione, alle conserve vegetali,
al caglio.
Acido propionico (figura 9.7) (E280) e suoi sali di
Na (E281), di K (E283) e di Ca (E282). Addizionato
ai prodotti da forno e nella pasticceria, negli estratti di
malto e per il trattamento superficiale nei formaggi. Ha
azione fungistatica.
Acido acetico (E260) e suoi sali di K (E261), di Na
(E262) e di Ca (E263). Ha un’azione acidulante e antibatterica nella panificazione: i lieviti sono microrganismi acidofili e quindi non vengono inibiti.
Nitrato di Na (E251) e di K (E252) e nitrito di Na
(E250) e di K (E249). Sono contenuti naturalmente in
alimenti animali e vegetali (tabella 9.5). Vengono addizionati a insaccati, prosciutti, würstel, mortadella, carni
in scatola, nei prodotti caseari e nel pesce marinato, con
limiti stabiliti dalla legge. Sono impiegati nelle carni per
mantenere il colore rosso, dovuto a formazione di nitroso mioglobina e nitroso emoglobina, per migliorarne
l’aroma, come antibatterico nei confronti di Clostridium
botulinum e degli enterobatteri e per favorire invece lo
sviluppo di lattobacilli e micrococchi responsabili della
maturazione degli insaccati crudi.
I nitriti (e l’acido nitroso che da questi deriva) reagiscono nello stomaco con le ammine che derivano dal
O
O
CH3
CH2
C
OH
OH
Figura 9.8 Nitrosammine.
catabolismo dei composti azotati, formando le nitrosammine (figura 9.8), sostanze cancerogene. Fonti di nitrosammine sono anche la birra, il whisky, i formaggi, la
carne e i pesci conservati, nonché sistemi di cottura come
la frittura e la grigliatura. L’acido ascorbico (vitamina C),
i tannini e i flavonoidi presenti nella frutta fresca, nel tè,
nel vino, contrastano la formazione delle nitrosammine.
I vegetali ricchi di nitrati come gli spinaci non vengono dati ai neonati prima dell’ottavo mese di vita perché
il loro pH gastrico più alto dell’adulto favorisce l’attecchimento di batteri anche nello stomaco, con aumento
del tasso di riduzione dei nitrati a nitriti. Ciò favorisce
la formazione nel sangue di metaemoglobina, prodotto
di ossidazione irreversibile dell’emoglobina. Le conseguenze possono essere mortali.
Tabella 9.5 Contenuto in nitrati e nitriti dei principali
alimenti freschi
NO3– mg/kg
NO2– mg/kg
Spinaci
1860
2,7
Bietola
2760
6
Rape
1369
=
Sedano
2340
0,5
Lattuga
850
0,4
Cavoli
635
0,5
Zucchine
413
0,7
ALIMENTI
Melanzane
302
0,5
Fagioli
253
0,9
Carote
119
0,8
Finocchi
66
4
Farina
45
2
Patate
119
0,4
Carne bovina
1,1
=
Pesce fresco
3,7
2,7
Latte bovino
0,7
=
Parmigiano
0,2
=
Figura 9.7 Acido propionico.
141
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9
LA CONSERVAZIONE DEGLI ALIMENTI
Antiossidanti
Hanno la funzione di proteggere gli alimenti dall’ossidazione, che si manifesta essenzialmente con l’irrancidimento dei grassi e cambiamenti di colore. Agiscono
ossidandosi al posto degli alimenti.
Acido l-ascorbico (E300), i suoi sali di Na (E301), di
Ca (E302) e l’estere palmitico (E304). La vitamina C
viene addizionata a molti prodotti: birra, gelatine, confetture, marmellate, insaccati, succhi di frutta, prodotti
dolciari, vino, liquori e molti altri. Negli insaccati previene la formazione di nitrosammine.
Tocoferoli (E306-E309). Si trovano soprattutto nei
grassi vegetali, sono molto sensibili ai raggi UV e si ottengono dagli oli vegetali ma anche per sintesi chimica. Vengono addizionati ai grassi, agli oli tranne che a
quello d’oliva, agli insaccati freschi insieme con l’acido
l-ascorbico.
Acido citrico (E330) e i suoi sali di Na (E331), di K
(E332) e di Ca (E333). Utilizzato in caramelle, confetti,
frutta, ortaggi, carne macinata preconfezionata.
Acido tartarico (E334) e i suoi sali di Na (E335), di K
(E335) e di Na/K (E337). Impiegato anche come acidulante e correttore del pH in enologia, nelle bevande
gassate, nelle conserve vegetali, nelle caramelle e nei
confetti. Nella panificazione e nei prodotti dolciari è impiegato come polvere lievitante.
Acido ortofosforico (E338) e i suoi sali di Na (E339),
di K (E340) e di Ca (E341); polifosfati di Na e K
(E450). Utilizzati sia come antiossidanti che acidulanti
nelle bevande analcoliche, come addensanti e sali di fusione. Un eccesso di queste sostanze influisce sul contenuto di fosforo nelle ossa, legato a quello del calcio, con
rischio di osteoporosi.
Addensanti
Gli addensanti o stabilizzanti hanno la funzione di conferire all’alimento una maggior consistenza e omogeneità. Comprendono molti polisaccaridi, fra cui la pectina
(E440), l’alginato di Na (E401) e di K (E402), l’agar-
agar (E406), la gomma arabica (E414) e la gomma
adragante (E413), la gelatina, le carragenine (E407), le
farine di semi di carrube e di guar.
La pectina (estere dell’acido galatturonico) è l’unico
addensante consentito nella preparazione di marmellate, confetture e gelatine di frutta. Si estrae dalla frutta,
soprattutto dalle mele. Bollita in acqua forma un gel soprattutto in ambiente acido, per cui nella preparazione
di marmellate casalinghe è opportuno aggiungere agli
estratti pectinici o a una certa quantità di mele un po’ di
succo di limone.
L’agar-agar si scioglie a caldo sopra gli 80 °C e solidifica al di sotto dei 45 °C: viene usato nei budini, nei
dolciumi, nelle glasse per torte. È la sostanza gelificante
più impiegata nei terreni di coltura per microbiologia.
La gelatina deriva dall’idrolisi del collagene animale, si ottiene dalla bollitura della pelle e delle ossa degli
animali macellati, dopo evaporazione ed essiccamento;
si scioglie in acqua calda e solidifica al di sotto dei 30 °C.
Emulsionanti
Gli emulsionanti sono sostanze che servono a rendere
stabile un’emulsione, cioè a miscelare tra di loro due
componenti non miscibili (per es. olio e acqua). Per assolvere a questa funzione le sostanze emulsionanti sono
anfotere: hanno un’estremità polare idrosolubile e un’altra apolare liposolubile. Sono quindi dei tensioattivi: in
pratica agiscono come i saponi. Vengono impiegati nella
maionese, nella margarina, nella cioccolata, nelle creme
e nei gelati: a questi prodotti conferiscono caratteri particolarmente graditi come la “palatabilità” o la cremosità. Gli emulsionanti più usati sono le lecitine (E322) e i
mono- e digliceridi degli acidi grassi (E471).
Esaltatori di sapidità
Il glutammato monosodico (E621) (figura 9.9) viene
usato per esaltare il sapore di molti alimenti ed è estratto dalle barbabietole o prodotto per sintesi chimica. È
il responsabile del quinto sapore fondamentale (oltre
all’amaro, al dolce, all’acido, al salato) definito come
“umami”. Il suo potere viene ulteriormente esaltato dai
composti chimici presenti negli estratti di carne, per cui
gli esaltatori di sapore sono prevalentemente una misce-
142
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LA CONSERVAZIONE DEGLI ALIMENTI
O
O
O-Na+
HO
NH2
9
coloranti sintetici, più stabili ed economici, destano
molte perplessità sulla loro innocuità. Quelli più discussi sono gli azoici, caratterizzati dalla presenza del
gruppo –N=N−.
Figura 9.9 Glutammato monosodico.
Edulcoloranti
la di questi due componenti. È l’ingrediente principale
dei dadi da brodo. Un suo consumo eccessivo può provocare disturbi temporanei al fegato (sindrome da ristorante cinese) in individui particolarmente predisposti. Il
glutammato è presente naturalmente in diversi alimenti
e abbondante in alcune alghe impiegate nella cucina cinese e giapponese.
Impiegati in sostituzione dello zucchero (saccarosio),
comprendono sostanze naturali o natural-derivate (sorbitolo, xilitolo, mannitolo) e sintetiche (saccarina, ciclammati, aspartame).
Coadiuvanti tecnologici
Coloranti
Vengono distinti in naturali (estratti da prodotti vegetali o prodotti in laboratorio con formula uguale a
quelli naturali) e sintetici (prodotti in laboratorio). I
Impiegati per “rispettare determinati obiettivi tecnologici” (D.M. 209/96) nella preparazione o trasformazione degli alimenti, possono lasciare residui nel prodotto
finito. Si tratta di enzimi, solventi, chiarificanti, decoloranti, demetallizzanti, agenti di distacco ecc.
143
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ESERCIZI DI VERIFICA
1. La pastorizzazione del latte prevede il riscaldamento a:
A 120 °C per 1 min
B 72 °C per pochi s
C 48 °C per 30 min
2. Il trattamento UHT prevede il riscaldamento
a:
A 220 °C per 2 s
B 180 °C per 1 s
C 140 °C per 2-5 s
3. Il latte UHT:
A si conserva a temperatura ambiente per 8
mesi
B si conserva a temperatura ambiente per 90
giorni
C non si conserva a temperatura ambiente
4. Il latte pastorizzato si conserva a temperatura ambiente:
A poche ore
B alcuni giorni
C per 3 mesi dalla data di confezionamento
5. Le spore del bacillo botulino germinano
solo:
A a pH inferiore a 4,5
B a pH superiore a 4,5
C quando il pH raggiunge valori uguali a quello delle cellule vegetative
6. Nella surgelazione la velocità di penetrazione del freddo deve risultare:
A inferiore a quella che si verifica nella congelazione
B superiore a quella che si verifica nella congelazione
C uguale a quella di refrigerazione
7. Nella liofilizzazione gli alimenti vengono
prima:
A congelati
B polverizzati finemente
C riscaldati
8. Rispondi alle seguenti domande:
Sai spiegare la differenza fra conserve e semiconserve?
Spiega la differenza fra atmosfera controllata e
atmosfera modificata.
Cosa sono i conservanti secondari? Puoi fare
alcuni esempi?
Per quale motivo i nitrati e i nitriti addizionati ai
cibi possono essere pericolosi?
Come agiscono gli antiossidanti impiegati nei
prodotti alimentari?
Cosa sono e come agiscono gli emulsionanti?
144
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10
NORMATIVE E CONTROLLI
PER LA SICUREZZA
E LA QUALITÀ ALIMENTARE
10.1 Sicurezza degli alimenti: normative
e certificazioni
10.2 Il “pacchetto igiene”
10.3 Il sistema HACCP nell’industria
alimentare
10.4 La shelf-life degli alimenti
10.5 Il challenge test
La sicurezza alimentare è oggetto di numerose norme
emanate dall’Unione Europea in materia di igiene degli alimenti al fine di tutelare i consumatori, il benessere degli animali e la salute delle piante. Un aspetto di
grande rilevanza è rappresentato inoltre dalle norme
che prescrivono un’adeguata etichettatura dei prodotti, per fornire una corretta informazione sulla natura, la
provenienza, le modalità di conservazione e la scadenza degli alimenti. L’approccio globale che ha ispirato
le iniziative legislative comunitarie in questo settore è
noto con la formula “dai campi alla tavola” per sottolineare il complesso di normative volte a garantire un
elevato standard di sicurezza in tutte le fasi della filiera
produttiva.
10.1 Sicurezza degli alimenti:
normative e certificazioni
Certificazione alimentare (Shutterstock Images LLC).
I riferimenti normativi cui le industrie produttrici di
tutti i settori merceologici sono tenute a uniformarsi per
garantire la sicurezza e la qualità dei loro prodotti sono
emanati da vari organismi a livello nazionale, comunitario e internazionale.
L’Organizzazione Internazionale per la Standardizzazione (International Organization for Standardization, ISO) ha da tempo emanato gli standard mondiali
di riferimento in tutti i settori produttivi.
La normativa ISO 9000, nelle sue varie parti, costituisce il punto di riferimento internazionale con cui
le aziende produttrici devono confrontarsi per potersi
fregiare della certificazione di conformità (rilasciata
145
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10
NORMATIVE E CONTROLLI PER LA SICUREZZA E LA QUALITÀ ALIMENTARE
da enti titolati a farlo) che attesta che un prodotto o un
servizio è conforme alle specifiche dettate.
La normativa ISO 22 000, ispirata ai criteri di ISO
9000 e che comprende i principi del sistema HACCP,
riguarda la sicurezza nel settore alimentare.
A livello comunitario l’ente preposto a emettere norme di standardizzazione è il CEN (Comitato Europeo
di Normazione), mentre in Italia opera l’Ente Unitario
Italiano di Unificazione, che emette le norme UNI. In
molti casi le certificazioni sono obbligatorie (in termine
tecnico si dicono “cogenti”), per esempio per i prodotti
che devono rispondere a caratteristiche specifiche stabilite da Direttive Europee, che di conseguenza possono
utilizzare il marchio CE.
Esclusivamente laboratori accreditati ed enti di
certificazione che rispondono alle norme europee EN
45 000 (in Italia UNI EN 45 000) sono autorizzati a
rilasciare attestati di omologazione e a certificare che
tale omologazione sia mantenuta nel tempo. I sistemi
di qualità delle aziende sono valutati e certificati da
specifici laboratori secondo le norme UNI EN 29 000.
In campo alimentare assume particolare importanza il
controllo e la certificazione del rispetto di precise norme
igieniche, allo scopo di garantire al consumatore la qualità
e la sicurezza del prodotto, intesa come assenza di rischi
per la salute. Tradizionalmente, anche se la normativa
viene periodicamente aggiornata secondo le acquisizioni
più recenti della microbiologia degli alimenti, il controllo
dell’igiene lungo tutta la filiera produttiva viene effettuato
con la ricerca e il conteggio di microrganismi indicatori
di inquinamento fecale: coliformi, Escherichia coli, enterococchi, clostridi solfito-riduttori. I controlli della sicurezza di un alimento si effettuano, secondo il Regolamento
CE 2073/2005, per escludere la presenza di batteri patogeni, fra cui soprattutto Salmonella e Listeria, di enterotossine (in particolare quelle stafilococciche) e di alcune
sostanze chimiche (come l’istamina nei prodotti ittici).
Il Regolamento CE 178/2002 si occupa di sicurezza alimentare nel significato più ampio del termine
e, a tutela della salute dei consumatori, intende responsabilizzare allevatori, agricoltori, produttori di mangimi,
operatori del settore alimentare (OSA). Istituisce inoltre l’EFSA (Autorità Europea per la Sicurezza Alimentare). Esso stabilisce:
“i principi e i requisiti generali della legislazione alimentare, dispone l’obbligo della rintracciabilità lungo tutte le
fasi di produzione, trasformazione e commercializzazione
degli alimenti e dei mangimi, istituisce l’Autorità Europea
per la Sicurezza Alimentare e fissa procedure nel campo della sicurezza alimentare.”
Uno degli aspetti più importanti dei vari regolamenti
che si sono succeduti nel tempo è rappresentato dalla
necessità che i controlli sulla sicurezza alimentare siano
affidati sia a enti certificatori esterni alle aziende che a un
responsabile interno, in modo da responsabilizzare maggiormente tutti gli operatori all’interno della filiera produttiva.
10.2 Il “pacchetto igiene”
Con l’emanazione del cosiddetto “pacchetto igiene”, in
vigore dal 2006, la Commissione Europea ha aggiornato e riorganizzato la precedente e complessa normativa in tema di sicurezza e qualità alimentare. Si tratta di
una raccolta di norme, inizialmente quattro (Regolamenti CE 852/2004 − CE 853/2004 − CE 854/2004
− CE 882/2004), poi portate a nove con il Regolamento 183/05, che stabilisce i requisiti per l’igiene dei
mangimi, e con i Regolamenti CE 2073, 2074, 2075 e
2076/2005 in materia di criteri microbiologici e organizzazione dei controlli.
Questi nove regolamenti emanati tra il 2004 e il
2005, insieme con il Regolamento 178 del 2002, fissano i principi comunitari in materia di igiene e sicurezza
degli alimenti e dei mangimi e disciplinano il regime dei
controlli.
Gli obiettivi fondamentali che si intendono perseguire con l’emanazione di queste direttive sono:
r garantire la salute del consumatore attraverso la
commercializzazione di alimenti sicuri e sani
r uniformare la legislazione dei Paesi membri in materia di sicurezza alimentare
r standardizzare le procedure di controllo in tutta la
Comunità Europea.
Il problema della sicurezza alimentare viene affrontato
a tutti i livelli della filiera produttiva (“approccio di filiera dal campo alla tavola”), a iniziare dalle materie prime
(prodotti agricoli e d’allevamento, della caccia e della
pesca) per proseguire con le varie fasi della trasformazione, della distribuzione e della vendita.
146
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NORMATIVE E CONTROLLI PER LA SICUREZZA E LA QUALITÀ ALIMENTARE
I Regolamenti 852 e 853 si rivolgono agli Operatori del Settore Alimentare (OSA), identificandoli come
unici responsabili della sicurezza e qualità dei prodotti;
i Regolamenti 854 e 882 riguardano le autorità cui competono i controlli lungo l’intera filiera.
Il Regolamento 852 stabilisce norme igieniche relative a tutti i prodotti alimentari che prevedono obbligatoriamente l’adozione del sistema HACCP. Si tratta
in pratica di esercitare un continuo autocontrollo per
prevenire o minimizzare i rischi inerenti la produzione,
mettere a punto interventi di neutralizzazione e verificare che tali interventi siano efficaci. Vengono fissate
norme riguardanti i locali, le attrezzature, il confezionamento, il trasporto, la gestione dei rifiuti.
Gli OSA sono inoltre tenuti a conoscere le materie
prime con cui è stato preparato l’alimento e a chi viene
fornito: si stabilisce così un principio di rintracciabilità
del prodotto (Regolamento CE 178/2002, figura 10.1),
in vigore dal gennaio 2005 e definito come:
“la possibilità di ricostruire e seguire il percorso di un
alimento o di una sostanza destinata o atta a entrare a far
parte di un alimento attraverso tutte le fasi della produzione, della trasformazione e della distribuzione.”
Nel Regolamento 853/2004 sono stabilite norme
igieniche riguardanti in modo specifico la produzione di
Figura 10.1 Etichettatura degli alimenti. L’immagine riporta
un esempio di etichettatura degli alimenti, procedimento utile
per la rintracciabilità di un prodotto.
10
alimenti di origine animale nelle aziende di grandi dimensioni che commercializzano i loro prodotti sull’intero territorio della Comunità Europea o nei Paesi extracomunitari.
I prodotti commercializzati devono essere dotati di
marchio o bollo di conformità sanitaria che ne certifica la provenienza CEE. Altre norme riguardano aspetti
igienici di alimenti quali carni, molluschi bivalvi vivi,
prodotti della pesca, latte e prodotti a base di latte, ovoprodotti, cosce di rana e lumache, grassi animali trasformati, gelatine, collagene.
Per quanto attiene ai controlli, i Regolamenti
854/2004 (prodotti di origine animale) e 882/2004
(tutti i prodotti alimentari) stabiliscono norme riguardanti:
r la corretta applicazione delle norme igieniche di lavorazione
r l’efficacia delle misure di autocontrollo
r l’applicazione di marchi e bolli, fondamentali anche
per il sistema di rintracciabilità
r la valutazione dei risultati delle analisi di laboratorio
sui campioni prelevati.
Il Regolamento 183/2005 stabilisce i requisiti per
l’igiene dei mangimi; il Regolamento 2073/2005 e
successive modifiche detta i criteri microbiologici applicabili ai prodotti alimentari (capitolo 12). Si tratta di
un complesso di norme particolarmente interessanti in
quanto fissano parametri di accettabilità e sicurezza microbiologica degli alimenti.
Il Regolamento 2074/2005 stabilisce le modalità
di attuazione relative a taluni prodotti di cui al Regolamento 853/2004 e all’organizzazione dei controlli
ufficiali.
Il Regolamento 2075/2005 riguarda norme specifiche applicabili ai controlli ufficiali relativi alla presenza
di trichine nelle carni.
Il Regolamento 2076/2005 reca disposizioni transitorie per l’attuazione dei Regolamenti 853/2004,
854/2004 e 882/2004 e la modifica dei Regolamenti
853/2004 e 854/2004.
Una delle innovazioni contenute nel “pacchetto
igiene” è l’estensione anche alla produzione primaria di
norme e procedure basate sull’applicazione di corrette prassi igieniche e non più sui principi di analisi dei
rischi del sistema HACCP. Per produzione primaria si
intendono tutte le fasi della produzione, allevamento e
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NORMATIVE E CONTROLLI PER LA SICUREZZA E LA QUALITÀ ALIMENTARE
coltivazione delle materie prime, compresi il raccolto, la
mungitura e l’allevamento di animali da macello. Sono
produzioni primarie anche la caccia, la pesca e la raccolta di funghi, bacche, lumache ecc.
10.3 Il sistema HACCP nell’industria
alimentare
Al fine di prevenire la diffusione di malattie infettive legate alla commercializzazione e al consumo di prodotti
alimentari non idonei sia dal punto di vista chimico che
microbiologico, le aziende produttrici sono tenute ad
adottare procedure di autocontrollo per garantire qualità e sicurezza dei prodotti. Il sistema è noto con l’acronimo HACCP (Hazard Analysis and Critical Control
Point, Analisi dei Rischi e Controllo dei Punti Critici) ed
è stato ideato dalla statunitense FDA (Food and Drug
Administration) (figura 10.2).
L’adozione del sistema HACCP consente, quando
correttamente applicato, di prevenire o minimizzare
inconvenienti non solo di ordine chimico o biologico
(contaminazioni), ma anche di garantire un prodotto
qualitativamente ineccepibile sotto ogni altro profilo.
Il sistema HACCP individua all’interno di un processo produttivo i punti di criticità operativa sui quali
è opportuno e comunque conveniente effettuare controlli (tabella 10.1). In questo modo si raggiunge la ragionevole sicurezza che il prodotto finito corrisponda
ai criteri di qualità prefissati. Un punto critico (critical
point) è infatti definibile come una fase produttiva o un
trattamento su cui effettuare un controllo (control) allo
scopo di eliminare o almeno minimizzare un pericolo
(hazard). L’attribuzione di criticità a un punto della
produzione (tabella 10.2) deve essere compiuta con cauTabella 10.1 Analisi dei pericoli e punti di criticità
Hazard analysis
(analisi dei pericoli)
Identificare dove e come un
problema di sicurezza dell’alimento può rendersi evidente
Critical control points
(punti critici per
il controllo e la gestione
dei pericoli)
Identificare, verificare e valutare
la correttezza e l’idoneità
dei modi di produzione
Documentare la loro corretta
applicazione
Figura 10.2 HACCP. L’HACCP è un sistema di controllo nel
settore della sicurezza alimentare.
Tabella 10.2 Guida per individuare i punti critici (CCP)
Il punto esaminato è in grado di eliminare o ridurre
un potenziale pericolo?
Sì ➝ CCP
No ➝ in corrispondenza del punto in esame potrebbe
nascere un nuovo pericolo?
No ➝ Non CCP
Sì ➝ nelle successive fasi della produzione esiste un altro momento in grado di eliminare o ridurre il pericolo identificato?
No ➝ CCP
Sì ➝ Non CCP
tela evitandone la sovrabbondanza. I punti critici hanno
infatti carattere ultimativo: il pericolo individuato non
deve poter essere gestito in ulteriori fasi della lavorazione. Ridurre i punti critici a quelli indispensabili può aiutare a mantenerli effettivamente sotto controllo.
Le materie prime devono essere verificate attraverso
la selezione dei fornitori e la conformità alle caratteristiche di qualità, igiene e sicurezza alimentare. Il ciclo
produttivo in cui si realizza la trasformazione della materia prima presenta sicuramente in molte delle sue fasi
altrettanti punti critici, sui quali va effettuato un attento
e costante controllo.
I controlli sul prodotto finito si eseguono attraverso
analisi a campione che verificano la rispondenza delle
caratteristiche chimiche, microbiologiche e organoletti-
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NORMATIVE E CONTROLLI PER LA SICUREZZA E LA QUALITÀ ALIMENTARE
10
Tabella 10.3 Analisi dei pericoli
1 Preparare una lista delle fasi della produzione in cui si
possono verificare ingresso, sopravvivenza e proliferazione di sostanze chimiche e/o microrganismi indesiderati
2 Identificare per ogni possibile pericolo la relativa causa
3 Descrivere le procedure operative in atto in corrispondenza
dei punti di pericolo e valutare se e quali possono avere
influenza sulla causa del pericolo
che del prodotto sia alle norme vigenti che agli standard
qualitativi adottati dall’azienda produttrice.
Nel controllo degli alimenti una fase molto importante è costituita dai piani di campionamento (capitolo 12) che possono essere di severità diversa a seconda
degli obiettivi più o meno categorici o stringenti che ci
si pone in termini di qualità.
Il sistema HACCP è fondato su 7 principi basilari,
riportati anche nel Regolamento 852/2004:
r identificazione dei rischi inerenti la produzione di
un alimento attraverso tutte le fasi produttive, valutazione della possibilità che il rischio si verifichi e
identificazione delle misure preventive per tenere il
rischio sotto controllo
r identificazione dei punti o fasi di produzione su cui
è possibile esercitare un controllo (dalle materie prime al loro trasporto, al trattamento, alla conservazione, alla vendita) allo scopo di eliminare i possibili
rischi o di minimizzarli
r definizione dei limiti di criticità per ogni CCP
r predisposizione di un sistema di monitoraggio (test)
da effettuare per ogni CCP
r predisposizione delle azioni correttive da intraprendere se un CCP risulta fuori norma
r predisposizione delle prove di verifica per il funzionamento complessivo del sistema HACCP predisposto
r allestimento di un’appropriata, completa e aggiornata documentazione dell’intero sistema e delle relative procedure.
10.4 La shelf-life degli alimenti
La shelf-life di un alimento può essere intesa come “vita
commerciale”, “vita di scaffale” o “stabilità durante la
conservazione”.
Figura 10.3 Shelf-life. Misure della shelf-life della lattuga
attraverso riscaldamento del contenitore.
In altre parole questo parametro indica per un dato
prodotto, in determinate condizioni di conservazione,
il tempo limite entro il quale si possono verificare al
suo interno lievi modificazioni della qualità, comunque ancora accettabili dal punto di vista della sicurezza
al consumo. Nel settore alimentare le aziende produttrici devono essere in grado di stimare quale possa essere la shelf-life dei loro prodotti: gli alimenti sono infatti
sottoposti a condizioni di trasformazione, confezionamento, distribuzione e conservazione estremamente
variabili.
La valutazione della shelf-life di un prodotto alimentare si basa su parametri diversi, fra cui la presenza di
alcuni microrganismi indicatori o di loro metaboliti e
l’andamento temporale della loro concentrazione. Nello studio di valutazione il prodotto viene sottoposto a
trattamenti che simulano in modo accelerato le condizioni ambientali “standard” in cui si troverà negli scaffali
del punto vendita (figura 10.3). Il monitoraggio riguarda
solitamente la conta microbica, la ricerca e la conta di
muffe e lieviti, quella di alcuni microrganismi patogeni
(in relazione alla tipologia dell’alimento) e dei germi indicatori di igiene (per es. gli indicatori di inquinamento
fecale), la determinazione di alcuni parametri chimici
(pH, aw ecc.) e sensoriali (caratteri organolettici). Lo
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10
NORMATIVE E CONTROLLI PER LA SICUREZZA E LA QUALITÀ ALIMENTARE
L’INSALATA RUSSA
Un esempio concreto di applicazione di procedura
HACCP alla produzione di alimenti può essere fornito
dalla preparazione dell’insalata russa (figura 10.4). Per
ottenere dati concreti, è possibile prendere in considerazione due parametri: la gravità del danno e la probabilità che questo si verifichi. Entrambi i parametri sono
espressi da coefficienti che vanno da 0 a 3. Moltiplicando
fra loro i due coefficienti assegnati, si ottiene un valore
identificato come gravità del rischio (GR). Nell’esempio indicato all’ingrediente “maionese” viene attribuito
un GR = 9, in quanto la gravità del possibile danno è
massima (3: salmonellosi) così come massima è la probabilità che si verifichi (fattore di rischio 3: utilizzo di
uova crude; esigenza di perfetta igiene nella manipolazione delle uova, di perfetta pulizia delle attrezzature e
del piano di lavoro, di accurato lavaggio delle mani da
parte dell’operatore ecc.).
scopo è quello di prevedere la possibile evoluzione
temporale dei parametri analizzati rispetto al “tempo
zero” di riferimento. I test di conservabilità e il challenge
test sono orientati al raggiungimento di questo obiettivo, ma ad essi si affianca anche la microbiologia predittiva, che attraverso l’utilizzo di modelli matematici e il
ricorso a specifici database si propone di “descrivere e
prevedere la risposta dei microrganismi al loro ambiente”.
Va in ogni caso precisato che la shelf-life di un prodotto può non coincidere esclusivamente con la sua
data di scadenza. Questo termine infatti è legato a parametri di sicurezza igienica e di stabilità imposti dalla normativa, mentre l’apprezzamento di un alimento
coinvolge fattori psicologici e sensoriali che determinano nel consumatore un complesso di aspettative nei
riguardi del prodotto.
Nel caso poi di alimenti “freschi” che non hanno
una data di scadenza (per es. frutta o verdura) entrano
in gioco valutazioni soggettive, per cui un consumatore
può rifiutare un prodotto che per un altro non è ancora
“invecchiato”. In definitiva, risulta spesso difficile determinare con precisione quale sia l’effettiva shelf-life di un
alimento e si preferisce parlare di probabilità che il consumatore ritenga più o meno accettabile un prodotto
dopo un certo periodo di tempo.
Per le verdure impiegate nella preparazione di un’insalata russa il rischio sussiste ugualmente, ma il GR è sicuramente inferiore in quanto si utilizzano verdure cotte:
il trattamento termico elimina gran parte del rischio microbico.
Figura 10.4 Insalata russa.
10.5 Il challenge test
Il challenge test è in pratica una simulazione di laboratorio di quello che può accadere a un prodotto durante
la preparazione, la distribuzione, la conservazione. Si
tratta di una prova che fornisce informazioni importanti
sull’andamento dell’eventuale sviluppo di microrganismi in un determinato prodotto (non solo alimentare;
viene effettuato, per esempio, anche sui cosmetici) allo
scopo di:
r poterne prevedere con sufficiente ragionevolezza la
durata nel tempo (shelf-life)
r monitorare il suo comportamento in termini di qualità microbiologica in conseguenza di un processo
produttivo
r verificare l’efficacia del sistema conservante, per la
valutazione della stabilità microbiologica del prodotto finito
r verificare l’efficacia di trattamenti impiegati per ridurre la carica microbica delle materie prime, dei
semilavorati o dei prodotti.
Il test è basato sull’inoculo nel prodotto di un alto numero di microrganismi scelti fra i patogeni o fra gli indicatori di uno scarso livello igienico per poter valutare,
in condizioni ambientali controllate, se l’alimento possa
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NORMATIVE E CONTROLLI PER LA SICUREZZA E LA QUALITÀ ALIMENTARE
arrivare a rappresentare un rischio per la salute dei consumatori. Il challenge test può essere effettuato per valutazioni in merito al:
r processo produttivo: si inocula con il microrganismo prescelto la materia prima e si procede al monitoraggio del prodotto nei vari passaggi del processo
r prodotto finale: si inocula il prodotto finito, lo si
confeziona nelle stesse condizioni in cui viene com-
10
mercializzato e se ne valutano gli sviluppi durante la
shelf-life.
I microrganismi utilizzati più di frequente per l’esecuzione di un challenge test sono Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans,
Streptococcus spp., Aspergillus niger.
ESERCIZI DI VERIFICA
1. Rispondi alle seguenti domande:
Quali aziende possono contrassegnare i loro
prodotti con il marchio CE?
Che cosa prevede il regolamento CEE
2073/2005 ai fini della certificazione di igiene e
sicurezza dei prodotti alimentari?
Spiega in che cosa consiste il “pacchetto igiene” e quali sono gli obiettivi che si intendono
perseguire
Cosa si intende con l’acronimo HACCP?
Cosa differenzia l’HACCP rispetto a un controllo compiuto esclusivamente al termine di un
processo produttivo?
Quali sono i principi su cui si fonda l’HACCP?
Come si giunge all’individuazione corretta di un
“punto critico”?
Cosa si intende per shelf-life di un alimento?
Come si può arrivare a stimare correttamente
quale può essere la shelf-life di un alimento?
Spiega cosa è e come può essere eseguito un
challenge-test.
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MALATTIE TRASMESSE
CON GLI ALIMENTI
11.1 Infezioni, intossicazioni, tossinfezioni
11.2 Intossicazione da stafilococchi
patogeni
11.3 Tossinfezione da Escherichia coli
11.4 Shigellosi
11.5 Salmonellosi
11.6 Tifo e paratifo
11.7 Tossinfezione da Yersinia enterocolitica
11.8 Intossicazione da Clostridium botulinum
11.9 Tossinfezione da Clostridium perfringens
11.10 Infezione da Bacillus cereus e altri bacilli
11.11 Infezione da Vibrio parahaemolyticus
Le malattie trasmesse con alimenti e bevande comprendono infezioni, intossicazioni e tossinfezioni. I
fattori più importanti che agiscono nel determinare le
caratteristiche di queste malattie sono da individuare
soprattutto nella virulenza dei microrganismi, nella carica microbica dell’alimento, nelle modalità di consumo, nello stato delle difese immunitarie dell’organismo
e nelle sue capacità di risposta. Maggiore è la virulenza
di un microrganismo (cioè il suo grado di patogenicità),
più facilmente sarà in grado di provocare una patologia
caratteristica anche in presenza di basse cariche microbiche. D’altra parte il consumo di alimenti con cariche
microbiche elevate rende più probabile il superamento
della dose minima infettante, cioè del numero minimo
di microrganismi necessario a determinare l’infezione.
Una permanenza prolungata dell’alimento contaminato nello stomaco permette una certa azione microbicida dei succhi gastrici nei confronti dei microrganismi:
l’assunzione di bevande contaminate a stomaco vuoto
facilita l’infezione.
11.12 Colera
11.13 Listeriosi
11.14 Brucellosi
11.15 Tossinfezione da Campylobacter
11.16 Micotossicosi
11.17 Epatite infettiva (epatite A)
11.18 Infezione da Entamoeba histolytica
11.1 Infezioni, intossicazioni,
tossinfezioni
Il requisito fondamentale di un prodotto alimentare è
indubbiamente la sua sicurezza, intesa come assenza di
rischi per la salute dei consumatori. La pericolosità di un
alimento è legata alla possibilità di provocare infezioni,
intossicazioni, tossinfezioni.
Nel caso delle intossicazioni, tossine di origine animale o vegetale possono essere presenti negli animali e
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MALATTIE TRASMESSE CON GLI ALIMENTI
11
nelle piante utilizzati come cibo, oppure essere prodotte
da microrganismi (batteri, muffe, alghe) che si siano sviluppati negli alimenti o ancora che abbiano accidentalmente contaminato l’alimento durante le fasi di produzione, trasformazione, conservazione e trasporto. È ovvio
che affinché un microrganismo possa produrre tossine
deve prima essere in grado di:
r contaminare l’alimento
r trovare le condizioni adatte al proprio sviluppo.
Sono questi i due punti fondamentali su cui bisogna agire per approntare un’efficace azione di prevenzione.
Le infezioni alimentari sono causate dall’ingestione di microrganismi patogeni presenti nell’alimento. La
stragrande maggioranza degli alimenti ospita una certa carica microbica, che può aumentare in relazione ai
processi di lavorazione o conservazione cui l’alimento
viene sottoposto: tali microrganismi derivano dall’ambiente, dagli utensili, dalle superfici di lavoro, dal personale. Un aumento considerevole della carica microbica
può portare, nel caso più semplice, alla rapida degradazione dell’alimento rendendolo non più adatto al consumo, ma può anche essere la premessa per lo sviluppo
di microrganismi patogeni, pericolosi per la salute dei
consumatori. Per causare un’infezione, i microrganismi
presenti nell’alimento devono potere invadere i tessuti
dell’ospite-consumatore: tipico il caso di batteri che invadono la mucosa intestinale esercitando in loco la loro
attività patogena oppure superano questa barriera e si
localizzano in altre sedi.
Nel caso di tossinfezioni di origine alimentare si registra sia l’ingestione e la presenza di batteri che la produzione nell’organismo ospite delle relative tossine.
11.2 Intossicazione da stafilococchi
patogeni
Gli stafilococchi sono batteri ubiquitari, diffusi in tutti gli
ambienti, dall’acqua al suolo, alla pelle, e quindi in grado
di contaminare molto facilmente gli alimenti. Fanno parte della flora microbica commensale delle vie respiratorie
e gastroenteriche. Sono cocchi Gram-positivi con disposizione a grappolo (figura 11.1), immobili e asporigeni,
caratterizzati dalla capacità di sopportare concentrazioni
saline fino al 10-15%. Sono tutti positivi al test della catalasi, mentre solo le specie patogene sono positive a quelli
Figura 11.1 Staphylococcus aureus. Immagine al
microscopio (fonte: CDC/Janice Carr; Jasmine Hageman).
della coagulasi e della termonucleasi e sono contraddistinte dalla capacità di fermentare il mannitolo. Sviluppano a temperature comprese fra 15 e 45 °C; non si riproducono e non elaborano tossine a pH < 5. Comprendono
specie saprofite ed altre patogene (Staphylococcus aureus,
nome che deriva loro dal caratteristico colore giallo-oro
delle colonie in agar) in grado di provocare svariate patologie come foruncoli, ascessi, endocarditi, artriti, meningiti. Gli stafilococchi producono vari tipi di tossine ad
attività citolitica (leucocidine, emolisine). Alcuni ceppi
patogeni elaborano una enterotossina (tossina ad azione intestinale) in grado di provocare, se ingerita con gli
alimenti, una sindrome gastroenterica con vomito e diarrea, raramente con febbre. I sintomi compaiono a breve
distanza di tempo dall’ingestione degli alimenti contaminati (2-4 h) e la guarigione è solitamente la norma.
La tossina viene prodotta dopo che gli stafilococchi,
che hanno contaminato l’alimento provenendo il più
delle volte dal personale addetto alla preparazione dei
cibi, hanno avuto la possibilità di riprodursi attivamente
raggiungendo cariche microbiche piuttosto elevate. Simili evenienze si possono verificare facilmente nel caso
di una cattiva conservazione del cibo (permanenza per
un paio d’ore a temperature di 30-40 °C e oltre, oppure
per una decina di ore a temperatura ambiente). Occorre
tenere presente che gli stafilococchi vengono facilmente
eliminati dall’esposizione al calore (50-60 °C), mentre le
tossine da essi prodotte sono termoresistenti e vengono inattivate solo da un trattamento a 100 °C per almeno
30 min o a 60 °C per almeno 3 h. Il semplice riscaldamento dell’alimento al cui interno siano state prodotte
tossine o anche una sua incompleta cottura non sempre
quindi è in grado di eliminare la tossina. Gli stafilococchi e le tossine possono inoltre rimanere a lungo negli
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MALATTIE TRASMESSE CON GLI ALIMENTI
alimenti, anche se conservati in ambiente refrigerato a
−10/−30 °C. Nella maggior parte dei casi fonte di infezione sono i soggetti con faringite, acne e infezioni cutanee, otiti o congiuntiviti sostenute da stafilococchi patogeni, coinvolti in qualche modo nella manipolazione
del cibo. Gli alimenti vengono contaminati dal contatto
con le mani non lavate o dall’aerosol microbico diffuso
con starnuti o colpi di tosse. Da non sottovalutare anche
la contaminazione da contatto con gli utensili di cucina. Gli alimenti che più frequentemente si dimostrano
veicolo dell’intossicazione sono le creme e i gelati, i prodotti freschi di pasticceria in genere, le uova e le preparazioni a base di uova crude (per es. maionese), i prodotti
ittici, la carne macinata, il latte e i latticini freschi.
11.3 Tossinfezione da Escherichia
coli
Il genere Escherichia fa parte degli enterobatteri (bacilli
Gram-negativi aerobi/anaerobi facoltativi e asporigeni ad
habitat intestinale degli animali a sangue caldo) e comprende l’unica specie E. coli (figura 11.2). All’interno di
questa specie si distinguono peraltro alcune centinaia di
varietà o sierotipi diversi, ciascuno caratterizzato da una
diversa combinazione degli antigeni O (somatico polisaccaridico dello strato lipidico LPS), H (proteico flagellare), K (polisaccaridico della capsula). I ceppi patogeni di
E. coli possono essere raggruppati nelle seguenti classi:
r EPEC enteropatogeni
r ETEC enterotossinogeni
r EIEC enteroinvasivi
r EHEC o VTEC (Vero Toxinogen E. Coli) enteroemorragici.
Ci sono poi ceppi opportunisti, normalmente non patogeni nel loro consueto habitat intestinale, ma che lo
diventano quando migrano in altri distretti dell’organismo: esempio tipico le cistiti da E. coli.
La causa più frequente di tossinfezione da E. coli consiste nel consumo di bevande o alimenti come carni crude o poco cotte contaminate da ceppi patogeni, in grado
di invadere la mucosa intestinale e/o di produrre potenti
tossine. I ceppi invasivi non producono enterotossine,
ma aderiscono alla parete intestinale e vi penetrano provocando ulcerazioni della mucosa con diarrea emorragica. Gli stipiti enterotossici rimangono adesi alla parete
Figura 11.2 Escherichia coli. Immagine al microscopio
elettronico del batterio Escherichia coli (fonte: CDC/Janice
Carr).
intestinale provocando dissenteria (sono i maggiori responsabili della “diarrea del viaggiatore”); quelli enteropatogeni causano lesioni nella parete intestinale e la
“sindrome diarroica” con dissenteria acquosa prolungata.
Ai ceppi enteroemorragici EHEC o VTEC appartengono fra i tanti altri E. coli O157:H7 e quello denominato
O104:H4, responsabili di casi molto gravi di tossinfezione, di cui alcuni con esito letale (sindrome uremicoemolitica). Le tossine elaborate da tali ceppi sono denominate anche SLT (Shiga-like toxin) 1 e 2. I ceppi VTEC
provengono il più delle volte dall’intestino dei bovini da
cui sono stati spesso isolati: ciò deve far riflettere sulla pericolosità del consumo di carne poco cotta, in particolare
quella macinata con cui vengono preparati gli hamburger,
più soggetta a possibili contaminazioni.
Escherichia coli è il più tipico rappresentante dei coliformi, un raggruppamento che non ha valore tassonomico, ma che comprende vari generi di Enterobacteriaceae
(Escherichia, Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella, Yersinia e
altri) caratterizzati dalla capacità di fermentare il lattosio
con produzione di acido e gas. I primi quattro generi sono
denominati coliformi fecali, in grado di crescere anche
alla temperatura di 44 °C. I coliformi, insieme con enterococcchi (streptococchi fecali) e clostridi solfito-riduttori
sono universalmente considerati i più specifici indicatori
di inquinamento fecale nelle acque e negli alimenti.
11.4 Shigellosi
Le shigelle sono enterobatteri responsabili di una sindrome diarroica severa con conseguenze anche letali
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MALATTIE TRASMESSE CON GLI ALIMENTI
(dissenteria bacillare da Shigella dysenteriae) con infiammazione intestinale, diarrea con muco, sangue e
pus; o forme meno gravi da S. flexneri e S. boydii. La patologia è ascrivibile alla produzione di un’endotossina:
i microrganismi non si diffondono al di là della parete
intestinale nel sangue e in altri organi, ma si moltiplicano nel colon. Le shigelle si sviluppano fra i 10 e 40 °C e
vengono uccise dalla pastorizzazione; la conservazione
dei cibi in ambiente refrigerato a +4 °C ne blocca la moltiplicazione. Il periodo d’incubazione si aggira intorno
alle 24 h e gli alimenti più frequentemente responsabili
sono acqua, latte e latticini freschi, carne, pollo e pesce,
contaminati generalmente dalla manipolazione da parte
di portatori sani.
11.5 Salmonellosi
Anche il genere Salmonella fa parte degli enterobatteri.
Le salmonelle (figura 11.3) producono endotossine che
si liberano nell’ambiente extracellulare dopo la morte
della cellula e la sua conseguente lisi, ma un ruolo importante nel determinare il tipico quadro patologico è
da attribuire anche alla presenza dei microrganismi vivi
che invadono la mucosa intestinale causandone l’ulcerazione: per questo il termine di tossinfezione appare
quello più appropriato. Le patologie infettive da salmonelle sono così schematizzabili:
r sindrome gastroenterica o tossinfettiva (salmonellosi)
r febbre tifoide
r febbre paratifoide.
Mentre nelle gastroenteriti l’azione patogena delle salmonelle è limitata all’ambito gastrointestinale, tifo e paratifo sono malattie sistemiche e interessano anche altri
organi. Le tossinfezioni da Salmonella si trasmettono tipicamente attraverso il circuito oro-fecale: l’uomo contrae l’infezione dall’ambiente esterno ingerendo i batteri
con acqua o alimenti e quindi elimina con le feci i microrganismi diffondendo l’infezione. Le salmonelle sono diffuse nei corsi d’acqua e nel terreno umido, dove vengono
disseminate dalle feci sia degli animali che dell’uomo e
dove possono persistere anche per lunghi periodi. Particolarmente pericolosi sono i portatori sani, che diffondono l’infezione inconsapevolmente e possono sfuggire
ai controlli. Ne consegue come risulti fondamentale, so-
11
Figura 11.3 Salmonella. Immagine al microscopio elettronico
di Salmonella, batterio responsabile di tossinfezioni
(fonte: CDC/Janice Carr).
prattutto nel settore delle produzioni alimentari e della
ristorazione collettiva, la più scrupolosa osservanza delle
norme igieniche (in primo luogo il semplice ma frequente lavaggio delle mani) da parte di tutti gli operatori coinvolti a ogni livello del processo produttivo. Le tipiche salmonellosi sono gastroenteriti che si manifestano a breve
distanza dall’ingestione dei cibi contaminati e hanno in
genere decorso benigno. Una corretta cottura dei cibi elimina ogni problema dal momento che la maggior parte
dei ceppi viene inattivata alla temperatura di 60 °C per
pochi minuti, mentre la pastorizzazione a 72 °C per 15 s
ne provoca la morte.
I ceppi più frequentemente responsabili di tossinfezione si sono rivelati S. typhimurium e S. enteritidis, ma
numerosi altri stipiti sono coinvolti in episodi di gastroenteriti ed epidemie collettive. Gli alimenti in cui più
facilmente si sviluppano le salmonelle sono soprattutto
la carne macinata (hamburger e salsicce), le uova, la maionese, i latticini, il pesce, i frutti di mare crudi o poco
cotti. Le salmonelle possono essere presenti all’origine
in molti alimenti: carni provenienti da animali nutriti
con mangimi di carne o pesce contaminati, uova in cui
le salmonelle penetrano attraverso il guscio durante la
deposizione, frutti di mare. Questi ultimi sono organismi filtratori e, se provengono da acqua contaminata da
scarichi fognari, possono concentrare nei loro tessuti
elevatissime cariche microbiche assai pericolose, eliminabili esclusivamente con una corretta cottura.
Sintomi della tossinfezione sono quelli tipici delle
gastroenteriti con nausea, vomito, diarrea con presenza
di sangue nelle feci e febbre.
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MALATTIE TRASMESSE CON GLI ALIMENTI
11.6 Tifo e paratifo
La febbre tifoide, o tifo addominale, è causata da Salmonella typhi, di cui l’uomo è l’unico serbatoio naturale. Si tratta di una malattia sistemica, che cioè coinvolge
vari distretti dell’organismo: l’infezione si contrae solitamente con l’ingestione di cibi o bevande contaminate
da materiale fecale in cui è presente S. tiphy. Spesso l’infezione è trasmessa da portatori sani che manipolano gli
alimenti, sintomo evidente di un’igiene personale e/o
ambientale assai carente. La patologia può risultare severa: ha in media un’incubazione di 1 o 2 settimane e si
manifesta con febbre alta, splenomegalia, caratteristico
esantema addominale a chiazze rosa, infiammazione intestinale con dissenteria e ulcerazioni della mucosa, diffusione ematica della tossina. Le salmonelle ingerite con
gli alimenti penetrano nella mucosa intestinale e raggiungono i linfonodi mesenterici da cui, attraverso i vasi
linfatici e il dotto toracico, vengono riversate nel sangue.
Segue la diffusione in vari organi: fegato, milza, polmoni, midollo osseo. Dal fegato le salmonelle raggiungono
la colecisti e con la bile vengono nuovamente riversate
nell’intestino. Qui causano emorragie e perforazioni
della parete intestinale con conseguente peritonite. Le
complicazioni possono essere anche molto gravi.
Il paratifo è sostenuto dai ceppi A, B e C di Salmonella paratyphi; è una patologia molto simile al tifo ma di
minore gravità. La prevenzione viene attuata mediante
vaccinazione, con vaccino costituito da microrganismi
uccisi o anche con batteri vivi e attenuati.
11.7 Tossinfezione da Yersinia
enterocolitica
Yersinia enterocolitica (figura 11.4) è un enterobatterio in
grado di sopravvivere e moltiplicarsi negli alimenti anche
in ambiente refrigerato a +4 °C a condizione che il pH
si mantenga sopra 5,4. È in grado di sopravvivere lungamente nelle acque, mentre nelle carni salate lo sviluppo
risulta inibito anche a temperatura ambiente dalla presenza combinata di sale e batteri lattici. I ceppi di Yersinia pericolosi per l’uomo devono la loro azione patogena
all’invasività e alla produzione di una enterotossina termoresistente, in grado di resistere per tre ore alla temperatura di 121 °C, collegabile alla tossina ST di E. coli. Tale
tossina può essere prodotta in alcuni casi anche da ceppi
Figura 11.4 Yersinia enterocolitica. Immagine al microscopio
elettronico (© Dennis Kunkel Microscopy, Inc.).
non patogeni e provoca una patologia di tipo enterocolitico. La tossinfezione si trasmette per via oro-fecale con
l’ingestione di alimenti (soprattutto quelli a base di carne
suina) e la successiva eliminazione del batterio con le feci.
11.8 Intossicazione da Clostridium
botulinum
La neurotossina prodotta da Clostridium botulinum (famiglia Bacillaceae) è la più potente che si conosca, in grado
di provocare intossicazioni che spesso hanno esito letale
(10 microgrammi possono uccidere un uomo). C. botulinum è un bacillo Gram-positivo sporigeno anaerobio,
di cui si conoscono sette tipi sierologici diversi, indicati
con le lettere dalla A alla G. Di questi, i tipi A, B, E sono
quelli che interessano la patologia umana. Le spore di C.
botulinum hanno un’ampia diffusione ambientale (suolo
e acque, feci animali, vegetali in decomposizione) e possono contaminare molti alimenti. Sono molto resistenti al
calore (vengono eliminate con trattamenti di almeno 15
min a 160 °C di calore secco, 5 h a 100 °C di calore umido,
3 min a 121 °C in autoclave); in particolare la resistenza
per 5 h a 100 °C deve far riflettere sui tempi di bollitura
da impiegare nella preparazione delle conserve casalinghe
o artigianali. È però noto che le spore non possono germinare e le cellule vegetative non elaborano tossina se il
pH dell’alimento conservato è inferiore a 4,5 (capitolo 9).
Quando trovano condizioni adatte (ambiente anaerobio,
pH > 4,5, sufficiente umidità e sostanze nutritive disponibili) le spore di C. botulinum germinano originando le
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MALATTIE TRASMESSE CON GLI ALIMENTI
corrispondenti cellule vegetative in grado di elaborare la
tossina. Le condizioni per la moltiplicazione vegetativa e
la produzione della tossina sono così riassumibili:
r anaerobiosi
r temperatura compresa fra 3 e 48 °C
r sufficiente disponibilità di acqua
r pH compreso fra 4,5 e 8,3
r assenza di sostanze ad azione inibente, come NaCl,
saccarosio o nitriti ad alte concentrazioni
r contaminazione dell’alimento da parte di altri microrganismi (muffe in particolare, caso tipico nelle conserve di
pomodoro) in grado di provocare variazioni del pH, inizialmente acido, verso l’alcalinità. Ciò crea le condizioni
per lo sviluppo dei clostridi e la produzione di tossina.
La tossina botulinica può essere inattivata da un trattamento alla temperatura di 100 °C per 15 min o di 30 °C
per 30 min: ne consegue che una corretta cottura dei cibi
scongiura ogni pericolo. Responsabili di intossicazione
sono più frequentemente cibi insaccati (il nome del batterio deriva dal latino botulus, salsiccia), le conserve di carne
e vegetali in scatola, il pesce affumicato, i prodotti lattiero-caseari. Particolarmente pericolose risultano essere le
preparazioni artigianali/domestiche, in quanto a livello
industriale viene esercitata una vigilanza molto attenta sui
parametri che condizionano la sopravvivenza del germe e
la produzione della tossina. In ogni caso, la presenza di bolle d’aria e un sapore acido devono far sorgere il sospetto di
contaminazione e impongono l’eliminazione del cibo. Si
tratta di una tossina neurotropa, che agisce attaccando il
sistema nervoso centrale e periferico. Il punto d’azione è
costituito dalle giunzioni (sinapsi) neuromuscolari, dove
la tossina blocca la liberazione di acetilcolina, mediatore chimico dell’impulso nervoso: sintomi caratteristici
dell’intossicazione botulinica sono diplopia (visione doppia), paralisi della faringe e dei muscoli, compresi quelli respiratori come il diaframma (paralisi flaccida). In assenza
di intervento terapeutico, che consiste nella somministrazione di anti-tossina, l’esito è spesso infausto. Il periodo di
incubazione si aggira fra le 12 e le 36 h.
11
e animali e possono facilmente contaminare gli alimenti.
Dall’intestino possono penetrare nelle masse muscolari
degli animali (bovini e pollame in particolare) durante
le operazioni di macellazione ed eviscerazione. Anche in
questo caso, quindi, è sconsigliabile cibarsi di carne cruda
o poco cotta. Queste spore resistono infatti alla temperatura di 100 °C per 2 ore e sono stimolate alla germinazione se esposte per 10 min a 80 °C (shock termico). La
germinazione delle spore, con il conseguente sviluppo
delle cellule vegetative, si verifica a temperature comprese
fra 30 e 45 °C, mentre risulta bloccata in ambiente refrigerato a +4 °C. Preparazioni più a rischio sono i prodotti
carnei, in particolare le carni “arrotolate” in cui le superfici
esterne nella fase di preparazione del prodotto vengono
poi portate all’interno della massa dove l’ossigeno è più
carente e il calore penetra più lentamente e con difficoltà.
La tossinfezione da C. perfringens si manifesta in genere con dolori addominali, febbre, vomito e diarrea,
dopo un’incubazione di alcune ore. Esso è uno degli
agenti della gangrena gassosa, grave infezione di ferite
causata da un complesso di tossine necrotiche tissutali.
11.10 Infezione da Bacillus cereus
e altri bacilli
Bacillus cereus è un batterio sporigeno aerobio-anaerobio
facoltativo ad ampia diffusione ambientale, le cui spore
sono inattivate a 100 °C per 30 min, e indotte a germinare
se esposte alla temperatura di 60-70 °C per 10 min. Le cellule vegetative che ne derivano si moltiplicano se esposte
alla temperatura di 28-35 °C per diverse ore: ne consegue
11.9 Tossinfezione da Clostridium
perfringens
Le spore di Clostridium perfringens (figura 11.5) si rinvengono nel suolo, nelle acque e nell’intestino di uomo
Figura 11.5 Clostridium perfringens. Nell’immagine sono
visibili le spore, (fonte: CDC/Don Stalons).
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MALATTIE TRASMESSE CON GLI ALIMENTI
l’opportunità del consumo immediato degli alimenti possibile fonte di infezione o di una loro sollecita conservazione in frigorifero, in particolare le creme, il latte, la carne
cotta, il brodo, il riso bollito o le frittelle di riso. Le tossine
prodotte da B. cereus sono essenzialmente quella diarroica e quella emetizzante: la prima provoca forti dolori addominali e diarrea; la seconda nausea e vomito. I sintomi
compaiono in entrambi i casi dopo alcune ore.
Altre specie del genere Bacillus possono rendersi responsabili di tossinfezioni alimentari con sintomatologia gastroenterica: B. subtilis, B. polimixa, B. megaterium.
11.11 Infezione da Vibrio
parahaemolyticus
Vibrio parahaemolyticus (famiglia Vibrionaceae) (figura
vive in ambiente marino prossimo alla costa e può
contaminare pesci, molluschi e crostacei. È un bacillo a
virgola aerobio-anaerobio facoltativo, alofilo (resiste a concentrazioni di NaCl dell’11%). Richiede un pH superiore a
6: le carni di tonni e sgombri, che hanno pH inferiori, non
hanno mai mostrato contaminazione da parte di tale batterio. È sufficiente trattare gli alimenti a 100 °C per almeno 1
minuto per uccidere il vibrione, per cui l’infezione è spesso
la conseguenza del consumo di pesce e frutti di mare crudi.
I sintomi sono tipicamente gastroenterici (nausea, vomito,
diarrea, febbre) con un’incubazione di circa 15 h.
11.6)
11.12 Colera
Il colera è una grave tossinfezione il cui agente eziologico,
Vibrio cholerae, è un caratteristico bacillo a virgola che
sviluppa a 37 °C e a pH alcalini (prossimi a 8): tale caratteristica viene sfruttata in laboratorio per il suo isolamento selettivo. Antigeni specifici sono quello somatico
polisaccaridico O e quello proteico flagellare H. L’antigene O comprende 6 tipi diversi: al tipo O1 appartengono i ceppi Ogawa, Inaba e Hikojima; altro sierogruppo
patogeno per l’uomo è l’O139. Sulla base delle diverse
combinazioni antigeniche è possibile individuare 140
sierotipi di V. cholerae con due biotipi: classico ed El Tor.
I vibrioni, eliminati con le feci da ammalati o portatori,
trovano soprattutto nelle acque un ambiente favorevole alla loro riproduzione e, in quanto moderatamente
alofili, sopravvivono generalmente anche nell’acqua del
Figura 11.6 Vibrio parahaemolyticus. Immagine
al microscopio elettronico di Vibrio parahaemolyticus, vibrione
responsabile di intossicazione da pesci e frutti di mare crudi
(© Dennis Kunkel Microscopy, Inc.).
mare. Poiché i vibrioni vengono eliminati dall’esposizione a 100 °C per 1 min, il consumo di pesce e molluschi
crudi o appena “scottati” o anche quello di acqua contaminata da scarichi fognari sono le cause prime della
diffusione della tossinfezione. I vibrioni assunti con cibo
e bevande arrivano all’intestino dove elaborano la tossina colerica: un’enterotossina proteica termolabile che
agisce sul sistema enzimatico adenilato-ciclasi. L’enzima
induce un’eccessiva produzione di AMP-ciclico, molecola che regola l’equilibrio idrosalino a livello intestinale: l’alterazione che ne consegue provoca una massiccia
perdita di liquidi ed elettroliti con diarrea “ad acqua di
riso”. Le conseguenze sono molto gravi: massiccia disidratazione, acidosi nel sangue e nei tessuti, collasso cardiocircolatorio che può sfociare, in assenza di opportuna
terapia, nel coma e nella morte. Il colera è una malattia
endemica in alcuni paesi sottosviluppati, ma può presentarsi in forma sporadica o epidemica dovunque si creino condizioni precarie di igiene per le cause più diverse
(conflitti, disastri naturali ecc.).
11.13 Listeriosi
Listeria monocytogenes è un corto bacillo Gram-positivo
aerobio-anaerobio facoltativo diffuso nell’ambiente e
in particolare nelle acque luride, nel suolo, nei vegetali
e come ospite saprofita nell’intestino di uomo e animali. Il batterio è stato isolato da molti alimenti di origine
animale fra cui il latte, dove può arrivare sia provenendo
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MALATTIE TRASMESSE CON GLI ALIMENTI
dalle mammelle di animali con mastite inapparente che
per contaminazione secondaria durante la mungitura da
portatori sani che ospitano il batterio nell’intestino. Altri
alimenti più spesso responsabili di infezione risultano
essere formaggi e uova. Il batterio viene comunque ucciso dalla temperatura di pastorizzazione, anche se alcuni
Autori riportano per qualche ceppo una certa termoresistenza fino a 75-76 °C. Il periodo di incubazione della
listeriosi è variabile da un giorno ad alcune settimane, e
si manifesta con meningite ed encefalite. L’infezione può
essere trasmessa anche per via transplacentare al feto.
11.14 Brucellosi
Le brucellose vengono trasmesse all’uomo attraverso
l’ingestione di latte e latticini provenienti da animali infetti (caprini, ovini, suini, bovini). Sono peraltro descritti
numerosi casi d’infezione riguardanti personale addetto
alla lavorazione delle carni, per cui non si può escludere
anche una via transcutanea di penetrazione del germe.
Sono inoltre riportati casi di trasmissione da aerosol di
colture microbiche di brucelle tra il personale tecnico
addetto alle analisi. La malattia prende anche il nome di
febbre maltese o ondulante, a indicare sia il luogo dove si
verificarono i primi casi e dove fu studiata (Malta) sia una
delle sue caratteristiche salienti: la febbre ricorrente. Le
brucelle sono coccobacilli Gram-negativi aerobi di piccole dimensioni, difficili da coltivare in laboratorio a causa
delle loro complesse esigenze nutrizionali. Le specie patogene per l’uomo sono Brucella melitensis, B. abortus e B.
suis, che si differenziano per le diverse combinazioni degli
antigeni di superficie M e A, caratteristici di questi batteri. Le brucelle giungono con gli alimenti nell’intestino e
di qui passano nel torrente circolatorio (batteriemia) con
episodi febbrili intermittenti. I microrganismi si localizzano quindi nel fegato, nella milza e nelle linfoghiandole, di
cui provocano necrosi parenchimale. La termoresistenza
delle brucelle non è elevata: vengono infatti eliminate dal
normale trattamento di pastorizzazione.
11
dei vibrioni (figura 11.7), responsabile di molti episodi di
gastroenterite soprattutto in età infantile. Questi batteri
vivono come commensali nell’intestino di bovini, ovini,
caprini, polli, cani, gatti e uccelli (in particolare uccelli migratori acquatici) e vengono eliminati con le feci. Sono in
grado di produrre diverse tossine. Gli alimenti possono
venire contaminati nella fase di produzione, trasformazione e conservazione. Campylobacter viene ucciso dalla pastorizzazione, per cui i casi d’infezione sono da far risalire
al consumo di carne poco cotta, soprattutto di pollo o di
maiale. Anche il latte crudo o non correttamente pastorizzato può diventare veicolo d’infezione. Inoltre cani e gatti
possono diffondere l’infezione in ambiente domestico. Il
periodo d’incubazione della tossinfezione varia dai 2 ai 10
giorni, i sintomi sono cefalea, dolori addominali, febbre e
diarrea con presenza di sangue nelle feci. Solitamente la
guarigione avviene in una decina di giorni.
11.16 Micotossicosi
Alcune muffe producono sostanze tossiche per l’uomo
e gli animali note come micotossine. Muffe e micotossine sono causa di gravi problemi nella produzione e
commercializzazione delle granaglie, sia per gli allevatori che le utilizzano per l’alimentazione degli animali dei
quali provocano morie, sia per le industrie alimentari
che corrono il rischio di produrre alimenti preparati con
farine contaminate. Le muffe si sviluppano su substrati
in cui sia disponibile una minima quantità di acqua libe-
11.15 Tossinfezione da
Campylobacter
Campylobacter jejuni è un batterio ricurvo Gram-negativo
asporigeno e microaerofilo, il cui aspetto ricorda quello
Figura 11.7 Campylobacter jejuni. Immagine al microscopio
elettronico del batterio Campylobacter jejuni, commensale
dell’intestino di diversi animali e produttore di tossine (fonte:
www.wikipedia.it).
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MALATTIE TRASMESSE CON GLI ALIMENTI
ra (tabella 11.1), con temperature comprese fra i 15 e i
37 °C. Una volta prodotte, non vengono eliminate dalla
cottura dei cibi data la loro termoresistenza.
L’azione cancerogena, teratogena e mutagena (capitolo 15) delle tossine è documentata per l’uomo e gli
animali in seguito all’ingestione di alimenti o mangimi
preparati con cereali o farine contaminati, ma anche, nel
caso dell’uomo, in seguito a quella di carne proveniente
da animali nutriti con mangimi contaminati. Nell’uomo
provocano raramente fenomeni di intossicazione acuta,
ma mostrano piuttosto tossicità cronica per la tendenza
ad accumularsi nel fegato provocando epatite, cirrosi,
tumori. Le micotossine più note sono le aflatossine
prodotte da Aspergillus flavus, Aspergillus orizae, Aspergillus parasiticus. Aspergillus ochraceus produce ocratossina, Penicillium expansum produce patulina, Fusarium
produce fumosine e zearalenone.
11.18 Infezione da Entamoeba
histolytica
L’amebiasi è un esempio d’infezione alimentare provocata dall’ingestione di bevande e alimenti contaminati dal protozoo Entamoeba histolytica. Questo
protozoo si presenta in forma di cellula vegetativa
(trofozoite), dotata di movimento attivo e della possibilità di riprodursi, o di cisti (figura 11.8), forma di
resistenza analoga alle spore batteriche. Le cisti vengono ingerite con acqua e alimenti; giunte nell’intestino si trasformano in trofozoiti in grado di perforare
la mucosa intestinale e di provocare lesioni ulcerative.
Cisti e trofozoiti vengono emessi con le feci. L’amebiasi si manifesta con diarrea profusa, perdita di sangue
e muco. Se le amebe si localizzano nel fegato possono
dare luogo a un ascesso epatico.
11.17 Epatite infettiva (epatite A)
L’epatite infettiva (epatite A) è un esempio di infezione di origine alimentare trasmessa attraverso il circuito
oro-fecale da un virus (virus HAV, Haepatitis A Virus)
che dall’intestino raggiunge il tessuto epatico provocando una necrosi cellulare. Attraverso il sangue il virus può
raggiungere altri organi ed è espulso con le feci, cui arriva attraverso la bile. La malattia ha un’incubazione variabile da una decina di giorni a due mesi circa, cui segue
ittero (colorazione giallastra della cute e delle sclere).
Gli alimenti attraverso cui si può trasmettere l’epatite
A sono soprattutto l’acqua, le verdure e i frutti di mare
contaminati e consumati crudi: il virus HAV è inattivato
dall’ebollizione a 100 °C per 5 min.
Figura 11.8 Entamoeba histolytica. L’immagine mostra cisti
di Entamoeba histolytica (fonte: CDC/Dr. L.L.A. Moore, Jr.).
Tabella 11.1 Esigenze minime di aw di alcune muffe micotossinogene
MICRORGANISMO
aw minima per la crescita
aw minima per la produzione di tossina
Aspergillus flavus
0,780
0,840 (aflatossine)
Aspergillus ochraceus
0,800
0,850 (ocratossina)
Aspergillus parasiticus
0,810
0,850 (aflatossine)
Penicillium cyclopium
0,830
0,890 (ocratossina)
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ESERCIZI DI VERIFICA
1. I coliformi sono:
A tutti i batteri intestinali
B quelli che producono anidride carbonica
C quelli che fermentano il lattosio con produzione di anidride carbonica
D quelli che non fermentano il lattosio
E quelli che non fermentano il lattosio ma producono anidride carbonica
2. La carica microbica infettante è:
A il numero di batteri presenti in tutto l’alimento
B la carica batterica totale per grammo di alimento
C il numero di batteri necessario affinché si
scateni un’infezione
3. Le salmonelle sono responsabili di:
A infezioni di ferite
B infezioni respiratorie
C tossinfezioni alimentari
4. I veicoli di infezione sono:
A topi
B insetti
C oggetti
5. Tifo e salmonellosi sono causati:
A dallo stesso batterio
B da batteri dello stesso genere
C da batteri della stessa specie
7. Le salmonelle:
A producono endotossine
B producono esotossine
C non producono tossine
8. Il colera si contrae:
A per contatto diretto
B ingerendo cibi o bevande contaminati da
salmonelle
C attraverso il circuito oro-fecale
9. Le salmonelle fanno parte dei coliformi:
A vero
B falso
10. La virulenza di un microrganismo indica:
A la capacità di produrre malattie
B il grado di patogenicità
C la capacità di essere invasivo
11. La tossina botulinica deve la sua pericolosità al fatto di essere:
A termoresistente
B termosensibile
C non rilevabile in laboratorio
12. La tossina botulinica inibisce:
A la contrazione muscolare
B il rilassamento dei muscoli
C il passaggio dei farmaci antitossina
6. Il tifo è una:
A gastroenterite
B malattia sistemica (interessa tutto l’organismo)
C malattia respiratoria
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12
CONTROLLO
MICROBIOLOGICO DEGLI
ALIMENTI
12.6 Le carni
Il controllo microbiologico degli alimenti ha lo scopo di
prevenire la trasmissione di tossinfezioni, infezioni e intossicazioni sostenute da microrganismi patogeni o loro
tossine. Poiché la contaminazione microbica può verificarsi in ogni punto della filiera produttiva, dalle materie prime alla loro trasformazione, confezionamento,
trasporto e stoccaggio, i controlli devono essere estesi a
tutte le fasi. I controlli microbiologici vengono effettuati
attraverso la ricerca di microrganismi indicatori per i
quali, in base a specifiche normative, viene prescritta la
completa assenza o viene tollerata una concentrazione
massima ammissibile.
12.7 Conserve e semiconserve in recipienti
a chiusura ermetica (prodotti in
scatola)
12.1 Tecniche analitiche
tradizionali e innovative
12.1 Tecniche analitiche tradizionali e
innovative
12.2 Criteri microbiologici
12.3 I piani di campionamento
12.4 Microrganismi indicatori
12.5 Le frodi alimentari
12.8 I salumi
12.9 Latte e derivati
12.10 Yogurt e latti fermentati
12.11 I gelati
12.12 Uova e derivati
12.13 Prodotti della pesca
12.14 Miele
12.15 Paste alimentari
Le tecniche analitiche impiegate nei laboratori di controllo sono indicate dalle normative ISO di riferimento.
Può trattarsi delle classiche tecniche di indagine microbiologica, ma si fa spesso ricorso a metodi messi a punto dalla ricerca biotecnologica, più rapidi e precisi. Fra
questi:
r tecniche immunologiche (EIA, ELISA), basate sulla
specificità di legame fra anticorpi monoclonali e antigeni microbici
r tecniche immunomagnetiche (IMS). Impiegano
particelle magnetiche ricoperte di anticorpi specifici per determinati antigeni di batteri oggetto della ricerca. La successiva applicazione di un campo
magnetico è in grado di separare e porre in coltura
esclusivamente i batteri legati a tali particelle
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CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI
12
a)
cDNA
cRNA fluorescente
Marcatura
Ibridazione
Scanner
Sonde
specifiche
b)
Misurazione
del pattern
di fluorescenza
Figura 12.1 Microarray.
a) Schema della tecnica di
ibridazione; b) pattern di
fluorescenza.
r impiego di sonde a DNA o RNA. Individuano sequenze geniche specifiche dei microrganismi ricercati. Queste sonde (DNA o RNA probes) sono
assemblate in laboratorio e sono complementari a
sequenze polinucleotidiche specifiche (target) dei
patogeni ricercati. L’ibridazione sonda/target viene
rivelata da reazioni colorimetriche o di chemioluminescenza. Utilizzando un microarray, su di un singolo
supporto si possono fissare anche decine di migliaia
di sequenze polinucleotidiche con cui cimentare il
DNA del microrganismo da identificare (figura 12.1)
r tecniche di amplificazione molecolare (PCR). La
polymerase chain reaction permette di amplificare una
determinata sequenza nucleotidica presente anche
in tracce minime. Ottenuta una quantità sufficiente
di materiale, si procede con l’identificazione mediante ibridazione con sonde DNA/RNA o con tecniche immunoenzimatiche
r tecniche di bioluminescenza: si basano sul dosaggio dell’ATP prodotto dai microrganismi, rivelato
dalla reazione fra l’enzima luciferasi e lo specifico
substrato (luciferina). La reazione provoca l’emissione di luce con intensità proporzionale alla disponibilità dell’ATP contenuto nelle cellule microbiche
vive presenti nel campione
r tecniche di impedenzometria: i microrganismi producono metaboliti (in particolare acidi organici) in
grado di modificare l’impedenza o conduttanza del
substrato in misura proporzionale al loro sviluppo.
L’impedenza si può definire come la resistenza opposta al passaggio di una corrente variabile. La conduttanza è il suo reciproco
r analisi degli acidi grassi (fatty acid methyl ester:
FAME). È basata sulla separazione cromatografica
degli esteri metilici degli acidi grassi dei singoli microrganismi (figura 12.2).
163
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CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI
Estrazione diretta
degli acidi grassi
dal campione
Metilazione
CH3
Gas cromatografia
Intensità relativa
10
26
27
25
5
11
6
3
8
2
0
9
1
12
7
14
12 18
13
14 19
21
15
22
16
17
20 23
16
24
29
28
18
20
Tempo di ritenzione (min)
Figura 12.2 Schema della tecnica FAME.
Queste tecniche affiancano e spesso sostituiscono, laddove possibile, quelle tradizionali basate sull’impiego
dei terreni di coltura generici o selettivi e sui test biochimici di identificazione, che rimangono comunque alla
base di ogni indagine microbiologica.
12.2 Criteri microbiologici
Un programma di controllo microbiologico di prodotti
alimentari deve predisporre adeguati piani di campionamento e stabilire criteri microbiologici sulla cui base
effettuare opportune indagini di laboratorio.
Un criterio microbiologico definisce l’accettabilità di un prodotto o di un processo produttivo, in base
all’assenza, alla presenza o al numero di microrganismi
e/o in base alla concentrazione delle relative tossine o
metaboliti, per unità di massa, volume, area o partita.
Per ogni alimento considerato un criterio microbiologico deve individuare:
r quali microrganismi possono rappresentare un rischio sanitario
r i metodi specifici di analisi
r il piano di campionamento
r il tipo di campione rappresentativo di un lotto o partita di prodotto
r i limiti microbiologici relativi al prodotto e ai microrganismi oggetto di ricerca
r il punto della catena produttiva o di trasformazione
in cui si applica
r le azioni da intraprendere nel caso di mancato rispetto dei limiti.
Gli scopi dei criteri microbiologici sono la valutazione
della sicurezza igienica di un alimento; il controllo della “buona prassi di fabbricazione”; la valutazione della
probabile shelf-life degli alimenti deperibili (tempo per
il quale un prodotto può essere commercializzato); il
controllo dell’idoneità degli ingredienti impiegati.
Il Regolamento CE 2073/2005 (e successive modifiche) stabilisce per le varie categorie di alimenti:
r i criteri di sicurezza alimentare: definiscono l’accettabilità di un prodotto o di una partita di prodotti
alimentari nei confronti di un potenziale rischio biologico (presenza di patogeni)
r i criteri di igiene di processo: definiscono il funzionamento accettabile del processo di produzione.
12.3 I piani di campionamento
I campioni scelti per il controllo devono rappresentare
un’intera partita produttiva. Elementi fondamentali nel
controllo microbiologico degli alimenti sono:
r l’unità campionaria: aliquota di prodotto o singola
confezione, scelta a caso, su cui effettuare il controllo
r il lotto: quantità di un alimento (unità di vendita)
prodotte e confezionate in circostanze praticamente
identiche
r il campione rappresentativo: quello in cui sono
mantenute le caratteristiche medie del lotto da cui
viene prelevato
r il campione casuale: insieme delle unità campionarie selezionate da un lotto.
I piani di campionamento devono essere predisposti in
base ai criteri microbiologi indicati dalla normativa, allo
scopo di stabilire il numero di unità campionarie da analizzare, il numero limite di microrganismi ammessi, il numero di unità in cui i limiti non devono essere superati.
Occorre in primo luogo stabilire la “severità” del piano, ossia il numero di unità campionarie da analizzare.
Maggiore è il rischio, tanto più severo e rigido deve risultare di conseguenza il piano di campionamento predisposto. Nei piani di campionamento viene stabilito:
164
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CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI
r il numero di campioni da analizzare, cioè le unità
campionarie (n)
r il numero di unità campionarie sulle quali si può
esprimere una tolleranza (c)
r il numero limite di microrganismi al di sotto del quale il risultato è soddisfacente (m)
r il limite massimo di accettabilità, al di sopra del quale il risultato è insoddisfacente (M).
I piani di campionamento possono essere:
❖ a due classi. Il sistema di giudizio in questo caso è di
tipo qualitativo (presenza/assenza), rivolto alla ricerca di patogeni (di cui è richiesta la completa assenza)
in un certo numero n di unità campionarie. Nella ricerca dei patogeni (per es. salmonelle) il numero di
unità campionarie n è consistente (per es. 10 campioni) e si pone c = 0 (tolleranza zero): il microrganismo
deve risultare assente in tutti i campioni esaminati
❖ a tre classi. La qualità del prodotto viene apprezzata
con criteri quantitativi, si fa cioè riferimento al numero di microrganismi presenti. Un piano a tre classi
offre maggiore flessibilità: si presuppone in questo
caso che sia accettabile una certa contaminazione da
germi saprofiti e il campione viene assegnato a tre
diverse classi di qualità, indicate come accettabile,
parzialmente accettabile, inaccettabile.
Quando è ritenuto importante il numero dei microrganismi, come nella determinazione della carica batterica o
nel conteggio dei coliformi, il numero di unità campionarie da esaminare può essere inferiore rispetto a un piano a
due classi (n = 5) e il risultato dell’analisi viene rapportato
ai seguenti parametri:
r un livello al di sotto del quale l’alimento è ritenuto
accettabile, espresso come valore m
r un livello al di sopra del quale l’alimento è ritenuto
inaccettabile, indicato come valore M
r un intervallo di tolleranza nel quale l’alimento è ancora accettabile o parzialmente accettabile, quando
per un certo numero c di campioni il risultato è compreso fra m e M.
12
alcuni patogeni (per es. salmonelle, Listeria o altri) la
cui presenza nell’alimento deve essere esclusa perché
indicatori di rischio biologico (sicurezza sanitaria), o
a quella di microrganismi indicatori dello stato igienico
del prodotto, la cui presenza o la cui concentrazione oltre limiti prestabiliti indica un potenziale pericolo. Questi indicatori sono legati alla scadente qualità igienica
del prodotto, ma indicano comunque anche la probabile
presenza di patogeni.
I microrganismi considerati indicatori devono possedere caratteristiche precise:
r essere associati costantemente ed esclusivamente
all’identica fonte di provenienza dei patogeni
r essere di facile e rapida reperibilità e individuazione
con tecniche di laboratorio relativamente semplici e
di basso costo
r essere agevolmente distinguibili dagli altri microrganismi.
Gli indicatori di inquinamento fecale sono quelli di
più comune impiego in campo alimentare:
r coliformi (bacilli Gram-negativi che fermentano il
lattosio con produzione di acido e di gas)
r coliformi fecali
r E. coli
r streptococchi fecali (enterococchi)
r clostridi solfito-riduttori.
Anche se i coliformi costituiscono tradizionalmente il
principale gruppo di microrganismi indicatori, si preferisce impiegare piuttosto E. coli come sicuro indicatore di inquinamento fecale, in quanto costantemente
correlato con la presenza della generalità dei patogeni
che hanno habitat intestinale. La ricerca specifica di
E. coli ha sostituito quella dei coliformi fecali, definiti
in origine come i coliformi di più sicura provenienza
fecale, in quanto la loro identificazione non si è dimostrata sufficientemente precisa con i terreni selettivi
disponibili.
12.5 Le frodi alimentari
12.4 Microrganismi indicatori
Il controllo microbiologico può essere rivolto, in base
a quanto sopra esposto, all’individuazione specifica di
Commette una frode chi, con l’inganno o l’imbroglio, si
sottrae a disposizioni di legge o a obblighi contrattuali.
In campo alimentare è possibile distinguere frodi sanitarie, che trasformano gli alimenti in sostanze nocive
165
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12
CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI
per la salute pubblica, e frodi commerciali, che procurano un danno economico a chi le subisce, acquistando
per esempio un prodotto di poco pregio venduto al posto e al prezzo di uno più pregiato. È opportuno conoscere il significato giuridico di alcuni termini che spesso
vengono usati impropriamente:
r alterazione: consiste nel degradamento delle caratteristiche organolettiche e nutritive e si verifica
generalmente in seguito a una conservazione non
corretta
r adulterazione: si verifica quando viene modificata
la composizione originale di un prodotto alimentare
r sofisticazione: consiste nell’aggiungere a un alimento sostanze estranee per migliorarne l’aspetto,
mascherandone alcuni difetti. Se il prodotto viene
addizionato con sostanze permesse, la sofisticazione
consiste nel superare le dosi consentite dalla legge
r falsificazione: si verifica quando un alimento viene
sostituito totalmente con un altro (olio di semi invece di olio d’oliva, margarina per burro)
r contraffazione: consiste nella commercializzazione
di un prodotto con indicazioni o marchi che possono trarre in inganno il consumatore (spumante etichettato come champagne).
12.6 Le carni
La carne costituisce indubbiamente un’ottima risorsa
nutritiva per l’alto contenuto di aminoacidi essenziali, di
proteine, di ferro e di vitamine del gruppo B. Dal punto
di vista dietetico non va però considerata la migliore oppure l’unica fonte di queste sostanze: altri alimenti (legumi, pesce, uova, latte, latticini) sono sorgenti di proteine altrettanto valide e preziose per un’alimentazione
equilibrata.
La carne viene definita come l’insieme delle masse
muscolari e dei tessuti connessi degli animali da macello
come ovini, bovini, suini, equini, caprini; di animali di
bassa corte o da cortile (pollame, tacchini, conigli); di
selvaggina.
Le cosiddette frattaglie comprendono cuore, fegato,
milza, reni, polmone, cervello; le animelle sono costituite da pancreas, timo e ghiandole salivari; con il nome di
trippa si intendono lo stomaco e il primo tratto dell’intestino dei ruminanti.
I muscoli sono costituiti da:
tessuto
connettivo: forma un sistema di membrane
❖
(epimisio, perimisio, endomisio) che avvolgono i
fasci muscolari e che alle due estremità del muscolo
formano i tendini
❖ tessuto muscolare: è formato da fasci muscolari a
loro volta costituiti da fibrocellule allungate contenenti proteine contrattili (actina e miosina). Sono
presenti altre importanti proteine come il collagene
e l’elastina (figura 12.3).
Nella carne è presente una certa quota di lipidi (8-9%) che
formano il grasso muscolare e quello adiposo, concentrato soprattutto nel tessuto sottocutaneo e nella cavità addominale. Sono presenti sali minerali, vitamine, composti
di riserva energetica come la fosfocreatina, molti enzimi e
la mioglobina, pigmento respiratorio dei muscoli. L’acqua
rappresenta il 50-80% del muscolo.
Poche ore dopo la macellazione di un animale subentra il rigor mortis o irrigidimento cadaverico, dovuto
al succedersi di una serie di eventi biochimici che hanno
come causa principale l’esaurirsi delle riserve energetiche di ATP muscolare: l’actina e la miosina si legano formando actomiosina, che fa accorciare e irrigidire i muscoli. In queste condizioni la carne non è ancora adatta
al consumo, in quanto deve prima subire un processo di
frollatura, che richiede 10-15 giorni, al termine del quale la carne si presenta tenera e pronta al consumo.
La frollatura della carne è un processo biochimico-biofisico in cui fenomeni di autolisi, determinati
dall’azione combinata di enzimi endocellulari che si liberano dopo la morte cellulare e di microrganismi, causano una parziale degradazione del tessuto connettivo
e muscolare. La contaminazione microbica delle carni
da macello è una diretta conseguenza delle condizioni
di allevamento, dello stato di salute dell’animale al momento della macellazione e naturalmente di quelle di lavorazione, lavaggio (toelettatura) e conservazione delle
carcasse.
Carni fresche e refrigerate
Le carni degli animali in vita sono molto probabilmente
sterili, condizione che viene inevitabilmente persa con
la macellazione. Le operazioni e le lavorazioni subite
dalle carcasse (eviscerazione, scuoiamento ecc.) porta-
166
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12
CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI
Un muscolo scheletrico è costituito
da fasci di fibre muscolari.
Fasci di fibre muscolari
Tendini
Tessuto connettivo
Muscolo
Nuclei
Membrana plasmatica
Miofibrilla
Singola fibra muscolare
(cellula)
Ogni fibra muscolare è una cellula
multinucleata che contiene numerose
miofibrille, a loro volta formate da
filamenti spessi di miosina e filamenti
sottili di actina molto ordinati.
Mitocondri
Banda M
Linea Z
Banda I
Singola
miofibrilla
I sarcomeri sono
le unità di contrazione.
Linea Z
Zona H
Banda A
Singolo sarcomero
Filamento di actina
Filamento di miosina
Titina
Figura 12.3 Struttura di un muscolo scheletrico.
no a una progressiva contaminazione delle masse muscolari, che comunque non si può ritenere pericolosa.
Lo stoccaggio delle carni in ambiente refrigerato (da 0
a +4 °C) blocca in modo considerevole la proliferazione microbica, impedendo lo sviluppo di germi mesofili.
Nella carne refrigerata possono accrescersi pressoché
esclusivamente germi psicrofili, quali Flavobacterium,
Achromobacter, Acinetobacter, Brochothrix thermosphacta, Mycobacterium e diverse specie di Pseudomonas.
Il genere Pseudomonas si può ritenere uno fra i maggiori responsabili di alterazione delle carni fresche,
anche se il più delle volte si tratta di fenomeni a carico
di un’ampia gamma di microrganismi. Nelle carni conservate in blocchi i microrganismi si sviluppano preva167
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12
CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI
I GERMI PSICROFILI
Brochothrix thermosfacta è un bacillo Gram-positivo, aerobio/anaerobio facoltativo, asporigeno, ossidasi negativo. È un batterio psicrofilo non patogeno,
ma può causare fenomeni degradativi nella carne se
in concentrazione elevata. L’isolamento si effettua su
STAA agar.
Pseudomonas è un bacillo Gram-negativo mobile,
aerobio obbligato, ossidasi positivo, asporigeno, ad
ampia diffusione ambientale e con un elevato grado
di versatilità metabolica. Alcune specie producono
pigmenti blu/verdi (piocianiana, pioverdina) e sono
frequentemente responsabili di alterazione degli alimenti. Il genere annovera specie patogene opportuniste per l’uomo e altre importanti per la biodegradazione di sostanze inquinanti come i derivati del
petrolio.
Achromobacter (figura 12.4) è un bacillo Gram-negativo aerobio obbligato, mobile, presente nel suolo e
nelle acque.
Figura 12.4 Achromobacter. L’immagine mostra il batterio
Achromobacter (fonte: CDC/Dr. Rodney M. Donlan).
lentemente in superficie, mentre in quelle macinate i
germi si sviluppano molto facilmente in tutta la massa
e la contaminazione risulta generalmente più elevata.
Il confezionamento della carne refrigerata può avvenire utilizzando film plastici permeabili o impermeabili
all’ossigeno, per cui si avrà lo sviluppo preferenziale di
germi aerobi, anaerobi o facoltativi a seconda dei casi. Se
in aerobiosi prevalgono batteri quali Pseudomonas e Brochothrix, in ambiente tendenzialmente anaerobio è prevedibile lo sviluppo di Lactobacillus. Le alterazioni più
comuni dovute a germi aerobi consistono nella comparsa di colorazioni anomale e di odori sgradevoli, aspetto
viscoso e mucillaginoso della superficie, mentre nel caso
di sviluppo di germi prevalentemente anaerobi si hanno
fenomeni putrefattivi e di inacidimento (tabella 12.1). Le
sostanze prodotte sono generalmente composti solforati
volatili, esteri degli acidi acetico e butirrico, ammine.
Carni congelate
Le caratteristiche organolettiche, di stabilità (per un
periodo che non dovrebbe superare i 18 mesi) e di accettabilità (momento in cui il consumatore non giudica
più accettabile l’alimento) della carne congelata dipendono essenzialmente, oltre che dalle qualità intrinseche
dell’alimento, dalla temperatura raggiunta al momento
del trattamento e da quella di conservazione, nonché
dalla velocità di penetrazione del freddo. Nel processo
di congelazione si raggiungono temperature di −40 °C o
anche inferiori, ma la bassa velocità di penetrazione del
freddo non riesce a impedire la formazione di grossolani
cristalli di ghiaccio che compromettono l’integrità delle
membrane cellulari, con una degradazione della qualità
della carne rispetto all’alimento fresco. Laddove invece,
come nella surgelazione, il freddo viene fatto penetrare
molto velocemente (capitolo 9) si raggiungono al massimo temperature di −18 °C, il periodo di conservazione
è indubbiamente più breve, ma le caratteristiche organolettiche vengono salvaguardate a tutto vantaggio della
qualità dell’alimento, paragonabile a quella del fresco.
Ciò è possibile perché i cristalli di ghiaccio che si formano sono di dimensioni molto inferiori e non provocano
alterazioni nelle strutture cellulari.
Dal punto di vista microbiologico occorre sottolineare come praticamente nessun microrganismo sia in
grado di moltiplicarsi a temperature così basse, che letteralmente “congelano” lo stato microbico della carne a
livello originario quando si rispettino ininterrottamente
le stesse temperature per tutto il periodo di conservazione. In realtà questo non sempre avviene: inconvenienti
o malfunzionamenti delle celle frigorifere durante il trasporto espongono la carne a contaminazione da parte di
germi psicrofili come lieviti e muffe che spesso si rinvengono all’interno di questi ambienti. Aumenti anche modesti della temperatura accompagnati da un minimo di
umidità disponibile possono innescare una più o meno
168
Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI
12
Tabella 12.1 Fenomeni alterativi nelle carni
O2
MICRORGANISMI
ALTERAZIONE
Presente
Batteri
Patina batterica superficiale (stime); colorazioni anomale; odori sgradevoli; decomposizione dei Iipidi
Presente
Lieviti
Patina batterica superficiale; colorazioni anomale; odori sgradevoli; decomposizione dei lipidi
Presente
Muffe
Callosità e ife fungine superficiali; colorazioni anomale; odori sgradevoli; decomposizione dei Iipidi
Assente
Batteri
Putrefazione con produzione di odori sgradevoli e nauseabondi; produzione di
gas; irrancidimento
Tabella 12.2 Controlli microbiologici consigliati per le carni bovine/ovine
TIPOLOGIA: CARNI BOVINE FRESCHE CONFEZIONATE – CARNI OVINE FRESCHE CONFEZIONATE
PARAMETRI
MICROBIOLOGICI
LIMITI
VALORI GUIDA
FONTE
BIBLIOGRAFICA
RIFERIMENTI NORMATIVI
Carica microbica totale
M = 106
m = 105
n=5c=2
Tiecco-1997
ISS 1985
Ordinanza del Ministero della Sanità del
7/12/93 - GU n. 291 del 13/12/93
Escherichia coli
M = 102
m = 10
n=5c=2
Tiecco-1997
ISS 1985
Ordinanza del Ministero della Sanità del
7/12/93 - GU n. 291 del 13/12/93
Stafilococco aureo
M = 102
m = 10
n=5c=2
Tiecco-1997
ISS 1985
Ordinanza del Ministero della Sanità del
7/12/93 - GU n. 291 del 13/12/93
Anaerobi solfito-riduttori
< 5 · 102/g
D.P.R. 01/03/92 n. 227
Salmonella spp.
Assenza in 25 g
n=5c=2
D.P.R. 01/03/92 n. 227
Legge n. 283/62 art. 5
Listeria monocytogenes
≤ 11/g in 1 u.c.
≤ 110/g in 2 u.c.
n=3c=2
O.M. 07/12/93
Per i criteri microbiologici in vigore vedi il Reg. CE 2073/2005 (Allegati 1 e 2) e successive modifiche, reperibile come approfondimento on-line.
Legenda:
M (UFC/g) = valore limite
m (UFC/g) = valore guida
n (UFC/g) = unità campionarie utilizzate
c (UFC/g) = numero delle unità campionarie il cui valore può essere compreso tra m e M
u.c. = unità campionarie
rapida riproduzione degli psicrofili. Questi microrganismi poi riescono a riprodursi in modo veloce o addirittura tumultuoso al momento dello scongelamento, che
non sempre viene fatto in modo corretto. Lo scongelamento infatti dovrebbe avvenire molto lentamente e a
bassa temperatura: al contrario processi troppo rapidi
portano a perdite della consistenza e del colore caratteristici delle carni.
Carne di pollo
La qualità microbiologica delle carni di pollame e dei
volatili in genere riflette quella delle condizioni di allevamento: poiché infatti la pelle rimane sempre parte
integrante dell’alimento fino al momento del consumo,
la popolazione microbica superficiale è quella maggiormente responsabile del tipo e dell’entità delle conta169
Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
12
CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI
Tabella 12.3 Controlli microbiologici consigliati per le carni di pollame
TIPOLOGIA: CARNI AVICOLE (prelievo effettuato su massa muscolare)
PARAMETRI
MICROBIOLOGICI
LIMITI
VALORI GUIDA
FONTE BIBLIOGRAFICA
RIFERIMENTI
NORMATIVI
Carica microbica totale
M = 107
m = 106
n=5c=2
Gelosa L in Industrie Alimentari - 1998; Ordinanza del Ministero della
Dossier Emilia Romagna, CDS Az. USL Sanità del 7/12/93 - GU n. 291
Città di Bologna e Ravenna “Centri di del 13/12/93
Produzione pasti”, guida per l’applicazione del sistema HACCP
Escherichia coli
M = 103
m = 102
n=5c=2
Gelosa L in Industrie Alimentari - 1998; Ordinanza del Ministero della
Dossier Emilia Romagna, CDS Az. USL Sanità del 7/12/93 - GU n. 291
Città di Bologna e Ravenna “Centri di del 13/12/93
Produzione pasti”, guida per l’applicazione del sistema HACCP
Anaerobi solfito-riduttori
M = 103
m = 102
n=5c=2
Gelosa L in Industrie Alimentari - 1998; Ordinanza del Ministero della
Dossier Emilia Romagna, CDS Az. USL Sanità del 7/12/93 - GU n. 291
Città di Bologna e Ravenna “Centri di del 13/12/93
Produzione pasti”, guida per l’applicazione del sistema HACCP
Stafilococco aureo
M = 103
m = 102
n=5c=2
Gelosa L in Industrie Alimentari - 1998; Ordinanza del Ministero della
Dossier Emilia Romagna, CDS Az. USL Sanità del 7/12/93 - GU n. 291
Città di Bologna e Ravenna “Centri di del 13/12/93
Produzione pasti”, guida per l’applicazione del sistema HACCP
Salmonella spp.
Assenza in 25 g
n=5c=2
Legge n. 283/62 art. 5
Listeria monocytogenes
≤ 11/g in 1 u.c.
≤ 110/g in 2 u.c.
n=5c=2
O.M. 07/12/93
Per i criteri microbiologici in vigore vedi il Reg. CE 2073/2005 (Allegati 1 e 2) e successive modifiche, reperibile come approfondimento on-line.
minazioni microbiche (tabella 12.3). Le operazioni di
eviscerazione e toelettatura delle carcasse possono rappresentare altrettante fonti di contaminazione, soprattutto nei riguardi delle contaminazioni da Salmonella, di
cui i polli sono assai spesso veri e propri serbatoi. Pseudomonas e Achromobacter sono i batteri che più spesso si
rendono responsabili di alterazioni superficiali come la
formazione di mucillagini e viscosità spesso accompagnate dallo sviluppo di odori disgustosi. Tali alterazioni compaiono in genere quando la carica microbica di
superficie raggiunge o supera valori di 108 UFC/cm2 di
pelle. Lo stoccaggio delle carcasse adeguatamente preparate a una temperatura refrigerata di 2-3 °C permette una conservazione di circa una settimana, prima che
si verifichino i primi sintomi di alterazione microbica.
Nelle carcasse congelate il rischio è rappresentato soprattutto dall’eventuale sviluppo di muffe.
Carni salate
Le carni salate comprendono vari prodotti di salumeria,
quali i prosciutti (crudi o cotti), la lonza, il capocollo, il
bacon. Affinché questi prodotti risultino di buona qualità sia dal punto di vista microbiologico che organolettico occorre che altrettanto buone siano le condizioni
della carne all’origine, e che ovviamente non subiscano contaminazioni pericolose durante la lavorazione e
la stagionatura. È opportuno perciò l’utilizzo di carni
prodotte in modo ottimale, nonché l’impiego di salamoie mantenute a bassa temperatura e il loro periodico, frequente rinnovo (capitolo 9). Il cloruro di sodio
e il potassio nitrito (salnitro) sono gli ingredienti delle
salamoie, impiegate a secco (per sfregamento superficiale) o per immersione del prodotto in una soluzione
di NaCl (10-30%), nitrati e nitriti (< 1%). L’azione del
170
Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI
sale determina un ambiente osmoticamente sfavorevole alla sopravvivenza dei microrganismi, nitrati e nitriti
contribuiscono a mantenere il colore rosso alle carni
ed esercitano anch’essi una certa azione antimicrobica.
Bassi valori di pH e di aw (intorno a 0,8) rappresentano altri fattori selettivi e di inibizione nei confronti di
molti microrganismi: i batteri alofili quali stafilococchi,
micrococchi e vibrioni generalmente sono gli unici che
sopravvivono nelle salamoie. I principali fenomeni alterativi cui sono soggette le carni salate vanno da odori e
colorazioni anormali all’irrancidimento (formazione di
grasso giallastro nei prosciutti) alla putrefazione, che
rappresenta il fenomeno più grave (souring o putrefazione acre-mefitica) dovuto allo sviluppo di germi proteolitici. Vibrio, Alcaligenes, Proteus, Clostridium, Bacillus
sono i batteri più frequentemente responsabili di tale
alterazione. Il prosciutto crudo può essere contaminato
da clostridi quando la carne non viene mantenuta a temperatura refrigerata prima della salatura.
12.7 Conserve e semiconserve in
recipienti a chiusura ermetica
(prodotti in scatola)
Dal punto di vista merceologico sono definiti conserve
(figura 12.5) i prodotti di origine animale, vegetale o misti che vengono sigillati ermeticamente in contenitori
e quindi sottoposti a trattamento termico che inattiva i
microrganismi e blocca le attività enzimatiche. Dal punto di vista microbiologico è corretto distinguere (capitolo 9):
❖ semiconserve: prodotti in contenitore sigillato
a trattamento termico moderato (70-80 °C o comunque inferiore ai 100 °C) che non uccide tutti i
microrganismi, ma elimina soprattutto i patogeni.
Questi prodotti si conservano per alcuni mesi in
quanto la presenza del contenitore evita il contatto
con l’aria e la possibilità di contaminazioni, ma anche per l’azione di additivi, per l’acidità del prodotto,
per l’impiego di basse temperature di conservazione
o per l’insieme di tutti questi fattori
❖ conserve: prodotti in contenitore sigillato sottoposti a trattamento termico effettuato a temperatura elevata, superiore a 100 °C. La sterilizzazione
(121 °C/15-20 min) elimina tutti i microrganismi
comprese le spore. La conservabilità in questo caso
12
Figura 12.5 Semiconserve. L’immagine mostra diversi tipi
di semiconserve (fonte: Shutterstock images, LLC).
si prolunga per anni ed è garantita dall’integrità del
contenitore che impedisce la ricontaminazione.
In realtà il significato stesso da attribuire al concetto di
trattamento di sterilizzazione genera spesso in ambito
merceologico-alimentare una certa confusione. Occorre
precisare che per le conserve alimentari molto spesso la
sterilità è intesa in senso merceologico o commerciale e
non microbiologico, anche se una tale distinzione non appare concettualmente corretta e coerente. È d’altra parte
intuitivo rendersi conto che i trattamenti termici molto
energici e relativamente lunghi propri della sterilizzazione portano a una degradazione delle qualità nutritive e
delle caratteristiche organolettiche del prodotto, di entità variabile in relazione alla composizione e alla natura
del prodotto stesso. Il concetto di sterilità commerciale
accetta quindi la presenza di spore nell’alimento in scatola, a condizione che queste non siano in grado di germinare, producendo le corrispondenti cellule vegetative
che possono elaborare tossine e causare intossicazioni o
tossinfezioni. I prodotti alimentari in contenitore sigillato
(conserve e semiconserve) devono quindi risultare stabili
nel tempo previsto di conservazione: in altre parole non
devono manifestare fenomeni di alterazione durante il
periodo di commercializzazione se conservati nelle normali condizioni.
Il pH del prodotto è un parametro di fondamentale importanza sotto il profilo igienico-sanitario e della
conservabilità, al fine di evitare gravi rischi biologici. Per
questo le conserve acide (pH < 4,5) sono sicure anche
se non subiscono trattamenti termici energici superiori
ai 100 °C. Le spore di Clostridium botulinum non germi171
Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
12
CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI
nano e non viene prodotta tossina se il pH dell’alimento
è inferiore a 4,5. La presenza di sale, di nitriti e nitrati,
nonché di bassi valori di aw contribuiscono a diminuire
la termoresistenza dei microrganismi.
I controlli di stabilità delle conserve vengono
eseguiti su un certo numero di campioni incubati a
temperature adatte a permettere lo sviluppo dei germi
eventualmente sopravvissuti al trattamento termico. Più
precisamente si incubano le confezioni in termostato a
30-32 °C per 20-30 giorni (germi mesofili) e a 55 °C per
7-10 giorni (germi termofili). Durante l’incubazione i
germi eventualmente presenti sviluppano, causando il
più delle volte rigonfiamenti e bombaggi nelle scatole.
Al termine dell’incubazione si valutano:
r modificazioni del contenitore
r alterazioni delle caratteristiche organolettiche del
prodotto e, nel caso della carne in scatola, liquefazione irreversibile della gelatina
r variazioni del pH.
I controlli di stabilità delle semiconserve vengono
condotti dopo incubazione a 30 °C per 4-5 giorni. La
stabilità di questi prodotti è garantita in buona misura,
oltre che dal trattamento termico, anche dall’aggiunta
di additivi e dalla temperatura di refrigerazione prevista
per la conservazione.
In entrambi i casi è consigliabile procedere anche a
indagini microbiologiche per l’isolamento e l’identificazione dei microrganismi eventualmente presenti.
Carni in scatola
Nel nostro Paese la produzione di carne in scatola risale
al 1881 ad opera di P. Sada, un cuoco che, riprendendo
le esperienze del francese Appert, sterilizzava la carne
inscatolata in soluzioni saline a 100-115 °C. L’industria
della carne in scatola nacque nel 1926, anno di fondazione della Simmenthal (dal nome della razza svizzera
di bovini da cui venivano ottenute le carni) ad opera di
uno dei suoi figli.
La preparazione della carne in scatola prevede il
taglio delle carni, la loro precottura, l’eliminazione di
buona parte del grasso e l’inscatolamento insieme con
la gelatina del brodo di cottura. Si procede poi alla chiusura ermetica, alla sterilizzazione, al raffreddamento e
all’etichettatura. Nella carne in scatola sono ammessi
diversi additivi: nitrati e nitriti per mantenere il colore
rosso, antiossidanti, addensanti e gelificanti (agar-agar),
glutammato di sodio come esaltatore di sapidità (capitolo 9). La conservazione della carne in scatola è garantita
dalla sterilizzazione con temperature e tempi variabili
a seconda delle dimensioni del prodotto e delle scelte
operative del produttore, con un trattamento minimo di
121,1 °C per 3 min.
12.8 I salumi
I prodotti che corrispondono alla definizione di salumi
sono molteplici e comprendono:
r insaccati freschi: salsicce
r insaccati stagionati: salami e cotechini
r insaccati cotti: mortadella, würstel, zampone
r non insaccati: prosciutto, bresaola, pancetta.
Gli insaccati sono costituiti da due componenti:
r l’impasto, preparato prevalentemente con carni suine (a cui si possono aggiungere percentuali diverse
di carni bovine, equine, di bufalo, pecora o capra),
addizionato di condimenti (droghe o spezie: pepe,
chiodi di garofano, noce moscata, cannella, paprica)
e additivi (polifosfati, coloranti, saccarosio, polvere
di latte, glutammato, acido ascorbico)
r un involucro naturale o artificiale. Gli involucri naturali sono costituiti da porzioni di intestino (“budelli”) o altre membrane dei visceri di suino e bovino accuratamente lavate e preparate, quelli artificiali
sono generalmente di origine vegetale (derivati della
cellulosa) o da film plastico. Dalle caratteristiche
igieniche e di qualità dell’involucro dipende in larga
misura la qualità dell’insaccato.
Le caratteristiche microbiologiche degli insaccati freschi riflettono quelle delle materie prime con cui sono
preparati, dell’ambiente di lavoro, degli utensili impiegati, dell’igiene degli operatori: le manipolazioni che subisce l’impasto sono ottime occasioni di contaminazione.
I microrganismi presenti in questi prodotti sono soprattutto coliformi, micrococchi, Pseudomonas, clostridi,
lieviti e muffe, che possono raggiungere cariche microbiche fino a 108 UFC/g o superiori (tabella 12.4). D’altra
parte gli insaccati freschi devono essere consumati cotti,
per cui i rischi per il consumatore dovrebbero essere
172
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12
PREPARAZIONE DEGLI INSACCATI
I salami vengono distinti in molte tipologie merceologiche in base alla composizione dell’impasto.
Milano (carne suina, bovina e lardo); Fabriano
(carne suina, bovina, lardo a cubetti, pesto); Felino
(solo carne e grasso di suino); Napoletano (suino,
bovino, grasso suino, aglio, pepe, vino); Cacciatorino
(impasto da salame non specificato, carne equina). I
salami vengono definiti prodotti fermentati ad opera
di colture starter di microrganismi (D.M. 28/12/94)
a concentrazione massima di 107 UFC/g di prodotto
per evitare sovramaturazione. Sono ammesse colture
di Lactobacillus, Pediococcus, Micrococcus, Debaryomyces, stafilococchi coagulasi negativi. Dopo l’insacco
possono venire distribuite sui budelli colture starter di
Penicillium. Il cotechino viene confezionato con carne
suina, grasso, cotenna, lardo, pesto. Per tutte le tipologie la stagionatura è di alcuni mesi (2-10).
Figura 12.6 Mortadella (fonte: www.wikipedia.com).
Lo zampone è preparato con carne suina, cotenna
lessata, grasso suino.
I würstel contengono carne bovina e grasso suino
salvo diversa indicazione.
La mortadella (figura 12.6) è preparata con carne
mista (suino, equino, bovino), polvere di latte, albumina, gelatina, vino bianco, pepe, aromi.
Tabella 12.4 Controlli microbiologici consigliati per gli insaccati
Alimento
Prodotti salati, crudi
e interi (prosciutto,
pancetta, bresaola
ecc.)
Prodotti crudi affettati
Prodotti cotti interi
(salame e salamelle,
spalla, mortadella,
lingua salmistrata
ecc.)
Prodotti cotti affettati
Prosciutto cotto
intero
Prosciutto cotto
affettato
Salami
Salsiccia di maiale,
cotechino ecc.
300 000
1 000
1 000
Microrganismi Salmonella
anaerobi solfi- /25 g
to-riduttori/g
100
25 Assente
1 000 000
1 000
1 000
100
25 Assente
30 000
100
100
100
25 Assente
500 000
100
100
100
25
10 000
100
50
50
5 Assente
10 000
3 000 000
Batteri lattici
30 000 000
Batteri lattici e
micrococchi
1 000 000
1 000
50
50
5 Assente
1 000
100
100
25 Assente
10 000
10 000
1 000
100 Assente
Microrganismi
aerobi/g
Coliformi/g
Streptococchi
fecali/g
Staphylococcus
aureus/g
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CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI
minimi. Negli insaccati stagionati il periodo di stagionatura serve a “maturare” quei prodotti che non vanno
consumati freschi: l’alimento subisce in questo modo
importanti modificazioni di carattere fisico, biochimico
e microbiologico. Il pH si stabilizza su valori acidi (5,5)
anche per l’aggiunta di microrganismi starter come i lattobacilli, ma l’evento più importante è la modificazione
della flora microbica. Gli enterobatteri praticamente
scompaiono dopo una decina di giorni, così come molti
altri Gram-negativi; le forme vegetative degli sporigeni
diminuiscono notevolmente, mentre le loro spore non
riescono a germinare; micrococchi e lattobacilli aumentano in modo considerevole e questi ultimi determinano il progressivo abbassamento del pH; le muffe non si
rinvengono nell’impasto. Lattobacilli e micrococchi
rappresentano quindi la componente microbica preponderante degli insaccati al termine del periodo di stagionatura: le particolari caratteristiche organolettiche
degli insaccati stagionati e pronti al consumo si devono
alla loro azione di selezione e d’inibizione nei confronti
degli altri microrganismi. Tale selezione si realizza attraverso la creazione e il mantenimento di bassi valori di
pH e una rapida fermentazione degli zuccheri presenti,
oltre a un insieme di altre complesse modificazioni che
si succedono nell’impasto.
Salumi non insaccati
Il prosciutto crudo stagionato rappresenta indubbiamente un prodotto di salumeria di alto valore nutritivo
(28 g di proteine/100 g di prodotto). Viene prodotto
con le cosce del maiale sottoposte a toelettatura, asportazione del grasso superfluo e salagione con massaggiamento in superficie con sale grosso (addizionato di
pepe e nitrati all’1%). L’operazione viene ripetuta più
volte a distanza di qualche giorno. Dopo la sosta di
un mese in celle frigorifere a 1-4 °C, i prosciutti vengono lavati in acqua calda e posti a stagionare per 1014 mesi in ambienti ben aerati. Durante il periodo di
stagionatura si verificano modificazioni biochimiche e
microbiologiche dovute soprattutto ai batteri lattici e
alla patina di muffa bianca che si sviluppa in superficie,
che conferiscono al prodotto le tipiche caratteristiche
organolettiche.
La bresaola è un salume prodotto con carne di manzo salata e stagionata che viene consumata cruda.
12.9 Latte e derivati
Latte e latticini rappresentano una fonte alimentare
molto importante per i principi nutritivi che apportano
alla dieta. La produzione di latte, yogurt e altri probiotici, quella dei formaggi, della ricotta, del burro e della
panna, dei gelati hanno enorme rilevanza anche sul piano economico.
Il latte
La definizione merceologica del latte è la seguente:
“prodotto integrale della mungitura totale e ininterrotta di una femmina lattifera sana, ben nutrita e non affaticata. In assenza di altre specificazioni per latte deve
intendersi il latte di vacca”. Il latte può essere di vacca,
pecora, capra, bufala; nel mondo viene utilizzato anche
latte di cavalla, renna, cammella e altre specie animali.
Il latte contiene, oltre all’acqua, glucidi, protidi, lipidi,
vitamine, sali minerali. Gli zuccheri, rappresentati dal
disaccaride lattosio (glucosio e galattosio) si trovano in
soluzione acquosa con sali minerali e vitamine; le proteine (caseina, lattoalbumina e lattoglobulina) sono
allo stato colloidale, i lipidi sono emulsionati. Il residuo secco del latte, che si ottiene dopo aver rimosso
l’acqua, è composto da glucidi per il 4,8%, da proteine
per il 3,3%, da lipidi per il 3,8% e da sali minerali per
lo 0,2%.
Fra le proteine, la caseina assume importanza fondamentale per la produzione dei formaggi (figura 12.7):
viene infatti fatta coagulare per azione del “caglio”, un
complesso enzimatico tradizionalmente estratto dallo
stomaco di vitelli lattanti, ma oggi ottenuto da ceppi
batterici geneticamente modificati. La cagliata viene poi
trasformata nei tanti tipi diversi di formaggio con l’innesto di microrganismi selezionati (fermenti lattici e/o
muffe) e in seguito a una più o meno lunga stagionatura in ambienti dedicati. Dalla cagliata si libera il siero o
latticello, fonte di proteine e da cui si può ottenere per
acidificazione la ricotta.
Importante anche dal punto di vista dei controlli
analitici è la presenza di enzimi, in particolare la perossidasi e la fosfatasi, la cui determinazione viene effettuata
per il controllo dei trattamenti termici cui viene sottoposto il latte crudo, e la reduttasi per un rapido controllo
della carica microbica:
174
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r la fosfatasi, un enzima che agisce nella scissione catalitica di esteri fosforici, è normalmente presente
nel latte crudo. Viene inattivata alla temperatura di
72 °C, corrispondente a quella di pastorizzazione, per
cui deve risultare assente nel latte pastorizzato
r la perossidasi catalizza la riduzione di perossidi e
viene inattivata da temperature superiori a 79 °C.
Assume importanza fondamentale a garanzia di un
trattamento di pastorizzazione corretto, cioè non effettuato ad alta temperatura: deve essere presente
nel latte pastorizzato; il latte “fresco” deve risultare positivo al test della perossidasi e negativo a
quello della fosfatasi
r la reduttasi è un enzima legato all’attività metabolica
dei microrganismi presenti nel latte, che consumano
ossigeno e producono sostanze riducenti: quanto
maggiore è il contenuto microbico di un campione,
tanto più rapida è la decolorazione di uno specifico indicatore redox (blu di metilene o resazurina).
Tempi di riduzione inferiori alle 2 h indicano una
qualità microbiologica inaccettabile del prodotto.
Il lattosio è lo zucchero principale del latte. Costituito
da glucosio e galattosio, questo disaccaride viene sintetizzato nella mammella a partire dal glucosio ematico.
L’intestino umano non può utilizzare direttamente gli
zuccheri complessi, che devono essere preventivamente
scissi nei monosaccaridi componenti. In molti adulti il
complesso di enzimi che assolvono a questa funzione
(indicato complessivamente come “lattasi”) non viene
sintetizzato o viene sintetizzato in quantità insufficiente. Questi soggetti presentano quindi un’intolleranza al
latte, la cui ingestione provoca notevoli disturbi intestinali (meteorismo e dissenteria). Poiché si tratta di un
enzima inducibile, la cui sintesi avviene esclusivamente
in presenza del substrato da degradare (in questo caso il
lattosio), l’intolleranza può essere la conseguenza di una
protratta disassuefazione al consumo di latte. In questi
casi si può utilizzare latte delattosato (in cui la scissione del disaccaride è compiuta artificialmente) o anche
yogurt e prodotti analoghi, in cui gran parte del lattosio
è stato fermentato e trasformato in acido lattico dai microrganismi di fermentazione.
I lipidi presenti nel latte sono essenzialmente gliceridi, fosfolipidi e colesterolo, che si trovano in emulsione
ma che tendono spontaneamente ad affiorare formando
uno strato superficiale di panna o crema. Nel processo di
12
Figura 12.7 Cagliatura del latte (fonte: www.wikipedia.com).
omogeneizzazione, cui viene normalmente sottoposto il
latte, i globuli di grasso vengono frammentati e le loro
ridotte dimensioni ne impediscono l’affioramento.
Il latte è un alimento pressoché completo, ricco di
vitamine (A, B12, tiamina, riboflavina, acido pantotenico), calcio, fosforo e potassio, ma risulta carente di ferro e rame, elementi che il feto accumula durante la vita
intrauterina e le cui riserve sono sufficienti per i primi 6
mesi circa di vita, dopodiché devono essere apportati dalla normale alimentazione. È interessante notare come le
femmine di ogni specie di mammiferi producano un latte
adatto alle caratteristiche della propria prole: l’uomo è
l’unica specie che si nutre anche del latte di specie diverse.
Nel latte crudo sono presenti anche cellule di provenienza ematica, soprattutto linfociti e granulociti, in
concentrazione mediamente di 300 000-500 000/mL di
latte. Una bassa concentrazione di cellule depone a favore di tecniche di allevamento e mungitura condotte con
un elevato standard igienico e di corretta conservazione
del latte alla stalla (uno dei criteri per definire il latte “di
alta qualità”).
Aspetti microbiologici
Il latte rappresenta un ottimo terreno di coltura per molti microrganismi: lasciato a sé, va incontro a una mas175
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siccia proliferazione microbica che in un paio di giorni
lo rende inutilizzabile. Il latte possiede una certa attività
antibatterica naturale, dovuta alla presenza di sostanze
che agiscono esclusivamente nelle ore immediatamente
successive alla mungitura, ma esauriscono la loro attività
dopo qualche ora. Tali sostanze sono:
r lactenine 1 e 2, batteriostatici che agiscono contro
streptococchi e lattobacilli
r agglutinine, anticorpi presenti nel colostro: oltre che
nei confronti di streptococchi e lattobacilli hanno
una discreta attività anche contro i coliformi
r lisozima, enzima ad ampio spettro batteriostatico
r sostanze inibitrici diverse, attive verso germi sporigeni anaerobi.
I microrganismi che si possono rinvenire nel latte hanno
varia provenienza:
r dalla mammella delle femmine lattifere in seguito a
patologie specifiche (mastiti) sostenute in massima
parte da streptococchi dei gruppi A, C e D: Streptococcus agalactiae, S. mastidis e S. uberis, o anche S.
pyogenes. Anche E. coli e altri coliformi sono frequentemente agenti di mastite
r germi di provenienza esterna che entrano nei dotti
galattofori dall’ambiente d’allevamento o da operazioni di mungitura igienicamente scorrette.
In un simile contesto appaiono di estrema importanza
sia le condizioni igieniche d’allevamento che l’immediata refrigerazione del latte dopo la sua mungitura: alla stalla, durante il trasporto e allo stabilimento di
lavorazione deve essere mantenuto a +4 °C. Il latte che
viene raccolto nei vari luoghi di produzione e da qui
inviato agli stabilimenti per essere trasformato in latte
pronto al consumo presenta dunque una certa carica
microbica in relazione ai fattori sopra ricordati, nel cui
ambito è possibile distinguere:
r microrganismi psicrofili: indesiderabili, appartenenti alle famiglie Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae e ai generi Alcaligenes, Achromobacter, Flavobacterium. Vi sono comprese specie proteolitiche,
aerobie e anaerobie, sporigene o meno, e specie lipolitiche (tabella 12.5)
r microrganismi acidificanti: fermenti lattici (Lactobacillus, Streptococcus, Pediococcus, Streptobacillus)
e propionici. Questi germi acidificanti hanno una
valenza positiva poiché, sviluppando acidità dalla
Tabella 12.5 Microrganismi psicrofili nel latte
GENERE
MICRORGANISMI
Enterobacteriaceae
Escherichia, Citrobacter,
Klebsiella, Enterobacter (cloacae, aerogenes, liquefaciens),
Hafnia, Serratia, Proteus,
Erwinia
Pseudomonadaceae
Pseudomonas (fluorescens,
aeruginosa, putida, putrefaciens), Aeromonas
Achromobacteriaceae
Alcaligenes, Achromobacter
Flavobacteriurn
fermentazione degli zuccheri inibiscono lo sviluppo
di altri germi dannosi, in particolare quelli proteolitici del gruppo Coli-Aerogenes e di quelli butirrici
che producono acido butirrico, acetico, idrogeno e
anidride carbonica. I batteri propionici (Propionibacterium jensenii, P. thoenii, P. acidipropionici) sono
indispensabili nella produzione e maturazione di
formaggi particolari come l’emmenthal, in cui sono
responsabili della caratteristica “occhiatura” e del
particolare sapore dovuto alla produzione di prodotti secondari della loro attività metabolica: aldeide
acetica e propionica, alcol etilico e propilico
r lieviti e muffe si sviluppano piuttosto lentamente
nel latte: alcuni generi sono impiegati per la preparazione di formaggi e latti fermentati come il kefir, uno
yogurt leggermente alcolico.
I trattamenti che il latte subisce prima di essere immesso
al consumo ne modificano lo stato fisico e ne garantiscono il risananamento microbiologico.
Con la filtrazione viene eliminato il sudiciume, con la
centrifugazione vengono dissolti gli ammassi microbici,
l’omogeneizzazione rende più piccoli e uniformi i globuli lipidici, conferendo al latte una maggiore digeribilità.
La sanitizzazione del latte si effettua con la pastorizzazione o la sterilizzazione.
Le malattie che più frequentemente sono trasmesse
attraverso l’ingestione di latte (e latticini) contaminati e
non pastorizzati sono:
r intossicazioni da tossina stafilococcica, a brevissimo
tempo d’incubazione (6 h)
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TRATTAMENTI TERMICI DEL LATTE
I trattamenti termici che può subire il latte al fine di
garantirne la sicurezza al consumo sono la pastorizzazione e la sterilizzazione.
Si distinguono secondo le vigenti normative 5 tipologie di latte pastorizzato:
r fresco pastorizzato di alta qualità
r fresco pastorizzato
r pastorizzato microfiltrato
r pastorizzato
r pastorizzato a temperatura elevata.
Per legge (Legge n. 169/89) il latte fresco pastorizzato è quello che ha subìto un unico trattamento di pastorizzazione a bassa temperatura (72 °C/15 s), confezionato entro 48 dalla mungitura, con fosfatasi negativa e
perossidasi positiva. Può essere intero o scremato, con
un contenuto in sieroproteine solubili non denaturate
non inferiore al 14% delle proteine totali. Quello fresco di alta qualità è solamente intero con un superiore
contenuto proteico (in sieroproteine solubili non denaturate non inferiori al 15,5% delle proteine totali) e con
caratteristiche microbiologiche particolari (alla stalla
CM < 100 000 UFC/mL); allo stabilimento CM <
r gastroenteriti da enterobatteri (salmonellosi, shigellosi ecc.)
r tossinfezioni da Clostridium perfringens
r infezioni da Pseudomonas
r infezioni da micobatteri (micobatteri tubercolari)
r brucellosi.
Infezioni, tossinfezioni e intossicazioni alimentari sono
trattate nel capitolo 11.
La crema o panna di latte
La panna si ottiene per centrifugazione o per un processo di affioramento naturale, lasciando a riposo il latte
intero e attendendo che i globuli di grasso risalgano in
superficie. L’affioramento spontaneo richiede in media
15 h alla temperatura di circa 15 °C e da questo si ottiene
panna acida con il 20% circa di grasso. La centrifugazione, con cui si ottiene la panna “dolce” perché il latte non
fa in tempo ad acidificare, rende più veloce e completo
12
300 000 UFC/mL). Può quindi subire una pastorizzazione più blanda (circa 2 °C inferiore a quella standard)
ma comunque igienicamente sicura.
Prima di essere pastorizzato il latte può subire anche una microfiltrazione su membrane filtranti in ceramica con pori di diametro pari a 1-2 μ.
Il latte pastorizzato a temperatura elevata non si
può definire fresco perché può subire due trattamenti
di pastorizzazione a 72 °C oppure uno solo a temperature comprese fra 80 °C e 135 °C per un tempo molto
breve (per es. 121 °C per 2-4 s oppure 135 °C per 1
s) con inattivazione della perossidasi, quindi confezionato asetticamente in contenitori. La conservazione si
prolunga fino a 15 giorni in ambiente refrigerato.
Latte trattato ad alta temperatura
Latte “a lunga conservazione”: il trattamento UHT
(uperizzazione) prevede temperature di 140/150 °C
mantenute per 1 o 2 s. Il prodotto si conserva chiuso
nella propria confezione per 180 giorni a temperatura
ambiente; una volta aperta la confezione, il latte va mantenuto in frigorifero e consumato entro qualche giorno.
Latte sterilizzato a 121 per 15 min: si conserva
fino a 6 mesi anche a temperatura ambiente.
il processo. La panna si può ottenere anche dal siero di
latte residuato dalla caseificazione. Viene pastorizzata
come il latte previa una sua disacidificazione e può essere consumata direttamente, utilizzata per produrre formaggi come il mascarpone o in pasticceria come panna
montata, oppure per produrre il burro.
Il controllo microbiologico della crema di latte prevede l’esclusione della presenza di E. coli. Un controllo
più completo può essere effettuato con la determinazione della carica microbica totale, la ricerca e il conteggio
dei coliformi, l’esecuzione del test al blu di metilene (reduttasi) dopo incubazione a 20 °C per 17 h.
Il burro
Il burro viene prodotto partendo dalla crema di latte o
panna dopo la sua pastorizzazione per eliminare batteri
patogeni eventualmente presenti. Si ottiene il burro di
panna dolce dalla lavorazione della panna come tale,
oppure la si può far acidificare naturalmente o con l’in177
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CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI
nesto di microrganismi selezionati dei generi Leuconostoc e Streptococcus. La panna così “maturata” conferisce
al burro qualità organolettiche migliori e una più lunga
conservabilità. Per diventare burro la panna subisce
un’operazione di zangolatura, consistente in un vigoroso e prolungato sbattimento che ha come conseguenza
la coalescenza dei globuli di grasso in agglomerati, con
l’interposizione di vacuoli che contengono acqua, lattosio e sali minerali. Il successivo impasto di questi granuli
forma una massa compatta e omogenea, cioè il burro.
Nel burro i microrganismi non riescono ad accrescersi facilmente e le alterazioni cui può andare incontro il
prodotto sono prevalentemente di natura chimica (irrancidimento). Dalla burrificazione della crema di latte
residua il latticello, che viene utilizzato nell’alimentazione dei polli e dei maiali.
Il controllo microbiologico del burro (tabella 12.6)
prevede la determinazione della carica batterica totale,
la ricerca dei coliformi, di Listeria monocytogenes, degli
stafilococchi patogeni e delle salmonelle. Questi batteri
devono risultare assenti. Possono essere ricercati anche
microrganismi alterativi come i batteri proteolitici e lipolitici.
I formaggi
Il formaggio è il prodotto della maturazione della cagliata, ottenuta per azione enzimatica o acida. Per la
produzione dei formaggi viene impiegato latte di vacca, pecora, capra, bufala o misto: dalla qualità intrin-
seca del latte e dalla sua provenienza, oltre che dalle
tecniche di preparazione e stagionatura, dipendono
le caratteristiche finali del prodotto. Si può impiegare
latte intero, a cui può essere aggiunta anche una certa
percentuale di panna, oppure completamente o parzialmente scremato. I formaggi da consumare freschi
richiedono la preventiva pastorizzazione del latte,
mentre per quelli a lunga maturazione le modificazioni
che intervengono durante la stagionatura garantiscono
l’eliminazione dei patogeni eventualmente presenti, a
condizione di rispettare le norme di igiene e di buona
prassi di produzione. La caseina, principale proteina
del latte, viene fatta precipitare con l’aggiunta del caglio o presame, complesso multienzimatico (rennina,
pepsina ecc.) estratto dall’abomaso di vitelli lattanti,
agnelli o capretti. Oggi si impiegano enzimi di origine
microbica, ottenuti da ceppi batterici geneticamente
modificati.
La caseina precipita assumendo in ambiente acido
una consistenza gelatinosa, la cagliata (paracaseinato
di calcio), da cui si separa una parte liquida (il siero
di latte). La caseificazione viene effettuata in caldaie di
grandi dimensioni, dove la cagliata forma un ammasso
consistente ed elastico. La cagliata può essere cotta o
meno, quindi subisce una salatura, l’eventuale innesto
di microrganismi selezionati e una stagionatura per
periodi diversi che portano alla produzione del formaggio maturo e pronto al consumo.
Durante la stagionatura l’impasto subisce trasformazioni ad opera di enzimi e di microrganismi che ne
modificano aspetto, consistenza, odore, sapore e aro-
Tabella 12.6 Controlli microbiologici consigliati per il burro
TIPOLOGIA: BURRO
PARAMETRI
MICROBIOLOGICI
LIMITI
VALORI GUIDA
RIFERIMENTI
NORMATIVI
Coliformi
M = 10
m=0
n=5c=2
D.P.R. 14/01/1997 n. 54
Stafilococco aureo
< 102/g
Allegato al titolo IV del Reg. Loc. Ig. BURL 15/05/1993
Muffe
< 102/g
Allegato al titolo IV del Reg. Loc. Ig. BURL 15/05/1993
Listeria monocytogenes
Assenza in 1 g
D.P.R. 14/01/1997 n. 54
Salmonella spp.
Assenza in 25 g
n=5c=0
D.P.R. 14/01/1997 n. 54
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ma, conferendo a ogni formaggio i caratteri tipici che
lo contraddistinguono. La produzione di acido lattico
ad opera di fermenti lattici modifica il pH rendendolo inadatto allo sviluppo di batteri putrefattivi e rende
contemporaneamente la pasta più elastica e compatta.
In formaggi particolari come il groviera e l’emmenthal
l’azione di batteri propionici è all’origine della tipica
occhiatura della pasta per sviluppo di CO2. Fenomeni
di degradazione proteica e lipidica portano allo sviluppo dei composti responsabili del gusto e dell’aroma del
prodotto maturo (aminoacidi, chetoacidi, acidi grassi a
corta catena).
Si distinguono formaggi:
r freschi (crescenza, taleggio) a breve maturazione e
con alto contenuto di acqua; a media o lunga stagionatura
r crudi, cotti o semicotti (grana) a basso contenuto in
acqua e lunga stagionatura
r a pasta filata (mozzarella, caciocavallo, scamorza,
provolone), preparati con la “filatura” della cagliata,
particolarmente elastica, in acqua calda (75-90 °C)
r fusi, ottenuti dalla fusione di altri formaggi in caldaia
sottovuoto a 70-75 °C.
sono naturalmente più a rischio di quelli stagionati, nei
quali il periodo di maturazione porta a una selezione
microbica che tende a eliminare le specie patogene. In
formaggi a pasta molle come le mozzarelle (formaggio
cotto a pasta filata) e nei tanti formaggi crudi si possono
rinvenire enterobatteri, micobatteri, stafilococchi coagulasi positivi, oltre a lattobacilli e streptococchi lattici.
Questi prodotti si devono comunque considerare facilmente contaminabili. Nei formaggi a pasta dura le condizioni microbiologiche sono mediamente migliori.
Il controllo microbiologico dei formaggi prevede
(tabella 12.8):
r la determinazione della carica microbica totale a
32 °C
r il conteggio dei coliformi
r la ricerca di miceti, di E. coli, di Salmonella, degli
stafilococchi coagulasi positivi, oltre all’eventuale
ricerca di Brucella, Shigella, Clostridium botulinum,
Listeria monocytogenes.
Nelle produzioni industriali standardizzate vengono di
norma impiegati ceppi di colture selezionate che sostituiscono i microrganismi utili eliminati dal trattamento di pastorizzazione. Si tratta di ceppi di Streptococcus
lactis, S. cremoris, S. thermophilus, Lactobacillus casei, L.
bulgaricus, L. helveticus. Batteri propionici vengono impiegati nella produzione dell’emmenthal, mentre muffe
quali Penicillium roqueforti e P. glaucum sono utilizzati
nella preparazione del roquefort e del gorgonzola (tabella 12.7).
Dalla rottura della cagliata si ottiene il siero di latte,
ancora ricco di lattoalbumina, grassi e lattosio, con una
percentuale di acqua del 93% circa. Questo importante sottoprodotto della produzione del formaggio può
essere nuovamente acidificato con latte acido e cotto
nuovamente a 80 °C per ottenere la ricotta, che per definizione non è propriamente un formaggio ma che, per
il suo ridotto contenuto in grassi (12%) e per le proteine
presenti è da considerarsi un alimento ottimo e molto
digeribile. Il siero di latte viene anche utilizzato per la
produzione di acido lattico e nell’alimentazione del bestiame.
Dal punto di vista microbiologico i formaggi freschi
La produzione di latte fermentato, yogurt e formaggi è
diffusa in molte regioni del mondo, ognuna caratterizzata dall’impiego di latte di diversa origine (vacca, pecora,
capra, giumenta, cammella ecc.) e di tecniche diverse,
tradizionali o moderne. Anche in questo caso l’origine
di queste trasformazioni risale a tempi remoti e a produzioni che sicuramente ebbero origine da eventi casuali,
probabilmente dalla constatazione che il latte, acidificando, cambiava consistenza e sapore ma poteva essere
conservato più a lungo (paragrafo 6.5).
12.10 Yogurt e latti fermentati
Yogurt
La produzione dello yogurt prevede innanzitutto la
pastorizzazione del latte (che rappresenta la materia prima) e la successiva inoculazione con ceppi selezionati
di Lactobacillus bulgaricus e Streptococcus thermophilus
(nella proporzione ottimale di 1:1), che rappresentano i
fermenti lattici di riferimento. Per la produzione di altri prodotti probiotici si possono impiegare anche altri
microrganismi, fra cui Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus acidophilus e L. casei.
179
Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
12
CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI
Tabella 12.7 Alcuni formaggi e relativi microrganismi produttori
MICRORGANISMI IMPIEGATIa
FORMAGGIO
(PAESE DI ORIGINE)
FASI INIZIALI
DELLA PRODUZIONE
FASI TERMINALI
DELLA PRODUZIONE
Lactococcus lactis
L. cremoris, L. diacetylactis, S. thermophilus
Lactobacillus bulgaricus
S. thermophilus, Lactobacillus bulgaricus
Leuconostoc cremoris
Molle, stagionato
Brie (Francia)
Lactococcus lactis, L. cremoris
Camembert (Francia)
L. lactis, L. cremoris
Penicillium camemberti,
P. candidum, Brevibacterium linens
Penicillium camemberti,
Brevibacterium linens
Semimolle
Blue (Francia)
Brick (Stati Uniti)
Limburger (Belgio)
Monterey (Stati Uniti)
Muenster (Stati Uniti)
Roquefort (Francia)
Lactococcus lactis, L. cremoris
L. lactis, L. cremoris
L. lactis, L. cremoris
L. lactis, L. cremoris
L. lactis, L. cremoris
L. lactis, L. cremoris
Penicillium roqueforti
Brevibacterium linens
Brevibacterium linens
Duro, stagionato
Cheddar (Gran Bretagna)
Colby (Stati Uniti)
Edam (Olanda)
Gouda (Olanda)
Swiss (Svizzera)
Lactococcus lactis, L. cremoris, E. durans
L. lactis, L. cremoris, E. durans
L. lactis, L. cremoris
L. lactis, L. cremoris, L. diacetylactis
L. lactis, L. helveticus, S. thermophilus
Lactobacillus casei, L. plantarum
L. casei
Lactococcus lactis,
L. cremoris, S. thermophilus
Lactobacillus bulgaricus
Molle, non stagionato
Tipo “cottage”
Cremoso
Mozzarella (Italia)
Molto duro, stagionato
Parmigiano (Italia)
Brevibacterium linens
Penicillium roqueforti
Propionibacterium shermanii,
P. freudenreichii
a
Lactococcus lactis sta per L. lactis spp. cremoris, e Lactococcus diacetylactis per L. lactis spp. diacetylactis.
Fonte: Adattata da Prescott et al. cit.
Dal punto di vista biochimico la produzione dello
yogurt consiste essenzialmente nella fermentazione
lattica, con la trasformazione del lattosio in acido lattico ad opera dei microrganismi inoculati. Il disaccaride
lattosio viene innanzitutto demolito nei monosaccaridi componenti (glucosio e galattosio) ad opera della
β-galattosidasi (lattasi), cui segue la conversione del galattosio in glucosio (figura 12.8). Al termine della glicolisi l’acido piruvico, che ne rappresenta il prodotto finale,
viene trasformato dalla lattico-deidrogenasi in acido lattico e dalla piruivato-decarbossilasi in acetaldeide, che
impartisce allo yogurt il caratteristico sapore e aroma.
Acetilmetilcarbinolo e diacetile sono altri prodotti secondari del catabolismo del lattosio. L’intero processo
Lattosio
CH2OH
O
CH2OH
O
HO
O
OH
+
OH
H2O
OH
OH
OH
OH
CH2OH
HO
OH
O
OH
+
OH
Galattosio
CH2OH
β-galattosidasi
O
OH
OH
HO
Glucosio
Figura 12.8 Idrolisi del lattosio.
180
Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
OH
CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI
12
Tabella 12.8 Controlli microbiologici consigliati per alcuni formaggi e per la ricotta di vacca
TIPOLOGIA: CRESCENZA/MOZZARELLA (formaggi freschi a pasta molle)
PARAMETRI
MICROBIOLOGICI
LIMITI
VALORI GUIDA
RIFERIMENTI
NORMATIVI
Escherichia coli
M = 103
m = 102
n=5c=2
Allegato al titolo IV del Reg. Loc. Ig. BURL 15/05/1993
D.P.R. 14/01/1997 n. 54
Coliformi (a 30 °C)
M = 105
m = 104
n=5c=2
D.P.R. 14/01/1997 n. 54
Stafilococco aureo
M = 103
m = 102
n=5c=2
Allegato al titolo IV del Reg. Loc. Ig. BURL 15/05/1993
D.P.R. 14/01/1997 n. 54
Salmonella spp.
assenza in 25 g
n=5c=0
D.P.R. 14/01/1997 n. 54
Listeria monocytogenes
assenza in 25 g
n=5c=0
D.P.R. 14/01/1997 n. 54
TIPOLOGIA: RICOTTA DI VACCA
Escherichia coli
< 10/g
2
Allegato al titolo IV del Reg. Loc. Ig. BURL 15/05/1993
Stafilococco aureo
< 10 /g
Allegato al titolo IV del Reg. Loc. Ig. BURL 15/05/1993
Salmonella spp.
Assenza in 25 g
Allegato al titolo IV del Reg. Loc. Ig. BURL 15/05/1993
D.P.R. 14/01/1997 n. 54
Listeria monocytogenes
Assenza in 1 g
D.P.R. 14/01/1997 n. 54
porta anche a una parziale demolizione delle proteine,
che aumenta la digeribilità del prodotto.
Il latte impiegato per la preparazione di yogurt può
essere intero o scremato, deve avere una bassa carica
microbica e risultare esente da sostanze antibatteriche,
presentare un alto contenuto in proteine e un contenuto
lipidico fra lo 0,5 e l’1%. Lo yogurt deve avere acidità
compresa fra 4 e 4,5 con un contenuto in acido lattico
non inferiore allo 0,8%.
L’associazione di Lactobacillus bulgaricus e Streptococcus thermophilus nella preparazione dello yogurt
può essere considerata una forma di simbiosi o quanto
meno di cooperazione: infatti S. termophilus richiede la
presenza di aminoacidi, fra cui la valina, e di peptidi.
Questi componenti sono assenti come tali nel latte, ma
vengono forniti dai lattobacilli, che possiedono aminopeptidasi e proteasi che li rendono disponibili. D’altra
parte L. bulgaricus richiede una certa concentrazione
di CO2, acido piruvico e acido formico, che vengono
messi a disposizione dall’attività metabolica iniziale da
S. thermophilus. Lo sviluppo di entrambi i batteri si arti-
cola in due fasi: nella prima, avvantaggiato dall’attività
proteolitica dei lattobacilli, si sviluppa più velocemente
S. thermophilus, mentre nella seconda fase di sviluppo
è favorito L. bulgaricus, che può utilizzare le sostanze
messe a disposizione dagli streptococchi. La crescita di
questi ultimi viene fra l’altro inibita dall’ambiente acido
creatosi.
La formazione di acido lattico dalla fermentazione del lattosio crea un ambiente a pH di circa 4,6 che
provoca la destabilizzazione del complesso calciofosforo-caseinato e la formazione del coagulo. I fermenti lattici sopra ricordati sono in grado di produrre
polisaccaridi, che quando sono in eccesso determinano
un aspetto viscoso e filante dello yogurt: è importante
quindi selezionare e scegliere ceppi medio-acidificanti
e basso-produttori di polisaccaridi. Un’eccessiva acidificazione può portare alla presenza di siero alla superficie del coagulo, mentre se è troppo scarsa si produce
yogurt di consistenza troppo liquida. Ceppi microbici
non adatti o in qualche modo inquinati (quindi non più
colture pure) possono portare a yogurt di consistenza
181
Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
12
CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI
e tessitura non omogenea, sabbiosa e con presenza di
granulazioni.
La produzione dello yogurt (figura 12.9) comprende una prima fase comune a tutte le tipologie di prodotto, che si articola nella scelta del latte da utilizzare, nella
sua filtrazione, concentrazione e omogeneizzazione (la
concentrazione influisce decisamente su consistenza e
densità dello yogurt), in un trattamento di pastorizzazione (90-95 °C per 5 min) e nel successivo raffreddamento a 36-44 °C, che rappresenta l’intervallo di temperatura ottimale per i fermenti lattici. Temperature più
basse (40 °C) favoriscono gli streptococchi e la produzione di yogurt meno acido, mentre quelle superiori
(44 °C) sono più favorevoli ai lattobacilli e danno generalmente un prodotto caratterizzato da maggior acidità.
La prima fase termina con l’inoculo delle colture starter
nella proporzione dell’1-3% di latte.
La seconda fase della produzione si differenzia in
base al tipo di yogurt che si desidera ottenere; a questo
punto inoltre si può effettuare l’aggiunta di frutta in pezzi o come succo.
Per ottenere yogurt a coagulo compatto o intero
si fa avvenire la fermentazione direttamente nella singola confezione di vendita per un tempo variabile da 2
a 10 h a 43 °C di temperatura media; lo yogurt viene poi
raffreddato a 6 °C e conservato a 4 °C.
Lo yogurt cremoso o a coagulo rotto viene prodotto in fermentatore con rottura lenta e uniforme del
coagulo, raffreddato e quindi confezionato in vasetti
e conservato a 4 °C. Lo yogurt da bere è prodotto in
condizioni simili al precedente ma subisce un’omogeneizzazione a 250 atmosfere che rende il coagulo molto
fluido, quindi è raffreddato, confezionato e conservato
a 6 °C.
Latti fermentati probiotici
LATTE
Filtrazione
Titolazione
Evaporazione
Omogenizzazione a circa 200 atm
Pastorizzazione a 90-95 °C per 5-6 min
Raffreddamento a 45 °C circa
Inoculo con starter
L. delbrueckii e S. thermophilus
in rapporto 1/1 o 1/2
Eventuale
aggiunta di frutta
e fermentazione
nelle confezioni
per 8-14 h a
43-44 °C
Eventuale
aggiunta di frutta
e fermentazione
nei tank
per 8-12 h a
43-44 °C
Eventuale
aggiunta di frutta
e fermentazione
nei tank
per 8-14 h a
43-44 °C
Raffreddamento
a 15-20 °C
Raffreddamento
a 15-20 °C e
confezionamento
Raffreddamento
a 15-20 °C e
confezionamento
Yogurt compatto
o a coagulo intero
Yogurt cremoso
o a coagulo rotto
Yogurt da bere
Figura 12.9 Schema del processo di produzione dello
yogurt.
Con il termine di microrganismi probiotici si indicano i microrganismi in grado di superare la barriera gastrica, aderire alla mucosa intestinale e riprodursi. Tali
batteri sono contenuti in una variegata gamma di prodotti a base di latte. Fra questi i più utilizzati sono Lactobacillus casei, L. acidophilus e il genere Bifidobacterium,
abbondante nell’intestino del neonato. Quest’ultimo,
insieme al genere Bacteroides e con altri batteri anaerobi
presenti nell’intestino dell’adulto, costituisce una comunità di microrganismi che, aderendo alla mucosa intestinale, svolge un’azione difensiva contro dismicrobismi
intestinali e malattie correlate, mantenendo il corretto
equilibrio delle funzioni intestinali e fornendo anche
all’organismo vitamine e altri elementi utili. I prodotti
probiotici sono principalmente latti fermentati o yogurt contenenti bifidobatteri (Bifidobacterium bifidus,
longum, infantis), Lactobacillus acidophilus e altri batteri
lattici in grado di arrivare e sopravvivere vitali nell’intestino. Non si confondano i probiotici con i prebiotici,
denominazione riferita a fibre non digeribili che favoriscono indirettamente l’attecchimento, la proliferazione
e l’attività benefica dei microrganismi probiotici a livello
intestinale.
Le caratteristiche di qualità dello yogurt sono legate essenzialmente a quella del latte impiegato e alla
presenza di un congruo numero di fermenti lattici (ta-
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Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI
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Tabella 12.9 Controlli microbiologici consigliati per lo yogurt
TIPOLOGIA: YOGURT CONFEZIONATO
PARAMETRI
MICROBIOLOGICI
LIMITI
VALORI GUIDA
RIFERIMENTI
NORMATIVI
Batteri lattici
< 106/g
Allegato al titolo IV del Reg. Loc. Ig. BURL 15/05/1993
Rapp. ISTISAN 26/63
Coliformi
≤ 10/mL
Allegato al titolo IV del Reg. Loc. Ig. BURL 15/05/1993
Rapp. ISTISAN 26/63
Stafilococco aureo
≤ 10/mL
Allegato al titolo IV del Reg. Loc. Ig. BURL 15/05/1993
Rapp. ISTISAN 26/63
Listeria monocytogenes
Assenza in 1 g
D.P.R. 14/01/1997 n. 54
Salmonella spp.
Assenza in 25 g
n=5c=0
D.P.R. 14/01/1997 n. 54
bella 12.9).
Valori accettabili si aggirano, sia per lattobacilli che per streptococchi, intorno a 109 cellule/mL.
Non devono naturalmente essere presenti batteri saprofiti indesiderabili, coliformi, muffe o lieviti. Le muffe agiscono alcalinizzando il substrato e preparando la
colonizzazione da parte di germi proteolitici, mentre i
lieviti si rinvengono soprattutto negli yogurt alla frutta, dove sono responsabili di produzione di gas e aromi
sgradevoli.
Kefir
Il kefir è una bevanda ottenuta dall’azione fermentativa congiunta di batteri lattici, acetici e lieviti. Il kefir
ha caratteristiche organolettiche peculiari, dovute alla
presenza di acido lattico, acido acetico ed etanolo. I microrganismi che si rinvengono nelle colture starter sono
innumerevoli (tabella 12.10) e formano i “granuli di kefir” di consistenza gelatinosa la cui matrice è composta
da polisaccaridi e proteine. La popolazione microbica
forma un ecosistema complesso, formato da batteri lattici (in maggioranza lattobacilli omofermentanti, da 106
a 109 UFC/mL), batteri acetici, lieviti (Candida kefyr e
Kluyveromyces marxianus in grado di fermentare il lattosio, oltre a Saccharomyces che non lo fermenta). La presenza dei lieviti è responsabile della produzione di alcol
etilico (0,1-2%), di vitamine, aminoacidi e fattori di crescita diversi utilizzati dai batteri, che a loro volta cedono
ai lieviti diversi metaboliti utili. I lieviti contribuiscono
inoltre in modo determinante a conferire al prodotto
l’aroma caratteristico. Osservazioni al microscopio elettronico hanno evidenziato come i rapporti fra le due comunità microbiche siano in effetti assai stretti, al punto
che ogni cellula di lievito appare circondata da un notevole numero di cellule batteriche.
La produzione del kefir prevede le seguenti fasi:
r pastorizzazione del latte per evitare possibile antagonismo microbico con i microrganismi del kefir
r omogeneizzazione
r inoculo con granuli di kefir in ragione del 5-10%
r fermentazione (18-24 h a 20 °C)
r raffreddamento a 10 °C
r filtrazione e confezionamento
Tabella 12.10 Alcuni fra i principali microrganismi dei
granuli di kefir
BATTERI
LIEVITI
Lactobacillus spp.
Kluyveromyces marxianus
Lactococcus spp.
Candida kefyr
Streptococcus thermophilus
Saccharomyces cerevisiae
Leuconostoc mesenteroides
Torulospora delbrueckii
Pediococcus spp.
Pichia fermentans
Micrococcus spp.
Brettanomyces anomalus
Acetobacter spp.
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12
CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI
Tabella 12.11 Controlli microbiologici consigliati per i gelati
TIPOLOGIA: GELATO A BASE DI LATTE
PARAMETRI
MICROBIOLOGICI
LIMITI
VALORI GUIDA
RIFERIMENTI
NORMATIVI
Carica microbica totale 32 °C
M = 105
m = 105
n=5c=2
D.P.R. 14/01/1997 n. 54
Coliformi totali
M = 102
m = 10
n=5c=2
D.P.R. 14/01/1997 n. 54
Stafilococco aureo
M = 102
m = 10
n=5c=2
D.P.R. 14/01/1997 n. 54
Salmonella spp.
Assenza in 25 g
n=5c=0
D.P.R. 14/01/1997 n. 54
Listeria monocytogenes
Assenza in 1 g
D.P.R. 14/01/1997 n. 54
r maturazione (24 h a 4 °C). In questa fase il kefir matura e affina le proprie caratteristiche organolettiche
r conservazione a 4 °C fino a un massimo di 10 giorni.
La composizione del kefir può variare in relazione
all’area geografica di produzione; è considerato comunque una bevanda acido-alcolica con proprietà probiotiche, profilattiche e terapeutiche. Risulta nutriente per la
presenza di aminoacidi essenziali e peptidi vari e anche
molto digeribile. Gli vengono attribuite anche proprietà
antitumorali e ipocolesterolizzanti.
12.11 I gelati
Questi derivati del latte vengono conservati a
−25/−30 °C, temperature alle quali alcuni microrganismi possono sopravvivere. Le possibili contaminazioni
riguardano le diverse fasi della lavorazione, a partire dalle materie prime utilizzate: in primo luogo latte, uova,
panna e burro. La massima attenzione deve essere posta
all’igiene personale degli addetti alla lavorazione e alla
vendita, a quella degli ambienti di lavoro e a quella dei
contenitori e utensili utilizzati.
I controlli da effettuare riguardano la determinazione della CBT, la ricerca e il conteggio di E. coli e dei
coliformi, quella di Staphylococcus aureus, quella delle
salmonelle (tabella 12.11).
12.12 Uova e derivati
Le uova sono un alimento ad alto valore nutritivo, ricche
di proteine e aminoacidi essenziali nonché di lecitine,
vitamine, calcio, ferro, fosforo. Sono costituite da guscio,
albume e tuorlo.
Il tuorlo è una cellula-uovo, costituita pressoché totalmente dal citoplasma. Dovendo provvedere alla nutrizione dell’embrione, è molto ricco di sostanze nutritive
(lipoproteine e fosfoproteine, trigliceridi, lecitine, colesterolo). Sul tuorlo si trova la vescicola germinativa, corrispondente al nucleo femminile: da questa si sviluppa
l’embrione quando l’uovo viene fecondato. Il tuorlo è racchiuso da una sottilissima membrana e circondato dall’albume, mantenuto in posizione centrale da due cordoni
(calaze). Durante il passaggio nell’ovidutto il tuorlo viene
circondato dall’albume e quindi ricoperto dal guscio.
L’albume è formato in massima parte di proteine
(ovoalbumina), ma contiene anche sali minerali, vitamine ed enzimi.
Il guscio è formato da tre strati di materiale: una cuticola esterna, uno strato intermedio e una membrana
testacea (formata a sua volta da due foglietti di cheratina) che lo separa dall’albume. La camera d’aria che si
trova a uno dei poli dell’uovo si forma per separazione
di un tratto dei due foglietti, e aumenta di volume con
l’invecchiamento dell’uovo. Il guscio costituisce una riserva di calcio ed è una barriera protettiva ma allo stesso
184
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12
CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI
Tabella 12.12 Controlli microbiologici consigliati per le uova
Alimento
Microrganismi
aerobi/g
Coliformi/g
Streptococchi
fecali/g
Staphylococcus
aureus/g
Microrganismi anaerobi
solfitoriduttori/g
Salmonella/25 g
Uova crude
500 0005 000 000
500
50
50
Assenti
Assente
tempo permeabile, per consentire gli scambi respiratori
al pulcino.
Le uova sono un alimento nutritivo e risultano facilmente digeribili se cotte senza l’aggiunta di grassi, ma
controindicate nella calcolosi biliare: possono provocare
infatti in questo caso spasmi assai dolorosi (coliche). Va
sottolineato che la composizione delle uova è influenzata
dal tipo di alimentazione della gallina: aumentando per
esempio la quota di mais e soia si ottengono uova più ricche di acidi grassi insaturi come il linolenico, da preferire
quindi ad altri alimenti che ne sono carenti. Un’alimentazione ricca di olio di pesce aumenta nelle uova la quota di
acidi grassi omega-3 che hanno un’azione protettiva nei
confronti delle patologie cardiovascolari, mentre fornendo alle ovaiole gli adatti precursori (per es. α-tocoferoli)
si può aumentare la concentrazione di vitamine A ed E.
Dal punti di vista merceologico (D. Lgs. 11/12/2009)
si distinguono uova:
r di categoria A, fresche e destinate al consumo diretto
r di categoria B, destinate alle industrie alimentari e non.
La contaminazione microbica delle uova può verificarsi prima della deposizione da parte di microrganismi
che infettano la gallina o per successivi contatti con l’ambiente esterno (tabella 12.12). Le condizioni igieniche
dell’allevamento e un’assidua vigilanza sanitaria sulle
produttrici sono i primi requisiti per ottenere prodotti
di qualità. Occorre quindi verificare lo stato di salute degli animali, l’idoneità delle strutture, effettuare periodici
controlli sull’eventuale presenza di infezioni microbiche,
adottare le misure per circoscrivere ed eliminare le situazioni di rischio. Le salmonelle sono il più delle volte di
provenienza esterna, dalle feci delle galline o dalla lettiera, ma si localizzano di frequente nell’ovaio e nell’ovidotto. In questo caso le difese naturali dell’uovo (albumina,
avidina, lisozima e ovotrasferrina), peraltro di breve durata e che contrastano la penetrazione di germi dall’esterno, sono inefficaci. Oltre a Salmonella i microrganismi
più spesso evidenziabili risultano essere Listeria monocytogenes, E. coli, Bacillus, Campylobacter e stafilococchi
coagulasi positivi. Per Salmonella, si ipotizza che la carica microbica infettante nelle uova possa variare fra 105
e 1011 UFC/g. Pseudomonas, Proteus e coliformi sono in
grado di causare nelle uova fenomeni putrefattivi.
Il lavaggio delle uova è materia controversa: se da
una parte ne favorisce la pulizia, dall’altra aumenta la
permeabilità del guscio favorendo l’ingresso dei microrganismi. Si può procedere con una soluzione di NaOH
0,35% in acqua a 70 °C.
Prodotti d’uovo
Sono i prodotti ottenuti dalle uova private dal guscio,
largamente impiegati nell’industria dolciaria e nei pastifici. Tali prodotti si presentano come liquidi, concentrati, disidratati, cristallizzati, congelati, surgelati o coagulati. Tutti devono subire la pastorizzazione o un idoneo
trattamento termico: nelle uova in polvere non pastorizzate sono state rinvenute spesso salmonelle.
12.13 Prodotti della pesca
I prodotti ittici comprendono pesci, molluschi (cefalopodi, gasteropodi, bivalvi) e crostacei.
Il pesce è un alimento ricco di proteine ad alto valore biologico e di alta digeribilità, attribuibile in parte al
basso contenuto di tessuto connettivo. Alta è la percentuale di acidi grassi insaturi, calcio e iodio e di vitamine,
in particolare A e D, superiore a quella della carne.
La qualità microbiologica del pesce è strettamente
legata a quella delle acque in cui vive. È inoltre esperienza comune come nei pesci, molluschi e crostacei
i fenomeni degradativi e di alterazione si verifichino
assai più velocemente che in altri alimenti: ciò sembra
185
Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
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CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI
Tabella 12.13 Controlli microbiologici consigliati per i prodotti ittici
Alimento
Microrganismi
aerobi/g
Coliformi/g
Streptococchi
fecali/g
Staphylococcus
aureus/g
Microrganismi anaerobi
solfitoriduttori/g
Salmonella/25 g
Pesce intero o a
tranci refrigerato o
surgelato
500 000
1 000
1 000
100
5
Assente
Molluschi (cozze,
vongole, seppie
ecc.) già puliti e
surgelati
100 000
100
100
100
5
Assente
Baccalà già
lavorato (dissalato)
pronto da cucinare
1 000 000
1 000
1 000
100
5
Assente
dovuto alla composizione chimica e al pH poco acido
dei tessuti. La pesca in acque profonde e fredde fornisce mediamente prodotti di qualità migliore rispetto a quelli che provengono da acque costiere, che più
facilmente risentono della prossimità di scarichi non
adeguatamente depurati.
Le possibilità di contaminazione polimicrobica
del pesce sono inoltre moltiplicate dalle operazioni
inerenti alla lavorazione e all’esposizione del pescato
sui banchi di vendita. Assume importanza strategica in
questo settore l’immediata refrigerazione sul luogo di
pesca a bordo delle navi, che aumenta notevolmente la
conservabilità del prodotto. Nei processi alterativi del
pesce si formano ammine, in particolare la trimetilammina, H2S, indolo, scatolo e mercaptani, prodotti tipici
delle putrefazioni.
Particolare attenzione va posta a proposito dei molluschi bivalvi (cozze, ostriche, vongole) che, in quanto
organismi microfiltratori, trattengono e concentrano i
microrganismi che si trovano nelle acque in cui vivono
(enterococchi, enterobatteri, vibrioni, virus). La legge
consente la commercializzazione esclusivamente dei
molluschi che hanno subìto un trattamento di stabulazione in acque controllate per un periodo prestabilito di
risanamento e depurazione.
La carica microbica presente normalmente nel pesce si aggira intorno a valori di 103-106 UFC/cm2 sulla
pelle e nelle branchie. I germi che si rinvengono più di
frequente sono Pseudomonas, Flavobacterium, Achromobacter, Micrococcus, Clostridium, enterobatteri e vibrioni: molti di questi batteri sono psicrofili e alotolleranti.
Possono essere presenti anche lieviti e muffe. Le masse
muscolari sono normalmente sterili al momento della
pesca, ma vanno ben presto incontro a contaminazione
in seguito ai traumi della cattura, che causa batteriemia e
diffusione dei microrganismi nelle carni. La valutazione
della freschezza e qualità del pesce si effettua innanzitutto con metodi sensoriali per apprezzarne le caratteristiche organolettiche. Le tecniche microbiologiche permettono di valutare la carica microbica (che denuncia
fenomeni alterativi quando raggiunge e supera valori di
5 × 106 UFC/cm2) e altri parametri come la ricerca di
alcuni enzimi (tabella 12.13). Indagini di tipo chimico
sono rivolte a verificare il pH, la concentrazione di istamina, indolo e H2S.
12.14 Miele
Il miele è definito un “prodotto alimentare ricavato da
api mellifere dal nettare dei fiori o da secrezioni di parti
vive di piante (melata) raccolto, trasformato, addizionato di sostanze specifiche, immagazzinato e lasciato maturare dalle api nei favi dell’alveare”.
La composizione tipica del miele è la seguente:
r acqua, non superiore al 18%, onde evitare la proliferazione di lieviti fermentativi. Una percentuale inferiore al 15% rende invece il miele troppo consistente
e cristallizzabile in masse troppo dure
r glucidi (95-99%), rappresentati da glucosio e fruttosio. Una delle caratteristiche peculiari del miele è la
presenza di zucchero “invertito” cioè i monosaccari-
186
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CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI
di come tali, in quanto il saccarosio destrogiro viene
scisso dall’enzima invertasi delle api in una miscela
di glucosio e fruttosio (levogira) in parti uguali.
Questa caratteristica fa sì che lo zucchero del miele
sia molto più digeribile e di pronta assimilazione rispetto al normale zucchero da tavola
r acidi, che conferiscono al miele un pH prossimo a
3,9
r proteine, presenti peraltro in modesta quantità
r altri componenti.
I microrganismi che si possono rinvenire nel miele generalmente provengono dal nettare o dalla melata, dalle api (in particolare Bacillus cereus, componente della
loro flora intestinale), da miele fermentato presente
nell’alveare, da contaminazioni nel processo di lavorazione.
I difetti microbiologici del miele sono ascrivibili in
12
genere a lieviti fermentanti, in particolare Zygosaccharomyces. Questi microrganismi, per la loro adattabilità
a sopravvivere in ambiente osmoticamente sfavorevole
come il miele per l’alta concentrazione zuccherina, e i
bassi valori di aw e di pH, provocano fermentazioni con
produzione di acidi, alcol etilico e CO2, che generano
sapori sgradevoli, schiuma e macchie biancastre. Cariche lievitiformi preoccupanti sono dell’ordine di 104
UFC/mL.
Altrettanto importante è l’assenza di antibiotici, che
spesso lasciano residui nel miele in quanto impiegati per
combattere malattie infettive delle api o parassiti che
possono penetrare all’interno dell’alveare.
La ricerca dei residui di antibiotici nel miele può
essere eseguita in modo analogo a quella del PAR test
nel latte, ma occorre tener presente che nel miele sono
presenti alcune sostanze naturali con un blando potere
antimicrobico.
Tabella 12.14 Controlli microbiologici consigliati per le paste alimentari
TIPOLOGIA: PASTA DI SEMOLA DI GRANO DURO/PASTA ALL’UOVO SECCA
PARAMETRI MICROBIOLOGICI
LIMITI VALORI GUIDA
RIFERIMENTI NORMATIVI
Carica microbica totale
≤ 104 UFC/g su 3 u.c.
≤ 105 UFC/g su 2 u.c.
Cir. Min. San. 03/08/85 n. 32
Rapp. ISTISAN 89/9
Stafilococco aureo
≤ 102 UFC/g su 3 u.c.
≤ 103 UFC/g su 2 u.c.
Cir. Min. San. 03/08/85 n. 32
Rapp. ISTISAN 89/9
Salmonella spp.
Assenza in 25 g
su 5 u.c.
Legge n. 283/62 art. 5
Cir. Min. San. 03/08/85 n. 32
Rapp. ISTISAN 89/9
Listeria monocytogenes
≤ 11/g in 1 u.c.
≤ 110/g su 2 u.c.
O.M. 07/12/93
TIPOLOGIA: GNOCCHI E PASTA FARCITA INDUSTRIALE (pasta fresca confezionata)
Carica microbica totale
≤ 105 UFC/g su 3 u.c.
≤ 106 UFC/g su 2 u.c.
Cir. Min. San. 03/08/85 n. 32
Rapp. ISTISAN 89/9
Stafilococco aureo
≤ 102 UFC/g su 4 u.c.
≤ 5 × 102 UFC/g su 1 u.c.
Cir. Min. San. 03/08/85 n. 32
Rapp. ISTISAN 89/9
Clostridium perfringens
≤ 102 UFC/g su 4 u.c.
≤ 103 UFC/g su 1 u.c.
Cir. Min. San. 03/08/85 n. 32
Rapp. ISTISAN 89/9
Salmonella spp.
Assenza in 25 g su 5 u.c.
Legge n. 283/62 art. 5
Cir. Min. San. 03/08/85 n. 32
Rapp. ISTISAN 89/9
Listeria monocytogenes
≤ 11/g in 1 u.c.
≤ 110/g in 2 u.c.
O.M. 07/12/93
Bacillus cereus
≤ 104 UFC/g
Nota Rapp. ISTISAN 89/9
187
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12
CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI
12.15 Paste alimentari
Le paste alimentari sono quelle preparate da un impasto di semola di grano duro (capitolo 6) e acqua, dopo
opportuna trafilatura, laminazione ed essiccamento. La
legge italiana impone l’esclusivo impiego del grano duro
per la produzione delle paste alimentari (secche), mentre in altri Paesi è consentito anche l’impiego di grano
tenero, meno costoso ma meno pregiato.
La pasta viene prodotta miscelando semola e acqua,
che ha la funzione di idratare l’amido e formare il glutine,
una lipoproteina derivante da gliadine e glutenine, due
proteine dell’endosperma del frumento (o grano) e che
si forma quando le due proteine vengono a contatto con
l’acqua. Il glutine rende elastico e coeso l’impasto. Si distinguono diversi tipi di paste:
r secche (o semplici, prodotte con grano duro)
r fresche per la cui preparazione è permesso l’impiego
di grano tenero
r speciali, preparate con grano duro (secche) o tenero
(fresche). Sono tutte paste all’uovo (minimo 4 uova;
200 g di uovo/kg di semola) e possono contenere
anche altri ingredienti (spinaci, concentrato di pomodoro ecc.). Le paste farcite hanno un ripieno a
base di carne, formaggio, verdure, funghi ecc.
ste a essiccazione ad alta temperatura, sono tali da non
presentare solitamente aspetti di contaminazione.
Completamente diverso si presenta il caso delle
paste fresche e farcite, in cui le occasioni di contaminazione microbica sono legate al maggior contenuto
di acqua, alla presenza delle uova e dei vari ingredienti
che compongono l’impasto e il ripieno. Il trattamento
termico cui viene eventualmente sottoposto il prodotto
dopo il confezionamento, la conservazione in atmosfera
modificata e in ambiente refrigerato possono diminuire
le occasioni di contaminazione. Particolare attenzione
deve essere naturalmente posta al rigoroso rispetto delle norme igieniche da parte degli operatori, alla pulizia
degli ambienti e delle superfici di lavoro, alle apparecchiature utilizzate.
Le indagini microbiologiche da effettuare riguardano (tabella 12.14):
r la carica microbica mesofila aerobia a 32 °C: valori
mediamente accettabili devono risultare non superiori a 103 UFC/g per le paste secche e a 104 UFC/g
per quelle fresche
r la ricerca di Salmonella, che deve risultare assente in
25 g di campione per tutte le tipologie
r la ricerca e il conteggio dello Staphylococcus aureus,
che non deve risultare superiore a 102 UFC/g per le
paste secche e a 103 per quelle fresche.
Le caratteristiche microbiologiche delle paste secche,
che hanno un basso contenuto di acqua e sono sottopo-
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ESERCIZI DI VERIFICA
1. Rispondi alle seguenti domande:
Cosa si intende per “criterio microbiologico”?
In che cosa consiste un piano di campionamento?
Quali sono le differenze fra un piano di campionamento a due classi e un altro a tre classi?
Che cosa rappresentano i microrganismi indicatori? A quali caratteristiche devono rispondere?
Spiega la differenza fra alterazione, adulterazione e sofisticazione alimentare.
In che cosa consiste la frollatura delle carni?
Come si ottiene il formaggio? Quali fenomeni
biochimici sono alla base della sua produzione
a partire dal latte?
Spiega il significato della presenza o assenza
degli enzimi perossidasi e fosfatasi nel latte pastorizzato.
Perché alcuni soggetti devono assumere latte a
ridotto contenuto di lattosio?
Come viene prodotto lo yogurt?
Quali sono le differenze fra alimenti prebiotici e
probiotici?
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13
SPERIMENTAZIONE DI NUOVI
FARMACI, COMPOSTI GUIDA
E FARMACOVIGILANZA
13.1 Alcune definizioni
13.2 Come nasce un farmaco
13.3 La fase di ricerca preclinica (fase 0)
13.4 La sperimentazione clinica
(clinical trials)
13.5 Le tre fasi dei clinical trials
13.6 La registrazione del farmaco e
l’immissione in commercio
Quando vengono avviati gli studi sperimentali per la
ricerca di un nuovo farmaco è necessario valutarne il
requisito fondamentale, cioè l’efficacia, ma è altrettanto importante monitorarne gli eventuali effetti tossici,
quelli collaterali e quelli inattesi. Vengono quindi adottati protocolli appositamente dedicati per quanto riguarda
la sperimentazione delle nuove molecole e la raccolta di
tutte le informazioni possibili da parte del medico che
prescrive il farmaco, della casa farmaceutica che lo ha
prodotto e dei pazienti che lo assumono. È quindi necessario distinguere una fase di sperimentazione e una
di vigilanza sul farmaco dopo la sua registrazione e l’immissione sul mercato.
13.7 Farmacovigilanza
13.1 Alcune definizioni
È opportuno premettere alcune definizioni schematiche
di argomento farmacologico al fine di agevolare la comprensione degli argomenti trattati nei successivi paragrafi.
FARMACOLOGIA: si occupa dello studio delle interazioni fra sostanze di varia natura e sistemi biologici per
valutarne possibili applicazioni terapeutiche.
PRINCIPIO ATTIVO: il termine indica una sostanza
che possiede una certa attività biologica, in senso positivo
(un farmaco possiede un’attività terapeutica) o negativo
(un veleno ha un’azione tossica).
Fonte: Shutterstock Images, LC.
ECCIPIENTI: nella composizione di un farmaco sono
tutte le sostanze diverse dal principio attivo, impiegate
190
Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
SPERIMENTAZIONE DI NUOVI FARMACI, COMPOSTI GUIDA E FARMACOVIGILANZA
Sito d’azione “recettori”
legato
13
Depositi tissutali
libero
legato
libero
Circolazione
sistemica
Assorbimento
Farmaco libero
Escrezione
Metaboliti
Farmaco legato
Biotrasformazione
Figura 13.1 Relazioni fra i parametri di farmacocinetica di un farmaco.
allo scopo di ottimizzarne la formulazione, facilitarne la
somministrazione e favorirne l’assorbimento da parte
dell’organismo, assicurarne la stabilità e prolungarne la
conservazione.
FARMACOCINETICA: studia i meccanismi con i quali
un farmaco viene assorbito, trasformato, dove e come si
localizza e come viene eliminato dall’organismo (figura
13.1). La farmacocinetica si occupa di:
r vie di somministrazione: vengono scelte in base
al minor grado di pericolosità possibile, alla facilità
nel raggiungere l’organo bersaglio, alla concentrazione con cui vi giunge (tabella 13.1). Esiste una
via enterale (ingestione orale o sublinguale, introduzione rettale), una via parenterale (iniezione sottocutanea, intramuscolare, endovenosa) e
un’applicazione topica (sulle mucose, sulla cute,
nell’occhio)
r assorbimento: riguarda la velocità e l’entità del trasferimento del farmaco dal luogo di somministrazione verso l’organo bersaglio Può avvenire mediante
diffusione passiva (passaggio da una zona a maggior
concentrazione verso un’altra meno concentrata)
oppure per trasporto attivo mediato da proteine
carrier che rendono possibile il passaggio attraverso
le membrane cellulari. In genere i farmaci vengono
assorbiti nell’apparato gastroenterico per diffusione
passiva
r biodisponibilità: indica la quota di principio attivo
che effettivamente viene resa disponibile nella cir-
colazione sanguigna o linfatica e quindi è in grado
di giungere integra ai siti recettori delle cellule bersaglio. In effetti non tutta la quota disponibile corrisponde alla dose somministrata: il farmaco assorbito
a livello intestinale passa attraverso il fegato prima
di arrivare alla circolazione sistemica. Se una parte
della dose somministrata viene inattivata dal metabolismo epatico, questa non risulta più disponibile
per l’effetto terapeutico
r distribuzione: riguarda la velocità e i meccanismi
con cui il farmaco passa dai capillari sanguigni agli
spazi intracellulari e da qui all’interno delle cellule.
In questo passaggio sono in gioco molte variabili,
dalla permeabilità dei capillari a quella delle membrane cellulari, al legame che il farmaco stabilisce
con le proteine plasmatiche e dei tessuti. Altri fattori
in grado di influenzare la velocità e l’efficacia della
distribuzione sono le dimensioni molecolari del farmaco (un alto peso molecolare rappresenta un ostacolo al passaggio attraverso i pori delle membrane
cellulari), il comportamento del farmaco come acido
o base deboli, la sua liposolubilità o il suo carattere
idrofilo
r biotrasformazione: i farmaci subiscono nell’organismo trasformazioni metaboliche che avvengono
nell’apparato digerente, nel rene, ma soprattutto
a livello epatico, dove agisce un gruppo di enzimi
noti come citocromo P450 (capitolo 15). Le reazioni di biotrasformazione convertono il farmaco
in metaboliti inattivi dotati di un più alto carattere
191
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13
SPERIMENTAZIONE DI NUOVI FARMACI, COMPOSTI GUIDA E FARMACOVIGILANZA
Tabella 13.1 Vie di somministrazione e assorbimento dei farmaci
VIE DI
SOMMINISTRAZIONE
Endovenosa
TIPO
DI ASSORBIMENTO
UTILITÀ
SPECIFICA
LIMITAZIONI
E PRECAUZIONI
Assorbimento evitato
Grande nelle situazioni di
emergenza
Aumentato rischio di effetti collaterali
Consente la titolazione del
dosaggio
Di regola le soluzioni devono essere iniettate lentamente
Effetti potenzialmente
immediati
Non consigliabile per soluzioni
Solitamente necessaria per
oleose o sostanze insolubili
farmaci proteici e peptidici
con elevato peso molecolare
Sottocutanea
Rapido, dalla soluzione
acquosa
Lento e sostenuto dalle
preparazioni deposito
Intramuscolare
Rapido, dalla soluzione
acquosa
Lento e sostenuto dalle
preparazioni deposito
Orale
Variabile: dipendente
da molti fattori
Consigliabile nel caso di
alcune sospensioni insolubili
e per l’impianto di pellet
Non consigliabile in caso di grossi
volumi
Consigliabile nel caso di volumi modesti, veicoli oleosi e
alcune sostanze irritanti
Preclusa durante trattamento con
anticoagulanti
La più conveniente ed economica
Richiede la collaborazione del
paziente
Solitamente la più sicura
Disponibilità potenzialmente irregolare e incompleta nel caso di farmaci scarsamente solubili, assorbiti
lentamente, instabili o estesamente
metabolizzati dal fegato e/o dal
canale digerente
di polarità e, quindi, più idrosolubili, che vengono
poi eliminati dall’organismo. Le biotrasformazioni
comprendono reazioni di fase I e II (figura 13.2).
Nel primo caso si tratta in genere di reazioni redox
e di idrolisi che portano alla perdita dell’attività farmacologica. Le reazioni di fase II sono reazioni di
coniugazione fra gruppi funzionali della molecola
del farmaco e l’acido glucuronico, il solfato o la glicina. I composti glucuronati sono privi di attività
biologica, assumono carattere di spiccata polarità e
vengono eliminati con le urine e le feci, a cui giungono con la bile.
r escrezione: l’eliminazione dei farmaci avviene per
via renale (la più importante), con la bile attraverso le feci o con altre vie come il sudore, il latte materno, la saliva. L’escrezione renale si realizza con i
meccanismi fisiologici caratteristici delle varie parti
del nefrone: filtrazione glomerulare, secrezione a
Possibile insorgenza di dolore e necrosi provocate da sostanze irritanti
Possibile interferenza con l’interpretazione di alcuni test diagnostici
(per es. della creatina chinasi)
livello del tubulo prossimale, riassorbimento nel tubulo distale. La prima eventualità si realizza per quei
farmaci che, non legati a composti macromolecolari
quali le proteine plasmatiche di trasporto (albumina), fuoriescono dai capillari arteriosi del glomerulo
nella capsula di Bowman insieme con il filtrato glomerulare. Le molecole che non subiscono filtrazione
possono venire escrete nel tubulo prossimale. Nel
tubulo contorto distale del nefrone il farmaco può
essere riassorbito (nel sangue) se liposolubile e non
in forma ionizzata, oppure eliminato con le urine se
ionizzato e non liposolubile.
FARMACODINAMICA: studia gli effetti specifici di
un farmaco e le sue modalità d’azione nei confronti di
un organo o sistema biologico e sui relativi meccanismi
fisiologici di funzionamento, nonché la relazione fra
concentrazione o dose del farmaco e suo effetto (figura
192
Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
SPERIMENTAZIONE DI NUOVI FARMACI, COMPOSTI GUIDA E FARMACOVIGILANZA
13
Alcuni farmaci subiscono
direttamente il metabolismo
di Fase II
Farmaco
Fase I
Ossidazione,
riduzione e/o idrolisi
A seguito della Fase I il farmaco
può risultare attivato, immodificato o,
nella maggior parte dei casi, inattivo
Fase II
Prodotti di
coniugazione
Il farmaco coniugato
solitamente è inattivo
Figura 13.2 Biotrasformazione dei farmaci.
13.3). È basata quindi sulle caratteristiche biochimiche
del farmaco (che prende il nome di “ligando”) e sul suo
modo di interagire con i relativi recettori cellulari con
cui si lega. Comprende:
r meccanismo d’azione: un farmaco altera la funzionalità dello specifico recettore nelle cellule bersaglio;
la formazione di un complesso farmaco-recettore
provoca di conseguenza un effetto biologico (risposta). Un farmaco che si lega a un recettore cellulare è
definito “agonista”
r relazione dose/risposta: dipende dalla concentrazione del farmaco a livello del recettore, e la risposta
è più intensa se la concentrazione è maggiore. Si stabilisce così una curva dose/risposta con andamento
graduale e progressivo.
CLEARANCE DEL FARMACO: la clearance di una
sostanza è il rapporto fra la sua concentrazione nel sangue e la concentrazione della stessa sostanza nelle urine.
In altri termini, essa esprime la capacità dell’organismo
di allontanare dal sangue un determinato composto.
Poiché l’organo emuntore per eccellenza è il rene, assume particolare importanza in medicina la clearance
renale per la valutazione della funzionalità di questi
organi. Si parla però anche di clearance epatica quan-
do una sostanza viene eliminata con le feci (attraverso
la bile prodotta dal fegato e riversata nella cistifellea, da
dove arriva poi nell’intestino). Nel caso dei farmaci, la
clearance di un farmaco è dunque la quantità di plasma
da cui il farmaco viene allontanato nell’unità di tempo
(mL/min).
TEMPO DI EMIVITA: esprime il tempo necessario
affinché la concentrazione massima di un farmaco nel
sangue diminuisca del 50%. Si misura in ore o minuti
e si indica con t/2. È un parametro importante per ottimizzare i tempi di somministrazione, in base alla constatazione che mediamente la fase di plateau della concentrazione nel sangue si raggiunge in 5 volte t1/2, mentre
l’eliminazione totale del farmaco è pressoché totale in
un tempo pari a 7 volte t1/2.
ACCUMULO DI UN FARMACO: si verifica quando
un farmaco viene somministrato a intervalli di tempo
regolari, per cui la sua concentrazione nel sangue e nei
tessuti aumenta progressivamente. Il fenomeno è la conseguenza della somministrazione nell’unità di tempo di
una quantità di sostanza maggiore di quella che l’organismo può eliminare.
193
Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
13
SPERIMENTAZIONE DI NUOVI FARMACI, COMPOSTI GUIDA E FARMACOVIGILANZA
Farmaco legato a proteina
Assorbimento
Farmaco legato al tessuto
Distribuzione
Dose
Concentrazione plasmatica
Concetrazione tissutale
Eliminazione
Metabolismo
Escrezione
Farmaco nel
compartimento
dell’effettore
Farmaco
legato al
recettore/effettore
FARMACOCINETICA
Eventi
Post-recettoriali
Effetto
biochimico
Risposta
farmacologica
FARMACODINAMICA
Figura 13.3 Relazione tra processi farmacocinetici e farmacodinamici.
13.2 Come nasce un farmaco
La creazione di un nuovo farmaco è un evento complesso che richiede energie da reclutare in campi diversi:
r medicina e biologia, per la conoscenza dei meccanismi che sono alla base del funzionamento degli organismi viventi
r chimica, per quanto riguarda la conoscenza delle
proprietà delle molecole e la loro sintesi
r farmacologia, per lo studio degli effetti sugli organi
bersaglio
r ingegneria e chimica industriale, per la progettazione degli impianti di produzione.
smo biochimico su cui dirigere l’intervento e i possibili
organi-bersaglio, la messa a punto del principio attivo,
una fase preclinica di sperimentazione in laboratorio
e sugli animali, quindi una fase clinica sperimentale
sull’uomo. Solo al termine di un processo della durata di
diversi anni (in media una decina) si arriva alla registrazione e alla commercializzazione del farmaco, cui segue
comunque il successivo costante controllo degli effetti
collaterali (farmacovigilanza). Gli obiettivi che la ricerca
farmacologica si pone nell’ideazione di un nuovo farmaco sono volti a individuare:
r l’area terapeutica verso cui indirizzare la ricerca
r la patologia specifica su cui il farmaco deve agire
r il meccanismo biologico su cui il farmaco deve intervenire.
Il percorso di un farmaco
Il percorso che porta alla nascita di un nuovo farmaco è
lungo e articolato e prevede la definizione del meccani-
Il primo passo è costituito dall’identificazione e caratterizzazione del principio attivo: la ricerca ha inizio con
l’individuazione di un composto che i ricercatori riten-
194
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SPERIMENTAZIONE DI NUOVI FARMACI, COMPOSTI GUIDA E FARMACOVIGILANZA
gono dotato di qualche attività favorevole nei confronti
di una determinata patologia, che sia cioè in grado di
modificare un processo biologico. Occorre innanzitutto
individuare il bersaglio farmacologico, cioè il meccanismo biologico coinvolto nella patologia allo studio e
su cui dirigere l’intervento farmaceutico. Gli esempi di
bersagli farmacologici sono numerosi e di varia natura:
può trattarsi del microrganismo responsabile di una specifica malattia infettiva, della degenerazione delle cellule nervose cerebrali nell’Alzheimer, dell’insufficiente
produzione di ormoni in alcune malattie metaboliche.
Purtroppo non è mai semplice individuare il punto o i
punti su cui intervenire, anche in considerazione della
notevole complessità della maggior parte delle patologie. A seconda del punto di intervento e della tipologia
del bersaglio i risultati sono sostanzialmente diversi: se
il bersaglio svolge la propria azione come “causa prima”
della malattia (il virus responsabile di un’infezione), il
farmaco può portare alla guarigione; se, al contrario,
il bersaglio farmacologico è un meccanismo biologico
secondario, il farmaco non può intervenire sull’origine
della malattia e ne modificherà soltanto alcuni aspetti
e per un periodo di tempo limitato. Si può scegliere di
agire anche in via preventiva quando il bersaglio è coinvolto indirettamente nella possibile insorgenza della patologia: un caso esemplare è rappresentato dal colesterolo nel sangue che, se presente in alta concentrazione,
diventa fattore predisponente per aterosclerosi e infarto
del miocardio.
Una volta individuato il bersaglio, si ricercano le
sostanze che sono in grado di interferire con esso e di
ottenere un effetto terapeutico: si tratta di trovare quelli che vengono chiamati composti guida o lead compounds. Sono queste sostanze i veri e propri precursori
del farmaco definitivo. Si tratta di composti con attività
biologica la cui struttura chimica di base può essere convenientemente modificata per cercare di migliorarne
l’efficacia, la selettività dell’azione farmacologica, i parametri farmacocinetici (assorbimento, distribuzione,
metabolismo ed escrezione). A volte è il caso che porta all’individuazione di una molecola utile: è noto che
Alexander Fleming notò l’attività antibiotica della muffa
Penicillium notatum dopo che questa aveva casualmente
inquinato un terreno di coltura con colonie di Staphylococcus aureus.
A parte le scoperte che si fanno in modo del tutto
fortuito, una tecnica che è possibile seguire consiste in
13
una paziente procedura di screening (setaccio), cioè
nel passare in rassegna con il criterio della casualità
(random) un numero molto alto di composti per individuare fra questi una o più molecole potenzialmente
interessanti per l’impiego terapeutico mirato.
Può trattarsi di sostanze estratte da piante, derivate
da invertebrati o da organismi marini, di prodotti della
fermentazione microbica, di molecole già sintetizzate
ma scartate in studi precedenti perché non rispondenti
ai requisiti allora richiesti, di molecole completamente
nuove, di sostanze di cui casualmente si scopre l’importanza terapeutica. Questo tipo di operazione, estremamente lunga e indaginosa, si può rendere più veloce e
diretta utilizzando la tecnica denominata High Throughput Screening (screening ad alta capacità), basata sullo
studio della relazione fra la struttura tridimensionale di
una molecola e la sua attività biologica. Si individuano
cioè i gruppi funzionali responsabili di un determinato effetto sull’organismo e si concentrano su di essi gli
sforzi per migliorarne l’attività. Tecnologie informatiche
assai sofisticate permettono di ideare nuovi composti
potenzialmente utili sulla base di descrittori molecolari (corrispondenti ad altrettante proprietà chimiche,
fisiche, biologiche), quali l’orientamento spaziale degli
atomi, la solubilità, la capacità di attraversare le membrane cellulari e le barriere biologiche, e di creare modelli
molecolari che in qualche modo si avvicinino alle caratteristiche richieste dal progetto. Lo screening ad alta
capacità permette di studiare migliaia di composti con
prove multiple (fino a 50 in contemporanea). L’utilizzo
di tecniche robotizzate e piastre microtiter (a microtitolazione o microdosaggio) con un elevato numero di
pozzetti permette di velocizzare ulteriormente la ricerca.
Un metodo molto efficace per l’ottimizzazione della
ricerca di nuovi farmaci è la chimica combinatoriale,
per mezzo della quale viene ottenuto ed esaminato un
gran numero di molecole o composti secondo tutte le
combinazioni possibili dei reagenti utilizzati, senza procedere per sintesi sequenziali successive. Questa tecnica
permette di sintetizzare simultaneamente un numero
molto elevato (centinaia o migliaia) di molecole affini
ma diverse (librerie) da sottoporre a screening. Uno
schema estremamente semplificato del metodo per ottenere una libreria di composti è descritto di seguito.
Si abbiano, per esempio, due classi diverse di composti (A e B). Alla classe A appartengono le molecole A1 e
A2, mentre a quella B le molecole B1 e B2. Partendo dai
195
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13
SPERIMENTAZIONE DI NUOVI FARMACI, COMPOSTI GUIDA E FARMACOVIGILANZA
4 composti base si potranno avere le combinazioni A1B1; A1-B2; A2-B1; A2-B2:
A1
A2
B1
A1-B1
A2-B1
B2
A1-B2
A2-B2
Un progresso decisivo è stato compiuto, anche in campo farmacologico, con l’introduzione delle biotecnologie. La manipolazione del DNA e le tecniche di
trasferimento di geni hanno aperto nuove prospettive
alla ricerca farmacologica. Sostanze in passato estratte
da piante o ottenute per sintesi chimica vengono oggi
prodotte da batteri ingegnerizzati (per es. l’insulina e
altri ormoni) con un alto grado di purezza e in quantità
elevate. Oggi almeno il 20% dei nuovi farmaci registrati
annualmente è di origine biotecnologica. Rimane comunque molto lungo il tempo che intercorre fra la scoperta di una molecola promettente e la sua commercializzazione, a testimonianza dell’inderogabile necessità
di un periodo di sperimentazione del farmaco per studiarne, oltre agli aspetti positivi, anche tutti i possibili
effetti collaterali.
La sperimentazione prevede una fase preclinica (in
genere sugli animali) e una fase clinica sull’uomo articolata a sua volta in tre step (figura 13.4).
13.3 La fase di ricerca preclinica
(fase 0)
Questa prima fase di sperimentazione preclinica si svolge in laboratorio e persegue questi obiettivi principali:
r stabilire con la massima approssimazione possibile
lo spettro di attività del farmaco, valutarne l’efficacia
e trarre indicazioni di massima sulla sua eventuale
tossicità nei confronti dell’organismo
r indagare gli aspetti legati alla farmacodinamica del
farmaco e studiare la sua formulazione più adatta
all’impiego sull’uomo.
D’importanza fondamentale in questa fase si rivelano
i modelli sperimentali della patologia, cioè sistemi
biologici in cui si ricreano artificialmente le medesime
condizioni della malattia cui il farmaco è dedicato. A
questo scopo si utilizzano modelli in vitro, in genere
colture di cellule eucariotiche, oppure modelli in vivo
Scoperta
Test di laboratorio
Test preclinici
Test di laboratorio e su animali
Fase I
Test su ~40 volontari
Fase II
Test clinici su 300-400 pazienti
Fase III
Test su migliaia di pazienti
Approvazione
Controllo della FDA o altri enti europei
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Anni
Figura 13.4 Tempi e fasi di sviluppo e commercio di nuovi
farmaci.
intesi come animali da esperimento. È evidente che
solo in quest’ultimo caso è possibile valutare gli aspetti farmacocinetici dei composti sotto esame e dedurre
parametri fondamentali quali la relazione dose/effetto,
stabilire la dose letale per gli animali da laboratorio, la
tossicità acuta e cronica, la dose massima tollerabile, i fenomeni di accumulo nei tessuti dell’organismo. Dall’esito di questa sperimentazione e dall’analisi accurata dei
dati disponibili si può avere una prima idea degli effetti
sull’uomo, con la massima cautela dettata dal passaggio
dalla sperimentazione sugli animali a quella sull’uomo.
Aspetti imprescindibili da approfondire con la massima
attenzione nella fase sperimentale sono i rischi genetici
(azione sul DNA), mutageni (induzione di mutazioni),
cancerogeni (induzione di tumori) e teratogeni (induzione di malformazioni) di cui la molecola allo studio
può rendersi responsabile direttamente o indirettamente. Per ragioni etiche la ricerca tende quando possibile a
evitare l’impiego degli animali da esperimento.
Nella fase preclinica, che può durare anche 2 o 3 anni,
la selezione fra le molecole allo studio è molto severa: si
può ragionevolmente calcolare che solo 1 su 104 possa
superare questa prima fase, e di queste solo 1 su 10 abbia
qualche probabilità di superare la sperimentazione clinica
successiva e diventare un farmaco vero e proprio.
13.4 La sperimentazione clinica
(clinical trials)
Una volta superata la fase di ricerca preclinica, il possibile futuro farmaco viene avviato alla sperimentazione
clinica.
196
Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
SPERIMENTAZIONE DI NUOVI FARMACI, COMPOSTI GUIDA E FARMACOVIGILANZA
Questa fase prevede una serie di studi che hanno
l’obiettivo di investigare nell’organismo umano sia gli
aspetti legati all’azione farmacodinamica del farmaco
(efficacia terapeutica, effetti collaterali o tossici, meccanismo d’azione) che a quella farmacocinetica, cioè assorbimento, distribuzione, metabolismo ed escrezione
della molecola.
Ogni nuovo farmaco dovrebbe consentire un significativo miglioramento rispetto a quelli già disponibili per
la cura della stessa patologia, sia in termini di specifica
efficacia terapeutica che come minori effetti collaterali
indesiderati. Anche gli aspetti economici sono importanti: l’obiettivo perseguito può essere in questo senso
quello di ottenere dal nuovo farmaco lo stesso successo
terapeutico ma a costi inferiori. Una sperimentazione
clinica può essere infatti rivolta sia a farmaci già in commercio che a nuove molecole.
La sperimentazione clinica deve essere condotta in ottemperanza a norme stabilite per legge, secondo le regole
della “Buona Pratica Clinica” (GCP: good clinical practice) recepite nel nostro Paese dal D.M. 15/7/1997 e successive modifiche. Alle GCP si affiancano le GLP (good
laboratory practice) per i test tossicologici e le GMP (good
manufactoring practice) per la fase produttiva.
Le regole della buona pratica clinica devono garantire:
r il benessere e la sicurezza dei pazienti che partecipano alla sperimentazione
r l’attendibilità dei dati, che devono essere riferiti integralmente e con il criterio della massima trasparenza
r una loro verifica indipendente
r la riservatezza delle informazioni.
Per condurre una sperimentazione clinica o uno studio
sperimentale è richiesta l’autorizzazione (ASC, Autorizzazione alla Sperimentazione Clinica o, in Italia,
Parere Unico) rilasciata dal Comitato Etico del Centro di Coordinamento dello studio (per farmaci già in
uso sull’uomo) o dall’Istituto Superiore di Sanità per i
farmaci di nuova formulazione. I Comitati Etici sono
strutture indipendenti e multidisciplinari, composte
da esperti che valutano l’etica e la metodologia della
sperimentazione per tutelare i diritti dei pazienti che
partecipano ai trials clinici, fornendo loro ogni informazione disponibile, e per ottenere dagli stessi il consenso informato al trattamento. Tale consenso è definito
come “decisione del candidato a essere sottoposto a
13
una sperimentazione clinica dopo essere stato informato in merito a natura, significato, conseguenze e rischi
della sperimentazione e dopo averne ricevuta adeguata
documentazione”. La normativa in vigore fa riferimento alla dichiarazione di Helsinki recepita dalla WMA
(World Medical Association) nel 1964 e aggiornata nel
2000, nonché alle norme adottate dalla FDA (Food and
Drug Administration) statunitense. La sperimentazione clinica adotta principi e metodi standard, fra cui in
particolare (tabella 13.2):
r la scelta casuale (random) o mirata dei soggetti sani
o malati che partecipano alla sperimentazione
r il confronto fra l’efficacia del farmaco sperimentale e
quella di un placebo (sostanza che non ha alcun effetto) o di un farmaco noto e già in uso per la stessa
patologia
r cross-over: alternanza di periodi di somministrazione del farmaco allo studio con altri in cui si somministra placebo o farmaco già noto. In questo modo si
cerca di compensare la fluttuazione dei vari stadi di
riacutizzazione o remissione della malattia
r studio in aperto (open label): somministratore e paziente sono informati della natura del prodotto
r singolo cieco: solo lo sperimentatore sa che cosa sta
somministrando (farmaco o placebo)
r doppio cieco: nessuna delle parti sa se sta utilizzando un farmaco nuovo, un altro già in uso oppure un
placebo.
13.5 Le tre fasi dei clinical trials
I clinical trials si svolgono in tre fasi (figura 13.4):
r studio preliminare (farmacologia clinica)
r studio terapeutico pilota (studio di efficacia)
r studio terapeutico su larga scala (studio multicentrico).
Lo studio preliminare (fase I)
La fase preliminare dei clinical trials ha lo scopo di indagare sicurezza e modalità d’azione del farmaco, e viene
effettuata su un numero relativamente piccolo di volontari sani. La sperimentazione viene invece condotta, per i
farmaci antitumorali, su soggetti già ammalati di tumore,
innanzitutto per la non trascurabile tossicità degli antitu197
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13
SPERIMENTAZIONE DI NUOVI FARMACI, COMPOSTI GUIDA E FARMACOVIGILANZA
Tabella 13.2 Caratteristiche e obiettivi principali delle tre fasi dei clinical trials e della farmacovigilanza
FASE
I
SOGGETTI
N°
TIPO DI STUDIO
No random
< 20
“In aperto”
Sani e malati
OBIETTIVI
Risposta al farmaco
Farmacocinetica
Tollerabilità (sicurezza; dose
massima tollerata)
II
No random
10-200
Singolo cieco
Malati
Effetti tossici
Efficacia terapeutica: confronto
con placebo o farmaco noto
Preclusa durante trattamento
con anticoagulanti
Possibile interferenza con
l’interpretazione di alcuni
test diagnostici (per es. della
creatina chinasi)
III
Malati
1000/3000
Doppio cieco
Cross-over
Farmacovigilanza Malati
(IV)
Tutti coloro che assumono
il farmaco (milioni). Enorme
numero di variabili non
precedentemente prevedibili
morali, ma anche per dare a questi pazienti un’ulteriore
possibilità di remissione della patologia. A parte quest’ultimo caso, in generale nella fase preliminare dei trials clinici non si tratta di studiare l’efficacia vera e propria di un
nuovo farmaco, quanto piuttosto di verificarne la sicurezza. In pratica, si cerca di appurare come e in che misura
possa venire tollerato dall’organismo e di conoscere quale possa essere la sua farmacocinetica, cioè come venga
assorbito, metabolizzato ed escreto. Questi dati si ottengono somministrando a un numero limitato di volontari,
sotto costante controllo medico, dosi progressivamente
più elevate di farmaco per verificarne la tollerabilità. È
importante sottolineare che in questa fase è ancora possibile modificare la molecola allo studio, perché se ciò
avvenisse in quelle successive occorrerebbe riprendere
la procedura di sperimentazione dall’inizio, per evitare il
pericolo che intervengano modificazioni in grado di provocare effetti inattesi e indesiderati. Si calcola che in media circa il 70% di molecole venga comunque eliminato
in questa fase a causa dell’esito sfavorevole dei test.
Controllo
post-marketing
Conferma efficacia –
affinamento dosaggi e
formulazione – effetti secondari
poco frequenti – sicurezza a
lungo termine
Effetti tossici rari (1:10 000) e a
lunga latenza
Lo studio terapeutico pilota (fase II)
Questa fase (che può richiedere un periodo medio di 2
anni) coinvolge un certo numero di pazienti affetti dalla
patologia per curare la quale il farmaco è allo studio. Si
prende in esame quella che viene definita “attività del
farmaco”, cioè la sua capacità di produrre nell’organismo le modificazioni desiderate. Punti importanti che
vengono definiti in questa fase sono la dose giornaliera e
la periodicità della somministrazione, nonché la durata
della terapia. Si possono approntare studi di confronto
con farmaci di riferimento o con placebo.
Lo studio terapeutico su larga scala
(fase III)
Se il composto allo studio supera la seconda fase, può essere avviato un programma a più ampio raggio anche su
base internazionale e su un campione molto più ampio di
198
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SPERIMENTAZIONE DI NUOVI FARMACI, COMPOSTI GUIDA E FARMACOVIGILANZA
pazienti, che potrà fornire risultanze statisticamente probanti in merito all’efficacia del trattamento e agli eventuali effetti collaterali. Ci si rivolge anche a fasce particolari di soggetti, come anziani o bambini, o anche persone
affette da patologie particolari, per valutare possibili interferenze o effetti crociati della nuova molecola con altri
farmaci impiegati per quelle determinate malattie.
13.6 La registrazione del farmaco
e l’immissione in commercio
Durante le varie fasi della sperimentazione clinica, compresa la fase III, il farmaco non può essere commercializzato, ma può essere utilizzato solo in ambito ospedaliero sui pazienti che partecipano alla sperimentazione.
Una volta superata la fase III, il produttore deve richiedere l’autorizzazione all’immissione in commercio
(AIC), che in Italia viene concessa con Decreto Ministeriale dal Ministero della Salute, dopo approvazione
dell’Agenzia Italiana del Farmaco (AIFA). Tale autorizzazione vale solo per il paese in cui la sperimentazione è stata condotta: a livello europeo è di competenza
dell’EMEA (European Agency for Evaluation of Medicinal products) che rilascia autorizzazioni alla commercializzazione in tutta l’Europa. L’autorizzazione deve essere
concessa o respinta entro un termine massimo di 210
giorni. Il nuovo farmaco, dopo il controllo delle autorità
sanitarie, viene quindi registrato e immesso in commercio con un nome “di fantasia” che lo contraddistingue. Il
foglietto illustrativo che accompagna la confezione riporta in modo schematico e riassuntivo le informazioni raccolte durante le fasi di sperimentazione. L’autorizzazione
ha una durata di 5 anni, dopodiché deve essere presentata
una nuova richiesta: il rinnovo della concessione, dopo
opportuna rivalutazione del rapporto fra rischi e benefici
nell’impiego del farmaco da parte degli enti predisposti,
ha durata illimitata. L’autorizzazione decade in seguito a
mancata commercializzazione del prodotto entro 3 anni
o alla sua assenza dal mercato per 3 anni consecutivi.
13.7 Farmacovigilanza
Per ogni farmaco registrato e messo in commercio viene esercitata un’azione di vigilanza, che in pratica si
può configurare come una fase IV di sperimentazione.
13
L’uso del farmaco da parte di un numero molto alto di
pazienti diversi per sesso, età e possibili patologie concomitanti offre una panoramica più esauriente e statisticamente assai significativa in merito soprattutto alla sua
sicurezza. Ogni effetto collaterale, anche se è fra quelli
già elencati nel foglietto illustrativo allegato, deve essere
segnalato al medico, che a sua volta lo trasmetterà al Dipartimento per la farmacovigilanza. Le segnalazioni
vengono controllate e valutate e costituiscono uno dei
motivi del periodico aggiornamento delle schede e dei
foglietti che accompagnano la confezione del farmaco.
La farmacovigilanza ha lo scopo di monitorare rischi e benefici dei farmaci una volta che questi siano
già entrati in commercio, con particolare attenzione
verso quelli di recente introduzione, e coinvolge quindi
non solo i ricercatori, ma anche e soprattutto i medici
che hanno l’obbligo di osservare nei pazienti cui hanno
prescritto il farmaco sia il reale effetto terapeutico che le
reazioni inattese e gli eventuali effetti tossici, riportando
ai competenti organi di riferimento i risultati della loro
azione di monitoraggio. Le procedure di farmacovigilanza si fanno decorrere storicamente dai tragici eventi legati all’assunzione del talidomide in donne gravide
(vedi scheda).
Le reazioni avverse e gli effetti collaterali possono essere catalogati come:
r rari, distinguibili a loro volta in specifici e aspecifici.
Nel primo caso si tratta di reazioni legate inequivocabilmente al farmaco in osservazione, nel secondo
riguardano reazioni avverse da mettere in relazione
con patologie naturalmente diffuse nella popolazione. In questo caso occorre essere in grado di valutare
l’aumento di incidenza di tali malattie attribuibile
con ogni probabilità al farmaco. È necessario in altri
termini misurare la differenza fra l’incidenza naturale della malattia e l’incidenza della medesima malattia indotta dal farmaco e se tale differenza abbia o
meno significatività statistica
r successivi a trattamenti prolungati, per cui è necessario condurre studi per un periodo di tempo
molto lungo, cui teoricamente non è possibile porre
un limite (manifestazioni avverse possono intervenire anche dopo molti anni di trattamento)
r a lunga latenza, che si rivelano dopo un periodo di
tempo tale da rendere difficile individuare il nesso
con l’assunzione del farmaco. Un esempio è costituito da patologie giovanili a carico di figli per assunzio199
Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
13
SPERIMENTAZIONE DI NUOVI FARMACI, COMPOSTI GUIDA E FARMACOVIGILANZA
LA VICENDA DEL TALIDOMIDE
Il talidomide (figura 13.5) venne prodotto nel 1950
come farmaco sedativo e antivomito, commercializzato
con nomi diversi, e prescritto frequentemente alle donne in gravidanza. Fu ritirato dal commercio nel 1961 in
seguito all’evidenza dei suoi effetti teratogeni:
le donne che avevano assunto il farmaco partorivano
infatti bambini focomelici, con riduzione delle ossa
lunghe degli arti o con la completa assenza di braccia o gambe. Responsabile dell’azione teratogena è
uno degli enantiomeri (coppia di molecole immagini
speculari l’una dell’altra e quindi non sovrapponibili)
della molecola, che agisce inibendo la formazione dei
vasi sanguigni e compromettendo il regolare sviluppo
dell’embrione. Prima di giungere al ritiro dal commercio si scontrarono per una decina d’anni opinioni
contrastanti in merito alla possibile tossicità del talidomide, con studi (poi risultati parziali e condotti in
modo non sempre corretto) che ne testimoniavano
l’innocuità. I primi studi che ne dimostravano l’effetto teratogeno furono pubblicati nel 1961, riportando
alla luce anche casi di malformazioni fetali collegabili
ne di un certo farmaco da parte delle madri durante
la gravidanza (adenocarcinoma in conseguenza di
trattamento della madre con dietilstilbestrolo in gravidanza)
r da interazione con altri farmaci, reazioni avverse
causate dall’impiego contemporaneo di più farmaci
diversi nello stesso paziente
r relativi a specifici gruppi a rischio. In quest’ultimo
caso la farmacovigilanza deve comprendere il confronto fra le reazioni evidenziate in specifiche fasce
di popolazione (anziani, bambini ecc.) con quelle in
soggetti scelti a caso fra la popolazione.
Gli studi descrittivi ai fini del monitoraggio dei farmaci
si basano essenzialmente su:
r segnalazioni spontanee da parte dei pazienti al
proprio medico che le trasmette ai centri specializzati per la farmacosorveglianza
r indagini senza controllo parallelo in cui non è
previsto il confronto con un gruppo di pazienti di
controllo. Questi schemi di monitoraggio sulla tollerabilità dei farmaci dopo la loro registrazione sono
al talidomide risalenti al 1957. A distanza di 50 anni
(settembre 2012), l’azienda produttrice del farmaco si
è scusata con una dichiarazione dell’A.D: “Chiediamo
perdono per il fatto che, in quasi 50 anni, non abbiamo
trovato un modo per parlarvi, da essere umano a essere umano. Chiediamo che si consideri il nostro lungo
silenzio un segnale dello shock che quello che vi accadde provocò in noi”.
Gli studi su questa molecola non sono stati comunque abbandonati: sono in corso sperimentazioni per
il suo impiego, con formula modificata, nella terapia
dell’AIDS e di alcuni tipi di tumore.
O
N
O
N
H
O
O
Figura 13.5 Formula chimica del talidomide.
articolati in più modalità di immissione in commercio: registrata (commercializzazione dopo 5 anni
di valutazione), limitata (rilevamento dei ricoveri
ospedalieri e dei decessi), controllata (follow up dei
pazienti mediante questionari), ristretta (coinvolge
solo medici selezionati, in ambito ospedaliero o ambulatoriale). Il metodo di valutazione retrospettiva
della tollerabilità del farmaco prevede la raccolta e
l’indagine sulle prime 100 000 ricette del nuovo farmaco e l’identificazione di 10 000 pazienti
r analisi dei registri nazionali, in cui vengono memorizzate le segnalazioni relative agli eventi patologici che potrebbero essere messi in relazione all’impiego di un certo farmaco. Fonte di informazione
privilegiata sono i registri ospedalieri e l’incrocio dei
dati riportati (record linkage). Importante l’esperienza inglese iniziata negli anni ’60 del secolo scorso
(Oxford record linkage study) e quella finlandese basata sull’incrocio dei dati desunti dai registri nazionali
dei tumori, delle malformazioni congenite, delle dimissioni ospedaliere, delle reazioni avverse a farmaci,
degli assistiti dal sistema sanitario nazionale.
200
Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
ESERCIZI DI VERIFICA
1. Rispondi alle seguenti domande:
Cosa si intende in farmacologia per “principio
attivo” e per “eccipiente”?
Illustra le fasi in cui si articola la cinetica di un
farmaco.
Di cosa si occupa la farmacodinamica?
Quali sono le vie di escrezione dei farmaci?
Spiega il concetto di “clearance” di un farmaco.
Che cosa si intende per tempo di emivita di un
farmaco?
In che cosa consiste la sperimentazione preclinica?
Illustra le varie fasi dei clinical trails.
In che cosa consiste la farmacovigilanza? Come
si realizza in pratica?
Spiega cosa si intende con i termini di: studio
“in aperto”, a singolo cieco, a doppio cieco.
201
Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
14
LE CELLULE STAMINALI
14.1 Le prime fasi di sviluppo dell’embrione:
il differenziamento cellulare
14.2 Le cellule staminali
14.3 Cellule staminali emopoietiche
14.4 Cellule staminali emopoietiche
dal sangue del cordone ombelicale
14.5 Trapianti di cellule staminali
emopoietiche (TCSE)
14.6 Patologie in cui è ritenuto valido
l’impiego di cellule staminali
14.7 Recenti acquisizioni: le staminali
pluripotenti indotte (iPS)
14.8 Riprogrammazione cellulare tramite
REAC
Le cellule di ogni organismo vivente vanno incontro a
progressivi processi fisiologici di usura, in modo differenziato e più o meno rapido a seconda del tessuto di
cui fanno parte. Traumi esterni e malattie contribuiscono ad accelerare i fenomeni di invecchiamento, per cui
le cellule che muoiono devono essere rimpiazzate. La
produzione di nuove cellule che sostituiscano quelle
morte non è propria di tutti i tessuti: quello epatico può
rigenerarsi velocemente se subisce un danno, l’epitelio
del tratto digerente e le cellule del sangue si rinnovano
continuamente, nel tessuto epidermico la capacità di
rigenerazione e proliferazione cellulare è molto pronunciata. Al contrario le cellule nervose, tranne casi di
lentissima rigenerazione degli assoni neuronali in presenza di un corpo cellulare integro, e quelle del muscolo cardiaco perdono la loro capacità rigenerativa dopo
la nascita. Le possibilità di rigenerazione di un tessuto
dipendono dalla permanenza al suo interno di cellule
staminali indifferenziate e da fattori diversi che ne bloccano il differenziamento.
14.1 Le prime fasi di sviluppo
dell’embrione: il
differenziamento cellulare
Cellule staminali embrionali (foto: Nissim Benvenisty).
Il differenziamento cellulare consiste nell’acquisizione di caratteri diversi e funzioni specializzate al fine di realizzare una divisione di compiti e funzioni, tipica degli
organismi pluricellulari, al contrario di ciò che avviene
negli organismi unicellulari in cui tutte le funzioni vitali
sono svolte da un’unica cellula. Gli organismi pluricellu-
202
Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
LE CELLULE STAMINALI
Segmentazione
dello zigote:
stadio a due
cellule (giorno 1)
Stadio a quattro
cellule (giorno 2)
14
Corpuscolo polare
Blastomeri
Zona pellucida
Nucleo
Citoplasma
a)
Morula
(giorno 4)
Blastocisti, veduta
esterna (giorno 5)
Blastocisti, veduta
interna (giorno 5)
Massa cellulare
interna
Cavità della
blastocisti
b)
Figura 14.2 Formazione dello zigote dalla blastocisti. Dallo
stadio a 8 cellule, morula (a) l’embrione si compatta diventando
una blastocisti (b).
Trofoblasto
Figura 14.1 Primi stadi dello sviluppo embrionale.
lari derivano anch’essi da un’unica cellula, l’uovo fecondato, ma questa si trasforma ben presto in una struttura
complessa, l’embrione, che dà origine a tessuti e organi
specializzati per svolgere funzioni diverse (figura 14.1).
Lo sviluppo dell’embrione è innescato dalla fecondazione, durante la quale lo spermatozoo (pronucleo
maschile) si fonde, una volta penetrato nel citoplasma
dell’uovo, con il pronucleo femminile dando inizio alla
divisione cellulare. Le dimensioni dell’uovo sono assai
maggiori di quelle dello spermatozoo, dovendo fornire
la maggior parte delle sostanze nutritive richieste per lo
sviluppo embrionale. L’uovo è circondato da una sottile
membrana trasparente chiamata zona pellucida. Immediatamente dopo la fecondazione, il DNA va incontro a
ripetuti e rapidi cicli biosintetici cui segue l’avvio della
divisione cellulare, detta segmentazione in quanto il
citoplasma (l’uovo) si divide all’interno del proprio involucro senza aumentare di dimensioni. Si forma così un
ammasso di cellule a forma di mora, che prende appunto
il nome di morula. Fra gli stadi di 8 e 16 cellule la superficie della morula diviene più liscia per il progressivo compattamento delle cellule fino a diventare simile a una sfera, mentre gli spazi intercellulari più interni si allargano
a formare una cavità centrale o blastocele, ripiena di liquido (figura 14.2). A questo punto la morula è diventata
una blastula o blastocisti, in cui si individua un gruppo
più consistente di cellule addossate a un polo della sfera
(massa cellulare interna), mentre le altre cellule formano
il trofoectoderma. Queste ultime, una volta eliminata la
membrana pellucida che le ricopre, entrano in strettissimo contatto con la parete dell’utero in cui l’uovo si è impiantato, dando luogo alla placenta, mentre dalla massa
cellulare interna derivano l’embrione vero e proprio e
alcuni annessi embrionali come il sacco vitellino.
In uno stadio successivo alcune cellule, con una
complessa serie di movimenti, subiscono un’invaginazione (gastrulazione), mentre compaiono i primi segni
della differenziazione morfologica.
Di qui in avanti si vanno delineando i tre strati germinativi (foglietti embrionali) che daranno origine a
tutte le strutture e i tessuti dell’organismo:
203
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14
LE CELLULE STAMINALI
(A)
Solco neurale
Piega neurale
Placca neurale
(B)
Notocorda
Ectoderma
Mesoderma
Endoderma
Intestino
Mesoderma
Tubo neurale
Notocorda
Celoma
Cellule della
cresta neurale
Tubo
neurale
Intestino
(C)
Figura 14.3 La neurulazione e lo sviluppo del tubo neurale
nella rana.
❖ endoderma, il foglietto più interno da cui traggono
origine apparato digerente e respiratorio, pancreas e
fegato
❖ mesoderma, lo strato intermedio da cui si formano
muscoli, ossa, cuore, vasi sanguigni, apparato urogenitale
❖ ectoderma, il più esterno, che dà origine a epidermide e relativi annessi, sistema nervoso e organi di
senso.
Dopo la gastrulazione nell’embrione compaiono la notocorda, che darà origine alla colonna vertebrale, e il
tubo neurale, che anteriormente è destinato a formare
l’encefalo mentre la parte rimanente formerà il midollo
spinale (figura 14.3).
Fino allo stadio di 8 cellule invece qualsiasi cellula
dell’embrione può dare origine a una qualunque parte
dell’embrione e dell’adulto. Si tratta quindi di cellule
totipotenti in quanto assolutamente indifferenziate.
r possono dividersi illimitatamente (capacità di autorinnovamento) e attivamente, dando origine a cloni
cellulari (cellule figlie uguali fra di loro e identiche
alla cellula madre)
r quando si dividono, possono diventare altre cellule
staminali, e quindi indifferenziate, oppure avviarsi
verso il differenziamento e la specializzazione funzionale. Il differenziamento è espressione di attività geniche diverse e implica la sintesi di proteine specifiche.
Le cellule staminali si possono catalogare in base alla
loro “potenzialità”:
r sono cellule unipotenti quelle che possono dare origine a un solo tipo di cellule differenziate (la cellula
staminale epidermica dà origine a cellule cheratinizzate dell’epidermide; le cellule epatiche possono dare origine esclusivamente a cellule epatiche e
riescono a ricostituire la massa completa dell’organo
partendo appena da ¼ della massa originaria)
r sono multipotenti le staminali che possono dare
origine ad alcuni tipi di cellule (staminali multipotenti del midollo osseo emopoietico originano più
tipi di staminali unipotenti: quelle da cui derivano i
globuli rossi e quelle che generano i vari tipi di leucociti e le piastrine)
r le staminali pluripotenti possono dare origine a
molti tipi cellulari diversi, come nel caso delle cellule
del feto e del cordone ombelicale
r le cellule staminali totipotenti possono generare
ogni tipo di cellula dell’organismo.
È importante ricordare che le cellule vegetali possono in
certe condizioni compiere il percorso a ritroso tornando
da uno stadio differenziato a uno indifferenziato.
14.2 Le cellule staminali
Le cellule indifferenziate sono cellule staminali, progenitrici di tutte le cellule di un organismo, caratterizzate
dalle seguenti proprietà:
r non svolgono attività specifiche, ma costituiscono
una sorta di riserva di cellule di ricambio
Figura 14.4 Cellule staminali embrionali (fonte: gettyimages).
204
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14
LE CELLULE STAMINALI
bianchi (linfociti, monociti, granulociti) e piastrine. Tali
cellule ricreano la popolazione originaria del midollo
osseo emopoietico danneggiato in seguito a gravi patologie (aplasia midollare), per esposizione a radiazioni
ionizzanti o in seguito a chemio- o radioterapia per il
trattamento delle neoplasie.
Il sistema emopoietico (figura 14.6) è deputato a generare e rigenerare le cellule del sangue (rossi, bianchi e
piastrine). Si calcola che ogni giorno vengano distrutte e ricreate oltre un miliardo di cellule. Le staminali
emopoietiche appartengono alle cellule staminali adulte, e si trovano nel sangue periferico, nel midollo osseo
e nel sangue del cordone ombelicale, nelle percentuali
seguenti:
r midollo osseo
1-3%
r sangue periferico 0,01-0,1%
r sangue cordonale 0,04-0,1%
nelle ossa piatte (bacino, sterno, coste, scapole, cranio) e
alle estremità delle ossa lunghe come il femore e l’omero. Nel midollo osseo si trovano anche cellule staminali
non emopoietiche che producono cellule del tessuto
adiposo, cartilagineo e osseo (cellule mesenchimali).
Le cellule staminali emopoietiche si prelevano dal
midollo osseo, dal sangue periferico (dopo opportuno
trattamento farmacologico sul donatore, nel cui sangue
di conseguenza le cellule staminali aumentano notevolmente rispetto alla concentrazione standard) o anche
dal sangue prelevato dal cordone ombelicale.
Le cellule staminali emopoietiche possono essere
prelevate da un donatore sano e trapiantate per infusione in un soggetto sottoposto a trattamento chemio- o
radioterapico o colpito da gravi malattie del sangue. È
da sottolineare che le indicazione terapeutiche per un
trapianto di midollo osseo si vanno continuamente ampliando dal lontano 1957, quando Thomas e i suoi collaboratori effettuarono i primi tentativi di intervento. Il
problema fondamentale da risolvere è indubbiamente
quello della compatibilità fra donatore e ricevente: per
questo i donatori vengono in primo luogo ricercati fra i
Il principale e più importante organo emopoietico è il
midollo osseo, che svolge questa funzione a iniziare
dal 5°-6° mese della vita fetale. L’attività emopoietica è
a carico del midollo rosso, che nella vita adulta si trova
Linfocita T
Immunità cellulare
Plasmacellula
Linfocita B
Precursore
linfoide
Immunità umorale
Cellula
natural
killer (K)
Cellula
staminale
pluripotente
Attività citolitica
Cellula
dendritica
Stabiliscono contatti con il
microambiente e presentano gli
antigeni ai linfociti T.
Azione fagocitaria
?
Neutrofilo
Precursore
granulocita/
monocita
Precursore
mieloide
Eosinofilo
Difesa contro i parassiti e intervento
nelle allergie
Basofilo
Infiammazione e reazioni allergiche
Azione fagocitaria
Monocita
Macrofago
Coagulazione del sangue
Precursore
megacariocita/
eritrocita
Megacariocita
Piastrine
Trasporto dell’ossigeno e della CO2
Eritrocita
Figura 14.6 Il sistema emopoietico. Le cellule del sangue derivano da cellule staminali pluripotenti del midollo osseo da cui
originano, in primo luogo le linee cellulari linfoide e mieloide e, in secondo luogo, i diversi tipi cellulari.
206
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LE CELLULE STAMINALI
consanguinei (fratelli o sorelle). Purtroppo una ricerca
di questo tipo ha risultati positivi solo in un quarto circa
dei casi: occorre allora effettuare la ricerca nel registro
internazionale dei donatori di midollo osseo.
14.4 Cellule staminali emopoietiche
dal sangue del cordone
ombelicale
La ricerca di donatori compatibili incontra notevoli difficoltà anche perché richiede tempi molto lunghi (anche
mesi) prima che sia coronata da successo. Per superare
queste difficoltà sono state utilizzate fin dal 1988 cellule
staminali embrionali prelevate dal cordone ombelicale. Le
cellule del sangue cordonale permettono infatti di superare, anche se non completamente, i problemi di compatibilità in virtù della loro relativa immaturità immunologica,
consentendo di effettuare trapianti anche fra soggetti non
completamente compatibili. Viene bypassato in questo
modo il requisito essenziale e imprescindibile nel caso dei
trapianti con cellule staminali di tipo adulto.
Per rendere più funzionale il sistema dei trapianti
sono state create vere e proprie banche, dove vengono
inviate le unità di sangue cordonale raccolte in sala parto
e condotte opportune analisi per verificarne la conservabilità e stabilirne il profilo immunologico ai fini della
compatibilità. Questi dati vengono quindi trasmessi al
Registro Internazionale dei Donatori di Midollo Osseo
che li rende universalmente disponibili e consultabili. La
rete italiana comprende 18 banche del sangue cordonale
tutte in ambito pubblico, la cui attività è coordinata dal
Centro Nazionale Sangue e dal Centro Nazionale
Trapianti.
Le unità di sangue cordonale conservate in queste
banche sono destinate a trapianti allogenici: sono cioè a
disposizione della società, o anche per impiego riservato
a familiari del nascituro che mostrino patologie curabili
con tali cellule, oppure a pazienti provenienti da famiglie
a rischio di avere figli affetti da malattie genetiche.
14.5 Trapianti di cellule staminali
emopoietiche (TCSE)
Il trapianto di cellule staminali emopoietiche consiste nella loro infusione endovena in un soggetto ricevente. In tali
14
pazienti viene precedentemente indotta per via farmacologica un’aplasia midollare massiva e irreversibile, con la
conseguente soppressione dell’autonoma funzione emopoietica. Il midollo osseo del paziente contiene infatti,
insieme con le cellule ancora sane, le cellule neoplastiche
acquisite per malattia o preesistenti per un difetto genetico. Tutto il tessuto emopoietico viene quindi eliminato e
sostituito con le cellule emopoietiche del donatore sano.
Un simile tipo di trapianto viene definito allogenico
(cellule provenienti da un donatore compatibile) per distinguerlo da quello di tipo autogenico, in cui le cellule
trapiantate sono prelevate e reinfuse nello stesso paziente. Questa tecnica ha aspetti e problematiche particolari
e verrà discussa più avanti.
La tecnica del trapianto allogenico prevede l’infusione di un elevato numero di cellule staminali sane (almeno 108 cellule per kg di peso corporeo del ricevente).
Il paziente che deve ricevere il midollo deve essere
adeguatamente preparato al trapianto, e viene sottoposto per questo a un trattamento chemio- e radioterapico
per la soppressione della propria attività midollare emopoietica. Tale trattamento prende il nome di regime di
condizionamento: rappresenta infatti la condizione
sine qua non per il successo del trapianto. L’obiettivo del
condizionamento è duplice: eliminare le cellule midollari malate e disattivare il sistema immunitario del ricevente. In questo modo le cellule staminali emopoietiche
del donatore hanno la possibilità di attecchire, fenomeno reso evidente nel soggetto ricevente dalla ricomparsa
in circolo prima dei granulociti (globuli bianchi), poi di
piastrine e infine dei globuli rossi.
Le cellule sane trapiantate svolgono due funzioni:
r sostituiscono quelle del midollo emopoietico distrutto dal condizionamento
r eliminano le cellule malate eventualmente residue
dopo il trattamento chemio- e radioterapico. Questo
compito è svolto da alcuni tipi di globuli bianchi: i
linfociti e i granulociti.
Nel trapianto allogenico il midollo emopoietico può
provenire da:
r un componente dello stesso nucleo familiare del ricevente, preferibilmente un fratello o una sorella. Se
il donatore è un gemello omozigote il trapianto viene definito singenico
r un soggetto estraneo volontario iscritto al Registro
dei Donatori di Midollo Osseo
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14
LE CELLULE STAMINALI
ANALISI PER LA COMPATIBILITÀ
Il successo di un trapianto di cellule staminali emopoietiche dipende in primo luogo dalla compatibilità tissutale fra donatore e ricevente. Nel determinare il grado
di istocompatibilità intervengono le proteine MHC, la
cui sintesi è codificata dai geni del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC, major histocompatibility complex) presente in tutti i mammiferi. Il sistema
MHC (tabella 14.1) è localizzato sul cromosoma 6 e
comprende 140 geni; è caratterizzato da un elevato
polimorfismo, dal momento che ogni gene può essere
presente in più forme alleliche. Nell’uomo le proteine
MHC vengono anche chiamate antigeni HLA (human
leukocytes antigen) e sono suddivise in classi:
r proteine MHC di classe I (antigeni HLA di classe I). Si trovano sulla membrana di tutte le cellule
dell’organismo, caratterizzano i tessuti di ogni individuo e sono responsabili del rigetto dei trapian-
ti. Presentano gli antigeni ai linfociti T citotossici
(processazione e presentazione degli antigeni)
r proteine MHC di classe II (antigeni HLA di classe
II). Sono presenti solo su alcuni tipi cellulari come i
linfociti B, i macrofagi e le cellule dendritiche. Queste ultime si trovano in vari tessuti dell’organismo
con la funzione di catturare gli antigeni e di esporli
insieme alle proteine MHC. Le proteine MHC di
classe II presentano gli antigeni ai linfociti T helper
e facilitano l’attivazione dei linfociti B
r proteine MHC di classe III: proteine citotossiche,
componenti del complemento e citochine.
Le reazioni di rigetto dei trapianti sono tanto minori
quanto più donatore e ricevente risultano compatibili
per il sistema MHC/HLA oltre che per quelli AB0 e
Rh. Questi sistemi sono identici solo nei gemelli omozigoti.
Tabella 14.1 Caratteristiche delle proteine MHC di classe I e II
CLASSE I
CLASSE II
Loci genetici
H-2K, H-2D, H-2L nel topo;
HLA-A, HLA-B, HLA-C nell’uomo
Gruppi H-2A e H-2E nel topo;
DP, DQ, DR e molte altre nell’uomo
Distribuzione cellulare
Maggior parte delle cellule nucleate
Cellule che presentano l’antigene
(comprese le cellule B), cellule
epiteliali timiche, alcune altre
Coinvolte nella presentazione
dell’antigene
Cellule T citotossiche
Cellule T helper
Origine dei frammenti
peptidici
Proteine prodotte nel citosol
Membrane plasmatiche endocitate
e proteine extracellulari
Domini polimorfici
α1 + β2
α1 + β1
r un’unità di sangue del cordone ombelicale conservata in una banca di sangue cordonale.
Il trapianto autogenico (autologo) consiste nel prelievo di midollo emopoietico da un paziente immediatamente dopo un ciclo di chemioterapia, periodo in cui
le cellule tumorali sono presumibilmente ancora poche.
Il paziente viene quindi sottoposto a un ulteriore trattamento di chemioterapia ad alte dosi e/o a una radioterapia prima di procedere alla reinfusione delle cellule
staminali precedentemente prelevate. Tale procedimento terapeutico si applica a determinate patologie, con
l’obiettivo di consolidare l’effetto dei trattamenti chemio- e radioterapici, ma presenta inconvenienti legati
alla probabile permanenza di cellule malate nel midollo
reinfuso e nella pressoché completa assenza della reazione citotossica nei confronti delle residue cellule malate, che non possono essere riconosciute come estranee
da quelle reinfuse dal momento che appartengono allo
stesso soggetto.
Queste considerazioni non depongono al momento
a favore della conservazione del sangue del proprio cordone ombelicale in vista di un eventuale suo riutilizzo
per il verificarsi di possibili future patologie.
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LE CELLULE STAMINALI
La conservazione del sangue cordonale è invece indicata quando se ne preveda l’utilizzo in ambito intrafamiliare (conservazione dedicata), nel caso di famiglie
a rischio di specifiche patologie e in cui un membro sia
già colpito da una malattia congenita per cui è indicato il
trapianto di midollo emopoietico. Un caso emblematico
è rappresentato dalla talassemia.
14.6 Patologie in cui è ritenuto
valido l’impiego di cellule
staminali
Le patologie per cui fin dall’inizio delle ricerche dedicate alle cellule staminali è stata raccomandata la tecnica
del trapianto di midollo emopoietico sono le leucemie
mieloidi e linfoidi acute. Nelle leucemie croniche il
trapianto è indicato solo nel caso di fallimento della terapia medica, considerati gli enormi progressi fatti registrare in questo campo. Le indicazioni terapeutiche si
sono progressivamente allargate a comprendere molte
patologie diverse, ma i trapianti di midollo si dimostrano validi soprattutto nelle terapie di recupero dopo
l’esposizione dei pazienti a dosi elevate di chemio- e
radioterapia. In questi casi la terapia non viene indirizzata in modo primario sul midollo osseo: quest’ultimo
viene distrutto o gravemente danneggiato come effetto
collaterale delle massicce dosi di chemioterapia o radioterapia dirette verso altri organi o tessuti colpiti da neoplasie. Se non supportati da trapianto midollare, questi
trattamenti provocherebbero con ogni probabilità la
morte del paziente. Il midollo osseo è infatti uno dei
tessuti più sensibili alle attuali terapie antineoplastiche.
Il trapianto di cellule staminali emopoietiche ha dato
risultati positivi anche nel mieloma multiplo o plasmocitoma, patologia in cui le cellule tumorali producono
una proteina anomala. Anche la talassemia o anemia
mediterranea può essere vantaggiosamente curata con
TCSE, così come alcuni rari errori congeniti del metabolismo.
Un’altra indicazione terapeutica riguarda le malattie
autoimmuni che non rispondono alle cure convenzionali. Si riporta di seguito un elenco delle patologie per
cui risulta indicato il trapianto di midollo (fonte: Ministero della Salute):
r aplasia midollare
r leucemie acute linfoidi e mieloidi
r
r
r
r
r
r
r
r
r
r
r
14
leucemia mieloide cronica
mielofibrosi con metaplasia mieloide
linfoma non-Hodgkin
linfoma di Hodgkin
leucemia linfatica cronica
mielodisplasia
mieloma multiplo
neuroblastoma
sarcoma dei tessuti molli
immunodeficienze
alcune malattie autoimmuni.
14.7 Recenti acquisizioni: staminali
pluripotenti indotte (iPS)
Il premio Nobel per la medicina 2012 è stato assegnato all’inglese John Gurdon e al giapponese Shinya Yamanaka (figura 14.7) per i loro studi sulla riprogrammazione cellulare. La scoperta, che può a buon diritto
essere definita rivoluzionaria, riguarda l’inserimento di
geni nel nucleo di cellule adulte (mature) che possono
venire “riprogrammate” per diventare embrionali pluripotenti.
Le motivazioni che hanno spinto questi scienziati a
intraprendere la strada della riprogrammazione cellulare
ha preso le mosse dalla necessità di superare due criticità
che limitano l’impiego delle cellule staminali embrionali. La prima motivazione è di ordine immunologico, in
quanto queste cellule vengono riconosciute come estranee dall’organo in cui vengono trapiantate scatenando
quindi una reazione immunitaria; la seconda è di natura
etica: la manipolazione di cellule embrionali provoca
necessariamente la distruzione dell’embrione stesso.
Figura 14.7 I premi nobel per la Medicina 2012. A sinistra
l’inglese John Gurdon e a destra il giapponese Shinya Yamanaka.
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14
LE CELLULE STAMINALI
La scoperta che possono essere ottenute cellule
staminali pluripotenti indotte (iPS) attraverso una riprogrammazione nucleare può permettere di superare
brillantemente questi limiti. L’idea da cui lo scienziato
giapponese e il collega inglese (noto per ricerche sulla
clonazione) sono partiti prende le mosse dalla clonazione della famosa pecora Dolly, resa possibile dal trasferimento del nucleo di una cellula somatica adulta nell’ovulo denucleato di una pecora “ospite” nel cui utero l’ovulo
così trasformato è stato impiantato. Il nucleo della cellula
adulta così trasferito può riprogrammarsi trasformandosi in cellula embrionale da cui può trarre origine un
intero organismo (come è appunto avvenuto nel caso
della pecora Dolly). Le ricerche hanno portato alla scoperta di quattro geni fondamentali che governano la vita
delle cellule staminali. Questi geni sono stati isolati dagli
ovociti di topo e trasferiti all’interno del nucleo di cellule adulte prelevate dalla pelle di topo. Queste ultime si
sono trasformate in cellule embrionali, denominate cellule staminali pluripotenti indotte (iPS).
La tecnica prevede il prelievo di cellule cutanee (fibroblasti) con una piccola biopsia cutanea e la loro coltura in piastra. I geni che inducono la riprogrammazione
vengono introdotti nel nucleo di queste cellule per mezzo di vettori retrovirali (capitolo 7). Nel tempo di un
mese queste cellule diventano iPS, occorrono poi almeno due settimane per la loro espansione in coltura e altre
quattro per ottenere la loro differenziazione, che si può
realizzare in direzione di qualsiasi tessuto. La scoperta
sembra aprire nuove prospettive nella terapia dell’infarto
del miocardio con la sostituzione di nuovi cardiomiociti
(cellule della muscolatura contrattile del cuore) al posto
di quelli morti. Le cellule iPS possono essere indotte a
differenziarsi anche come neuroni: questo lascia intravvedere la possibilità di riparare lesioni spinali. Un aspetto
che può rivelarsi decisivo nella possibile riparazione delle
menomazioni neuronali spinali è rappresentato dalla necessità di intervenire con urgenza, il che è possibile solo
se si dispone di una riserva di iPS sempre disponibili. Si
può quindi ipotizzare di creare vere e proprie “banche
di iPS”, come avviene per le banche del sangue, anche
se esiste una differenza sostanziale fra i gruppi sanguigni
(quattro) e i tipi cellulari diversi (oltre diecimila). L’ideale sarebbe trovare una sorta di tipo cellulare paragonabile
al gruppo sanguigno 0 (zero), che come noto è donatore
universale. Si calcola comunque che con almeno 150 tipi
di iPS si possa coprire il 90% della popolazione.
Uno degli aspetti più significativi di questa scoperta
consiste nella possibilità di introdurre le cellule originate da iPS nello stesso paziente da cui sono state prelevate le cellule da riprogrammare, eliminando in questo
modo all’origine i problemi di incompatibilità immunologica. È possibile quindi ottenere cellule sane da individui malati.
Nuovi indirizzi di ricerca sono volti alla individuazione di vettori non retrovirali, da impiegare per
l’introduzione dei geni all’interno delle cellule da riprogrammare, al fine di evitare qualsiasi rischio di dereprimere o comunque indurre l’espressione di geni oncògeni (oncogèni) che potrebbero indurre tumori.
Sono in ogni caso da chiarire diversi aspetti ancora
non sufficientemente delineati, quali la possibilità che
vengano trapiantate cellule iPS non completamente
differenziate. Anche questo potrebbe scatenare l’insorgenza di tumori, che infatti in ultima analisi sono eventi
derivati da una riprogrammazione del nucleo cellulare.
14.8 Riprogrammazione cellulare
tramite REAC
Nel novembre 2012 sono stati annunciati dal team di
ricercatori dell’Università di Bologna guidati da Carlo
Ventura i risultati degli studi (pubblicati su Cell transplantation) relativi a una nuova tecnica di riprogrammazione delle cellule adulte che sembra costituire l’evoluzione delle scoperte dei Nobel Yamanaka e Gurdon.
Gli scienziati bolognesi hanno ottenuto una riprogrammazione cellulare diretta di fibroblasti adulti verso destini cellulari diversi (cardiaco, muscolare, neuronale)
senza la necessità di fare prima regredire le cellule adulte
a uno stadio embrionale. La riprogrammazione cellulare
diretta è stata ottenuta per mezzo di campi radioelettrici
a bassissima intensità (REAC, radio electric asymmetric
conveyer). Questa tecnica aggira sia l’uso di vettori virali
che di tecniche di ingegneria genetica, evitando quindi
rischi tumorali o di altro tipo, legati alla modulazione
dell’espressione genica, e rende disponibili cellule staminali immediatamente utilizzabili e sicure. Anche questa scoperta sembra confermare che proprio utilizzando i fibroblasti e con meccanismi di riprogrammazione
come il REAC si può arrivare a processi generali di riparazione e rigenerazione di organi e tessuti danneggiati
da varie patologie.
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ESERCIZI DI VERIFICA
1. Rispondi alle seguenti domande:
Spiega il significato dei termini morula, blastula
e gastrula.
Come vengono chiamati i tre foglietti embrionali
e a quali tessuti e organi danno origine?
Quali sono le proprietà delle cellule staminali?
Come vengono classificate le cellule staminali
in base alla loro potenzialità?
Cosa sono e dove si trovano le cellule staminali
emopoietiche?
Dove si possono trovare nell’uomo le cellule
staminali adulte?
Cosa si intende per trapianto autogenico (autologo) e allogenico?
In che cosa consiste il “regime di condizionamento” in un paziente che deve subire un trapianto di cellule staminali?
Come si può stabilire la compatibilità tissutale
per un trapianto di cellule staminali?
Che cosa sono le cellule staminali pluripotenti
indotte (IPS)?
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INQUINANTI XENOBIOTICI E
MUTAGENESI AMBIENTALE
15.1 Genotossicità e cancerogenesi
15.2 Le mutazioni: alcune nozioni
indispensabili
15.3 Mutageni fisici
15.4 Mutageni chimici
15.5 Fonti di esposizione a sostanze
chimiche
Gli organismi viventi sono quotidianamente esposti all’azione di composti sia di origine naturale che di
sintesi, prodotti artificialmente dall’uomo e per questo
denominati xenobiotici, cioè estranei alla composizione
dell’ambiente naturale. Una delle conseguenze più preoccupanti dell’esposizione alle sostanze xenobiotiche
diffuse nell’ambiente è la loro capacità di indurre modificazioni nel genoma degli organismi con cui vengono a
contatto: i possibili effetti mutageni di queste sostanze,
che molto spesso hanno come conseguenza modificazioni cellulari in senso neoplastico, costituiscono oggetto degli studi di mutagenesi ambientale.
15.6 Meccanismi di riparazione del DNA
15.7 Destino degli xenobiotici
nell’organismo
15.8 Metabolismo degli xenobiotici
15.9 Tossicogenetica e polimorfismi
metabolici
15.10 Esempi di attivazione metabolica
15.11 Controlli di genotossicità su matrici
ambientali
15.1 Genotossicità e cancerogenesi
Un agente tossico, naturale o meno, provoca nell’organismo effetti negativi più o meno gravi, a volte anche
con esito letale.
Gli agenti genotossici inducono cambiamenti nel
DNA: l’informazione genetica subisce in qualche misura modificazioni (mutazioni) che, se non vengono
riparate dai sistemi cellulari di riparazione, diventano
stabili. La valutazione di genotossicità di un agente chimico o fisico equivale quindi a verificare la sua capacità
di alterare la struttura del DNA o i suoi meccanismi di
replicazione.
Il verificarsi di mutazioni somatiche può scatenare
fenomeni di cancerogenesi, cioè dare origine a tumori,
patologie riconducibili a qualche alterazione del DNA.
Se quindi nell’ambiente si diffondono agenti mutageni,
ci si può purtroppo attendere fenomeni di genotossicità
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INQUINANTI XENOBIOTICI E MUTAGENESI AMBIENTALE
e un conseguente rischio cancerogeno. La relazione di
interdipendenza fra mutagenicità e cancerogenicità è
confermata dal test di Ames, che impiega ceppi batterici
su cui vengono saggiate sostanze chimiche o agenti fisici
per valutarne l’azione mutagena e quindi la potenziale
cancerogenicità.
Se le mutazioni riguardano la linea germinale possono essere ereditate. Le conseguenze non si osserveranno nell’individuo che le ha subite, ma nella progenie
a cui sono trasmesse, con effetti anche molto gravi: gli
agenti teratogeni inducono anomalie nello sviluppo
embrionale, nel feto o nel neonato. Agenti fisici (radiazioni), molte sostanze chimiche e alcuni farmaci, se
assunti durante la gravidanza, possono avere effetto teratogeno. I danni provocati al regolare sviluppo dell’embrione possono condurre all’aborto o a malformazioni
congenite di varia gravità. Quando le mutazioni si verificano nelle cellule somatiche, come in effetti avviene più
di frequente, non vengono naturalmente trasmesse alle
generazioni successive.
15.2 Le mutazioni: alcune nozioni
indispensabili
La variabilità genetica, che si verifica con i processi di
ricombinazione e con le mutazioni, è alla base dei fenomeni di selezione naturale. Le mutazioni consistono
in cambiamenti all’interno del genoma che, in quanto
tali, sono trasmessi alla progenie: si tratta di fenomeni
rari, improvvisi e casuali. Negli organismi con corredo cromosomico diploide i cromosomi di ogni coppia
(cromosomi omologhi) contengono gli stessi geni disposti nello stesso ordine lungo il filamento di DNA,
anche se i geni di ogni coppia di cromosomi omologhi
(alleli) possono non essere uguali. Si può ragionevolmente pensare che le varie forme alleliche di un gene
siano generate da altrettante mutazioni. Il genotipo è
espresso in modo manifesto nel fenotipo (l’insieme
delle caratteristiche visibili) e poiché gli alleli possono
essere dominanti o recessivi, le mutazioni dominanti
vengono espresse fenotipicamente anche nella condizione eterozigote (presenza in un solo allele), mentre
quelle recessive sono espresse solo allo stato omozigote
(mutazione presente in entrambi gli alleli). Quanto sopra non vale per gli organismi aploidi (batteri, virus),
in cui il cromosoma è unico e le mutazioni vengono
15
espresse sempre e comunque nella stessa generazione
in cui si verificano.
Le mutazioni possono riguardare le cellule somatiche o quelle germinali (figura 15.1). Se le mutazioni
somatiche coinvolgono geni che regolano la crescita
cellulare, si può avere la trasformazione della cellula in
senso tumorale. Mutazioni somatiche generano cloni di
cellule che possono coesistere in uno stesso tessuto con
cellule normali non mutate; tali mutazioni non sono ovviamente trasmissibili alla discendenza. Le mutazioni
che si verificano nelle cellule germinali sono trasmesse
in tutte le cellule dell’embrione generato da quelle cellule germinali. Le mutazioni nella linea germinale non
hanno quindi effetto nell’individuo colpito, ma possono
manifestarsi nella discendenza come gravi malattie genetiche.
Si possono distinguere tre tipi fondamentali di mutazioni:
❖ geniche: interessano singoli geni e si possono verificare per sostituzione, inserzione o delezione di basi.
Queste ultime (mutazioni frameshift) portano allo
scorrimento (shift) del modulo o cornice (frame)
di lettura delle triplette di basi a valle del sito di mutazione, con conseguente profonda alterazione del
messaggio genetico
❖ cromosomiche: hanno un bersaglio più ampio e
riguardano la struttura di interi cromosomi (aberrazioni cromosomiche)
❖ genomiche: interessano l’intero genoma e consistono in variazioni del numero complessivo di cromosomi: poliploidia (numero di cromosomi multiplo
di quello caratteristico della specie) e aneuploidia
(quando manca un esponente di una coppia oppure
un membro è presente più volte).
Le mutazioni si distinguono in spontanee e indotte.
Le prime avvengono senza l’intervento di agenti esterni
con una frequenza molto bassa (1/10–4–1/10–9). Quelle indotte sono causate da numerosi agenti mutageni,
chimici o fisici. Le mutazioni spontanee nell’organismo umano possono rientrare nel normale processo di
turnover cellulare dei tessuti oppure, caso ovviamente
molto grave, indirizzare la cellula verso la trasformazione tumorale: la cancerogenesi è attivata dall’accumulo
di mutazioni che possono rendersi evidenti solo dopo
molti anni, per cui la probabilità di ammalarsi di tumore
aumenta con l’età.
213
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INQUINANTI XENOBIOTICI E MUTAGENESI AMBIENTALE
Vento
Freddo
Pioggia
Caldo
Acqua
Ventilazione
Gas
Ventilazione
Materiale da costruzione
Scarico
Pressione
Diffusione
Figura 15.2 ll radon nelle abitazioni. Fonti di radon (A) e
sistemi di dispersione (A).
15
Gli effetti biologici delle radiazioni sono diversi
da quelli causati da agenti chimici. Sono infatti indipendenti dal metabolismo, dal tipo di organismo che subisce l’esposizione e dalla sua complessità strutturale: le
radiazioni agiscono direttamente sul DNA cellulare. Gli
effetti delle radiazioni sono diversi a seconda del loro
contenuto energetico: quelle ionizzanti (raggi X e γ)
trasferiscono alte quantità di energia e provocano la ionizzazione degli atomi, cioè la perdita definitiva di uno
o più elettroni. Le radiazioni a energia inferiore (UV)
non riescono a spezzare il legame fra nucleo ed elettrone, ma si limitano a eccitare l’atomo: provocano in pratica la transizione reversibile di elettroni da un’orbita a
un’altra senza destabilizzare l’atomo.
Radiazioni ionizzanti
Le radiazioni ionizzanti come i raggi X e i raggi γ provocano un danno diretto sul DNA causando nelle strutture
biologiche alterazioni dovute alla capacità di strappare
Figura 15.3 Lo spettro elettromagnetico.
215
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15
INQUINANTI XENOBIOTICI E MUTAGENESI AMBIENTALE
Effetto
indiretto
Fo
to n
e
e-
dove i simboli con un pallino nero indicano radicali liberi.
È indispensabile tenere presente che, se da una parte
il danno si verifica in tempi velocissimi, dall’altra gli effetti biologici dell’azione dei radicali liberi si manifestano anche dopo molti anni.
p+
Radiazioni non ionizzanti
Effetto
diretto
Fo
e
to n
ep+
1 nm
2 nm
Figura 15.4 Radiazioni. In figura sono mostrati i danni diretti e
indiretti delle radiazioni.
elettroni da atomi o molecole, oppure ionizzano altri
atomi o molecole diverse dagli acidi nucleici che, a loro
volta, agiscono sul DNA (danno indiretto, figura 15.4).
Una delle conseguenze delle radiazioni ionizzanti
è la formazione di radicali liberi: atomi, molecole,
gruppi atomici in cui sull’orbita elettronica esterna è
presente un elettrone spaiato dopo che l’altro è stato
“strappato” dall’energia di ionizzazione. I radicali liberi
sono specie chimiche altamente instabili e reattive, che
tendono a riacquistare l’elettrone mancante o a cedere
quello spaiato a molecole con ruolo biologico centrale
come DNA, enzimi, proteine: il danno innesca nelle
strutture cellulari reazioni a catena complesse e imprevedibili. Se si considera per esempio che le strutture
biologiche sono composte in gran parte di acqua, appare estremamente importante nella formazione di radicali liberi il fenomeno noto come fotolisi dell’acqua,
che consiste nell’assorbimento da parte della molecola
di energia sufficiente a provocare l’allontanamento di
un elettrone:
irradiazione + H2O
H2O+ + e–
–
e + H2O
H2O–
+
+
H2O
H + OHt
–
H2O
Ht + OH–
Sono rappresentate dalle radiazioni UV, che vengono
distinte in radiazioni UVA (> 315 nm), UVB (280-315
nm), UVC (< 280 nm). Tali radiazioni determinano la liberazione di energia quando un elettrone, eccitato e quindi passato su un’orbita più esterna, torna nell’orbita primitiva restituendo l’energia accumulata come aumento
di temperatura. Ciò può attivare reazioni fotochimiche
che non potrebbero altrimenti avvenire. Fonti di esposizione sono il sole, le cui radiazioni UV più dannose a corta
e media lunghezza d’onda sono filtrate dallo strato di ozono, ma che comunque, se l’esposizione è intensa e prolungata, possono provocare tumori alla pelle; le lampade UV,
costruite con quarzo al posto del vetro (impermeabile agli
UV) e contenenti vapori di mercurio, xenon o idrogeno.
Gli effetti biologici si registrano sul DNA e consistono
nella formazione di dimeri fra le basi pirimidiniche.
Danni biologici delle radiazioni
I danni biologici delle radiazioni si manifestano a livello
molecolare o cellulare.
Danni molecolari
Si possono distinguere in base all’effetto di eccitazione o
di ionizzazione che sono in grado di provocare:
r le radiazioni UV (non ionizzanti) provocano negli
acidi nucleici la formazione di dimeri fra due timine adiacenti sullo stesso filamento di DNA
r le radiazioni ionizzanti provocano l’eliminazione
di basi azotate o legami crociati DNA-proteine ad
opera dei radicali liberi.
Danni cellulari
Comprendono alterazioni a livello delle strutture cellulari (membrane plasmatiche, citoplasma e nucleo). Le
membrane plasmatiche vengono danneggiate da pro-
216
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INQUINANTI XENOBIOTICI E MUTAGENESI AMBIENTALE
Luce
ultravioletta
T
A
T
A
Dimero
di timina
A
T
T
A
G
C
15
il meccanismo con cui in primo luogo si esercita la loro
cancerogenicità. È possibile distinguere fra:
r mutageni diretti, sostanze chimiche che interagiscono direttamente con il DNA
r promutageni, molecole di per sé non reattive ma
che lo diventano ad opera delle trasformazioni subite nel metabolismo
r mutageni indiretti, in grado di interagire con molecole o strutture biologiche interessate alla replicazione del materiale genetico. Molti mutageni indiretti
vengono utilizzati come antitumorali.
Mutageni diretti
cessi di perossidazione dei lipidi e di ossidazione dei
gruppi sulfidrilici delle proteine. Ciò conduce a pesanti modificazioni della fluidità e della permeabilità delle
membrane con conseguente morte della cellula. Tale
evento finale si può verificare come incapacità riproduttiva in cellule che dovrebbero attivamente riprodursi (cellule staminali del midollo emopoietico) oppure
come attivazione dell’apoptosi. L’apoptosi è una sorta
di morte cellulare programmata (suicidio cellulare)
che si verifica normalmente nello sviluppo embrionale
o nell’adulto per evitare la trasformazione neoplastica di
cellule, che vengono così avviate all’autoeliminazione.
In tali cellule si assiste alla condensazione del DNA in
masse che funzionano come segnale di riconoscimento
per i fagociti che quindi le digeriscono.
Queste sostanze agiscono direttamente sul DNA anche
senza l’intervento di sistemi metabolici. Comprendono:
r analoghi delle basi: sostanze dotate di una qualche
analogia di struttura con le basi azotate e che vengono erroneamente incorporate nel DNA (5-bromouracile; 2-aminopurina)
r agenti che reagiscono con il DNA: acido nitroso;
idrossilammina; idrazine (industria chimica, propellenti e chemioterapici); agenti alchilanti; psoraleni
(presenti negli agrumi o sintetici, subiscono fotoattivazione da UV formando addotti con il DNA e
bloccandone la replicazione: vengono impiegati per
la terapia della psoriasi, malattia dell’epidermide con
iperproliferazione cellulare); epossidi (di etilene e
di propilene nelle resine epossidiche, nei processi di
verniciatura e incollaggio, pesticidi come il dieldrin
e l’eldrin, intermedi metabolici di IPA e stirene);
aldeidi (mobili, pitture murali e detergenti contengono formaldeide che forma addotti con i gruppi
aminici delle basi azotate e provoca mutazioni puntiformi nonché inibizione di RNA e DNA polimerasi)
r agenti intercalanti: le acridine (sostanze coloranti
come l’arancio di acridina) e il bromuro di etidio
sono mutageni fra i più noti, inducono inserzione o
delezione di basi provocando mutazioni da scivolamento nello schema di lettura.
15.4 Mutageni chimici
Promutageni
La varietà delle sostanze chimiche cui è esposto l’organismo è enorme e la loro azione mutagena sembra essere
Comprendono sostanze che sono convertite in derivati
reattivi da parte di reazioni metaboliche:
G
C
T
A
T
A
A
C
G
C
Figura 15.5 Formazione di dimeri di timina.
217
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15
INQUINANTI XENOBIOTICI E MUTAGENESI AMBIENTALE
r ammine aromatiche: impiegate nell’industria come
antiossidanti, nella preparazione di coloranti, nell’industria petrolchimica e della gomma, si originano
dalla combustione di materiale organico (cottura
alimenti e fumo di sigaretta). Composti correlati con
le ammine aromatiche sono gli azocoloranti e le ammine eterocicliche (per es. il colorante rosso metile)
r IPA: benzo[a]pirene, antracene, fenantrene ecc.
r benzene, stirene: presenti nel fumo di sigaretta, nei
gas di scarico degli autoveicoli, prodotti durante la
cottura di alcuni cibi. Si trasformano in nitroderivati
per azione degli ossidi d’azoto atmosferici
r aflatossine, sostanze genotossiche e cancerogeni epatici tra i più potenti, prodotte da Aspergillus spp. nelle
granaglie e nei cibi contaminati da queste muffe
r nitrosammine si originano per nitrosazione delle ammine a opera dei nitriti nello stomaco o per il
metabolismo batterico intestinale (tabacco, alimenti
conservati con l’impiego di nitrati e nitriti)
r carbammati, impiegati come anticrittogamici e, in
particolare, i ditiocarbammati utilizzati nell’industria
della gomma, in quella tessile e degli adesivi
r idrocarburi alogenati utilizzati in agricoltura e
nell’industria chimica, si possono formare nella potabilizzazione dell’acqua quando viene impiegato cloro.
Il cloruro di vinile viene biotrasformato nell’organismo
dal citocromo P450 e forma addotti con il DNA, altri
alcheni formano epossidi altamente genotossici.
Mutageni indiretti
Comprendono agenti chimici utilizzati come antimetaboliti o inibitori della crescita:
r bleomicina: chemioterapico per la cura dei linfomi
e altri carcinomi. Reagisce con il DNA in presenza di
ioni ferro e ossigeno dando origine alla forma attivata
r mitomicina: un antibiotico impiegato come antitumorale isolato da Streptomyces caespitosus
r antracicline: gruppo di sostanze fra cui l’adriamicina, farmaco antineoplastico
r antimetaboliti: sostanze simili ai normali metaboliti, cui si sostituiscono bloccando le vie metaboliche
in cui sono coinvolti (metatrexato, utilizzato per la
psoriasi e come immunosoppressore; analoghi pirimidinici e purinici come la 6-mercaptopurina impiegata come antileucemico)
r inibitori della mitosi: il taxolo da Taxus brevifolia
(figura 15.6), la vincristina e la vinblastina dalla pervinca sono impiegati nei linfomi e nelle leucemie.
15.5 Fonti di esposizione a
sostanze chimiche
L’organismo è quotidianamente esposto a una miriade
di sostanze chimiche, le cui fonti si collocano in diversi
ambienti e contesti professionali.
Ambiente esterno
Figura 15.6 Taxus brevifolia (fonte: www.wikipedia.it).
Le attività antropiche sono sicuramente le maggiori responsabili del rilascio di xenobiotici nelle matrici ambientali. Nell’aria la combustione di carburanti fossili
costituisce la fonte principale di inquinamento: stabilimenti industriali, riscaldamento domestico, autoveicoli e
inceneritori di rifiuti. Il benzene, gli IPA e i loro nitroderivati sono i principali composti genotossici nell’ambiente urbano. Le acque superficiali vengono contaminate
dagli scarichi dei reflui industriali e civili non adeguatamente depurati, le acque profonde (di falda) da pesticidi
e fertilizzanti impiegati in agricoltura. Il cloro impiegato
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INQUINANTI XENOBIOTICI E MUTAGENESI AMBIENTALE
nella potabilizzazione può reagire con altre sostanze presenti nelle reti di distribuzione idrica formando composti
genotossici. I suoli agricoli sono contaminati da acque
irrigue che contengono residui di pesticidi e fertilizzanti
o direttamente dall’impiego di erbicidi (atrazina, diazzine
e triazine), anticrittogamici (carbammati e ditiocarbammati), insetticidi (DDT) e idrocarburi alogenati.
15
tà e cancerogenicità dei metalli pesanti non è però
solo un problema professionale, perché queste sostanze vengono continuamente emesse nelle matrici ambientali (aria, acque, suolo) dalle industrie
metallurgiche, dalle discariche di rifiuti, dal traffico
autoveicolare, fenomeni che causano l’esposizione
generalizzata dell’intera popolazione.
Esposizione professionale
Ambiente confinato
Interessa in tutto il mondo milioni di lavoratori, esposti
per molte ore al giorno al contatto con:
r polveri e particolato: polvere di carbone nelle miniere, polvere di legno, residui della combustione dei
motori diesel
r fibre di vetro, impiegate nell’isolamento termico e
acustico. Causano danni citogenetici e trasformazione cellulare
r asbesto (amianto) cancerogeno a lunga latenza che
agisce sul DNA direttamente o indirettamente con
la formazione di radicali liberi. Provoca asbestosi
(fibrosi parenchimale del polmone), mesotelioma
pleurico, carcinoma polmonare
r fumi, composti chimici: fonte di IPA genotossici è
l’asfalto, soprattutto quando raggiunge temperature intorno ai 150 °C a cui il rischio di volatilità dei
composti è molto più alto. La saldatura provoca liberazione di gas contenenti ossidi e sali di metalli. Parrucchieri e lavoratori della cosmesi sono a contatto
prolungato con le tinture per capelli che contengono
ammine aromatiche, amminofenoli, amminoantrachinoni, azocoloranti ecc.
r gas: i gas utilizzati in chirurgia espongono gli operatori a rischi di mutagenesi, con aumento nella frequenza di aborti spontanei, riduzione della fertilità e
presenza di sostanze mutagene nelle urine
r metalli pesanti: i metalli pesanti e i metalloidi (arsenico) sono responsabili dell’induzione di tumori
in ambito professionale; l’azione cancerogena di
arsenico, nichel e cadmio sembra essere indiretta e
si fa risalire all’inibizione dei meccanismi riparatori
del DNA. Il cromo agisce come mutageno genico a
livello del DNA, mentre a livello cellulare provoca
il blocco del ciclo cellulare, apoptosi e trasformazione neoplastica. Cancerogeni sono anche cobalto e
composti inorganici del piombo. La tossicogenici-
Anche all’interno delle abitazioni, delle scuole, dei luoghi di lavoro dove non si effettui una frequente ventilazione si possono liberare miscele di sostanze mutagene
composte da IPA, ammine e nitrosammine, asbesto, formaldeide. Derivano dal fumo dei camini e delle sigarette, da particolari metodi di cottura dei cibi, da componenti dei mobili e da tinture per le pareti. Se si considera
che gran parte della popolazione trascorre molto tempo
in ambienti confinati, che durante l’inverno le norme sul
risparmio energetico (con l’impiego di serramenti ad
alto coefficiente di isolamento) impediscono l’ingresso
di aria esterna e che nella stagione calda sono molto diffusi gli impianti di climatizzazione, se ne può dedurre
che un efficace e frequente ricambio di aria all’interno
degli edifici può risultare spesso insufficiente.
Alimentazione
Mutageni e cancerogeni presenti negli alimenti possono
essere di origine naturale, come per esempio le micotossine (aflatossine, fumosine, ocratossine) prodotte da
alcune muffe. È purtroppo frequente negli alimenti la
contaminazione da xenobiotici di derivazione ambientale, dagli scarichi degli autoveicoli ai residui di pesticidi,
ai metalli pesanti. Negli alimenti si ritrovano molti additivi e sostanze che si originano durante la cottura dei
cibi, fra cui soprattutto:
r nitrosammine (tabella 15.1)
r IPA: vengono prodotti quando la carne viene cotta
direttamente sulla fiamma libera e derivano dalla pirolisi dei grassi. Questi composti si formano anche
durante l’affumicatura di carne e pesce
r ammine eterocicliche (AEC): si formano da reazioni dei costituenti della carne (proteine, zuccheri, creatina, acidi nucleici) durante la cottura. All’aumento
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INQUINANTI XENOBIOTICI E MUTAGENESI AMBIENTALE
Tabella 15.1 Nitrosammine negli alimenti
NITROSAMMINE
TIPO DI ALIMENTO (mg/kg)
N-nitroso-dimetilammina
Seppia in conserva (300), carne salata (54), pesce affumicato (32), carni conservate (22),
bacon (17), salsiccia (12), birra (8), formaggio (5), latte in polvere (4,5)
Dietilammina
Formaggio (20), salsiccia (10), pesce conservato (4,8), pane di mais (4,8)
Pirrolidina
Bacon fritto (100), salsiccia (54), prosciutto (36), carne affumicata (10)
Piperidina
Salsiccia (50), mortadella (50), pesce conservato (23), carne affumicata speziata (9)
Metilbenzilammina
Pane di mais (> 100)
della temperatura, i precursori di AEC migrano verso
la superficie della carne e i composti genotossici si
formano per condensazione e ciclizzazione quando si
raggiungono temperature critiche e la carne si disidrata. Qualsiasi tipo di cottura della carne porta in grado
variabile alla formazione di AEC, per cui l’unico modo
di diminuire l’introduzione di xenobiotici biologicamente attivi è quello di ridurne il consumo. Il pretrattamento con microonde della carne prima della cottura riduce da tre a nove volte la produzione di AEC,
diminuendo del 95% la loro mutagenicità. Alcune sostanze naturali sembrano invece agire come inibitori
della cancerogenesi, come la salsa di soia fermentata,
la curcumina dietetica e il wasabi (spezia giapponese)
r fenoli: presenti nel modo vegetale, vengono impiegati come additivi e alcuni di essi hanno dimostrato
azione genotossica; altri, al contrario, sembrano avere effetto protettivo sulla cancerogenesi.
15.6 Meccanismi di riparazione
del DNA
Il DNA umano possiede meccanismi di riparazione che
in alcuni casi riescono a rimuovere il danno subìto. Tali
meccanismi, frutto dell’evoluzione, tentano di ripristinare la corretta sequenza nucleotidica oppure permettono in qualche modo la sopravvivenza delle cellule. I
principali meccanismi conosciuti di riparazione sono:
r excisione di nucleotidi
r excisione di basi
r ricombinazione
r modifica degli appaiamenti errati.
L’excisione di nucleotidi consiste nell’apertura della
doppia elica nel tratto danneggiato per denaturazione,
rimozione dell’oligonucleotide danneggiato, sintesi riparativa sullo stampo dell’elica complementare integra,
ligazione della catena neosintetizzata al DNA.
La riparazione per excisione di basi richiede l’intervento della DNA glicosidasi, che rompe il legame fra
la base danneggiata e il desossiriboso. La base anomala
viene liberata e sostituita con una corretta, che viene poi
inserita nella catena da una DNA polimerasi.
La riparazione per ricombinazione interviene
negli eucarioti per riparare le rotture della doppia elica
causate soprattutto da radicali liberi, radiazioni ionizzanti e agenti ossidanti, e coinvolge la sintesi di una copia identica di DNA costituita da un cromatidio fratello.
La modifica degli appaiamenti errati è operata da
un sistema noto come MMR (mismatch repair) che agisce immediatamente dopo ogni replicazione del DNA
correggendo gli errori della DNA polimerasi.
Alcuni danni possono essere riparati direttamente
per mezzo della fotoriattivazione, che ripara i danni da
raggi UV, e della transmetilazione, che ripara quelli da
agenti alchilanti. La fotoriattivazione consiste nell’utilizzo dell’energia luminosa per rompere l’anello di ciclobutano che lega fra di loro le due basi pirimidiniche
(dimeri di timina). La transmetilazione rimuove la Ometilguanosina, che può accoppiarsi indifferentemente
con l’adenina o la citosina, la cui formazione è indotta da
agenti metilanti o farmaci chemioterapici. La riparazione viene effettuata da una metiltransferasi.
15.7 Destino degli xenobiotici
nell’organismo
Vengono definite xenobiotiche le sostanze estranee
all’organismo, possibili cause di effetti indesiderati. Il
loro potenziale tossico non è determinato solo dalle
220
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INQUINANTI XENOBIOTICI E MUTAGENESI AMBIENTALE
Assorbimento
Distribuzione
Bioaccumulo
e rilascio
Biotrasformazione
Eliminazione
Figura 15.7 Tossicocinetica. In figura sono illustrati i
principali processi che influenzano la cinetica di una sostanza
nell’organismo.
loro proprietà intrinseche, ma anche dal tipo di reazione che l’organismo ha nei loro confronti, che dipende
dall’assorbimento, dalla distribuzione, dall’accumulo e
dall’eliminazione di queste sostanze. Per questi processi
viene usato in farmacologia il termine “farmacocinetica”
e in questo caso, trattandosi di sostanze tossiche, di “tossicocinetica” (figura 15.7).
Parametri fondamentali nel determinare la pericolosità di uno xenobiotico sono la dose, le modalità di esposizione, che può risultare acuta, ripetuta o cronica, e le
vie di penetrazione. Un aspetto molto rilevante è rappresentato dai meccanismi di biotrasformazione che
riguardano le trasformazioni che le sostanze estranee
subiscono nell’organismo ad opera degli enzimi metabolici. La funzione delle biotrasformazioni è essenzialmente quella detossificante, ma in molti casi questi processi contribuiscono ad accrescere il potenziale tossico
degli xenobiotici.
L’organismo può entrare in contatto con le sostanze
estranee attraverso (figura 15.8):
r ingestione di cibi e bevande contaminate
r inalazione di sostanze volatili come gas o particolato
molto fine (fumo e inquinanti dispersi in atmosfera)
r contatto cutaneo diretto
r iniezione endovena o intramuscolo (farmaci, droghe).
Anche se l’epidermide integra e impermeabile all’acqua
rappresenta un’efficace barriera che l’organismo op-
pone all’ingresso delle sostanze estranee, è altrettanto
vero che soluzioni di continuo o la natura stessa degli
xenobiotici, che spesso sono sostanze lipofile, possono
favorirne l’assorbimento, facilitato a volte anche dalla
presenza di solventi o detergenti.
Una volta assorbito e penetrato nei capillari sanguigni, il tossico viene trasportato in circolo e raggiunge i
vari tessuti dove può distribuirsi e concentrarsi in relazione al tipo di tessuto e alla presenza o meno di barriere
particolari, come quella ematoencefalica o placentare.
Alcune sostanze mostrano capacità di bioconcentrazione in determinati tessuti, come accade ai metalli pesanti
nelle ossa. Pesticidi come il DDT, i PCB (bifenili policlorurati) e le diossine si accumulano nel tessuto adiposo.
Le sostanze volatili (etanolo, benzene ecc.) inalate attraverso le vie respiratorie vengono in parte espulse con
l’aria espirata, ma possono facilmente essere assorbite e
immesse in circolo, in relazione alla loro concentrazione
nell’aria ambiente e alle differenze di pressione parziale
dei gas a livello degli alveoli polmonari. Le sostanze ingerite possono a volte essere chimicamente modificate
per idrolisi nell’ambiente acido dello stomaco e passare
attraverso l’intestino senza essere assorbite, quindi eliminate con le feci. Le vie principali di eliminazione sono
quella urinaria, quella biliare con le feci e quella polmonare. L’escrezione biliare si verifica solo per sostanze polari che possono essere sciolte nella bile.
Molte sostanze esogene sono eliminate dopo aver
subìto una trasformazione chimica mediata da enzimi
e che ha luogo principalmente nel fegato, ma anche nei
reni e nei polmoni (figura 15.9).
Cibi e
bevande
Polveri
e liquidi
Apparato
digerente
Pelle
Gas e vapori
Fumi
Inquinamento
atmosferico
Apparato
respiratorio
Sangue
Farmaci
Sostanze d’abuso
Figura 15.8 Vie di esposizione agli xenobiotici.
221
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15
INQUINANTI XENOBIOTICI E MUTAGENESI AMBIENTALE
Fegato
Circolo sanguigno
Circolo
enteroepatico
Intestino
Latte
Pelle
Polmoni
Feci
Ghiandole mammarie
Aria espirata
Reni
Urine
Sebo
Sudore
Cellule desquamate
Peli
Unghie
Figura 15.9 Vie di eliminazione delle sostanze esogene.
15.8 Metabolismo degli xenobiotici
Le sostanze esogene (inclusi i farmaci) vengono metabolizzate nell’organismo attraverso due processi mediati
da reazioni enzimatiche, denominati rispettivamente:
r fase I (di funzionalizzazione), in cui vengono inseriti nella molecola gruppi funzionali reattivi elettrofili o nucleofili, attraverso reazioni di ossidazione, di
riduzione o di idrolisi
r fase II (di coniugazione), caratterizzata da reazioni
di sintesi o coniugazione con gruppi chimici, quali
glutatione, acetile, solfato, glucuronide, di provenienza endogena.
Nel complesso, gli enzimi di fase I e II catalizzano molte
reazioni che hanno l’obiettivo comune di facilitare e promuovere l’escrezione degli xenobiotici trasformandoli
in molecole con un maggior grado di polarità e quindi
più idrosolubili. Si tratta quindi di processi di difesa
dell’organismo tendenti a ridurre il potenziale tossico
o genotossico dei composti chimici, un sistema utile ed
efficace utilizzato anche nel metabolismo dei farmaci.
Nel corso delle biotrasformazioni possono però formarsi alcuni intermedi metabolici molto più instabili delle
molecole da cui derivano, quindi assai più reattivi e pericolosi. Questo fenomeno prende il nome di attivazione
metabolica o bioattivazione.
Reazioni di fase I
Le reazioni di fase I sono mediate da enzimi appartenenti a varie classi: le monossigenasi citocromo P450
dipendenti (CYP) rappresentano il gruppo più numeroso, sono localizzate a livello delle membrane dei mitocondri e del reticolo endoplasmatico, si trovano in particolare (ma non esclusivamente) nelle cellule epatiche.
L’attività specifica di questi enzimi ossidativi, che possiedono come gruppo prostetico un gruppo eme, consiste nell’introdurre nel substrato un atomo di ossigeno.
Di particolare interesse in tossicologia sono gli isoenzimi (capitolo 1) CYP1A1 (indicato anche come AHH,
aryl hydrocarbon hydroxylase), attivo nel tessuto polmonare sugli idrocarburi aromatici, e CYP1A2 a localizzazione soprattutto epatica. Questo enzima ha fra i propri
substrati (quindi interviene nella sua detossificazione)
l’aflatossina B1 di Aspergillus flavus, una micotossina ad
alta potenzialità cancerogena a livello epatico. L’attività
cancerogena dell’aflatossina B1 è legata alla formazione
del relativo epossido, un intermedio metabolico che forma addotti al DNA (un addotto è costituito dal legame
covalente di una molecola con il DNA).
Gli enzimi della famiglia CYP2 sono i più numerosi e comprendono enzimi coinvolti nel metabolismo
di inquinanti ambientali e di molti farmaci antipertensivi, antidepressivi, antistaminici e analgesici. L’enzima
CYP2A6 presente anche nell’apparato respiratorio è
coinvolto nel metabolismo della nicotina, potente cancerogeno dei prodotti derivati dal tabacco (figura 15.10).
Fra gli enzimi di fase I, le alcol-deidrogenasi e le
aldeide-deidrogenasi sono coinvolte nel metabolismo
dell’etanolo. L’alcol etilico, che come noto rappresenta
un composto esogeno di larghissimo uso, viene deidrogenato ad acetaldeide dall’alcol-deidrogenasi poi convertito ad acido acetico dall’aldeide-deidrogenasi.
Reduttasi batteriche della flora commensale del trat-
222
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H
H
N
N
N+
CYP2A6
CH3
Nicotina
N
CH3
Ione nicotin-imminio
Aldeide ossidasi
H
OH
H
H
N
N
CH3
Idrossicotinina
O
N
CYP2A6
N
O
CH3
Cotinina
Figura 15.10 Metabolismo della nicotina. La
biotrasformazione della nicotina ha inizio con un’ossidazione e
procede con una successiva reazione che porta alla formazione
di cotinina, escreta con le urine.
to intestinale possono catalizzare reazioni di riduzione
sui nitrocomposti aromatici dando origine a idrossilammine aromatiche, precursori di composti a elevata genotossicità.
Reazioni di fase II
Le reazioni di fase II sono mediate, fra gli altri, da enzimi
appartenenti alle glutatione-S-transferasi (GST) e Nacetiltransferasi (NAT), che catalizzano reazioni di sintesi e di coniugazione. Anche le reazioni di fase II hanno
lo scopo di detossificare gli xenobiotici inattivandone le
proprietà biologiche ma, a volte, si ottiene l’effetto opposto: nel caso di alcuni derivati N-coniugati delle ammine
aromatiche si genera lo ione nitronio, cancerogeno che
si forma nell’ambiente relativamente acido delle urine.
Questo fenomeno può spiegare la relazione fra esposizione alle ammine aromatiche e tumore alla vescica.
La suddivisione fra reazioni di fase I e II è da considerare una semplificazione del complesso delle trasformazioni che si verificano nel metabolismo, che in realtà
consiste in una rete estremamente articolata di reazioni
interconnesse dalla presenza di metaboliti comuni a più
vie. Da una molecola si possono formare molti intermedi metabolici con caratteristiche e proprietà diverse; il
corredo enzimatico specifico di un tessuto o di un or-
15
gano rispetto a un altro modifica inoltre in una certa
direzione gli equilibri metabolici che in esso si creano.
Questi ed altri ancora sono i motivi per cui un composto
esogeno svolge la propria azione tossica su un bersaglio
preferenziale: metaboliti attivi in un distretto organico
piuttosto che in un altro possono spiegare per esempio
perché il benzene provochi leucemie e linfomi, le ammine aromatiche possano causare tumore alla vescica,
mentre gli idrocarburi policiclici aromatici (IPA) provochino tumori al polmone.
Molteplici fattori possono influenzare in varia misura
il metabolismo: fra questi il sesso (in relazione ai diversi
quadri ormonali), l’età e lo stato di salute. Patologie o disfunzioni epatiche o renali alterano l’attività metabolica
di questi importanti organi-filtro, con il possibile accumulo di metaboliti tossici nel sangue o nei tessuti. Dieta,
fumo, alcol, farmaci, condizioni di stress, attività fisica,
stato di nutrizione sono tutti fattori che hanno effetti
sulle attività metaboliche dell’organismo. L’alcol ha un
elevato potere di induzione sull’attività degli enzimi che
lo metabolizzano, così come le benzodiazepine e i barbiturici; PCB e diossine attivano gli enzimi che ossidano gli xenobiotici. Come sopra esposto, le conseguenze
delle biotrasformazioni possono essere talvolta anomale, con la formazione di intermedi instabili e iperreattivi,
potenzialmente o notoriamente cancerogeni. Al contrario, sostanze normalmente presenti nella dieta come
la caffeina, i flavonoidi di cui sono ricchi la frutta e i
vegetali, componenti del vino rosso come il resveratrolo, farmaci come il paracetamolo e l’acido acetilsalicilico
sono tutti inibitori dell’attività dei sistemi enzimatici di
bioattivazione.
15.9 Tossicogenetica e polimorfismi
metabolici
Alcuni enzimi di fase I e II coinvolti nel metabolismo
degli xenobiotici sono codificati da geni polimorfici,
cioè presenti nella popolazione in più forme alleliche.
Queste varianti alleliche sono originate da mutazioni
puntiformi, il cui risultato pratico è una forte variabilità
sia nella sintesi che nella modulazione dell’attività enzimatica controllata: si può andare dall’aumento di attività a una sua riduzione fino all’assenza completa. Questo
fenomeno può spiegare come la capacità metabolica di
un individuo sia da far risalire in ultima analisi al suo
223
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15
INQUINANTI XENOBIOTICI E MUTAGENESI AMBIENTALE
corredo genetico e come, quindi, ci si possa attendere
una forte variabilità nel metabolismo degli xenobiotici.
Le prime evidenze di tali fenomeni sono legate alla comparsa, con una frequenza superiore a quanto ragionevolmente atteso, di reazioni indesiderate in seguito alla
somministrazione di farmaci di largo impiego e comunemente ben tollerati. In questi casi i soggetti presentano difetti enzimatici che non permettono o permettono
solo in misura limitata, e quindi insufficiente, la detossificazione del farmaco, che di conseguenza persiste più a
lungo in circolo (più lungo periodo di emivita, cioè del
tempo necessario a dimezzarne la concentrazione iniziale nel sangue o nelle urine) mostrando gli effetti indesiderati. Esempi sono l’isoniazide (un antitubercolare)
e la debrisochina (un antipertensivo). Il polimorfismo
del gene che codifica per la debrisochina-idrossilasi è la
causa di una notevole variabilità nella risposta al farmaco, da soggetti a metabolizzazione lenta nei quali il farmaco permane a lungo in circolo, con rischio di collasso,
ad altri a metabolizzazione rapida che manifestano una
risposta normale.
Il difetto enzimatico può manifestarsi anche come
mancato effetto terapeutico, quando il farmaco viene
somministrato in forma inattiva, che deve essere trasformata in quella attiva da uno specifico sistema enzimati-
co, come nel caso del farmaco antiepilettico carbamazepina. Se l’enzima deputato alla sua trasformazione nella
forma attiva è carente, la terapia non risulta efficace, a
meno che la carbamazepina non venga somministrata
direttamente in forma attiva.
15.10 Esempi di attivazione
metabolica
Vengono di seguito riportati degli esempi di come il
metabolismo di alcuni xenobiotici possa trasformarli in
derivati genotossici e cancerogeni.
Metabolismo del benzene
Principali fonti di esposizione dell’organismo al benzene (il più piccolo degli idrocarburi aromatici) sono
sicuramente le emissioni degli autoveicoli, l’evaporazione durante il rifornimento di carburante, il fumo di
sigaretta attivo (stimabile in 2 mg/pacchetto) e passivo.
Il benzene inalato e non allontanato con l’espirazione
subisce un’attivazione metabolica in fase I, quindi una
detossificazione in fase II (figura 15.11).
H
OH
CYP2E1
Benzene
EH
O
O
Benzene ossido
H
OH
Diidrodiolo
Benzene ossepina
EH
OH
OH
OH
OH
CYP2E1
OH
Idrochinone
O
CYP2E1
OH
Fenolo
OH
OH
Catecolo
MPO
NQO1
O
p-Benzochinone
OH
1,2,4-Triidrossibenzene
o benzenetriolo
Figura 15.11 Metabolismo del benzene. In figura sono schematizzati i passaggi del metabolismo ossidativo del benzene.
224
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INQUINANTI XENOBIOTICI E MUTAGENESI AMBIENTALE
Si tratta in origine di un composto stabile e poco
reattivo, che può subire però una bioattivazione. Il suo
metabolismo inizia con l’ossidazione da parte di monossigenasi P-450-dipendenti a benzene-ossido, che viene
poi convertito a fenolo. Da questo si formano catecolo,
idrochinone e 1,2,4-benzenetriolo ad opera dell’enzima
CYP2E1.
L’esposizione al benzene ha gravi conseguenze a livello ematologico e linfatico: causa infatti leucemie mieloidi, linfomi, anemia aplastica. Responsabile principale
di queste patologie sembra essere il benzochinone, un
intermedio reattivo derivato dall’idrochinone, che agisce a livello del midollo osseo emopoietico.
I vari prodotti dell’ossidazione del benzene sono
coniugati in fase II con il glutatione, convertiti in acidi
mercapturici, che sono poi eliminati con le urine. Si può
verificare in alternativa l’apertura dell’anello aromatico
con formazione di muconaldeide, un intermedio tossico
che può dare origine ad addotti al DNA. La sua ulteriore
ossidazione porta all’acido trans, trans-muconico eliminato con le urine.
15
Benzo[a]pirene
Benzo[a]pirene-7,8-epossido
O
Benzo[a]pirene-7,8-diidrodiolo
HO
OH
Metabolismo degli IPA
Gli idrocarburi policiclici aromatici (IPA) sono in origine composti relativamente inerti, ma vengono convertiti in fase I dalla monossigenasi CYP1A1 (AHH)
in prodotti di ossidazione (epossidi) altamente instabili, che reagiscono con proteine e DNA, a meno che
non vengano immediatamente trasformati nelle reazioni idrolitiche e di coniugazione della fase II (figura
15.12).
In fase I si formano così composti quali il BPDE
(benzo[a]pirene-7,8-diidrodiolo-9,10-epossido), che è
il principale metabolita cancerogeno del benzopirene e
in grado di formare addotti al DNA, cioè molecole di
acido nucleico legate al BPDE.
Le reazioni di fase II possono prevenire la formazione di BPDE, ma anch’esse possono dare origine in
alcuni casi a intermedi (esteri solfato) che si decompongono facilmente generando molecole altamente cancerogene. In ultima analisi l’ossidazione degli IPA ad opera
dell’AHH che avviene a livello polmonare è un evento
centrale nella formazione di composti altamente genotossici e cancerogeni, responsabili principali del tumore
al polmone.
Benzo[a]pirene-7,8-diidrodiolo-9,10-epossido
O
HO
OH
Addotto alla guanosina
O
N
N
N
N
R
HO
NH
HO
OH
Figura 15.12 Formazione del benzo[a]pirene7,8-diidrodiolo9,10-epossido (BPDE).
225
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15
INQUINANTI XENOBIOTICI E MUTAGENESI AMBIENTALE
Metabolismo delle ammine aromatiche
Le ammine aromatiche, derivate dall’ammoniaca dove
uno o più atomi di idrogeno sono sostituiti da un radicale aromatico (per es. benzene, naftene, difenile), hanno
come capostipite l’anilina. Altre ammine aromatiche
sono la benzidina, la 2-naftilamina, la o-toluidina, la
3-3ʹ-diclorobenzidina, la 4-cloro-o-toluidina e la 4-cloroanilina. Vengono utilizzate nella produzione di coloranti, nell’industria della gomma e delle materie plastiche, in quella petrolchimica.
Attraverso varie reazioni di ossidazione e di deaminazione ossidativa le ammine aromatiche possono dare
origine ad aldeidi, ammoniaca e idroperossidi, idrossilammine e acidi idrossiamminici. Nel corso di queste
trasformazioni, catalizzate da enzimi della fase I (monossigenasi CYP1A2 e ciclossigenasi), si generano intermedi molto più reattivi dei composti di partenza. La detossificazione avviene in fase II con l’intervento di specifici
enzimi che portano a N-acetati, N-glucoronidi, N-solfati.
Alcuni di questi composti sono però instabili e si decompongono spontaneamente generando ioni nitronio che si
legano alle proteine e formano addotti del DNA.
15.11 Controlli di genotossicità
su matrici ambientali
Gli studi di monitoraggio su matrici ambientali (aria,
acqua e suolo) per valutare tossicità e/o genotossicità
vengono effettuati con varie procedure:
r test in vitro su batteri luminescenti (Vibrio fischeri
e Vibrio harvey), di cui viene misurata la variazione
di intensità nell’emissione di luce. La bioluminescenza è in relazione al consumo di ATP e quindi
è un indicatore del tasso di attività metabolica. Si
utilizza un ceppo mutante che ha perso la capacità
di emettere luce. La presenza di sostanze mutagene
ripristina la funzionalità del gene responsabile della
bioluminescenza
r test di Ames, uno dei più noti test in vitro su colture batteriche. Si tratta di un test di reversione su
mutanti istidina-negativi (richiedono l’aggiunta
dell’aminoacido al terreno di coltura) di Salmonella
typhimurium, che hanno la possibilità di retromutare al ceppo “selvatico” (istidina positivo) originario
quando esposti a sostanze chimiche mutagene
r test citogenetici per l’evidenziazione di aberrazioni
cromosomiche si possono effettuare su vegetali, in
particolare su tessuti meristematici, foglie o cellule gametiche e somatiche coltivate di Tradescantia,
Hordeum vulgare, Allium cepa, scelte perché provviste di un numero ridotto di cromosomi di grandi
dimensioni su cui è più facile condurre osservazioni
r animali e organismi marini sono utilizzati come bioindicatori: molluschi bivalvi del genere Mitilus, particolarmente adatti in quanto organismi filtratori e in
grado di bioconcentrare i contaminanti ambientali nei
loro tessuti. Anche alcuni pesci vengono impiegati in
test di tossicità (Dicentrarchus labrax, Seranus cabrilia).
Aria
L’inquinamento atmosferico ha origini naturali e antropiche. Nel primo caso deriva da eruzioni vulcaniche,
incendi, polveri e gas prodotti dal metabolismo; nel secondo ne sono responsabili le attività umane. Le sorgenti principali dell’inquinamento atmosferico di origine
antropica sono i processi di combustione e il traffico veicolare. Vengono immessi in atmosfera enormi quantità
di nerofumo, ceneri, polvere di carbone, gas tossici (CO,
CO2, SO2, NO, NO2, NO3) e vari idrocarburi. Oltre a
ciò, occorre tenere conto delle reazioni che si verificano
tra i vari inquinanti presenti, che possono dar luogo a
intermedi altamente reattivi e tossici come il perossiacetilnitrato (PAN). Il particellato atmosferico (sostanze chimiche inorganiche e organiche che aderiscono a
microparticelle di carbone e silice con funzione aggregante) è uno degli inquinanti più importanti. La constatazione di una maggior incidenza statistica di tumori
polmonari fra la popolazione urbana rispetto a quella
rurale non ha fatto che confermare la relazione esistente
fra contaminazione dell’aria e tossigenicità degli inquinanti. Per il monitoraggio vengono effettuati test:
r in vitro: raccolta del particellato, estrazione delle
sostanze ritenute mutagene, esposizione di cellule
animali o batteriche a tali sostanze
r in situ: esposizione diretta nel luogo di indagine di
determinati organismi (soprattutto vegetali) sensibili agli agenti mutageni.
Per il campionamento del microparticellato, su cui si procede poi all’estrazione delle varie sostanze, si impiegano
226
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INQUINANTI XENOBIOTICI E MUTAGENESI AMBIENTALE
Tabella 15.2 Principali inquinanti chimici da controllare
nelle acque superficiali (D. Lgs. 11.5.1999 n. 152)
Cadmio
Aldrin
Cromo totale
Cloroformio
Mercurio
DDT
Nichel
1,2-Dicloroetano
Piombo
Dieldrin
Rame
Endrin
Zinco
Esaclorobenzene
Esaclorobutadiene
Esaclorocicloesano
Isodrin
Pentaclorofenolo
Percloroetilene
Tetracloruro di carbonio
Triclorobenzene
Tricloroetilene
particolari filtri che permettono il calcolo del volume
d’aria filtrato e sono dotati di selettori di dimensione delle particelle. Questi apparecchi ripetono la situazione di
filtrazione fisiologica dell’apparato respiratorio umano. I
risultati sono espressi come “potenza mutagena specifica” (numero di mutazioni per unità di peso di estratto
organico) o anche come “attività mutagena specifica”
(numero di mutazioni per unità di volume di aria).
Acqua
I principali inquinanti chimici da controllare nelle acque
superficiali e nei sedimenti sono elencati nelle tabelle
15.2 e 15.3.
Vi sono compresi metalli pesanti, diossine e DDT
(composti organoclorurati), IPA, PCB e il gruppo di
composti noti come POP (persistent organic pollutants)
di difficile degradazione.
In ambiente acquatico assumono particolare importanza i fenomeni di:
r bioaccumulo: concentrazione più elevata di un contaminante all’interno dell’organismo rispetto all’ambiente esterno. Il fenomeno è particolarmente significativo per sostanze lipofile come PCB e DDT, che
raggiungono nei tessuti concentrazioni anche decine
di migliaia di volte maggiori rispetto all’ambiente
r biomagnificazione: progressivo aumento di con-
15
centrazione di un inquinante nei passaggi da un
livello della catena alimentare a quello superiore.
Questo fenomeno è da tenere nella massima considerazione, perché spiega come un inquinante, immesso nell’acqua in concentrazione minimale e a
prima vista ininfluente, possa in realtà presentarsi
per biomagnificazione a concentrazioni elevatissime
e con effetti irreversibili ai livelli più alti della catena
trofica (uomo, grandi predatori).
Gli effetti biologici dell’esposizione degli organismi
acquatici agli inquinanti tossici e genotossici sono stati studiati in vari programmi di ricerca da cui è emerso
come questi si possano verificare a tutti i livelli di organizzazione, da quello cellulare all’ecosistema.
In termini generali si va dall’induzione di tumori in
animali nei cui tessuti sono parallelamente state trovate
alte concentrazioni di DDT, IPA, PCB, a conseguenze
sulla capacità riproduttiva, a effetti a lunga scadenza sulla
biodiversità degli ecosistemi. Un esempio indicativo proviene da ricerche svolte su molluschi bivalvi in zone fortemente contaminate da pesticidi nella costa del Maine
(USA), nei quali si è riscontrata un’alta incidenza di tumori nei tessuti germinali (germinomi) parallelamente a
una percentuale molto superiore alla media di tumori alle
gonadi anche nella popolazione della medesima area. Ciò
ha suggerito il possibile impiego di questi bivalvi come
indicatori di rischio tumorale per l’uomo. I danni relativi
alla biodiversità (numero, varietà e variabilità delle specie
viventi all’interno di un ecosistema) si esprimono ovviamente nel senso di una sua progressiva riduzione.
Anche nelle acque potabili sono presenti sostanze
dotate di possibile cancerogenicità o mutagenicità, preTabella 15.3 Principali microinquinanti da ricercare nei
sedimenti (D. Lgs. 11.5.1999 n. 152)
Arsenico
Policlorobifenili (PCB)
Cadmio
Diossine (TCDD)
Zinco
Idrocarburi policiclici aromatici (IPA)
Cromo totale
Pesticidi organoclorurati
Mercurio
Nichel
Piombo
Rame
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15
INQUINANTI XENOBIOTICI E MUTAGENESI AMBIENTALE
senti all’origine o derivate da processi di potabilizzazione. Il cloro universalmente impiegato è molto reattivo e
produce, reagendo con sostanze naturalmente presenti
come gli acidi umici e fulvici, composti organici clorurati tossici o cancerogeni (clorofenolo, acidi cloroacetici,
trialometani ecc.). Il rischio per la salute umana è comunque considerato irrilevante, anche in considerazione del sempre più ridotto uso del cloro e della sua possibile sostituzione con ozono e acido peracetico.
Suolo
La contaminazione dei suoli deriva principalmente da
discariche abusive o non adeguate, dalla non corretta
gestione di sostanze pericolose che possono percolare
nel terreno da siti minerari o militari abbandonati e non
bonificati, da contaminazioni accidentali (tabella 15.4 e
figura 15.13).
Gli inquinanti che giungono al suolo vengono in parte dilavati, in parte assorbiti dai vegetali, possono subire
fotodecomposizione, possono venire degradati per via
chimica o dal metabolismo microbico. Si possono distinguere:
r inquinanti inorganici: metalli pesanti (piombo,
mercurio, cadmio, rame, arsenico)
r inquinanti organici: si legano alle particelle solide del suolo o sono disciolti nell’acqua o dissolti
nell’aria fra gli interstizi delle particelle. Sono soprattutto diossine, furani policlorurati, IPA, PCB,
pesticidi. Gli IPA derivanti dal traffico autoveicolare
rappresentano probabilmente la maggior fonte di
Tabella 15.4 Sostanze contaminanti del suolo e loro fonti di derivazione
SORGENTI
SOSTANZE INQUINANTI
Tecniche agricole moderne: fertilizzazione, lotta
antiparassitaria, allevamenti zootecnici, irrigazione
Nitrati, fosfati e metalli pesanti contenuti nei concimi
Metalli pesanti e altri microinquinanti contenuti nei fanghi
di depurazione e nei liquami delle deiezioni animali
Pesticidi (biocidi)
Acque irrigue inquinate (in particolare metalli pesanti)
Sanità pubblica: lotta contro gli insetti vettori di malattie
Pesticidi
Impianti termici e industriali: inquinamento atmosferico
Ossidi di zolfo
Ossidi di azoto
Idrocarburi
Metalli pesanti (contenuti nelle particelle sospese)
Trasporti (nelle zone adiacenti le vie di comunicazione)
Ossidi di azoto
Idrocarburi
Pb, Cd
Prodotti utilizzati per la manutenzione delle vie di comunicazione (sali ecc.)
Smaltimento nel suolo e sul suolo di rifiuti urbani
e industriali
Fanghi e rifiuti solidi urbani e industriali
Acque reflue (“percolato”)
Inceneritori di rifiuti
Zn, Pb, Al, Fe, Cd, Br, Cr, Cu, Ca, K, Mg, Na, S, N, SO2,
NO2, HCl
Composti organici volatili (VOC) quali benzene, metano ecc.
Composti organici alogenati quali policlorodibenzo-diossine
(PCDD) e policlorodibenzo-furani (PCDF)
Policlorobifenoli (PCB)
Clorobenzeni e clorofenoli
Centrali termonucleari; esplosioni nucleari
Gas e polveri radioattivi
Rifiuti radioattivi volatili, liquidi e solidi
Varie
Tensioattivi
Oli usati
228
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INQUINANTI XENOBIOTICI E MUTAGENESI AMBIENTALE
Volatilizzazione
Applicazione di pesticidi
15
Trasporto eolico
Fotodecomposizione
Scorrimento
Degradazione
chimica
Lisciviazione
Assorbimento
radicale
Assorbimento
Degradazione
microbica
Figura 15.13 Distribuzione e degradazione di contaminanti del suolo.
sostanze genotossiche nel suolo. I pesticidi annoverano sostanze a elevata attività genotossica. In base
alla loro natura chimica molto varia, questi composti
hanno tempi di attività e di permanenza molto diversi. La progressiva messa al bando dei POP, 12 sostanze ritenute estremamente dannose per gli ecosistemi
e l’uomo, è stata concordata a livello internazionale
nel 2001. Di queste, ben 9 sono pesticidi organoclorurati (DDT, Dieldrin, Aldrin, Endrin, Mirex, Toxafene, Eptaclor, Clordane, HCB o esaclorobenzene).
Questi composti mostrano una tossicità acuta relaTabella 15.5 Persistenza di pesticidi
TIPO
ATTIVITÀ
PERSISTENZA
Organofosforici
1-12 settimane
Non persistenti
Carbammati
1-18 mesi
Moderatamente
persistenti
Organoclorurati
a base di Hg,
As, Pb
2-5 anni
Residui
permanenti
Persistenti
Permanenti
tivamente bassa, ma effetti cancerogeni sul sistema
immunitario e riproduttivo, conseguenti all’esposizione a basse dosi per lunghi periodi di tempo. Per
il DDT, in considerazione del suo indispensabile impiego per la prevenzione della malaria in molti Paesi,
vengono solo previste alcune cautele e limitazioni
nell’impiego.
Il contatto diretto con suoli contaminati, l’inalazione
di polvere o microparticelle di suolo si possono verificare nelle discariche ma, in modo subdolo e pericoloso
in quanto inconsapevole, anche in seguito al cambio di
destinazione d’uso di siti industriali o ex discariche che
divengono aree abitative, scolastiche o parchi.
In campo alimentare è preoccupante e costantemente da monitorare la pericolosità della presenza di residui
di pesticidi nei prodotti agricoli come cereali, patate e
verdure, frutta. I metalli pesanti possono accumularsi
nei vegetali: il cadmio inibisce la biosintesi degli acidi
nucleici e delle proteine, il cromo induce mutazioni geniche, blocco della riproduzione cellulare, fenomeni di
apoptosi; la mutagenicità del nichel si manifesta con la
rottura dei filamenti di DNA.
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ESERCIZI DI VERIFICA
1. Rispondi alle seguenti domande:
Definisci il significato dei termini: mutageno, genotossico, cancerogeno.
Spiega in che cosa consistono le mutazioni somatiche e quelle germinali e quali conseguenze
possono avere.
Illustra le differenze fra mutazioni geniche, cromosomiche e genomiche.
Come agiscono le radiazioni ionizzanti? E quelle non ionizzanti?
Come si possono manifestare i danni biologici
delle radiazioni?
Come possono essere distinti i mutageni chimici?
Come agiscono gli analoghi delle basi?
Quali sono i meccanismi di riparazione del
DNA?
Attraverso quali fasi si realizza nell’organismo il
metabolismo delle sostanze esogene?
In che cosa consiste il fenomeno dell’attivazione metabolica?
230
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16
ESPOSIZIONE PROFESSIONALE
E VALUTAZIONE DEL DANNO
DA XENOBIOTICI
16.1 Esposizione professionale
e biomarcatori
16.2 Biomarcatori
16.3 Aspetti normativi e linee guida
comunitarie
La valutazione del rischio conseguente all’esposizione a
determinate sostanze chimiche e la valutazione realistica
del loro grado di genotossicità e cancerogenicità richiede ovviamente un approccio meditato. Una valutazione
obiettiva deve essere fondata sull’esame di un numero
consistente di dati attendibili e verificabili che devono
scaturire da metodi standardizzati e validati. L’impiego
di test su microrganismi, colture cellulari e animali da
laboratorio consente di eseguire prove in vivo per estrapolare poi i risultati e applicarli, laddove sia possibile,
sull’organismo umano.
16.1 Esposizione professionale
e biomarcatori
Addotto di DNA generato dal benzo[a]pirene, il maggiore
agente mutageno presente nel fumo di tabacco (fonte: Richard
Wheeler).
I test e le simulazioni condotte in laboratorio rappresentano un approccio sostanzialmente corretto e spesso
anche l’unico possibile per poter disporre di dati in un
tempo ragionevole. È indubbio però che il monitoraggio diretto su particolari fasce di popolazione, quali gli
addetti a certe lavorazioni o i cittadini esposti in qualche
modo al danno (radiazioni, fumi e polveri ecc.), è la soluzione migliore in termini di effettiva valutazione diretta per poter adottare le necessarie e specifiche misure di
prevenzione. Si impiegano biomarcatori di esposizione,
di effetto e di suscettibilità, indirizzando studi e ricerche
su alcune cellule e tessuti in particolare: i linfociti ma anche l’epitelio di esfoliazione vescicale, quello della bocca,
gli spermatozoi. Sono stati studiati dapprima gli effetti
delle radiazioni ionizzanti e non ionizzanti, che hanno
dimostrato inequivocabilmente la loro relazione con il
231
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16
ESPOSIZIONE PROFESSIONALE E VALUTAZIONE DEL DANNO DA XENOBIOTICI
danno cromosomico, quindi le ricerche sono state estese
ai composti xenobiotici come cloruro di vinile e benzene che causano gli stessi effetti, per poi essere ampliate a
ossido di etilene, ammine aromatiche e acrilonitrile, che
provocano la formazione di addotti emoglobinici.
Le esposizioni professionali sono naturalmente oggetto dei più approfonditi studi di mutagenesi e cancerogenesi, che hanno permesso di determinare specifici
valori-soglia per le singole lavorazioni, al di sotto dei
quali non si dovrebbero avere conseguenze per la salute
nemmeno in seguito a esposizioni prolungate. Allo stesso modo sono oggetto di monitoraggio l’assunzione di
farmaci, le abitudini alimentari, l’inquinamento atmosferico, le conseguenze anche a lungo termine di “incidenti” industriali (veri e propri disastri sotto ogni punto
di vista) come quelli di Seveso, Bophal e Chernobyl, per
non citare che quelli più tristemente noti.
trasformazioni o bioattivazioni degli xenobiotici all’interno dell’organismo e permettono di ripercorrere le fasi
biochimiche della transizione dall’esposizione al tossico
fino al danno biologico conclamato.
La valutazione di rischio utilizza sistemi di indagine, modelli di previsione e protocolli di ricerca basati
sull’impiego di biomarcatori (figura 16.1).
I biomarcatori sono suddivisi in tre tipologie diverse:
r biomarcatori di esposizione: mettono in relazione
concentrazione degli xenobiotici e presenza di addotti
r biomarcatori di effetto biologico: indicano una
conseguenza dell’esposizione allo xenobiotico attraverso l’alterazione di funzioni biologiche
r biomarcatori di suscettibilità: preesistono alla presenza dello xenobiotico e sono indipendenti dall’esposizione; indicano la probabilità che un individuo manifesti la patologia in seguito all’esposizione.
16.2 Biomarcatori
Biomarcatori di esposizione
Per completare i dati derivati dal monitoraggio degli
xenobiotici a livello ambientale (capitolo 15) si possono
utilizzare indagini su campioni biologici. Queste analisi sono in grado di fornire dati fondamentali sulle bio-
Riguardano le possibili vie di esposizione dell’organismo umano (cute, apparato respiratorio e digerente) e le
trasformazioni metaboliche cui possono andare incontro i composti esogeni. Uno xenobiotico può agire pres-
MONITORAGGIO BIOLOGICO
Esposizione
Malattia
Biomarcatori di suscettibilità
Geni per
il metabolismo
Dose interna
Sostanze e
metaboliti in
sangue
urine
ssuti
Geni di stabilità
del DNA
Dose
biologicamente
efficace
Addotti
alle proteine
Addotti al DNA
Biomarcatori di esposizione
Geni per
l’immunocompetenza
Risposta
efficace
Mutazioni somatiche
Cambiamenti cinogenetici
aberrazioni
micronuclei
aneuploidia
Cambiamenti
morfofunzionali
Spettro mutazionale
nei tumori
Biomarcatori di effetto
Figura 16.1 Schema dei parametri di monitoraggio biologico di popolazione esposta a rischi genotossici.
232
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ESPOSIZIONE PROFESSIONALE E VALUTAZIONE DEL DANNO DA XENOBIOTICI
16
Tabella 16.1 Biomarcatori di esposizione e relativi parametri misurabili
CAMPIONE BIOLOGICO
ESPOSIZIONE
PARAMETRO MISURABILE
Sangue intero
Benzene, toluene, xilene, nitrobenzene,
tricloroetilene
Benzene, toluene, xilene, anilina,
tricloroetano
Siero
Idrocarburi clorurati lipofili (PCB, DDT)
Lindano, esaclorobenzene, PCB, DDT
Urine
Benzene
Stirene
Cloruro di vinile
Parathion
Metalli (As, Cd, Hg, Cr, Al)
Triossido di cromo
Tricloroetilene
Fenolo
Acido mandelico e acido fenilgliossilico
Acido tiodiglicolico
p-nitrofenolo
As, Cd, Hg, Cr, Al
Cromo
Acido tricloroacetico
Aria alveolare
Solventi organici, per esempio
tetracloroetilene
Tetracloroetilene
Latte materno
DDT, PCB, metalli
Metaboliti stabili DDE, PCB
Feci
Metalli, sostanze organiche
Derivati glutationici
Capelli, unghie
Mercurio
Metilmercurio
Placenta
Cadmio, piombo, mercurio
Cadmio, piombo, mercurio
soché esclusivamente a livello locale, ma di norma viene
veicolato dal sangue e raggiunge i tessuti. Vengono quindi misurate le concentrazioni di xenobiotici e dei loro
metaboliti nei liquidi biologici, nelle cellule o nei tessuti
(biomarcatori di dose interna); nonché l’eventuale
formazione di addotti al DNA e alle proteine, indicati
invece come biomarcatori di dose biologica efficace.
Le sostanze mutagene (genotossiche) o i loro metaboliti possono essere ricercati nel sangue, nelle urine,
nelle feci, nella saliva, nella placenta, nei capelli (i metalli pesanti si legano ai gruppi sulfidrilici della cheratina) o
anche nell’aria espirata (per le sostanze volatili inalate)
(tabella 16.1). Se uno xenobiotico si ritrova nelle urine,
ciò significa evidentemente che è già stato assorbito nel
sangue e accumulato nei tessuti, dove può esercitare
effetti mutageni. Le urine vengono prima concentrate, quindi si procede in genere con il test di Ames. Gli
addotti al DNA sono sostanze chimiche che possono
formare legami covalenti con gli acidi nucleici (figura
16.2): la presenza di un addotto al DNA in un campione
biologico testimonia che uno xenobiotico genotossico
(o qualche suo metabolita) ha raggiunto il DNA e può
esercitare la propria azione mutagena.
Gli xenobiotici possono formare addotti anche con
le proteine, reagendo in particolare con siti di reazione
degli aminoacidi istidina, cisteina e valina (catene alfa
e beta dell’emoglobina). Emoglobina e albumina sono
le proteine in cui viene preferibilmente effettuata la ricerca di addotti. I metodi di indagine più utilizzati sono
soprattutto gas cromatografici (HPLC) e immunologici
(ELISA).
Biomarcatori di effetto biologico
Sono marcatori che indicano la vera e propria risposta
biologica alla presenza di xenobiotici genotossici. Si
O
N
N
NH
N
O
–O
P
OH
–O
HO
O
O
NH
H
H
O
H
P
O
HO
OH
OH
Figura 16.2 Addotto al DNA. Esempio di addotto al DNA
derivato dalla reazione del benzo[a]pirene con il DNA e marcato
con 32P (*) per il dosaggio con autoradiografia.
233
Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
16
ESPOSIZIONE PROFESSIONALE E VALUTAZIONE DEL DANNO DA XENOBIOTICI
tratta quindi di individuare nei campioni biologici (soprattutto linfociti di sangue periferico, ma anche cellule
delle mucose respiratorie) la presenza di mutazioni geniche, cromosomiche o genomiche. Si eseguono a questo scopo analisi di citogenetica, ricercando aberrazioni
cromosomiche, presenza di micronuclei (frammenti
cromosomiali non incorporati nelle cellule figlie durante la mitosi), scambi fra cromatidi fratelli, oppure danni
al DNA come rotture della doppia elica o formazione di
legami crociati (legami fra le due eliche del DNA o fra
DNA e proteine).
16.3 Aspetti normativi e linee guida
comunitarie
Biomarcatori di suscettibilità
Classificazione degli agenti mutageni
L’enorme variabilità nell’ambito della popolazione umana è un parametro molto influente per quanto riguarda
le differenze individuali nella sensibilità e nella risposta
biologica alle sostanze genotossiche. I biomarcatori di
suscettibilità si propongono di identificare i soggetti
con una maggior probabilità di manifestare gli effetti
negativi dell’esposizione a xenobiotici ambientali. Sul
piano pratico tali soggetti possono venire individuati
sulla base di una più scarsa capacità nella riparazione dei
danni a carico del DNA e/o della presenza di alleli polimorfi, notoriamente coinvolti nella biotrasformazione
metabolica degli xenobiotici in derivati bioattivi potenzialmente cancerogeni.
Gli agenti mutageni vengono classificati in tre categorie in base alla loro probabilità di indurre genotossicità
nell’organismo umano (tabella 16.2):
r nella categoria 1 sono comprese le sostanze di cui è
nota l’attività mutagena sugli esseri umani
r nella categoria 2 sono elencate le sostanze da considerare mutagene pur senza una chiara evidenza diretta
r in categoria 3 si trovano le sostanze che devono essere considerate con preoccupazione.
La legislazione comunitaria fa riferimento alle Direttive
67/548/EEC; 76/769/EEC; 94/60/EC e successive
modifiche e aggiornamenti (2003/36) riguardanti la
classificazione, l’imballaggio e l’etichettatura delle sostanze tossiche, mutagene e cancerogene. Vengono indicati i
criteri per definire le proprietà tossiche, eco-tossicologiche e chimico-fisiche delle sostanze chimiche e le “frasi di
rischio” da apporre in etichetta.
In categoria 1 (mutageni umani), basata sull’evidenza
epidemiologica di effetti genetici trasmissibili (che fino a
ora manca), non si trova nessuna sostanza. L’inserimento nelle categorie 2 e 3 è dedotto da test sugli animali.
Tabella 16.2 Classificazione delle sostanze mutagene in base alla Direttiva 67/548/EEC
DEFINIZIONI
CRITERI DI CLASSIFICAZIONE
Categoria 1 Sostanze di cui si conoscono gli effetti mutageni sugli esseri umani
Prove positive derivanti da studi epidemiologici sulle mutazioni negli esseri umani
Categoria 2 Sostanze che dovrebbero considerarsi
mutagene per gli esseri umani
Risultati positivi ottenuti in prove che dimostrino (a) effetti
mutageni o (b) altre interazioni cellulari relative alla
mutagenicità nelle cellule germinali di mammiferi in vivo,
o (c) effetti mutageni sulle cellule somatiche dei mammiferi
in vivo, unitamente a prove evidenti che la sostanza o un
metabolita raggiungano le cellule germinali
Categoria 3 Sostanze da considerare con sospetto
per possibili effetti mutageni
Risultati positivi da test che dimostrino (a) effetti mutageni
o (b) altre interazioni cellulari relative alla mutagenicità
nelle cellule somatiche dei mammiferi in vivo, normalmente
confermate con risultati positivi ottenuti in prove
di mutagenicità in vitro
234
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ESPOSIZIONE PROFESSIONALE E VALUTAZIONE DEL DANNO DA XENOBIOTICI
Linee guida comunitarie per la
valutazione degli effetti mutageni
In ambito CEE sono previste normative specifiche per
la valutazione del rischio mutageno di pesticidi, additivi
alimentari, mangimi, cosmetici, farmaci, sostanze a contatto con gli alimenti, biocidi, prima che i prodotti siano
immessi in commercio. È fatto obbligo al produttore di
procedere alla valutazione del rischio secondo le linee
guida contenute nel documento TGD (technical guidance document), che illustra la strategia di saggio da seguire (tabelle 16.3 e 16.4).
Sono previsti un test di mutazione genetica su batteri e un test su cellule di mammifero per evidenziare
danni cromosomici. Entrambi i test sono effettuati in
vitro. Per le sostanze positive a una o a entrambe le tipologie dei saggi in vitro sono previsti saggi su animali
(test citogenetici sul tessuto emopoietico di roditori e
saggi di danno e riparazione del DNA in fegato di ratto).
La negatività a entrambi i test depone per una valutazione di rischio da effettuarsi caso per caso, tenendo nel
debito conto una serie di variabili che possono influenzare la decisione finale. Se almeno uno dei test in vivo
è positivo, la sostanza viene definita mutagena a livello
16
somatico e ne va valutata l’eventuale mutagenicità anche a livello germinale. Tale possibilità è teoricamente
prevedibile in base alle caratteristiche tossicocinetiche e
tossicodinamiche della sostanza, che permettono di non
effettuare ulteriori inutili esperimenti. La sostanza viene
quindi definita mutagena. In mancanza di elementi sufficienti per una decisione motivata, si dovrà procedere a
ulteriori indagini su cellule germinali.
Classificazione delle sostanze
cancerogene
La direttiva 93/72/CEE suddivide le sostanze cancerogene in tre categorie:
r categoria 1, in cui sono inserite le sostanze di cui è
noto l’effetto cancerogeno
r categoria 2 che comprende sostanze che dovrebbero essere considerate cancerogene per l’uomo, sulla
base soprattutto di studi a lungo termine effettuati
sugli animali
r categoria 3 che comprende sostanze sospette cancerogene, pur in assenza di informazioni sufficienti a
classificarle in categoria 2.
Tabella 16.3 Metodi di saggio di effetti mutageni
SET DI BASE (DIRETTIVA 92/69/EEC)
B.10
Test citogenetico su cellule di mammifero in vitro (OECD 473)
B.11
Analisi metafasica in cellule di midollo osseo in vivo (OECD 475)
B.12
Test del micronucleo in vivo (OECD 474)
B.13/B.14
Reversione della mutazione in Escherichia coli/Salmonella typhimurium (OECD 471)
TEST SUPPLEMENTARI (DIRETTIVA 96/54/EC)
B.15
Mutazione genica: Saccharomyces cerevisiae
B.16
Ricombinazione mitotica: Saccharomyces cerevisiae
B.17
Cellule di mammifero in vitro: saggio di mutazione genica
B.18
Danno e riparazione del DNA: sintesi non programmata del DNA in cellule di mammifero in vitro
B.19
Saggio degli scambi tra cromatidi fratelli in vitro
B.20
Saggio dei letali recessivi legati al sesso: Drosophila melanogaster
B.21
Saggio in vitro di trasformazione di cellule di mammifero
B.22
Saggio dei letali dominanti nei roditori
B.23
Analisi citogenetica delle cellule germinali di mammiferi in vivo
B.24
Saggio delle macchie (spot test) nel topo
235
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16
ESPOSIZIONE PROFESSIONALE E VALUTAZIONE DEL DANNO DA XENOBIOTICI
Tabella 16.4 Strategia europea per la valutazione delle proprietà mutagene di sostanze chimiche
SET DI BASE (PER TUTTE
LE SOSTANZE > 1 tpa)
TEST
SU BATTERI
ULTERIORE SPERIMENTAZIONE
TEST PER
EFFETTI
CROMOSOMICI
Neg.
Neg.
Set di base completato; ulteriore sperimentazione (in vitro o eventualmente
in vivo) richiesta solo in caso di elevati livelli di produzione (> 100 tpa)
o di significativa esposizione umana
Pos.
Neg.
Verificare l’attività mutagena in cellule di mammifero con altri test
(per es. mutazione genica o UDS in vitro, test in vivo) e possibili
meccanismi specifici per i batteri
Neg. o Pos.
Pos.
Selezionare test in vivo in base all’effetto osservato in vitro e la disponibilità
sistemica: per sostanze disponibili, test citogenetici su midollo o UDS nel
fegato; altrimenti, test al sito di contatto (test della cometa, test di mutazione
su animali transgenici)
In caso di risultati positivi in vivo, considerare la possibilità di effetti
trasmissibili, preliminarmente in base a proprietà tossicocinetiche
e tossicodinamiche
* tpa = tonnellata per anno
Le sostanze comprese nelle categorie 1 e 2 (benzene,
benzidina, benzopirene, amianto ecc.) devono essere
contrassegnate con le sigle R45 (può provocare il cancro) o R49 (può provocare il cancro per inalazione). Le
sostanze in categoria 3 (fra cui aldeide formica, ossido di
etilene, benzoantracene) devono essere contrassegnate
con la sigla R40 (possibili effetti cancerogeni – prove
insufficienti).
ESERCIZI DI VERIFICA
1. Rispondi alle seguenti domande:
Spiega la differenza fra i processi di biotrasformazione e bioattivazione di uno xenobiotico.
Quali sono le caratteristiche dei biomarcatori di
esposizione e di effetto biologico?
Che cosa indicano i biomarcatori di suscettibilità?
Quali parametri misurano i biomarcatori di dose
interna?
Descrivi in che cosa consiste il test di Ames.
Che cosa si intende per “addotto al DNA”?
Quali sostanze mutagene sono comprese nella
categoria 1 della classificazione secondo la direttiva 67/458/EEC?
236
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17
1
BIODEGRADAZIONE
DEI COMPOSTI ORGANICI
NATURALI E DI SINTESI
17.1 Biodegradabilità e fattori condizionanti
17.2 Biodegradazione dei derivati del
petrolio
17.3 Biodegradazione aerobica degli
idrocarburi
17.4 Biodegradazione aerobica dello xilene
17.5 Biodegradazione degli idrocarburi
policiclici aromatici (IPA)
17.6 Biodegradazione anaerobica degli
idrocarburi
Il problema fondamentale dell’inquinamento ambientale consiste sostanzialmente nell’immissione nella biosfera di enormi quantità di rifiuti organici, che possono
essere di origine naturale o di sintesi (sostanze xenobiotiche: estranee ai componenti naturali della biosfera).
La degradazione di alcuni di questi composti, a prescindere dalla loro origine, può essere vantaggiosamente effettuata da molti microrganismi. Uno degli obiettivi
delle biotecnologie, in particolare con le tecniche di trasferimento di geni (ingegneria genetica), è quello di modificare o creare specie microbiche in grado di degradare
in maniera sempre più efficiente le sostanze inquinanti.
17.1 Biodegradabilità e fattori
condizionanti
17.7 Biodegradazione degli xenobiotici
17.8 Biodegradazione dei composti
organici alogenati
17.9 Biodegradazione dei PCB
17.10 Aspetti genetici del metabolismo
biodegradativo
Una sostanza si definisce biodegradabile quando può
essere metabolizzata e trasformata da microrganismi.
I microrganismi, nella loro grande varietà, possiedono
un ampio ventaglio di strategie metaboliche che conducono alla completa trasformazione delle sostanze organiche in elementi semplici quali CO2, H2O o anche
CH4 e altre piccole molecole a corta catena carboniosa.
In questo caso (degradazione completa della sostanza
organica) la biodegradazione equivale alla mineralizzazione, con il rientro dei prodotti metabolici finali nei
cicli biogeochimici della materia. Anche una biodegradazione che non porta alla completa mineralizzazione
può essere comunque considerata accettabile dal punto
di vista ecologico-ambientale se il composto in oggetto
perde la sua tossicità.
237
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17
BIODEGRADAZIONE DEI COMPOSTI ORGANICI NATURALI E DI SINTESI
Quando invece una sostanza non è suscettibile di
degradazione più o meno completa, si parla di recalcitranza e la sostanza stessa viene definita persistente se
è in grado di rimanere inalterata nell’ambiente per periodi anche molto lunghi. È ovvio che il pericolo risulta
maggiore se la sostanza è dotata anche di una tossicità
più o meno elevata. La biodegradabilità di alcuni composti organici naturali, compresi alcuni componenti del
petrolio come gli idrocarburi, è spiegabile in termini
evolutivi quando si consideri il lunghissimo tempo che
i microrganismi hanno avuto a disposizione per mettere
a punto le opportune e specifiche strategie metaboliche.
La comparsa molto più recente di un’enorme varietà di
xenobiotici immessi in ambiente, non ha evidentemente consentito ai microrganismi una parallela evoluzione
metabolica. A conferma di queste considerazioni rimane comunque il fatto che la biodegradabilità dei composti xenobiotici è tanto maggiore quanto più questi ultimi
assomigliano ai composti naturali.
La figura 17.1 illustra quale può essere il destino metabolico dei composti organici di sintesi.
La possibilità di biodegradazione di un composto
organico risulta legata a una serie di fattori condizionanti, così schematizzabili:
r la presenza di microrganismi in grado di metabolizzarlo e il reale possesso di vie metaboliche che permettano la degradazione del composto
r le caratteristiche della molecola da degradare
r le condizioni ambientali in cui si verifica l’immissione della sostanza, in quanto fondamentali per la
sopravvivenza dei microrganismi e la creazione di
condizioni adatte allo sviluppo ottimale delle loro
potenzialità metaboliche (temperatura, pH, esigenze gassose ecc.).
Le caratteristiche che rendono una molecola più o meno
biodegradabile sono in relazione a una serie di elementi
chimico-fisici, quali la presenza di molte ramificazioni (come avviene per es. nelle molecole dei detergenti
anionici), le grandi dimensioni molecolari e la struttura
polimerica (che richiede la capacità microbica di produrre innanzitutto enzimi in grado di liberare i monomeri costituenti), la presenza di sostituenti alogeni (Cl,
Br, I, Fl) o di gruppi nitro (−NO2). Tutte queste caratteristiche influenzano in modo negativo la biodegradabilità di un composto e la rendono problematica e spesso
impossibile (figura 17.2).
Dal punto di vista fisico la solubilità in acqua delle
Composti organici di sintesi
Simili a composti naturali
Strutture non esistenti in natura
Attaccabili dai microorganismi
Mineralizzazione
Co-ossidazione:
parziale ossidazione
del composto in presenza
di un composto degradabile
strutturalmente analogo
CICLO DELLA MATERIA
Bioaccumulo o
polimerizzazione
Integrazione nelle
matrici ambientali
Recalcitranti:
composti che tendono
a mantenere inalterate
le loro caratteristiche
chimico-fisiche
Persistenza
Inquinamento
Figura 17.1 Destino dei composti organici di sintesi.
238
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17
BIODEGRADAZIONE DEI COMPOSTI ORGANICI NATURALI E DI SINTESI
Cl
Cl
CH3
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
O3N
NO3
Cl
O
Cl
Cl
O
Cl
Cl
NO3
Esaclorocicloesano
Trinitrotoluene (TNT)
Tetraclorodibenzodiossina
Policlorobifenile (PCB)
Figura 17.2 Xenobiotici non biodegradabili. La non biodegradabilità è dovuta alla presenza di sostituenti cloro e nitro.
molecole inquinanti è una caratteristica assai importante: poiché i microrganismi sono attivi soprattutto in
ambiente acquoso o comunque in substrati con valori
elevati di aw (activity water), ne consegue che composti
idrosolubili sono degradabili più facilmente di altri.
Informazioni dettagliate su inquinanti e vie metaboliche microbiche per la loro degradazione sono reperibili all’indirizzo http://umbbd.msi.umn.edu nel
“Biocatalysis and Biodegradation database” (Minnesota
University).
17.2 Biodegradazione dei derivati
del petrolio
Il petrolio deriva dalla trasformazione anaerobia di
materiali vegetali in condizioni di elevata temperatura
e pressione. È costituito da una miscela di idrocarburi (componenti maggioritari), acidi naftenici, fenoli e
composti eterociclici che contengono azoto e zolfo. Gli
idrocarburi (molecole formate da carbonio e idrogeno) possono essere suddivisi in (figura 17.3):
❖ aromatici, in cui sono presenti uno o più anelli benzenici
❖ alifatici, costituiti da catene lineari o ramificate oppure a struttura ciclica. Comprendono idrocarburi
saturi (alcani) e insaturi (alcheni e alchini).
Dal punto di vista fisico gli idrocarburi a più basso PM
sono gassosi, gli altri sono liquidi o solidi a temperatura
ambiente.
Poiché il petrolio è un prodotto di origine naturale,
è comprensibile che l’evoluzione abbia selezionato microrganismi capaci di degradare alcuni dei suoi compo-
H
H
H
H
H
H
C
C
C
C
H
H
H
H
H
C
H
H
H
H
CH3
H
H
C
H3C
H
a)
b)
c)
Figura 17.3 Idrocarburi. Formula del butano, un alcano (a); del
butene, un alchene (b); del benzene, un aromatico (c).
nenti più semplici (cioè a minor peso molecolare), come
gli idrocarburi. Tali microrganismi, procarioti, sono indicati con il nome di batteri idrocarburo-ossidanti e
sono in grado di utilizzare gli idrocarburi come unica
fonte di carbonio e sorgente di energia. Poiché il petrolio ha un ruolo così centrale nella società industrializzata e non sono rari i casi di contaminazione accidentale
dell’ambiente (soprattutto acquatico) durante l’estrazione e il trasporto del greggio, lo studio dei microrganismi
in grado di operare la mineralizzazione degli idrocarburi
ha assunto un’enorme importanza nel settore biotecnologico, con l’obiettivo di selezionare e creare i ceppi e le
varietà più efficienti in tal senso.
La biodegradazione degli idrocarburi è stata particolarmente studiata relativamente ai processi aerobi,
che si sono rivelati più veloci e redditizi rispetto a quelli
anaerobi, che pur esistono. Tale degradazione richiede
la presenza nei batteri di catene di trasporto degli elettroni che convogliano il potenziale riduttivo (NADH)
fino all’accettore finale, che è appunto l’ossigeno (metabolismo respiratorio). Si producono CO2 ed energia, ma
dal processo i batteri ricavano anche piccole molecole a
2 o 4 atomi di C che utilizzano per le biosintesi. I batteri
che si sono rivelati più efficienti in queste degradazioni
239
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17
BIODEGRADAZIONE DEI COMPOSTI ORGANICI NATURALI E DI SINTESI
a) Monossigenasi:
catalizzano l’incorporazione di un solo atomo di ossigeno molecolare sul substrato
1) Monossigenasi aromatiche
R
O2
H2O
2) Monossigenasi di gruppi alchilici
R
O2
OH
NADH + H+
H2O
R—(CH 2 ) n—CH 3
R—(CH 2 ) n—CH 2—OH
NADH + H+
NAD+
NAD+
b) Diossigenasi:
catalizzano l’incorporazione di entrambi gli atomi di ossigeno molecolare sul substrato
1) Diossigenasi di attivazione dell’anello aromatico
R
2) Diossigenasi di apertura dell’anello aromatico
R
O2
O2
OH
OH
H
H
OH
OH
NADH + H+
COOH
COOH
NAD+
Figura 17.4 Reazioni catalizzate da monossigenasi (a) e diossigenasi (b).
metaboliche appartengono al genere Pseudomonas, facilmente coltivabili in laboratorio.
Altri batteri interessanti in questo ambito sembrano
essere alcuni attinomiceti, attivi soprattutto in ambiente tellurico caratterizzato da una concentrazione di inquinanti non eccessivamente elevata.
17.3 Biodegradazione aerobica
degli idrocarburi
La capacità biodegradativa dei batteri idrocarburo-ossidanti è da far risalire in primo luogo al possesso di particolari enzimi, le ossigenasi. Gli enzimi appartenenti a
questa classe sono monossigenasi (o ossigenasi a funzione mista), che agiscono su idrocarburi alifatici e aromatici, e diossigenasi, che agiscono prevalentemente
su idrocarburi aromatici (figura 17.4).
Le ossigenasi introducono ossigeno nella molecola
da degradare, rendendola più reattiva e aumentandone
l’idrosolubilità. Si tratta di enzimi endocellulari complessi a più componenti, che risultano attivi esclusivamente all’interno della cellula batterica: ne consegue
che gli idrocarburi devono in ogni caso essere introdotti
nell’ambiente endocellulare per poter subire la successiva degradazione.
La degradazione degli idrocarburi alifatici avviene
generalmente per ossigenazione del gruppo metilico
(−CH3) terminale della catena e con la conseguente trasformazione in gruppo alcolico (figura 17.5). Successive
ossidazioni portano alla sua trasformazione in gruppo
aldeidico e quindi carbossilico. Si ottiene in pratica un
acido grasso, che come tale viene degradato con un processo di β-ossidazione.
Gli idrocarburi aromatici devono in primo luogo
subire modificazioni dell’anello benzenico, che portano comunque alla sua apertura. Il processo inizia con
una sorta di destabilizzazione dell’anello attraverso introduzione di almeno due gruppi ossidrilici, con la formazione di intermedi diidrossilati (difenoli) da cui si
240
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BIODEGRADAZIONE DEI COMPOSTI ORGANICI NATURALI E DI SINTESI
CH3—(CH2)n—CH3
n-alcano
NADH + H+
O2
NAD+
H 2O
Alcano
monossigenasi
CH3—(CH2)n—CH2OH
Alcol
NAD+
NADH +
Alcol
deidrogenasi
H+
CH3—(CH2)n—CHO
Aldeide
NAD+
Aldeide
deidrogenasi
NADH + H+
CH3—(CH2)n—COOH
Acido carbossilico
β-ossidazione
Figura 17.5 Degradazione di un idrocarburo alifatico.
La degradazione avviene mediante ossidazione del gruppo
metilico terminale.
originano composti lineari che possono entrare nel ciclo
degli acidi tricarbossilici (ciclo di Krebs). È da notare
che le reazioni iniziali del processo possono non essere energeticamente produttive (come del resto avviene
nella glicolisi), ma sono comunque indispensabili per
le successive tappe ossidative che permettono una resa
energetica elevata.
17.4 Biodegradazione aerobica
dello xilene
Gli xileni sono idrocarburi formati da un anello benzenico con 2 sostituenti metilici in posizione variabile.
Fanno parte della miscela di idrocarburi denominata
BTEX, componenti principali delle benzine e impiegati anche come solventi e nella produzione di vernici e
plastiche. I tre isomeri dello xilene sono praticamente
identici come proprietà chimico-fisiche, ma vengono
degradati in modo diverso. L’o-xilene viene degradato
attraverso l’introduzione diretta di ossigeno da monoe diossigenasi. Se questo si verifica negli isomeri meta
e para, l’intermedio formatosi non può subire ulteriore
degradazione con la conseguente morte della cellula.
17
Nel caso di questi due isomeri, la degradazione procede
per ossidazione progressiva di un gruppo metilico con
successivo allontanamento come CO2 (figura 17.6).
17.5 Biodegradazione degli
idrocarburi policiclici
aromatici (IPA)
La degradazione di questi composti si presenta più complessa di quella che avviene negli idrocarburi monoaromatici. La biodegradazione microbica è relativamente
efficiente per i composti formati da un massimo di tre
anelli, mentre i composti con un numero di anelli maggiore risultano pressoché non biodegradabili. Questo
fenomeno è attribuibile alla loro idrofobicità e alle loro
dimensioni, che ne rendono in pratica impossibile l’introduzione nella cellula batterica. La degradazione, laddove possibile, prevede l’intervento delle diossigenasi.
17.6 Biodegradazione anaerobica
degli idrocarburi
Anche se le conoscenze sulle vie di degradazione degli
idrocarburi in anaerobiosi non sono ancora sufficientemente approfondite, si può senza dubbio affermare che
diversi batteri appartenenti al gruppo dei solfato-riduttori (anaerobi obbligati) o denitrificanti (facoltativi),
nonché alcuni batteri rossi non sulfurei (Rhodopseudomonas) sono attivi in questo senso.
La degradazione anaerobica non può ovviamente
prevedere gli stessi meccanismi di attivazione degli idrocarburi che si verificano nel caso del metabolismo aerobico. Per quanto riguarda gli idrocarburi alifatici, è noto
il sistema di attivazione per addizione di acido fumarico che porta alla produzione di acidi grassi (figura 17.7).
Gli idrocarburi aromatici sono stati studiati utilizzando molecole-modello come il benzene o il toluene e
si ritiene che l’evento centrale dell’attivazione microbica
consista nella conversione in benzoil-CoA. Le tappe
prevedono la riduzione dei doppi legami, l’addizione
di una molecola di H2O, la formazione di un chetone
e la successiva apertura dell’anello per idrolisi. Si forma un acido grasso che, attraverso un meccanismo di
β-ossidazione produce infine acetil-CoA, molecola centrale del metabolismo cellulare.
241
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17
BIODEGRADAZIONE DEI COMPOSTI ORGANICI NATURALI E DI SINTESI
Ossidazione
del metile (via TOL)
Ossidazione
dell’anello aromatico
CH3
CH3
CH3
CH3
C2,3O
Apertura
dell’anello
OH
OH
3,4-dimetil catecolo
o-xilene
CH2OH
CH3
CH3
3-metil benzilalcol
CH2OH
CH3
CH3
CH3
HO
OH
3,5-dimetil catecolo
m-xilene
CH3
CH3
OH
CH3
CH3
4-metil benzilalcol
p-xilene
OH
CH3
3,6-dimetil catecolo
Figura 17.6 Vie di degradazione degli xileni. Il simbolo ––I indica che la reazione non avviene o porta a metaboliti improduttivi per
la degradazione.
CH3—CH2—CH2—CH2—CH2—CH3
Esano
+
COO——CH=CH—COO—
CH3—CH—CH2—CH2—CH2—CH3
COO——CH—CH2—COO—
1-metilpentilsuccinato
Fumarato
Figura 17.7 Addizione di fumarato nella degradazione anaerobica degli idrocarburi alifatici.
17.7 Biodegradazione degli
xenobiotici
Con il nome di xenobiotici (dal greco, xenos = estraneo)
vengono indicati i composti organici che possiedono
una struttura non rilevabile in alcun composto di origine naturale.
Appartengono a questa categoria composti insetticidi e pesticidi e polimeri utilizzati nella produzione
di oggetti in plastica. Una delle caratteristiche di questi
prodotti è la stabilità chimica, la capacità cioè di non
subire modificazioni: questo ha come contropartita la
loro permanenza in ambiente per tempi lunghissimi,
fino a rivelarsi pressoché perenne. Il problema è parti-
242
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17
BIODEGRADAZIONE DEI COMPOSTI ORGANICI NATURALI E DI SINTESI
OCH2—COOH
OCH2—COOH
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
2,4-Diclorofenossiacetico
(2,4-D)
(4-5 giorni)
2,4,5-Triclorofenossiacetico
(2,4,5-T)
(20 giorni)
RE C AL C I T R AN Z A
CH2—CH3
COCH2Cl
NHCOOCH(CH3)2
N
CH2OCH3
CH2—CH3
Propham
(5-15 giorni)
Alachlor
(15-30 giorni)
RE C AL C I T R AN Z A
CH3—O
CH
O—CH3
Cl
Cl
CH
CCl3
CCl3
Methoxychlor
(6-12 mesi)
DDT
(2-12 anni)
RE C AL C I T R AN Z A
CO—NH—CH3
Cl
O
Cl
CH2
Cl-C-Cl
Cl
Carbaryl
(1-3 mesi)
Cl
Aldrin
(2-10 anni)
Figura 17.8 Xenobiotici e biodegradabilità. La resistenza alla biodegradazione aumenta con l’aumentare del numero di
sostituenti; in parentesi è indicato il tempo medio di emivita nel suolo.
colarmente grave nel caso in cui questi composti siano
tossici, cancerogeni o mutageni.
Alcune di queste molecole, come il DDT, subiscono
inoltre una bioconcentrazione nei tessuti animali fino
a raggiungere concentrazioni molto superiori a quelle
registrate nell’ambiente in cui l’animale vive, e sono soggette a biomagnificazione passando da un livello tro-
fico a quello successivo nelle catene alimentari. Simili
considerazioni hanno spinto la ricerca verso la sintesi di
composti con tempi di permanenza in ambiente più brevi: confrontando molecole datate con altre molto simili
ma di sintesi più recente si può notare come spesso la resistenza alla biodegradazione sia legata a un alto numero
di sostituenti (figura 17.8).
243
Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
17
BIODEGRADAZIONE DEI COMPOSTI ORGANICI NATURALI E DI SINTESI
17.8 Biodegradazione dei composti
organici alogenati
In questi composti la possibilità di biodegradazione è legata all’attività di microrganismi in grado di allontanare
l’alogeno, rendendo disponibile la parte restante della
molecola per altri microrganismi in grado di utilizzarla.
Spesso la degradazione dei composti alogenati è un fatto
casuale, originato da processi di co-metabolismo: con
questo termine si indica la trasformazione metabolica
di una sostanza ad opera di enzimi in realtà destinati a
catalizzare altre reazioni. Il microrganismo non trae da
questa attività catabolica alcun vantaggio in termini
energetici; questo fenomeno si verifica perché spesso
il composto così metabolizzato assomiglia per analogia
di struttura al nutriente che il microrganismo introduce
per la propria crescita.
17.9 Biodegradazione dei PCB
I PCB (bifenili policlorurati) sono composti impiegati
come pesticidi, lubrificanti e isolanti, la cui utilizzazione
è stata proibita in molti paesi per la loro tossicità, ma che
permangono ancora in ambiente. Anche se non sembra
che esistano microrganismi in grado di compierne la
degradazione, sono noti tuttavia alcuni casi di trasformazione microbica parziale di tali composti. La degradazione aerobica implica una sorta di consorzio microbico in cui intervengono batteri aerobi appartenenti ai
generi Pseudomonas, Burkholderia, Rhodococcus, Achromobacter. Questi microrganismi, che utilizzano il bifenile come unica fonte di carbonio e di energia, si sono
dimostrati in grado di attaccare, oltre al bifenile, anche il
4,4′-diclorobifenile. Tale composto, però, non può subire una degradazione completa, e produce intermedi metabolici che si accumulano con effetti negativi sulla po-
polazione batterica. La capacità degradativa si deve alla
produzione dell’enzima bifenile-diossigenasi, in grado
di introdurre gruppi ossidrile nel composto. In alcuni
casi il processo porta contestualmente all’allontanamento del cloro (dealogenazione). Sono stati osservati
anche altri gruppi di batteri (presenti nei sedimenti) in
grado di compiere la degradazione anaerobica dei PCB.
17.10 Aspetti genetici del
metabolismo biodegradativo
Le coltivazione in laboratorio dei ceppi batterici coinvolti nelle vie metaboliche di degradazione degli idrocarburi (principalmente Pseudomonas e generi affini) ha
permesso di approfondire le conoscenze sulla genetica
dei ceppi interessati e, aspetto assai importante, ha costituito la base per la loro manipolazione genetica alla
ricerca di varietà metabolicamente più efficienti.
Si conoscono e vengono studiati gli operoni che in
Pseudomonas recano i geni interessati alla degradazione
metabolica di diversi idrocarburi. Nella maggior parte
dei casi questi geni sono raggruppati in uno stesso operone e quindi trascritti insieme in un unico RNA messaggero. Più raramente tali geni si trovano in operoni distinti. In entrambi i casi la loro collocazione può essere
cromosomica o plasmidica.
Gli enzimi per la degradazione degli idrocarburi
sono in genere enzimi inducibili, vengono cioè prodotti
solo in presenza dello specifico substrato da degradare.
Un esempio è costituito da due ceppi di Pseudomonas: il ceppo F1, in grado di metabolizzare il benzene
aprendone l’anello aromatico, e il ceppo B13 in grado
di degradare composti clorati (clorocatecoli). Impiegando come agente selettivo 1,4-diclorobenzene, è stato
isolato un ceppo ricombinante che utilizza questo composto come unica fonte di carbonio ed energia.
244
Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
ESERCIZI DI VERIFICA
1. Rispondi alle seguenti domande:
Qual è la differenza fra biodegradazione e mineralizzazione?
Indica quali sono i fattori che influiscono sulla
biodegradabilità di una sostanza.
Quali caratteristiche molecolari rendono una
molecola organica più o meno biodegradabile?
Per quale motivo esistono microrganismi in grado di biodegradare alcuni componenti del petrolio?
Che cosa sono, dove hanno sede e come agiscono le ossigenasi?
Quali processi sono alla base della biodegradazione degli idrocarburi alifatici? E di quelli aromatici?
Che cosa si intende con l’acronimo BTEX?
Quali batteri sono attivi nella biodegradazione
anaerobica degli idrocarburi?
Che cosa si intende per co-metabolismo? Perché si verifica?
Gli enzimi microbici per la biodegradazione degli idrocarburi sono in genere inducibili o costitutivi? Illustra il significato dei termini.
245
Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
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246
Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
INDICE ANALITICO
A
acclimatazione, 110
aceto balsamico tradizionale di
Modena e Reggio Emilia, 96
Acetobacter, 21
Achromobacter, 169
acidi grassi insaturi, 63
acido
acetico, 141
l-ascorbico, 142
benzoico, 140
citrico, 142
clavulanico, 88
fenilacetico, 37
fenossiacetico, 37
gluconico, 61
glutammico, 65
lattico, 59, 141
ortofosforico, 142
piruvico, 7
poli-beta-idrossibutirrico, 58
polilattico, 60
propionico, 141
sorbico, 140
tartarico, 142
acidophilus milk, 100
aconitasi, 60
acqua, 97
acqua libera, 123
acque
profonde, 219
superficiali, 219
acridine, 25
activity water (aw), 123
adattamento indotto, 13
addensanti, 102
addizione di acido fumarico, 243
adsorbimento, 46
adulterazione, 167
aerazione, 40
aerobiosi, 67
affinità di un enzima per uno specifico
substrato, 16
affioramento naturale, 178
aflatossina B1, 223
aflatossine, 161, 219
agar-agar, 142
agente tossico, 213
agenti
che migliorano la solubilità, 74
che reagiscono con il DNA, 218
di distacco, 128
genotossici, 213
intercalanti, 218
Agrobacterium tumefaciens, 107
AIC, 200
air-lift
a circolazione esterna, 43
a circolazione interna, 43
alcani, 241
alcheni, 241
alchini, 241
alcol-tolleranza, 62
algoritmo di screening, 24
alimenti
deperibili, 120
semideperibili, 120
stabili, 120
allele, 214
ALT, 15
alterazione, 167
amebiasi, 161
amido, 34, 35
α-amilasi, 15
amilasi, 12, 66
aminoglicosidici, 88
ammine
aromatiche, 219
eterocicliche, 220
ammostamento o saccarificazione,
98
AMP-ciclico, 159
anabolizzanti ormonali, 127
analisi cromatografica, 24
analoghi delle basi, 25, 218
anatossine, 76
androgeni, 86
anello tiazolidinico, 89
anello β-lattamico, 89
anidride carbonica, 141
anidride solforosa, 140
anilina, 226
antibiotici 37, 53, 127
β-lattamici, 87
naturali, 87
semisintetici, 87
anticorpi monoclonali, 70, 79, 113
anticrittogamici, 127
antigeni ricombinanti per la
produzione di vaccini, 113
antimetaboliti, 218
antiparassitari, 91
antitumorali, 91
antracicline, 219
apiculati, 94
247
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INDICE ANALITICO
apoenzima, 12
apoptosi, 217
applicazione topica, 191
Arthrobacter, 21
asbesto, 219
ASC, 197
asparaginasi, 66
Aspergillus niger, 60
assorbimento, 191
AST, 15
atmosfera
controllata, 135
modificata in equilibrio, 136
protettiva, 135
ATP, 3
attinomiceti, 241
attivazione metabolica, 222
attività degli enzimi, 16
attività fermentativa, 120
auxine, 110
azione meccanica, 43
B
Bacillus, 21, 57
Bacillus thuringiensis, 57, 109
baffles, 43
banche, 208
batteri, 21, 26
idrocarburo-ossidanti, 239
lattici, 174
rossi non sulfurei, 242
benzene, 218
bersaglio farmacologico, 195
bifenile-diossigenasi, 244
bilancio energetico complessivo, 5
bioaccumulo, 227
bioattivazione, 222
biocatalizzatori, 11, 30
bioconcentrazione, 221, 243
bioconversione, 30, 38, 84
biodegradazione, 237
degli idrocarburi, 239
biodisponibilità, 191
bioetanolo, 62
bioindicatori, 226
bioluminescenza, 163
biomagnificazione, 227, 243
biomarcatori, 231
di dose biologica efficace, 233
di dose interna, 233
biomasse microbiche, 37, 53
bioreattore
a fibre cave, 79
ad agitazione pneumatica, 43
biosensori 48
biotecnologie microbiche, 11
biotrasformazione, 49, 191, 221
blastocele, 203
blastocisti, 203
blastula, 203
bleomicina, 218
Bordetella pertussis, 78
Brochothrix thermosfacta, 168
BTEX, 241
C
cadmio, 128
caffeina, 223
cagliata, 178
callo cicatriziale, 107
campione, 24
biologico, 232
casuale, 164
rappresentativo, 164
carbammati, 218
carenza nutrizionale, 31
carica microbica, 123
carotenoidi, 68
caseina, 174
catalasi, 66
catena respiratoria, 4
cefalosporine, 87
cellulasi, 35
cellule
di mammifero, 72
microbiche, 11
multipotenti, 204
staminali, 204
staminali adulte, 205
staminali embrionali, 205
staminali emopoietiche, 206
staminali pluripotenti indotte (iPS),
210
totipotenti, 204
tumorali di mieloma, 79
cellulosa, 35
CEN, 146
Centro Nazionale Sangue, 207
Centro Nazionale Trapianti, 207
ceppi enteroemorragici, 154
ceppi invasivi, 154
ceppo B13, 244
ceppo F1, 244
certificazione di conformità, 143
challenge test, 150
chemioautotrofi, 4
chemioeterotrofi, 4
chemiolitotrofi, 4
chemiorganotrofi, 4
chemiostato, 45
chemiotrofi, 4
chimica combinatoriale, 195
ciclo di Krebs, 4
cisti, 160
citochine, 80
citochinine, 110
classe I, 208
classe II, 208
classe III, 208
clearance renale, 193
Clostridium, 21
Clostridium botulinum, 156
Clostridium perfringens, 157
Codex Alimentarius, 138
coefficiente di resa (Y), 45
coenzimi, 12, 13
cofattori, 12, 13
coliformi, 154
coltura
discontinua, 44
di batteri azotofissatori, 38
starter, 38
co-metabolismo, 244
complesso intermedio EnzimaSubstrato (ES), 16
componente
biologica, 48
elettronica, 48
composti inorganici, 34
composti-guida, 195
condizioni di aerazione, 32
condizioni igieniche d’allevamento, 176
conducibilità termica, 133
conduzione, 133
congelamento, 74
coniugazione, 26, 222
conservanti, 74
conservazione dedicata, 209
conserve sott’aceto, 139
conserve, 134, 171
contaminazione
microbica delle uova, 185
primaria, 119
248
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INDICE ANALITICO
quaternaria, 119
secondaria, 119
terziaria, 119
contraffazione, 166
controlli, 147
di stabilità delle conserve, 172
di stabilità delle semiconserve, 172
in ingresso, 45
convezione, 133
cordone ombelicale, 205
Corynebacterium glutamicum, 21
costante di Michaelis-Menten, 16
costitutivi, 12
cottura dei cibi, 219
CPK, 15
cremoso o a coagulo rotto, 182
criteri di igiene di processo, 164
criteri di sicurezza alimentare, 164
criterio microbiologico, 164
critical point, 148
cromosomica, 244
cross-over, 199
CTP, 3
D
decoloranti, 128
decozione, 98
degradazione, 237
deidrogenasi, 12
deidrogenazione, 4
demetallizzanti, 128
denitrificanti, 241
detergenti, 128
difenile, 140
differenziamento cellulare, 202
digitossina, 115
diosgenina, 86
diossigenasi, 240
Dipartimento per la farmacovigilanza,
199
diserbanti, 127
disinfettanti, 128
distribuzione, 191
DNA polimerasi, 67
doppio cieco, 197
downstream, 31
E
ectoderma, 204
effetto
biologico, 232
biologico delle radiazioni, 215
batteriostatico, 135
Crabtree, 55
Pasteur, 62
teratogeno, 200
Eh negativo, 125
Eh positivo, 125
EHEC, 154
EIA, 162
EIEC, 154
elettronici, 48
elettroporazione, 27
eliminazione di basi azotate, 216
ELISA, 163
ematocrito (Ht), 84
embrione, 203
emicellulosa, 35
emulsionanti, 102
endoderma, 204
energia di attivazione, 12
enteropatogeni, 154
enterotossina, 153
Entner-Doudoroff, 8
enzimi, 11, 38, 128
di superficie, 66
endocellulari, 66
extracellulari, 66
pectinolitici, 66
EPEC, 154
eritropoiesi, 83
ES, 13
Escherichia, 154
Escherichia coli, 21
escrezione, 192
esochinasi, 17
esosofosfato, 8
espianto, 110
esposizione, 232
essiccamento I, 74
essiccamento II, 74
esteri dell’acido p-idrossibenzoico, 140
estratto di lievito, 35
estratto di malto, 33
estrogeni, 86
ETEC, 154
eterocarion, 26
eucarioti, 26
eventi provocati, 24
ex vivo, 115
excisione di nucleotidi, 220
extracellulari, 12
F
falsificazione, 166
FAME, 163
farina di semi di soia e di cotone, 35
farina, 100
farmaci antineoplastici, 113
farmacocinetica, 197
farmacodinamica, 197
fase
clinica, 194
downstream, 31
I, 90, 222
II, 90, 222
IV, 199
preclinica, 194
upstream, 31
FDA, 148
febbre
maltese, 159
paratifoide, 155
tifoide, 155, 156
fed-batch, 32
a ciclo unico, 45
ripetuto, 46
feedback, 18
fenoli, 220
fenomeni
alterativi, 119
naturali, 24
fermentazione, 6
acida, 99
acido-mista, 7
alcolica, 7
butandiolica, 7
butirrica, 7
eterolattica, 7
lenta, 98
omolattica, 7
propionica, 7
tumultuosa, 98
fermenti lattici, 179
FIA, 48
fibre di vetro, 219
filtrazione, 49, 176
fitormoni/fitoregolatori, 127
flavonoidi, 223
flocculazione, 50
flottazione, 50
foglietti embrionali, 203
fosfatasi, 175
alcalina, 15
249
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INDICE ANALITICO
fosforilazione, 3
a livello del substrato, 3
ossidativa, 3
fotoautotrofi, 4
fotoeterotrofi, 4
fotofosforilazione, 3
fotolitotrofi, 4
fotorganotrofi, 4
fotoriattivazione, 220
fototrofi, 4
freeze drying, 139
fresco di alta qualità, 177
fresco pastorizzato, 177
frodi
commerciali, 166
sanitarie, 165
frollatura, 166
fumi, 219
funghi filamentosi, 21
fuseloil, 64
G
β-galattosidasi, 66
gas, 219
gastrulazione, 203
GCP, 197
gelatina, 142
gelatinizzazione, 35
gelificanti, 102
gene
marcatore, 108
operatore, 19
polimorfico, 223
promotore, 19, 108
regolatore, 19
repressore, 19
strutturale, 19
genomica
funzionale, 111
strutturale, 111
germi
patogeni, 119
psicrofili, 135
gibberelline, 110
gliadina, 99
glicerina, 64
glicolisi, 4, 6
glicoproteine, 71
GLP, 198
glucochinasi, 17
glucocorticoidi, 86
Gluconobacter oxydans, 86
glutammato monosodico, 142
glutenina, 99
glutine, 99
GMP, 197
good manufactoring practices, 73
GPT, 15
GTP, 3
GUS, 108
H
HACCP, 148
hazard, 148
High Throughput Screening, 195
hit, 24
HLA, 208
HTST, 134
I
ibridazione dei caratteri, 27
ibridoma, 79
idiofase, 37, 89
idoneità degli ingredienti, 164
idrocarburi, 239
alifatici, 240
alogenati, 218
aromatici, 240
idrolisi delle maltodestrine, 35
idrosolubili, 67
imatinib, 113
immobilizzazione, 45
immunoseparazione, 80
impedenzometria, 163
impellers, 43
inattivattori, 18
incapsulamento, 46
inclusione in gel, 46
indicatori
di inquinamento fecale, 154, 165
di processo, 121
di qualità, 122
di rischio biologico, 165
indice chimico di alterazione, 123
induttore, 19
infezioni alimentari, 121
infusione, 98
inibitori della mitosi, 218
inibizione
a feedback, 20
competitiva, 18
non competitiva, 18
per analogia di struttura, 18
inquinamento atmosferico, 226
inquinanti
inorganici, 228
organici, 228
insaccati
cotti, 172
freschi, 172
stagionati, 172
insetticidi, 127
insulina, 81
interazione con altri farmaci, 200
interazioni covalenti, 46
interferoni, 70, 80
intermedi diidrossilati, 240
intossicazioni alimentari, 121
ione nitronio, 223
ionizzazione degli atomi, 215
IPA, 218, 219
irraggiamento, 133
ISO 22000, 146
ISO 9000, 145
ISO, 145
isolamento
di colture, 23
selettivo, 26
K
kefir, 100
Km, 16
kos, 100
kumis, 100
L
Lactobacillus, 21
Lactobacillus delbrueckii, 59
latte
a lunga conservazione, 177
delattosato, 175
pastorizzato, 177
pastorizzato a temperatura elevata,
177
lattobacilli, 174
lattosio, 175
LDH, 14
lead compounds, 195
lecitine, 142
legami ad alta energia, 3
leg-emogobina, 57
leucemia mieloide cronica, 114
librerie, 195
250
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INDICE ANALITICO
lieviti, 21, 97
lieviti selezionati, 38
lignina, 35
limite di accettabilità, 122
linea germinale, 213
lipasi, 66
lipidi, 175
liposolubili, 67
liquefazione, 35
liquido amniotico, 205
liscivio solfitico, 33
LT, 79
lubrificanti, 128
luppolo, 97, 98
M
macrolidi, 88
malattia di Lyme, 79
malattie autoimmuni, 209
maltazione, 97
malto, 98
maltodestrine, 35
marchio CE, 146
marker, 28
materie plastiche, 127
mazun, 100
melassi, 33
mercurio, 128
mesoderma, 204
metaboliti, 49
endocellulari, 49
extracellulari, 49
primari, 37
secondari, 37
metalli pesanti, 219
metilmercurio, 128
metodi biologici, 49
mezzi
chimici, 50
diagnostico, 80
fisici, 49
MHC, 208
micotossine, 160
microbiologia industriale, 6
microbiologiche, 119
micrococchi, 174
microfiltrazione, 177
microonde, 137
micropropagazione, 110
microrganismi
acidificanti, 176
alofili, 139
geneticamente modificati (MGM),
21
indicatori, 162
probiotici, 182
psicrofili, 176
uccisi o inattivati, 76
vivi ma attenuati, 76
midollo osseo, 206
mieloma multiplo, 29
mineralcorticoidi, 86
mineralizzazione, 237
mitomicina, 218
modalità di conservazione, 123
modalità di recupero, 49
molecole farmacologicamente attive,
106
monitoraggio su matrici ambientali, 226
monossigenasi citocromo P450
dipendenti (CYP), 222
morte cellulare programmata, 217
morula, 203
mosto, 63, 96
muffa bianca, 174
muffe, 159
mutagenesi, 23
ambientale, 212
inserzionale, 116
mutageni
diretti, 217
indiretti, 217
mutanti auxotrofi, 31
mutazioni, 213
cromosomiche, 25, 213
geniche, 25, 213
genomiche, 214, 26
indotte, 25
somatiche, 212
spontanee, 25
Mycobacterium, 21
N
NAD+, 13
NIF (nitrogen fixation), 109
nisina, 140
nitrato, 141
nitrito, 141
nitrogenasi, 57
nitrosammine, 141, 220, 219
notocorda, 204
novobiocina, 88
O
ocratossina, 160
olio, 139
oloenzima, 12
omogeneizzazione, 176
opanoidi, 63
operone, 19, 244
opine, 107
ormoni, 81
β-ossidazione, 240
ossidazione, 4
ossigenasi, 240
P
packaging di espressione, 116
paratifo, 156
paste fresche e farcite, 188
paste secche, 188
pastorizzazione, 99
patulina, 160
PCB, 244
PCR, 163
pectina, 142
PEG, 79
penicillina, 87
acilasi, 66
G, 37
V, 37
peptoni, 35
periodo di emivita, 224
perossidasi, 175
pH, 125, 134
piani di campionamento, 164
piante geneticamente modificate, 107
piombo, 128
piridossalfosfato, 14
polifosfati, 142
poliidrossialcanoati, 58
polimeri biodegradabili, 60
polveri e particolato, 219
potenziale redox, 125
potere riducente, 6
prebiotici, 182
pretrattamenti, 33
processi
a membrana, 50
anaerobi, 6
in continuo, 45
produttivi, 151
prodotti
alimentari, 38
251
Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
INDICE ANALITICO
complessi, 38
fermentati, 173
inorganici, 127
metabolici, 11
organici, 127
probiotici, 182
finali, 151
produzione
dello yogurt, 182
in immersione, 96
in superficie, 96
industriale, 95
promutageni, 217
proteasi alcaline, 66
proteina
anomala, 114
ad attività catalitica, 11
glicosilata, 71
immunogena, 77
ricombinanti, 113
protoplasti, 27
protozoo, 160
Pseudomonas, 168, 240
punto di dimezzamento, 14
Punto di Morte Termica, 132
putrefazione, 119
Q
qualità
dello yogurt, 182
igienica, 119
microbiologica, 119
sanitaria, 119
R
radiazioni
ionizzanti, 137
non ionizzanti, 137
UV, 216
radicali liberi, 216
radicazione, 110
radon, 214
raggi X, 25, 215
raggi γ, 215
rancidità, 120
reattore anaerobico, 42
recalcitranza, 238
record linkage, 200
reduttasi, 175
refrigerazione del latte, 176
regime di condizionamento, 207
relazione dose/risposta, 193
resa, 45
respirazione
aerobia, 4
anaerobia, 5
resveratrolo, 223
Rhizopus, 21
riciclaggio, 45
ricombinazione genetica, 107
rifamicine, 88
rintracciabilità, 147
riparazione
per excisione di basi, 220
per ricombinazione, 220
risposta biologica, 233
RNA, 163
RNA polimerasi, 19
S
saccarosio, 35
Saccharomyces, 21
Saccharomyces cerevisiae, 54
saggi di attività, 24
salagione, 139
salami, 173
Salmonella, 155
Salmonella typhi, 156
salmonellosi, 155
sanitizzazione, 176
scambiatori di calore, 133
SCP (single cell proteins), 54
screening, 23, 195
primario, 23
secondario, 23, 24
segmentazione, 203
selezione casuale, 26
seme sessato, 112
semiconserve, 134, 171
semole, 100
shelf-life, 122, 149, 164
Shiga-like toxin, 154
Shigella dysenteriae, 155
shunt dell’esomonofosfato, 8
sicurezza, 120
igienica, 164
nel settore alimentare, 146
singolo cieco, 197
sintesi chemio-enzimatiche, 86
sistema a perfusione, 79
sistemi
aperti, 45
chiusi, 45
di qualità delle aziende, 146
sito
allosterico, 18
attivo, 12
slant, 39
sofisticazione, 166
solfato-riduttori, 241
solventi, 128
somatostatina, 81
somatotropina, 82
somministrazione
parenterale, 74
per via orale, 75
sonde
a DNA, 163
geniche, 114
sorting, 112
sostanza dopante, 84
sostanze nutritive in eccesso, 31
spore, 156
stabilizzanti, 102
statine, 91
sterilizzazione, 110
commerciale, 135
separata, 44
stigmasterolo, 86
stirene, 218
STR, 43
Streptococcus, 21
Streptomyces, 21
substrato comune, 7
suoli agricoli, 219
suscettibilità, 232
T
talassemia, 209
tamponi, 74
Taq polimerasi, 67
TDP, 132
TDT, 132
tecniche immunomagnetiche, 162
temperatura, 125
Tempo D, 132
Tempo di Morte Termica, 132
tempo totale di reazione, 16
teratogeni, 213
termostatazione, 40
test citogenetici, 225
test di Ames, 225
tetracicline, 88
252
Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
INDICE ANALITICO
TGD, 235
Ti (tumor inducing), 107
tocoferoli, 142
toette, 100
tossina
botulinica, 121, 158
colerica, 78
stafilococcica, 121
tossinfezioni alimentari, 121
tracciabilità, 113
transaminasi GOT, 15
transferasi, 12
transgeni, 107
transmetilazione, 220
trapianto autogenico, 208
trasduzione, 26
trasformazione, 26
traslocazione bilanciata, 114
trattamento di sterilizzazione, 171
trofoectoderma, 203
trofofase, 37, 89
trofozoite, 161
tubo neurale, 204
turbidostato, 45
U
UHT, 135, 177
unipotenti, 204
unità campionaria, 164
UTP, 3
V
vaccini
polisaccaridici, 76
ricombinanti, 70
valore Z, 132
variabilità somatica clonale, 110
velocità
di penetrazione, 133
di reazione, 15
vettore innocuo, 77
vettori
di farmaci, 80
non retrovirali, 210
retrovirali, 210
virali, 116
via
enterale, 192
parenterale, 191
Vibrio cholerae, 158
vie di somministrazione, 191
vinificazione
in bianco, 94
in rosso, 94
naturale, 94
virus HAV, 161
vitamina
B12, 67
B2, 68
C, 86
Vmax, 16
VTEC, 154
Y
yogurt, 179
a coagulo compatto o intero, 182
da bere, 182
Z
zangolatura, 178
Zymomonas, 21
253
Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario
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