Idee per il tuo futuro Fabio Fanti Biologia, microbiologia e biotecnologie Biotecnologie di controllo sanitario SCIENZE Fabio Fanti Biologia, microbiologia e biotecnologie Biotecnologie di controllo sanitario Copyright © 2013 Zanichelli editore S.p.A., Bologna [9401] www.zanichelli.it I diritti di elaborazione in qualsiasi forma o opera, di memorizzazione anche digitale su supporti di qualsiasi tipo (inclusi magnetici e ottici), di riproduzione e di adattamento totale o parziale con qualsiasi mezzo (compresi i microfilm e le copie fotostatiche), i diritti di noleggio, di prestito e di traduzione sono riservati per tutti i paesi. L’acquisto della presente copia dell’opera non implica il trasferimento dei suddetti diritti né li esaurisce. 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Non possono considerarsi rare le opere di cui esiste, nel catalogo dell’editore, una successiva edizione, le opere presenti in cataloghi di altri editori o le opere antologiche. Nei contratti di cessione è esclusa, per biblioteche, istituti di istruzione, musei ed archivi, la facoltà di cui all’art. 71 - ter legge diritto d’autore. Maggiori informazioni sul nostro sito: www.zanichelli.it/fotocopie/ Realizzazione editoriale: – Coordinamento redazionale: Elena Bacchilega, Simona Vannini – Redazione: Epitesto, Milano – Segreteria di redazione: Deborah Lorenzini – Progetto grafico: 46XY, Milano – Impaginazione: pre&stampa, Segrate MI – Ricerca iconografica, disegni e indice analitico: Epitesto, Milano – Disegni: Giuseppe Maserati, Riccardo Vercesi – Fotografie al microscopio elettronico: © Dennis Kunkel Mycroscopy, Inc. – Idee per il tuo futuro: Laura Mancuso (testi), Barbara Di Gennaro (redazione), Miguel Sal & C., Bologna (progetto grafico e impaginazione), Sara Colaone (disegni) L’Autore ringrazia la professoressa Anna Rita Musa per la preziosa collaborazione. Copertina: – Progetto grafico: Miguel Sal & C., Bologna – Realizzazione: Roberto Marchetti – Immagine di copertina: cellule di Candida albicans, un saccaromicete che vive nel cavo orale, nel tratto gastrointestinale e nell’apparato riproduttore femminile; questo fungo può diventare patogeno e provocare una malattia detta candidosi. © Science Photo Library/TIPS. Prima edizione: febbraio 2013 L’impegno a mantenere invariato il contenuto di questo volume per un quinquennio (art. 5 legge n. 169/2008) è comunicato nel catalogo Zanichelli, disponibile anche online sul sito www.zanichelli.it, ai sensi del DM 41 dell’8 aprile 2009, All. 1/B. Zanichelli garantisce che le risorse digitali di questo volume sotto il suo controllo saranno accessibili, a partire dall’acquisto dell’esemplare nuovo, per tutta la durata della normale utilizzazione didattica dell’opera. Passato questo periodo, alcune o tutte le risorse potrebbero non essere più accessibili o disponibili: per maggiori informazioni, leggi my.zanichelli.it/fuoricatalogo File per diversamente abili L’editore mette a disposizione degli studenti non vedenti, ipovedenti, disabili motori o con disturbi specifici di apprendimento i file pdf in cui sono memorizzate le pagine di questo libro. Il formato del file permette l’ingrandimento dei caratteri del testo e la lettura mediante software screen reader. Le informazioni su come ottenere i file sono sul sito www.zanichelli.it/diversamenteabili Suggerimenti e segnalazione degli errori Realizzare un libro è un’operazione complessa, che richiede numerosi controlli: sul testo, sulle immagini e sulle relazioni che si stabiliscono tra essi. L’esperienza suggerisce che è praticamente impossibile pubblicare un libro privo di errori. Saremo quindi grati ai lettori che vorranno segnalarceli. Per segnalazioni o suggerimenti relativi a questo libro scrivere al seguente indirizzo: lineaquattro@zanichelli.it Le correzioni di eventuali errori presenti nel testo sono pubblicate nel sito www.zanichelli.it/aggiornamenti Zanichelli editore S.p.A. opera con sistema qualità certificato CertiCarGraf n. 477 secondo la norma UNI EN ISO 9001:2008 Fabio Fanti Biologia, microbiologia e biotecnologie Biotecnologie di controllo sanitario SCIENZE Idee per il tuo futuro CHE COSA FARÒ DA GRANDE www.ideeperiltuofuturo.it Sei alla fine del tuo percorso scolastico. Che cosa fare adesso? Iscriversi a un corso universitario? Fare uno stage o un corso professionalizzante? Cercare di entrare subito nel mondo del lavoro? Studiare e al contempo lavorare? Per aiutarti nella scelta ti proponiamo alcuni dati relativi al 2009-2011. È impossibile dire come saranno le cose tra qualche anno, i tempi recenti ci hanno abituati a cambiamenti anche repentini. La laurea “paga”. Una recente ricerca Isfol 1 ha mostrato che chi è laureato ha più possibilità di trovare un’occupazione e in media riceve uno stipendio più alto rispetto a chi possiede soltanto un diploma. Dal momento che i diplomati entrano nel mondo del lavoro prima dei laureati, inizialmente il tasso di occupazione per i primi è superiore rispetto a quello dei secondi, ma già prima del compimento dei 30 anni chi possiede una laurea ha più possibilità di trovare lavoro, per arrivare nella fascia 34-44 anni, dove il tasso di occupazione dei laureati supera del 7% quello dei diplomati. In media, tra 25 e 64 anni è occupato il 73,1% dei diplomati e il 79,2% dei laureati. Però, secondo uno studio OCSE del 2011, i giovani laureati subiscono di più gli effetti della recente crisi economica rispetto ai loro coetanei con istruzione secondaria inferiore2. Quali lauree valgono un lavoro? Le lauree “brevi” servono? Le lauree triennali si rivelano molto utili ai fini dell’occupazione: a un anno dal termine degli studi il 42,1% dei laureati triennali lavora, con picchi dell’81,7% per le professioni sanitarie. Tirocini e stages sono determinanti per formare e inserire questi laureati nel mondo del lavoro. I tassi di occupazione più alti si hanno tra i medici, seguiti dai laureati in chimica farmaceutica e ingegneria. In generale, sono le discipline di tipo scientifico – sia a livello di diploma sia a livello di laurea – le più spendibili nel mondo del lavoro, mentre le discipline umanistiche condannano a una difficile collocazione sul mercato, anche a fronte di un eccesso di offerta di laureati in questi ambiti. A Nord c’è più lavoro, ma… A livello nazionale il tasso di disoccupazione è 7,8%, che sale a 27,4% se si considerano solo i giovani (15-24 anni): più alto al Sud (39,2%), meno al Centro (25,3%), più basso al Nord (19,0%). La situazione per le ragazze è più critica: il tasso della disoccupazione femminile, nella fascia 15-24 anni, supera di circa 8 punti percentuali quello maschile (32,3% per le donne, 23,9% per gli uomini), forbice che si mantiene simile nelle diverse zone geografiche: al Nord il tasso è 22,7% per le donne e 16,4% per gli uomini; al Centro è 34,8% per le donne e 18,7% per gli uomini e a Sud è di 44,0% per le donne e 36,0% per gli uomini. Tuttavia, i dati della disoccupazione giovanile non devono scoraggiare chi cerca lavoro: se la disoccupazione giovanile è del 27,4%, vuol dire che una parte non piccola dei giovani che hanno cercato lavoro (il 72,6%) lo ha trovato3. Inoltre i dati variano molto da luogo a luogo e anche all’interno di una stessa regione può esservi una grande varietà di situazioni. L’Emilia-Romagna è tra le regioni in cui la disoccupazione giovanile incide meno, ma con grandi differenze tra le province: se Bologna nel 2010 raggiunge un tasso di disoccupazione di 29,2%, a Piacenza il valore è più che dimezzato (13,6%)4. 1 Tutti i dati sono tratti da una ricerca Isfol con dati relativi al 2010, (l’Isfol, Istituto per lo Sviluppo della Formazione Professionale dei Lavoratori è un ente pubblico di ricerca), e ISTAT del II Trimestre 2011. 2 Rapporto OCSE Education at a Glance 2011. 3 Dati ISTAT del II Trimestre 2011. 4 Dati Confartigianato Imprese EmiliaRomagna, 2010. V Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario COME FUNZIONA L’UNIVERSITÀ L’Università italiana offre corsi di studio organizzati in tre cicli: laurea, di durata triennale (180 crediti formativi in un massimo di 20 esami), al termine della quale si consegue il titolo di Dottore; ad esempio laurea in Tecniche di radiologia medica o in Scienze del comportamento e delle relazioni sociali. POSSO ISCRIVERMI ALL’UNIVERSITÀ? Laurea magistrale, di durata biennale (120 crediti in un massimo di 12 esami), al termine della quale si consegue il titolo di Dottore magistrale; ad esempio laurea in Biotecnologie mediche o in Psicologia clinica. Per iscriversi all’Università è necessario il diploma di maturità quinquennale oppure quello quadriennale con un anno integrativo o, in alternativa, un obbligo formativo aggiuntivo da assolvere durante il primo anno di corso. Dottorato di ricerca e Scuola di specializzazione. Esistono anche corsi di laurea magistrali a ciclo unico, della durata di 5 (300 crediti in un massimo di 30 esami) o 6 anni (360 crediti in un massimo di 36 esami); ad esempio Medicina e Chirurgia. Per approfondire gli studi si può accedere a master di 1° e di 2° livello e ai corsi di alta formazione. Quanto costa l’Università? www. ideeperiltuofuturo.it Il mio diploma è riconosciuto in Europa? http://www.enicnaric.net/ Vorrei studiare negli USA www. ideeperiltuofuturo.it I crediti formativi universitari (CFU) misurano il carico di lavoro dello studente (1 CFU = 25 ore di impegno; 60 CFU = 1 anno di impegno universitario), compresi lo studio individuale ed eventuali esperienze di apprendistato5. Sono stati introdotti per facilitare il confronto tra i sistemi e i programmi di differenti corsi e Atenei italiani ed europei, e quindi il passaggio da un corso di studio a un altro, oppure da un’Università a un’altra, anche straniera: i CFU sono trasferibili in ECTS (European Credit Transfer and Accumulation System) e quindi riconosciuti nelle Università di tutta Europa. Tramite i CFU è possibile valutare ai fini della laurea anche esperienze quali stages e tirocini. Infine i CFU permettono di semplificare la determinazione dei piani di studio individuali (PSI) che ciascuno studente può modulare su se stesso. In alcuni casi è possibile personalizzare il proprio percorso di studi, inserendo nel piano degli esami da sostenere alcuni corsi non previsti dal piano di studi istituzionale. Quando si presenta il PSI bisogna rispettare il minimo di crediti obbligatori per ciascun ambito disciplinare previsti dal proprio corso di laurea. Vorrei studiare in Europa. I cittadini dell’Unione europea (UE) possono studiare, dalla scuola primaria al dottorato di ricerca, in uno dei paesi UE. Per facilitare questi scambi è stato creato Ploteus, il portale delle opportunità di apprendimento (www.europa.eu/ploteus): programmi di scambio, borse di studio, descrizioni dei sistemi di istruzione e apprendimento dei vari paesi europei, nonché indicazioni dei siti web degli istituti di istruzione superiore, i database dei corsi di formazione, le scuole... Attraverso Ploteus è possibile anche avere notizie pratiche, ad esempio su come raggiungere la località e dove alloggiare, sul costo della vita, le tasse, i servizi cui si può accedere. 5 Regolamento recante norme concernenti l’autonomia didattica degli atenei, Decreto Ministeriale 3 novembre 1999, n.509 VI Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario I TEST DI AMMISSIONE L’accesso ad alcuni corsi di laurea è filtrato da una prova di ammissione, per iscriversi alla quale occorre versare un importo (attorno ai 60 euro): sono Medicina e Chirurgia, Odontoiatria e Protesi Dentaria, Medicina Veterinaria, le lauree a ciclo unico finalizzate alla formazione in altre professioni sanitarie e in architettura. Il numero programmato è reso obbligatorio dal Ministero dell’istruzione dell’Università e della ricerca (MIUR) per alcuni corsi di laurea, mentre in altri casi è il singolo Ateneo a decidere (a Bologna, ad esempio, vi sono 44 corsi di laurea a numero programmato). Le prove d’ingresso comprendono 80 quesiti, cui rispondere in due ore di tempo (15 minuti in più per architettura); ogni risposta corretta fa guadagnare un punto, le risposte sbagliate fanno perdere 0,25 punti, mentre le risposte non date valgono 0. I test comprendono quesiti di “cultura generale e ragionamento logico”, oltre a domande sulle materie caratterizzanti i diversi indirizzi universitari. Ad esempio, per essere ammessi a Medicina bisogna rispondere a 40 quesiti di “cultura generale e ragionamento logico”, 18 di biologia, 11 di chimica e 11 di fisica e matematica. Di seguito trovi una selezione di test di biologia tratti da alcune prove di ammissione ai corsi di laurea in Medicina e Chirurgia e in Odontoiatria e Protesi Dentaria; queste domande riguardano argomenti di microbiologia. 01 “Uno scienziato, nel suo laboratorio di St. Martin, a Londra, verificando lo stato di una coltura di batteri, vi trovò una copertura di muffa. Questo evento non aveva nulla di straordinario, poiché situazioni del genere erano normali nei laboratori. La cosa eccezionale fu invece il fatto che questa muffa aveva annientato tutti i batteri circostanti. La scoperta fu casuale: se si fosse trattato di uno scienziato più distratto, probabilmente tutto sarebbe passato inosservato...” Il brano riportato si riferisce alla scoperta: a d dell’aspirina b del virus HIV c e 03 a b c d e della penicillina del vaccino del vaiolo Qui trovi tante informazioni in più e le prove assegnate negli ultimi anni http:// accessoprogrammato. miur.it. Qui trovi tante informazioni in più e degli esempi di test www.cisiaonline.it. Dall’osservazione al microscopio ottico di una cellula si nota che in essa sono presenti mitocondri e ribosomi insieme ad altri organuli. Si può sicuramente escludere che si tratti: di una cellula vegetale con attività fotosintetica di un batterio in forte attività metabolica del micelio di un fungo del terreno di una cellula di calamaro gigante della cellula di un lievito usato per la panificazione [dalla prova di ammissione al corso di laurea in Odontoiatria e Protesi Dentaria, anno 2008-2009] degli anticorpi [dalla prova di ammissione al corso di laurea in Medicina e Chirurgia, anno 2005-2006] 02 a b c d e 04 Individuare l’unica affermazione del tutto corretta: tutte le cellule utilizzano ossigeno per le proprie attività metaboliche tutte le cellule posseggono più cromosomi tutte le cellule presentano mitocondri tutte le cellule possono riprodursi tutte le cellule traggono origine da altre cellule [dalla prova di ammissione al corso di laurea in Medicina e Chirurgia, anno 2008-2009] a Indica quale di queste affermazioni sui virus è corretta: i virus non infettano i batteri b i virus contengono entrambi gli acidi nuc cleici i virus si replicano solo all’interno della cellula d i virus infettano solo cellule animali e i virus provocano solo malattie incurabili [dalla prova di ammissione al corso di laurea in Medicina e Chirurgia, anno 2009-2010] Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario VII DOVE SI STUDIA ... All’Università potrai studiare la Microbiologia in molti corsi di laurea in ambito medico, biologico-ambientale, agrario e farmaceutico; riportiamo qui di seguito solo alcuni esempi Scienze biologiche Biotecnologie Scienze e tecnologie agrarie Scienze e tecnologie alimentari Viticoltura ed enologia Farmacia Chimica e tecnologia farmaceutiche Scienze ambientali Scienze del territorio e dell’ambiente agro-forestale Per saperne di più Ingegneria per l’ambiente e il territorio www. ideeperiltuofuturo.it Medicina e chirurgia Odontoiatria e protesi dentaria Corsi di laurea abilitanti alle professioni sanitarie Medicina veterinaria Acquacoltura e igiene delle produzioni ittiche Produzioni animali e controllo della fauna selvatica Ci sono poi diversi altri corsi di laurea (per esempio Scienze delle attività motorie e sportive) che prevedono esami di igiene, comprendenti una parte molto vasta dedicata alla microbiologia. VIII Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario VERSO IL LAVORO Vorresti trovare lavoro? Nelle pagine che seguono trovi informazioni su come e dove cercare lavoro, cos’è lo stage, come scrivere un curriculum e una lettera di accompagnamento, come sostenere un colloquio. Sul sito www.ideeperiltuofuturo.it trovi tante informazioni utili e dettagliate in più per aiutarti nella tua ricerca in Italia e all’estero: i centri per l’impiego e i Career days, siti internazionali, una panoramica dei contratti di lavoro e altro ancora. Vuoi cercare lavoro all’estero? www. ideeperiltuofuturo.it La ricerca di lavoro in Italia. Per mettere in contatto domanda e offerta di lavoro esistono in Italia numerosi soggetti, sia pubblici sia privati, autorizzati dallo Stato a svolgere servizi di intermediazione e collocamento. Sono i Centri per l’impiego (CIP), le Agenzie per il lavoro, la Borsa continua nazionale del lavoro (BCNL) e il portale «Cliclavoro». Anche le scuole secondarie di secondo grado, le Università, i comuni, le associazioni dei datori di lavoro e dei lavoratori, i patronati, i gestori di siti internet possono svolgere attività di intermediazione, purché non abbiano fini di lucro. Cercare lavoro tra le pagine dei giornali. Un canale tradizionale ma sempre valido per chi cerca annunci di lavoro è rappresentato da supplementi e inserti delle maggiori testate a diffusione nazionale e dai giornali specializzati; ne segnaliamo alcuni fra i principali: il supplemento «Tutto Lavoro» del lunedì della «Stampa»; le pagine dedicate al lavoro il giovedì dalla «Repubblica»; il supplemento «Corriere lavoro», con la sezione «Trovo Lavoro», del «Corriere della Sera» del venerdì; il supplemento «Carriere&Lavoro» del «Sole 24Ore» del venerdì tocca tematiche relative al nuovo mercato del lavoro attraverso inchieste e dossier, e fornisce strumenti e notizie utili per cambiare mestiere e migliorare la propria carriera. Fra i giornali specializzati: il settimanale «Trova Lavoro» con annunci dall’Italia e dall’estero e una selezione dei concorsi tratti dalla Gazzetta Ufficiale; «Walk on Job» , un bimestrale distribuito gratuitamente in 41 città italiane, che dà spazio al mondo del lavoro e della formazione, con inchieste, interviste, notizie e opportunità prima e dopo la laurea; il mensile «Bollettino del Lavoro». Cercare lavoro online. Accanto alla versione cartacea dei supplementi dei giornali, si trova anche la versione online, col vantaggio di consentire un aggiornamento continuo degli annunci, l’inserimento immediato del proprio curriculum in apposite banche dati, di inviare direttamente la propria candidatura in risposta alle offerte di lavoro, di ricevere gli annunci sulla propria e-mail. Tra le versioni online segnaliamo «Job24» del «Sole 24Ore» e «MioJob» della «Repubblica». Tra i più importanti (e seri) siti per la ricerca di lavoro indichiamo Monster (www.monster.it) e Infojobs (www.infojobs.it). Da consultare è anche il sito www.concorsi.it, che informa sui concorsi pubblici banditi in Italia. Per quanto riguarda i social network professionali si segnalano Linkedin (www.linkedin.com) e Xing (www.xing. com) che, oltre a funzionalità come “find job”, offrono la possibilità di entrare a far parte di gruppi di discussione utili alla crescita professionale. LA TOP TEN DEI LAVORI IN ITALIA Non hai un’idea precisa di cosa vorresti fare? Alcune figure professionali sono molto ricercate in Italia, ecco la top ten dei profili lavorativi più ricercati in Italia nel 2011, secondo il quotidiano “Il Sole 24 Ore”. 1) Farmacista 2) Progettista settore metalmeccanico 3) Infermiere 4) Addetto consulenza fiscale 5) Sviluppatore software 6) Progettista meccanico 7) Educatore professionale 8) Addetto logistica 9) Disegnatore tecnico Cad-Cam 10) Fisioterapista (Fonte: Union CamereExcelsior 2011) IX Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario CURRICULUM VITAE E LETTERA DI ACCOMPAGNAMENTO Scarica il CV Europass www.europassitalia.it Il Curriculum Vitae. Quando si è alla ricerca di un lavoro, prima o poi arriva il momento di inviare (per posta ordinaria o per e-mail) il proprio Curriculum Vitae (CV) e una lettera di accompagnamento alle aziende per le quali si desidera lavorare, sperando di essere chiamati per un colloquio. Il CV è la carta di identità professionale del candidato e deve indicare l’iter formativo, le conoscenze e le competenze di chi si propone per ottenere un impiego. Si comincia sempre dai dati anagrafici, per un’inquadratura iniziale, e dai contatti (indirizzo, numero di telefono, cellulare, e-mail...), per poi passare in rassegna le precedenti esperienze lavorative e le varie tappe della propria istruzione/formazione, dalla più recente alla più lontana nel tempo. Altre informazioni indispensabili riguardano la padronanza di una o più lingue straniere e le competenze tecniche; conviene anche mettere in rilievo le capacità relazionali e organizzative, se si posseggono. Per quanto riguarda altre informazioni personali, è meglio inserire solo quelle che possono essere apprezzate dalla specifica azienda cui è indirizzato il CV. Infine, non bisogna mai dimenticare di autorizzare il trattamento dei dati personali, facendo riferimento al d. lg. 196/2003. Un CV efficace sarà completo, chiaro e soprattutto breve (due pagine di solito sono sufficienti): bisogna tenere conto che chi lo legge è abituato a valutarne decine tutti i giorni e apprezzerà il fatto di trovare subito le informazioni che gli interessano. Meglio selezionare solo le aziende che più si avvicinano al proprio profilo professionale e scrivere per ciascuna una lettera di accompagnamento mirata. I portali che si occupano di selezione del personale solitamente danno la possibilità di compilare CV online, secondo modelli prestabiliti; oppure si può preparare da soli il CV e poi caricarlo sul sito su cui ci si vuole proporre. La lettera di accompagnamento (o cover letter ) va preparata con molta attenzione perché serve a convincere il selezionatore a prendere in considerazione l’offerta di lavoro e quindi a esaminare il CV. La forma deve essere curata e corretta, per dimostrare un buon livello di istruzione. La lettera di accompagnamento è una e-mail (o una lettera) dalla quale devono emergere in maniera sintetica (dieci righe al massimo) le motivazioni del candidato, le competenze, i titoli, le esperienze che rendono la persona adatta per quel posto di lavoro. Sintetici sì, ma non vaghi o generici: l’impegno nello scrivere la lettera sta proprio nel risultare sinceri, con le idee chiare ma anche aperti a varie possibilità. La lettera deve far capire che si conosce, anche se dal di fuori, l’azienda e che se ne comprendono le necessità. Per avere queste informazioni è necessario visitarne il sito internet ma anche, ad esempio, cercare e, se si può, sperimentare, i prodotti di quell’azienda. In questo modo sarà più facile mettersi dal punto di vista dell’azienda stessa, capire quali competenze potrebbero essere utili e puntare su quelle. X Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario CURRICULUM VITAE E LETTERA DI ACCOMPAGNAMENTO Le possibilità di essere valutati crescono se la busta che contiene lettera e CV, o l’email, è indirizzata al direttore del settore nel quale vorremmo lavorare e non genericamente all’impresa o, ad esempio, all’ufficio delle risorse umane. In questo caso bisogna fare accurati controlli per essere certi di scrivere correttamente il nome, il titolo di studio, la posizione che ricopre la persona a cui indirizziamo la lettera ed essere sicuri che effettivamente lavori ancora lì. Una lettera di accompagnamento. Carla è diplomata in Servizi per l’agricoltura e lo sviluppo rurale. Ha sfruttato un periodo di lavoro part-time in un call center per avere il tempo di cercare un corso di formazione che faccia al caso suo. Dopo ha frequentato un corso della Regione di 180 ore in Sicurezza alimentare. Nel frattempo visita i siti di varie aziende della zona in cui abita e ne individua alcune cui decide di inviare il CV. ELDQFRODWWH#ODPR]]DUHOODLW La ditta dove vorrebbe lavorare è “La Mozzarella”, che produce latte e deriva2IIHUWDGLFROODERUD]LRQH ti. Nel sito si insiste sulla qualità dei prodotti unita al rispetto dell’ambiente. Egr. dott. Biancolatte, A chi vuole lavorare per “La Mozho frequentato l’Istituto professionale per i Servizi per l’agricoltura e lo sviluppo rurale di A… diplomandomi con 96/100. Di recente ho seguito un corso di specializzazione zarella” è richiesta personalità, grinta della Regione B… in Sicurezza alimentare, che verteva sulle moderne tecniche di analisi e condivisione dei valori dell’azienda. degli alimenti. Con una telefonata Carla verifica che il ,OYRVWURQRPHFKHFRQRVFRVLQGDSLFFRODSHUPHqVLQRQLPRGLVHULHWjHDI¿GDELOLWj responsabile della sicurezza alimentare HFRQGLYLGRO¶RELHWWLYRGLSXQWDUHVXOODTXDOLWjHODVRVWHQLELOLWjGHOODSURGX]LRQHH VXOULVSHWWRSHUO¶DPELHQWHPLqVHPSUHSLDFLXWDO¶LGHDGLODYRUDUHQHOO¶DUHDGHOOD è il dott. Biancolatte. produzione e del controllo alimentare, e in particolare nella produzione dei latticini Ecco la lettera di accompagnamento che apprezzo molto, pertanto vi chiedo gentilmente di informarmi riguardo alla vostra scritta da Carla. GLVSRQLELOLWj Le porgo i miei più cordiali saluti, Carla Bianchi XI Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario IL COLLOQUIO E LO STAGE E se mi fanno una domanda assurda? www. ideeperiltuofuturo.it Il colloquio. La strategia per la buona riuscita di un colloquio di lavoro comincia nel momento in cui si viene contattati. Innanzitutto è importante rispondere subito e con gentilezza alla convocazione (che sia arrivata per telefono, lettera o e-mail) e presentarsi puntuali all’appuntamento. Per evitare ritardi, conviene informarsi bene su come raggiungere la sede del colloquio e partire con largo anticipo, così da non arrivare trafelati all’incontro. Il successo di un colloquio dipende anche da una serie di informazioni che sarà stato possibile raccogliere sull’azienda e utilizzare a proprio vantaggio. Ad esempio, per decidere quale sia l’abbigliamento più adatto, uno sguardo allo stile dell’azienda è consigliato. Basterà poi adattare questo stile al proprio e alla posizione alla quale si aspira. Se, ad esempio, cerchiamo lavoro in banca potrebbe essere una buona idea non mettere i jeans, se si tratta di un’azienda di grafica che ha uno stile giovane e casual i jeans andranno benissimo. Conoscere l’azienda per la quale si desidera lavorare è importante anche per mostrare in maniera mirata le competenze di cui si dispone, nonché interesse e sintonia con quella specifica linea imprenditoriale. Quando ci si trova di fronte alla persona incaricata della selezione, bisogna mostrarsi sicuri e determinati senza essere spavaldi o sbruffoni. Non conviene mentire a proposito delle esperienze lavorative precedenti o essere disonesti riguardo alle proprie capacità: prima o poi si verrà scoperti, magari nel momento meno opportuno... È invece importante mostrarsi positivi, disponibili a imparare e a risolvere problemi. I reclutatori rivolgono al candidato una serie di domande, a volte prevedibili, che possono riguardare la sfera personale (ad esempio “Da quanto tempo cerca lavoro?”...) o la sfera professionale: sia sulle esperienze passate (ad esempio: “Mi parli del suo curriculum”, “Perché ha scelto proprio quel corso di studi?”...), sia sul lavoro per cui si è a colloquio (ad esempio “Cosa sa della nostra azienda?”, o anche “Perché dovremmo assumerla?”). Alcune aziende preparano un colloquio di gruppo, per osservare in che modo i candidati interagiscono tra loro, collaborano, affrontano alcune situazioni critiche che simulano quelle reali. In questi casi il consiglio è di non essere eccessivi: la cosa migliore è mostrare senso pratico e capacità di mediare e partecipare o guidare il gruppo verso la soluzione del problema. Lo stage (tirocinio formativo o internship). Si tratta di un’esperienza professionale utile per chi si avvicina al mondo del lavoro per la prima volta, per accrescere le proprie competenze e arricchire il Curriculum Vitae, anche perché è difficile trovare un impiego senza avere precedenti esperienze. Lo stage non rientra nelle tipologie di lavoro subordinato poiché è obbligatoria per il tirocinante solo un’assicurazione in caso di infortunio (e non lo stipendio). Per quantificare l’utilità dello stage è stato creato il sistema dei crediti formativi, ossia un punteggio che il giovane studente guadagna nel corso del suo tirocinio e che può spendere ai fini formativi: di diploma, per gli studenti del quinto anno di scuola media superiore; di esame o di laurea, per gli universitari. Un’esperienza di stage può anche arrivare a sostituire un esame universitario: è sufficiente certificare che l’esperienza svolta durante lo stage va a integrare le conoscenze acquisite nell’arco degli studi, completandole e arricchendole. XII Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario SOMMARIO 2.11 Capitolo 1 METABOLISMO ED ENERGIA 1.1 1.2 1.3 Energia dal metabolismo Strategie metaboliche per la produzione di energia Le fermentazioni 2 4 6 Capitolo 2 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 2.10 Biotecnologie tradizionali e innovative Biotecnologie microbiche Biocatalizzatori molecolari: gli enzimi Composizione Classificazione Meccanismo d’azione degli enzimi Specificità degli enzimi Coenzimi e cofattori Isoenzimi Cinetica e attività enzimatica Fattori che influenzano la velocità di reazione Concentrazione dell’enzima Concentrazione del substrato Temperatura pH Inibizione enzimatica Regolazione della sintesi degli enzimi Induzione Repressione Biocatalizzatori cellulari: i microrganismi Le tecniche di selezione dei ceppi microbici Strategie di screening 24 25 26 27 27 28 28 Capitolo 3 BIOTECNOLOGIE MICROBICHE 2.1 Selezione dei ceppi alto-produttori Mutazioni Ricombinazione naturale di geni Ibridazione di lieviti Fusione di protoplasti Elettroporazione DNA ricombinante (ingegneria genetica) I PROCESSI BIOTECNOLOGICI 10 11 11 11 12 13 13 13 14 14 16 16 16 17 17 18 19 19 20 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 21 3.7 3.8 3.9 21 23 3.10 3.11 Substrati e prodotti I terreni di coltura per la microbiologia industriale Fonti di carbonio Fonti di azoto Fonti di vitamine Minerali Agenti antischiuma Sistemi tampone Precursori I prodotti Fasi produttive: preparazione dell’inoculo Lo scale-up I fermentatori o bioreattori Classificazione dei bioreattori in base alla tipologia costruttiva Classificazione in base al sistema di aerazione/agitazione Sterilizzazione Processi batch, continui, fed-batch Immobilizzazione dei biocatalizzatori I sistemi di controllo Il recupero dei prodotti (downstream) 30 31 33 34 35 35 36 36 37 37 39 39 40 41 42 43 44 46 47 49 XIII Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario SOMMARIO Capitolo 4 PRODOTTI OTTENUTI DA PROCESSI BIOTECNOLOGICI 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 Biomasse microbiche Single cell proteins Lievito per panificazione Colture insetticide da Bacillus Colture di Rhizobium Acido poli-beta-idrossibutirrico e poli-idrossi-alcanoati da biomasse Acidi organici Acido lattico (fermentazione anaerobia) Acido citrico (fermentazione aerobia) Acido gluconico Etanolo Aminoacidi Produzione di L-lisina Produzione di acido glutammico Enzimi Vitamine 54 54 55 56 57 58 58 59 60 61 61 64 64 65 65 67 5.9 5.10 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 Produzione biotecnologica di proteine umane Sistemi di espressione Sistemi di coltura, mezzi colturali e contaminanti Purificazione Sterilità Eliminazione dei pirogeni Eccipienti impiegati nei farmaci proteici biotecnologici Liofilizzazione delle proteine Vie di somministrazione e assorbimento La produzione industriale: lo scale-up Produzione di vaccini Vaccini ricombinanti Produzione di anticorpi monoclonali Produzione di interferoni Produzione di ormoni Ormoni polipeptidici Bioconversioni Produzione di vitamina C Bioconversione di ormoni steroidi Produzione di antibiotici Classi strutturali e meccanismo d’azione degli antibiotici 6.1 6.4 6.5 6.6 70 71 72 72 73 74 74 74 74 75 75 77 79 80 81 81 84 86 86 86 87 88 88 89 89 89 90 90 91 PRODUZIONI BIOTECNOLOGICHE ALIMENTARI 6.3 PROTEINE UMANE RICOMBINANTI, ORMONI E ANTIBIOTICI 87 88 Capitolo 6 6.2 Capitolo 5 Antibiotici che inibiscono la sintesi della parete cellulare batterica Antibiotici che bloccano la sintesi proteica Antibiotici che alterano le funzioni della membrana cellulare Antibiotici che interferiscono con la sintesi degli acidi nucleici Produzione di penicilline e cefalosporine Produzione di penicillina Penicilline naturali Penicilline semisintetiche Cefalosporine Statine e altre molecole di impiego medico e zootecnico 6.7 Il vino Alterazioni microbiche del vino L’aceto Aceto balsamico La birra Alterazioni della birra Il pane e i prodotti da forno a lievitazione naturale Lo yogurt I vegetali fermentati Crauti Olive Cetrioli Esopolisaccaridi Xantano Destrano Alginato 93 95 95 96 97 99 99 100 101 101 102 102 102 103 103 104 Capitolo 7 BIOTECNOLOGIE IN CAMPO AGRARIO, ZOOTECNICO E SANITARIO 7.1 7.2 7.3 7.4 Biotecnologie in campo agrario Tecniche di trasformazione Sistemi diretti Sistemi indiretti Identificazione delle cellule trasformate Piante transgeniche Piante transgeniche che fissano l’azoto atmosferico Piante transgeniche resistenti agli insetti Piante transgeniche resistenti al gelo XIV Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 106 107 107 108 108 109 109 109 109 SOMMARIO 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 7.10 7.11 7.12 7.13 La micropropagazione Aspetti legislativi Biotecnologie nel settore veterinario e zootecnico Il sessaggio del seme in zootecnia La tracciabilità genetica Applicazione delle biotecnologie in campo biomedico e farmacologico Prodotti farmaceutici e diagnostici Principi attivi per uso farmaceutico da piante superiori La terapia genica Vettori di geni Vettori retrovirali 110 111 111 112 113 9.3 9.4 113 113 115 115 116 116 Conservazione con mezzi chimici Salagione, zuccheraggio Conservazione con aceto o con olio Conservazione con alcol Conservazione mediante fermentazione Impiego di additivi e conservanti Conservanti ad azione antimicrobica Conservanti secondari Antiossidanti Addensanti Emulsionanti Esaltatori di sapidità Coloranti Edulcoloranti Coadiuvanti tecnologici 139 139 139 139 139 140 140 141 142 142 142 142 143 143 143 Capitolo 10 Capitolo 8 CONTAMINAZIONI MICROBIOLOGICHE E CHIMICHE DEGLI ALIMENTI 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 Qualità e igiene degli alimenti 118 Contaminazione microbica degli alimenti 119 Processi di degradazione microbica 119 I microrganismi indicatori 120 I microrganismi indicatori di sicurezza 120 Microrganismi indicatori di igiene di processo 121 Microrganismi indicatori di qualità o shelf-life 121 I fattori che condizionano la microbiologia degli alimenti 123 Contaminazione chimica degli alimenti 126 Contaminazione da pesticidi 126 Impiego di ormoni anabolizzanti e antibiotici 127 Contaminazione da contenitori 127 Contaminazione da coadiuvanti tecnologici 127 Contaminazione da metalli pesanti 128 Capitolo 9 LA CONSERVAZIONE DEGLI ALIMENTI 9.1 9.2 La conservazione degli alimenti Conservazione con mezzi fisici Alte temperature Basse temperature Irradiazione Affumicatura Disidratazione/essiccamento Liofilizzazione 130 131 131 135 137 138 138 138 NORMATIVE E CONTROLLI PER LA SICUREZZA E LA QUALITÀ ALIMENTARE 10.1 10.2 10.3 10.4 10.5 Sicurezza degli alimenti: normative e certificazioni Il “pacchetto igiene” Il sistema HACCP nell’industria alimentare La shelf-life degli alimenti Il challenge test 145 146 148 149 150 Capitolo 11 MALATTIE TRASMESSE CON GLI ALIMENTI 11.1 11.2 11.3 11.4 11.5 11.6 11.7 11.8 11.9 11.10 11.11 11.12 11.13 11.14 11.15 Infezioni, intossicazioni, tossinfezioni 152 Intossicazione da stafilococchi patogeni 153 Tossinfezione da Escherichia coli 154 Shigellosi 154 Salmonellosi 155 Tifo e paratifo 156 Tossinfezione da Yersinia enterocolitica 156 Intossicazione da Clostridium botulinum 156 Tossinfezione da Clostridium perfringens 157 Infezione da Bacillus cereus e altri bacilli 157 Infezione da Vibrio parahaemolyticus 158 Colera 158 Listeriosi 158 Brucellosi 159 Tossinfezione da Campylobacter 159 XV Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario SOMMARIO 11.16 Micotossicosi 11.17 Epatite infettiva (epatite A) 11.18 Infezione da Entamoeba histolytica 159 160 160 13.4 13.5 Capitolo 12 CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI 12.1 12.2 12.3 12.4 12.5 12.6 12.7 12.8 12.9 12.10 12.11 12.12 12.13 12.14 12.15 Tecniche analitiche tradizionali e innovative 162 Criteri microbiologici 164 I piani di campionamento 164 Microrganismi indicatori 165 Le frodi alimentari 165 Le carni 166 Carni fresche e refrigerate 166 Carni congelate 168 Carne di pollo 169 Carni salate 170 Conserve e semiconserve in recipienti a chiusura ermetica (prodotti in scatola) 171 Carni in scatola 172 I salumi 172 Salumi non insaccati 174 Latte e derivati 174 Il latte 174 Aspetti microbiologici 175 La crema o panna di latte 177 Il burro 177 I formaggi 178 Yogurt e latti fermentati 179 Yogurt 179 Latti fermentati probiotici 182 Kefir 183 I gelati 184 Uova e derivati 184 Prodotti d’uovo 185 Prodotti della pesca 185 Miele 186 Paste alimentari 188 13.6 13.7 Capitolo 14 LE CELLULE STAMINALI 14.1 14.2 14.3 14.4 14.5 14.6 14.7 14.8 15.1 15.2 15.3 15.4 15.5 13.3 190 194 194 196 202 204 205 207 207 209 209 210 INQUINANTI XENOBIOTICI E MUTAGENESI AMBIENTALE SPERIMENTAZIONE DI NUOVI FARMACI, COMPOSTI GUIDA E FARMACOVIGILANZA Alcune definizioni Come nasce un farmaco Il percorso di un farmaco La fase di ricerca preclinica (fase 0) Le prime fasi di sviluppo dell’embrione: il differenziamento cellulare Le cellule staminali Cellule staminali emopoietiche Cellule staminali emopoietiche dal sangue del cordone ombelicale Trapianti di cellule staminali emopoietiche (TCSE) Patologie in cui è ritenuto valido l’impiego di cellule staminali Recenti acquisizioni: staminali pluripotenti indotte (iPS) Riprogrammazione cellulare tramite REAC Capitolo 15 Capitolo 13 13.1 13.2 La sperimentazione clinica (clinical trials) 196 Le tre fasi dei clinical trials 197 Lo studio preliminare (fase I) 197 Lo studio terapeutico pilota (fase II) 198 Lo studio terapeutico su larga scala (fase III)198 La registrazione del farmaco e l’immissione in commercio 199 Farmacovigilanza 199 Genotossicità e cancerogenesi Le mutazioni: alcune nozioni indispensabili Mutageni fisici Radiazioni Fonti di radiazioni Radiazioni ionizzanti Radiazioni non ionizzanti Danni biologici delle radiazioni Mutageni chimici Mutageni diretti Promutageni Mutageni indiretti Fonti di esposizione a sostanze chimiche Ambiente esterno Esposizione professionale Ambiente confinato Alimentazione XVI Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 212 213 214 214 214 215 216 216 217 217 217 218 218 218 219 219 219 SOMMARIO Meccanismi di riparazione del DNA 15.7 Destino degli xenobiotici nell’organismo 15.8 Metabolismo degli xenobiotici Reazioni di fase I Reazioni di fase II 15.9 Tossicogenetica e polimorfismi metabolici 15.10 Esempi di attivazione metabolica Metabolismo del benzene Metabolismo degli IPA Metabolismo delle ammine aromatiche 15.11 Controlli di genotossicità su matrici ambientali Aria Acqua Suolo Classificazione degli agenti mutageni 234 Linee guida comunitarie per la valutazione degli effetti mutageni 235 Classificazione delle sostanze cancerogene 235 15.6 220 220 222 222 223 223 224 224 225 226 226 226 227 228 Capitolo 16 ESPOSIZIONE PROFESSIONALE E VALUTAZIONE DEL DANNO DA XENOBIOTICI 16.1 16.2 16.3 Esposizione professionale e biomarcatori Biomarcatori Biomarcatori di esposizione Biomarcatori di effetto biologico Biomarcatori di suscettibilità Aspetti normativi e linee guida comunitarie 231 232 232 233 234 234 Capitolo 17 BIODEGRADAZIONE DEI COMPOSTI ORGANICI NATURALI E DI SINTESI 17.1 17.2 17.3 Biodegradabilità e fattori condizionanti 237 Biodegradazione dei derivati del petrolio 239 Biodegradazione aerobica degli idrocarburi 240 17.4 Biodegradazione aerobica dello xilene 241 17.5 Biodegradazione degli idrocarburi policiclici aromatici (IPA) 241 17.6 Biodegradazione anaerobica degli idrocarburi 241 17.7 Biodegradazione degli xenobiotici 242 17.8 Biodegradazione dei composti organici alogenati 244 17.9 Biodegradazione dei PCB 244 17.10 Aspetti genetici del metabolismo biodegradativo 244 Bibliografia 246 Indice analitico 247 XVII Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario BIOTECNOLOGIE DI CONTROLLO SANITARIO Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 1 METABOLISMO ED ENERGIA 1.1 Energia dal metabolismo 1.2 Strategie metaboliche per la produzione di energia 1.3 Le fermentazioni Tutti gli esseri viventi utilizzano sistemi per convertire l’energia disponibile nell’ambiente (luminosa per i fototrofi, chimica per i chemiotriofi) in energia utile per le cellule. I meccanismi di trasformazione consistono in reazioni redox in cui elettroni vengono trasferiti da un donatore iniziale a un accettore finale. Il donatore di elettroni è un substrato nutritivo per i chemiotrofi o una molecola d’acqua (in seguito alla sua fotolisi) per i fotoautotrofi; l’accettore finale può essere l’ossigeno o un altro composto ossidato. Generalmente le reazioni di ossidoriduzione dei substrati energetici nei chemiotrofi comportano la mobilizzazione di atomi di idrogeno (elettroni e ioni idrogeno) che sono trasferiti ai coenzimi NAD+ e NADP+, generando “potere riducente” cellulare sotto forma di NADH e NAPH. Questo verrà utilizzato con modalità diverse per la sintesi di ATP, la molecola che rappresenta la fondamentale riserva energetica della cellula. 1.1 Energia dal metabolismo Fermentazione del mosto (Shutterstock Images, LLC). Il metabolismo cellulare risponde in primo luogo all’esigenza fondamentale di produrre energia. I processi metabolici nel loro insieme si compongono di trasformazioni cataboliche da cui le cellule ricavano energia e di reazioni anaboliche che la riutilizzano (figure 1.1-1.2). Il catabolismo infatti comprende reazioni di demolizione di molecole nutritive complesse (tipicamente carboidrati, ma non solo) fino a composti semplici: durante alcune di queste reazioni viene liberata una certa quantità di energia (reazioni esoer- 2 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario METABOLISMO ED ENERGIA 1 Aminoacidi Energia A n a bolis Glucosio mo Proteine C at a boli s m o Rifiuti (CO2, H2O) Figura 1.1 Energia e metabolismo. L’energia funge da anello di congiunzione tra catabolismo e anabolismo. goniche) che la cellula deposita, sotto forma di energia di legame, in composti di “riserva energetica” quali l’ATP (adenosintrifosfato) o altri nucleotidi fosfati (UTP, CTP, GTP) (figura 1.3). L’energia immagazzinata in queste molecole viene resa disponibile per rispondere alle diverse richieste cellulari, inerenti sia alla costruzione di molecole complesse per la crescita (processi endoergonici dell’anabolismo) che a tutte le altre molteplici esigenze vitali. Ciò si realizza con la rottura dei legami ad alta energia fra il gruppo fosfato e la parte restante della molecola: si formano così i nucleotidi difosfati (adenosindifosfato) e monofosfati (adenosinmonofosfato): ATP ADP + P + E ADP AMP + P + E È evidente che le riserve di energia si esaurirebbero se non venissero continuamente ricostituite attraverso un processo di fosforilazione che forma nuovamente ATP associando nuovo fosfato inorganico all’ADP (più raramente partendo da AMP) (figura 1.4). Per la formazione di ogni nuovo legame altamente energetico è richiesta naturalmente una quota di energia pari a quella fornita dalla sua rottura. La fosforilazione può avvenire in seguito a: r reazioni di ossidazione di composti organici (fosforilazione ossidativa) r trasferimento diretto sull’ADP di un fosfato ad alta energia proveniente da altri composti fosforilati (fosforilazione a livello del substrato come nella glicolisi) r fotofosforilazione come nella fotosintesi. La demolizione di ogni legame ad alta energia porta alla liberazione di 30,56 kJ/mole (7,3 kcal); l’idrolisi dell’AMP libera un minor quantitativo di energia (14,24 kJ/mole). Fase catabolica E n e rg i a Fase anabolica Figura 1.2 La fase catabolica produce energia che viene consumata nella fase anabolica. Figura 1.3 Accoppiamento energetico. L’energia prodotta dalle reazioni esoergoniche all’interno della cellula viene utilizzata per la sintesi di ATP a partire da ADP e fosfato; l’idrolisi dell’ATP ad ADP e fosfato produce a sua volta energia utilizzata per le reazioni endoergoniche. 3 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 1 METABOLISMO ED ENERGIA Adenina H H CARBONIO COME FONTE DI ENERGIA N N N H N N –O O– O– O– P~O P~O P O O O CH2 Ribosio O O OH OH Adenosina AMP = Adenosina monofosfato ADP = Adenosina difosfato ATP = Adenosina trifosfato Figura 1.4 Struttura dell’ATP. L’ATP, come l’ADP, è una molecola ad alta energia. L’idrolisi dei legami P—O è, infatti, una reazione altamente esoergonica, mentre l’idrolisi dell’ADP libera una minor quantità di energia dovuta alla rottura di un legame estere e non anidride fra il gruppo fosforico e il ribosio. Gli organismi fototrofi infatti ricavano energia per la formazione di ATP dalla luce solare attraverso la fotosintesi, quelli chemiotrofi la ottengono dall’ossidazione di composti chimici. Gli organismi che non possono utilizzare l’energia luminosa come fanno gli autotrofi, la ricavano dalla demolizione dei substrati nutritivi. Questo processo avviene per progressiva rimozione di elettroni (ossidazione o deidrogenazione) da composti ridotti organici o inorganici. È interessante notare come questa energia non sia resa disponibile immediatamente al momento in cui queste reazioni si verificano, ma solo in un secondo tempo e con un processo graduale. Elettroni e idrogeno rimossi dai substrati vengono infatti temporaneamente “caricati” su coenzimi trasportatori ossidati (NAD+, NADP+, FAD+) che in questo modo passano nella loro forma ridotta (NADH, NADPH, FADH). L’energia verrà liberata solo quando i coenzimi ridotti verranno riossidati dagli accettori finali di elettroni e idrogeno. La riduzione del NAD+ comporta l’acquisto di due elettroni e un solo protone: il secondo protone rimane Tenendo conto anche della sorgente di carbonio, si possono tracciare schematicamente le seguenti distinzioni fra gli organismi viventi: r fotoautotrofi o fotolitotrofi: luce solare come sorgente di energia; CO2 come fonte di carbonio (piante, cianobatteri, batteri solfurei rossi e verdi) r fotoeterotrofi o fotorganotrofi: luce solare come sorgente di energia e carbonio organico come fonte di questo elemento (batteri rossi non solfurei) r chemioautotrofi o chemiolitotrofi: ossidazione di sostanze inorganiche come sorgente di energia e CO2 come fonte di carbonio (batteri nitrificanti, solfobatteri incolori, ferrobatteri, idrogenobatteri) r chemioeterotrofi o chemiorganotrofi: ossidazione di sostanze organiche come sorgente di energia e fonte di carbonio (la maggior parte degli organismi: protozoi, batteri, funghi, animali. Fra i microrganismi, il batterio Beggiatoa ossida sostanze inorganiche). infatti in soluzione. La forma ridotta del NAD viene solitamente indicata come NADH, ma in realtà la si dovrebbe indicare come NADH + H+. 1.2 Strategie metaboliche per la produzione di energia Gli organismi viventi possono disporre di tre tipi di strategie metaboliche per ricavare energia: r respirazione aerobia r respirazione anaerobia r fermentazione. La respirazione aerobia è la strategia più redditizia in termini di energia: il substrato nutritivo organico viene completamente ossidato prima nella glicolisi, quindi nel ciclo di Krebs; gli elettroni e l’idrogeno, trasportati da coenzimi trasportatori (NAD, FAD, citocromi) lungo la catena respiratoria mitocondriale in un’ordinata successione di ossidoriduzioni, arrivano all’ossigeno che ne rappresenta l’accettore finale riducendosi ad acqua (figura 1.5). In tre di questi passaggi si libera energia sufficiente alla produzione di ATP. I prodotti sono quin- 4 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 1 METABOLISMO ED ENERGIA Spazio intermembrana H+ H+ H+ H+ 2e– Cyt c1 FeS FeS Cyt bL Cyt b560 FeS 2e– FeS H Cyt a Cu Q 2e– NADH + H+ Cyt c + NAD+ Cyt bH H FADH2 + Cyt a3 F0 Cu 2e– 1/2 O2 + 2H+ H+ H2O FAD F1 Matrice mitocondriale ADP + Pi H+ ATP Figura 1.5 Catena di trasporto degli elettroni nei mitocondri. Sono visualizzati i quattro complessi enzimatici e l’ATP sintetasi. I complessi I e II ricevono gli elettroni dal NADH e dal FADH2 e li inviano all’O2. I complessi I, III e IV pompano i protoni nello spazio intermembrana. L’energia associata al riflusso dei protoni nella matrice, attraverso l’ATP sintetasi, è utilizzata per la sintesi dell’ATP. di anidride carbonica, acqua e una considerevole quota di ATP. L’equazione complessiva può essere schematizzata nel modo seguente: C6H12O6 + 6O2 6H2O + 6 CO2 + energia (686 kcal/mole = 2870,224 kJ/mole) 1 caloria = 4,184 joule Il bilancio energetico complessivo tiene conto, per ogni molecola di glucosio respirato: r della produzione netta di 2 ATP nella glicolisi r di 2 ATP prodotti nel ciclo di Krebs (da una molecola di glucosio se ne ottengono 2 di acido piruvico) r della riossidazione dei coenzimi ridotti (NADH e FADH2) nella catena respiratoria (3 ATP per ogni NADH e 2 ATP per ogni FADH2). Si ha quindi, a un guadagno netto di 38 ATP per mole di glucosio. Nelle cellule eucariotiche la glicolisi ha luogo nel citoplasma, le reazioni del ciclo di Krebs e della catena respiratoria nei mitocondri, mentre nei batteri queste reazioni si svolgono nel citoplasma e nei mesosomi, particolari organuli o annessi della membrana cellulare dove si trovano gli enzimi di catene respiratorie particolari. La respirazione anaerobia non prevede l’ossigeno molecolare come accettore finale degli elettroni e dell’idrogeno provenienti dall’ossidazione dei substrati nutritivi organici o inorganici. Il ruolo di accettore è svolto in questo caso da composti inorganici quali, per esempio, il nitrato, il solfato, lo zolfo elementare, la CO2. C6H12O6 + 12NO3– 6H2O + 6CO2 + 12NO2– + energia (2058,528 kJ/mole) La respirazione anaerobia viene effettuata da batteri sia aerobi/anaerobi facoltativi che anaerobi. Nel caso dei batteri anaerobi facoltativi (Campylobacter, Alcaligenes, Thiobacillus ecc.) il metabolismo viene indirizzato verso la respirazione anaerobia quando nel mezzo sia presente un composto ossidante diverso dall’ossigeno che promuove la produzione di specifici enzimi o quando l’ossigeno sia stato consumato completamente da processi aerobi. Per i batteri anaerobi un esempio è rappresentato dai batteri metanogeni (Methanosarcina, Methanococcus, Methanobacterium); l’accettore di idrogeno ed elettroni è in questo caso la CO2 che viene ridotta a metano dall’idrogeno molecolare: 4H2 + CO2 CH4 + 2H2O 5 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 1 METABOLISMO ED ENERGIA 1.3 Le fermentazioni Il significato del termine fermentazione, in relazione all’ambito in cui è usato, può essere inteso con sfumature diverse: r in ambito tradizionale le fermentazioni comprendono processi chimici che avvengono naturalmente e sono accompagnati da sviluppo di effervescenza (l’etimologia del termine rimanda al latino fervere, cioè bollire), come avviene, per esempio, nella fermentazione del mosto o in conserve alimentari avariate, in cui si nota sviluppo di gas r in microbiologia industriale le fermentazioni indicano processi che utilizzano, in aerobiosi o in anaerobiosi, ceppi selezionati di microrganismi e che portano a ottenere prodotti utili in condizioni controllate, dagli alimenti (prodotti da forno, yogurt e latti fermentati, lievito alimentare) alle bevande (vino, birra), a composti chimici particolari (etanolo, acido citrico), ai farmaci (antibiotici, ormoni). È opportuno tenere presente che tutte le fermentazioni industriali (quindi anche quelle tipicamente anaerobie) richiedono almeno in una prima fase la presenza di ossigeno, indispensabile per l’aumento della biomassa, cioè per consentire una veloce riproduzione dei microrganismi e quindi, in ultima analisi, aumentare la resa del processo r dal punto di vista biochimico/metabolico le fermentazioni sono processi biotecnologici in cui intervengono successioni ordinate di reazioni chimiche di degradazione operate da microrganismi, che le utilizzano per la produzione dell’energia necessaria alla loro sopravvivenza, trasformando le sostanze di cui si nutrono in prodotti più semplici. Si tratta di processi anaerobi di demolizione parziale di carboidrati o altri composti organici (aminoacidi, basi azotate) senza intervento di catene di trasporto di elettroni né di ossigeno, che utilizzano sostanze organiche provenienti dalla demolizione dei substrati nutritivi come accettori finali di elettroni. Dal punto di vista microbico l’obiettivo fondamentale della fermentazione è la produzione di energia per la formazione di ATP ancorché in quantità estremamente ridotta rispetto alla resa energetica del metabolismo respiratorio. Glucosio Fruttosio-1,6-difosfato 2-Gliceraldeide-3-fosfato 2-Acido piruvico Vie fermentative Figura 1.6 Schema riassuntivo delle reazioni della glicolisi. Il prodotto delle fermentazioni è un composto organico con un contenuto di energia non molto inferiore a quello del composto che viene utilizzato come substrato da demolire: la resa energetica delle fermentazioni è quindi molto più bassa rispetto a quella del metabolismo respiratorio aerobio. C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 + energia (225,936 kJ/mole) Dalla fermentazione di una molecola di glucosio si ottengono infatti 2 ATP, contro i 38 ATP prodotti nella respirazione aerobia. La via metabolica fermentativa più comune è la glicolisi o via EMP (Embden-Meyerhof-Parnas) che dal glucosio (esoso, C6) porta alla formazione di due molecole di acido piruvico (trioso, C3) secondo lo schema riassuntivo di figura 1.6. Il composto iniziale viene progressivamente demolito attraverso reazioni di ossidazione in cui la rimozione di elettroni e idrogeno dal substrato nutritivo si accompagna alla riduzione dei coenzimi trasportatori (NAD, FAD). Su questi coenzimi si accumula quindi potere riducente, che si annulla quando gli stessi vengono riossidati, cedendo idrogeno ed elettroni a un composto accettore finale. È proprio la natura di questo accettore finale a rappresentare la discriminante sostanziale fra fermentazione e respirazione: r nel metabolismo respiratorio l’accettore finale di idrogeno ed elettroni è una molecola inorganica: 6 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario METABOLISMO ED ENERGIA O O– O O– C C C O + NADH + H+ HO C H + NAD+ Lattato deidrogenasi CH3 Piruvato CH3 Lattato C6H12O6 + 2Pi + 2ADP 2CH3CHOHCOOH + 2ATP Glucosio Acido lattico Figura 1.7 Fermentazione omolattica. In figura è rappresentata la sequenza terminale delle reazioni della fermentazione omolattica con la reazione generale. l’ossigeno in quella aerobia; nitrato o solfato o zolfo elementare o CO2 in quella anaerobia r nelle fermentazioni l’accettore finale è un composto organico derivato dalla demolizione del glucosio: l’acido piruvico o un suo derivato. L’esempio tipico è offerto dalla fermentazione lattica, in cui l’acido piruvico viene direttamente ridotto ad acido lattico (figura 1.7). L’acido piruvico rappresenta il substrato comune da cui derivano i prodotti che danno il nome alle rispettive fermentazioni (figura 1.8): 1 r alcolica, tipica di lieviti e alcuni batteri; produce alcol etilico e CO2 r omolattica, tipica dei batteri lattici; produce acido lattico r eterolattica, produce acido lattico insieme con altre sostanze (CO2, etanolo), tipica di alcuni batteri lattici (Leuconostoc, alcune specie di Lactobacillus) r propionica, tipica dei propionobatteri, con produzione di acido propionico, acido acetico e CO2 r acido-mista, tipica di enterobatteri e vibrioni; produce acido acetico, succinico, lattico, formico, etanolo, CO2, H2 r butandiolica, tipica di Enterobacter, Serratia, Erwinia e sviluppa, oltre ai prodotti tipici della fermentazione acido-mista, acetoina, acido 2,3-butandiolo e CO2 r butirrica, tipica dei clostridi, sviluppa acido butirrico, alcol isopropilico, acido acetico, acetone, alcol butilico, CO2, H2. Il ruolo dell’acido piruvico come intermedio centrale del metabolismo è importante non solo nelle fermentazioni: la glicolisi non è che la prima fase della degradazione aerobia del glucosio (che si completa con il ciclo degli acidi tricarbossilici o di Krebs e con la catena respi- Acido lattico Acido acetico Acido piruvico Alcol etilico Acetil coezima A Figura 1.8 L’acido piruvico è un substrato comune di una serie di fermentazioni. 7 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 1 METABOLISMO ED ENERGIA ratoria) in cui l’acido piruvico viene decarbossilato per entrare nel ciclo di Krebs come acetil-CoA. Glucosio ATP ADP Glucosio-6-fosfato Altre vie metaboliche fermentative sono: r via dei pentoso-fosfati o shunt dell’esomonofosfato: costituisce per il glucosio-6P una via alternativa a quella glicolitica. Viene utilizzata per la demolizione del glucosio in anaerobiosi da alcuni batteri lattici (Leuconostoc, alcune specie di Lactobacillus) e porta alla formazione di acido lattico, etanolo e CO2 (fermentazione eterolattica). Si tratta di una via costantemente operante nei batteri accanto a quella glicolitica, in quanto è l’unica che porta a ribulosio5C e eritrosio-4C, importanti per la sintesi di acidi nucleici e di aminoacidi r via di Entner-Doudoroff: utilizzata da batteri privi dell’enzima fosfofruttochinasi per la sintesi di fruttosio 1,6-difosfato. Porta allo sviluppo di acido piruvico e CO2 (Pseudomonas, Rhizobium) attraverso intermedi come il chetodeossifosfogluconato. Zymomonas utilizza questa via fermentativa per la produzione di etanolo (figura 1.9) r via dell’esosofosfato: produce acido acetico e acido lattico (bifidobatteri intestinali). + NADP Comune al ciclo dei pentafosfati NADPH 6-Fosfogluconato Enolasi H 2O 2-Cheto-3-deossi-6-fosfogluconato (KDPG) Aldolasi Piruvato Gliceraldeide-3-fosfato (3PGA) NAD + NADH Pi 1,3-Difosfoglicerato ADP ATP 3-Fosfoglicerato 2-Fosfoglicerato H 2O Fosfoenolpiruvato ADP ATP Piruvato Figura 1.9 Via di Entner-Doudoroff. 8 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario Comune alla glicolisi ESERCIZI DI VERIFICA 1. Rispondi alle seguenti domande: Che cosa si intende per metabolismo? Quali sono le reazioni metaboliche che consumano energia? Quali sono le strategie adottate dagli esseri viventi per ottenere energia? Quali sono le differenze sostanziali fra respirazione e fermentazione? In che cosa consiste la glicolisi? 2. Le reazioni di sintesi consistono nella trasformazione di: A composti semplici in altri a struttura più complessa B sostanze complesse in altre più semplici C sostanze inorganiche al fine di ottenere energia 3. La resa energetica delle fermentazioni risulta: A paragonabile a quella dei processi respiratori B molto inferiore a quella dei processi respiratori C superiore a quella dei processi respiratori 4. Con il termine di fosforilazione si intende: A il trasferimento di un gruppo fosforico sull’ATP B l’allontanamento di un gruppo fosforico dall’ATP C il trasferimento di un gruppo fosforico sull’AMP o sull’ADP 5. La fosforilazione è un processo: A endoergonico B esoergonico C che avviene spontaneamente nella respirazione ma non nei processi fermentativi 6. La glicolisi è un processo: A caratteristico della fermentazione B comune a fermentazione e respirazione C che avviene solo nella respirazione del glucosio 7. La resa energetica della glicolisi risulta di: A 36 molecole di ATP B 2 molecole di ATP C 4 molecole di ATP 8. Nella fermentazione, la produzione di ATP si ha: A nella glicolisi B nel ciclo di Krebs C nella fosforilazione ossidativa 9. Negli aerobi la massima parte dell’ATP si produce: A nella glicolisi B nella catena di trasporto degli elettroni (catena respiratoria) C nel ciclo di Krebs 10. Un substrato può essere definito come: A il prodotto finale di una reazione metabolica B una sostanza organica che i microrganismi trasformano C il prodotto che si vuole ottenere dalle attività metaboliche dei batteri modificati geneticamente 11. La catena respiratoria è: A una sequenza di reazioni di ossidoriduzione B l’insieme dei processi di ossidazione del glucosio C un sistema di ancoraggio dei batteri al substrato 9 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 2 BIOTECNOLOGIE MICROBICHE 2.1 Biotecnologie tradizionali e innovative 2.2 Le biotecnologie microbiche 2.3 Biocatalizzatori molecolari: gli enzimi 2.4 Cinetica e attività enzimatica 2.5 Fattori che influenzano la velocità di reazione L’attività fermentativa dei microrganismi è stata inconsapevolmente sfruttata dall’uomo fin dalle epoche più antiche per ottenere prodotti utili (alimenti), gratificanti (bevande alcoliche) o per curare malattie e infezioni (muffe o estratti di muffe). La fermentazione del succo d’uva, la preparazione di bevande molto simili alla birra, i formaggi, i tanti tipi di yogurt ottenuti dal latte fermentato, il pane prodotto dalla lievitazione di impasti di acqua e farina sono altrettanti esempi di processi tramandati empiricamente di generazione in generazione per migliaia di anni. 2.6 Inibizione enzimatica 2.7 Regolazione della sintesi degli enzimi 2.8 Biocatalizzatori cellulari: i microrganismi 2.9 Le tecniche di selezione dei ceppi microbici 2.10 Strategie di screening 2.11 Selezione dei ceppi alto-produttori 2.1 Biotecnologie tradizionali e innovative Il termine biotecnologie microbiche si riferisce ai processi in cui le materie prime vengono trasformate in prodotti utili a opera di microrganismi o enzimi. Nel XIX secolo gli studi compiuti da L. Pasteur sulla fermentazione alcolica e lattica e la scoperta del ruolo dei microrganismi in questi processi hanno segnato il passaggio da un ambito esclusivamente empirico a tecniche basate su presupposti scientifici, dando inizio alla microbiologia industriale. Da allora la microbiologia applicata ha avuto sviluppi straordinari, dalla scoperta degli antibiotici (A. Fleming, 1929) alla produzione di metaboliti microbici come vitamine, aminoacidi, enzimi, ormoni steroidi. In anni più recenti, a partire dagli ultimi decenni del 1900, le tecniche del DNA ricombinante e dell’ingegneria genetica hanno dato ai ricercatori la possibilità di inserire geni estranei nei microrganismi, trasformandoli in produttori specializzati di molecole di importanza spes- 10 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario BIOTECNOLOGIE MICROBICHE so strategica. Le applicazioni delle biotecnologie microbiche offrono oggi un ampio ventaglio di possibilità. In campo alimentare vengono impiegate per ottenere prodotti di qualità costante controllando o modificando le trasformazioni degli alimenti; in ambito ecologico intervengono nella depurazione delle acque reflue, nel compostaggio dei rifiuti, nei processi di disinquinamento e biorisanamento; in campo medico la produzione di antibiotici, ormoni (insulina, eritropoietina, HGH), vitamine, anticorpi monoclonali, vaccini, interferone sono solo alcuni esempi dei loro possibili impieghi; nel settore della chimica si utilizzano per la produzione mirata di nuove molecole non inquinanti come i biopolimeri o per nuove forme di energia quali il bietanolo e il biodiesel. Anche se ogni distinzione pone limiti e confini che spesso non trovano giustificazione, sembra opportuno indicare come biotecnologie innovative quelle basate sulle tecniche del DNA ricombinante e dell’ingegneria genetica, per distinguerle dalle biotecnologie tradizionali di più antica origine. 2.2 Biotecnologie microbiche A prescindere dalle diverse vie metaboliche e dalla varietà dei microrganismi interessati, le biotecnologie microbiche hanno come protagonisti fondamentali: r gli enzimi, molecole ad attività catalitica prodotte dalle cellule, che permettono lo svolgersi ordinato delle reazioni metaboliche rendendole energeticamente possibili r le cellule microbiche, al cui interno gli enzimi operano, che possiedono le informazioni genetiche per la loro sintesi e ne regolano l’attività. I microrganismi possono quindi essere considerati veri e propri “laboratori” in cui vengono prodotte o trasformate molecole di elevato interesse in campo biomedico, alimentare, industriale, agrario, zootecnico, ecologico-ambientale. In molti casi gli enzimi possono essere estratti dalle cellule che li producono e utilizzati come tali in diversi processi produttivi, il più delle volte dopo averli “immobilizzati” su supporti artificiali per migliorarne efficienza catalitica e produttività r i prodotti metabolici cellulari (metaboliti). Dal punto di vista biochimico è possibile distinguere reazioni omofermentative, che danno origine a un unico prodotto finale, ed eterofermentative, che danno 2 origine a più prodotti. Le tecnologie disponibili per l’utilizzo industriale di microrganismi consentono di ottenere un’ampia gamma di prodotti: accanto ai prodotti delle fermentazioni tradizionali ottenuti dall’attività microbica degradativa dei substrati nutritivi si sono sviluppate in tempi molto più recenti tecnologie che sfruttano non le vie cataboliche dei microrganismi, ma piuttosto alcune loro vie anaboliche per la sintesi di acidi organici, antibiotici, ormoni, anticorpi. 2.3 Biocatalizzatori molecolari: gli enzimi In microbiologia industriale vengono spesso indicati con il termine unico di biocatalizzatori sia i microrganismi (biocatalizzatori cellulari) che gli enzimi (biocatalizzatori molecolari) (figura 2.1). Gli enzimi costituiscono un esempio fra i più importanti della versatilità funzionale delle proteine. Prodotti dalla cellula come una delle espressioni dell’informazione genetica (biosintesi proteica), gli enzimi regolano praticamente ogni passaggio delle molteplici sequenze ordinate di reazioni che costituiscono il metabolismo cellulare. Composizione Gli enzimi sono proteine ad attività catalitica, grazie alle quali le reazioni biochimiche avvengono in tempi Figura 2.1 Struttura tridimensionale di un enzima di E. coli. L’enzima glutammato-cisteina ligasi di E. coli è costituito da un tetramero. 11 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 2 BIOTECNOLOGIE MICROBICHE Enzima Enzima Catalisi Molecola A (substrato) Complesso enzima-substrato Complesso enzima-substrato Molecola B (prodotto) Figura 2.3 Rappresentazione modello dell’attività enzimatica. Meccanismo d’azione degli enzimi L’attività catalitica degli enzimi è basata sulla creazione di un complesso intermedio enzima-substrato (ES). Gli schemi assai semplificati che mettono in confronto due reazioni, una non catalizzata (a) e un’altra catalizzata dall’intervento di un enzima (b), possono essere indicati come segue: S (Substrato) P (Prodotto) a) reazione non catalizzata S+E ES P+E b) reazione catalizzata da enzima, dove S è il substrato da trasformare, E è l’enzima, P il prodotto di reazione ed ES il complesso intermedio (figura 2.3). Gli enzimi abbassano l’energia di attivazione giungendo allo stesso risultato della reazione non catalizzata ma percorrendo una via diversa, costituita da una serie di intermedi e più facile sotto il profilo energetico (figura 2.4). Specificità degli enzimi La caratteristica fondamentale degli enzimi è la loro elevata specificità, cioè la capacità di reagire solo su di un substrato o su un ristretto numero di substrati assai simili tra di loro. Essi risultano inoltre altamente specifici per un solo tipo di reazione e sono inattivi su altre reazioni che coinvolgono gli stessi substrati. La specificità è da attribuire anche al sito attivo, cioè quella parte della molecola enzimatica con cui interagisce il substrato. Il sito attivo ha una conformazione tridimensionale specifica tale che il substrato vi si può inserire con un meccanismo di chiave-serratura: in questo modo, per esempio, un enzima agisce solo sull’isomero d di un composto, ma non su quello l. Energia potenziale Sito attivo Energia di attivazione senza catalizzatore Energia di attivazione con catalizzatore Reagenti Prodotti Coordinata di reazione Figura 2.4 Enzimi e reazioni. Gli enzimi agiscono abbassando l’energia richiesta perché una reazione avvenga. Teorie diverse spiegano il meccanismo dell’attività enzimatica ipotizzando una sorta di adattamento indotto, in cui il sito attivo subisce una parziale modificazione assumendo una forma complementare a quella del substrato (figura 2.5). Coenzimi e cofattori Molti enzimi richiedono per la loro attività catalitica l’intervento di frazioni non proteiche, indicate come coenzimi oppure (se si tratta di ioni metallici) come cofattori o attivatori. I coenzimi funzionano come trasportatori di particolari gruppi chimici funzionali che l’enzima vero e proprio rimuove da uno specifico substrato. Molti coenzimi rappresentano la forma attiva di altrettante vitamine. Per esempio, il coenzima NAD+ Substrato a + a c b c b Complesso ES Enzima Figura 2.5 Adattamento indotto. Il sito attivo dell’enzima assume una forma complementare a quella del substrato con cui viene a contatto. 13 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 2 BIOTECNOLOGIE MICROBICHE NADH + H+ O HH ziano per: r diversa distribuzione nei tessuti r diversa mobilità elettroforetica r differente affinità nei confronti del substrato. C H NH2 + H+ H H N Un esempio è fornito dai 5 isoenzimi della lattico deidrogenasi (LDH) caratterizzati dalla diversa combinazione di 4 subunità di due tipi diversi (M e H). L’aumento della concentrazione ematica di uno di questi isoenzimi è di altissimo valore diagnostico in relazione alle patologie dell’organo di provenienza (vedi scheda). R 2 H (2 H+ + 2 e–) Ossidato Ridotto NAD+ H C Nicotinamide H NH2 + N H O O H L’attività di un enzima è in funzione della sua velocità di reazione, intesa come la quantità di substrato trasformato nell’unità di tempo, in altre parole è la velocità con cui il substrato viene trasformato in prodotto O HO P O CH2 Ribosio OH O N HO P O O NH2 OH O CH2 Ribosio OH N H N 2.4 Cinetica e attività enzimatica N E S H Adenina OH Figura 2.6 NADH e NAD+. (nicotinamide adenindinucleotide, forma attiva della vitamina PP) è un coenzima trasportatore di idrogeno associato a molte deidrogenasi: il coenzima accetta idrogeno per poi cederlo a un accettore, passando alternativamente dalla forma ossidata a quella ridotta e viceversa (figura 2.6). Il piridossalfosfato (forma attiva della vitamina B6) partecipa a importantissime reazioni di trasferimento di gruppi amminici nel metabolismo degli aminoacidi, in associazione con gli enzimi transaminasi glutammico ossalacetica (GOT o AST) e glutammico piruvica (GPT o ALT) che agiscono soprattutto a livello epatico. Fra i cofattori, gli ioni calcio, magnesio, zinco, rame risultano indispensabili in numerose reazioni enzimatiche. a) b) [S] [S] [S] 2 [S] 2 t1/2 Isoenzimi Gli isoenzimi sono forme molecolari diverse di uno stesso enzima, che catalizzano la stessa reazione ma si differen- P La velocità di reazione viene misurata valutando la diminuzione della concentrazione del substrato in un tempo prestabilito, ma può essere ovviamente dedotta anche in base alla quantità di prodotto ottenuto nell’unità di tempo. L’andamento della reazione si può rappresentare ponendo in un sistema di assi cartesiani in ascissa il tempo e in ordinata la concentrazione del substrato, osservando cioè come varia la concentrazione del substrato [S] in funzione del tempo t (figura 2.7). In questa funzione (di tipo esponenziale decrescente) assume particolare rilievo il punto di dimezzamento (t1/2) corrispondente al tempo necessario al dimezzamento della concentrazione del substrato. Da dati t t1/2 7t1/2 t Figura 2.7 a) Variazione della concentrazione di substrato [S] in funzione del tempo t. b) Il valore 7t1/2 corrisponde praticamente al tempo totale di reazione; le tangenti sulla curva indicano le variazioni della velocità in funzione del tempo. 14 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario ENZIMI E DIAGNOSTICA CLINICA Gli enzimi metabolici agiscono nell’ambiente endocellulare. La loro presenza nel sangue in condizioni fisiologiche è dovuta al normale turnover cellulare per cui la concentrazione ematica degli enzimi si mantiene in un range di “valori normali”. Processi infiammatori o patologici portano all’aumento del tasso di mortalità cellulare, per cui dalle cellule in necrosi gli enzimi si riversano nel plasma in quantità superiore alla norma. Poiché ogni tessuto possiede un proprio “corredo enzimatico” caratteristico, è piuttosto semplice risalire dall’aumento della concentrazione plasmatica di uno o più enzimi all’organo danneggiato. Per esempio, l’aumento delle transaminasi GOT (AST) e GPT (ALT) è conseguenza di un danno a livello epatico; l’aumento della GOT si ha anche nel caso di infarto del miocardio. La creatina fosfochinasi (CPK) è un altro enzima che aumenta nel siero nelle prime ore successive all’infarto per tornare piuttosto rapidamente a valori normali (figura 2.8); l’aumento della fosfatasi alcalina è legato a lesioni del sistema scheletrico o all’ostruzione delle vie biliari; un aumento dell’α-amilasi a una probabile pancreatite. Quando un enzima esiste in più forme molecolari (isoenzimi), generalmente ognuna di queste, pur catalizzando la medesima reazione, presenta una concentrazione maggiore in un certo tessuto, espressione della più o meno spiccata attività e dell’affinità per determinati substrati. La determinazione della concentrazione plasmatica di uno specifico isoenzima consente di risalire all’organo da cui l’isoenzima proviene, permettendo una diagnosi clinica specifica, altrimenti problematica con il solo dosaggio dell’enzima in toto, espressione di una necrosi cellulare generica. Nel caso dell’LDH è possibile discriminare fra patologie di origine epatica e cardiaca: l’aumento degli isoenzimi LDH-1 e LDH-2 dipende da un danno specifico al tessuto cardiaco dove queste forme molecolari sono più abbondanti; si registra un aumento marcato dell’isoenzima 1, con rapporto LDH1/LDH-2 maggiore di 1. Questi isoenzimi aumentano entro 24 h dall’episodio infartuale tornando a valori normali in 5-6 giorni. L’aumento plasmatico dell’isoenzima LDH-5 è conseguente piuttosto a danno epatico o della muscolatura scheletrica. Il mezzo migliore per determinarne la concentrazione degli enzimi consiste nel misurare l’intensità della reazione da essi catalizzata. Viene quindi determinata la velocità di reazione, in Aumento dell’attività enzimatica BIOTECNOLOGIE MICROBICHE 2 CPK HBDH LDH 1 2 Dolore toracico 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Giorni dopo l’episodio Figura 2.8 Quadro enzimatico in caso di infarto del miocardio. Il grafico mostra i tempi di comparsa nel siero dei diversi enzimi liberati da cellule miocardiche infartuate. CPK = creatina fosfochinasi; LDH = lattico deidrogenasi; HBDH = isoenzima della lattico deidrogenasi. pratica la quantità di substrato consumata nell’unità di tempo. Quando infatti i parametri fondamentali di reazione (pH, temperatura, concentrazione del substrato) risultano ottimali, la velocità di reazione dipende dalla concentrazione dell’enzima. Diversamente dalle determinazioni colorimetriche “a termine”, in cui la concentrazione di una sostanza viene dedotta dall’intensità di sviluppo di un cromogeno come prodotto finale di reazione, la misura della concentrazione di un enzima viene effettuata in cinetica, valutando nel tempo l’azione dell’enzima su di uno specifico substrato. Quando uno dei reagenti presenta una specifica banda di assorbimento, se ne può valutare la variazione di estinzione per minuto (ΔE/min). È il caso dei coenzimi NAD+ e NADP+, che nella forma ridotta (NADH, NADPH) hanno un massimo di assorbimento a 340 nm, mentre nella forma ossidata alla medesima lunghezza d’onda non mostrano alcun assorbimento. L’attività delle deidrogenasi NAD-dipendenti può quindi essere determinata dal decremento di estinzione del NADH a 340 nm. Le stesse reazioni possono essere accoppiate in qualità di “sistemi indicatori” ad altre reazioni, che non hanno il NAD come coenzima, per valutare la concentrazione di prodotto della prima reazione (test ottico accoppiato). L’attività enzimatica viene determinata nei primi momenti di reazione: la velocità iniziale è infatti l’unica che mostra proporzionalità fra concentrazione di enzima e di substrato consumato. L’unità di attività enzimatica è la quantità di enzima in grado di trasformare in 1 minuto, in condizioni ottimali, una μmole di substrato a 25 o 30 °C. 15 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 2 BIOTECNOLOGIE MICROBICHE sperimentali risulta che moltiplicando per 7 tale valore si ottiene con buona approssimazione il tempo totale di reazione, che è in sostanza quello necessario a ridurre la concentrazione di substrato a livelli trascurabili (consumo completo di S). La velocità di una reazione enzimatica diminuisce con il procedere della reazione in quanto diminuisce la concentrazione del substrato; possono inoltre verificarsi fenomeni di inibizione enzimatica da parte dei prodotti di reazione o per azione di fattori ambientali diversi, quali il pH e la temperatura. Per questi motivi gli studi di cinetica enzimatica prendono solitamente in esame la velocità iniziale della reazione, in quanto è l’unica fase in cui i parametri fondamentali sono esattamente noti (concentrazione dell’enzima e del substrato, pH del mezzo ecc.). L’attività degli enzimi viene espressa in Unità Internazionali (UI): quantità di enzima in grado di idrolizzare 1 μmole di substrato in 1 minuto in condizioni standard. 2.5 Fattori che influenzano la velocità di reazione I fattori che influenzano la velocità di reazione sono soprattutto: r concentrazione dell’enzima r concentrazione del substrato r pH r temperatura r presenza di inibitori. Per poter avere dati attendibili gli studi di cinetica vengono eseguiti variando di volta in volta un singolo parametro e mantenendo costanti tutti gli altri. Concentrazione dell’enzima La velocità di una reazione enzimatica è direttamente proporzionale alla concentrazione dell’enzima (figura 2.9), in relazione alla quantità di siti attivi disponibili: V = K [E] dove K è la costante di proporzionalità. V [E] Figura 2.9 Grafico velocità-concentrazione. Il grafico mostra la variazione della velocità di reazione V in funzione della concentrazione di enzima [E]. Concentrazione del substrato Mantenendo costante la concentrazione dell’enzima e quella degli altri parametri, la velocità di reazione aumenta in modo direttamente proporzionale a quella del substrato, dapprima in modo rapido, poi sempre più lentamente fino a raggiungere una velocità massima indicata con Vmax, al di là della quale essa rimane costante e dipendente non più dalla concentrazione del substrato, ma esclusivamente da quella dell’enzima. La spiegazione di tale comportamento si basa sulla formazione del complesso intermedio Enzima-Substrato (ES) che si forma quando il substrato aderisce al sito attivo dell’enzima per essere degradato. Se la concentrazione del substrato è bassa, i siti attivi degli enzimi non sono tutti saturati, l’enzima non è in grado di esprimere per intero la propria potenzialità e la velocità di reazione risulta proporzionale alla concentrazione del substrato. Se la concentrazione del substrato continua ad aumentare, i siti attivi vengono progressivamente saturati fino a raggiungere il massimo dell’attività catalitica per quella data concentrazione di enzima. Un ulteriore aumento della quantità di substrato non ha alcun effetto: Vmax indica quindi la velocità massima di reazione per una certa concentrazione di enzima (figura 2.11a). In realtà si fa riferimento alla metà di questo valore, indicato come 1/2 Vmax: per ogni enzima esiste una particolare concentrazione di substrato a cui la velocità di reazione è pari alla metà di quella massima. Tale concentrazione di substrato viene definita costante di Michaelis-Menten indicata con Km ed esprime in pratica l’affinità di un enzima per uno specifico substrato: 16 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 2 BIOTECNOLOGIE MICROBICHE se 1/2 Vmax si raggiunge con basse concentrazioni del substrato, ciò significa che l’enzima possiede un’alta affinità per il substrato, cioè esprime in modo ottimale la propria potenzialità anche in presenza di modeste quantità di substrato; una Km elevata depone invece per un enzima che ha bisogno di un’alta concentrazione di substrato per svolgere l’azione catalitica ad alte velocità. Questa caratteristica diventa strategicamente importante in molte situazioni. Un esempio è offerto da due enzimi che catalizzano la stessa reazione di fosforilazione del glucosio a glucosio-6P (indispensabile per l’utilizzo cellulare del carboidrato) in tessuti diversi e con differenti Km: r esochinasi, presente nel cervello e nel muscolo r glucochinasi che catalizza la stessa reazione e si trova nel fegato. L’esochinasi presenta una Km molto più bassa, cioè un’affinità molto alta per il glucosio: cento volte maggiore rispetto alla glucochinasi epatica. La concentrazione normale di glucosio nel sangue è circa 45 volte più grande dell’affinità dell’esochinasi per il glucosio nel tessuto cerebrale. In pratica, questa maggiore affinità si traduce nella possibilità di utilizzare il glucosio (quindi di ricavare energia) anche se la concentrazione del carboidrato nell’organismo è relativamente bassa. In queste condizioni nelle cellule muscolari e nervose l’esochinasi è ancora saturata e lavora sempre alla velocità massima, riuscendo a sfruttare per intero le risorse energetiche disponibili e destinandole alle cellule più importanti. La glucochinasi epatica entra invece in funzione solo quando il glucosio in questa sede raggiunge livelli alti, per esempio dopo i pasti, e indirizza l’eccesso di glucosio verso la sintesi di glicogeno. In altre parole l’alta Km della glucochinasi permette a muscoli e cervello (dove agisce l’esochinasi) di utilizzare il poco glucosio disponibile (per es. nel digiuno) con un criterio di assoluta priorità (figura 2.10). Temperatura Ogni enzima presenta un proprio optimum di temperatura in corrispondenza del quale la velocità di reazione è massima. A questo valore lo stato di agitazione termica dei componenti la reazione è massima, rendendo più frequenti e probabili le interazioni molecolari e fa- Concentrazione normale di glucosio nel sangue 100 Esochinasi Km = 100 μM Glucochinasi Km = 10 mM 50 5 10 Concentrazione di glucosio, mM Figura 2.10 L’esochinasi catalizza la fosforilazione del glucosio a glucosio-6-fosfato. Il confronto fra la Km dell’esochinasi (0,1 mM) e della glucochinasi o esochinasi epatica (10 mM) mette in evidenza che l’esochinasi ha un’affinità per il glucosio 100 volte maggiore rispetto alla glucochinasi, che catalizza la stessa reazione nel fegato. A valori normali di glicemia (80-100 mg/dL) l’esochinasi è saturata e lavora costantemente alla massima velocità. vorendo la formazione del complesso enzima-substrato con l’abbassamento dell’energia di attivazione. D’altra parte gli enzimi sono proteine e in quanto tali subiscono alterazioni consistenti, fino alla loro denaturazione, se esposti a temperature troppo elevate. Temperature inferiori a quelle ottimali rallentano l’azione catalitica anche se l’enzima mantiene più a lungo la propria attività. Nella figura 2.11b si può notare come in un primo tratto della curva l’attività enzimatica aumenti progressivamente con l’aumentare della temperatura fino a un valore massimo, dopodiché l’attività decresce rapidamente per progressiva denaturazione dell’enzima fino a un valore in cui l’attività enzimatica cessa completamente in seguito a denaturazione irreversibile dell’enzima. pH Analogamente a quanto visto per la temperatura, anche per il pH del mezzo esiste un valore ottimale, sopra e sotto al quale la velocità di reazione decresce rapidamente (figura 2.11c). Ciò è attribuibile al fatto che enzima e substrato sono composti ionizzabili caratterizzati da gruppi acidi e basici, per cui esiste un preciso valore di pH in corrispondenza del quale si ha l’interazione massima possibile (la maggiore affinità) fra enzima e substrato in relazione a un particolare grado di dissociazione dei rispettivi diversi gruppi funzionali. È mol17 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 2 Velocità di reazione V Vmax Vmax 2 a) Km Concentrazione del substrato [S] Denaturazione Velocità di reazione BIOTECNOLOGIE MICROBICHE pH Temperatura b) pH ottimale c) Figura 2.11 Fattori che agiscono sull’attività degli enzimi. to interessante notare, a conferma di quanto detto sopra, che generalmente il pH ottimale non coincide con il punto isoelettrico (che corrisponde al valore di pH al quale la molecola ha un’eguale distribuzione di cariche negative e positive, quindi con carica netta pari a zero e un minimo grado di dissociazione). Se il pH ottimale si trova sopra o sotto al punto isoelettrico significa evidentemente che un enzima ha bisogno di avere un certo numero di gruppi funzionali ionizzati per esplicare al massimo la propria attività. Il pH assume dunque un ruolo decisivo nella regolazione dell’attività enzimatica. a) b) Enzima Inibitore non competitivo Enzima Substrato Substrato Enzima con inibitore competitivo Substrato Enzima con inibitore non competitivo Substrato Figura 2.12 Reazioni enzimatiche in presenza di un inibitore competitivo (a) e non competitivo (b). 2.6 Inibizione enzimatica Sono definiti inibitori enzimatici quelle sostanze che provocano un blocco reversibile dell’attività enzimatica e vengono distinti in competitivi e non competitivi. Sono invece definite inattivattori le sostanze che determinano un blocco irreversibile dell’attività. Nell’inibizione competitiva si registra una competizione fra substrato e inibitore, e il grado di inibizione dipende dalle concentrazioni relative dei due competitori. Se si aumenta la concentrazione del substrato si può arrivare ad annullare l’effetto dell’inibitore. Generalmente la competizione si verifica quando l’inibitore e il substrato sono strutturalmente simili (inibizione per analogia di struttura) ed entrambi competono per occupare il sito attivo dell’enzima. L’inibizione si definisce non competitiva quando l’inibitore si unisce all’enzima non nel sito attivo ma in una posizione diversa (sito allosterico). In realtà il sito allosterico può ospitare anche molecole effettrici, per cui in questi enzimi (enzimi allosterici) la modificazione del sito attivo da parte di quello allosterico può avere effetti modulatori di inibizione o di attivazione (figura 2.12). L’inibizione enzimatica si può realizzare anche con un meccanismo a retroazione (feedback). Ciò si verifica per esempio nel caso di una reazione biochimica a più stadi, mediati ciascuno da enzimi specifici, che porti alla sintesi di un metabolita terminale (prodotto finale). Quando la concentrazione del prodotto finale raggiunge una concentrazione critica, tale da causare a livello cellulare l’attivazione di un meccanismo di regolazione, questo si realizza con l’intervento dello stesso prodotto finale che funziona come inibitore allosterico “a retroazione” sul primo degli enzimi coinvolti. La produzione 18 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario BIOTECNOLOGIE MICROBICHE Enzima E1 (allosterico) Enzima E2 2 Enzima E3 Prodotto finale Substrato Blocco della via Intermedio 2 Intermedio 1 Inibizione di E1 Figura 2.13 Modello di inibizione a feedback. riprende se il metabolita terminale viene consumato e la sua concentrazione decresce (figura 2.13). Operone DNA Promotore Operatore Gene strutturale Figura 2.14 Struttura di un operone. 2.7 Regolazione della sintesi degli enzimi Poiché gli enzimi sono proteine, i meccanismi di regolazione della loro produzione sono in pratica quelli della sintesi proteica. È necessario ricordare che esistono enzimi inducibili, destinati alla degradazione di substrati nutritivi diversi (amilasi, proteasi ecc.) e la cui sintesi viene attivata dalla presenza del substrato che funziona come induttore, mentre altri enzimi (costitutivi, come quelli della glicolisi) sono prodotti da geni continuamente attivi. Nei procarioti i sistemi di regolazione si realizzano attraverso i meccanismi di induzione e repressione, controllati a livello genetico da vari segmenti di DNA che nel loro insieme formano un operone. Un operone è costituito da geni strutturali (che codificano per le proteine) e da geni adiacenti, denominati gene operatore e gene promotore (figura 2.14). Non direttamente a contatto con i precedenti esiste un altro gene chiamato regolatore. Regolatore, promotore e operatore hanno funzioni di regolazione del processo di sintesi, mentre i geni strutturali trascrivono sull’RNA messaggero l’informazione per la sintesi delle rispettive proteine: r il gene regolatore produce un repressore, che può essere attivo o inattivo r per questo repressore il gene operatore presenta un sito di legame specifico r il gene promotore “promuove” la sintesi di RNA messaggero: per svolgere questo compito deve combinarsi con la RNA polimerasi, per la quale possiede uno specifico sito di legame. Induzione In assenza del substrato (induttore) da degradare, il repressore prodotto dal gene regolatore si associa all’operatore: in tal caso viene contemporaneamente impedito all’RNA polimerasi di legarsi al gene promotore. Non è quindi possibile avviare la trascrizione dell’mRNA e la sintesi proteica. La presenza di substrato dà luogo al complesso induttore-repressore, che non può più legarsi al sito specifico sul gene operatore, lasciando contemporaneamente libero anche il sito per l’RNA polimerasi sul gene promotore: in tal caso la sintesi proteica può procedere. Nell’operone-lac di E. coli in assenza del lattosio (substrato induttore) la produzione in sequenza degli enzimi β-galattosidasi, permeasi e transacetilasi (necessari per la degradazione del lattosio) viene inibita dal repressore che può legarsi all’operatore e bloccare la RNA polimerasi. Introducendo nel terreno di coltura solo il lattosio come unica fonte di carbonio, questo si lega al 19 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 2 BIOTECNOLOGIE MICROBICHE Figura 2.15 L’operone lattosio. L’operone lattosio è un esempio di sistema inducibile: il lattosio funge, infatti, da induttore permettendo la sintesi degli enzimi coinvolti nella sua stessa via metabolica attraverso l’inibizione del legame della proteina repressore con l’operatore. repressore bloccandone l’azione. L’RNA polimerasi può occupare il proprio sito specifico sul gene promotore e indurre la sintesi degli enzimi per la degradazione del substrato (figura 2.15). Repressione Un esempio che può illustrare il fenomeno della repressione (co-repressione) si verifica nell’inibizione a feedback (repressione da prodotto finale) in cui un metabolita terminale, che viene normalmente prodotto perché il repressore è originariamente inattivo, una volta raggiunta una concentrazione critica si lega come Figura 2.16 L’operone triptofano. L’operone triptofano è un esempio di sistema reprimibile: se il triptofano è assente, il repressore è inattivo e non può legarsi all’operatore. Quando il triptofano è presente, funge da corepressore, attivando il repressore; quest’ultimo si lega all’operatore e blocca la sintesi dell’operone. co-repressore al repressore inattivo trasformandolo in attivo, ponendo di conseguenza termine alla produzione del metabolita. Tale sistema si registra nell’operone triptofano (figura 2.16). 20 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario BIOTECNOLOGIE MICROBICHE 2.8 Biocatalizzatori cellulari: i microrganismi I processi biotecnologici industriali impiegano microrganismi selezionati in funzione del prodotto che si vuole ottenere. In questo senso le moderne tecnologie si differenziano da quelle tradizionali: per ottimizzare un processo e migliorare le rese produttive è indispensabile una conoscenza approfondita della fisiologia, delle reazioni biochimiche cellulari e delle caratteristiche genetiche dei microrganismi. Occorre quindi fare affidamento su colture microbiche pure e attentamente selezionate, frutto di un lungo e paziente lavoro di screening. I microrganismi che interessano le produzioni biotecnologiche (o fermentazioni industriali tradizionalmente intese) sono: r batteri: procarioti r lieviti e funghi filamentosi (muffe): eucarioti. L’elenco che segue, lungi dall’essere esaustivo, ha esclusivamente valore di rassegna sintetica di alcuni dei microrganismi impiegati nelle più note fermentazioni industriali. Fra i batteri, Escherichia coli è indubbiamente la specie meglio conosciuta. Il suo utilizzo nella microbiologia industriale tradizionalmente intesa è indubbiamente secondario rispetto ad altri microrganismi, ma è innegabile che le nuove frontiere della tecnologia del DNA ricombinante e dell’ingegneria genetica lo vedono assoluto protagonista. Praticamente tutte le manipolazioni genetiche su altri procarioti lo utilizzano come ospite intermedio e ne fanno il batterio più adatto e gestibile nelle tecniche di biologia molecolare per la produzione di enzimi. Altro genere rilevante è Bacillus, ad ampia diffusione ambientale e impiegato nella produzione di antibiotici, enzimi e bioinsetticidi (B. thuringiensis). Da batteri del genere Zymomonas si ottengono acetone e alcol etilico, prodotto anche da Clostridium, mentre Corynebacterium glutamicum è in grado di produrre acido glutammico. Lactobacillus e Streptococcus sono i generi più rappresentativi fra i batteri lattici, agenti della fermentazione lattica (produzione di acido lattico e industria lattiero-casearia). Molti antibiotici sono prodotti da batteri appartenenti al genere Streptomyces. Batteri appartenenti ai generi Arthrobacter, Ace- 2 tobacter, Mycobacterium ed eucarioti come la muffa Rhizopus vengono impiegati nelle bioconversioni (biotrasformazioni) per la produzione degli ormoni steroidi. Fra i microrganismi eucarioti una grande varietà di funghi filamentosi (muffe) è utilizzata nella produzione di molecole bioattive (antibiotici, farmaci diversi), metaboliti primari (acido citrico) ed enzimi. I lieviti (funghi unicellulari) con il genere Saccharomyces rappresentano sicuramente i microrganismi più noti per le trasformazioni biotecnologiche in campo alimentare (produzione di vino, birra, lievitazione del pane e dei prodotti da forno). Vengono coltivati anche come integratori alimentari e fonte di proteine (SCP, single cell proteins). I lieviti sono però estremamente importanti anche perché, fra gli eucarioti, sono microrganismi-modello per le manipolazioni genetiche e vengono utilizzati anche per la produzione di metaboliti primari e proteine ricombinanti. L’avvento delle biotecnologie avanzate e il perfezionamento delle tecniche di ingegneria genetica per il trasferimento di geni hanno consentito la creazione di microrganismi geneticamente modificati (MGM) allo scopo di ottenere prodotti specifici. L’impiego degli MGM viene condizionato dalla legislazione specifica in vigore nei vari Paesi. Nel campo delle produzioni alimentari si impiegano microrganismi non modificati classificati dalla FDA (Food and Drug Administration) come GRAS (generally recognized as safe, tabella 2.2). I microrganismi utilizzati nelle produzioni industriali e nella ricerca sono conservati in collezioni nazionali, alcune delle quali sono riportate in tabella 2.3. 2.9 Tecniche di selezione dei ceppi microbici La ricerca nel campo delle biotecnologie microbiche tende costantemente alla scoperta di nuovi metaboliti microbici. Le strategie impiegate a questo fine possono essere diverse (tabella 2.4). Una ricerca può avere come scopo quello di ottenere un nuovo prodotto, mettere a punto un processo innovativo rispetto a quello attualmente in uso, o la combinazione dei due obiettivi. Il più delle volte il punto di partenza in questo tipo 21 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 2 BIOTECNOLOGIE MICROBICHE Tabella 2.2 Alcuni microrganismi classificati GRAS BATTERI PRODOTTO/SETTORE DI IMPIEGO Bacillus subtilis Pectina liasi e proteasi per il settore alimentare Bacillus licheniformis Proteasi per il settore alimentare Geobacillus stearothermophilus α-amilasi per la produzione di maltodestrine da amido Gluconobacter oxydans Sorbosio per uso alimentare Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Produzione di yogurt Lactococcus lactis Nisina, antibiotico impiegabile nei formaggi pastorizzati, aminopeptidasi per lo sviluppo di aroma nel formaggio cheddar Leuconostoc mesenteroides Destrano per uso alimentare Streptococcus thermophilus Produzione di yogurt Streptomyces griseus Vitamina B12 Xantomonas campestris Xantano LIEVITI Candida utilis Mangimistica Kluyveromyces lactis β-galattosidasi per la produzione di latte delattosato Saccharomyces cerevisiae Lievito per panificazione, lievito per uso dietetico, estratti proteici Yarrowia lipolytica Produzione di acido citrico MUFFE Aspergillus niger Cellulasi per il trattamento di molluschi e crostacei Aspergillus oryzae α-amilasi da addizionare alle farine Endothia parasitica Caseificazione Penicillium roqueforti Caseificazione Rhizopus niveus Amiloglucosidasi per l’idrolisi dell’amido, lipasi per reazioni di interesterificazione in grassi e oli Rhizopus oryzae Amilasi per la produzione di destrosio da amido Rhizomucor miehei Caseificazione (rennina): esterasi-lipasi con ruolo sulla sapidità dei formaggi Rhizomucor pusillus Caseificazione Tabella 2.3 Principali collezioni di microrganismi COLLEZIONE MICRORGANISMO American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, USA) Tutti Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) (Braunschweig, Germania) Tutti Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) (Parigi, Francia) Tutti CABI Bioscience Genetic Resource Collection (formalmente International Mycological Institute, IMI) (Egham, UK) Tutti Czechoslovak Collection of Microorganisms (CCM) (Brno, Repubblica Ceca) Tutti Culture Collection of the Institut for Fermentation (IFa) (Osaka, Giappone) Tutti Japan Collection of Microorganisms (JCM) (Saitama, Giappone) Tutti Collection de l’Institut Pasteur (CIP) (Parigi, Francia) Batteri National Collection of Industrial, Food and Marine Bacteria (NCIB , NCIMB , NCFB) (Aberdeen, UK) Batteri National Collection of Yeast Cultures (NCYC) (Norwich, UK) Lieviti Centraal Bureau voor Schimmelcultures (CBS) (Baarn, Olanda) Lieviti e muffe Canadian Collection of Fungal Cultures (CCFC) (Ottawa, Canada) Muffe 22 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario BIOTECNOLOGIE MICROBICHE 2 Tabella 2.4 Strategie per l’ottenimento di nuovi metaboliti microbici STRATEGIE tIsolamento di ceppi microbici per la produzione di nuovi metaboliti tModificazione chimica di molecole già note tBiotrasformazioni a opera di microrganismi o enzimi per la modifica di molecole ottenute per via chimica o microbiologica tFusione di protoplasti interspecifica per la ricombinazione di informazioni genetiche fra ceppi produttori, ragionevolmente correlati tClonaggio di geni per il trasferimento di informazioni genetiche fra ceppi non correlati di ricerche consiste nell’individuazione, su varie matrici ambientali, di un elevato numero di generi e specie microbiche diverse fra cui selezionare ceppi microbici più efficienti o in grado di produrre nuovi metaboliti. Questo procedimento prende il nome di screening (vagliare, setacciare); ad esso seguono o si affiancano anche tecniche di mutagenesi (induzione di mutazioni sui microrganismi selvatici o “wild”) allo scopo di ottenere ceppi alto-produttori. Nelle biotecnologie microbiche lo screening può avere come obiettivo la ricerca di: r un ceppo microbico r un enzima r una molecola. I microrganismi, per le loro dimensioni microscopiche, per la rapida crescita, per l’enorme varietà, sono “campioni” ideali da vagliare per scoprire ceppi dotati di particolari attività metaboliche, in grado di produrre determinati enzimi o nuove molecole suscettibili di applicazioni interessanti. Il fattore tempo e quello economico hanno importanza primaria, per cui il target ideale si rivela essere quello di saggiare molti campioni in un tempo breve. Questo è solo il primo passo (ma già di per sé complesso) di una procedura lunga e impegnativa che porta alla realizzazione di un impianto-pilota (generalmente un piccolo fermentatore da laboratorio di capacità non superiore a 20 L), alla messa a punto dei parametri biochimici e microbiologici del processo e alla valutazione finale del prodotto ottenuto. Se l’operazione risulta conveniente anche sul piano economico, si può passare dalla fase sperimentale alla progettazione dell’impianto per la produzione industriale vera e propria. 2.10 Strategie di screening Se l’obiettivo è la produzione di un nuovo metabolita, occorre intervenire sul metabolismo microbico individuando la via biochimica in cui la molecola-target è coinvolta, intervenire sui sistemi di regolazione e indirizzare o deviare il metabolismo microbico verso la molecola di interesse. I sistemi di controllo principali su cui intervenire sono relativi alla sintesi degli enzimi coinvolti nella via biochimica specifica e, per quanto riguarda le sostanze escrete nell’ambiente extracellulare, alla regolazione della permeabilità cellulare. In questo ambito l’intervento delle tecnologie del DNA ricombinante che hanno reso possibile il trasferimento e l’espressione controllata di geni hanno consentito progressi prima inimmaginabili: basti pensare all’inserimento di geni codificanti per la produzione di ormoni umani in ceppi batterici (insulina da E. coli). Lo screening per ottenere nuove molecole si svolge in più fasi, con la selezione di ceppi microbici, l’effettuazione di saggi di attività e di prove preliminari in fermentatori su piccola scala. Successivamente si affrontano indagini di tipo più strettamente chimico, quali l’estrazione e la caratterizzazione delle proprietà della molecola ottenuta. Questi procedimenti vengono schematizzati come screening primario e screening secondario, ciascuno composto da diverse fasi (tabella 2.5). La fase di screening primario comprende: r isolamento di colture. Esistono collezioni ufficiali di colture microbiche a cui ci si può rivolgere, ma l’individuazione di nuovi ceppi di interesse parte generalmente con la ricerca nei substrati più diver23 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 2 BIOTECNOLOGIE MICROBICHE SCREENING: TERMINOLOGIA Programma di screening: operazioni mirate alla scoperta di un prodotto. Campione: elemento da saggiare nello screening. Library (libreria): insieme dei campioni disponibili per lo screening. Proprietà: attività biologica che è richiesta al campione. Test: saggio che viene impiegato per valutare se qualche campione della library possiede la proprietà desiderata. Si distinguono test primari, cui vengono sottoposti tutti i campioni, e test secondari che vengono eseguiti solo sui campioni positivi ai test primari. Algoritmo di screening: definisce i criteri di positività e negatività dei test che un campione deve superare per essere classificato interessante, con proprietà che vale la pena indagare ulteriormente. Un simile campione viene chiamato hit. Tipologie di library Una library può essere formata, a seconda degli obiettivi, da microrganismi, da enzimi, da DNA, da metaboliti. Caratteristiche primarie di una library sono la diversità, il grado di novità, la dimensione. Minori sono la diversità e la novità, maggiore dovrà essere la dimensione di una library. Viceversa, maggiori sono le novità, minore si (acqua, suolo, vegetali ecc.) mediante l’impiego di terreni prima generici e poi selettivi a seconda dell’obiettivo che si intende perseguire. È ovvio che la premessa indispensabile per poter proseguire le indagini con criteri di razionalità consiste nell’ottenere colture pure r saggi di attività. Comprendono vari test (per es. di efficacia antimicrobica della nuova molecola) da effettuarsi su terreni solidi o liquidi sui vari ceppi microbici isolati r analisi cromatografica dei campioni del filtrato colturale. Viene eseguita per l’individuazione e la classificazione chimica preliminare del composto di interesse presente nel terreno liquido di coltura. Se il prodotto ricercato è in massima parte inglobato nelle cellule, occorrono procedure mirate di estrazione. potrà essere la dimensione della library. Gli aspetti innovativi di uno screening consentono di prendere in esame elementi non precedentemente esaminati da altri ricercatori: per esempio utilizzando nuovi campioni, perfezionando o modificando i test per identificare nuovi elementi interessanti (nuovi hit). Library di microrganismi: viene utilizzata quando interessa in primo luogo il microrganismo nella sua integrità piuttosto che uno dei suoi prodotti. È composta generalmente di microrganismi simili, che vanno sottoposti a screening in condizioni di omogeneità, possibilmente utilizzando lo stesso terreno, la medesima temperatura di incubazione ecc. Library di geni: si utilizza quando si vuole ricercare il prodotto di uno o più geni, cioè una proteina; ma anche il prodotto dell’azione catalitica di più enzimi codificati da geni diversi. Library di enzimi: per identificare nuovi enzimi si possono utilizzare lisati cellulari o il mezzo di coltura. In genere si tratta di miscele complesse di proteine. Library di metaboliti: per l’identificazione di una nuova molecola bioattiva, ci si basa sulla capacità dei microrganismi di produrre metaboliti secondari. Si procede con l’ottenere estratti dai terreni di coltura, quindi si perfeziona la ricerca con tecniche diverse per eliminare possibili interferenze. Lo screening secondario viene avviato quando la fase primaria ha dato risultati positivi, si è cioè arrivati con successo all’isolamento di ceppi in grado di produrre la sostanza di interesse. A questo punto diventa sostanziale la necessità di migliorare le rese produttive cercando di ottenere ceppi microbici alto-produttori e di ottimizzare le condizioni colturali. 2.11 Selezione dei ceppi alto-produttori La selezione dei ceppi alto-produttori viene effettuata impiegando tecnologie genetiche basate sul verificarsi di: r fenomeni naturali: mutazioni spontanee, ricombinazioni r eventi provocati: mutazioni indotte, fusione di protoplasti, ibridazione fra cellule, ingegneria genetica. 24 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 2 BIOTECNOLOGIE MICROBICHE Tabella 2.5 Fasi che costituiscono una procedura di ricerca e sviluppo applicata alla messa a punto di nuove molecole ad attività biologica FASI SOTTOPASSAGGI Screening primario t3BDDPMUBEJDBNQJPOJFJTPMBNFOUPEFMMFDPMUVSF t&WFOUVBMFTBHHJPQSFMJNJOBSFEJBUUJWJUËJOTPMJEP t4BHHJEJWBMVUB[JPOFEJBUUJWJUËJOMJRVJEP DBNQJPOJEJýMUSBUPDPMUVSBMF t4BHHJEJJOJCJ[JPOFFO[JNBUJDB t$BSBUUFSJ[[B[JPOFEFMDFQQPQSPEVUUPSF FEFWFOUVBMFCSFWFUUB[JPOF di microrganismo e processo Screening secondario Selezione di ceppi alto-produttori t*NQJFHPEFMMFUFDOJDIFNVUBHFOFFPHFOFUJDIF t4FMF[JPOFEFJDFQQJ Messa a punto delle condizioni colturali t.FTTBBQVOUPEFMMBGPSNVMB[JPOFEFMUFSSFOPDPMUVSBMF QSPEVUUJWJUË in rapporto al costo) t"OBMJTJEF*MJOþVFO[BEFMMFWBSJBCJMJEJGFSNFOUB[JPOF t4UVEJPEFMMFDJOFUJDIFEJGFSNFOUB[JPOF t4WJMVQQPCJPUFDOPMPHJDPEFMQSPDFTTP scale-up): laboratorio pilota-impianto Isolamento e valutazione della sostanza isolata t&TUSB[JPOFEBJDBNQJPOJEJýMUSBUPDPMUVSBMFFQVSJýDB[JPOF t$BSBUUFSJ[[B[JPOFDIJNJDPýTJDBFTUVEJPEFMNFDDBOJTNPEB[JPOF t"UUJWJUËFTUBCJMJUËin vitro e in vivo t4UVEJPEFMMBCJPHFOFTJ t1SPWFEJUPTTJDJUË Analisi dei costi t7BMVUB[JPOFHMPCBMFEFJDPTUJEJQSPEV[JPOF -JEFOUJýDB[JPOFUBTTPOPNJDBEFMDFQQPQSPEVUUPSF DJPÒJMTVPSJDPOPTDJNFOUPEJBQQBSUFOFO[BBVOBTQFDJFHJËDMBTTJýDBUBPBVOBTQFDJFOVPWB può essere effettuata in uno stadio della ricerca più avanzato, cioè quando l’interesse per il prodotto ottenibile sia ben dimostrato. Mutazioni Si può fare affidamento sulla comparsa nel ceppo in esame di mutazioni spontanee potenzialmente utili, ma, per la bassa frequenza con cui queste si manifestano, risulta senz’altro più conveniente un approccio rivolto alla creazione di mutazioni indotte (figura 2.17). Si impiegano allo scopo agenti mutageni fisici quali radiazioni ionizzanti (raggi X e γ) o non ionizzanti (raggi UV) o mutageni chimici come analoghi delle basi, acridina, agenti alchilanti, enzimi che interferiscono con la sintesi del DNA. Gli effetti delle radiazioni UV possono essere in certa misura annullati dall’esposizione dei mutanti alla luce visibile (reversione per foto riattivazione). L’azione dei raggi X e γ è molto più intensa e penetrante e causa la formazione di radicali liberi altamente reattivi che inattivano gli acidi nucleici e altre macromolecole cellulari. Gli analoghi delle basi vengono incorporati nel DNA e ne alterano il meccanismo di replicazione. Le acridine (arancio di acridina e bro- muro di etidio) sono agenti intercalanti che si inseriscono fra le coppie di basi del DNA, producendo mutazioni da scivolamento (frameshift) nello schema di lettura del codice genetico e provocandone di conseguenza il completo stravolgimento. Le tecniche di mutagenesi si sono rivelate molto efficaci nel miglioramento della produttività di processo, anche se in molti casi si preferisce impiegare le tecnologie del DNA ricombinante attualmente disponibili. Gli agenti mutageni, trattati in modo più approfondito nel capitolo 15, possono agire a livello molecolare in modi diversi, provocando mutazioni: r geniche: consistono in variazioni di basi all’interno di un gene e si verificano per sostituzione, delezione, inserzione di base. Tali mutazioni vengono dette puntiformi se riguardano una sola base r cromosomiche: coinvolgono uno o più cromosomi. Sono alterazioni piuttosto estese riguardanti segmenti di DNA che si possono spezzare e ricongiungere. Si possono avere cambiamenti di posizio25 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 2 BIOTECNOLOGIE MICROBICHE Figura 2.17 Mutazioni spontanee e mutazioni indotte. a) La forma rara della citosina può appaiarsi con una base diversa. b) Alcune sostanze chimiche, grazie alla loro azione mutagena, possono indurre modificazioni nelle basi. c) In entrambi i tipi di mutazioni si arriva a un cambiamento della sequenza di DNA dopo la duplicazione. ne (traslocazione), eliminazioni (delezioni) o duplicazioni r genomiche: modificazioni del numero di cromosomi presenti in un individuo, in più o in meno rispetto alla norma. La mutazione modifica l’intero cariotipo. Una volta ottenuti i mutanti, sia spontanei che indotti, la fase successiva risulta lunga e indaginosa, poiché l’individuazione di microrganismi potenzialmente utili comporta l’analisi di un elevato numero di ceppi fra quelli sopravvissuti all’evento mutageno. L’operazione può essere eseguita affidandosi alla selezione casuale o piuttosto all’isolamento selettivo, in condizioni che permettono di individuare solo i ceppi che rispondono a determinate caratteristiche (resistenza a inibitori o antimetaboliti, ceppi auxotrofi che richiedono l’integrazione nel mezzo colturale di un particolare nutriente ecc.). Ricombinazione naturale di geni La ricombinazione naturale di geni si verifica sia nei procarioti che negli eucarioti. I batteri, pur non avendo una riproduzione sessuale, possono scambiare materiale genetico cromosomico o plasmidico con tre modalità: ❖ coniugazione: trasferimento di DNA plasmidico o parti di cromosoma batterico da una cellula donatrice a una ricevente attraverso il “pilum F” (figura 2.18) ❖ trasformazione: acquisizione da parte di una cellula ricevente di frammenti di DNA dall’ambiente o dal substrato colturale ❖ trasduzione: inserimento di materiale genetico proveniente da un batterio donatore in una cellula ricevente con l’intervento di un vettore virale. Negli eucarioti che si riproducono sessualmente la ricombinazione genetica naturale si verifica nella meiosi con il crossing-over, fenomeno che è all’origine dell’infinita variabilità genetica originata dalla riproduzione sessuale. In muffe di interesse industriale quali Aspergillus e Penicillium due diversi ceppi aploidi possono fondere le loro ife formando un micelio che contiene i nuclei di entrambi i ceppi (eterocarion), dando origine a individui con caratteri ricombinati. 26 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario BIOTECNOLOGIE MICROBICHE F+ Integrazione del fattore F al cromosoma F-- Trasferimento del DNA plasmidico F+ F+ Hfr Trasferimento del DNA cromosomiale Hfr F+ ricombinante 2 Figura 2.18 Trasferimento del DNA per coniugazione. La cellula donatrice (F+) entra in contatto con una cellula ricevente (F–) attraverso il pilum. Il DNA del donatore entra nella cellula ricevente e al termine del processo le due cellule hanno una copia completa di DNA. Ibridazione di lieviti Nei lieviti è possibile procedere all’ibridazione dei caratteri di due ceppi diversi ma compatibili. L’operazione viene eseguita tramite un micromanipolatore con cui due ascospore, ciascuna delle quali derivante da un ceppo, vengono messe a contatto e coniugano fondendo i rispettivi genomi. Ne risulta uno zigote ibrido con corredo cromosomico diploide dotato dei caratteri ricombinati dei singoli ceppi, da cui si ottiene un clone cellulare coltivabile su adatto terreno di propagazione. Fusione di protoplasti In alcune cellule eucariotiche, come lieviti o cellule vegetali, è possibile ottenere varianti genetiche attraverso la fusione dei protoplasti. I protoplasti sono cellule private della parete cellulare in seguito a opportuni trattamenti con enzimi litici in ambiente osmoticamente controllato: soluzioni ec- Protoplasti + Parete cellulare Figura 2.19 Fusione di protoplasti. In condizioni di fusione due protoplasti mescolano i loro materiali genetici; al ripristino delle condizioni naturali ogni protoplasto riforma la propria parete cellulare. 27 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 2 BIOTECNOLOGIE MICROBICHE Membrana citoplasmatica DNAr Membrana DNAr Citoplasma Nucleo Citoplasma Cellula Scarica elettrica Entrata del DNAr Rilassamento Figura 2.20 Elettroporazione. La scarica elettrica crea dei pori nella membrana citoplasmatica permettendo l’ingresso di DNA esogeno. cessivamente ipotoniche potrebbero infatti provocare danni irreversibili alla membrana plasmatica, l’unico involucro cellulare superstite. Il successivo trattamento con polietilenglicol permette la fusione dei due protoplasti, provenienti ciascuno da ceppi affini ma geneticamente diversi. Il DNA delle due cellule progenitrici viene quindi ricombinato negli ibridi risultanti che ricostituiscono poi la parete cellulare (figura 2.19). Elettroporazione Un’altra tecnica per inserire molecole di DNA esogeno in cellule riceventi è l’elettroporazione. Questa metodica consiste nel sottoporre la cellula ricevente a ripetute scariche elettriche a intervalli regolari che hanno il potere di allargare i pori della membrana cellulare (figura 2.20). DNA ricombinante (ingegneria genetica) La tecnologia del DNA ricombinante offre indubbiamente il più ampio ventaglio possibile di ricombinazioni genetiche, permettendo il passaggio di materiale genetico da un organismo a un altro attraverso specifici vettori. Un frammento di DNA può essere facilmente clonato in un vettore, quindi inserito nell’ospite adatto. Un aspetto particolarmente problematico riguarda l’espressione nell’ospite, nei confronti del quale il DNA esogeno rappresenta pur sempre un gene estraneo. Per questo devono essere inserite nell’ospite, insieme al gene che codifica per la proteina di interesse (il prodotto che si vuole ottenere), specifiche sequenze di attivazione, nonché marker, per poter riconoscere le cellule ospite trasformate, distinguendole da quelle che non hanno incorporato il DNA esogeno. La trasformazione della cellula ospite e l’effettiva espressione del gene esogeno trasferito sono infatti eventi probabili e non sicuri. 28 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario ESERCIZI DI VERIFICA 1. Gli enzimi sono: A proteine con attività catabolica B proteine con attività catalitica C molecole inorganiche con attività catalitica 2. I coenzimi sono: A forme diverse di uno stesso enzima B molecole organiche che partecipano all’attività catalitica con funzione di trasporto C enzimi che agiscono contemporaneamente su di uno stesso substrato 3. Il coenzima NAD funziona come: A catalizzatore B trasportatore C inibitore D repressore E corepressore 4. La retroregolazione (feedback) esercita un controllo sulle attività metaboliche di: A biosintesi B degradazione (catabolismo) C respirazione D fermentazione 5. Nel meccanismo di regolazione a retroazione della sintesi proteica il gene regolatore produce: A un repressore attivo B un repressore inattivo C un corepressore 6. Nel meccanismo di regolazione degli enzimi inducibili il gene regolatore produce: A un repressore attivo B un repressore inattivo C un induttore 7. Lo scopo della fusione di protoplasti è quello di: A ottenere cellule più grandi B ottenere ibridi con caratteri ricombinati C ottenere un numero maggiore di cellule per la produzione industriale di sostanze 8. Completa le seguenti frasi: Con la ricombinazione genetica si ottengono ........................................................................... ........................................................................... ........................................................................... Il trasferimento di plasmidi consente di ............ ........................................................................... ........................................................................... Gli isoenzimi sono .......................................... ..………..…….. e catalizzano ............................ ma si differenziano per ...................................... Tenendo conto della natura chimica degli enzimi, la loro attività può essere bloccata da un ........................................................................... .............., in quanto ciò ne provoca la .............. ................................ Gli enzimi che vengono sintetizzati solo in presenza di un substrato specifico si dicono.......... ....................................................., mentre quelli che non seguono questa regola sono chiamati ............................................... Esempio del primo gruppo è l’enzima ....................................... .............., esempi del secondo gruppo sono gli enzimi che intervengono nella ........................... .......................... 29 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 3 I PROCESSI BIOTECNOLOGICI 3.1 Substrati e prodotti 3.2 I terreni di coltura per la microbiologia industriale 3.3 I prodotti 3.4 Fasi produttive: preparazione dell’inoculo 3.5 Lo scale-up 3.6 I fermentatori o bioreattori 3.7 Sterilizzazione 3.8 Processi batch, continui, fed-batch 3.9 Immobilizzazione dei biocatalizzatori 3.10 I sistemi di controllo 3.11 Il recupero dei prodotti (downstream) I processi biotecnologici si basano sull’impiego di enzimi o di cellule microbiche, spesso indicati con il termine unico di biocatalizzatori: gli enzimi possono essere estratti dalla cellula, isolati e utilizzati come tali. I processi che portano a prodotti ottenuti in questo modo, cioè con l’utilizzo dell’attività catalitica dei soli enzimi, sono detti anche conversioni o bioconversioni e trasformano semplicemente il substrato nel prodotto desiderato. Quando invece il prodotto è ottenuto dall’attività della cellula in toto si tratta piuttosto di fermentazioni vere e proprie: in questo caso le cellule microbiche sono chiamate sia a realizzare non solo le vie metaboliche che portano alla formazione del prodotto, ma anche quelle necessarie alla sintesi degli enzimi coinvolti nella produzione. Le cellule vengono utilizzate in sospensione nel mezzo colturale, mentre gli enzimi vengono solubilizzati nel sistema di reazione. Sia le cellule che gli enzimi possono inoltre essere fissati (immobilizzati) su particolari supporti. L’impiego di microrganismi aumenta la complessità dei sistemi di reazione, per l’imprevedibilità degli equilibri propria delle cellule viventi: tutti i parametri in gioco devono quindi essere rigidamente controllati e ottimizzati non solo per assicurare alle cellule le migliori condizioni di sopravvivenza e operatività, ma anche per ottenere le massime rese produttive. 3.1 Substrati e prodotti I processi biotecnologici presentano indubbiamente diversi vantaggi rispetto a quelli chimico-industriali: r impiego di materie prime naturali, rinnovabili e che spesso sono residui di altre lavorazioni o anche so30 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario I PROCESSI BIOTECNOLOGICI stanze non altrimenti riciclabili (fanghi di depurazione o residui di idrocarburi) r minor consumo di energia nella conduzione del processo r prodotti ecologicamente compatibili r prodotti di scarto riciclabili. Nelle produzioni biotecnologiche si distinguono due diverse fasi: ❖ upstream di biotrasformazione in cui microrganismi o enzimi elaborano il prodotto ❖ downstream di estrazione e isolamento del prodotto desiderato. Insieme con la scelta del microrganismo più efficiente e produttivo, quella del substrato più adatto ad ottenere il prodotto desiderato è altrettanto fondamentale in qualsiasi processo fermentativo. Un aspetto di primaria importanza nell’economia di produzione è rappresentato dal rapporto fra costi e resa del processo: per questo motivo l’industria preferisce sfruttare per quanto possibile come materie prime i prodotti di scarto o i surplus residuati da altri processi o da attività agricole, come melasso, farina di soia, corn-steep liquor. Caratteristica principale di un qualsiasi substrato è quella di rispondere in modo ottimale ma compatibile con l’economia di processo alle esigenze nutritive dei microrganismi e di contribuire nel migliore dei modi alla sintesi del prodotto. Quest’ultimo può essere il microrganismo stesso (biomassa cellulare: per es. cellule di lievito nella produzione del lievito alimentare o per la panificazione) o un composto chimico di particolare interesse prodotto dal metabolismo microbico. I criteri su cui basare la scelta dei substrati più opportuni sono essenzialmente: r costo r disponibilità per quanto possibile continua r scarsa incidenza di problemi logistici di trasporto e stoccaggio r stabilità alle temperature di sterilizzazione r caratteristiche chimico-fisiche tali da non incidere negativamente sul processo produttivo (formazione di schiuma o altri effetti indesiderati) r alte rese r scarsa produzione di prodotti secondari r assenza di problemi di sicurezza e igienico-sanitari. 3 In conclusione, la redditività economica di un prodotto è la risultante di una somma di fattori fra cui hanno un ruolo decisivo la resa di processo, la convenienza economica delle materie prime da utilizzare e la complessità degli impianti di estrazione e purificazione, naturalmente in relazione al valore aggiunto del prodotto. 3.2 I terreni di coltura per la microbiologia industriale La composizione dei terreni colturali deve essere commisurata alle esigenze dei microrganismi impiegati nei processi di produzione biotecnologica. Nelle fermentazioni industriali la formulazione dei terreni di coltura e le condizioni operative risultano il più delle volte non equiparabili a quelle osservate in laboratorio: per ottimizzare le condizioni colturali allo scopo di ottenere un determinato prodotto a volte è necessario fornire alcune sostanze nutritive in eccesso per indurre i microrganismi a percorrere vie metaboliche alternative a quelle abituali. Si può allestire, per esempio, un terreno sbilanciato con un eccesso di carbonio rispetto al contenuto in azoto per indurre la produzione di polisaccaridi. In altri casi, invece, si ricorre a condizioni di carenza nutrizionale: Corynebacterium glutamicum aumenta la produttività di acido glutammico se mantenuto in carenza di biotina, mentre Aspergillus niger produce alte concentrazioni di acido citrico quando il terreno di coltura è carente di ferro. Se si impiegano mutanti auxotrofi, risulta indispensabile la conoscenza approfondita delle specifiche esigenze nutrizionali, fornendo i componenti che i microrganismi non sono più in grado di sintetizzare autonomamente. In altri casi si richiede un mezzo colturale privo di uno specifico cofattore per causare il blocco dell’attività di un enzima con punto di intervento immediatamente a valle del metabolita che si vuole ottenere. In questo modo il metabolita si accumula nel terreno di coltura e può essere recuperato. Un simile fenomeno si verifica, per esempio, nella produzione dell’acido citrico con il blocco programmato dell’enzima aconitasi che lo trasformerebbe, se lasciato libero di agire, in acido cisaconitico (figura 3.1). La valutazione dell’impatto dei parametri ambientali in cui viene condotta la fermentazione (temperatura, pH, condizioni di aerazione ecc.) è un altro punto fondamentale nella gestione e nell’ottimizzazione del pro31 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 3 I PROCESSI BIOTECNOLOGICI Tabella 3.1 Rapporti dei microrganismi con l’ossigeno in relazione al metabolismo Glucosio Fruttosio-6-fosfato PFK Fruttosio-1,6-difosfato Piruvato CO2 Piruvato carbossilasi GRUPPO METABOLISMO ESIGENZE DI O2 Aerobi Obbligati Respirazione Esigenti. Si sviluppano in presenza di O2 atmosferico (circa 20%) Microareofili Respirazione Esigenti. Richiedono livelli di O2 del 2-10% Facoltativi Respirazione aerobica e anaerobica Fermentazione Non esigenti. Si sviluppano meglio in presenza di O2 Respirazione anaerobica o fermentazione Non tollerano la presenza di O2 Fermentazione Non esigenti. Si sviluppano meglio in assenza di O2 Acetil-CoA CoA Anaerobi Obbligati Ossalacetato Citrato Aconitasi TCA cis-Aconitato Aerotolleranti Isocitrato Tabella 3.2 Composizione (g/L o mg/L) di terreni colturali impiegati per la produzione di alcuni metaboliti Figura 3.1 Inibizione dell’aconitasi. Lo schema mostra come il blocco dell’enzima aconitasi induce un accumulo di acido citrico. cesso produttivo. Occorre quindi studiare sistemi di termostatazione per il controllo costante della temperatura e tamponare eventuali variazioni del pH. È fondamentale mettere a punto strumenti per mantenere la concentrazione dell’ossigeno disciolto sopra a determinati valori-soglia. Le condizioni di aerazione del sistema rivestono infatti importanza strategica: la quantità di ossigeno da introdurre nel sistema di reazione è commisurata alle esigenze dei microrganismi impiegati (tabella 3.1), ma non sono rari i casi in cui risulta opportuno aumentarne la disponibilità per incrementare le rese produttive. Altri parametri di primaria importanza sono quelli relativi alla cinetica di fermentazione, cioè alla relazione fra la fase della curva di crescita microbica (logaritmica, stazionaria ecc.) e quella in cui si ha la massima resa produttiva. Poiché non esiste una corrispondenza fissa fra la fase di sviluppo e quella di massima biosintesi, alcuni metaboliti vengono sintetizzati nella fase di cre- Acido glutammico Glucosio 270 NH4H2PO4 2 (NH4)2HPO4 2 K2SO4 2 MgSO4 · 7H2O 0,5 MnSO4 · 7H2O 0,04 FeSO4 · 7H2O 0,02 Polietilenglicole 0,3 Biotina 0,01 mg Penicillina 0,01 mg Vitamina B12 Melasso di canna 100 Estratto di lievito 2 (NH4)2HPO4 5 MgSO4 · 7H2O 3 MnSO4 · 7H2O 0,2 Co(NO3)2 · 6H2O 0,19 Dimetilbenzimidazolo 25 mg ZnSO4 · 7H2O 20 mg Na2MoO4 · 2H2O 5 mg Riboflavina Glucosio Caseina K2HPO4 Olio di soia Glicerolo Corn steep Penicillina Glucosio Corn steep Acido fenilacetico Olio vegetale 20 12 1 20 12 12 100 40 5-8 5 scita logaritmica, mentre altri in quella stazionaria. Ciò si ripercuote nella scelta della tecnologia di processo più opportuna (a lotti, in continuo, fed-batch) a seconda dell’obiettivo specifico di produzione. 32 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 3 I PROCESSI BIOTECNOLOGICI Nelle produzioni industriali si impiegano generalmente terreni complessi, che contengono in larga misura materie prime grezze: farine animali o vegetali, sottoprodotti di altre lavorazioni come l’acqua di macerazione del mais (corn-steep liquor) e melasso, residuo della lavorazione della canna da zucchero o delle barbabietole. Le materie prime grezze, vantaggiose dal punto di vista economico, richiedono comunque pretrattamenti di idrolisi dei polimeri (come nel caso di amido e cellulosa) o di chiarificazione (corn-steep liquor). Esempi di composizione di terreni di coltura impiegati in microbiologia industriale sono riportati in tabella 3.2. Fonti di carbonio Possono essere impiegati carboidrati in forma pura come lattosio o glucosio, forniti anche come sciroppi ottenuti dall’idrolisi enzimatica dell’amido (sciroppo di glucosio). Più spesso vengono però impiegati carboidrati in forma grezza (tabella 3.3): r melassi: sottoprodotti dell’industria saccarifera, residui dell’estrazione del saccarosio da barbabietole e canna da zucchero (figura 3.2). Si presentano come una sorta di sciroppi densi ad alta viscosità, di colore scuro, e oltre che una fonte di carboidrati sono ricchi di importanti fattori di crescita come inositolo, acido pantotenico e biotina, il cui contenuto è sensibilmente più alto nel melasso derivato dalla canna. Vengono impropriamente indicati come “melas- Figura 3.2 Melasso. CH2OH O OH H O OH OH n α-1,4 2 < n < 20 Figura 3.3 Unità costituente delle maltodestrine. si” anche residui di estrazione di zuccheri (diversi dal saccarosio) come il glucosio da amido di mais (corn molasse o hydrol) o l’high-test molasse ottenuto dallo sciroppo di canna, che contiene saccarosio e zucchero invertito (miscela di glucosio e fruttosio, ottenuta per azione dell’enzima invertasi) r liscivio solfitico: residuo della lavorazione della cellulosa del legname. Con opportuni trattamenti chimici dal legno si ottiene la solubilizzazione della lignina, con produzione della pasta di cellulosa e di un liscivio solfitico che viene separato per filtrazione e quindi pretrattato per eliminare i residui di anidride solforosa. È un liquido che contiene il 20% circa di carboidrati (esosi e pentosi come xilosio e arabinosio) utilizzabile come substrato nutritivo per lieviti come Saccharomyces, che utilizza gli esosi, e Candida, in grado di metabolizzare anche i pentosi r estratto di malto: impiegato anche in laboratorio come ingrediente di molti terreni di coltura per miceti, deriva dalla maltizzazione dell’orzo, processo basilare anche nella produzione della birra (capitolo 6). L’ammollamento dell’orzo in acqua ne provoca la germinazione, con liberazione delle amilasi contenute nel seme e idrolisi dell’amido. Dopo essiccamento e successivo ammostamento si ottiene un estratto ricco di carboidrati e con il 5% circa di sostanze azotate (soprattutto aminoacidi), che viene commercializzato come sciroppo o in forma solida r siero di latte: è il principale sottoprodotto dell’industria lattiero-casearia, residuo della coagulazione della caseina (principale proteina del latte) nella produzione dei formaggi. Può essere impiegato nella produzione di ricotta e nell’alimentazione animale. 33 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 3 I PROCESSI BIOTECNOLOGICI Tabella 3.3 Fonti di carbonio in forma grezza INGREDIENTE ORIGINE CARATTERISTICHE Melasso Residuo del processo di cristallizzazione del saccarosio Barbabietola: circa il 50% di saccarosio; ricco di fattori di crescita (tiamina, riboflavina, acido folico ecc.) Canna: 30% di saccarosio e 20-30% di zucchero invertito; più elevato contenuto di biotina Altri “melassi” Da sciroppo di canna Residuo del processo di estrazione dell’amido da mais High-test molasse: 15-30% di saccarosio e 40-60% di zucchero invertito Corn molasse o hydrol: 60% di zuccheri, limitato contenuto proteico, alta concentrazione salina Liscivio solfitico Residuo del processo di produzione di cellulosa da legname Orzo maltizzato Spent sulfite liquor o sulfite waste liquor: 10-12% di s.s., di cui il 20% esosi (glucosio, mannosio e galattosio) e pentosi (xilosio e arabinosio) Richiede pretrattamento per eliminare l’eccesso di anidride solforosa Sweet wort: 15% di zuccheri (maltosio e destrine) Siero di latte Residuo del processo di caseificazione Contiene lattosio (4-5%) Fonte di carbonio diluita Cellulosa Residuo agro-industriale Formata da unità di glucosio legate con legame β Utilizzabile tal quale da un limitato numero di microrganismi Contiene il 5% circa di lattosio e viene utilizzato in microbiologia industriale come substrato nutritivo nella produzione di etanolo, acidi organici e biomasse microbiche r amido e maltodestrine: l’amido viene ottenuto soprattutto da patate e mais, e risulta poco idrosolubile. Le maltodestrine (catene polimeriche di glucosio con legame α-1,4-glicosidico e lunghezza variabile da 3 a 17 unità di glucosio) si ottengono per idrolisi dell’amido dei cereali e delle patate in ambiente acido e sono solubili in acqua: sono impiegate nei substrati nutritivi per la produzione di antibiotici. Le maltodestrine trovano impiego nell’alimentazione degli sportivi come supplemento e integratore energetico per la pronta assimilazione e la facile digeribilità, dovuta alla labilità del legame glicosidico fra le unità di glucosio (figura 3.3) r fonti di carbonio non da carboidrati: si possono utilizzare polialcoli come glicerolo, mannitolo e sorbitolo; alcani come le paraffine, oli vegetali (da semi di lino, mais, soia, cotone) e animali (olio di lardo). Gli oli sono impiegati anche come agenti antischiuma. Poiché i principali carboidrati impiegati come substrato nutritivo sono oligo- e polisaccaridi come il saccarosio, l’amido, la cellulosa, nelle produzioni biotecnologiche è indispensabile sottoporre tali polimeri glucidici a trattamenti specifici affinché siano mobilizzati i monosaccaridi utilizzabili dai microrganismi. Fonti di azoto L’azoto può essere ottenuto da (tabella 3.4): r composti inorganici (sali di ammonio) e organici (aminoacidi e proteine, urea) r acqua di macerazione del mais. Sottoprodotto 34 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario I PROCESSI BIOTECNOLOGICI SORGENTI DI CARBONIO E RELATIVO TRATTAMENTO Le materie prime utilizzate nelle produzioni biotecnologiche come fonte di carbonio sono generalmente di provenienza agricola e contengono saccarosio, amido o cellulosa. Per poter rendere disponibile il glucosio contenuto in questi materiali occorre procedere a pretrattamenti che hanno lo scopo di liberarlo dalle forme polimeriche in cui è presente. Il saccarosio è un disaccaride formato da glucosio e fruttosio. Microrganismi come Saccharomyces cerevisiae e Zymomonas mobilis sono in grado di utilizzare questo disaccaride poiché possiedono l’enzima invertasi che libera i due monosaccaridi componenti: con questi microrganismi è quindi possibile impiegare direttamente barbabietole, canna da zucchero, melassi. L’amido è costituito da amilosio e amilopectina: il primo è un polimero lineare del glucosio (legame α-1,4-glicosidico), l’amilopectina è un polimero simile ma a struttura ramificata dovuta alla presenza di legami α-1,6 ogni 20-25 molecole di glucosio. Per ottenere glucosio dall’amido si utilizza un trattamento che si svolge in due fasi successive: dell’estrazione di amido dal mais è sorgente, oltre che di sostanze azotate, anche di vitamine del gruppo B. È fornito in forma liquida concentrata o in polvere r farina di semi di soia e di cotone. La soia viene coltivata per la produzione dell’olio dai semi, che dopo il processo di estrazione forniscono come residuo una farina ad alto contenuto proteico (50%) impiegata nell’alimentazione animale e come ingrediente di substrati colturali in microbiologia industriale. Derivati dei semi del cotone sono impiegati nei terreni per la produzione di antibiotici r borlande di distilleria. Sono così chiamati i residui della produzione di etanolo. Contengono terreno esausto e cellule di lievito e forniscono proteine e vitamine del gruppo B. Fonti di vitamine 3 r gelatinizzazione e liquefazione, attraverso idratazione dell’amido e trattamento con α-amilasi. Vengono idrolizzati i legami α-1,4 e si ottiene una miscela di maltodestrine r idrolisi delle maltodestrine, che si ottiene a pH 4,5 e a 60 °C ad opera di due enzimi: la glucoamilasi, che scinde i legami α-1,4 e α-1,6, e la pullulanasi, che scinde solo quelli α-1,6. I materiali legnosi contengono i polimeri del glucosio cellulosa, emicellulosa e lignina. La cellulosa è formata da catene di glucosio unite da legami β-1,4-glicosidici in catena lineare. L’emicellulosa è un polimero ramificato che contiene esosi (glucosio, galattosio, mannosio) e pentosi (xilosio e arabinosio). I trattamenti per rendere disponibili i carboidrati fermentabili comprendono un trattamento fisico seguito da uno enzimatico, che utilizza le cellulasi endo-β-1,4-glucanasi, eso-β-1,4-glucanasi che liberano cellobioso (dimero del β-glucosio) e quindi le β-glucosidasi che idrolizzano il cellobioso a glucosio. La lignina è un composto fenolico ad alto peso molecolare, polimero composto da unità monomeriche fenilpropiliche. di lievito, in quanto si può ottenere per la naturale azione litica degli enzimi endocellulari dei lieviti in condizioni controllate. L’estratto è ricco di aminoacidi, vitamine del gruppo B, glucosio e polisaccaridi (glicogeno) r peptoni: si ottengono per idrolisi di materiali proteici animali, quali carne, latte, caseina, e vegetali (soia). Ingredienti pressoché universali dei terreni di coltura in laboratorio, sono poco utilizzati in microbiologia industriale per i costi elevati. Minerali I minerali sono in genere forniti in quantità sufficiente dall’acqua e dalle materie prime impiegate nella preparazione dei terreni colturali. Se necessario si possono aggiungere sali di calcio, fosforo, potassio, cloro, magnesio. Le fonti di vitamine possono provenire da (tabella 3.4): r estratto di lievito: è denominato anche autolisato 35 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 3 I PROCESSI BIOTECNOLOGICI Tabella 3.4 Fonti di azoto in forma grezza, di vitamine e fattori di crescita INGREDIENTE ORIGINE CARATTERISTICHE Corn steep liquor Acque di macerazione Sottoprodotto del processo di estrazione dell’amido dal mais Residuo acquoso in cui è stato immerso il mais (pH 4 a 45-50 °C, per 48 h, in presenza di anidride solforosa). Si ha solubilizzazione delle sostanze azotate e fermentazione lattica. Concentrazione fino al 50% s.s. Fonte di sostanze azotate, minerali, vitamine (gruppo B) Composizione variabile: tUJQPEJNBJT tUJQPEJþPSBMBUUJDBFJOUFOTJUËGFSNFOUB[JPOF tUFNQPEJFTUSB[JPOF tUFNQFSBUVSBEJFTUSB[JPOF Svantaggio: conferisce forte acidità al terreno colturale Si addiziona carbonato di Ca Farine vegetali Semi di soia Residuo proteico ottenuto dal processo di estrazione dell’olio (usato anche in mangimistica) Contenuto di proteine 45-55% Molto usate nelle fermentazioni industriali Semi di cotone (Proflo® e Pharmamedia®) Residuo proteico sottoprodotto del processo di estrazione di olio Contenuto di proteine 50-55% Farina impiegata in particolare per la produzione di tetracicline Dal processo di distillazione dell’etanolo Contiene vitamine (niacina e inositolo), proteine derivanti dal lievito e i nutrienti del terreno colturale non utilizzati Contenuto di proteine 25% Residuo solubile di distillazione (borlande) Ingredienti particolari impiegabili prevalentemente quali fonti di vitamine e fattori di crescita Estratto di lievito In polvere o pasta, ottenuto per lisi delle cellule di lievito; costi elevati Ricco di fattori di crescita; impiegato in quantità moderata Idrolizzato di caseina Ottenuto per idrolisi acida o enzimatica; costi variabili Impiegato per microrganismi esigenti Azoto totale 8-13%; azoto amminico 6-7% NaCl: i. acido 38%; i. enzimatico 3% Ceneri: i. acido 40%; i. enzimatico 6% Agenti antischiuma Sistemi tampone Sono sostanze ad azione tensioattiva che riducono la tensione superficiale limitando la formazione di schiuma. Si impiegano oli naturali (che figurano già fra gli ingredienti di normale impiego come sorgente di carbonio) o sintetici come il silicone o il polipropilenglicol, di costo elevato ma inerti dal punto di vista biologico. I terreni colturali sono il più delle volte forniti di propri sistemi tampone, ma possono venire addizionati sali inorganici per la correzione del pH, parametro di fondamentale importanza per la crescita dei microrganismi e la migliore resa produttiva. I più comuni sono il carbonato di calcio, se il sistema tende verso l’acidità, oppure i fosfati se, al contrario, il substrato è troppo alcalino. 36 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario I PROCESSI BIOTECNOLOGICI Precursori Si tratta di sostanze che vengono incorporate dai microrganismi e che andranno a formare parti della molecola che il microrganismo è chiamato a produrre. In questo modo la resa è altamente potenziata. L’esempio più noto è costituito dall’acido fenilacetico precursore della molecola di penicillina G o dall’acido fenossiacetico, precursore della penicillina V. 3.3 I prodotti I prodotti dell’attività microbica, compresi quelli ottenuti per bioconversione in cui i microrganismi svolgono solo alcuni passaggi biosintetici, sono distinguibili in metaboliti primari, metaboliti secondari, biomasse microbiche, enzimi, alimenti (prodotti complessi): r metaboliti primari: essenziali per la vita delle cellule, vengono sintetizzati trasformando le sostanze nutritive fonti di carbonio ed energia in molecole indispensabili alle più svariate funzioni metaboliche, lungo le vie biosintetiche e cataboliche del metabolismo centrale. La produzione di metaboliti primari infatti si verifica soprattutto nella prima fase di crescita dei microrganismi (trofofase), in cui consumo di substrato, di energia e crescita risultano strettamente associati, come nel caso della produzione di etanolo, acido lattico e alcuni aminoacidi. Altri metaboliti primari come gli acidi citrico e fumarico vengono invece prodotti nella fase successiva a quella di crescita (fase stazionaria o idiofase), in quantità generalmente proporzionale alla biomassa microbica 3 r metaboliti secondari: non risultano essenziali per la vita delle cellule microbiche e non mostrano una relazione diretta con la loro crescita. Sono il risultato di biosintesi che si verificano nella fase di crescita rallentata o stazionaria e sono particolarmente diffusi nei microrganismi del suolo e dei sedimenti (attinomiceti, batteri del genere Bacillus, funghi filamentosi). In alcuni casi i metaboliti secondari vengono prodotti a partire da quelli primari, per cui spesso risulta difficile tracciare una netta differenziazione, così come non è chiaro dal punto di vista microbico il significato della loro produzione. Possono svolgere funzioni di protezione da agenti fisici, agire come segnali di comunicazione (quorum sensing) fra le cellule, o di antagonismo nei confronti di altri microrganismi. Molti metaboliti secondari hanno infatti attività antimicrobica: in primo luogo gli antibiotici prodotti dal metabolismo di muffe e batteri filamentosi (attinomiceti). Alcuni metaboliti secondari inibiscono specifiche attività enzimatiche, altri trovano impiego come farmaci antitumorali, antivirali, antimicotici, antiparassitari, immunosoppressori, insetticidi, erbicidi (tabella 3.5) r biomasse microbiche: sono rappresentate dai microrganismi stessi. L’aumento della biomassa (cioè il promuovere al massimo la velocità di riproduzione microbica) costituisce in questo caso lo scopo del processo in cui il prodotto si identifica con il produttore. Il prodotto è il risultato di una intensa attività catabolica di substrati nutritivi ad alta resa energetica che forniscono l’energia necessaria alla fase anabolica per la produzione di nuove cellule. Le biomasse microbiche vengono prodotte in Tabella 3.5 Alcuni esempi di metaboliti secondari con applicazioni biotecnologiche ATTIVITÀ MOLECOLA Antibatterica Penicillina, tetraciclina, eritromicina, vancomicina, daptomicina Antitumorale Daunomicina, bleomicina, calicheamicina, mitomicina Antifungina Amfotericina, echinocandina Immunosoppressiva Ciclosporina, tacrolimus, rapamicina Farmacologica Lovastatina, acarbosio Veterinaria Avermectina, monensina Agronomica Poliossina, bialafos, blasticidina, spinosina 37 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 3 I PROCESSI BIOTECNOLOGICI Tabella 3.6 Esempi di prodotti complessi ottenibili per intervento microbico PREPARAZIONI ALIMENTARI CONSERVAZIONI ALIMENTARI LAVORAZIONI DIVERSE t#FWBOEFBMDPMJDIF t7FHFUBMJGFSNFOUBUJ (crauti, olive ecc.) t.BDFSB[JPOFEJýCSFUFTTJMJ (canapa, lino, iuta) t"DFUP t'PSBHHJJOTJMBUJ t5SBUUBNFOUPEJSJýVUJMJRVJEJFTPMJEJ t5JQJEJMBUUFGFSNFOUBUP t4UBHJPOBUVSBEJDBSOJJOTBDDBUF t1SPEPUUJDBTFBSJ t$JCJPSJFOUBMJGFSNFOUBUJ t5JQJEJMBUUFGFSNFOUBUP quanto utilizzabili come tali in funzione del loro contenuto o per la loro attività su alcuni substrati. Nel primo caso ciò che interessa è il loro contenuto proteico e/o vitaminico e il loro utilizzo in questo senso è quello di integratori alimentari o veri e propri sostituti di fonti nutritive temporaneamente non disponibili (vedi per es. la produzione di SCP, capitolo 4). Per estrazione si possono ottenere enzimi, lipidi, miscele proteico-vitaminiche, RNA. Nel secondo caso, biomasse di saccaromiceti (Saccharomyces cerevisiae) vengono prodotte per essere utilizzate per la lievitazione naturale nel settore della panificazione e dei prodotti da forno. Altri esempi sono costituiti dai lieviti selezionati impiegati in enologia e dalle colture starter di fermenti lattici (in questo caso non si tratta di lieviti ma di batteri) nell’industria lattiero-casearia. In campo ambientale è importante la produzione di colture di batteri azotofissatori (Rhizobacter, Azotobacter) per il biorisanamento (ceppi di Pseudomonas in grado di degradare gli idrocarburi), per la produzione di bioinsetticidi (endotossine ad azione antiparassitaria da colture di Bacillus thuringiensis), per la depurazione delle acque reflue con i fanghi attivi (concentrati di aggregazioni flocculari polimicrobiche ad alta attività degradativa sulla materia organica) r enzimi: costituiscono una parte importante dei prodotti biotecnologici ottenibili dai microrganismi. Nel processo produttivo occorre tenere presente che diversi enzimi (microbici e non) sono normalmente repressi e altri risultano inducibili, cioè vengono sintetizzati esclusivamente in presenza dello specifico substrato. Gli enzimi prodot- ti dai microrganismi sono numerosi e formano un raggruppamento eterogeneo. Da E. coli si ottiene la penicillina acilasi, da Bacillus amilasi e proteasi, da Saccharomyces cerevisiae si ricava l’invertasi. In questo ambito le biotecnologie hanno aperto nuove e ampie possibilità con le tecniche del DNA ricombinante che ha permesso il trasferimento di geni da un organismo a un altro. Per esempio, enzimi termostabili alle alte temperature, prodotti in origine da batteri termofili estremi di difficile coltivazione, vengono ottenuti da ceppi mesofili nei quali è stato trapiantato lo specifico gene codificante: uno dei batteri di più largo impiego in questi casi è E. coli. Altri esempi sono forniti da enzimi amilolitici, da lipasi e proteasi, dalla chimosina ottenuta da ceppi ricombinanti di E. coli r prodotti alimentari: in questi casi tutta la massa di substrato si trasforma nel prodotto in cui, con l’eccezione delle bevande alcoliche, sono presenti anche i microrganismi responsabili (esempio tipico è lo yogurt). Bevande e alimenti ottenuti per via biotecnologica vengono indicati anche come prodotti complessi r bioconversioni: non si tratta di un prodotto vero e proprio quanto piuttosto di una modalità di utilizzo di alcuni microrganismi, che possono essere vantaggiosamente impiegati facendo loro svolgere alcune reazioni in processi che per la parte rimanente utilizzano sintesi chimiche. Ciò avviene per esempio nella bioconversione degli steroidi (paragrafo 4.11) e della vitamina C (paragrafo 4.7), prodotti ottenuti mediante la combinazione di tecnologie chimiche e microbiologiche. 38 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario I PROCESSI BIOTECNOLOGICI 3 Tabella 3.7 Prodotti ottenibili da biomasse microbiche PREPARAZIONI ALIMENTARI Impiego integrale t'VOHIJTVQFSJPSJ commestibili t#JPNBTTFQFSEJFUFUJDB t"MHIF t#JPNBTTFQSPUFJDIF per mangimistica Impiego per t-JTBUJEJMJFWJUJ estrazione t&TUSBUUJQSPUFJDPWJUBNJOJDJ t-JQJEJ t&O[JNJ t3/"FEFSJWBUJ LAVORAZIONI DIVERSE Substrati o ambienti complessi t-JFWJUPQFSQBOJýDB[JPOF t4UBSUFS t'FSNFOUJMBUUJDJ t$PMUVSFB[PUPýTTBUSJDJ t$PMUVSFJOTFUUJDJEF t7BDDJOJ t$PMUVSFQFSGBOHIJBUUJWJ Molecole particolari t#JPNBTTFJNQJFHBCJMJJOCJPUSBTGPSNB[JPOJ 3.4 Fasi produttive: preparazione dell’inoculo In ogni processo definibile come biotecnologico intervengono almeno due componenti fondamentali: la materia prima che costituisce il substrato e i biocatalizzatori con cui questo viene inoculato. Le cellule, o gli estratti cellulari (biocatalizzatori), hanno la funzione di trasformare, con la loro attività metabolica o catalitica, la materia prima e dare origine al prodotto desiderato. Nel caso dell’impiego di cellule microbiche deve trattarsi di colture selezionate (ceppi microbici e colture pure) o rispondere, se si tratta di estratti cellulari, a criteri di elevata purezza. Le caratteristiche fondamentali di un ceppo microbico da impiegare in una produzione biotecnologica sono: r facilità di coltivazione e manipolazione r assenza di qualsiasi carattere di patogenicità r alta velocità di riproduzione r elevata capacità produttiva (ceppo alto-produttore) r stabilità genetica (bassa frequenza di mutazione). Le sorgenti dei ceppi microbici sono le matrici ambientali (aria, acqua, suolo) oppure i materiali più disparati, dovunque si presuma possano trovarsi sostanze nutritive utilizzabili da parte dei microrganismi. La natura del substrato o della matrice da cui si opera il prelievo indirizza di per sé a una selezione dei ceppi microbici che vi si potranno presumibilmente trovare: materiali ricchi di zuccheri potranno fornire lieviti; ambienti anossici con potenziale redox basso o negativo saranno popolati preferibilmente da batteri anaerobi; se si ricercano batteri in grado di utilizzare idrocarburi sarà più probabile reperirli presso pozzi petroliferi o impianti per la raffinazione del petrolio. Le tecniche impiegate per la selezione (screening) di nuovi ceppi microbici o di varianti alto-produttive di ceppi noti vengono descritte nel paragrafo 2.9. Una volta ottenuti i ceppi desiderati, questi possono essere conservati per futuri utilizzi con la liofilizzazione o il congelamento in azoto liquido a −178 °C, sistemi che consentono una conservazione a lungo termine. Altre tecniche in uso per una conservazione a più breve scadenza prevedono l’uso di colture in provetta ricoperte di olio di paraffina e conservate a 0-2 °C. Dalle colture conservate con queste o altre tecniche si preleva all’occorrenza un’aliquota da inoculare solitamente in provetta (slant), utilizzando un terreno agarizzato di composizione appositamente studiata e bilanciata e incubando la coltura in condizioni chimico-fisiche ottimali. Da qui, attraverso successivi passaggi, prenderà le mosse la preparazione dell’inoculo da utilizzare per la semina nel fermentatore (scale-up). 3.5 Lo scale-up Il trasferimento della coltura-starter da un microambiente come quello di una provetta da laboratorio a contenitori della capacità di centinaia di migliaia di litri utilizzati per la produzione industriale non può avvenire troppo repentinamente, ma deve svolgersi in tappe suc39 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 3 I PROCESSI BIOTECNOLOGICI cessive nelle quali l’inoculo è trasferito in contenitori di volume progressivamente maggiore. Ogni trasferimento è intervallato da un periodo di incubazione in condizioni accuratamente controllate. Una simile procedura viene adottata per prevenire traumi nei meccanismi biochimici e fisiologici cellulari dovuti all’enorme differenza fra i due ambienti, che si potrebbero ripercuotere nel ritardato avvio della crescita microbica, in un suo rallentamento o in un vero e proprio arresto. Il volume assai elevato del fermentatore finale di produzione costringe infatti le cellule microbiche a parametri vitali e di attività ad alta disomogeneità, cui devono essere progressivamente abituate. La procedura di scale-up si articola in più fasi (figura 3.4): r la coltura selezionata viene seminata su slant (becco di clarino) Preparazione dell’inoculo e scale-up Coltura liofilizzata Coltura in provetta Coltura liquida da ∼ 5L Fermentatore vegetativo Fermentazione Acqua e nutriente Fermentatore di produzione Figura 3.4 Schema di scale-up e trasferimento in fermentatore di produzione. r la coltura viene trasferita dallo slant in altre provette di terreno, questa volta liquido r si semina quindi in contenitori di capacità più elevata, fino a travasare la brodocoltura in recipienti e in condizioni operative equivalenti al fermentatore finale ma di capacità non superiore al migliaio di litri (minifermentatori) r l’ultima fase prevede il trasferimento dal minifermentatore al bioreattore di produzione. 3.6 I fermentatori o bioreattori I processi fermentativi vengono generalmente effettuati in coltura sommersa, cioè con biocatalizzatori in sospensione o in soluzione in un mezzo di coltura liquido. I fermentatori o bioreattori sono generalmente di grandi dimensioni, costruiti in acciaio inossidabile elettrolucidato, hanno forma cilindrica con aperture di ingresso e di uscita asservite da valvole e sono dotati di numerosi sistemi di controllo (figura 3.5). Devono essere sterilizzabili e poter operare in condizioni di asepsi interna durante l’intero processo produttivo. I fermentatori vengono riempiti fino a circa 2/3 del proprio volume con la brodocoltura, costituita dalle cellule microbiche e dal terreno di coltura, oppure dagli enzimi e dal substrato. Devono essere dotati di un sistema di agitazione meccanica o pneumatica per un’ottimale omogeneizzazione del contenuto e un’uniforme distribuzione della temperatura. I bioreattori destinati alle trasformazioni aerobiche sono forniti di sistemi di aerazione allo scopo di fornire la quantità di ossigeno necessaria a mantenere a livelli elevati gli scambi fra aria e fase liquida. I sistemi ad agitazione pneumatica permettono, con l’immissione di aria, sia di garantire un ambiente aerobico che l’omogeneizzazione della brodocoltura. La temperatura interna viene controllata e mantenuta costante attraverso sistemi di termostatazione, ottenuti generalmente per mezzo della circolazione di acqua calda o fredda in intercapedini che circondano il reattore, oppure in serpentine immerse direttamente nel terreno di coltura. Le valvole che regolano ingressi e uscite possono essere di tipo automatico o manuale, per rispondere nel modo più pratico alle necessità che si possono presentare nel corso del processo produttivo: immissione di sostanze nutrienti dopo l’inoculo delle colture starter; aggiunta di precursori, di sostanze tampone per la cor- 40 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 3 I PROCESSI BIOTECNOLOGICI Motore Nutrienti Rivestimento di raffreddamento Agitatore Prodotto Figura 3.5 Schema di fermentatore ad agitazione meccanica e relativi componenti. rezione del pH; di sostanze antischiuma. Sui condotti di uscita dei gas sono presenti inoltre valvole e manometri per il controllo della pressione interna del bioreattore. È previsto un condotto di uscita con valvola per a) l’eventuale prelievo di materiale allo scopo di effettuare in itinere gli opportuni controlli sulle condizioni microbiologiche e biochimiche della brodocoltura. Il controllo on-line dei vari parametri di processo (temperatura, pH, ossigeno disciolto, velocità di agitazione, pressione interna, livello di schiuma, flusso di gas) viene effettuato per mezzo di appositi sensori, spesso immersi direttamente nel mezzo colturale, che confrontano i valori dei parametri con quelli considerati ottimali e prefissati (set point) facendo eventualmente intervenire le azioni correttive. I bioreattori possono essere classificati secondo criteri diversi: r in base alla tipologia costruttiva r in base ai sistemi di aerazione e di agitazione r in base alle tecniche produttive (sistemi continui o batch, discontinui, fed-batch). Classificazione dei bioreattori in base alla tipologia costruttiva Un fermentatore viene detto monofasico se i costituenti sono tutti in fase acquosa, multifasico se almeno uno di questi è presente anche in fase solida o gassosa. I bioreattori a letto fisso e a letto fluido sono detti bifasici perché presentano una fase acquosa ed una fase solida. Il bioreattore a letto fisso consta di una colonna di materiale inerte su cui è stato immobilizzato il biocatalizzatore, e in cui la materia prima viene immessa Terreno di coltura b) Letto fisso impaccato Prodotti Figura 3.6 Reattore a letto fisso. a) A riciclo totale; b) a flusso continuo. 41 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 3 I PROCESSI BIOTECNOLOGICI Come noto, le cellule microbiche vegetative vengono generalmente eliminate a temperature comprese fra i 50 e 60 °C per una decina di minuti; la distruzione delle spore richiede invece una temperatura di 121 °C per 15 min. È opportuno ricordare che il concetto di sterilità a volte non viene inteso in microbiologia industriale con il significato assoluto di completa assenza di microrganismi, quanto con quello della massima riduzione possibile della flora microbica contaminante compatibilmente con le esigenze operative di produzione. Il numero di cellule e di spore che può teoricamente sopravvivere diminuisce progressivamente con l’aumentare della temperatura di trattamento: l’efficienza della sterilizzazione viene valutata come “probabilità di fallimento” e di norma si opera su livelli pari a 10−3 o 10−4, cioè si definisce accettabile una procedura se un lotto ogni 1000 o 10 000 può risultare contaminato. La sterilizzazione del terreno di coltura e quella del fermentatore possono essere eseguite contemporaneamente oppure in due fasi separate. Nel primo caso si procede alla sterilizzazione del fermentatore contenente il terreno di coltura impiegando vapore ad alta temperatura immesso indirettamente in un sistema chiuso (intercapedine o serpentina) o direttamente nella brodocoltura. Il terreno va mantenuto in continua agitazione per consentire un uniforme scambio del calore. La figura 3.9 mostra la relazione fra tempo di trattamento e temperatura impiegata in relazione alle dimensioni del fermentatore, sia per la fase di riscaldamento che per quella successiva di raffreddamento. La sterilizzazione separata prevede il trattamento termico del fermentatore (vuoto) con immissione di vapore ad alta temperatura. A sua volta il terreno viene 1 2 3 4 90 70 50 I processi di produzione biotecnologica sono riconducibili a tre tipologie principali: r a lotti (fermentazione discontinua o batch) r continui r semicontinui (fed-batch). Nei processi produttivi a lotti la coltura discontinua o batch prevede il progressivo scale-up dell’inoculo iniziale fino alla semina nel reattore di produzione, il mantenimento della coltura per un tempo prefissato e calcolato per la massima resa produttiva, l’interruzione del processo e il recupero dei prodotti. Il terreno di coltura viene sterilizzato separatamente, quindi introdotto nel fermentatore già sterilizzato insieme con la coltura microbica selezionata per la produzione o con il catalizzatore biologico. Il processo viene avviato e monitorato nelle variabili fondamentali per 1 → 200 L 2 → 500 L 3 → 5000 L 4 → 50 000 L 90 70 1 2 3 4 50 0 a) 3.8 Processi batch, continui, fed-batch 110 Temperatura (°C) Temperatura (°C) 110 sterilizzato nel serbatoio in cui è stato preparato, quindi inviato al fermentatore sterile. La tecnica di sterilizzazione maggiormente impiegata è quella HTST (high temperature short time), che prevede il riscaldamento del terreno di coltura fino a 135-150 °C per alcuni minuti, quindi il suo raffreddamento a 60 °C e infine l’immissione nel bioreattore precedentemente sterilizzato. L’aria deve essere sterilizzata prima di essere immessa nel bioreattore: vengono utilizzati filtri a captazione in materiale fibroso (lana di vetro) oppure a cartuccia in materiale polimerico come polipropilene o poliamide. 20 40 60 80 Tempo (min) Fase riscaldamento 100 0 b) 20 40 60 80 100 Tempo (min) Fase raffreddamento Figura 3.9 Temperature e tempi di sterilizzazione in relazione alle dimensioni del fermentatore. a) Andamento della fase di riscaldamento; b) andamento della fase di raffreddamento. 44 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario I PROCESSI BIOTECNOLOGICI controllare il regolare svolgersi della reazione (temperatura, pH, presenza di schiuma, regime del flusso d’aria nei processi aerobi). Quando il prodotto ha raggiunto la concentrazione prevista, il processo viene arrestato, si eliminano il terreno esaurito e il biocatalizzatore (cellule microbiche o enzimi) e si recupera il prodotto finale. Naturalmente, nel caso sia la biomassa ciò che interessa, avviene il contrario. Si dà quindi inizio al nuovo lotto di produzione. È ovvio che in questo caso il biocatalizzatore va rinnovato ad ogni nuovo ciclo produttivo. È il sistema più diffuso, sia per la relativa semplicità delle apparecchiature che per l’ottimizzazione che tale tecnica ha subìto nel tempo. La resa in un processo batch è rappresentata dalla percentuale di substrato trasformata in biomassa e/o in prodotto, e può essere valutata solo al termine del processo. Il coefficiente di resa (Y) indica la quantità di cellule o di prodotto per unità di peso di substrato. I processi in continuo vengono condotti rifornendo il sistema di reazione di sostanze nutritive in modo continuo con una velocità accuratamente programmata per ottimizzare l’efficacia delle reazioni metaboliche dei microrganismi. Nello stesso modo vengono prelevati i prodotti della reazione. Queste tecniche prevedono quindi il rifornimento continuo di nutrienti e la sottrazione di prodotto, mentre al contrario il biocatalizzatore viene conservato e rimane sempre all’interno del fermentatore. Ciò rappresenta un vantaggio ma ha la contropartita di un probabile progressivo deterioramento di qualità ed efficienza del biocatalizzatore, che si cerca di salvaguardare tramite riciclaggio o immobilizzazione. Con il riciclaggio il biocatalizzatore può essere recuperato ma risulta difficile separarlo dalla massa complessiva del prodotto. L’immobilizzazione rappresenta perciò il più delle volte la scelta preferenziale (paragrafo 3.9). Le colture continue (definite anche sistemi aperti) permettono di annullare pressoché completamente i tempi morti tipici dei sistemi batch (sistemi chiusi), di utilizzare reattori di capacità inferiore e quindi di più agevole controllo, nonché di studiare l’influenza di singoli componenti del terreno di coltura. Per avere maggiore produttività si può passare da impianti monostadio, che utilizzano un unico reattore, alla realizzazione di impianti multistadio, costituiti da più reattori in cascata. Un ulteriore vantaggio dei sistemi multistadio è dato dalla possibilità di utilizzare reattori di volume e con tempi di residenza progressivamente maggiori, cia- 3 scuno operante con flora microbica specializzata: sistemi simili vengono impiegati nel trattamento biologico di reflui industriali di difficile depurazione come quelli provenienti da raffinerie. I sistemi continui possono essere classificati in due diverse tipologie a seconda dei sistemi tecnologici di controllo, che sui fermentatori di questo tipo possono essere effettuati in ingresso all’impianto, in uscita, oppure sia in ingresso che in uscita: r nel primo caso (controlli in ingresso) il fermentatore prende il nome di chemiostato, un tipo di reattore in cui la velocità di crescita è controllata dall’esterno dalla velocità di immissione nel sistema di reazione di un substrato limitante (generalmente la fonte di carbonio). Un apposito strumento determina (mediante misura della densità ottica) la concentrazione del nutriente che agisce come fattore limitante, mentre le altre sostanze vengono immesse in eccesso. Il prototipo di questa tecnologia è costituito dal chemiostato monostadio. Un simile impianto però porta alla fuoriuscita, insieme al prodotto finale, di una notevole concentrazione di sostanze nutrienti non utilizzate (quelle immesse in eccesso) che andrebbero perciò perdute. Queste possono essere recuperate predisponendo un sistema multistadio. Un chemiostato quindi esercita un controllo in ingresso sui nutrienti (figura 3.10a) r nel turbidostato non sono previsti substrati limitanti e tutti i nutrienti sono forniti in eccesso. Il bioreattore è dotato di uno strumento che misura la torbidità del flusso in uscita, indice della riproduzione microbica (biomassa cellulare). Il turbidostato effettua quindi un controllo in uscita sulla biomassa (figura 3.10b). Un sistema con funzionamento semicontinuo (fedbatch) si differenzia dal sistema batch in quanto, se in quest’ultimo tutto il substrato nutritivo viene immesso nel fermentatore prima dell’inizio del processo, nel sistema fed-batch il terreno di coltura viene introdotto in un primo tempo in quantità limitata, indicata con V0 e pari a circa 1/10 del volume massimo (Vm). Raggiunta la fase logaritmica della curva di accrescimento, viene immesso un flusso costante di terreno fresco senza però procedere parallelamente allo scarico di materiale. Raggiunto un volume di riempimento prestabilito, si procede allo svuotamento che può essere totale (fed-batch a 45 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario I PROCESSI BIOTECNOLOGICI mero in forma solubile, quindi si provoca la gelificazione del polimero che ingloba le cellule. Si può procedere con modificazioni ioniche o termiche. Per esempio, l’alginato è un polimero solubile in acqua come sodio alginato ma gelifica in presenza di cationi bivalenti o trivalenti. L’agarosio è liquido a 80 °C, gelifica a 45 °C. Gli enzimi vengono immobilizzati con tre tecniche principali: r legandoli a un supporto r aggregandoli fra di loro (enzimi crosslinked) r con l’intrappolamento. 3.10 I sistemi di controllo I processi microbiologici, coinvolgendo organismi viventi, sfuggono il più delle volte a una standardizzazione matematica che ne possa esprimere compiutamente l’andamento, tante e tanto diverse sono le variabili e i parametri in gioco. In microbiologia industriale uno degli aspetti fondamentali è rappresentato dalla standardizzazione e ripetitività dei processi per ottenere caratteristiche costanti del prodotto finale, condizione che si può realizzare esclusivamente esercitando un continuo controllo nonché opportuni interventi di regolazione dei parametri in gioco. Quelli di importanza strategica sono: r la temperatura 3 r l’immissione di aria, la sua concentrazione e la sua pressione r la concentrazione di ossigeno disciolto nella brodocoltura r la concentrazione di CO2 r il pH. Accanto a questi, altre variabili vengono monitorate ed eventualmente corrette quando se ne ravvisi la necessità, relativamente alle caratteristiche dello specifico processo produttivo: r la formazione di schiuma r la viscosità della brodocoltura r la concentrazione dei nutrienti r la concentrazione dei prodotti del metabolismo microbico r la concentrazione della biomassa. I controlli vengono effettuati con tecnologie più o meno sofisticate in modalità off-line e on-line. I controlli off-line, relativi soprattutto al controllo dei parametri biologici (concentrazione della biomassa), vengono effettuati all’esterno del fermentatore in ambiente non sterile e si rivelano utili per la conferma dei dati desunti dalle misure in situ (tabella 3.8). Le misure on-line riguardano in particolare temperatura, pH, concentrazione di ossigeno, di CO2 e di Tabella 3.8 Metodi off-line per la determinazione della biomassa METODO TIPO DI MISURAZIONE COMMENTI Sedimento cellulare Altezza del sedimento in un volume noto Veloce ma approssimativo Peso secco Peso del materiale in sospensione in un volume noto dopo essiccamento Non utilizzabile in terreni contenenti particelle solide Densità ottica 5PSCJEJUË Necessità di diluizioni e non utilizzabile in terreni contenenti solidi Microscopia Conta diretta delle cellule in apposite camere Elevato impegno degli operatori, possibilità di automazione mediante analisi d’immagine Coulter counter Numero di particelle che attraversano un capillare Distribuzione anche volumetrica delle cellule, non utilizzabile con organismi filamentosi o a cellule molto piccole Metodi chimici e fluorescenti Misurazione della quantità di componenti della CJPNBTTB %/" 3/" QSPUFJOF "51 /"%FDD Conta su piastra Numero di colonie che si sviluppano dopo apposite diluizioni Misura delle sole cellule in grado di riprodursi, lunghi tempi di incubazione 47 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 3 I PROCESSI BIOTECNOLOGICI Tabella 3.9 Esempi di applicazioni on-line della flow injection analysis (FIA) COMPOSTO SISTEMA DI ANALISI RILEVAZIONE Glucosio Glucosio ossidasi (membrana) Glucosio ossidasi (cartuccia) Elettrodo H2O2/O2 Chemioluminescenza (rilevazione H2O2 con Luminol) Glucosio ossidasi + catalasi Perossidasi (cartuccia) Saggio enzimatico Fotometro Glucosio deidrogenasi + mutarotasi + indicatore redox Fotometro β-galattosidasi Glucosio ossidasi (cartuccia) Elettrodo O2 Lattosio Lattato Lattato ossidasi (cartuccia) Elettrodo O2 Ammonio /B0)&%5" NFNCSBOF 5SBUUBNFOUJDIJNJDJ Gas-sensori di NH3 Fotometro Urea Ureasi (cartuccia) Gas-sensori di NH3 Fosfato 5SBUUBNFOUJDIJNJDJ Fotometro Penicillina G e V Penicillinasi (cartuccia) Penicillina amidasi (cartuccia) Saggio enzimatico, elettrodo pH Saggio enzimatico Proteine Biureto, bradford Fotometro Aminoacidi 5SBUUBNFOUJDIJNJDJ Fluorimetro alcuni ioni che devono essere misurati direttamente con sistemi in situ o che permettono il prelievo sterile di campioni. I controlli on-line sono effettuati in tempo reale per mezzo di rivelatori a diretto contatto con la biomassa, spesso realizzati con biosensori. I biosensori sono costituiti da supporti su cui vengono immobilizzati cellule, enzimi, biomolecole. Sono sistemi di controllo funzionanti in base all’integrazione di una componente biologica con una componente elettronica impiegata come trasduttore di segnale. La componente biologica può essere costituita da enzimi, antigeni, anticorpi, cellule, biomolecole, che devono in ogni caso essere fissate (immobilizzate) su di un supporto inerte (silicio, polimeri particolari, silicone ecc.). I trasduttori possono essere costituiti da elettrodi, transistor, fibre ottiche, cristalli piezoelettrici. Se il componente biologico subisce modificazioni biochimiche intervenute in seguito a particolari reazioni, queste sono captate dal trasduttore che, a seconda della propria natura, reagisce segnalando in qualche modo la variazione intervenuta. Si distinguono biosensori elettrochimici (impiegati per rilevare variazioni di potenziale redox) termici (rivelano variazioni di temperatura), elettronici (realizzati con semiconduttori, registrano variazioni di proprietà elettroniche successive a reazioni enzimati- che), fotonici (sensibili a variazioni dell’intensità luminosa in seguito a reazioni fotochimiche). La regolazione di una variabile viene effettuata in modo continuo o discontinuo. La regolazione continua è quella più efficace, poiché è quantitativamente dosabile in risposta all’entità della variazione che subisce la variabile. La regolazione discontinua è invece più grossolana e consiste in interventi di stop and go, off-on, apri-chiudi da effettuarsi quando il valore controllato si allontana da quello ottimale. La metodologia FIA (flow injection analysis) è ampiamente utilizzata nei controlli on-line e off-line, e consiste nel prelievo di campioni liquidi che vengono inviati a sistemi automatici di misurazione di parametri su prodotti e substrati (tabella 3.9). La formazione di schiuma può causare problemi anche seri di inquinamento, perdita di materiale per risalita nel condotto di scarico dei gas, diminuzione della resa di processo. Sensori appositamente progettati con sonde e galleggianti inviano un segnale di allarme quando la schiuma raggiunge il livello critico: si attiva così un sistema di pompa che immette nel bioreattore la quantità necessaria di agente antischiuma. Per eliminare la schiuma si possono usare sistemi chimico-fisici o meccanici. Nel primo caso vengono immessi nel siste- 48 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario I PROCESSI BIOTECNOLOGICI ma sostanze in grado di ridurre la tensione superficiale come oli o siliconi sterili. I sistemi meccanici si basano sull’azione di agitatori che centrifugano la schiuma. La regolazione della temperatura, estremamente importante nei processi microbiologici, si può realizzare con intercapedini esterne dove viene fatto circolare il liquido che serve per la termoregolazione oppure con serpentine interne. Un metodo più sofisticato prevede la circolazione della brodocoltura in uno scambiatore a piastre esterno al fermentatore. 3.11 Il recupero dei prodotti (downstream) Ai fini delle modalità di recupero, i prodotti delle trasformazioni biotecnologiche possono essere distinti in: r biomasse microbiche r metaboliti extracellulari (molti antibiotici, alcuni enzimi, acidi organici, acido citrico, etanolo, polisaccaridi, aminoacidi) r metaboliti intracellulari (acidi nucleici, vitamine, enzimi, alcuni antibiotici). Le procedure per isolare i prodotti ottenuti dalle trasformazioni microbiche sono più o meno complesse in funzione della tipologia del metabolita che si vuole recuperare, e influenzano in modo consistente le rese di processo. In linea schematica, al termine di un processo mediato da microrganismi si avrà una brodocoltura in cui si trovano sia le cellule microbiche che il terreno di coltura ormai esaurito. Si deve procedere quindi in primo luogo alla separazione della biomassa dal brodo di coltura residuo. La separazione delle cellule si può effettuare per centrifugazione o per filtrazione: il primo metodo è preferibile per i microrganismi unicellulari, il secondo per quelli filamentosi. Quando l’obiettivo del processo è il recupero della biomassa, la separazione delle cellule costituisce l’evento finale e lascia come prodotto residuo da eliminare il terreno di coltura esaurito. In questo caso risultano generalmente sufficienti semplici operazioni di separazione e lavaggio. Per i prodotti alimentari come lo yogurt non è necessario in genere procedere alla separazione del prodotto, che costituisce un tutto unico con il sub- 3 strato modificato dall’attività microbica. Nel caso delle bevande alcoliche si procede invece alla separazione e all’allontanamento della biomassa. Quando invece l’obiettivo è rappresentato dal recupero di metaboliti, naturalmente è la biomassa che viene eliminata (o piuttosto utilizzata come sottoprodotto in altre linee produttive) per procedere poi alla separazione e purificazione dal filtrato colturale, utilizzando tecniche diverse. Nel caso degli antibiotici molto spesso i prodotti naturali vengono ulteriormente modificati chimicamente (antibiotici semisintetici). È inoltre opportuno distinguere fra metaboliti intraed extracellulari, in quanto naturalmente le strategie di recupero dei prodotti devono in questo caso tenere conto della loro localizzazione: r nel caso dei metaboliti extracellulari primari (per es. acido lattico o acido citrico) o secondari (antibiotici), o dei prodotti che si ottengono per biotrasformazione (per es. acido gluconico), si procede alla separazione del filtrato contenente il prodotto dalle cellule e dagli altri residui insolubili, quindi all’estrazione, concentrazione e purificazione del prodotto. Gli enzimi extracellulari, prodotti dai microrganismi ed escreti nel mezzo colturale, si recuperano agevolmente dal terreno di coltura come frazione delle proteine presenti r nel caso dei metaboliti endocellulari (enzimi e acidi nucleici) occorre naturalmente procedere preventivamente alla rottura degli involucri cellulari. Il recupero dei metaboliti endocellulari può essere effettuato in modi diversi, in relazione alle caratteristiche delle cellule e a quelle del metabolita che si intende recuperare. Le sostanze a basso peso molecolare vengono fatte fuoriuscire dagli involucri cellulari con trattamenti acidi o basici o con solventi idrosolubili. I metaboliti macromolecolari non riescono in ogni caso a fuoriuscire, quindi si deve procedere alla rottura delle cellule. Le metodologie impiegate posso essere diverse: r le tecniche meccaniche impiegano ultrasuoni, sferette di materiale rigido, presse, omogeneizzatori (figura 3.12) r i mezzi fisici impiegano cicli ripetuti di congelamento e scongelamento o la disidratazione r i metodi biologici utilizzano enzimi e antibiotici che inibiscono la sintesi della parete cellulare. Gli enzimi impiegati si differenziano in base al tipo di 49 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 3 I PROCESSI BIOTECNOLOGICI Cellule disintegrate cellule: nel caso di batteri si impiegano lisozima, glicosidasi, endopeptidasi e proteasi; con i lieviti si utilizzano miscele enzimatiche di glucanasi, proteasi e mannanasi r i mezzi chimici consistono nello shock osmotico, nell’uso di acidi e basi, di solventi e detergenti. Sospensione cellulare Non è comunque possibile riunire in uno schema valido per tutti i processi biotecnologici le fasi operative per il recupero e la purificazione dei prodotti, né organizzarle in una sequenza preordinata: non sempre tutte le fasi si rivelano necessarie e non sempre si svolgono nella stessa Figura 3.12 Omogeneizzatore per la disintegrazione di cellule. FLOCCULAZIONE, FLOTTAZIONE E PROCESSI A MEMBRANA La flocculazione consiste nella formazione di aggregati cellulari che sedimentano o rendono più facile la filtrazione. Diversi ceppi microbici tendono naturalmente a flocculare (è un caratteristica di alcuni lieviti), ma il processo può essere accelerato modificando il pH, aggiungendo elettroliti che annullano o diminuiscono la forza di repulsione fra cellule, polimeri sintetici (acrilammide) o naturali (amido, cellulosa, alginati). La flottazione è un processo che permette di separare particelle in sospensione in un liquido quando vengono messe a contatto con un gas (aria). Se si immette aria in una brodocoltura i microrganismi vengono adsorbiti sulle bolle di gas e risalgono in superficie. In questo modo la biomassa risale verso la parte alta del fermentatore insieme con la schiuma, che viene poi allontanata (figura 3.13). La flottazione può essere favorita dall’addizione di acidi grassi a lunga catena e ammine. Nella produzione della birra, i ceppi di lieviti ad alta fermentazione flottano spontaneamente. Un altro esempio di flottazione riguarda la rimozione dei fanghi superficiali nella depurazione delle acque reflue. I processi a membrana separano i componenti di una miscela facendoli passare attraverso una membrana selettiva che separa il retentato (fase trattenuta) dal permeato (fase che riesce ad attraversare la membrana). La forza responsabile della separazione può essere meccanica (pressione idrostatica) o l’applicazione di un campo elettrico; il diametro dei pori e la direzione del flusso (ortogonale o tangenziale) differenziano le varie tipologie di progetto. Alimentazione Raschiatore Uscita liquido Ricircolo Coadiuvante Aria compressa Spurgo Materiale flottato Serbatoio di pressurizzazione Acqua pressurizzata Figura 3.13 Schema di un flottatore. 50 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 3 I PROCESSI BIOTECNOLOGICI successione. L’elenco seguente ha quindi solo carattere orientativo. Si procede generalmente con (figura 3.14): r trattamenti preliminari: consistono, per esempio, nel provocare lisi cellulare per il recupero di metaboliti endocellulari r separazione solido-liquido: si effettua per separare la biomassa e le sostanze solide eventualmente presenti dal substrato colturale. Vengono impiegate a questo scopo tecniche di centrifugazione, sedimentazione, filtrazione, flocculazione e flottazione r concentrazione/purificazione: il prodotto desiderato viene separato da altre componenti con caratteristiche grossolanamente diverse dal punto di vista chimico-fisico. Le tecniche di più comune impiego sono la precipitazione, l’evaporazione, i processi a membrana r purificazione mirata ad alta risoluzione: permette di isolare il prodotto da altre sostanze molto simili. Si impiegano tecniche cromatografiche ed elettroforetiche r formulazione finale: risponde a esigenze di commercializzazione del prodotto, che può venire per esempio liofilizzato, essiccato o cristallizzato. Isolamento del prodotto Filtrazione o centrifugazione Brodo Biomassa Separazione tramite precipitazione, adsorbimento o estrazione Lavaggio Prodotto grezzo Brodo esausto Essiccamento Prodotto finito Smaltimento dopo la depurazione Alimento o mangime Figura 3.14 Schema di isolamento del prodotto finale. 51 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario ESERCIZI DI VERIFICA 1. Rispondi alle seguenti domande: In un processo biotecnologico cosa indicano i termini upstream e downstream? Quali sono i criteri per la scelta di un substrato? Cosa sono i mutanti auxotrofi e quale problema fondamentale deriva dal loro utilizzo? Quali sostanze si usano generalmente in microbiologia industriale come fonte di carbonio? Cosa sono i precursori? Sei in grado di fare qualche esempio? Qual è la differenza fra metaboliti primari e secondari? Cosa si intende per scale-up? Che cosa si intende per bioreattore a letto fluido? Sei in grado di illustrare la differenza fra un sistema continuo, a lotti e fed-batch? Come si possono immobilizzare i biocatalizzatori? 52 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 4 PRODOTTI OTTENUTI DA PROCESSI BIOTECNOLOGICI 4.1 Biomasse microbiche 4.2 Acidi organici 4.3 Etanolo 4.4 Aminoacidi 4.5 Enzimi 4.6 Vitamine In questo capitolo vengono trattati alcuni dei prodotti ottenuti da trasformazioni biotecnologiche: r biomasse microbiche, impiegate integralmente per il loro contenuto oppure in funzione della loro attività su specifici substrati r derivati dal metabolismo primario, cioè prodotti intermedi o finali del metabolismo energetico fermentativo o ossidativo: acidi organici (lattico, acetico, citrico), alcoli e polialcoli (etanolo, glicerolo), aminoacidi, vitamine ed enzimi r antibiotici, derivati dal metabolismo secondario o di biosintesi, accumulati prevalentemente nella fase stazionaria di crescita microbica. Altre produzioni biotecnologiche sono trattate nel capitolo 5: r prodotti da ricombinazione genetica (insulina, interferone, eritropoietina, HGH, somatostatina, vaccini, anticorpi monoclonali) r prodotti ottenuti da bioconversioni (ormoni steroidi) r molecole di elevato interesse nei settori medico-farmacologico, agrario e zootecnico. Tabella 4.1 Esempi di metaboliti primari Acidi organici (lattico, butirrico, propionico, acetico, citrico, fumarico ecc.) Aminoacidi e loro intermedi (acido glutammico, lisina ecc.) Alcoli (etanolo) Polialcol (glicerolo, mannitolo ecc.) Carboidrati Vitamine Nucleotidi e acidi nucleici Lipidi Proteine Colonia del lievito Saccharomyces cerevisiae (Dennis Kunkel Microscopy, Inc.). 53 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 4 PRODOTTI OTTENUTI DA PROCESSI BIOTECNOLOGICI Sono trattate nel capitolo 6 le produzioni biotecnologiche alimentari, note anche come prodotti complessi. 4.1 Biomasse microbiche Il termine biomasse microbiche indica colture di microrganismi che costituiscono esse stesse il prodotto del processo biotecnologico. Sono ottenute per essere utilizzate come tali in funzione del loro contenuto come fonte alternativa di proteine e vitamine, nell’alimentazione umana e animale. Gli studi per l’impiego alimentare di Saccharomyces cerevisiae risalgono all’epoca della seconda guerra mondiale, quando alcuni Paesi dovettero far fronte alle difficoltà di approvvigionamento di fondamentali derrate alimentari. Le biomasse microbiche trovano un altro importante campo di impiego, in funzione della loro attività, come colture selezionate e starter nella produzione del pane e dei prodotti da forno, nell’industria enologica e delle bevande alcoliche, nel disinquinamento ambientale, come colture insetticide. Biomasse microbiche vengono anche utilizzate per l’estrazione di componenti chimici quali enzimi, vitamine, acidi nucleici, lipidi. Le biotecnologie del DNA ricombinante hanno dato notevole impulso a questi specifici settori di ricerca. Biomasse microbiche possono essere ottenute da batteri, lieviti e muffe, in relazione agli obiettivi che si vogliono perseguire e ad altre considerazioni econo- miche e di ordine igienico-sanitario. In genere i batteri possono fornire un discreto contenuto in aminoacidi; i lieviti forniscono un buon contenuto proteico e in vitamine del gruppo B; le muffe hanno un buon contenuto proteico, ma alcuni ceppi producono micotossine. Single cell proteins Le biomasse ad elevato contenuto proteico rappresentano una produzione biotecnologica di particolare interesse. Il termine SCP (single cell proteins) indica microrganismi unicellulari impiegati come fonte proteica. L’idea di utilizzare i lieviti come fonte alternativa di proteine nell’alimentazione umana risale agli anni del secondo conflitto mondiale, ma solo negli anni ’60 del XX secolo furono condotte ricerche mirate per ottenere proteine da microrganismi, allora molto costose, da fonti a quel tempo economicamente convenienti come il petrolio o altri idrocarburi. Furono progettati e realizzati impianti per la loro produzione ma il mutamento delle condizioni economiche e i forti dubbi di ordine tossicologico sollevati dall’impiego dei derivati del petrolio hanno fatto sì che simili tecnologie rimanessero in gran parte allo stadio pilota. La tabella 4.2 elenca alcuni di questi processi. Come si può notare dalla tabella 4.3, è possibile utilizzare tipi diversi di microrganismi per la produzione di SCP, ognuno dei quali presenta aspetti più o meno vantaggiosi. Tabella 4.2 Processi per la produzione di SCP PROCESSO E NAZIONALITÀ MATERIA PRIMA MICRORGANISMO Pruteen (GB) (batteri) Metanolo Methylophylus methylotrophus Bio Protein (N) (batteri) Metano Methylococcus capsulatus Protibel (F) (lieviti) Siero di latte Kluvieromyces lactis Kluvieromyces marxianus Symba (S) (lieviti) Residui amilacei dalle patate Saccharomycopsis fibuligera Candida utilis Pekylo (FL) (muffe) Residui lavorazione legname, addizionato di melasso o siero di latte Paecilomyces variotii Giappone, Messico, Taiwan (alghe) Terreno sintetico (acqua, CO2, sali minerali) in ambiente a elevata illuminazione Spirulina, Chlorella 54 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario PRODOTTI OTTENUTI DA PROCESSI BIOTECNOLOGICI 4 Tabella 4.3 Vantaggi e svantaggi nell’impiego di microrganismi diversi per la produzione di SCP MICRORGANISMI VANTAGGI SVANTAGGI Alghe Autotrofia Facile reperibilità delle materie prime Condizioni ambientali particolari (acqua, luce) Difficoltà di estrazione dall’ambiente Contenuto proteico basso Batteri Facile reperibilità delle materie prime Facilità di adattamento Elevata velocità di riproduzione Elevato contenuto proteico Elevato contenuto di acidi nucleici Produzione di sostanze tossiche Lieviti Buon contenuto proteico Elevato contenuto di vitamine Facilità di separazione Limitata velocità di riproduzione Muffe Facilità di accrescimento Buon contenuto proteico Bassa velocità di riproduzione L’impiego di batteri dà origine a biomasse ad alto contenuto proteico (fino all’80%) ma contemporaneamente anche ad acidi nucleici, con il pericolo di problemi metabolici nell’alimentazione umana e animale. L’ampio range di pH nella coltivazione dei batteri (5-7) può inoltre facilitare le contaminazioni. Le biomasse ottenute da lieviti corrono rischi inferiori di contaminazione per l’azione selettiva del pH (3,5-5) e sono recuperabili con minore difficoltà rispetto ai batteri, che hanno dimensioni notevolmente inferiori. Hanno un buon contenuto proteico (fino al 60%) e una percentuale di acidi nucleici inferiore a quella delle biomasse batteriche. Sono anche un’ottima fonte di vitamine. Le muffe richiedono tempi di sviluppo più lunghi e si sviluppano in un ampio intervallo di pH; in genere si opera a pH inferiore a 5 per evitare contaminazioni batteriche. Il contenuto proteico è buono (fino al 50%) ma nella parete cellulare può essere presente la chitina, che risulta di digestione assai difficile. Poiché diverse muffe producono micotossine, occorre porre attenzione nella scelta del ceppo da selezionare. Come substrati colturali possono essere utilizzati il metano, gli alcani, il metanolo, l’etanolo, il siero di latte, il melasso da barbabietole e canna da zucchero, residui della lavorazione di riso e mais e delle cartiere. L’utilizzo delle n-paraffine che residuano dalla raffinazione del greggio potrebbe rappresentare una soluzione al loro riciclaggio ma, nella biomassa, possono essere presenti residui cancerogeni e tossici. Vengono quindi utilizzati soprattutto siero di latte, melassi e gli alcoli etilico e metilico. L’impiego di SCP riguarda soprattutto l’integrazione proteica nell’alimentazione umana e animale. Lievito per panificazione Il microrganismo utilizzato per la panificazione è il lievito Saccharomyces cerevisiae. I lieviti possono attuare sia un metabolismo fermentativo che respiratorio: il metabolismo ossidativo (figura 4.1) porta alla produzione di biomassa (la più alta resa energetica incentiva la riproduzione cellulare) che poi viene utilizzata nell’industria dei prodotti da forno per ottenere la lievitazione naturale dell’impasto di farina e acqua, con produzione di CO2 e modeste quantità di etanolo che evapora durante la cottura. Un parametro di cui occorre tenere conto in questo tipo di produzione è rappresentato dalla concentrazione del substrato nutritivo zuccherino che deve risultare inferiore a 50 g/L per non incorrere in un effetto inibitore noto come effetto Crabtree: in condizioni di aerobiosi il metabolismo respiratorio-ossidativo viene inibito da concentrazioni zuccherine superiori a 50 g/L. A tali concentrazioni il substrato stesso esplica un’azione di repressione della sintesi degli enzimi del ciclo di Krebs o ne blocca l’attività. Se anche si fornisce ossigeno, prevale comunque il metabolismo fermentativo con 55 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 4 PRODOTTI OTTENUTI DA PROCESSI BIOTECNOLOGICI Saccarosio (melasso) Glucosio-6-fosfato Coltura di laboratorio in agar malto Fruttosio-6-fosfato Coltura in liquido 5 L Piruvato Fermentatore 100 L Ossigeno CO2 CICLO DI KREBS CO2 ATP BIOMASSA CELLULARE Prestadi successivi (rapporto 1/5-1/10) i primi stadi in parziale anaerobiosi gli ultimi in aerobiosi Figura 4.1 Biochimismo della produzione di lievito. la riossidazione per via fermentativa del NADH formato nella glicolisi. La produzione di lievito per panificazione avviene in più stadi (figura 4.2), di cui i primi sono in condizioni di semi-anaerobiosi allo scopo di non deprimere la capacità fermentativa per repressione degli enzimi responsabili. Occorre infatti tenere conto che le condizioni che garantirebbero un’elevata produttività di biomassa non sempre danno origine a cellule dotate di buona capacità fermentativa, che è la caratteristica richiesta per una buona lievitazione dell’impasto. Gli stadi finali sono invece in aerobiosi, cui segue una sosta di un paio d’ore per la “maturazione” delle cellule: in questo lasso di tempo rallentano le sintesi proteiche e si raggiunge una sorta di stabilizzazione fisiologica delle cellule che ne garantisce anche una più lunga conservabilità. La fonte di carbonio è costituita da melasso (saccarosio) che fornisce anche vitamine (biotina), mentre l’azoto è fornito da sali di ammonio e urea. Nitrati e nitriti non vengono utilizzati dal lievito. Vengono aggiunti fosfato di sodio e solfato di magnesio. La temperatura viene mantenuta intorno ai 30 °C, il pH non deve allontanarsi da valori di 4-4,5. Il lievito per panificazione viene commercializzato sotto diverse forme: r lievito compresso (shelf-life di circa 30 giorni a 4 °C) r lievito essiccato e confezionato sottovuoto (shelf-life di un anno a temperatura ambiente) r lievito liofilizzato come integratore alimentare (fonte di vitamine del gruppo B e sali minerali). Per il significato del termine shelf-life vedi il capitolo 10. Stadio finale 250-450 m3 (melasso in feed) resa fermentazione 60 g s.s./L Y = 0,5 Sosta 2 h (maturazione cellule) Separazione per centrifugazione lavaggio cellule crema (17-18% s.s.) Filtrazione sottovuoto in presenza di NaCl (0,5%) lievito compreso (28% s.s.) Bilancio: 240-250 g melasso/L 60 g biomassa/L Confezionamento Figura 4.2 Schema del processo di produzione del lievito per panificazione. Colture insetticide da Bacillus I pesticidi, molecole di impiego universale in agricoltura per il controllo e l’eliminazione dei parassiti dannosi, pongono gravi problemi legati alla loro scarsa o assente biodegradabilità e alla conseguente persistenza nel suolo e nelle acque, matrici ambientali da cui poi entrano nelle catene alimentari fino all’uomo. Queste considerazioni hanno dato notevole impulso alla lotta biologica, con l’obiettivo di ottenere dai microrganismi molecole attive contro gli 56 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario PRODOTTI OTTENUTI DA PROCESSI BIOTECNOLOGICI Tossine in forma cristallina Spore Batteri normalmente presenti nel digerente passano attraverso l’epitelio danneggiato Morte della larva Figura 4.3 Meccanismo d’azione della δ-endotossina di Bacillus thuringiensis. 4 co rendendolo disponibile per la pianta, che a sua volta fornisce al batterio carbonio. Altri batteri azotofissatori vivono liberi nel terreno. La produzione prevede una prima fase colturale in aerobiosi per favorire la riproduzione cellulare, cui segue una seconda fase in carenza di ossigeno per favorire lo sviluppo di nitrogenasi, enzima ossigeno-labile responsabile della fissazione dell’azoto. La brodocoltura di Rhizobium viene miscelata con torba sterile e quindi con i semi delle leguminose da “infettare”, rispettando la specie-specificità come da tabella 4.4. La reazione di fissazione dell’azoto è schematizzabile come segue: Nitrogenasi insetti dannosi. Fra i pregi di tali sostanze si annoverano l’assenza di effetti dannosi dei loro eventuali residui in ambiente, la loro biodegradabilità, il costo economicamente conveniente rispetto agli insetticidi chimici. Vengono impiegate in agricoltura tossine ottenute da specie di Bacillus e colture di Bacillus thuringiensis. Le colture di Bacillus thuringiensis si ottengono su terreno colturale contenente corn-steep liquor, amido, idrolisato di caseina. La sporificazione, che avviene in condizioni di media aerazione alla temperatura di circa 30 °C e pH prossimo alla neutralità, è associata alla produzione di una tossina (δ-endotossina) che non è tossica per l’uomo e gli animali poiché è inattivata a livello gastrointestinale. Il trattamento a base di biotossina (figura 4.3) deve essere effettuato come per i prodotti chimici, poiché il bacillo non persiste in ambiente e non si sviluppa in quantità tali da rappresentare una costante attività insetticida. Gli effetti della tossina si hanno dopo l’ingestione da parte delle larve, che muoiono in seguito alla necrosi cellulare dell’apparato digerente. L’attività di tali bacilli si esplica nei confronti di bruchi e larve di farfalle e falene (Bacillus thuringiensis serovar kurstaki), zanzare e moscerini (serovar israelensis), coleotteri (serovar san diego e tenebrionis). Altri microrganismi impiegati come insetticidi sono Bacillus (Paenibacillus) popiliae e Bacillus sphaericus. Colture di Rhizobium Lo sviluppo dei vegetali è strettamente dipendente, oltre che da altri elementi, dalla disponibilità di azoto. Rhizobium è un batterio endosimbionte delle radici delle leguminose, in grado di fissare l’azoto atmosferi- N2 + 8H+ + 8e– + 16ATP 2NH3 + H2 + 16ADP + 16Pi La nitrogenasi è molto sensibile all’ossigeno, da cui viene facilmente inattivata. I noduli o tubercoli radicali formati in seguito all’infezione da Rhizobium contengono leg-emogobina, molecola dotata di un’elevata affinità con l’ossigeno. La produzione di leg-emoglobina è estremamente importante, in quanto questa molecola si lega all’ossigeno libero abbassandone considerevolmente la concentrazione. Il microrganismo produce inoltre esopolisaccaridi che hanno anch’essi un ruolo nel limitare la diffusione dell’ossigeno. La formazione dei tubercoli radicali si svolge in varie fasi (figura 4.4): r i batteri invadono i peli radicali formando il “filamento di infezione” r i rizobi penetrano nel citoplasma delle cellule radicali r inizia a formarsi un nodulo radicale r i rizobi assumono forme irregolari formando i batteroidi che fissano l’azoto atmosferico, convertendolo in ammoniaca o nitrati. Tabella 4.4 Relazioni tra rizobi e leguminose SPECIE MICROBICA LEGUMINOSA R. galegae R. loti R. meliloti R. leguminosarum biovar. phaseoli biovar. trifolii biovar. viceae Bradyrhizobium japonicum Capraggine Fagiolo, ginestrino Erba medica Fagiolo (piselli, veccia) Trifoglio (piselli, veccia, siratro) Piselli, veccia (trifoglio) Soia, siratro 57 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 4 PRODOTTI OTTENUTI DA PROCESSI BIOTECNOLOGICI Pianta di leguminosa Pelo radicale Rilascio dei flavonoidi Formazione dei noduli radicali Nodulo Batteroidi Tubulo d’infezione I rizobi si trasformano in batteroidi Rizobi Incurvamento del pelo radicale e penetrazione dei rizobi Figura 4.4 Formazione dei noduli radicali. I rizobi instaurano simbiosi con diverse specie di leguminose attraverso un processo d’infezione delle cellule radicali che porta alla formazione di noduli radicali. Acido poli-beta-idrossibutirrico e poli-idrossi-alcanoati da biomasse L’acido poli-beta-idrossibutirrico (PHB) è una sostanza di riserva batterica che alcuni microrganismi come Alcaligenes eutrophus accumulano in quantità notevole all’interno della cellula. Con questo composto si ottiene un materiale plastico biodegradabile lavorabile in fogli e forme cave con cui si ottengono bottiglie e bicchieri. Altri composti simili, per esempio poliidrossialcanoati (PHA), sono impiegati per la produzione di plastiche biodegradabili ottenute da ceppi di E. coli ingegnerizzati in cui sono stati trasferiti i geni di Alcaligenes eutrophus che codificano per il PHA. 4.2 Acidi organici Molti acidi organici si possono ottenere in modo economicamente conveniente dal metabolismo microbico, sia aerobio che anaerobio (figura 4.5). Intermedi primari del metabolismo aerobio sono, per esempio, gli acidi del ciclo di Krebs (acido citrico): non si accumulano spontaneamente ma devono essere ottenuti con interventi sui meccanismi biochimici di regolazione del metabolismo microbico. Altri acidi, come il lattico, l’acetico, il butirrico e il propionico, derivano da vere fermentazioni anaerobiche. Questi ultimi sono prodotti finali del metabolismo microbico, che si accumulano in seguito allo 58 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario PRODOTTI OTTENUTI DA PROCESSI BIOTECNOLOGICI 4 Acidi organici ottenibili dal metabolismo AEROBIO Intermedi ciclo di Krebs Glucosio Ossidazione Ac. fumarico Ac. citrico Altri intermedi Ac. malico Ac. succinico Ac. ossalacetico Ac. cis-aconitico Ac. gluconico Ac. itaconico Acidi organici ottenibili dal metabolismo ANAEROBIO Ac. piruvico Lattici Ac. lattico Propionici Ac. propionico Glicerolo Clostridi Ac. butirrico Clostridi Ac. acetico Figura 4.5 Schema della via di produzione di acidi organici. In figura sono riportati gli acidi organici che derivano dal metabolismo aerobio e anaerobio. sviluppo del microrganismo produttore. L’acido gluconico infine è un esempio di bioconversione in quanto viene ottenuto per ossidazione diretta del glucosio. Acido lattico (fermentazione anaerobia) L’acido lattico viene utilizzato nell’industria farmaceutica e alimentare come acidificante e conservante, in zootecnia come ammonio lattato per l’alimentazione animale, come mordente nella concia delle pelli e per la produzione di polimeri biodegradabili (acido polilattico). La produzione è effettuata impiegando batteri lattici omofermentanti, in quanto gli eterofermentanti (che ugualmente lo producono) liberano anche altre sostanze indesiderate: ciò porta a una diminuzione nella resa del processo, che invece in questo modo può avvicinarsi (almeno teoricamente) al 100%. Il microrganismo maggiormente utilizzato è il Lactobacillus delbrueckii (subsp. bulgaricus) omofermentativo, anaerobio facoltativo e asporigeno, coltivato in tecnica batch su di un substrato costituito da glucosio nella concentrazione di 150 g/L, 0,25% circa di (NH4)2 HPO4, malto, vari fattori di crescita, oltre al 10% circa di CaCO3 che ha lo scopo di tamponare l’eccessivo abbassamento del pH. L’aggiunta di Ca(OH)2 interviene trasformando l’acido lattico in lattato di calcio. La temperatura viene mantenuta intorno ai 45-50 °C (il microrganismo impiegato è un termofilo) con pH prossimo a 6. L. delbrueckii è piuttosto esigente dal punto di vista nutrizionale, come del resto tutti i lattobacilli, e non produce amilasi: per questo è necessario un pretrattamento per mobilizzare gli zuccheri semplici contenuti nella materia prima (melasso, siero di latte, prodotti amidacei) in forma polimerica. Dal punto di vista biochimico il processo coincide con la glicolisi (via EMP), con la successiva riduzione dell’acido piruvico da parte del NADH liberato dalle reazioni di glicolisi e formazione di acido lattico (figura 4.6). Si tratta della tipica fermentazione lattica, con accumulo spontaneo del prodotto finale desiderato senza necessità d’intervento di blocco metabolico come avviene nella produzione di acido citrico. Il terreno di coltura non richiede trattamento di ste59 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 4 PRODOTTI OTTENUTI DA PROCESSI BIOTECNOLOGICI Glucosio Fruttosio-difosfato 2ATP 2ADP 2-Fosfoglicerato 2-Trioso-fosfato 2NADH + H+ 2ATP 2ADP 2-Piruvato 2NAD+ 2-Lattato Figura 4.6 Schema della fermentazione lattica. rilizzazione per l’azione inibente di L. delbrueckii sugli altri microrganismi, relativamente sia al pH che alla temperature di processo. Terminata la fermentazione, la biomassa viene trattata a 80 °C per eliminare i microrganismi, segue una decantazione o filtrazione per recuperare la fase liquida. Questa viene poi chiarificata su carboni attivi, purificata e concentrata. Dopo precipitazione di CaSO4 con acido solforico si ottiene una soluzione di acido lattico che va ulteriormente purificata e concentrata per evaporazione. L’acido lattico viene utilizzato per la sintesi di polimeri biodegradabili (bioplastiche o biopolimeri) che sostituiscono i materiali di origine petrolchimica, con evidente riduzione dell’impatto ambientale, dell’impiego di risorse fossili e delle emissioni di anidride carbonica. L’acido polilattico (PLA) è un poliestere termoplastico biodegradabile molto resistente e utilizzabile in vari impieghi: dalla produzione di bottiglie per le acque minerali a quella di piatti, bicchieri e posate monouso, con doti di resistenza assolutamente paragonabili a quelle delle plastiche tradizionali. Oltre che per via biotecnologica il lattato può essere prodotto anche per via chimica dal lattonitrile, residuo della produzione di acrilonitrile (composto usato nella sintesi di materie plastiche). Acido citrico (fermentazione aerobia) L’acido citrico è impiegato nell’industria alimentare come acidulante e antiossidante (bevande, caramelle), come veicolante del ferro nelle preparazioni farmaceutiche per la sua capacità di complessare i metalli, nella preparazione di detergenti come sostituto dei fosfati, nell’industria chimica per la produzione di materie plastiche e vernici, per ridurre la durezza dell’acqua in quanto complessante di ioni Mg++ e Ca++. Il microrganismo maggior- mente utilizzato è la muffa Aspergillus niger, impiegando come substrati il saccarosio da melasso di barbabietola e il glucosio da amido di mais. Il fatto che la muffa possieda la capacità di produrre amilasi facilita l’impiego di polisaccaridi complessi. Altri microrganismi in grado di produrre acido citrico sono i lieviti Candida (Yarrowia) lipolytica e Candida guilliermondii, ma con rese inferiori. La produzione biotecnologica ha ormai completamente soppiantato la tecnica di estrazione diretta dagli agrumi. I microrganismi utilizzati sono aerobi stretti e mesofili. L’acido citrico è un metabolita intermedio del ciclo di Krebs (ciclo degli acidi tricarbossilici) sintetizzato attraverso la reazione di condensazione dell’acetil-CoA con l’acido ossalacetico, quindi non si accumula spontaneamente come prodotto finale come nel caso dell’acido lattico. Occorre perciò intervenire “dall’esterno” bloccando l’azione dell’enzima aconitasi, che nel ciclo di Krebs agisce a valle dell’acido citrico trasformandolo in acido cis-aconitico. L’attività dell’aconitasi è soggetta all’influenza di vari fattori. È necessario un attento controllo degli ioni ferro e manganese, che a concentrazioni relativamente alte favoriscono l’attività dell’aconitasi: per questo è necessario il pretrattamento del melasso con ferrocianuro che precipita i metalli pesanti. Anche l’acqua impiegata nell’impianto deve essere controllata per il suo possibile alto contenuto di ferro. L’aconitasi è invece inibita dalla presenza di ioni rame, con azione positiva sull’accumulo di acido citrico. Occorre però contemporaneamente tenere conto della possibile inibizione a feedback della fosfofruttochinasi nella seconda reazione della via glicolitica da parte dello stesso acido citrico accumulato (figura 3.1): questo si ottiene in carenza di ioni manganese e abbondanza di ioni ammonio. Fosfofruttochinasi Fruttosio-6-P 60 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario Fruttosio-1,6-PP 4 PRODOTTI OTTENUTI DA PROCESSI BIOTECNOLOGICI O– O C C O CH3 TTP, Mg2+ CO2 NADH+H+ NAD+ C Piruvato decarbossilasi Piruvato H O OH CH2 CH3 Alcol deidrogenasi Acetaldeide CH3 Etanolo Figura 4.8 Fermentazione alcolica. In figura sono riportati i passaggi finali, da piruvato a etanolo, della fermentazione alcolica. de alcoliche a quella cosmetica e delle essenze; è utilizzato come solvente e come combustibile (bioetanolo). Rappresenta un importante precursore di altri tre composti industrialmente importanti: acido acetico, etilene, acetaldeide. A loro volta questi composti sono alla base della produzione di beni di largo consumo come polimeri dell’etilene, acetati di cellulosa ecc. Crisi energetica e progressivo esaurimento delle fonti energetiche non rinnovabili (petrolifere e di gas naturale) hanno spinto la ricerca verso l’utilizzo di etanolo come combustibile e l’incremento della sua produzione da materiali cellulosici oltre che dalle tradizionali fonti di saccarosio e amido. L’etanolo può essere ottenuto sia per via chimica che fermentativa: quest’ultima viene preferita, oltre che per convenienza economica, soprattutto perché consente di utilizzare residui ed eccedenze di varie produzioni agricole e industriali. La produzione di alcol etilico per la preparazione di bevande alcoliche è un processo che risale a tempi remoti. La fermentazione alcolica si può realizzare partendo da una gran varietà di materie prime contenenti zuccheri anche complessi (polisaccaridi) previa la loro idrolisi. Molti microrganismi sono infatti in grado di produrre alcol etilico da substrati zuccherini, amidi, scarti della lavorazione del legno e cellulosa (tabella 4.5). I microrganismi impiegati sono in primo luogo i lieviti Saccharomyces cerevisiae, S. carlbergensis, S. elipsoideus, ma anche batteri come Zymomonas mobilis (anaerobio facoltativo, Gram-negativo). Alcune specie dei generi Bacillus e Thermomonospora sono in grado di effettuare l’idrolisi e la fermentazione della cellulosa. I saccaromiceti (lieviti microaerofili e comunque facoltativi) sono soggetti, per quanto riguarda le loro possibilità metaboliche, all’effetto Crabtree (paragrafo 4.1) e a quello Pasteur. Per l’effetto Pasteur il lievito in condizioni di carenza di ossigeno devia il proprio metabolismo da respiratorio-ossidativo a fermentativo con la produzione di alcol etilico. In condizioni di aerobiosi è invece privilegiata la via respiratoria con aumento di biomassa. La concentrazione di etanolo può portare a fenomeni di inibizione a feedback: l’alcol-tolleranza è infatti una delle caratteristiche ricercate nella selezione dei lieviti per l’impiego industriale. Tale carattere sembra essere legato alla composizione in lipidi della membrana cellulare, con particolare riferimento alla presenza più Tabella 4.5 Nella produzione biotecnologica dell’etanolo il rendimento di alcol etilico dipende dalla fonte di carboidrati utilizzata MATERIA PRIMA CARBOIDRATI % IN ZUCCHERI RENDIMENTO (L/t) Frutta Glucosio, fruttosio Variabile Variabile Canna da zucchero Saccarosio 16 70 Barbabietola Saccarosio 16 100 Patata Amido 75 110 Grano Amido 70 340 Granturco Amido 70 360 Paglia, residui da lavorazione Cellulosa, emicellulosa, del legno e della carta lignina Bassa Basso Residui erbacei Bassa Basso Cellulosa, emicellulosa 62 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario PRODOTTI OTTENUTI DA PROCESSI BIOTECNOLOGICI o meno abbondante di acidi grassi insaturi. L’alcol può diffondere liberamente attraverso la membrana cellulare alterandone la permeabilità e i delicati meccanismi di equilibrio osmotico, con la fuoriuscita del materiale citoplasmatico e la morte della cellula. L’abbondante presenza di acidi grassi insaturi e di opanoidi (molecole simili agli steroli) nella membrana cellulare di Zymomonas mobilis può spiegare perché questo batterio possa produrre etanolo più velocemente e con una resa (97% di quella teorica massima) anche superiore a Saccharomyces cerevisiae (92%), anche se la gamma di fonti di carbonio assimilabili risulta meno ampia rispetto ai saccaromiceti. Ceppi ingegnerizzati di questo batterio, che utilizza per degradare il glucosio la via di EntnerDoudoroff (ED) invece che quella glicolitica di Embden-Meyerhoff-Parnas (EMP) (capitolo 1), vengono progettati per allargare la gamma di substrati assimilabili a pentosi come xilosio e arabinosio e per metabolizzare direttamente cellulosa ed emicellulosa. Nella produzione industriale l’etanolo si ottiene prevalentemente da: r melasso (da barbabietola o canna da zucchero) r amido (da patate e cereali, previa idrolisi) r cellulosa e materiali cellulosici (anche in questo caso previa idrolisi) r siero di latte r residui della preparazione dei succhi di frutta. Il melasso (costituito praticamente da saccarosio) deriva da processi di estrazione a caldo in acqua da barbabietola e canna da zucchero (figura 4.9). Il disaccaride deve poi essere scisso nei monosaccaridi componenti (glucosio e fruttosio) dando così origine a zucchero invertito, così detto perché la miscela dei due monosaccaridi inverte il potere rotatorio della luce polarizzata rispetto al disaccaride d’origine. Grano, granturco (che devono essere prima macinati) e patate vengono sottoposti a cottura e liberano una gelatina amidacea da cui si ottiene glucosio per azione idrolitica delle amilasi e della maltasi: questi enzimi vengono addizionati come tali ma può essere convenientemente impiegato anche malto (orzo germinato). La cellulosa si può ricavare dai residui della lavorazione del legno e della carta, da paglia e residui erbacei. Anche se il costo di partenza è indubbiamente inferiore ad altre materie prime, i pretrattamenti che tali materiali devono subire non rendono l’impiego di cellulosa par- 4 Melasso Diluizione del melasso Mosto Inoculo del mosto Fermentazione Fuseloil Prodotti Glicerina Etanolo Figura 4.9 Schema della produzione di etanolo dal melasso. ticolarmente conveniente dal punto di vista economico. La degradazione della cellulosa e dei materiali che la contengono può essere eseguita per via chimica per mezzo di trattamento con acidi forti o per via biochimica per mezzo di enzimi (cellulasi) prodotti da microrganismi (Trichoderma rosei, Aspergillus niger, Cellulomonas spp., Clostridium thermosaccharolyticum). Il pretrattamento è sempre necessario e consiste nella triturazione del materiale utilizzato fino a ridurlo in frammenti estremamente piccoli. Il miscuglio che si ottiene ha un aspetto colloidale e su di esso vengono inoculati i microrganismi produttori di cellulasi, dopo aver subìto una preincubazione su terreni colturali arricchiti per ottenere una notevole quantità di biomassa. I substrati impiegati per la fermentazione alcolica vengono anche indicati complessivamente con il nome di mosto, che viene portato a un pH prossimo a 4,5, addizionato di fosfato e ammonio per ottimizzare l’attività metabolica dei microrganismi di fermentazione e mantenuto alla temperatura di circa 20 °C. L’inoculo, a partire dal ceppo selezionato in coltura pura in provetta, viene preparato con successivi passaggi di scale-up fino ad ottenere il cosiddetto “lievito madre” con cui si procede all’inoculo del mosto in ragione del 5% circa in volume. La fermentazione viene condotta in anaerobiosi in bioreattori in discontinuo STR a temperatura compresa generalmente fra 25 e 30 °C. Produ63 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 4 PRODOTTI OTTENUTI DA PROCESSI BIOTECNOLOGICI zioni più efficienti si ottengono utilizzando fermentatori di tipo continuo CSTR (continuous stirred tank reactor) e altri a torre a letto fluido. Entrambi prevedono l’immobilizzazione dei microrganismi in sospensione o su supporti a letto fisso. L’etanolo viene separato tramite distillazione dagli altri prodotti di fermentazione, fra cui il fuseloil e la glicerina. Il primo è una miscela di alcoli superiori (amilico, isobutilico ecc.), acidi organici, esteri e aldeidi che può rimanere in piccola percentuale in diverse bevande alcoliche. La resa teorica della conversione zucchero/alcol si ricava dall’equazione: C6H12O6 (pm 180) 2C2H5OH (pm 46 × 2 = 92) + 2CO2 (pm 44 × 2 = 88) + ATP da cui: 180 : 92 = 100 : x x = 51,1 quindi da 100 g di substrato si ottengono 51,1 g di etanolo e 48,9 g di CO2 con un fattore di conversione di 0,51. La resa reale è inferiore a quella teorica, per cui da 100 g di substrato si ottengono circa 48 g di etanolo, 47 g di CO2, 3 g di glicerolo, 1 g di biomassa, 1 g di altre sostanze. Volendo misurare l’alcol in volumi, poiché V = massa/densità COOH H2N C COOH H H C R R L-aminoacido D-aminoacido NH2 Figura 4.10 L e D aminoacidi. In figura sono mostrati aminoacidi generici in conformazione L e D. si ottengono miscele racemiche delle forme l ed r (figura 4.10). Poiché l’organismo umano non è in grado di sintetizzare otto aminoacidi (aminoacidi essenziali), la microbiologia industriale ha indirizzato i propri sforzi verso la loro produzione. Gli aminoacidi vengono estratti per idrolisi dalle proteine, per fermentazione, per bioconversione enzimatica, per sintesi chimica. Per le produzioni biotecnologiche il substrato maggiormente utilizzato è il melasso, integrato da composti azotati organici e inorganici. Per i processi di sintesi chimica si utilizzano sostanze organiche, mentre se gli aminoacidi vengono estratti da proteine si utilizzano materiali proteici di scarto. Il microrganismo più utilizzato è Corynebacterium glutamicum, ma vengono impiegati o almeno studiati anche Brevibacterium flavum, E. coli, Bacillus licheniformis, oltre ai lieviti Candida humicola e Saccharomyces cerevisiae. e la densità dell’alcol puro è 0,79, si avrà: 0,51/0,79 = 0,64 (coefficiente teorico di conversione zucchero-alcol). 4.4 Aminoacidi Gli aminoacidi trovano impiego nell’alimentazione umana e animale come integratori, sia quando l’organismo non può sintetizzarli sia quando si deve sopperire a carenze nutrizionali in diete povere di proteine. La produzione biologica presenta diversi vantaggi rispetto a quella chimica, anche e soprattutto perché microrganismi ed enzimi di derivazione cellulare sono specifici per la produzione di l-aminoacidi (la forma biologicamente attiva, con l’unica eccezione della metionina per la quale entrambe le forme d e l sono attive), mentre con la sintesi chimica Produzione di L-lisina La lisina è un aminoacido essenziale impiegato come integratore nell’alimentazione umana e animale. La produzione di lisina si può effettuare anche per via sinteticochimica, ormai sostituita da quella biologica per ragioni economiche. La via biotecnologica si basa sull’utilizzo di due intermedi metabolici dei microrganismi: acido piruvico e semialdeide aspartica. Questi due composti reagiscono per condensazione formando l’acido 2,6-diidropicolinico da cui, attraverso la formazione di acido diaminopimelico, si ottiene l-lisina. C. glutamicum metabolizza il glucosio producendo oltre alla l-lisina, anche l-treonina e l-metionina. La presenza contemporanea di lisina e treonina può portare a inibizione a feed-back della produzione di semi- 64 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario PRODOTTI OTTENUTI DA PROCESSI BIOTECNOLOGICI aldeide aspartica e quindi, in ultima analisi, a quella di l-lisina. Si cerca perciò di utilizzare ceppi batterici privi della capacità di produrre gli enzimi coinvolti nella sintesi di treonina. Quantità minime di treonina e metionina devono in ogni caso essere fornite nel terreno di coltura per permettere la sintesi delle proteine e di conseguenza la riproduzione cellulare. Per l’impianto di produzione si utilizzano fermentatori di tipo STR con agitazione air-lift in coltura sommersa, a pH compreso fra 6 e 8. Per la purificazione del prodotto finale, che deve essere molto spinta, si utilizzano centrifugazione e filtrazione seguite da trattamenti con resine a scambio ionico. La soluzione ottenuta viene concentrata e ulteriormente filtrata; si procede quindi alla cristallizzazione ed essiccazione dell’aminoacido. Produzione di acido glutammico L’acido glutammico, prodotto anch’esso da colture di Corynebacterium glutamicum, viene utilizzato nell’induGlucosio Fruttosio-6-fosfato Fruttosio-1,6-difosfato CO2 Acetil-CoA CoA Citrato TCA Succinato KDH cis-Aconitato Isocitrato α-chetoglutarato stria alimentare come esaltatore di sapidità. Viene sintetizzato dall’acido α-chetoglutarico, un intermedio del ciclo di Krebs, e accumulato come metabolita endocellulare (figura 4.11). L’accumulo di acido glutammico è regolato dagli enzimi: r l-glutammato deidrogenasi (GDH), che catalizza la trasformazione di α-chetoglutarato in l-glutammato r α-chetoglutarato deidrogenasi (KDH), che catalizza la trasformazione di α-chetoglutarato in succinato. Nel processo industriale viene inibita la KDH e favorita l’azione della GDH con conseguente accumulo di prodotto. Il possibile effetto feedback da alti livelli endocellulari di glutammato si previene aumentando la permeabilità cellulare, per cui il prodotto viene accumulato in ambiente extracellulare. I ceppi produttori di acido glutammico sono molto esigenti in biotina, che deve essere presente in concentrazione subottimale nel terreno di coltura come cofattore dell’enzima acetil-CoA carbossilasi. Una concentrazione di biotina superiore a 5 mg/L favorisce la formazione regolare della membrana cellulare, condizione che impedisce la fuoriuscita di glutammato dalla membrana e l’effetto di inibizione a feedback sulla sua sintesi. Concentrazioni inferiori portano a carenza di fosfolipidi di membrana e aumentata permeabilità con fuoriuscita del prodotto. 4.5 Enzimi Piruvato Ossalacetato 4 GDH Glutammato Figura 4.11 Schema della via di sintesi dell’acido glutammico. Gli enzimi, proteine ad azione catalitica coinvolti nelle reazioni del metabolismo cellulare, sono impiegati in molti settori, da quello alimentare a quello medico-diagnostico, farmacologico, industriale (tabella 4.6). La produzione biotecnologica degli enzimi ha sostituito pressoché totalmente quella basata sulla loro estrazione dalle cellule in cui hanno origine. I microrganismi impiegati nella loro produzione appartengono a ceppi selezionati, o ingegnerizzati con la tecnologia del DNA ricombinante per rispondere a specifiche esigenze industriali. L’ingegneria genetica contribuisce in modo determinante e con ampie prospettive di successo alla creazione di ceppi microbici modificati in cui viene inserito il gene per la produzione di uno specifico enzima insieme con quello relativo alla sua espressione. I microrganismi modificati (soprattutto batteri del genere Bacillus e muffe appartenenti al genere Aspergillus) ven65 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 4 PRODOTTI OTTENUTI DA PROCESSI BIOTECNOLOGICI Tabella 4.6 Enzimi prodotti per via biotecnologica e settori di applicazione ENZIMA CAMPO DI APPLICAZIONE Glucosiossidasi (GOD) Ricerca diagnostica del glucosio Perossidasi (POD) Ricerca diagnostica del glucosio Ureasi Determinazione dell’urea Rennina Industria lattiero-casearia Amilasi Industria della birra Proteasi Industria di detergenti Asparaginasi Terapia dei tumori Tripsina Industria farmaceutica gono poi coltivati in condizioni che ne permettono un veloce accrescimento e un’elevata produttività. I terreni di coltura utilizzati contengono generalmente substrati amidacei o comunque fonti diverse di carboidrati, fattori di crescita, sali minerali, fonti di azoto (urea o sali d’ammonio) e dipendono ovviamente sia dalle esigenze specifiche del microrganismo da coltivare che dalle caratteristiche biochimiche dell’enzima che si vuole ottenere. Uno schema generale della produzione di enzimi è riportato in figura 4.12. Una suddivisione degli enzimi microbici distingue tra: ❖ enzimi endocellulari, il cui utilizzo richiede la preventiva lisi delle cellule produttrici. Alcuni sono idrolitici, come la penicillina-acilasi da E. coli, altri sono non idrolitici come la catalasi e la glucosioossidasi da Aspergillus niger ❖ enzimi extracellulari, facilmente recuperabili dalla filtrazione della brodocoltura. Sono prevalentemente idrolitici (idrolasi), impiegati per la degradazione di polimeri (polisaccaridi, cellulosa, emicellulose, pectine, proteine, lipidi) ❖ enzimi di superficie, come le disaccaridasi (maltasi, invertasi, lattasi, cellobiasi) presenti soprattutto nella parete cellulare dei lieviti, che infatti non possono utilizzare direttamente i polimeri ma (oltre ai monosaccaridi) solo di- e trisaccaridi. Le amilasi sono enzimi esocellulari presenti naturalmente nel malto d’orzo (orzo germinato) in grado di scindere il legame 1,4-glicosidico che tiene legate le molecole dei monosaccaridi nell’amido e in altri polisaccaridi. Vengono liberate in primo luogo le destrine (polimeri a corta catena) quindi i disaccaridi e infine il glucosio. La α-amilasi dà origine a glucosio e maltosio, mentre la β-amilasi solamente a maltosio. Si impiegano prevalentemente le α-amilasi di origine batterica prodotte da ceppi selezionati di Bacillus licheniformis e B. amyloliquefaciens o dalla muffa Aspergillus oryzae. Esempi del loro utilizzo industriale sono la produzione di sciroppi di glucosio e fruttosio da materiali amilacei, l’impiego nei prodotti da forno lievitati per il miglioramento della crosta superficiale, la rimozione dell’amido nei detergenti biologici. La β-galattosidasi o lattasi, ottenuta soprattutto da ceppi di Kluyveromyces, viene impiegata per la scissione del lattosio negli alimenti destinati ai soggetti intolleranti al disaccaride, e nella produzione di gelati per prevenire la granulosità dovuta alla presenza di lattosio. La , (prodotta da Aspergillus, Corynebacterium e Micrococcus) viene usata fra l’altro nel trattamento delle lenti a contatto. L’asparaginasi è di grande importanza in medicina per la sua azione antitumorale nella terapia di alcune forme di leucemia in cui si assiste a una proliferazione incontrollata di globuli bianchi. Tali cellule tumorali richiedono l-asparagina, che invece viene scissa dall’enzima asparaginasi in ammoniaca e acido aspartico. I microrganismi impiegati per la produzione di asparaginasi sono alcuni ceppi mutanti di E. coli e Serratia marcescens, ottenuti da mutazioni spontanee o indotte o anche con la tecnologia del DNA ricombinante. Le lipasi catalizzano l’idrolisi dei trigliceridi in glicerolo e acidi grassi e sono prodotte da funghi. Vengono impiegate nei detersivi per lavatrici e lavastoviglie, settore in cui la ricerca è rivolta alla produzione di lipasi termostabili per trattamenti a temperature elevate. Proteasi alcaline sono prodotte da B. amyloliquefaciens e vengono impiegate nei detersivi per rimuovere grassi e sostanze proteiche dai tessuti. Nell’industria casearia il caglio di origine naturale estratto dall’abomaso (IV stomaco) dei ruminanti viene sostituito da proteasi acide (rennina) prodotte dalla muffa Rhizomucor pusillus o da chimosina ricombinante ottenuta dal lievito Kluyveromyces lactis. Enzimi pectinolitici vengono utilizzati per l’estrazione di succhi vegetali o a scopo chiarificante in molte bevande. 66 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario PRODOTTI OTTENUTI DA PROCESSI BIOTECNOLOGICI Cellule Coltura semisolida Enzima extracellulare 4 PREPARAZIONE LIQUIDA Separazione Standardizzazione Surnatante MICRORGANISMO Stabilizzazione Coltura in liquido Enzima extracellulare Enzima intracellulare Concentrazione Surnatante Rottura cellule Purificazione Essiccamento Standardizzazione Residui cellulari PREPARAZIONE IN POLVERE Figura 4.12 Enzimi microbici. Schema di produzione degli enzimi microbici con coltura liquida o semisolida. La penicillina acilasi prodotta da ceppi mutanti di E. coli viene utilizzata per ottenere acido penicillanico, precursore delle penicilline. Anche la Taq polimerasi e la DNA polimerasi, utilizzate nella PCR vengono ottenute da processi fermentativi. Gli enzimi vengono utilizzati il più delle volte dopo la loro immobilizzazione su una matrice di supporto. 4.6 Vitamine Le vitamine sono sostanze organiche indispensabili alla vita degli organismi. Svolgono funzioni di mantenimento dell’integrità delle membrane biologiche e di bioregolazione metabolica: molti coenzimi rappresentano la forma attiva di altrettante vitamine (tabella 4.7). Vengono suddivise in due gruppi: ❖ vitamine idrosolubili (B1, B2, B12, C), solubili in acqua ❖ vitamine liposolubili (A, D, E, K), solubili nei solventi dei grassi. La vitamina B12 (cianocobalamina) ha una formula complessa in cui si individuano tre frazioni diverse: un sistema ad anello simile a quello porfirinico dell’emoglobina (ma con al centro uno ione cobalto), una deossiadenosina e un ribonucleotide (figura 4.13). I microrganismi utilizzati per la produzione della vitamina B12 sono Propionibacterium shermanii, Propionibacterium freudenreichii, Streptomyces olivaceus, Pseudomonas. La produzione avviene in coltura sommersa a pH 7 su terreni contenenti substrati nutritivi zuccherini, oltre a sali di cobalto e ioni cianuro. Le fasi della produzione risultano piuttosto complesse. Il ceppo produttore, selezionato e isolato su terreno agarizzato, subisce un processo di scale-up colturale per trapianti successivi in terreni liquidi di volume sempre maggiore, fino ai fermentatori di vegetazione. La percentuale dell’inoculo viene mantenuta costante, intorno al 5% del volume della biomassa nel fermentatore di produzione. I bioreattori sono generalmente di tipo STR con agitazione meccanica. La produzione viene effettuata in aerobiosi a una temperatura di circa 26 °C, cui segue la morte delle cellule in concomitanza del progressivo esaurimento delle sostanze nutritive. L’estrazione del prodotto comprende diverse fasi, che prevedono l’ebollizione della brodocoltura, quindi il suo raffreddamento e filtrazione, più fasi di estrazione con alcol, precipitazione con miscela acetone/etere, estrazione su colonna e cristallizzazione. Gli impieghi principali della vitamina B12 sono quello di integratore per l’alimentazione animale (mangimi) e quello farmaceutico. Per l’impiego farmaceutico è naturalmente richiesto un elevatissimo grado di purezza 67 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 4 PRODOTTI OTTENUTI DA PROCESSI BIOTECNOLOGICI Tabella 4.7 Vitamine come coenzimi VITAMINA COENZIMA SIGLA Tiamina Tiamina pirofosfato TPP Decarbossilazione Riboflavina Flavinmononucleotide Flavinadenindinucleotide FMN FAD Trasporto di idrogeno Niacina Nicotinamide adenindinucleotide Nicotinamide adenindinucleotide fosfato NAD+ NADP+ Trasporto di idrogeno Biotina Biocitina Bt Trasporto di carbossile Piridossina Piridossalfosfato PLP Transaminazione e decarbossilazione degli aminoacidi Acido pantotenico Coenzima A CoA Trasporto di gruppo acilico R CH3 H3C CH2CONH2 NH2COCH2CH2 NH2COCH2 CH2CH2CONH2 H3C N H3C N Co+ N N CH3 NH2COCH2 CH3 NHCOCH2CH2 CH3 H3C CH2CH2CONH2 CH2 CH O O- N CH3 N CH3 O O O OH H H H HOCH2 O Vitamina B12 (cobalamina) H FUNZIONE del prodotto, che si ottiene in primo luogo con l’utilizzo di ceppi batterici selezionati di Pseudomonas, che come prodotto metabolico forniscono pressoché esclusivamente la vitamina (mentre altri batteri producono, insieme con la cianocobalamina, anche antibiotici), quindi con più complessi sistemi di estrazione, purificazione con tecniche cromatografiche e successiva cristallizzazione. La vitamina B2 (riboflavina) viene prodotta dal fungo filamentoso Eremothecium gossypii impiegando una via metabolica complessa che parte dall’acetil-CoA derivato dalla β-ossidazione degli acidi grassi. I carotenoidi (precursori della vitamina A) sono impiegati come coloranti alimentari, come integratori nella prevenzione delle malattie cardiovascolari e come antitumorali per la loro spiccata azione antiossidante. Vengono estratti dai vegetali o prodotti per sintesi chimica, ma sono prodotti anche per via fermentativa dal fungo filamentoso Blakeslea. La vitamina C è invece un esempio di bioconversione (paragrafo 5.6). Figura 4.13 Formula della vitamina B12. 68 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario ESERCIZI DI VERIFICA 1. L’informazione genetica per la produzione di vitamine: A deve essere introdotta nel microrganismo B è contenuta completamente nel microrganismo C è presente nel microrganismo solo in parte 2. Le biomasse microbiche vengono utilizzate per: A il loro contenuto B la loro attività C entrambe queste funzioni 3. L’acronimo SCP indica: A cellule eucariotiche o procariotiche B solo cellule di mammifero C solo cellule procariotiche 4. L’effetto Crabtree che si verifica nei lieviti consiste: A nell’inibizione del metabolismo fermentativo B nell’inibizione del metabolismo ossidativo respiratorio C nel blocco della sporificazione 5. La tossina di Bacillus thuringiensis: A viene inattivata a livello gastrico nelle larve B blocca la riproduzione degli insetti parassiti C elimina le larve degli insetti causando la necrosi dell’apparato digerente 6. L’acido poli-beta-idrossibutirrico è prodotto da: A lieviti B alcune alghe C batteri del genere Pseudomonas D batteri del genere Alcaligenes 7. L’effetto Pasteur che si registra nei lieviti saccaromiceti consiste nel passaggio da: A metabolismo respiratorio a fermentativo se manca ossigeno B metabolismo fermentativo a ossidativo se manca ossigeno C metabolismo ossidativo a fermentativo in presenza di abbondante aerazione 69 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 5 PROTEINE UMANE RICOMBINANTI, ORMONI E ANTIBIOTICI 5.1 Produzione biotecnologica di proteine umane 5.2 Produzione di vaccini 5.3 Produzione di anticorpi monoclonali 5.4 Produzione di interferoni 5.5 Produzione di ormoni 5.6 Bioconversioni 5.7 Produzione di antibiotici 5.8 Classi strutturali e meccanismo d’azione degli antibiotici 5.9 Produzione di penicilline e cefalosporine 5.10 Statine e altre molecole di impiego medico e zootecnico I meccanismi alla base dell’espressione in proteine delle informazioni contenute nel genoma sono noti da tempo. I progressi della tecnologia del DNA ricombinante, relativamente più recenti, hanno reso possibile il trasferimento dei geni codificanti per proteine di interesse e la loro espressione in ospiti diversi da quelli originari. Tale processo può essere indicato come produzione di proteine ricombinanti, che si accumulano nelle cellule ospiti in quantità significativa. Poiché tali cellule sono prevalentemente microrganismi, la loro coltura e la loro manipolazione risulta agevole ed economicamente conveniente. I vaccini ricombinanti, gli anticorpi monoclonali, gli interferoni sono esempi di proteine di interesse medicofarmacologico prodotte in questo modo. La produzione di antibiotici occupa un ruolo di primissimo piano nella terapia delle malattie infettive, mentre le bioconversioni sono un esempio di come i microrganismi possono sostituire o affiancare la chimica svolgendo alcune reazioni in modo più rapido e conveniente. 5.1 Produzione biotecnologica di proteine umane Uno dei settori in più rapido sviluppo in campo biotecnologico è indubbiamente quello delle biotecnologie farmaceutiche. Fra i prodotti biotecnologici che interessano il settore farmaceutico, la produzione di proteine umane ha registrato uno sviluppo straordinario dall’avvento delle tecniche del DNA ricombinante. La preparazione, la caratterizzazione, la somministrazione e la farmacocinetica di questi composti biotecnologici ad alto peso molecolare 70 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 5 PROTEINE UMANE RICOMBINANTI, ORMONI E ANTIBIOTICI Gene Vettore di espressione Trasformazione delle cellule ospiti Espressione Purificazione Proteine ricombinanti Altre proteine r in primo luogo occorre individuare la sequenza nucleotidica o il gene che contiene l’informazione per la sintesi della proteina di interesse r la sequenza nucleotidica (gene) ottenuta, insieme con le sequenze nucleotidiche che ne regolano l’espressione, viene inserita tramite un vettore in una cellula coltivabile r questa cellula diventa il “sistema di espressione” che si incaricherà di fabbricare la proteina r la proteina una volta prodotta deve essere estratta dal sistema di coltura e purificata, operazione che deve essere svolta in modo da raggiungere la massima purezza possibile del prodotto. Secrezione Sistemi di espressione Figura 5.1 Passaggi della produzione biotecnologica di proteine. sono aspetti che spesso differiscono sostanzialmente da quelli tipicamente relativi ai prodotti convenzionali a più basso peso molecolare. Si ricordano schematicamente i punti basilari della produzione biotecnologica delle proteine (figura 5.1): LA GLICOSILAZIONE DELLE PROTEINE La maggior parte delle proteine d’impiego farmacologico ottenute con la tecnologia del DNA ricombinante sono glicoproteine, caratterizzate cioè dalla presenza di catene laterali oligosaccaridiche (figura 5.2). Questa loro caratteristica ne influenza molte proprietà, come la solubilità, la stabilità e il tempo di dimezzamento. La glicosilazione di una proteina non è determinata direttamente dalla sequenza del DNA, ma è un processo enzimatico che avviene in una fase successiva alla sua produzione (traduzione), dipendente in buona misura dall’ambiente cellulare in cui la proteina viene sintetizzata. Risulta quindi piuttosto difficile controllare l’intero processo, poiché struttura e composizione dei carboidrati nelle proteine ricombinanti risultano a volte diverse da quelle delle molecole originali, in quanto gli enzimi indispensabili alla sintesi differiscono al variare dei sistemi di espressione: ne sono esempi l’interleuchi- Le proteine di impiego terapeutico vengono prodotte utilizzando come sistemi di espressione cellule procariotiche (batteri) o eucariotiche (cellule di lievito o animali). Teoricamente, un organismo manipolato geneticamente è in grado di produrre qualsivoglia proteina, ma in molti casi ciò non è possibile: i procarioti, per esempio, per la natura dei loro sistemi di espressione che sono diversi da quelli degli eucarioti, possono produrre proteine più o meno degradate; inoltre i batteri non possono produrre proteine glicosilate, che ne rappresentano spesso la forna 4, la gonadotropina corionica, l’eritropoietina o l’attivatore tissutale del plasminogeno. - NH2 Proteina - COOH Asn N-acetilglucosammina Catena laterale Mannosio Di solito un’asparagina Glucosio Figura 5.2 Glicosilazione delle proteine. 71 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 5 PROTEINE UMANE RICOMBINANTI, ORMONI E ANTIBIOTICI ma biologicamente più attiva. Per la produzione si deve perciò ricorrere a cellule di mammifero, che possiedono naturalmente il corredo informazionale per produrre proteine bioattive, assolutamente paragonabili a quelle umane. Alcuni esempi di cellule animali che producono proteine di interesse farmacologico sono: r cellule tumorali linfoblastoidi per la produzione di interferone r cellule di melanoma per la produzione di attivatore del plasminogeno r cellule tumorali ibridate per la produzione di anticorpi monoclonali. Sistemi di coltura, mezzi colturali e contaminanti Le colture cellulari si effettuano in fermentatori o bioreattori ad agitazione meccanica o pneumatica (air-lift), a perfusione a fibre cave, a letto fisso, con tecnica continua, discontinua, discontinua con rifornimento (feed-batch). La composizione dei terreni di coltura per la coltivazione di cellule animali le condizioni ambientali (temperatura, pH, tensione di ossigeno) devono essere accuratamente controllate per apportare tutti gli elementi nutritivi indispensabili (ormoni, fattori di crescita, carboidrati, aminoacidi, elettroliti, vitamine ecc.). Le cellule animali devono essere esenti da qualsiasi tipo di contaminazione, si deve quindi agire in un regime di assoluta sterilità e verificare l’assenza di contaminanti quali virus, batteri, DNA cellulare. Contaminanti particolarmente Tabella 5.1 Operazioni fondamentali di purificazione di una macromolecola di interesse farmacologico PASSAGGI DI PURIFICAZIONE Eliminazione del particolato Concentrazione Cattura/Purificazione iniziale Purificazione intermedia Purificazione finale Sterilizzazione/Formulazione pericolosi sono i virus, che tendono per natura a parassitare cellule superiori. Vengono generalmente apportati con il mezzo colturale e il componente più frequentemente responsabile è il siero animale. Particolarmente rischiosa è la contaminazione da pirogeni (endotossine batteriche) cui l’uomo è sensibile a concentrazioni anche estremamente basse. Anche la presenza di proteine estranee in un prodotto farmaceutico può rivelarsi assai pericolosa: il loro riconoscimento come antigeni da parte del sistema immunitario del paziente che assume il farmaco può scatenare una violenta reazione anafilattica nel caso (che è il più frequente) di assunzione ripetuta. Purificazione La qualità finale di un prodotto farmaceutico si misura in termini di purezza: ne consegue che rivestono capitale importanza le tecniche che permettono di portare un Tabella 5.2 Processi di separazione di impiego frequente e loro fondamento fisico TECNICA DI SEPARAZIONE MODALITÀ/PRINCIPIO SEPARAZIONE BASATA SU Separazione su membrana Microfiltrazione Ultrafiltrazione Dialisi Dimensione Dimensione Dimensione Configurazione Frazionamento isopicnico Precipitazione in condizioni di non equilibrio Densità Densità Estrazione Estrazione in fase liquida Estrazione liquido/liquido Solubilità Ripartizione, cambiamento di solubilità Precipitazione Precipitazione frazionata Cambiamento di solubilità Cromatografia Scambio ionico Filtrazione su gel Affinità Interazioni idrofobe Adsorbimento Carica Dimensione Interazione specifica ligando-substrato Idrofobicità Legame covalente e non 72 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario PROTEINE UMANE RICOMBINANTI, ORMONI E ANTIBIOTICI 5 Tabella 5.3 Componenti di formulazioni parenterali di prodotti biotecnologici. Non necessariamente sono tutti presenti in una particolare formulazione proteica t*OHSFEJFOUFBUUJWP t4PMVCJMJ[[BOUJ t"HFOUJBOUJBETPSCJNFOUPFBOUJBHHSFHB[JPOF t5BNQPOJ t$POTFSWBOUJFBOUJPTTJEBOUJ t-JPQSPUFUUPSJBHHMPNFSBOUJ t"HFOUJPTNPUJDJ t4JTUFNBWFUUPSF composto al massimo grado di purezza. La conoscenza approfondita dei meccanismi di reazione e dei fattori condizionanti consente di monitorarli e governarli più agevolmente, con l’obiettivo di ottenere un prodotto finale che risponda alle caratteristiche specifiche di registrazione e agli standard di qualità propri del progetto. Un elevato grado di purezza è assolutamente richiesto dalle norme stabilite dagli enti preposti alla vigilanza (EMEA, FDA) per evitare che il prodotto possa ancora contenere tracce di sostanze chimiche (per es. solventi) in grado di scatenare nei pazienti reazioni indesiderate o tossiche. I limiti di tollerabilità di eventuali impurezze vengono indicati per ogni farmaco tenendo conto anche della via di somministrazione. Le linee-guida previste dalle Good Manufactoring Practices (GMP), che permettono di poter immettere sul mercato prodotti rispondenti ai requisiti richiesti, rispondono a criteri molto severi. Il processo di purificazione è strutturato in diverse fasi, riassunte schematicamente in tabella 5.1. L’esempio di figura 5.3 riporta il trattamento di purificazione dell’interferone ricombinante glicosilato e risulta decisamente complesso. I processi più utilizzati per la separazione delle proteine sono elencati in tabella 5.2. Sterilità Figura 5.3 Passaggi di purificazione dell’interferone. Le proteine sono generalmente termolabili e, poiché ai fini della loro somministrazione (che avviene solitamente per via parenterale) devono naturalmente essere sterili, non è possibile utilizzare alte temperature, ma nemmeno il gas o le radiazioni ionizzanti. In definitiva, poiché non 73 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 5 PROTEINE UMANE RICOMBINANTI, ORMONI E ANTIBIOTICI si può sterilizzare il prodotto finale, l’unica soluzione è quella di lavorare in ambiente asettico nelle varie fasi della preparazione del farmaco. Apparecchiature ed eccipienti vengono quindi sterilizzati separatamente in autoclave, sottoposti all’azione dei raggi γ, a trattamenti chimici oppure sterilizzati a secco con temperature superiori a 160 °C. Si utilizzano inoltre sistemi di microfiltrazione prima di immettere il preparato nelle fiale, con l’impiego di filtri con pori del diametro di 0,2 μm. L’assemblaggio viene quindi effettuato in camera sterile a flusso laminare d’aria filtrata con sistema HEPA, da parte di personale appositamente addestrato provvisto di adeguati indumenti protettivi. Il regolare periodico ricambio dei filtri HEPA, la perfetta pulizia dei locali e dell’intero apparato rappresentano altrettanti fattori essenziali per il successo delle operazioni. Eliminazione dei pirogeni I pirogeni sono sostanze che inducono nell’organismo una reazione febbrile. Sono detti esogeni se provengono dall’esterno dell’organismo, cioè da microrganismi come batteri, miceti e virus. Sono di particolare importanza i pirogeni batterici, identificabili nelle endotossine prodotte dai Gram-negativi, in pratica il lipide A situato nello strato esterno lipopolisaccaridico (strato LPS) della parete cellulare di questi batteri. Le endotossine non vengono eliminate con il trattamento a calore umido dell’autoclave, ma sono inattivate dal calore secco a temperature superiori ai 160 °C. I recipienti per confezionare il farmaco vengono per questo trattati a 250 °C per 30 min al calore secco. Anche gli eccipienti (componenti di un farmaco diversi dal principio attivo, tabella 5.3) devono essere esenti da endotossine e vengono trattati con la distillazione se si tratta di soluzioni, mentre l’acqua per le iniezioni si produce con tecniche di osmosi inversa, che utilizzano membrane che non lasciano passare le endotossine. Viene utilizzato anche il carbone attivo. Eccipienti impiegati nei farmaci proteici biotecnologici Gli eccipienti sono rappresentati da: r agenti che migliorano la solubilità: vengono aggiunti al fine di prevenire fenomeni di aggregazione delle proteine con la loro conseguente precipitazione. Si impiegano in genere aminoacidi (arginina e lisina) e tensioattivi come il sodio dodecilsolfato r tamponi: il controllo del pH è un fattore decisivo, dal momento che caratteristiche fondamentali delle proteine quali la stabilità e la solubilità dipendono dal pH; si impiegano quindi i sistemi tampone fosfato, acetato, citrato r conservanti e antiossidanti: molte proteine contengono aminoacidi facilmente soggetti a ossidazione come metionina, triptofano, istidina, cisteina e tirosina. Per prevenirne l’ossidazione si può sostituire l’ossigeno nelle fiale con un gas inerte, o anche aggiungere antiossidanti come acido ascorbico o sodio formaldeide solfossilato. Nel caso di preparati da somministrare in più volte, occorre limitare il pericolo di contaminazione microbica durante la conservazione: si impiegano a questo scopo sostanze conservanti come l’acido p-idrossibenzoico, l’alcol benzilico, il cloro butanolo. Liofilizzazione delle proteine La liofilizzazione consiste nell’allontanamento dell’acqua per sublimazione (passaggio diretto dallo stato liquido a quello solido). Il processo si svolge in tre fasi: r congelamento, in cui la temperatura viene portata a livelli estremamente bassi, tali da provocare la cristallizzazione dell’acqua libera allo stato fluido (−40 °C) r essiccamento I, in cui l’acqua cristallizzata e non legata viene allontanata per sublimazione abbassando la pressione r essiccamento II, in cui si elimina l’acqua legata a proteine ed eccipienti. La temperatura viene gradualmente portata a 20 °C. Vie di somministrazione e assorbimento Viene definita via di somministrazione parenterale quella che si effettua tramite ago: iniezione endovena, sottocutanea, intramuscolo, intraperitoneale. Il tempo di dimezzamento dei prodotti biotecnologici nel sistema circolatorio risulta essere assai variabile: per l’attivatore del plasminogeno è di pochi minuti, mentre per gli an- 74 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario PROTEINE UMANE RICOMBINANTI, ORMONI E ANTIBIOTICI ticorpi monoclonali è di diversi giorni. Per aumentare il tempo di dimezzamento del farmaco (e quindi quello di permanenza nel sangue) si può passare alla somministrazione intramuscolare o sottocutanea piuttosto che a quella endovena, anche se ciò porta a modificazioni relative alla sua eliminazione e agli effetti terapeutici specifici. La somministrazione per via orale delle proteine ricombinanti ad attività terapeutica incontra alcuni ostacoli, primo fra tutti la naturale attività degradativa dell’apparato gastrointestinale nei confronti delle proteine, che vengono rapidamente demolite a peptidi a corta catena e ad aminoacidi. Risulta inoltre praticamente impossibile l’assorbimento passivo (per diffusione) di sostanze ad alto peso molecolare, quali le proteine, attraverso l’epitelio intestinale. Quando è necessario avere una biodisponibilità elevata e costante di proteine ad attività terapeutica la via orale di somministrazione non è perciò praticabile. Un’importante eccezione è peraltro costituita dai vaccini orali: in questo caso è sufficiente che ai siti-bersaglio arrivi una quantità anche minima di antigene proteico (la proteina ricombinante) per sensibilizzare il sistema immunocompetente e indurre la risposta immunitaria. Tabella 5.4 Categorie di vaccini prodotti per uso umano e malattie contro le quali proteggono TIPO DI VACCINO MALATTIA/PATOGENO Ucciso batterico Salmonella typhi Pertosse Colera Ucciso virale Rabbia Poliomielite Influenza Encefalite giapponese Epatite A Vivo attenuato batterico 5VCFSDPMPTJ Colera Salmonella typhi Vivo attenuato virale Vaiolo Rabbia Febbre gialla Poliomielite Influenza Morbillo Parotite Rosolia Varicella Rotavirus Encefalite giapponese Polisaccaridico Salmonella typhi Meningococco Pneumococco Haemophilus influenzae tipo b Ricombinante batterico Pertosse Malattia di Lyme La produzione industriale: lo scale-up Nella messa a punto di un farmaco assume importanza strategica l’individuazione della migliore formulazione e della via di somministrazione più appropriata. Un’altra fase critica è l’avvio della produzione su scala industriale della molecola prescelta che, come avviene per le produzioni biotecnologiche di microbiologia industriale, richiede il passaggio da dimensioni relativamente ridotte (milligrammi o grammi) a una scala di ordine enormemente maggiore (anche tonnellate). Ciò significa ottimizzare la sintesi di enormi quantità di principio attivo, tenendo sotto controllo tutti gli svariati parametri coinvolti nel processo di sintesi (temperatura, reazione del mezzo, solventi impiegati, tempi di reazione, formazione di sottoprodotti e loro eliminazione ecc.). Al contrario di quanto possa sembrare, trasferire reazioni complesse su scala più ampia (scale-up) non è mai un’operazione semplice: aumenti consistenti delle quantità di prodotto comportano considerevoli variazioni delle condizioni di reazione. Occorre quindi procedere con passaggi in fermentatori di dimensioni progressivamente maggiori (paragrafo 3.5). 5 Ricombinante virale Epatite B Virus-like particles (VLP) Papilloma 5PTTPJEF Difterite 5FUBOP Pertosse 5.2 Produzione di vaccini I vaccini sono sostanze antigeniche che inducono nell’organismo in cui sono introdotte una reazione immunitaria specifica, in grado di prevenire le conseguenze di un’ulteriore aggressione da parte degli stessi antigeni contro cui ci si è vaccinati: sono quindi impiegati a scopo profilattico (tabella 5.4). Il presupposto imprescindibile nella preparazione di un vaccino è l’annullamento del suo potere patogeno (virulenza propria 75 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 5 PROTEINE UMANE RICOMBINANTI, ORMONI E ANTIBIOTICI Batteri attenuati Batteri 60 °C Virus attenuati Vaccino Virus Trattamento ad alta temperatura Batteri uccisi Trattamento chimico Virus uccisi Vaccino Figura 5.4 Preparazione di vaccini uccisi e attenuati. dell’antigene da cui deriva) mantenendo intatta la capacità immunogena, cioè la capacità di indurre nell’organismo una risposta immunitaria. I vaccini si possono ottenere da: r microrganismi vivi ma attenuati. L’attenuazione del potere patogeno si effettua con mezzi fisici o chimici come la nitroso guanidina o con ripetuti passaggi in vitro del ceppo selvatico. In questo modo la loro virulenza viene considerevolmente ridotta o annullata. Si tratta in genere di vaccini antivirali, contro malattie quali il morbillo, la rosolia, la varicella, la febbre gialla, la tubercolosi, la poliomielite (vaccino orale di Sabin). Possono permanere alcuni rischi legati alla manipolazione di microrganismi vitali, come nel caso di ritorno dei ceppi attenuati alla forma selvatica patogena. Nel caso del vaccino antipolio di Sabin ciò può verificarsi in 1 caso su 3 milioni r microrganismi uccisi o inattivati. L’impiego di microrganismi uccisi elimina del tutto la quota di rischio del caso precedente: la contropartita consiste nella possibile attenuazione anche della proprietà immunogena (figura 5.4). Questi vaccini, perciò, devono essere somministrati in dosi ripetute. Esempi sono il vaccino antipolio di Salk, quelli contro la rabbia, l’influenza, l’epatite A, il colera, la peste, la pertosse r anatossine o tossoidi. Sono tossine microbiche di natura proteica o altre sostanze private del potere patogeno (figura 5.5). La detossificazione viene effettuata con formolo o con tecniche di purificazione. I vaccini contro la difterite e il tetano sono esempi di tossoidi r vaccini polisaccaridici. Si ottengono per purificazione dei polisaccaridi della capsula batterica, che vengono poi coniugati con un antigene proteico (vaccini contro Streptococcus pneumoniae e Neisseria meningitidis). 76 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario PROTEINE UMANE RICOMBINANTI, ORMONI E ANTIBIOTICI 5 Polisaccaridici Polisaccaride Batteri O O O O O O O O O O O O O O O Coniugato O O Vaccino O Tossoidi Trattamento chimico Tossina Tossina inattiva Vaccino Figura 5.5 Vaccini polisaccaridici e tossoidi. Vaccini ricombinanti Nel campo della preparazione dei vaccini le tecniche di biologia molecolare e del trasferimento di geni hanno raggiunto traguardi significativi. Uno degli aspetti più importanti è rappresentato dalla possibilità di ottenere proteine immunogene in forma pura e assolutamente prive di attività patogena. Le procedure si basano sull’identificazione dei geni codificanti per gli specifici fattori di virulenza dei microrganismi patogeni, sulla loro manipolazione e sul loro trasferimento in cellule che siano in grado di esprimerli. L’ingegneria genetica si avvale di diverse tecniche, tra cui: r impiego di un vettore innocuo per l’organismo umano, utilizzato per introdurre nell’organismo geni in grado di indurre la produzione di anticorpi contro una malattia infettiva. Si possono utilizzare vettori plasmidici o virali come il virus del vaiolo. Il gene responsabile dell’immunizzazione contro il vaiolo viene sostituito dal gene desiderato. Con questa tecnica si possono inserire più geni diversi, ottenendo un multivaccino r con la tecnica del DNA ricombinante vengono sintetizzate proteine immunogene proprie del microrganismo responsabile della malattia e che quindi sono in grado di sensibilizzare il sistema immunocompetente. L’impiego di frazioni proteiche e non 77 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 5 PROTEINE UMANE RICOMBINANTI, ORMONI E ANTIBIOTICI di interi microrganismi elimina il rischio di effetti collaterali indesiderati r l’ingegneria genetica permette anche di attenuare la virulenza dei microrganismi modificando i geni responsabili della patogenicità senza interferire con quelli responsabili dell’immunogenicità. Il rischio è rappresentato da possibili mutazioni “di ritorno” (reversioni) che riportano il genoma microbico nella condizione di esprimere la patogenicità originaria. Soprattutto nel caso dei vaccini contro alcune malattie virali, le biotecnologie avanzate e la tecnica del DNA ricombinante hanno consentito notevoli progressi, come la messa a punto del vaccino ricombinante contro l’epatite B (HBV) (figura 5.6). In questo caso il vaccino è preparato utilizzando l’antigene di superficie del virus (HBsAg) trasferito ed espresso in cellule di lievito e quindi sottoposto a purificazione. Il primo vaccino ricombinante batterico contro la pertosse (figura 5.6) risale al 1993. Bordetella pertussis produce una tossina formata da 5 subunità, ciascuna delle quali sotto il controllo di un gene specifico. Tali geni sono stati sostituiti nel genoma di Bordetella da geni modificati, tali da indurre la produzione nello stesso batterio di una tossina mutata priva di tossicità (cioè un tossoide) ma dotata dell’originale immunogenicità. Un simile approccio di detossificazione genetica è stato in seguito applicato alla tossina colerica e a quella Epatite B Clonaggio del gene in un plasmide di espressione Virus Vaccino Lievito Pertosse Gene Gene mutato Batterio ricombinante Batterio Mutagenesi sito diretta S1 Vaccino Figura 5.6 Vaccini ricombinanti. La figura illustra i passaggi per la produzione di vaccini ricombinanti per epatite B e pertosse. Nel vaccino della pertosse la subunità S1, responsabile della tossicità, viene resa non tossica per mutagenesi. 78 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario PROTEINE UMANE RICOMBINANTI, ORMONI E ANTIBIOTICI LT di E. coli. La tossina LT è termolabile e antigenica, con un’attività simile alla tossina colerica; E. coli produce anche un’altra tossina, termostabile e priva di potere antigenico. Un altro vaccino ricombinante è stato messo a punto contro la malattia di Lyme (infezione da Borrelia) utilizzando una lipoproteina batterica (OspA) ottenuta trasferendo e facendo esprimere in E. coli il gene che la codifica. 5.3 Produzione di anticorpi monoclonali Si tratta di anticorpi prodotti da un unico clone cellulare. Gli anticorpi si legano in modo selettivo e specifico ai corrispondenti antigeni, molecole non-self (estranee all’organismo) che ne hanno indotto la produzione in seguito alla sensibilizzazione del sistema immunocompetente (reazione immunitaria). In questo modo gli anticorpi, insieme con le cellule dell’immunità cellulare, svolgono la loro missione di difesa contro gli agenti estranei nella più ampia accezione del termine (antigeni batterici, virali, chimici ecc.). La reazione fra antigene e anticorpo offre molte possibilità di sfruttamento e applicazione proprio per la sua estrema specificità: viene impiegata in diagnostica clinica per individuare uno dei due componenti quando è noto il complementare (ricerca di anticorpi nel siero del paziente cimentando il siero con gli antigeni corrispondenti; ricerca degli antigeni con l’impiego di anticorpi specifici). Più in generale gli anticorpi possono essere impiegati per individuare, isolare ed estrarre molecole o cellule da un substrato. Per la loro capacità di legarsi in modo assolutamente selettivo alle corrispondenti molecole bersaglio, si è pensato di impiegare gli anticorpi come veri e propri agenti terapeutici in molte patologie. Un’applicazione importante può essere quella di impiegarli come vettori specifici di farmaci a localizzazione elettiva o come arma estremamente precisa e mirata contro cellule tumorali. Gli anticorpi vengono prodotti dai linfociti B, quindi sembra ovvia la possibilità di ottenerne quantità significative dalla coltura di linfociti. Purtroppo coltivare in vitro i linfociti B umani risulta assai difficile: essi muoiono infatti dopo poche generazioni, insufficienti a produrre il quantitativo sufficiente di linfociti, e quindi di anticorpi, necessario a un qualsiasi intervento terapeutico. 5 Il problema ha trovato soluzione nel 1975, quando si pensò di utilizzare cellule tumorali di mieloma che in condizioni adatte hanno la proprietà di riprodursi pressoché all’infinito e linfociti B dalla milza, produttori di anticorpi. Le due linee cellulari, provenienti entrambe da topi, furono indotte a fondersi dando luogo a un ibridoma. Tale ibrido mantiene le caratteristiche desiderate di entrambe le linee cellulari d’origine: capacità di riproduzione pressoché illimitata e produzione di anticorpi. Si induce quindi nel topo un mieloma; l’animale viene inoltre immunizzato con l’antigene (o gli antigeni) verso cui si vogliono ottenere gli anticorpi. Si prelevano separatamente sia i linfociti B che le cellule tumorali, che vengono poi riunite in condizioni controllate formando gli ibridomi. Ogni ibridoma viene fatto riprodurre dando origine così ad altrettanti cloni cellulari che producono anticorpi tutti dello stesso tipo, appunto anticorpi monoclonali (figura 5.7). La fusione delle due diverse linee cellulari che formano l’ibridoma si realizza annullando la selettività delle rispettive membrane cellulari per mezzo di sostanze chimiche come il polietilenglicol (PEG) o applicando campi elettrici. Il materiale citoplasmatico di entrambe le cellule si fonde e si crea un unico corpo cellulare. La coltivazione degli ibridomi avviene in condizioni di temperatura (37 °C), pH (7,2-7,4), tensione di ossigeno e pressione osmotica rigidamente controllate. Tutti gli altri parametri ottimali per la vita cellulare devono essere mantenuti il più possibile simili alle condizioni naturali. Il terreno di coltura (liquido) deve quindi contenere in precise concentrazioni aminoacidi, glucosio, vitamine, sali minerali e siero, oltre ad antibiotici per evitare possibili infezioni. La coltivazione viene effettuata generalmente all’interno di un bioreattore a fibre cave (figura 5.8). Si tratta di un cilindro in materiale plastico attraversato nel senso della lunghezza da un gran numero di capillari (fibre cave) di alcuni millimetri di spessore, costruiti con materiale microporoso e disposti orizzontalmente, che fungono da supporto semipermeabile per le cellule (che si trovano quindi negli spazi extracapillari), mentre il terreno liquido di coltura viene inviato e fatto circolare all’interno dei capillari (spazi intracapillari). La permeabilità dei capillari permette il passaggio dei nutrienti e dei cataboliti, realizzando così un vero e proprio sistema a perfusione. All’interno delle fibre 79 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 5 PROTEINE UMANE RICOMBINANTI, ORMONI E ANTIBIOTICI Antigene con determinanti diversi Permeato Alimentazione Immunizzazione nel topo Linfociti B diversi per differenti determinanti antigenici Cellule di mieloma Fusione Miscela di cellule ibride e non fuse Distribuzione in terreni selettivi che inibiscono le cellule non ibridate Clonaggio degli ibridomi e verifica della produzione degli anticorpi Retentato Figura 5.8 Bioreattore a fibre cave. terreno extracapillare contenente il prodotto desiderato, che viene recuperato e purificato con tecniche di cromatografia a scambio ionico e per immunoaffinità. Gli anticorpi monoclonali sono impiegati: r come mezzo diagnostico, tecnica che prevede la marcatura dell’anticorpo monoclonale con reagenti che sviluppano luminescenza, radioattività, reazioni cromatiche. È possibile l’identificazione rapida di antigeni virali o batterici e di cellule tumorali con tecniche ELISA e di immunofluorescenza r come sistema di separazione dei componenti di una miscela (immunoseparazione) r come vettori di farmaci verso cellule tumorali, nei confronti delle quali è stata creata specificità di combinazione. Anticorpi monoclonali Figura 5.7 Anticorpi monoclonali. La figura illustra i passaggi per la produzione di anticorpi monoclonali. viene introdotta aria che filtra attraverso i micropori dei capillari e arriva alle cellule. Aumentando la pressione del terreno di coltura liquido negli spazi intracapillari, le sostanze nutritive attraversano le fibre cave e vengono inviate alle cellule; diminuendo poi la pressione il liquido rientra all’interno delle fibre portando con sé i cataboliti di rifiuto. L’alternanza di questi cicli permette una miscelazione ottimale del terreno. In queste condizioni la riproduzione cellulare è massima così come la produzione di anticorpi monoclonali, che può perdurare per circa 30 giorni. A intervalli prefissati si preleva il 5.4 Produzione di interferoni Gli interferoni (IFN) sono proteine specie-specifiche prodotte dall’organismo in risposta a un’infezione virale. Appartengono alle citochine, insieme con altri fattori solubili che attivano o inibiscono le complesse interazioni cellulari nella risposta immunitaria: interleuchine, CSF (fattore stimolante la formazione di colonie cellulari), TNF (fattore di necrosi tumorale), TGF (fattore di crescita trasformante). La scoperta degli interferoni risale alla seconda metà del secolo scorso e ha destato un alto interesse per le possibili applicazioni di queste molecole nella terapia di molte patologie e dei tumori. I costi di produzione degli interferoni da cellule umane, all’inizio 80 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario PROTEINE UMANE RICOMBINANTI, ORMONI E ANTIBIOTICI 5 sibile produrre interferone ricombinante inserendo e facendo esprimere il gene umano che codifica per la loro sintesi in cellule di E. coli. 5.5 Produzione di ormoni Figura 5.9 Struttura dell’interferone γ umano. proibitivi, si sono progressivamente ridotti pur rimanendo elevati; parallelamente l’atteggiamento di medici e ricercatori sulle prospettive di successo del loro impiego è divenuto molto più cauto, anche se rappresentano comunque un’importante arma farmacologica. Nell’organismo umano vengono prodotti gli interferoni α, β, γ, rispettivamente da leucociti, fibroblasti e linfociti T attivati dall’antigene (figura 5.9). La produzione industriale riguarda soprattutto il tipo α, ottenuto dal clonaggio di linee cellulari specifiche, oppure utilizzando microrganismi geneticamente modificati. La coltivazione di cellule umane presenta sempre molte criticità per la loro natura eucariotica estremamente complessa rispetto alla relativa semplicità dei procarioti, per cui si preferisce in ogni caso impiegare batteri o lieviti (fra gli eucarioti). La coltivazione delle cellule di mammifero richiede una prima fase in cui il tessuto prescelto viene trattato con enzimi o sottoposto ad azione meccanica al fine di staccare le une dalle altre le cellule, che poi vengono meglio separate con una centrifugazione molto delicata. Le singole cellule vengono poi coltivate in bottiglie di vetro schiacciate (Roux) e disposte su di un piano orizzontale mantenuto in agitazione. Si passa quindi alla coltivazione su scala più grande, in bioreattori STR con agitazione air-lift onde evitare eccessiva turbolenza della massa. Il terreno di coltura liquido e tutti i parametri di coltivazione (temperatura, pH, tensione di ossigeno ecc.) devono essere mantenuti rigidamente e costantemente sotto controllo. Il terreno viene sterilizzato tramite filtrazione su membrana. L’interferone prodotto viene prima estratto dalle cellule per filtrazione, quindi ulteriormente separato dalla soluzione tramite cromatografia con tecnica HPLC. Impiegando le tecniche di ingegneria genetica è pos- Gli ormoni sono sostanze prodotte dalle ghiandole endocrine, che riversano il loro prodotto direttamente nel sangue. Attraverso il circolo ematico gli ormoni raggiungono gli organi-bersaglio dove esercitano la loro azione regolatrice su molte funzioni fisiologiche. Dal punto di vista chimico si distinguono ormoni polipeptidici e ormoni steroidei. La carenza, la mancata o eccessiva produzione di un ormone si ripercuote sui delicati equilibri fisiologici dell’organismo, generando quadri patologici anche molto gravi o perfino incompatibili con la vita. È quindi facilmente comprensibile come la biochimica e la ricerca farmacologica abbiano da molto tempo concentrato i loro sforzi sulla possibilità di ricreare in laboratorio queste molecole, nell’intento di poter curare le numerose malattie da carenza ormonale. Il primo ormone sintetizzato artificialmente è stato la somatostatina (1977), seguita poco tempo dopo dall’insulina, che ha permesso di curare nel mondo milioni di persone affette da diabete mellito. Il diabete è una complessa patologia causata dall’insufficiente produzione di insulina da parte del pancreas con conseguente aumento della glicemia. Anche nel campo della produzione di ormoni le biotecnologie offrono la possibilità di creare ceppi batterici modificati con l’inserimento dei geni che codificano per la sintesi dell’ormone richiesto. Ormoni polipeptidici La somatostatina, l’insulina, l’eritropoietina, l’ormone della crescita o somatotropina (HGH, human growth hormon) sono i più importanti ormoni proteici prodotti industrialmente. Gli ormoni proteici vengono prodotti in bioreattori di tipo STR con agitazione meccanica e sistema di insufflazione d’aria. La separazione del prodotto di interesse dalla biomassa richiede tecniche sofisticate quali la cromatografia HPLC su resine a scambio ionico. Segue una fase di eluizione con adatto solvente, la concentrazione e la cristallizzazione, da cui si ottiene il prodotto purificato. 81 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 5 PROTEINE UMANE RICOMBINANTI, ORMONI E ANTIBIOTICI Somatostatina La somatostatina è un ormone proteico costituito da una catena di appena 14 aminoacidi. Viene secreta dall’ipotalamo e regola la produzione di altri ormoni fra cui l’insulina e l’HGH. L’ormone si ottiene con la tecnologia del DNA ricombinante. Una volta nota la sequenza nucleotidica della somatostatina, si è costruita “a ritroso” la sequenza genica artificiale, inserita poi nel plasmide batterico pBR322. Insieme a questo gene, è stato inserito nello stesso plasmide quello che codifica per la sintesi dell’enzima β-galattosidasi, insieme con la regione di controllo (operone lac). Tale enzima si è rivelato indispensabile perché senza la sua sintesi E. coli non riconoscerebbe come propria la somatostatina, che verrebbe aggredita e distrutta. Il plasmide ricombinante con entrambi i geni (somatostatina e β-galattosidasi) è quindi stato inserito in E. coli che provvede alla sintesi dell’ormone. Si calcola che in condizioni standard si possa arrivare a rese dell’ordine di decine di migliaia di molecole di somatostatina per ogni cellula di E. coli coltivata in fermentatore. Insulina L’insulina è un ormone ipoglicemizzante, secreto dalle cellule β delle isole di Langerhans della frazione endocrina del pancreas. La sua funzione è quella di permettere il trasferimento del glucosio dal sangue all’interno delle cellule, dove viene utilizzato per produrre energia. Una carenza di insulina provoca quindi un innalzamento della glicemia (tasso di glucosio nel sangue), diabete e una serie di complesse patologie correlate. La struttura chimica dell’insulina è costituita da due catene polipeptidiche, denominate A (21 aminoacidi) e B (30 aminoacidi), unite da ponti disolfuro. L’ormone viene secreto come pro-insulina, forma che comprende anche una terza catena proteica (C) che non ha alcuna attività nei confronti del glucosio ma che serve a connettere fra di loro le altre due catene, da cui in seguito si separa. L’insulina è stata per lungo tempo estratta dal pancreas di bovini e suini prima di essere prodotta da microrganismi geneticamente modificati. In effetti l’ormone derivato da animali (non perfettamente identico a quello umano) può spesso creare nei soggetti trattati allergie e intolleranze. L’insulina ottenuta per via biotecnologica è invece assolutamente identica a quella umana. I microrganismi utilizzati e in cui è stato introdotto il gene umano che controlla la sintesi di insulina non DNA umano per la sintesi della catena A DNA umano per la sintesi della catena B Inserimento del DNA nel plasmide munito di regione di controllo DNAr DNAr Inserimento del DNAr nel batterio Sintesi della catena A Sintesi della catena B Fusione delle catene A e B (formazione dei ponti -S-S-) Insulina umana Figura 5.10 Insulina. In figura sono schematizzati i passaggi per la sintesi dell’insulina. DNAr = DNA ricombinante. sono però in grado di procedere al distacco del peptide C dalla pro-insulina: questo inconveniente porta all’impossibilità di utilizzare la pro-insulina come farmaco. Per superare questo inconveniente si producono separatamente le due catene A e B, per ricomporre in seguito la catena completa (figura 5.10). Si procede quindi a partire dalle sequenze aminoacidiche delle singole catene e si assemblano le corrispondenti sequenze nucleotidiche (i geni), che vengono inserite in due plasmidi separati insieme con il gene della β-galattosidasi e della regione di controllo. I geni vengono introdotti separatamente in cellule di E. coli, da cui si sviluppano cloni cellulari separati coltivati in bioreattori distinti. In ciascun clone viene prodotta la catena A o la catena B. Ciascuno di questi complessi molecolari viene estratto dalle miscele di reazione, purificato e trattato per allontanare la β-galattosidasi. Le due catene A e B vengono ulteriormente purificate e riunite chimicamente con la formazione dei ponti disolfuro. HGH L’ormone proteico somatotropina, formato da una catena di 121 aminoacidi, viene secreto dal lobo anteriore dell’ipofisi e regola l’accrescimento corporeo agendo in modo specifico sull’allungamento delle ossa lunghe. La 82 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 5 PROTEINE UMANE RICOMBINANTI, ORMONI E ANTIBIOTICI Vettore di espressione batterico cDNA clonato di ormone della crescita umana Codone d’inizio Codone di stop Ormone della crescita ricombinante Trasformazione di E. coli Taglio con enzimi di restrizione (e altre manipolazioni in vitro) Sequenza codificante l’ormone della crescita Promotore batterico Purificazione dell’ormone della crescita NH2 Inserimento del gene nel vettore di espressione COOH La sequenza proteica è identica a quella dell’ormone della crescita naturale Figura 5.11 Schema di produzione dell’ormone della crescita. sua carente produzione in età prepuberale porta al nanismo ipofisario. Al termine dell’ossificazione (età postpuberale) un’eccessiva secrezione di ormone della crescita conduce all’acromegalia, che si manifesta con un accrescimento non armonico delle ossa, un loro allungamento anomalo e conseguenti deformazioni. Poiché questo ormone è specie-specifico non è mai stato possibile, contrariamente a quanto avvenuto per l’insulina, utilizzare in terapia la somatotropina di origine animale. Si è perciò proceduto con l’estrazione di HGH dai cadaveri e se ne è anche tentata la sintesi chimica: nel primo caso con notevoli rischi di effetti collaterali, nel secondo con efficacia molto ridotta rispetto all’ormone naturale. L’ingegneria genetica in associazione con i tradizionali metodi di sintesi chimica (via biotecnologica integrata) ha permesso di ottenere HGH in notevoli quantità, per rispondere alle esigenze terapeutiche, allargate anche al trattamento di altre patologie (osteoporosi). Il ricorso parziale alla sintesi chimica è necessario in quanto non si è riusciti a produrre HGH a partire dallo specifico mRNA. La sua produzione si può schematizzare nel modo seguente (figura 5.11): r estrazione dall’ipofisi umana del mRNA r azione dell’endonucleasi di restrizione r stampo di cDNA con l’enzima trascrittasi inversa che codifica per una sequenza della catena pari all’87% dell’intera molecola r la parte rimanente della catena proteica viene ottenuta per sintesi chimica producendo una sequenza polinucleotidica che codifica per gli aminoacidi mancanti r i due frammenti sono purificati e poi riuniti con la DNA ligasi nel gene completo. Questo viene inserito nel plasmide pBR322 insieme con il gene per la β-galattosidasi e la regione di controllo (lac) r il plasmide viene inserito in E. coli che inizia a produrre HGH e β-galattosidasi r dopo separazione tra HGH ed enzima, l’ormone viene estratto e purificato. Eritropoietina L’eritropoietina è un ormone secreto dai reni con funzione di eritropoiesi, promuove cioè nel midollo osseo la formazione e la maturazione delle cellule staminali eritropoietiche (pro-eritroblasti) in globuli rossi (eritrociti). Verificata l’importanza terapeutica dell’impiego di eritropoietina su pazienti sottoposti a dialisi e in casi di insufficiente produzione di globuli rossi, sono stati messi a punto metodi per la produzione industriale dell’ormone, impiegando microrganismi geneticamente modificati e linee cellulari eucariotiche (cellule dell’ovaio di criceto). La produzione di eritropoietina si articola in diverse fasi: r a partire dall’eritropoietina umana, estratta dal rene, se ne stabilisce la sequenza aminoacidica da cui si ricava la corrispondente sequenza nucleotidica (DNA) r questo DNA viene marcato per essere impiegato come sonda (DNA probe) per la ricerca del gene corrispondente r il DNA umano viene frammentato in tante sequenze nucleotidiche, ciascuna delle quali, tramite un virus vettore, viene introdotta in altrettante cellule batteriche coltivate separatamente r il DNA sonda viene introdotto nel mezzo di coltura dove rivelerà in quali cellule si trova il gene ricercato 83 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 5 PROTEINE UMANE RICOMBINANTI, ORMONI E ANTIBIOTICI r MFDFMMVMFUSBTGPSNBUFWFOHPOPBNQMJėDBUFJODPMUVSB r JMHFOFDPTÑBNQMJėDBUPWJFOFFTUSBĨPFNBSDBUPQFS GVO[JPOBSFEBOVPWBTPOEB r DPORVFTUP%/"TPOEBJOUSPEPĨPJOVOBNJTDFMBEJ DFMMVMF EFM SFOF VNBOP TJ SJDFSDB JM DPSSJTQPOEFOUF N3/" r DPO RVFTUP N3/" TJ PĨJFOF DPO MB USBTDSJĨBTJ JOWFSTB JMDPSSJTQPOEFOUFD%/"*MD%/" HFOFQFS MBTJOUFTJEJFSJUSPQPJFUJOBVNBOB WJFOFJOUSPEPĨP JOVOQMBTNJEF r JMQMBTNJEFWJFOFJOUSPEPĨPJODFMMVMFCBĨFSJDIFQFS FTTFSFDMPOBUP r JM HFOF DMPOBUP WJFOF JOTFSJUP JO DFMMVMF EJ PWBJP EJ DSJDFUPDIFWFOHPOPQPJJOUSPEPĨFJOVOCJPSFBĨPSF r M̮FSJUSPQPJFUJOBQSPEPĨBWJFOFFTUSBĨBFQVSJėDBUB -̮FSJUSPQPJFUJOBFNFSHFQFSJPEJDBNFOUFBHMJPOPSJEFMMB DSPOBDBQFSJMTVPVTPJNQSPQSJPDPNFsostanza dopante *O NPMUF EJTDJQMJOF TQPSUJWF TPQSBĨVĨP RVFMMF DIF SJDIJFEPOPTGPS[JJOUFOTJFQSPMVOHBUJDPNFJMDJDMJTNP MBNBSDJBPMBDPSTBTVMVOHIFEJTUBO[F TJJNQJFHBJMMFDJUBNFOUFRVFTUPPSNPOFQFSBVNFOUBSFMBDPODFOUSB[JPOFEJHMPCVMJSPTTJOFMTBOHVF*MEPQJOHÍTWFMBCJMFDPO l’ematocrito Ht VO̮BOBMJTJFNBUPMPHJDBDIFSJWFMBJM CHO HO HO 5.6 Bioconversioni 1FSbioconversione BWPMUFJOEJDBUBBODIFDPNFCJPUSBTGPSNB[JPOF TJJOUFOEFVOBTJOUFTJDIJNJDBSFTBQJÜ WFMPDF EBMM̮JOUFSWFOUP EJ CJPDBUBMJ[[BUPSJ 5BMF EFėOJ[JPOF JO SFBMUÆ BQQBSF FTUSFNBNFOUF HFOFSJDB UVĨF MF QSPEV[JPOJCJPUFDOPMPHJDIFQPTTPOPFTTFSFDPOTJEFSBUF USBTGPSNB[JPOJ CJPMPHJDIF EJ VO TVCTUSBUP DIF QVÖ SFBMJ[[BSTJ DPO M̮JOUFSWFOUP EJ FO[JNJ JTPMBUJ P EJ DFMMVMF NJDSPCJDIF in toto -B HSBO QBSUF EFMMF CJPDPOWFSTJPOJ SJHVBSEB QFSÖ MP TWJMVQQP EJ sintesi chemio-enzi- CH 2 OH H2 /cat HO HO OH HO WPMVNFQFSDFOUVBMFPDDVQBUPEBHMJFSJUSPDJUJOFMTBOHVF 7BMPSJOPSNBMJEJFNBUPDSJUPPTDJMMBOPOFMM̮VPNPGSBJM FJM OFMMBEPOOBGSBJMFJM7BMPSJNPMUP QJÜBMUJ RVBMJTJSJMFWBOPOFJDBNQJPOJFNBUJDJDIFSJTVMUBOPQPTJUJWJBJDPOUSPMMJ SFOEPOPPWWJBNFOUFJMTBOHVF BTTBJNFOPĚVJEPDPOVOFMFWBUPSJTDIJPQFSGPSNB[JPOF EJUSPNCJ DPBHVMB[JPOFJOUSBWBTBMF FHSBWJEBOOJSFOBMJ UVĨP JM TBOHVF WJFOF DPOUJOVBNFOUF NJDSPėMUSBUP OFJ HMPNFSVMJ SFOBMJ M̮FDDFTTJWB DPODFOUSB[JPOF EJ HMPCVMJ SPTTJOPOQFSNFĨFJMSFHPMBSFGVO[JPOBNFOUPEFJOFGSPOJ MFVOJUÆGVO[JPOBMJEFJSFOJ CH 2 OH O Acetobacter suboxydans HO OH OH HO CH 2 OH D-glucosio HO CH 2 OH CH 2 OH D-sorbitolo L-sorbosio 5 passaggi sintetici O O HO Acido ascorbico HO (vitamina C) HO CH 2 OH Figura 5.12 Vitamina C. Schema della sintesi della vitamina C con il processo Reichstein. 84 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 5 PROTEINE UMANE RICOMBINANTI, ORMONI E ANTIBIOTICI Glucocorticoidi O O CH2OH CH3 OH O HO Cortisone CH2OH CH3 Corticosterone CH3 CH3 O O O Mineralcorticoidi HO CH2OH CHO Aldosterone CH3 O Androgeni CH3 O OH CH3 Testosterone Androsterone CH3 CH3 HO O Estrogeni CH3 OH CH3 O Estrone OH CH3 Estradiolo OH Estriolo CH3 HO OH HO O Progestinici CH3 CH3 Progesterone CH3 O Figura 5.13 Ormoni steroidei. In figura è riportata una classificazione degli ormoni maggiormente utilizzati in campo farmacologico. 85 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 5 PROTEINE UMANE RICOMBINANTI, ORMONI E ANTIBIOTICI matiche, in cui cioè compaiono sia reazioni chimiche tradizionalmente intese che trasformazioni biologiche. Alcuni microrganismi si sono in effetti dimostrati in grado di intervenire nel processo produttivo di determinate sostanze sostituendosi in alcuni passaggi alla sintesi chimica. Uno dei vantaggi offerti dalle bioconversioni consiste nell’alta specificità e selettività della reazione biocatalizzata: in particolare risulta molto vantaggiosa la stereoselettività, cioè l’azione su uno solo dei possibili stereoisomeri di una molecola. Bioconversioni intervengono, per esempio, nella produzione della vitamina C e in quella degli ormoni steroidi. Produzione di vitamina C La vitamina C viene prodotta utilizzando 5 step di sintesi chimica ma anche con l’intervento del microrganismo Gluconobacter oxydans (Acetobacter suboxydans) che effettua la bioconversione selettiva di ossidazione del dsorbitolo a l-sorbosio (processo Reichstein). Lo schema di sintesi è riportato sommariamente in figura 5.12. Bioconversione di ormoni steroidi Gli ormoni steroidi presentano una formula di base comune, riconducibile al ciclopentanoperidrofenantrene. La diversa tipologia e funzionalità degli ormoni steroidi è da attribuirsi ai vari sostituenti dell’anello. Una schematica classificazione degli ormoni steroidi li suddivide in (figura 5.13): r glucocorticoidi r mineralcorticoidi r androgeni r estrogeni r progestinici. I glucocorticoidi comprendono fra gli altri il cortisone e il corticosterone, sono secreti dalla corteccia surrenale e la loro concentrazione ematica aumenta in condizioni di stress. Hanno azione antinfiammatoria e immunodepressiva; influenzano il metabolismo glucidico. I mineralcorticoidi, fra cui l’aldosterone, sono anch’essi secreti dalla corteccia surrenale e regolano a livello renale l’escrezione e il riassorbimento degli ioni sodio e potassio e dell’acqua. Gli androgeni, fra cui il testosterone e l’androsterone, sono secreti dal tessuto interstiziale dei testicoli e dalla corteccia surrenale. Il testosterone influenza la produzione di spermatozoi e, insieme con gli altri androgeni, è responsabile dello sviluppo dei caratteri sessuali secondari nel maschio. Questi ormoni steroidi hanno anche una spiccata azione anabolizzante. Gli estrogeni più importanti sono l’estrone, l’estradiolo e l’estriolo. Vengono prodotti dagli organi sessuali secondari femminili (ovaie e corpo luteo), regolano il ciclo mestruale e lo sviluppo dei caratteri sessuali secondari femminili. I progestinici sono rappresentati soprattutto dal progesterone, secreto dal corpo luteo. Regolano il ciclo mestruale inibendo la produzione delle gonadotropine ipofisarie (LH e FSH) che promuovono la maturazione dell’ovulo. Sono quindi ormoni con attività contraccettiva. Dal punto di vista industriale l’importanza di questi ormoni è legata al loro impiego in campo farmacologico come antinfiammatori, anabolizzanti e contraccettivi. Per la loro produzione si utilizzano substrati rappresentati da altri steroidi animali o vegetali che vengono modificati in parte da microrganismi (bioconversione) e per il resto chimicamente. Molti steroli sono estratti da vegetali e impiegati come substrati-base per ottenere molecole di elevato interesse farmacologico: vegetali come il barbasco (nome che indica alcune piante del genere Dioscorea) e la soia forniscono, rispettivamente, substrati quali la diosgenina e lo stigmasterolo, molecole impiegate per la produzione di progesterone e altri steroli. Alcuni microrganismi impiegati in reazioni di bioconversione sono Gluconobacter oxydans, Mycobacterium fortuitum, Rhizopus arrhizus e Arthrobacter simplex. Le modificazioni operate da tali microrganismi (idrossilazione, degradazione selettiva di catene laterali, introduzione di doppi legami, deidrogenazioni, ossidazioni ecc.) richiederebbero, se effettuate chimicamente, reazioni più complesse con un maggior numero di passaggi e condizioni operative più critiche. 5.7 Produzione di antibiotici Gli antibiotici sono molecole prodotte da microrganismi, attive nei confronti di altri microrganismi di cui inibiscono lo sviluppo. L’azione antimicrobica di un antibiotico può esprimersi come eliminazione dei micror- 86 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario PROTEINE UMANE RICOMBINANTI, ORMONI E ANTIBIOTICI ganismi (effetto microbicida) o come blocco della loro riproduzione (effetto microbiostatico). La produzione di antibiotici, iniziata negli anni ’40 del secolo scorso, diversi anni dopo la scoperta della penicillina da parte di Fleming (1928), ha avuto da allora un incessante sviluppo, con la progressiva scoperta e messa a punto di nuove molecole, più efficaci e contemporaneamente più tollerate dall’organismo. Le ricerche ricevono continuo impulso dalla constatazione del costante diffondersi dei fenomeni di resistenza microbica: si assiste quindi al continuo sforzo per la sintesi di nuove molecole, che però dopo qualche tempo risultano molto meno efficaci per le sopravvenute resistenze. Un più ampio ventaglio di possibilità alla ricerca farmacologica è offerto dall’avvento delle biotecnologie, con la possibilità di modificare geneticamente i microrganismi produttori di antibiotici indirizzando il loro metabolismo verso la produzione di molecole in grado di aggirare le resistenze batteriche. Si calcola che si conoscano diverse migliaia di sostanze ad azione antimicrobica, delle quali però solo una quota relativamente modesta (un centinaio circa) trova impiego nella terapia antimicrobica. Altre vengono utilizzate come farmaci antitumorali, quando si è disposti a tollerare una serie di effetti collaterali anche pesanti pur di allungare la sopravvivenza del paziente. Per la produzione di antibiotici su scala industriale si utilizzano substrati colturali che in genere provengono da scarti di altre lavorazioni: residui agricoli della lavorazione di barbabietole da zucchero, mais, graminacee e dell’industria lattiero-casearia. I terreni di coltura devono in ogni caso contenere fonti di carbonio organico (amido, polisaccaridi, monosaccaridi) e di azoto come proteine e aminoacidi ricavati da estratti di carne, farine animali o vegetali, latte e derivati. Sono indispensabili sali minerali, vitamine, fattori di crescita. Nella produzione industriale degli antibiotici si distinguono fasi di sporificazione, germinazione e vegetazione condotte nei germinatoi e fasi di produzione all’interno dei fermentatori: per ognuna di queste si utilizzano terreni diversi, arricchiti con le componenti nutritive più appropriate a seconda degli obiettivi specifici (per es. indurre la formazione di spore, la crescita cellulare o la produzione del metabolita desiderato). Come metaboliti secondari gli antibiotici vengono prodotti dai microrganismi nella fase stazionaria di sviluppo; la loro sintesi è sotto il controllo di più di un gene, per cui risulta piuttosto difficoltoso intervenire sul DNA 5 microbico: spesso si preferisce procedere con tecniche mutazionali nel tentativo di creare e selezionare ceppi alto-produttivi e ottenere molecole in grado di aggirare le resistenze batteriche. Accanto agli antibiotici naturali è possibile ottenere antibiotici semisintetici, che derivano da modificazioni del prodotto microbico originario effettuate artificialmente in laboratorio, sostituendo gruppi chimici o catene laterali nella molecola di base. I microrganismi più impiegati per la produzione di antibiotici sono le muffe (Aspergillus, Penicillium), i batteri filamentosi (Streptomyces), altri batteri non filamentosi (Bacillus). Si noti che il solo genere Streptomyces produce da solo oltre la metà delle sostanze antimicrobiche. 5.8 Classi strutturali e meccanismo d’azione degli antibiotici Gli antibiotici possono essere classificati in base alla loro struttura chimica e/o al loro meccanismo d’azione. Antibiotici che inibiscono la sintesi della parete cellulare batterica Gli antibiotici β-lattamici agiscono bloccando le fasi finali della sintesi della parete cellulare, con bersagli d’azione molecolari negli enzimi transpeptidasi e carbossipeptidasi. Sono rappresentati da penicilline, ottenute da Penicillium chrysogenum, e cefalosporine, prodotte da Cephalosporium acremonium (Acremonium chrysogenum). Devono il loro nome alla presenza di un anello caratteristico a 4 atomi di carbonio (anello β-lattamico). Questa caratteristica ne costituisce anche il punto debole, dal momento che molti microrganismi producono l’enzima β-lattamasi, in grado di rompere l’anello inattivando l’antibiotico (figura 5.14). Gli antibiotici β-lattamici semisintetici sono generalmente più resistenti. Questi antibiotici sono fra quelli più frequentemente impiegati nella terapia delle infezioni batteriche: per la loro efficacia, la bassa tossicità e lo spettro d’azione piuttosto ampio costituiscono da soli circa la metà degli antibiotici oggi utilizzati. Il problema dell’antibioticoresistenza ad opera delle β-lattamasi batteriche viene su87 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 5 PROTEINE UMANE RICOMBINANTI, ORMONI E ANTIBIOTICI O R C S NH CH3 CH CH C C N CH R4 R3 R2 CH3 COOH H R1 H N(CH3)2 OH OH O OH O O CONH R5 Tetraciclina Penicillasi O R C S NH O CH3 CH CH C C N H CH CH3 COOH HO Figura 5.14 Penicillasi. La figura illustra il meccanismo d’azione della penicillasi, enzima che rompe l’anello β-lattamico delle penicilline. O CH3 H2O H2O HO N CH3 OH HO OH CH H2O 3 H C H2O O O 3 O O O CH3 CH3 O CH 3 O CH3 H2O OH Eritromicina perato associando all’antibiotico un’altra molecola priva di attività antimicrobica, ma in grado di inibire l’azione dell’enzima formando con esso un legame covalente irreversibile: l’acido clavulanico, prodotto da batteri del genere Streptomyces, in particolare dallo Streptomyces clavoligerus. L’augmentin, uno degli antibiotici più noti, è infatti un’associazione di ampicillina e acido clavulanico. È da sottolineare che l’acido clavulanico funziona come inibitore delle β-lattamasi prodotte da stafilococchi e da gran parte dei Gram-negativi, ma risulta praticamente inefficace su quelle prodotte da Pseudomonas. Figura 5.15 Formule dell’eritromicina e della tetraciclina. Il gruppo degli aminoglicosidici è molto vasto e comprende antibiotici prodotti soprattutto da attinomiceti appartenenti ai generi Streptomyces e Micromonospora. Streptomicina, kanamicina, gentamicina e neomicina, carboidrati con gruppi aminici come sostituenti, sono fra i più noti. Agiscono inibendo la sintesi proteica legandosi alla frazione 16S della subunità ribosomiale 30S. Alcuni derivati semisintetici come l’amicacina sono attivi anche nei confronti di batteri resistenti agli altri aminoglicosidici. Antibiotici che bloccano la sintesi proteica Appartengono a questo gruppo tetracicline, macrolidi e aminoglicosidici. Le tetracicline hanno una molecola costituita da quattro anelli condensati linearmente (figura 5.15a). Questi antibiotici agiscono inibendo la sintesi proteica legandosi alla subunità ribosomiale 30S e impedendo il legame fra tRNA e ribosoma. I macrolidi sono costituiti da un anello macrolattonico a 12-16 atomi di carbonio. Vi appartengono l’eritromicina prodotta da Saccharopolyspora erythraea (figura 5.15b), l’azitromicina e la claritromicina. Agiscono inibendo la sintesi proteica: si legano con la frazione 23S della subunità ribosomiale 50S, con un meccanismo d’azione specifico che blocca il rilascio dei peptidi neoformati dai ribosomi. Antibiotici che alterano le funzioni della membrana cellulare I polipeptidici, fra cui bacitracina (da Bacillus subtilis) e polimixina (da Paenibacillus polymixa), agiscono interferendo con la funzionalità della membrana cellulare batterica, provocandone la lisi. Antibiotici che interferiscono con la sintesi degli acidi nucleici La novobiocina agisce sulla topoisomerasi 2 batterica, coinvolta nella sintesi del DNA; le rifamicine bloccano la sintesi dell’RNA inattivando l’RNA polimerasi batterica. 88 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 5 PROTEINE UMANE RICOMBINANTI, ORMONI E ANTIBIOTICI O 5.9 Produzione di penicilline e cefalosporine S CH2 C CH3 NH CH3 N La produzione industriale degli antibiotici prevede una trofofase (stadio vegetativo per lo sviluppo di biomassa) e una idiofase (fase biosintetica di produzione) in cui il metabolita batterico, cioè l’antibiotico, viene prodotto. Nella trofofase, o stadio vegetativo, il terreno di coltura è particolarmente arricchito ed è messo a punto con l’unico obiettivo di avere il massimo sviluppo cellulare. Lo sviluppo avviene su scala ridotta, in fermentatori semplici e di piccole dimensioni. La produzione avviene con tecnologia fed-batch in reattori STR in acciaio inox di dimensioni non eccessive (30-200 m3) per minimizzare il rischio di inquinamento microbico, pericolo frequente per il pH non selettivo del mezzo colturale, l’aggiunta progressiva di nutrienti, i tempi relativamente lunghi del processo. Penicillina G o Benzilpenicillina O S L’unione fra anello tiazolidinico e anello β-lattamico dà origine all’acido 6-aminopenicillanico (6-APA), molecola base delle penicilline semisintetiche (figura 5.17). È soprattutto la composizione della catena laterale C CH3 NH CH3 N COOH O Penicillina V o Fenossimetilpenicillina O S CH C CH3 NH CH3 N NH2 COOH O Ampicillina O S Oxacillina Gli antibiotici β-lattamici vengono sintetizzati partendo da aminoacidi e sono caratterizzati da: r anello β-lattamico (indispensabile per l’attività antimicrobica) r anello tiazolidinico (dagli aminoacidi valina e cisteina) r catena laterale, la cui struttura differenzia le varie penicilline. CH2 O Produzione di penicillina La penicillina viene prodotta da colture di Penicillium chrysogenum. Le penicilline ottenute vengono impiegate sia in farmacologia umana e veterinaria, sia come molecole-base per ottenere le penicilline semisintetiche. È possibile distinguere diversi tipi di penicilline: r naturali (G e V) (figura 5.16) r semisintetiche (ampicillina, amoxicillina) r resistenti alla β-lattamasi (meticillina, cloxacillina, oxacillina) r ad ampio spettro, attive anche su Pseudomonas (carbenicillina, meziocillina, piperacillina). COOH O C C N C O C NH N O CH3 CH3 COOH CH3 Figura 5.16 Caratteristiche delle penicilline naturali. La struttura comune di tutte le penicilline è composta da un anello β-lattamico e un nucleo tiazolidinico. a influenzare le proprietà dell’intera molecola quanto a resistenza in ambiente acido, spettro antimicrobico, sensibilità alla β-lattamasi e ad altre proprietà farmacologiche. L’acido fenilacetico e fenossiacetico devono essere aggiunti come precursori delle catene laterali delle penicilline G e V. Impiegando precursori diversi è possibile ottenere un numero elevato di molecole, delle quali solo alcune possiedono attività antimicrobica e sono utilizzabili in farmacologia. Penicilline naturali Sono di origine naturale la penicillina G (benzilpenicillina) e V (fenossimetilpenicillina). Il microrganismo coinvolto nella loro sintesi è Penicillium chrysogenum (Fleming aveva impiegato il Penicillium notatum), che dopo innumerevoli processi di mutagenesi e ricombinazione genetica può produrre penicillina con una buona resa (50 g/L). La produzione ha luogo in coltura som89 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 5 PROTEINE UMANE RICOMBINANTI, ORMONI E ANTIBIOTICI mersa, alla temperatura di 25-27 °C. La produzione si suddivide in due fasi successive: r fase I o di sviluppo (trofofase): utilizza un terreno di coltura composto da saccarosio o glucosio (fonti di C), oli vegetali in funzione di antischiuma, corn steep liquor (fonte di N), fattori vari di crescita. Il pH viene mantenuto su valori di 6-7, controllando che il corn-steep liquor non provochi eccessiva acidità nel substrato. r fase II o di produzione (idiofase): il terreno di coltura utilizza lattosio o glucosio, con un pH mantenuto intorno a 7-7,2. Accorgimenti di particolare importanza da adottare per non abbassare la resa produttiva consistono nell’evitare di fornire un eccesso di fonti di carbonio e di azoto che potrebbero innescare fenomeni di inibizione a feedback. Per questo si utilizza il rifornimento di carbonio in fedbatch, tarando la velocità di rifornimento su quella di utilizzazione e mantenendo la concentrazione di C inferiore a quella che produce inibizione. È preferibile inoltre impiegare fonti complesse di N (e C) che per loro natura vengono metabolizzate lentamente. Devono essere aggiunti acido fenilacetico e fenossiacetico come precursori delle catene laterali. La penicillina viene isolata per estrazione in controcorrente con acetato di amile. più resistenti alla β-lattamasi e presentano un più ampio spettro di attività antimicrobica. Cefalosporine La loro scoperta in ceppi di Cephalosporium chrysogenum si deve al ricercatore italiano G. Botzu (1945) mentre al 1964 risale l’introduzione sul mercato della prima cefalosporina semisintetica. Le cefalosporine hanno uno spettro d’azione più ampio delle penicilline, nonché un minor grado di tossicità. Quelle utilizzabili in farmacologia si sono succedute nel corso del tempo in varie generazioni: r I generazione: attive soprattutto sui Gram-positivi r II generazione: attive soprattutto sui Gram-negativi, meno sui Gram-positivi; discretamente resistenti alla β-lattamasi r III generazione: molto attive nei confronti dei Gramnegativi, buona resistenza alla β-lattamasi, miglior farmacocinetica Produzione di cefalosporine a partire dalla penicillina Penicillina G Substrato di partenza Espansione anello tiazolidinico Penicilline semisintetiche Cefalosporina Vengono prodotte a partire da penicillina G (raramente V) previo distacco della catena laterale ad opera dell’enzima penicillina acilasi (generalmente ottenuto da ceppi mutanti di E. coli) con formazione di 6-APA (figura 5.17). Viene poi aggiunta per sintesi chimica una diversa catena laterale. Le penicilline semisintetiche presentano un grado di stabilità più elevato in ambiente acido, sono Catena laterale 7-ACA Inserimento catena laterale Cefalosporina di semisintesi Espansione dell’anello tiazolidinico S S Acido 6-aminopenicillanico (6-APA) H2N O H H S CH3 R + catena N CH3 laterale R H CO2H Distacco catena laterale con penicillina aciliasi HN H H N O S CH3 CH3 H CO2H Figura 5.17 Preparazione di penicilline semisintetiche e attività delle penicilline. N O N O 6-APA 7-ACA Figura 5.18 Produzione di cefalosporine e di 7-ACA partendo da 6-APA. 90 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario PROTEINE UMANE RICOMBINANTI, ORMONI E ANTIBIOTICI r IV generazione: ampio spettro d’azione sia su Gram-positivi che su Gram-negativi, resistenti alla β-lattamasi. La produzione delle cefalosporine naturali (cefalosporina C o CPC) avviene con una procedura analoga a quella delle penicilline naturali, con la dovuta attenzione anche in questo caso ai fenomeni di inibizione da feedback in presenza di sorgenti di C e N a pronta assimilazione. Le cefalosporine semisintetiche vengono prodotte da cefalosporina C o anche da penicillina G e V. In entrambi i casi l’acido 7-aminocefalosporanico (7ACA), ottenuto dalla molecola di CPC dopo il distacco della catena laterale, rappresenta il composto chiave a cui vengono aggiunte catene laterali diverse, così come avviene per l’acido 6-aminopenicillanico (6-APA) nella produzione delle penicilline. Il distacco della catena laterale originaria viene effettuato per via enzimatica con una acilasi ottenuta da E. coli. Partendo da penicillina, in particolare da penicillina G, si procede dapprima con l’espansione dell’anello tiazolidinico (figura 5.18), quindi con il distacco della catena laterale. 5 5.10 Statine e altre molecole di impiego medico e zootecnico Altre importanti molecole sono prodotte da microrganismi; fra queste le statine sono molecole impiegate per la terapia della ipercolesterolemia. Esse agiscono infatti inibendo a livello epatico la sintesi di colesterolo. Anche se alcune fra le principali statine sono prodotte per sintesi chimica, altre sono naturali o semisintetiche come la lovastatina, la pravastatina e la simvastatina prodotte da Aspergillus terreus, Monascus ruber, Penicillium spp. Doxorubicina (adriamicina), bleomicina e mitomicina sono (antibiotici) antitumorali prodotti da alcuni streptomiceti. L’epotilone è un altro antitumorale prodotto da un micobatterio, con meccanismo d’azione simile al taxolo, originariamente estratto da Taxus brevifolia, ma che può anche essere prodotto da un fungo endofitico. Fra le sostanze ad azione immunosoppressiva, la ciclosporina A, prodotta da Tolypocladium inflatum è la molecola più nota; altri immunosoppressori sono l’acido micofenolico e il brenidin, prodotti, rispettivamente, da Penicillium e da Eupenicillium. Sostanze come le avermectine, prodotte da Streptomyces avermitilis, sono ampiamente usate come antiparassitari contro nematodi e artropodi nei bovini, ovini e maiali. Altre sostanze ad azione antibiotica (polieteri) sono impiegate contro i coccidi nel pollame. 91 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario ESERCIZI DI VERIFICA 1. Le penicilline e le cefalosporine agiscono: A impedendo la sintesi della membrana cellulare B interferendo con la sintesi proteica C impedendo la formazione di legami del peptidoglicano D inibendo la funzionalità della membrana cellulare 2. Per tossicità selettiva di un antibiotico si intende la capacità di essere: A dannoso per una specie batterica e non per altre B dannoso per i batteri e non per i tessuti dell’ospite C tossico per le specie batteriche selezionate con l’antibiogramma 3. Gli antibiotici β-lattamici sono: A penicilline e cefalosporine B tetracicline C aminoglicosidici 4. La β-lattamasi è un enzima prodotto: A dagli antibiotici β-lattamici B da alcuni batteri C dai microrganismi sensibili alle penicilline 5. L’acido clavulanico è un: A antibiotico β-lattamico B inibitore della β-lattamasi C un prodotto secondario nella produzione delle penicilline e delle cefalosporine 6. La biosintesi mutazionale o mutasintesi è una tecnica che consente di: A creare antibiotici resistenti B creare microrganismi incapaci di sintetizzare determinati precursori molecolari C selezionare microrganismi in grado di produrre mutazioni particolari 8. La produzione di penicillina è massima: A nella fase di crescita stazionaria B nella fase di crescita logaritmica C quando le cellule non si riproducono più e svolgono solo attività metabolica 9. Lo spettro d’azione di un antibiotico è: A la varietà di microrganismi su cui è efficace B la capacità di essere tossico per i batteri e non per gli organismi superiori C la possibilità di agire in vari modi sui microrganismi 10. Il testosterone è un ormone: A femminile B maschile C antinfiammatorio 11. Gli ormoni sono prodotti da: A ghiandole endocrine B ghiandole esocrine C proteine circolanti nel sangue D midollo osseo E ghiandole che riversano il loro contenuto indirettamente all’esterno del corpo 12. L’insulina è formata da: A tre catene polipeptidiche B due catene polipeptidiche C quattro catene polipeptidiche uguali due a due 13. Gli anticorpi monoclonali sono: A anticorpi in grado di inattivare solo un clone di cellule antigeniche B anticorpi che derivano da uno stesso clone di cellule C linfociti B tutti uguali fra di loro 7. La penicillina è prodotta mediante colture: A anaerobie sommerse B aerobie sommerse C aerobie su terreno solido 92 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 6 PRODUZIONI BIOTECNOLOGICHE ALIMENTARI 6.1 Il vino 6.2 L’aceto 6.3 La birra 6.4 Il pane e i prodotti da forno a lievitazione naturale 6.5 Lo yogurt 6.6 I vegetali fermentati 6.7 Esopolisaccaridi Le biotecnologie tradizionali per la produzione di alimenti e bevande si sono tramandate per millenni; la nascita della microbiologa e in tempi molto più recenti quella delle tecnologie del DNA ricombinante hanno poi permesso di gestire questi processi, utilizzati prima in modo inconsapevole, secondo criteri scientificamente più corretti, a tutto vantaggio della qualità del prodotto e della sicurezza del consumatore. Tutti i processi fermentativi utilizzati prima che si conoscessero i microrganismi possono essere interpretati come tecniche empiriche di conservazione o di utilizzo diversificato di risorse alimentari evitandone lo spreco: così il latte si “conserva” più a lungo se trasformato in yogurt o ancora di più in formaggio; i vegetali si conservano se fermentati; il vino può essere un modo di conservare l’uva, bevande come la birra hanno indubbiamente caratteristiche più piacevoli e meno pericolose dal punto di vista microbiologico di un’acqua di dubbia provenienza. 6.1 Il vino Il batterio Leuconostoc (© Dennis Kunkel Microscopy, Inc.). La produzione del vino, così come quella di altre bevande alcoliche, risale a tempi molto antichi, effettuata tradizionalmente con metodi empirici. Solo quando ci si rese conto che erano microrganismi (i lieviti) i veri artefici della trasformazione del succo d’uva in vino si è passati lentamente dalla produzione artigianale (che comunque perdura tuttora, figura 6.1a) a quella di impronta industriale, basata sull’impiego di tecnologie avanzate e su conoscenze biochimiche e microbiologiche approfondite (figura 6.1b). L’odierna produzione di vini di qualità impiega 93 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario PRODUZIONI BIOTECNOLOGICHE ALIMENTARI ces ellipsoideus. I lieviti apiculati sono gli iniziatori della fermentazione e sono caratterizzati da basso potere fermentativo e scarsa alcol-tolleranza (max 6-8%). Vengono ben presto sostituiti dagli ellittici che mostrano una più elevata tolleranza all’etanolo fino a una concentrazione di alcol prossima al 16%. La produzione industriale si avvale di colture di lieviti selezionati, che vengono inoculati nel mosto dopo una sua pastorizzazione. L’inoculo viene generalmente eseguito inizialmente con colture di Saccharomyces rosei come starter, quindi con S. cerevisiae in grado di portare la produzione di alcol fino al 13% circa ed eventualmente con S. bayanus che, fermentando tutto lo zucchero presente, può arrivare a produrre fino al 16% di alcol etilico. La fermentazione alcolica è indubbiamente la trasformazione biochimica principale nella produzione del vino, con un coefficiente di resa effettiva pari a circa 0,6 in volume di alcol etilico (capitolo 4): C6H12O6 2 C2H5OH + 2CO2 Accanto a questa reazione se ne verificano altre, in quella che si può definire, nel complesso, “fermentazione vinaria” e che porta allo sviluppo di numerose sostanze chimiche che nel loro insieme contribuiscono al caratteristico “bouquet” di un certo tipo di vino. Tali reazioni sono, fra le altre: r la trasformazione del diidrossiacetonfosfato in glicerina r la fermentazione di aminoacidi, che porta alla liberazione di alcoli superiori r la fermentazione malolattica, che consiste nella trasformazione di acido malico in acido lattico ad opera di lattobacilli. Questa fermentazione porta alla diminuzione dell’acidità del vino e alla maturazione del prodotto e risulta particolarmente importante nei vini rossi, cui conferisce corpo e rotondità (figura 6.2). COOH 6 Nel processo produttivo si devono poi registrare altri processi di tipo fisico-chimico, come precipitazione di sostanze insolubili, decantazioni e solubilizzazione di coloranti presenti nella buccia. Alterazioni microbiche del vino Il vino può andare incontro ad alterazioni di origine microbica, anche se si tratta di eventi piuttosto rari in quanto facilmente prevenibili con la pastorizzazione e la solfitazione dei mosti durante la fermentazione: r lo sviluppo di batteri acetici (Gluconobacter e Acetobater) causa spunto e acescenza, che conducono alla trasformazione dell’alcol in aceto r i batteri lattici (Lactobacillus, Leuconostoc e Pediococcus) danno origine a diverse alterazioni, fra cui l’agrodolce (sviluppo di acido lattico, acido acetico e mannite), il filante (vino di consistenza mucillaginosa), l’amaro, il girato (intensa torbidità e sviluppo di CO2) r la fioretta è dovuta allo sviluppo di lieviti (Candida, Pichia, Hansenula) che provocano la formazione di un velo biancastro superficiale quando il vino viene lasciato a contatto con l’aria. 6.2 L’aceto L’aceto di vino è prodotto da ceppi di Acetobacter e Gluconobacter in grado di ossidare l’alcol etilico ad acido acetico. Si tratta quindi di un’ossidazione e non di una fermentazione. Il processo biochimico presenta una fase in cui un’alcol-deidrogenasi catalizza la formazione di acetaldeide, subito deidrogenata ad acido acetico da un’aldeidedeidrogenasi in presenza di NAD+. Elettroni e idrogeno COOH CHOH CHOH + CO2 Malicodecarbossilasi CH2 CH3 COOH Acido malico Acido lattico Figura 6.2 Fermentazione malolattica. 95 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 6 PRODUZIONI BIOTECNOLOGICHE ALIMENTARI r essiccazione/torrefazione, in cui l’orzo germinato viene riscaldato fino a circa 70 °C per l’essiccazione della radichetta che viene eliminata. Il malto così ottenuto si utilizza per la produzione della birra chiara, mentre per ottenere quella scura occorre raggiungere i 105 °C, temperatura alla quale si ha una parziale caramellizzazione degli zuccheri. L’aggiunta di altri cereali richiede una loro preventiva macinazione e riduzione in farina. A queste operazioni segue l’ammostamento o saccarificazione, che ha lo scopo di ottenere un mosto zuccherino fermentabile e che consiste nella macinazione del malto e nella sua miscelazione con la farina di cereali e acqua, poi riscaldata per diverse ore a temperature comprese fra 45 e 73 °C. Le temperature vanno scelte in funzione dell’attività enzimatica di amilasi e proteasi, che devono degradare i polisaccaridi e le proteine per fornire ai lieviti monomeri utilizzabili. La saccarificazione prevede una prima fase di infusione (riscaldamento della miscela a 65 °C attraverso l’infusione di acqua calda e successiva filtrazione per eliminare i residui in sospensione o trebbie) e quindi la decozione, in cui il mosto viene addizionato di luppolo e portato all’ebollizione per circa tre ore, per estrarne le sostanze aromatiche e sterilizzare il tutto. Il mosto viene a questo punto raffreddato fino a 6 °C, filtrato e inoculato con i lieviti prescelti, quindi viene immessa una certa quota di ossigeno per attivare la riproduzione dei saccaromiceti. Si verifica una prima fermentazione tumultuosa (per circa 6-7 giorni), al termine della quale la birra viene separata dalle cellule e travasata in contenitori chiusi dove avviene la fermentazione lenta con sviluppo di CO2. Come nel caso del vino, anche per la birra la fermentazione alcolica non rappresenta che uno solo degli eventi biochimici che Preparazione del malto Macerazione in acqua dell’orzo Macinazione Germinazione Essiccazione Orzo Farina di orzo maltato Separazione delle trebbie Luppolo Mosto Raffreddamento Filtrazione Bollitura del mosto Riscaldamento a ~ 65 °C Inoculo di lievito Birra Fermentazione primaria Maturazione o fermentazione secondaria Filtrazione Confezionamento Figura 6.6 Schema generale dei passaggi di produzione della birra. 98 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario Miscelazione con acqua PRODUZIONI BIOTECNOLOGICHE ALIMENTARI portano al prodotto finito: accanto all’alcol etilico si forma infatti una serie di composti come acidi organici, esteri, alcoli superiori, vitamine del gruppo B, sostanze amaricanti e aromi vari, che contribuiscono alla definizione delle caratteristiche organolettiche. Con la filtrazione si allontanano dalla birra residui solidi come cellule di lievito e resine coagulate. Si procede infine alla pastorizzazione, con cui si inattivano gli enzimi e i microrganismi presenti al fine di conferire stabilità al prodotto: si può effettuare a 60 °C per 20 min oppure a 70 °C per 1-1,5 min. Segue il confezionamento. Alterazioni della birra Durante le varie fasi di produzione la birra può andare incontro a contaminazioni dovute a microrganismi presenti negli impianti, nelle materie prime, nell’ambiente. Il rischio aumenta quando si utilizzano lieviti residui da lavorazioni precedenti, in cui possono essere presenti lieviti selvaggi, batteri lattici e bacilli. I lattobacilli (in particolare Lactobacillus brevis, Pediococcus damnosus, Lactococcus lactis) sono responsabili di ossidazioni e sviluppo di acetoino e diacetile, sostanze che causano torbidità e cambiamenti apprezzabili di colore e sapore. La contaminazione da enterobatteri (Hafnia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter) provoca formazione di dimetilsolfuro e conferisce alla birra aromi di frutta o di latte. 6.4 Il pane e i prodotti da forno a lievitazione naturale La produzione di pane e prodotti da forno è collegata a quella dei lieviti, che sono gli artefici della lievitazione dell’impasto composto di farina e acqua. Alla trasformazione possono concorrere anche batteri, in particolare lattobacilli o batteri lattici in genere, che svolgono prevalentemente un’azione acidificante che favorisce il potere lievitante di saccaromiceti. Anche la produzione di pane, molto probabilmente una scoperta del tutto casuale, si fa risalire a tempi assai remoti. È opportuno ricordare che per la preparazione di alcuni prodotti da forno è impiegato lievito chimico (bicarbonato di sodio e acido tartarico), che nulla ha a che fare con il processo di lievitazione naturale svolto dai saccaromiceti. Il microrganismo d’elezione è il Saccharomyces cere- 6 visiae, che provoca la lievitazione dell’impasto formato da farina, acqua e sale. Nella farina sono contenuti carboidrati (amido) e gli enzimi α- e β-amilasi, che vengono attivati dall’acqua aggiunta per formare l’impasto. Le amilasi degradano l’amido a zuccheri semplici (monosaccaridi) che vengono metabolizzati dai saccaromiceti attraverso la via fermentativa glicolitica (EMP, capitolo 1), con la produzione di alcol etilico, CO2 e altre sostanze secondarie. C6H12O6 2 C2H5OH + 2CO2 Nel corso della fermentazione l’anidride carbonica che si libera durante la fermentazione sotto forma di bolle fa rigonfiare (lievitare) l’impasto di farina e acqua, rendendolo più soffice, spugnoso e digeribile. L’alcol etilico sviluppato in modesta quantità evapora durante la cottura, mentre altri prodotti secondari della fermentazione, come acido succinico, acido lattico e glicerina, conferiscono al pane aromi e caratteristiche organolettiche tipiche, anche in relazione al tipo di farina impiegato per l’impasto. La lievitazione dell’impasto di farina e acqua si fa av- LA CELIACHIA (INTOLLERANZA AL GLUTINE) Alcuni soggetti (in Italia circa una persona su cento, anche se molti adulti non sanno di esserlo) sono permanentemente intolleranti al glutine per predisposizione genetica: attualmente l’unica terapia è la completa e assoluta esclusione del glutine dalla dieta, pena l’atrofia dei villi intestinali con gravi alterazioni nell’assorbimento delle sostanze nutritive. Spesso la sintomatologia (dolore e gonfiore addominale, dissenteria o stipsi, dimagrimento, anemia, affaticamento; nei bambini è frequente una facile irritabilità) è confusa con più comuni affezioni intestinali (varie forme di colite ecc.) e a volte negli adulti è anche asintomatica, pur portando nel lungo periodo a conseguenze da malnutrizione. La celiachia può essere diagnosticata con la ricerca nel sangue degli anticorpi anti-transglutaminasi (tTG), anti-gliadina (AGA) e anti-endomisio (EMA). La conferma definitiva viene fatta con una biopsia intestinale (duodeno) per valutare le lesioni e il grado di atrofia dei villi. 99 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 6 PRODUZIONI BIOTECNOLOGICHE ALIMENTARI SEMOLE E FARINE Dalle cariossidi di frumento (o grano) si ottengono gli sfarinati con le operazioni di pulitura, macinazione e abburattamento o setacciatura. Quest’ultima non viene eseguita nella preparazione delle farine integrali, che quindi contengono anche frammenti delle parti periferiche delle cariossidi (crusca). Le specie di frumento attualmente coltivate sono soprattutto quello duro (Triticum durum, figura 6.7) e quello tenero (Triticum vulgare). Dalla macinazione del grano duro si ottengono semole e semolati a grana grossa e di colore ambrato, dal grano tenero si ottiene la farina, a grana fine o finissima e di colore bianco. Le semole e i semolati si utilizzano normalmente per la produzione della pasta; la farina, impastata con acqua e lieviti, viene impiegata per la preparazione del pane e dei prodotti da forno, nonché per quella di paste fresche. Le farine di grano tenero si possono suddividere a seconda del grado di raffinazione nelle classi 00, 0, 1, 2 venire anche per fermentazione acida, in cui l’impasto è lasciato acidificare in modo naturale (pasta madre), per utilizzarne poi una parte per inoculare un successivo impasto. L’acidificazione è effettuata in primo luogo dai batteri lattici omofermentanti, che però non sono in grado di apportare al prodotto finale gli aromi caratteristici, effetto che invece si attribuisce ai batteri lattici eterofermentanti in quanto produttori di acido propionico, valerico, isovalerico, isobutilico. Componenti fondamentali della farina di frumento, oltre all’amido, sono due proteine (gliadina e glutenina) presenti nelle cariossidi dei cereali come frumento, farro, segale, kamut, orzo, avena, spelta e tricale che, in presenza di acqua, vanno a formare il glutine, una lipoproteina che conferisce all’impasto maggior coesione, elasticità e viscosità. Il glutine subisce prima modificazioni strutturali durante l’azione meccanica dell’impasto, quindi anche chimiche per opera dei lieviti che liberano cisteina e glutatione per rottura di ponti disolfuro: ciò contribuisce a rendere il pane più digeribile. Nella preparazione del pane vengono adottate condizioni operative variabili soprattutto in fase di cottura, che comunque prevedono la formazione di una crosta superficiale dovuta alla caramellizzazione della parte in base al “tasso di abburratamento” (t), cioè alla resa finale in kg di sfarinato per 100 kg di frumento. Il tasso di abburratamento è più alto per le farine poco raffinate. Per esempio, la farina 00 ha un valore t pari al 50%, quella 0 ha un t = 72%. Figura 6.7 Triticum durum (fonte: www.wikipedia.com). più esterna dell’impasto, che assolve anche al compito di prolungare la conservabilità del prodotto. 6.5 Lo yogurt Ottenuti in origine dalla fermentazione spontanea del latte a temperature comprese fra 40 e 45 °C, lo yogurt e altri prodotti simili vengono ottenuti industrialmente con l’impiego di colture starter di fermenti lattici selezionati che, aggiunti al latte fresco, ne provocano la trasformazione per la fermentazione del lattosio e la produzione di acido lattico. Lo yogurt tradizionalmente inteso, ottenuto dall’azione fermentativa di batteri quali Lactobacillus bulgaricus e Streptococcus thermophilus, è il prototipo di altri prodotti simili, che si differenziano per il tipo di latte, i microrganismi impiegati e le tecnologie produttive, ma che dal punto di vista biochimico hanno sostanzialmente la stessa origine. Si tratta di prodotti con una storia molto antica: r il kefir, ottenuto in origine in Turchia dal latte di capra con l’intervento di lieviti che producono anche una piccola quota di alcol etilico (2%) 100 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario PRODUZIONI BIOTECNOLOGICHE ALIMENTARI r il toette, di origini scandinave, di consistenza vischiosa r l’acidophilus milk (diffuso negli USA e in Germania) r il gioddu o miciurato, prodotto tipico della Sardegna e con una piccola percentuale di alcol per la presenza di lieviti r il mazun, prodotto in Armenia con il latte di capra, pecora o bufala r il kumis, prodotto di origine russa ottenuto con latte di giumenta r il leben, tipico di Egitto, Siria e Paesi nordafricani r il kos, prodotto in Albania da latte ovino o di vacca. L’argomento è trattato in modo più approfondito nel capitolo 12. 6.6 I vegetali fermentati La conservazione di alimenti vegetali tramite fermentazione è un altro aspetto della microbiologia industriale che ha radici molto antiche. La produzione industriale di vegetali fermentati riguarda soprattutto cetrioli, olive e crauti (cavoli acidi); in misura minore carote, cipolle, cavolfiore. I microrganismi responsabili delle trasformazioni fermentative sono soprattutto lattobacilli. Questi, insieme ad altri batteri anaerobi o facoltativi, prendono ben presto il sopravvento sugli aerobi, una volta esaurito l’ossigeno a disposizione dopo l’introduzione dei vegetali negli appositi recipienti (tini di fermentazione). Si avvia quindi la fermentazione lattica ad opera di batteri omo- ed eterofermentanti, con produzione di acidi organici (lattico e acetico), CO2, etanolo. L’ambiente acido creatosi agisce a questo punto come fattore di selezione e permette la sopravvivenza e lo sviluppo esclusivamente dei batteri acido-tolleranti microaerofili e relativamente alofili, data la concentrazione salina che nei crauti può arrivare fino al 2,5%. I microrganismi che sviluppano in un simile ambiente sono batteri appartenenti ai generi Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus e alcuni lieviti appartenenti ai generi Candida, Debaromyces, Saccharomyces, Pichia, Zygosaccharomyces. I lieviti producono sostanze aromatiche (acetoino e diacetile), etanolo, CO2 e dalla loro lisi si liberano nutrienti (peptidi, aminoacidi, vitamine) utilizzati dai batteri. I lieviti possono però provocare anche alterazioni o fenomeni 6 indesiderati, quali il rammollimento del prodotto o lo sviluppo di gas. In ultima analisi, quindi, la conservabilità di questi prodotti e i loro caratteri organolettici sono da attribuire all’acidità del mezzo che impedisce lo sviluppo di batteri putrefattivi, allo sviluppo di sostanze chimiche diverse (prodotti organici volatili provenienti da attività fermentativa) nonché a reazioni enzimatiche interne dei tessuti vegetali. Crauti Si ottengono per fermentazione di cavolo cappuccio (Brassica oleracea var. capitata, figura 6.8). I cavoli subiscono un pretrattamento che consiste nel taglio a piccole strisce. Segue la salatura, lo stoccaggio in barili e la pressatura. I contenitori vengono chiusi con coperchi (in legno come i barili) su cui si pongono pesi. Dai coperchi deve poter fuoriuscire il gas che si sviluppa nella fermentazione. La pressatura porta alla fuoriuscita dai tessuti vegetali di essudato, che rappresenta il mezzo colturale in cui si sviluppano i microrganismi. Può essere aggiunta una piccola quantità di zucchero che favorisce lo sviluppo microbico. Sulla superficie della salamoia si sviluppa generalmente un film di lieviti (fioretta) che viene eliminato, ma che comunque risulta importante per evitare lo sviluppo di muffe produttrici di sapori e odori sgradevoli o sostanze tossiche (micotossine). Figura 6.8 Brassica oleracea var. capitata. 101 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 6 PRODUZIONI BIOTECNOLOGICHE ALIMENTARI La produzione industriale, che deve fare ricorso a starter di inoculazione selezionati e costituiti da una comunità ben precisa di microrganismi per ottenere un prodotto con caratteristiche standard, si articola schematicamente in tre fasi successive, per un tempo totale di circa 6-7 settimane: r in una prima fase, della durata di circa 3 giorni, si sviluppano e agiscono batteri aerobi e anaerobi facoltativi (Acinetobacter, Gluconobacter, Acetobacter, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pseudomonas, che operano dapprima un metabolismo ossidativo e poi fermentativo. r in una fase successiva, esaurito l’ossigeno disponibile, si sviluppano i batteri lattici soprattutto eterofermentanti (Leuconostoc mesenteroides) r nella fase finale (che inizia dopo circa 6 giorni) l’acidità raggiunta è tale da inibire tutti i microrganismi tranne Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis e Pediococcus. Olive Si possono preparare con olive verdi oppure con olive mature o nere. I microrganismi presenti normalmente sulle olive, nell’acqua impiegata e sugli strumenti di lavoro rappresentano la flora microbica fermentante. Si tratta di batteri (lattici e non), lieviti e muffe (tabella 6.1). La preparazione delle olive viene eseguita con il metodo sivigliano o con quello naturale. Nel primo caso si impiegano olive raccolte al giusto punto di maturazione, nel secondo si possono utilizzare sia olive mature che verdi. Le olive vengono deamarizzate con NaOH (allontanamento per idrolisi dell’oleuperina di sapore amaro), quindi lavate e poi immerse in salamoia al 7%: ciò provoca la fuoriuscita dalla drupa di zuccheri, vitamine, sostanze azotate, sali minerali. La fermentazione è operata da batteri lattici (Streptococcus, Lactobacillus, Pediococcus) fino a raggiungere i valori ottimali di acidità (pH < 5), con una concentrazione di acido lattico pari allo 0,5-0,6%. Si sviluppano in tali condizioni pressoché esclusivamente lieviti (Debaromyces, Candida, Hansenula, Rhodotorula) che producono vitamine e fattori nutrizionali utilizzati dai lattobacilli. La fermentazione è completata in due mesi circa, con pH finale di 4 e acido lattico all’1%, in una salamoia al 6% di NaCl. Il prodotto può venire anche pastorizzato. La tecnica di preparazione naturale non contempla la fase di deamarizzazione, che in realtà avviene spontaneamente nel corso della fermentazione, per solubilizzazione delle sostanze amare. La fermentazione anche in questo caso è compiuta da batteri lattici: in superficie nella salamoia si crea una membrana costituita da lieviti (Pichia, Hansenula, Debaromyces, Candida), muffe (Rhizopus, Aspergillus, Penicillium, Alternaria) e batteri (Micrococcus e Bacillus). Anche se i microrganismi sono ossidanti e tendono ad innalzare il pH, la membrana microbica è indispensabile per la disacidificazione della salamoia e la produzione degli aromi. L’intero processo dura generalmente 7-9 mesi. Il confezionamento per Tabella 6.1 Microrganismi nelle olive BATTERI LATTICI BATTERI NON LATTICI LIEVITI E MUFFE Lactobacillus brevis Pseudomonas Saccharomyces Lactobacillus plantarum Achromobacter Torulopsis (Candida) Lactobacillus casei subsp. casei Serratia Hansenula Lactobacillus casei subsp. pseudoplamarum Flavobacterium Candida Enterococcus faecium Xantomonas Rhodotorula Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris Sarcina Pichia Leuconostoc paramesenteroides Enterobacter Pediococchi Propionobatteri Fusarium Bacillus Aspergillus Clostridium 102 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 6 PRODUZIONI BIOTECNOLOGICHE ALIMENTARI Tabella 6.2 Funzioni, applicazioni e settori di impiego dello xantano ALIMENTARE NON-ALIMENTARE Emulsionante in salse (per es. maionese) Stabilizzante dei colori Incapsulazione di aromi in polvere Carrier di fertilizzanti ed erbicidi Formazione di film Addensante dei coloranti tessili Stabilizzante (gelati e salse) Produzione di carta di alta qualità Inibitore di sineresi (formaggi e alimenti congelati) Recupero terziario nell’industria petrolifera Addensante (marmellate, succhi, sciroppi) Facilita il movimento di materiale pastoso (per es. dentifricio) Stabilizzante di schiuma (birra) la vendita avviene in contenitori di piccole dimensioni, con rinnovo della salamoia al 7-8% di sale e chiusura a tenuta d’aria che garantisce l’anaerobiosi. Si può procedere anche alla pastorizzazione. extracellulari, di origine capsulare, che vengono liberati nel mezzo colturale. I principali polisaccaridi di origine microbica sono xantano, destrano, alginato. Xantano Cetrioli I cetrioli vengono raccolti maturi e introdotti in recipienti con una salamoia al 5-8% di NaCl e spezie varie, aneto e droghe (per spezie si intendono le piante speziate essiccate e in polvere, le droghe sono le essenze delle spezie). La fermentazione che segue è simile a quella dei crauti, fino al raggiungimento di un pH di circa 3,5. Nella preparazione industriale si utilizzano anche colture starter di Lactobacillus plantarum. Alla fine della fermentazione i cetrioli sono immersi in salamoia (3,5%) e aceto in presenza di sorbati come conservanti. 6.7 Esopolisaccaridi Molti polisaccaridi sono ottenuti tradizionalmente da piante superiori o alghe, come l’alginato, la gomma arabica, la carragenina, l’agar-agar e impiegati come gelificanti, addensanti, emulsionanti, stabilizzanti. Diversi microrganismi, a seconda del loro patrimonio genetico e delle caratteristiche del mezzo colturale, sono però in grado di produrre polisaccaridi che possono sostituire vantaggiosamente quelli di origine vegetale, con il vantaggio di avere una composizione standard. Sono di interesse industriale soprattutto i polisaccaridi Conosciuto nei Paesi europei come addensante E415, viene prodotto da Xantomonas campestris. È un eteropolisaccaride ramificato (figura 6.9) dotato di interessanti proprietà: facilmente solubile dà soluzioni viscose anche a bassa concentrazione; in soluzione ha un comportamento pseudoplastico; può interagire con altri polimeri. Trova numerosi campi d’impiego, sia in campo alimentare che in altri settori (tabella 6.2). Per la produzione di xantano si impiegano substrati come amido, melasso, glucosio, saccarosio, siero di latte. L’azoto è fornito da corn-steep, idrolizzati di soia o caseina, peptoni, sali ammoniacali, urea. La produzione 4 Gluc 1 4 Gluc 1 Mann* Ac. gluc * gruppo acetile ** piruvato Mann** Figura 6.9 Struttura dello xantano. È un eteropolisaccaride ramificato, costituito da un’unità pentasaccaridica ripetuta: D-glucosio, D-mannosio, acido D-glucuronico, in rapporto 2:2:1. 103 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 6 PRODUZIONI BIOTECNOLOGICHE ALIMENTARI Destrano È un importante polisaccaride di origine microbica, impiegato inizialmente come sostituto del plasma sanguigno e per altri scopi clinici, ma anche come componente di resine chimiche separatrici (Sephadex) e nel settore alimentare. È un omopolisaccaride lineare, prodotto da microrganismi quali Leuconostoc mesenteroides e Leuconostoc destranicum. Il substrato utilizzato è il saccarosio, trasformato dall’enzima destransaccarasi in destrano (che incorpora il glucosio) e fruttosio, liberato nel substrato. Figura 6.10 Pseudomonas aeruginosa. L’immagine mostra il batterio P. aeruginosa, usato industrialmente per la produzione di alginato, al microscopio elettronico (fonte: CDC/Janice Carr). avviene in coltura sommersa a pH 7, alla temperatura di 28-30 °C. L’elevata viscosità del polisaccaride può causare problemi in sede di separazione dalle cellule, estrazione e recupero del prodotto. Alginato Questo polisaccaride, presente naturalmente in alcune alghe rosse (Gelidium), viene prodotto industrialmente da ceppi di Pseudomonas aeruginosa (figura 6.10) e Azotobacter vinelandii. L’alginato è costituito da acido mannuronico e acido glucuronico. L’impiego maggiore è in campo alimentare, ma viene utilizzato anche come supporto per l’immobilizzazione di microrganismi e per la preparazione di resine a scambio ionico. 104 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario ESERCIZI DI VERIFICA 1. La lievitazione produce: A anidride carbonica e acqua B anidride carbonica C anidride carbonica e alcol etilico D anidride carbonica, acqua e alcol etilico 7. La fermentazione vinaria è operata da: A lieviti B lieviti e batteri C lieviti e muffe D batteri 2. Il glutine è una: A proteina del luppolo B proteina del frumento C delle proteine presenti nel mais 8. Il malto è: A un monosaccaride contenuto nel luppolo B un polisaccaride contenuto nell’orzo C orzo germinato D orzo trattato con luppolo 3. I microrganismi responsabili della formazione dello yogurt sono: A streptococchi ed enterobatteri B lattobacilli e streptococchi C Staphylococcus lactis e Lactococcus termophilus 9. Nella preparazione della birra il lievito è aggiunto al: A mosto cotto B mosto prima della cottura C malto tal quale 4. I destrani sono: A polisaccaridi B monosaccaridi gelatinosi C resine poliviniliche 10. La melassa deriva da: A lavorazione di carni bovine B barbabietola e canna da zucchero C fermentazione del glucosio 5. I destrani si ottengono da: A Propionibacter cauloparvum B Leuconostoc mesenteroides C Escherichia coli var. dexii D Pedosporum cruzei 11. Nella riproduzione di lieviti un eccesso di carboidrati può spostare le reazioni verso: A l’anaerobiosi B una maggior velocità di riproduzione C un aumento di biomassa 6. I destrani sono impiegati come: A antibatterici B antitumorali C sostituti del plasma nelle trasfusioni 12. L’amilopectina è un polimero del: A D-glucosio B L-glucosio C maltosio 105 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 7 BIOTECNOLOGIE IN CAMPO AGRARIO, ZOOTECNICO E SANITARIO 7.1 Biotecnologie in campo agrario 7.2 Tecniche di trasformazione 7.3 Identificazione delle cellule trasformate 7.4 Piante transgeniche 7.5 La micropropagazione 7.6 Aspetti legislativi 7.7 Biotecnologie nel settore veterinario e zootecnico Il panorama delle biotecnologie nei settori dell’agricoltura, della zootecnia e in ambito medico-farmacologico è estremamente variegato e in continua evoluzione. Come descritto più in dettaglio in altri capitoli, grazie alle biotecnologie si ottengono farmaci, vaccini, ormoni, anticorpi. La terapia genica di gravi malattie è uno degli obiettivi cui tende la ricerca biomedica. La tecnologia del DNA ricombinante in agricoltura può sostituire, agendo direttamente a livello genetico, i tradizionali metodi di incrocio e selezione delle specie vegetali. Tramite il trasferimento di geni si possono ottenere piante ingegnerizzate resistenti ai parassiti e cereali con proprietà nutrizionali potenziate. Al pari delle piante, sono stati creati anche animali transgenici, allo scopo di produrre, per esempio nel loro latte, proteine di interesse farmacologico. 7.8 Il sessaggio del seme in zootecnia 7.9 La tracciabilità genetica 7.10 Applicazione delle biotecnologie in campo biomedico e farmacologico 7.11 Principi attivi per uso farmaceutico da piante superiori 7.12 La terapia genica 7.13 Vettori di geni 7.1 Biotecnologie in campo agrario Il settore agrario è fra quelli che più hanno tratto vantaggio dai progressi delle biotecnologie. Si sono così potute ottenere rese considerevolmente più elevate di prodotto, miglioramenti nella qualità e nel potere nutritivo degli alimenti. È possibile aumentare la resistenza delle piante alle malattie e ai parassiti con una parallela diminuzione del ricorso all’impiego di sostanze chimiche sul campo. Un aspetto applicativo di estremo interesse è la produzione di molecole farmacologicamente attive da parte di molte piante superiori. La tutela dell’ambiente e la diminuzione dei rischi per la salute dei consumatori sono due importanti conquiste delle biotecnologie applicate in questo settore. 106 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 7 BIOTECNOLOGIE IN CAMPO AGRARIO, ZOOTECNICO E SANITARIO Gli enormi progressi delle biotecnologie hanno portato alla possibilità di inserire nelle piante specifici geni di interesse (transgeni) codificanti per alcuni caratteri desiderati. Queste piante vengono indicate come PGM (piante geneticamente modificate) o transgeniche, in grado di trasferire alla discendenza il gene introdotto artificialmente, che può teoricamente provenire da qualsiasi specie vivente. Il processo è la risultante della combinazione fra la coltura in vitro dei tessuti vegetali e la tecnologia del DNA ricombinante. La possibilità di coltivare piante in vitro a partire da cellule vegetali meristematiche totipotenti offre un ampio ventaglio di possibili applicazioni. Nei vegetali, coltura in vitro e clonazione sono realizzabili senza troppe difficoltà per perseguire obiettivi di miglioramento genetico, produrre piante immuni da infezioni virali o da micoplasmi, per la conservazione del germoplasma e la propagazione clonale o per riprodurre una pianta intera da cellule geneticamente modificate. Le cellule vegetali presentano una caratteristica molto interessante: sono in grado di passare da uno stadio differenziato a uno indifferenziato e viceversa. Nei vegetali la differenziazione cellulare e la conseguente specializzazione di forma e funzioni nei diversi tessuti sono caratteristiche dipendenti dalle concentrazioni relative di ormoni specifici. La dimostrazione pratica di questo fenomeno si verifica in natura quando, per esempio, una pianta subisce una ferita: in corrispondenza dei tessuti lesi si forma infatti un nuovo tessuto cicatriziale indifferenziato (callo cicatriziale) che rimargina la lesione (figura 7.1). In seguito queste cellule indifferenziate subiscono il differenziamento evolvendo in vasi conduttori, tessuti corticali ecc. 7.2 Tecniche di trasformazione A prescindere dalle tecniche impiegate per ottenerle, le piante transgeniche rappresentano il risultato di eventi di ricombinazione genetica, fenomeno che peraltro si verifica normalmente fra cromosomi omologhi nella riproduzione sessuale (crossing-over). I sistemi per creare piante transgeniche possono essere suddivisi in diretti e indiretti. Sistemi diretti Trasformazione con batteri La più nota tecnica di trasferimento di geni impiega il batterio Agrobacterium tumefaciens, che è in grado di inserire naturalmente propri geni nel nucleo delle cellule vegetali, in particolare nelle dicotiledoni. L’ingresso del batterio è in sostanza una vera e propria infezione: Agrobacterium, che si trova nel terreno, entra attraverso ferite nella zona del colletto in risposta a sostanze emesse dai tessuti vegetali lesi, che stimolano l’attività di specifici geni di virulenza (vir) presenti nel plasmide batterico Ti (tumor inducing). L’infezione provoca nelle piante la formazione del “tumore del colletto” e la produzione di opine, aminoacidi modificati utilizzati dalle cellule batteriche come fonte di carbonio ed energia. Introducendo geni estranei per mezzo del plasmide è possibile modificare il DNA delle piante (figura 7.2). Cellula vegetale Transgene BT Geni vir Ori Mais BT Figura 7.1 Callo cicatriziale. Figura 7.2 Utilizzo di Agrobacterium tumefaciens per produrre piante geneticamente modificate. 107 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 7 BIOTECNOLOGIE IN CAMPO AGRARIO, ZOOTECNICO E SANITARIO Sistemi indiretti Trasformazione con cannone a microsfere Un “cannone” particolare è in grado di trasformare cellule vegetali sparando letteralmente all’interno dei tessuti vegetali microparticelle di oro o tungsteno (0,4-1 micron) ricoperte di DNA. In questo modo si hanno ragionevoli probabilità che il DNA esogeno venga incorporato nel genoma della pianta “bombardata”. Questa tecnica trova applicazione nella trasformazione di numerose monocotiledoni: si possono, per esempio, trattare embrioni immaturi di riso. Tali embrioni sono successivamente stimolati a produrre calli, da cui si originano germogli e radici. Segue il trasferimento in terra. l’ingresso di DNA plasmidico esogeno destinato a integrarsi nel genoma della cellula. I protoplasti trasformati e mantenuti in idonei substrati e condizioni colturali riformano la parete cellulare e danno origine a colonie cellulari e a calli da cui si originano piante trasformate. Due protoplasti provenienti da specie diverse e incompatibili in natura (che cioè non si possono incrociare naturalmente) possono essere indotti a fondersi dando origine a un ibrido somatico (fusione di protoplasti ottenuti da cellule somatiche, capitolo 2). Il più delle volte questi ibridi sono però sterili. Durante la proliferazione dei calli derivati da tale fusione in genere uno dei nuclei può venire eliminato. Un’applicazione di questa procedura è rappresentata dal trasferimento di geni di resistenza da specie selvatiche alle corrispondenti specie coltivate di interesse agrario. Elettroporazione Consiste nell’impiego di una corrente elettrica per indurre la penetrazione di DNA esogeno in protoplasti vegetali (capitolo 2). Trasformazione con protoplasti Cellule vegetali private della parete con enzimi cellulosolitici diventano protoplasti (figura 7.3). L’ulteriore trattamento con polietilenglicol causa l’aumento di permeabilità della membrana cellulare permettendo Figura 7.3 Protoplasti. Cellule vegetali trattate con cellulasi e pectinasi diventano protoplasti. 7.3 Identificazione delle cellule trasformate Le tecniche precedentemente descritte prevedono obbligatoriamente una fase in cui le cellule trasformate devono essere identificate e quindi separate da quelle che non hanno acquisito il gene d’interesse: la trasformazione è sempre un evento possibile per somma di probabilità. Inoltre una cellula ospite può venire trasformata, ma il gene può non venire espresso. Struttura e configurazione del gene trasferito condizionano notevolmente la possibilità della sua integrazione e della sua espressione nell’ospite. Diventa quindi fondamentale la scelta del gene promotore, cioè la sequenza di DNA deputata alla trascrizione dei geni strutturali. Uno di questi geni è indicato con la sigla 35S (CaMV) del virus del mosaico del cavolfiore. Per rendere possibile la selezione vengono inseriti, insieme con il gene di interesse, alcuni geni marcatori (marker o reporter) che codificano per proprietà facilmente identificabili, quali la resistenza ad antibiotici, la produzione di luciferasi o la sintesi di enzimi. È diffuso l’impiego del gene di E. coli che codifica per la sintesi dell’enzima β-glucoronidasi (GUS): questo enzima catalizza l’idrolisi di glucuronidi formando un composto di colore azzurro/blu visibile nei tessuti delle piante che hanno subìto la trasformazione (figura 7.4). 108 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 7 BIOTECNOLOGIE IN CAMPO AGRARIO, ZOOTECNICO E SANITARIO Figura 7.4 β-glucuronidasi. La figura mostra piante con colorazione blu data dalla reazione catalizzata dalla β-glucuronidasi. 7.4 Piante transgeniche Piante transgeniche che fissano l’azoto atmosferico L’introduzione di geni NIF (nitrogen fixation) nelle radici di piante permette a queste ultime di fissare direttamente l’azoto atmosferico convertendolo in nitrati. Il possesso di tali geni è prerogativa di batteri appartenenti ai generi Rhizobium, Azotobacter e Clostridium, dei quali il primo è simbionte delle radici delle leguminose, gli altri vivono liberi nel suolo. L’ingegneria genetica può trovare il modo di inserire tali geni nelle piante, indipendentemente dall’infezione batterica. Piante transgeniche resistenti agli insetti Bacillus thuringiensis (figura 7.5) è un batterio che produce una tossina nociva per larve e insetti fitopatogeni, ma innocua per le piante e l’uomo. Tale composto, di origine naturale, è inoltre facilmente degradabile e non si accumula nell’ambiente. Il gene responsabile viene prelevato dal batterio, inserito in un plasmide vettore e trasferito nella pianta, che diventa così in grado di secernere autonomamente la sostanza tossica nei propri tessuti. Nell’apparato digerente dei parassiti che si cibano della pianta, tale sostanza viene convertita nella forma tossica e ne provoca la morte. La produzione di insetticidi naturali è una delle più promettenti applicazioni della biotecnologia per la Figura 7.5 Bacillus thuringiensis (Dennis Kunkel Microscopy, Inc.). salvaguardia dell’ambiente con l’obiettivo di ridurre l’impiego di pesticidi. Piante transgeniche resistenti al gelo La formazione di cristalli di ghiaccio sulle piante è legata al contemporaneo sviluppo di batteri appartenenti ai generi Pseudomonas, Xantomonas ed Erwinia. Tali batteri (ice+) possiedono geni inaZ e inaW che codificano per la sintesi di una proteina superficiale che favorisce la diffusione dei cristalli di ghiaccio su tutta la pianta. Se si inoculano le piante con concentrazioni elevate di batteri ice− privati di questi geni, essi inibiscono competitiva109 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 7 BIOTECNOLOGIE IN CAMPO AGRARIO, ZOOTECNICO E SANITARIO mente lo sviluppo degli ice+ prevenendo la formazione di ghiaccio. 7.5 La micropropagazione La riproduzione di piante da meristema o micropropagazione rappresenta un importante settore delle biotecnologie agrarie e ha una notevole rilevanza economica. Tale sistema consiste nel riprodurre piante partendo da piccolissime parti, anche singole cellule, prelevate da espianti caulinari (del fusto), come le gemme ascellari o apicali. Le piante così ottenute sono dei cloni della pianta madre. La micropropagazione si realizza in diverse fasi: r reperimento e sterilizzazione degli espianti r impianto r proliferazione e allungamento dei germogli r radicazione r acclimatazione. L’espianto è di solito costituito da tessuto meristematico o dall’apice vegetativo di un germoglio o di una gemma. La sterilizzazione dell’espianto è premessa indispensabile per il successo dell’intera operazione: si effettua tramite immersione in alcol 80% e quindi in NaClO al 10% per 30 min. Si procede quindi al lavaggio con acqua sterile; tutte le operazioni vanno effettuate sotto cappa a flusso laminare. La sterilizzazione si effettua in autoclave per i contenitori e il mezzo colturale. Gli espianti sterili vengono posti in coltura in provette per un periodo di circa 30 giorni, quindi posti in camera di crescita con fotoperiodismo controllato. I germogli iniziano a proliferare, quindi vengono prelevati e trasferiti in nuovo terreno colturale per ottenere altre piantine (figura 7.6). La formazione di nuovi germogli è collegata all’alto contenuto di citochinine nel terreno di coltura. Il cambiamento della concentrazione di ormoni (aumento delle auxine e riduzione o eliminazione delle citochinine), induce la radicazione degli espianti. La fase di acclimatazione al substrato in cui gli espianti radicati vengono infine trasferiti è molto delicata e richiede un attento e costante controllo di tutti i parametri che ne condizionano la sopravvivenza nelle condizioni naturali. Per coltivare in vitro i tessuti vegetali sono necessari terreni colturali di particolare e complessa composizione, contenenti un’ampia gamma di sali minerali, miscele di vitamine e una fonte di carboidrati (saccarosio). Figura 7.6 Micropropagazione di piante in vitro. Componenti indispensabili sono inoltre gli ormoni vegetali auxine e citochinine, che hanno ruoli fondamentali nella rigenerazione dei tessuti vegetali. Questi ormoni, che influenzano la produzione dei germogli o quella delle radici, devono essere somministrati in proporzione bilanciata e in rapporti ponderali precisi, a seconda della direzione verso cui si vuole indirizzare lo sviluppo (germogli o radice): le auxine stimolano la radicazione; le citochinine stimolano la divisione cellulare. Altri ormoni necessari sono le gibberelline, la cui attività di allungamento degli internodi varia anche in relazione al tipo di pianta e del tessuto vegetale che si intendono coltivare. I terreni di coltura hanno pH oscillante fra 5 e 6, vengono solidificati con agar e sterilizzati come i normali terreni per microbiologia (20 min a 121 °C). La coltivazione in vitro o micropropagazione ha avuto un notevole sviluppo e viene usata soprattutto per la riproduzione di piante da frutto, da fiore e per le colture orticole. Un fenomeno particolarmente interessante che si verifica con una discreta frequenza nei cloni in vitro è la variabilità somatica clonale (somaclonale), che si manifesta con l’apparizione di cloni diversi dalle linee parentali. Si tratta di mutazioni che si verificano nelle cellule meristematiche e che interessano caratteri morfologici. Il fenomeno viene indagato al fine di poter eliminare tali mutanti se si vuole mantenere la purezza genetica delle piante, ma anche per poter sfruttare queste mutazioni per introdurre una maggior variabilità genetica da cui poter ottenere piante nuove e/o migliori. Pompelmo rosa, mandarancio, pesca nettarina insieme con molte varietà di piante per la floricoltura sono altrettanti esempi di varianti somatiche coltivate. 110 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario BIOTECNOLOGIE IN CAMPO AGRARIO, ZOOTECNICO E SANITARIO 7.6 Aspetti legislativi Piante e sementi geneticamente modificate vengono prodotte in molte parti del mondo. L’Europa e l’Italia sono al momento attuale apertamente contrarie all’impiego di sementi e alla coltivazione di piante OGM, almeno in attesa di dati sicuri in merito alla loro innocuità. In effetti emergono almeno tre ordini di preoccupazioni: r la possibile propagazione incontrollata e non governabile di caratteri genetici nuovi ad altri organismi, con la conseguente alterazione di delicati equilibri ambientali e della biodiversità r i timori in merito ai pericoli per la salute umana derivanti dal consumo di piante transgeniche r implicazioni di carattere politico-economico derivanti dai brevetti su sementi e innovazioni biotecnologiche. Ciò porterebbe al trasferimento del controllo del settore agroalimentare, strategicamente rilevante nell’economia di un Paese, dall’ambito pubblico a quello privato detentore dei brevetti. Norme comunitarie e nazionali vietano al momento l’introduzione di sementi non incluse nel “registro nazionale delle sementi” a cui non è iscritta nessuna varietà OGM (legge 1096/71 mod. dal D. Lgs. 212/2001). La legge prevede quindi una sorta di tolleranza zero, anche se a causa dell’impollinazione crociata il mantenimento della purezza assoluta all’interno delle specie risulta in pratica irraggiungibile. 7.7 Biotecnologie nel settore veterinario e zootecnico L’aumento della popolazione mondiale fa emergere sempre di più la necessità di una aumento delle produzioni animali oltre che di quelle vegetali. L’incremento delle produzioni animali dipende dal miglioramento delle condizioni ambientali, delle tecniche di gestione degli allevamenti, dal miglioramento genetico. In quest’ultimo caso le biotecnologie sono ampiamente utilizzate e si traducono in: r incremento delle possibilità riproduttive r miglioramento della qualità dei prodotti r migliore utilizzo dei nutrienti nell’alimentazione degli animali r più efficace controllo delle loro condizioni di salute 7 r più elevato grado di sicurezza alimentare, attraverso un’ampia disponibilità di strumenti diagnostici per la tracciabilità e il controllo di qualità degli alimenti. Applicazioni biotecnologiche particolarmente importanti in campo zootecnico riguardano: r genomica strutturale e funzionale r sessaggio del seme r tracciabilità genetica. La genomica si occupa dell’analisi, dell’identificazione e dell’espressione dei geni. La genomica strutturale riguarda l’analisi della struttura del genoma, più in particolare l’individuazione della localizzazione dei geni, mentre la genomica funzionale indaga l’espressione dei geni come proteine, in altre parole la proteomica. I due approcci di ricerca integrano metodi e obiettivi al fine di identificare loci genetici che presiedono all’espressione di caratteri particolarmente interessanti dal punto di vista economico-produttivo. Per esempio, si possono indagare i geni in grado di influenzare il carattere “tenerezza della carne”, parametro particolarmente apprezzato e controllato, oltre che da fattori ambientali, di allevamento e nutrizionali, anche a livello genetico. La tenerezza della carne dipende infatti dalla natura e dal tipo delle fibre muscolari, dalle caratteristiche del collagene e dal grasso intramuscolare. Le ricerche hanno permesso di identificare particolari e specifiche regioni cromosomiche deputate o comunque associate all’espressione di questi caratteri all’interno delle masse muscolari dell’animale. La selezione dei caratteri desiderati viene effettuata con l’impiego di marcatori o direttamente sul gene regolatore responsabile. Applicazioni importanti sono rappresentate inoltre dalle ricerche di paternità, basate sul confronto fra il genoma di un individuo e quello dei genitori. Tali tecniche sono basate sulla ricerca di “loci marcatori”, cioè microsatelliti ad alto grado di polimorfismo e abbondantemente distribuiti all’interno del genoma. La genomica animale trova importante applicazione anche nello studio delle differenze genetiche fra razze. Ciò permette di studiare e comprendere le relazioni di affinità o parentela fra razze diverse, appurarne le eventuali origini comuni, valutare il grado di variabilità genetica all’interno delle popolazioni. Si possono così avviare e mettere a punto programmi di conservazione 111 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario BIOTECNOLOGIE IN CAMPO AGRARIO, ZOOTECNICO E SANITARIO 7 pregio per la produzione della carne. Si ha anche vantaggio economico dalla maggior produzione di vitelli meticci: le vacche non destinate a produrre rimonta (cioè la quota di ricambio generazionale fra le fattrici di una mandria) vengono fecondate da tori da carne per avere vitelli meticci di valore economico più elevato rispetto ai vitelli maschi di razze pure da latte. iti dal formaggio francese “Beaufort” (da razze Tarantaise e Abondance) e dall’italiano Fontina, prodotto esclusivamente con latte di vacche di razza Valdostana. 7.9 La tracciabilità genetica Le applicazioni delle biotecnologie nel settore biomedico sono numerose e di estrema rilevanza: le tecnologie del DNA ricombinante hanno reso possibile la produzione su scala industriale di molecole terapeutiche un tempo non disponibili o ottenibili con difficoltà e in scarsa quantità. Nel sistema di certificazione ISO 8420 viene data la seguente definizione di tracciabilità: “possibilità (attitudine) di risalire a storia, utilizzazione o localizzazione di un prodotto attraverso identificazioni registrate”. Nel settore alimentare ci si riferisce all’acquisizione di informazioni sull’origine del prodotto, sulle materie prime utilizzate, sulle tecniche di produzione. In zootecnia la tracciabilità consiste nella possibilità di risalire all’identità degli animali e all’origine dei prodotti attraverso tutta la filiera, dall’allevamento alla vendita al consumo. I casi di BSE e di altre pericolose patologie o contaminazioni microbiche o chimiche delle carni hanno evidenziato l’importanza di poter disporre di adeguate informazioni su origine, provenienza, luogo di macellazione e trattamento dei prodotti. La preferenza da parte dei consumatori per i prodotti locali o comunque di origine nazionale, ottenuti da allevamenti improntati al benessere dell’animale e al rispetto dell’ambiente, così come le produzioni derivate da agricoltura biologica, ne sono un chiaro esempio. A tutto ciò si aggiunge l’avversione (giustificata o meno) per i prodotti geneticamente modificati (OGM). La tracciabilità, in ultima analisi, si traduce in una garanzia di qualità per il consumatore, ma anche di identificazione e di tutela per il produttore. La tracciabilità genetica si fonda sull’identificazione del DNA, possibile in tutte le parti dell’animale, e sulla possibilità di risalire alla sua origine confrontando il profilo genetico ottenuto dalla carne con un database che contiene i profili di tutti gli animali. Il profilo genetico è utilizzato per le carni, ma può essere trasferito in altri settori alimentari, per esempio nel campo dei prodotti lattiero-caseari. Nel caso di formaggi tipici che si fregiano di indicazioni di origine protetta e prodotti con il latte di vacche di una sola razza, diventa possibile verificare se la provenienza del latte utilizzato corrisponde o meno a quella dichiarata. Esempi in tal senso sono costitu- 7.10 Applicazione delle biotecnologie in campo biomedico e farmacologico Prodotti farmaceutici e diagnostici La produzione di vaccini, proteine ricombinanti, ormoni, antibiotici, sonde molecolari per impiego diagnostico, anticorpi monoclonali costituisce l’esempio più significativo dei risultati ottenuti in campo farmacologico dalle biotecnologie: r proteine ricombinanti: eritropoietina, insulina, somatotropina, somatostatina, interferoni, interleuchine, fattore VIII della coagulazione, attivatore tissutale del plasminogeno (t-PA), fattore di crescita per i granulociti polimorfonucleati (GM-CSF), fattore di crescita epidermico (EGF) sono esempi di proteine ottenute da batteri ingegnerizzati (capitolo 5) r farmaci antineoplastici: il DNA ricombinante ha reso possibile la sintesi di molecole che agiscono bloccando proteine indispensabili alla crescita delle cellule tumorali. Per esempio, l’imatinib è un farmaco impiegato nella terapia della leucemia mieloide cronica, causata da una proteina anomala sintetizzata da un gene presente nei malati portatori di un’anomalia cromosomica particolare (cromosoma Filadelfia, vedi scheda) r anticorpi monoclonali, ottenuti dalla coltura in vitro di cellule di mieloma di topo ibridate con linfociti umani produttori di anticorpi (capitolo 5) r antigeni ricombinanti per la produzione di vaccini: la tecnologia del DNA ricombinante permette di sintetizzare antigeni proteici specifici della superficie di molti virus patogeni, indipendente113 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 7 BIOTECNOLOGIE IN CAMPO AGRARIO, ZOOTECNICO E SANITARIO 1 Si isolano il DNA Cellula batterica Gene lacZ Cellula umana plasmidico e quello umano Sito di restrizione 2 Si tagliano entrambi i campioni di DNA con lo stesso enzima di restrizione 3 Si mescolano i DNA: R Plasmide gene amp (resistenza batterico all’ampicillina) essi si uniscono attraverso appaiamento di basi. I prodotti comprendono molti plasmidi non ricombinanti e alcuni ricombinanti Gene di interesse “sticky ends”: estremità adesive Gene dell’insulina 4 Si introduce il DNA in cellule batteriche che hanno una mutazione del gene lacZ che permette di distinguere la cellula trasformata dalle altre Plasmidi ricombinanti 5 I microrganismi ricombinati vengono posti in bioreattori dove producono insulina Figura 7.8 Schema di produzione dell’insulina umana con tecniche del DNA ricombinante. LA LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA La leucemia mieloide cronica è caratterizzata dalla crescita incontrollata di globuli bianchi (leucociti) causata da un’anomalia genetica acquisita (quindi non ereditaria) presente nel cromosoma 22, che appare più corto del normale. Questo cromosoma è denominato “Filadelfia” e scambia alcuni tratti con il cromosoma 9: il frammento che si stacca dal cromosoma 9 a livello di un gene denominato Abelson (ABL) si sposta sul 22, mentre un frammento del 22 (dove la rottura si verifica in corrispondenza del gene BCR (breakpoint cluster region) va sul 9. Questo fenomeno è un esempio di traslocazione bilanciata. Ne deriva la formazione di un mente dalle rimanenti frazioni virali. I geni virali che codificano per tali proteine vengono clonati ed espressi in batteri (E. coli) e lieviti (Saccharomyces cerevisiae), ottenendo così i vaccini ricombinanti (capitolo 5) gene ibrido “di fusione” (BCR-ABL) che codifica per una proteina anomala, principale responsabile della trasformazione delle cellule staminali emopoietiche in cellule leucemiche. Il fenomeno riguarda esclusivamente le cellule staminali del midollo emopoietico e di conseguenza tutte le cellule del sangue, che dal midollo hanno origine. Le cellule dei tessuti mostrano invece un cariotipo non alterato. Gli studi di biologia molecolare con la scoperta del gene ibrido BCR-ABL e della proteina anomala prodotta, insieme con le possibilità offerte dalla tecnologia del DNA ricombinante, hanno permesso la sintesi di inibitori dell’oncogène e/o della proteina anomala (inibitori della tirosina-chinasi). r sonde geniche con le quali, con tecniche come Northern e Southern blotting, sono possibili numerose applicazioni in associazione alla PCR: dall’identificazione di microrganismi, a quella di geni mutanti, al DNA fingerprinting. 114 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario BIOTECNOLOGIE IN CAMPO AGRARIO, ZOOTECNICO E SANITARIO 7 lanata (figura 7.9): alcune linee cellulari di questa specie sono in grado di convertire la β-metildigitossina (ottenuta chimicamente dalla digitossina) in β-metildigossina impiegata in cardiologia. 7.12 La terapia genica Figura 7.9 Digitalis lanata. 7.11 Principi attivi per uso farmaceutico da piante superiori Molte sostanze chimiche farmacologicamente attive vengono ottenute da piante superiori: si può stimare che circa un quarto dei farmaci contenga principi attivi di derivazione vegetale. Per superare le difficoltà legate alla coltivazione in campo di queste piante e per la necessità di svincolare la produzione dei farmaci da variabili non controllabili dall’uomo, quali la disponibilità e le caratteristiche del terreno da destinare alla coltivazione, il clima ecc., la ricerca si è rivolta alla coltivazione diretta in vitro delle cellule vegetali per disporre di una fonte alternativa, che potesse garantire caratteristiche di qualità e produzione costanti, da cui estrarre i principi attivi utili in farmacologia. Un esempio di utilizzo di cellule vegetali analogo a quello di cellule microbiche nella bioconversione degli ormoni steroidi (capitolo 5) si ha nella trasformazione della digitossina, un glicoside scarsamente impiegato come tale in cardiologia per l’elevata tossicità, in digossina. La digitossina viene estratta da foglie di Digitalis L’individuazione anche precoce di anomalie genetiche con test che rilevano mutazioni per mezzo di sonde a DNA e tecniche di ibridazione rappresenta uno dei progressi più straordinari della medicina. La cura delle anomalie geniche è a volte possibile tramite la terapia genica con il trapianto di geni sani negli individui malati, almeno nei casi in cui l’alterazione è a carico di un singolo gene: l’inserimento del gene normale corregge l’anomalia. Ciò avviene con l’utilizzo di un vettore che solitamente è un retrovirus, e prevede l’inserimento diretto dei geni o il prelievo dal paziente delle cellule malate, la loro coltivazione e trasformazione con il gene normale e la loro reintroduzione nel paziente. La terapia genica può essere effettuata in due modi: ❖ in vivo, quando i geni clonati vengono inseriti direttamente nelle cellule del paziente. Si impiega questa tecnica se le cellule non possono essere prelevate, coltivate, trasformate e reimpiantate oppure non è possibile farlo con quantitativi sufficienti di cellule ❖ ex vivo, quando le cellule possono essere prelevate dal paziente, coltivate e trasformate in vitro e reimpiantate (per es. le cellule del midollo emopoietico e quelle epiteliali). Uno dei problemi centrali della terapia genica è riuscire a inserire il gene normale nelle cellule dell’organismo in modo stabile, facendo cioè in modo che anche la discendenza esprima il gene trapiantato. Un simile risultato è ottenibile se si opera su cellule che non hanno ancora completato il loro differenziamento: in altri termini, si tratta di operare su cellule staminali o embrionali. Le cellule staminali del midollo osseo emopoietico danno origine a tutti i tipi di cellule del sangue, compresi i linfociti dell’immunità. Nella sindrome da immunodeficienza combinata grave (SCID) le cellule del midollo osseo emopoietico di bambini colpiti dalla malattia non possono produrre l’enzima ADA (adenosina deaminasi) per la presenza di una mutazione. Il deficit immunitario 115 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 7 BIOTECNOLOGIE IN CAMPO AGRARIO, ZOOTECNICO E SANITARIO che ne consegue è estremamente grave: con la terapia genica un virus vettore trasporta il gene corretto all’interno del linfociti periferici, che sono così in grado di produrre regolarmente l’enzima. La terapia genica, di cui non si conoscono ancora tutte le possibili incognite, presenta comunque diversi rischi: il retrovirus utilizzato come vettore potrebbe per esempio inserirsi in prossimità di oncogèni (geni normalmente silenti che codificano per proteine tumorali) e indurne l’attivazione. Oltre a ciò sono note le perplessità di ordine etico-morale e le esplicite contrarietà da parte di molti in merito all’impiego di queste tecniche sull’uomo. 7.13 Vettori di geni L’introduzione di DNA esogeno in una cellula bersaglio richiede la presenza di un vettore in grado di trasportarlo al suo interno. Tali vettori possono essere non virali (DNA legato a molecole che facilitano l’attraversamento della membrana plasmatica) oppure virali. I virus infatti, nella loro condizione di parassiti endocellulari obbligati, hanno la peculiare caratteristica di introdurre il loro genoma nella cellula parassitata. I vettori virali attualmente utilizzati sono retrovirus, adenovirus e herpes virus. Alcuni (retrovirus) sono in grado di integrare il loro genoma in quello della cellula ospite, altri (adenovirus e virus erpetici) non lo fanno. L’assemblaggio di un vettore virale prevede come operazione fondamentale l’eliminazione dei geni responsabili dell’attività patogena del virus: ciò fra l’altro consente di disporre di più spazio per l’inserimento, insieme al transgene, di un packaging di espressione, cioè di una sequenza nucleotidica che permetta l’espressione del gene trasferito. Vettori retrovirali Si tratta di virus a RNA, in cui l’enzima trascrittasi inversa opera la sintesi di una molecola di DNA complementare che può integrarsi con il DNA cellulare. Più in particolare, il virus vettore che trasporta il transgene attraversa la membrana plasmatica della cellula bersaglio, quindi il genoma virale a RNA viene retrotrascritto in DNA a doppia catena, che entra nel nucleo e si integra nel DNA della cellula ospite. Come ogni altro gene cellulare, il transgene viene a questo punto prima trascritto in mRNA e poi tradotto in proteina, quindi espresso. I vettori derivati da retrovirus possono ospitare inserti di DNA lunghi fino a 8 kb. Fra i vantaggi dei vettori retrovirali sono soprattutto importanti la capacità di integrazione stabile anche nella discendenza, che si traduce nella possibilità di terapia genica prolungata nel tempo. L’integrazione e l’espressione esclusivamente in cellule proliferanti ne permette inoltre l’attività su tumori localizzati in tessuti non proliferanti, in cui solo le cellule tumorali invece si dividono: l’infezione è quindi limitata e selettiva, e non interessa in genere i tessuti limitrofi. Il rovescio della medaglia è rappresentato dalla non applicabilità in tessuti con attività replicativa ridotta o assente, come il tessuto nervoso, e dalla non applicabilità alla terapia genica in vivo per l’azione di killing operata dal sistema immunitario sulle cellule trasformate. L’impiego di questi vettori ha diverse incognite, fra cui l’eventualità che l’integrazione nel genoma cellulare avvenga in modo non controllato, al punto da determinare mutagenesi inserzionale: può avvenire in pratica che l’inserzione del transgene si verifichi all’interno di geni essenziali per la vita e le funzioni delle cellule ospiti, al punto da causarne la morte. L’inserzione può inoltre avvenire all’interno di geni oncosoppressori inattivandoli, oppure di oncogèni silenti causandone l’attivazione. Si ricorda che i geni oncosoppressori sono geni che reprimono l’espressione di geni potenzialmente oncògeni, mentre gli oncogèni sono geni tumorali normalmente silenti, cioè inattivi. L’attivazione di questi ultimi può in effetti avvenire per azione di sostanze chimiche, radiazioni, infezioni virali ecc. Si possono inoltre verificare altre possibili conseguenze indesiderate: variazioni nelle capacità e modalità di risposta cellulare nei confronti di fattori di crescita, ormoni, citochine e conseguente possibile acquisizione di oncogenicità; o ancora la riattivazione di virus latenti (Herpes virus, Virus di Epstein-Barr, Citomegalovirus). Occorre quindi prendere in attenta considerazione tale eventualità sia nella selezione dei soggetti da sottoporre a trattamento sia nel monitoraggio post-terapia. 116 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario ESERCIZI DI VERIFICA 1. Rispondi alle seguenti domande: Come avviene il trasferimento di geni nelle piante con il batterio Agrobacterium tumefaciens? Cosa sono i protoplasti? Come si realizza la micropropagazione? Descrivi il funzionamento degli ormoni auxine, citochine e gibberelline. Cosa si intende per “sessaggio del seme” in zootecnia? Che cos’è e quali vantaggi porta la tracciabilità genetica nei prodotti alimentari? Cosa sono le proteine ricombinanti? Spiega come si ottengono e illustra qualche esempio. Spiega cosa si intende per terapia genica in vivo ed ex vivo. Cosa sono i retrovirus? Quali rischi comporta l’impiego dei vettori retrovirali nella terapia genica? 117 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 8 CONTAMINAZIONI MICROBIOLOGICHE E CHIMICHE DEGLI ALIMENTI 8.1 Qualità e igiene degli alimenti 8.2 Contaminazione microbica degli alimenti 8.3 Processi di degradazione microbica 8.4 I microrganismi indicatori 8.5 I fattori che condizionano la microbiologia degli alimenti 8.6 Contaminazione chimica degli alimenti Da molto tempo l’alimentazione umana fa un uso sempre più massiccio di alimenti preparati industrialmente, per ragioni facilmente comprensibili legate alle consuetudini e ai ritmi attuali di vita. In un simile contesto assume un’importanza fondamentale l’igiene dei processi produttivi, sia per assicurare il mantenimento delle caratteristiche organolettiche e nutrizionali degli alimenti, sia per prevenire la diffusione di malattie (infezioni, intossicazioni, tossinfezioni) legate al consumo di alimenti contaminati da microrganismi, da tossine o da sostanze chimiche pericolose. D’altronde è noto che anche le preparazioni casalinghe e i tradizionali metodi di preparazione e di conservazione dei cibi possono nascondere insidie per la salute. 8.1 Qualità e igiene degli alimenti Muffa su cibo (fonte: www.wikipedia.com). La qualità di un alimento, intesa nella più ampia accezione del termine, deriva dall’interazione di un insieme di fattori diversi. Concorrono infatti alla definizione di “qualità totale” le seguenti caratteristiche: r nutrizionali: riguardano gli elementi nutritivi presenti in un alimento rendendolo più o meno pregiato. Le tecnologie di preparazione e trasformazione degli alimenti possono influenzarne le qualità nutrizionali, come nel caso delle vitamine, che vengono parzialmente o totalmente eliminate dai trattamenti termici r organolettiche: consistono in aspetti apprezzabili quali il colore, l’odore, il sapore, la consistenza e altri ancora, che vengono ben presto modificati dall’attacco dei microrganismi. Per ogni alimento esistono 118 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario CONTAMINAZIONI MICROBIOLOGICHE E CHIMICHE DEGLI ALIMENTI qualità organolettiche “standard”, la cui variazione è indice di fenomeni alterativi r microbiologiche: la qualità microbiologica è in relazione alla presenza/assenza di microrganismi alteranti, di microrganismi patogeni, all’osservanza delle “buone pratiche di produzione”, all’adozione di efficaci trattamenti di sanitizzazione. La qualità microbiologica comprende aspetti legati alle fasi produttive, cioè all’igiene del personale e degli ambienti di produzione che nel loro insieme condizionano la conservabilità dell’alimento (qualità igienica), e altri legati all’assenza di rischi per la salute pubblica, rappresentati da microrganismi patogeni o loro tossine (qualità sanitaria) r tecnologiche: sono in stretta relazione con la qualità delle materie prime impiegate nella preparazione dell’alimento. Nel caso delle carni è possibile valutare la loro qualità ricorrendo a specifiche indagini di laboratorio, quali il controllo del pH, la conducibilità elettrica, la capacità di trattenere l’acqua, l’aspetto e la consistenza delle masse muscolari r chimiche: sono legate alla composizione chimica dell’alimento e alla possibile presenza di sostanze tossiche o comunque dannose, come residui di pesticidi, metalli pesanti ecc. 8.2 Contaminazione microbica degli alimenti La distinzione fra qualità igienica e sanitaria è basata sulla considerazione che negli alimenti è possibile rinvenire anche un numero relativamente elevato di microrganismi senza che ciò costituisca un pregiudizio per la sicurezza in termini di rischio biologico: si può trattare, in altri termini, di germi banali o saprofiti, la cui presenza può causare fenomeni alterativi che rendono l’alimento non adatto al consumo in seguito alla modificazione delle qualità organolettiche/sensoriali. Gli aspetti sanitari sono invece legati alla presenza di germi patogeni in grado di provocare infezioni, intossicazioni o infezioni alimentari (capitolo 11). Le contaminazioni microbiche si possono realizzare a livelli diversi: r la contaminazione primaria si verifica nella fase di produzione ad opera di microrganismi presenti nell’acqua, nell’aria, nel suolo (particolarmente im- 8 Figura 8.1 Norme di sicurezza igienica in stabilimenti di produzione alimentare (Shutterstock Images LLC). portante per gli alimenti di origine vegetale), nell’animale produttore; è legata alla qualità delle materie prime impiegate nella preparazione r la contaminazione secondaria riguarda l’igiene all’interno dello stabilimento di trasformazione e quello degli addetti alla lavorazione (figura 8.1) r la contaminazione terziaria si può verificare a livello del punto vendita (per es. nel caso di interruzione della catena del freddo) r la contaminazione quaternaria è quella che si realizza al momento della preparazione del cibo per il consumo, sia in ambiente domestico che nella ristorazione collettiva. Una suddivisione più semplice distingue solo fra una contaminazione primaria, legata alle materie prime, e una secondaria, raggruppando in quest’ultima tutte le altre possibili fonti di contaminazione sopra elencate. 8.3 Processi di degradazione microbica Gli alimenti sono composti principalmente da proteine, lipidi, carboidrati, insieme con una percentuale più o meno elevata di acqua e di altri elementi: i microrganismi, disponendo di un’ampia versatilità metabolica, possono utilizzare sostanze molto diverse come substrati nutritivi per il loro accrescimento. Schematicamente, è possibile elencare le seguenti possibilità (tabella 8.1): r l’attacco delle sostanze proteiche da parte dei microrganismi proteolitici è noto come putrefazione 119 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 8 CONTAMINAZIONI MICROBIOLOGICHE E CHIMICHE DEGLI ALIMENTI Tabella 8.1 Alimenti come substrati nutritivi per i microrganismi ALIMENTI MICRORGANISMI PRODOTTI Proteici Proteolitici Aminoacidi, ammine, ammoniaca, acido solfidrico Ricchi in carboidrati Fermentanti Acidi, alcol, gas Lipidici Lipolitici Acidi grassi, glicerolo r sui substrati di natura prevalentemente glucidica si verifica in particolare l’attività fermentativa dei microrganismi, con la produzione di un’ampia varietà di prodotti metabolici. Vengono generalmente prodotti acidi, alcol e gas r il risultato dell’azione microbica sulla componente lipidica degli alimenti provoca rancidità, causata peraltro anche dall’azione della luce e dell’aria con produzione di acidi grassi e glicerolo. Conseguenze di questi fenomeni di alterazione microbica sono: r sviluppo di sapori e odori sgradevoli r variazioni di colore r rammollimenti r marciumi r produzione di mucillagini (da batteri e/o lieviti) r ammuffimenti superficiali (da muffe). Poiché spesso gli alimenti non presentano una composizione uniforme ma sono costituiti da una miscela eterogenea di ingredienti, alterazioni e degradazioni microbiche di natura e tipo diversi possono verificarsi contemporaneamente o in rapida successione, determinando modificazioni biologiche e chimiche spesso irreversibili. Nel primo caso, le alterazioni sono dovute all’attività metabolica dei microrganismi o a quella degli enzimi presenti nell’alimento, nel secondo risulta decisiva l’azione della luce, della temperatura, dell’ossigeno: è noto per esempio che luce e ossigeno causano l’inattivazione di molte vitamine. Temperature di conservazione superiori a quelle prescritte possono favorire lo sviluppo di molti microrganismi, mentre sono sufficienti percentuali anche molto basse di umidità per lo sviluppo delle muffe. A seconda della loro suscettibilità ad andare incontro ad alterazione, gli alimenti possono essere distinti in almeno tre categorie diverse: r alimenti deperibili, che subiscono facilmente l’attacco dei microrganismi e possono di conseguenza essere conservati per un periodo molto breve (per es. il latte crudo) r alimenti semideperibili, il cui periodo di conservabilità è relativamente più lungo, anche in relazione alle tecniche di conservazione adottate r alimenti stabili, che difficilmente sono soggetti ad alterazioni microbiche. 8.4 I microrganismi indicatori Per la valutazione della qualità microbiologica degli alimenti ci si può avvalere della ricerca di microrganismi indicatori di sicurezza, indicatori di processo e indicatori di qualità o shelf-life. I microrganismi indicatori di sicurezza Comprendono i microrganismi e i relativi prodotti metabolici la cui concentrazione (quantificabile, rispettivamente, in UFC/g o mL e in mg/kg) possono rappresentare un pericolo per la salute del consumatore. Si tratta di microrganismi patogeni e tossine responsabili di malattie anche gravi (capitolo 11). È ovvio che condizioni che permettono la proliferazione dei microrganismi nell’alimento aumentano il rischio, mentre opportuni trattamenti tecnologici che li distruggono lo diminuiscono in modo significativo. Il pericolo per il consumatore è reso più insidioso dalla constatazione che raramente la presenza dei microrganismi e dei prodotti metabolici indicatori di sicurezza causa alterazioni visibili nell’alimento. Il regolamento CE 2073/2005 riporta come indicatori di sicurezza per l’accettabilità dei prodotti alimentari microrganismi responsabili di infezioni, tossinfezioni e intossicazioni alimentari: in particolare Salmonella (figura 8.2) e Listeria monocytogenes, nonché Enterobacter sakazakii limitatamente ai prodotti destinati alla prima infanzia; le enterotossine stafilococciche nei prodotti lattiero-caseari; la presenza di istamina nei prodotti della pesca. Per le acque destinate al consumo umano (Direttiva 98/83 CE) vengono utilizzati microrganismi 120 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario CONTAMINAZIONI MICROBIOLOGICHE E CHIMICHE DEGLI ALIMENTI 8 dei funghi (micotossine) sono in genere composti eterociclici; le tossine di pesci e molluschi sono prodotte da alghe di cui questi organismi si cibano r le tossinfezioni alimentari si verificano in seguito all’ingestione di alimenti contaminati da microrganismi che, una volta penetrati nell’organismo, elaborano tossine. Tipico è il caso di tossinfezioni da batteri sporigeni quali Clostridium perfringens e Bacillus cereus, le cui spore, resistenti all’ambiente acido dello stomaco, germinano a livello intestinale producendo e liberando le tossine. Microrganismi indicatori di igiene di processo Figura 8.2 Salmonella. Immagine al microscopio elettronico del batterio Salmonella, responsabile di alcune tossinfezioni alimentari (Dennis Kunkel Microscopy, Inc.). indicatori di contaminazione fecale (Escherichia coli, Enterococcus) per il loro habitat intestinale e per la sicura corrispondenza fra il loro rinvenimento nei campioni e la possibile concomitante presenza di microrganismi patogeni di origine fecale. Gli indicatori di contaminazione fecale nel loro complesso (coliformi, E. coli, enterococchi, clostridi solfitoriduttori) possono comunque essere tradizionalmente considerati indicatori di qualità in tutti gli alimenti. I germi patogeni trovano negli alimenti e nelle bevande un veicolo di trasmissione ideale, rendendosi responsabili di: r infezioni alimentari: causate dalla penetrazione e dalla riproduzione dei microrganismi all’interno dell’ospite, come nel caso di infezioni da Salmonella e Listeria monocytogenes, che sono anche gli indicatori di sicurezza più frequentemente ricercati negli alimenti r intossicazioni alimentari: sono dovute all’ingestione di alimenti contenenti tossine liberate dai microrganismi nell’alimento prima del consumo. Al momento del consumo la presenza delle tossine può risultare indipendente da quella dei microrganismi: i microrganismi infatti possono essere stati eliminati ma le tossine risultare ancora presenti. Esempi di intossicazioni sono quelle causate dall’ingestione di tossina stafilococcica e botulinica: quest’ultima è un’intossicazione di estrema gravità con conseguenze spesso letali (tabella 8.2). Le tossine batteriche sono di natura proteica o lipopolisaccaridica; quelle Gli indicatori di processo testimoniano lo stato igienico in uno o più punti della filiera produttiva, dalla materia prima al prodotto finito. Il regolamento CE 2073/2005 riporta come indicatori di igiene di processo le seguenti ricerche: r per la carne e derivati: carica mesofila aerobia, Enterobacteriaceae, E. coli r per il latte e derivati: Enterobacteriaceae, E. coli e stafilococchi coagulasi positivi r per i prodotti a base d’uovo: Enterobacteriaceae r per i prodotti ittici: E. coli e stafilococchi coagulasi positivi r ortaggi, frutta e derivati: E. coli. Escherichia coli è considerato indicatore di inquinamento di origine fecale; Staphylococcus aureus è un indicatore di manipolazione umana igienicamente scorretta. Microrganismi indicatori di qualità o shelf-life La qualità di un alimento decade in un lasso di tempo più o meno lungo durante la sua conservazione per cause dovute in gran parte all’attività di microrganismi contaminanti, anche in relazione a fattori fisici e ambientali. Un alimento viene considerato alterato quando si siano verificate al suo interno modificazioni sostanziali che lo rendono inaccettabile e non adatto al consumo. Le alterazioni sono ascrivibili in gran parte all’azione di enzimi idrolitici prodotti dai microrganismi contaminanti e li121 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 8 CONTAMINAZIONI MICROBIOLOGICHE E CHIMICHE DEGLI ALIMENTI Tabella 8.2 Microrganismi responsabili di intossicazioni alimentari TIPO GENERE O SPECIE MALATTIA SINTOMI ALIMENTI MAGGIORMENTE COINVOLTI Batterio Gram-positivo Clostridium botulinum Botulismo, botulismo infantile Vomito, debolezza, vertigini, disturbi della visione, difficoltà di respirazione, paralisi Conserve e semiconserve di carne e di pesce, conserve di verdure e di funghi, alimenti non acidi condizionati in assenza di aria Staphylococcus aureus Gastroenterite Nausea, vomito, dolori addominali, debolezza e diarrea Latte e derivati, uova e ovoprodotti, preparazioni a base di carne, piatti pronti di gastronomia, alimenti preparati con manipolazione, pasticceria alla crema Aspergillus flavus, A. parasiticus Aflatossicosi (aflatossine) Ittero, edema agli arti inferiori, cirrosi epatica, cancro al fegato Cereali e derivati, semi oleaginosi, mangimi, frutta secca, latte e derivati Aspergillus versicolor Micotossicosi (sterigmatocistina) Ittero, edema agli arti inferiori, cirrosi epatica, cancro al fegato Cereali e derivati, semi oleaginosi, mangimi, frutta secca, caffè, cacao Aspergillus ochra- Ocratossicosi ceus (ocratossina A) Penicillium verrucosum Anemia, poliuria, nefrite Cereali e derivati, mangimi, caffè, latte e derivati, carne suina, vino, birra Fusarium graminearum Micotossicosi (zearalenone) Vomito, diarrea, cefalea Cereali e derivati Fusarium moniliformis Micotossicosi (fumonisina) Vomito, diarrea, cefalea Cereali e derivati Penicillium patalum, P. expansum Micotossicosi (patulina) Nausea, vomito, dolori addominali Frutta e derivati, frutta secca, succhi di frutta Muffa berati nel substrato oppure direttamente al metabolismo microbico. È indispensabile considerare che l’entità e la velocità delle alterazioni sono determinate o comunque influenzate da una serie di fattori, quali: r la natura dell’alimento e gli enzimi presenti naturalmente al suo interno, i processi subiti dall’alimento (congelamento, scongelamento, essiccamento ecc.) r eventuali danni subiti durante la lavorazione, il trasporto, lo stoccaggio sia delle materie prime che dei prodotti finiti r modificazioni delle condizioni ambientali (pH, temperatura, potenziale redox, aw) r eventuali infestazioni da parte di insetti o roditori. I microrganismi indicatori di qualità o shelf-life (letteralmente “vita di scaffale”, cioè stabilità di un prodotto durante la sua conservazione; capitolo 10) determinano la conservabilità del prodotto, poiché ne condizionano le caratteristiche organolettiche di qualità. Una loro eventuale moltiplicazione durante la conservazione del prodotto può pregiudicarne l’accettabilità. Questi microrganismi devono essere facilmente rilevabili, la loro presenza e concentrazione e quella dei loro metaboliti deve avere relazione diretta con le alterazioni subite dall’alimento; devono inoltre essere rinvenuti con elevata frequenza. Una dato di fatto ampiamente accettato è che, anche se la contaminazione iniziale è nella maggior parte dei casi polimicrobica, la responsabilità finale dell’alterazione è ascrivibile solo a pochi microrganismi o a uno solo in particolare, in grado di riprodursi con un ritmo più veloce dei “concorrenti” perché ha trovato le condizioni ambientali ottimali. In questo contesto assumono particolare importanza due parametri (figura 8.3): r il limite di accettabilità, in pratica la concentrazione minima di microrganismi che determina l’inaccettabilità dell’alimento 122 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 8 CONTAMINAZIONI MICROBIOLOGICHE E CHIMICHE DEGLI ALIMENTI 9 8.5 I fattori che condizionano la microbiologia degli alimenti Le variabili in grado di condizionare il tipo e l’entità della contaminazione microbica di un alimento riguardano soprattutto: r il tipo di microrganismi: batteri, lieviti, muffe hanno esigenze nutritive e ambientali (temperatura, pH, aw ecc.) diverse per cui, a seconda delle condizioni in cui si trova l’alimento e della sua composizione, si avrà lo sviluppo preferenziale dell’uno o dell’altro tipo microbico. Spesso la contaminazione è dovuta inizialmente a un tipo di microrganismo, il cui metabolismo provoca nel substrato variazioni che in seguito si rivelano più favorevoli ad altri tipi microbici che prendono quindi il sopravvento r la carica microbica: una carica microbica saprofitica relativamente alta già all’origine causa nell’alimento un rapido decadimento in termini di caratteristiche organolettiche e di valore nutritivo, fino a provocare alterazioni che lo rendono inutilizzabile. Se poi si verifica contaminazione da parte di batteri patogeni, il problema assume aspetti preoccupanti o gravi anche dal punto di vista sanitario r la composizione dell’alimento, che condiziona il tipo di microrganismi che vi si possono preferibilmente sviluppare r le modalità di conservazione: tecniche di conservazione che non tengono conto delle caratteristiche dell’alimento e dei rischi legati alla sua manipolazione possono comprometterne irreparabilmente la qualità igienica e la sicurezza. 8 Log UFC/g Data la varietà della loro composizione, è logico attendersi che a prodotti diversi corrispondano in linea di massima microrganismi alteranti diversi. Per ogni tipologia di prodotto si possono quindi individuare microrganismi o loro metaboliti che ne causano di preferenza l’alterazione, perché in quell’alimento trovano condizioni adatte al loro sviluppo. Questi microrganismi possono venire impiegati come specifici indicatori di qualità (tabella 8.3). 9 Popolazione microbica totale Microrganismo alterante Metabolita alterante 8 7 7 6 6 5 5 4 4 3 3 2 2 1 Limite di accettabilità mg/kg r l’indice chimico di alterazione (chemical spoilage index): la concentrazione minima di metabolita che determina l’inaccettabilità dell’alimento. Chemical spoilage index 1 Shelf-life 0 0 0 2 4 6 Tempo 8 10 Figura 8.3 Andamento di alcuni parametri di alterazione microbica. I fattori che condizionano la sopravvivenza dei microrganismi su un alimento coincidono in pratica con quelli che influiscono sullo sviluppo microbico in generale: r presenza di acqua: come tutti gli organismi viventi, i microrganismi necessitano di acqua, presente negli alimenti in concentrazione variabile. L’acqua di cui i microrganismi possono disporre rappresenta solo una parte del quantitativo totale presente in un alimento: è la quota detta acqua libera, che cioè non risulta impegnata in legami con altre sostanze e viene indicata con il simbolo aw (attività dell’acqua o activity water). Ogni microrganismo presenta un proACTIVITY WATER Il parametro aw si ricava dal rapporto P/P0 fra tensione di vapore P dell’acqua nel mezzo (substrato, in questo caso l’alimento) e tensione di vapore dell’acqua pura (P0) nelle stesse condizioni di temperatura e pressione. Nell’acqua pura P0 = 1 e P = P0. L’aggiunta di soluti nell’acqua pura (che in questo modo diventa in pratica equivalente al substrato) abbassa la sua tensione di vapore, per cui il rapporto P/P0 diventa inferiore all’unità. Per tensione o pressione di vapore s’intende la pressione esercitata in condizioni di equilibrio (fra molecole che sfuggono dalla superficie e molecole che vi ricadono) dal vapore che sovrasta un liquido in un contenitore chiuso, a una determinata temperatura. 123 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 8 CONTAMINAZIONI MICROBIOLOGICHE E CHIMICHE DEGLI ALIMENTI Tabella 8.3 Microrganismi e metaboliti di origine microbica indicatori di qualità INDICATORE PRODOTTO GRUPPO O GENERE MICROBICO Carica batterica standard o carica mesofila aerobia Tutti gli alimenti Batteri mesofili aerobi Batteri psicrotrofi Latte pastorizzato Bacilli, Enterococcus Burro, formaggi freschi non acidi, carne fresca Pseudomonadaceae Enterobacteriaceae, Enterococcus Pesce fresco e altri prodotti ittici Pseudomonadaceae, Bacillus, Erwinia, Enterobacter, Leuconostoc Latte UHT e sterile in bottiglia, panna UHT, bibite analcoliche pastorizzate o UHT, conserve vegetali e animali, pane e prodotti da forno lievitati, spezie Bacillus spp. Latte destinato a caseificazione di formaggi a lunga stagionatura Clostridium spp. Batteri acidificanti Piatti pronti di gastronomia, carne fresca in atmosfera modificata, salumi (prosciutto cotto, mortadella), ricotta fresca Batteri lattici, coliformi, Enterococcus, Carnobacterium, Brochothrix Batteri pectinolitici Ortaggi e frutta fresca, ortaggi pronti all’uso refrigerati, semiconserve vegetali Pseudomonadaceae, Bacillus, Erwinia, Clostridium Batteri alotolleranti Pesce, molluschi, crostacei, carne salata, prodotti in salamoia (fino al 12% di sale) Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxella, Shewanella, Vibrio, Clostridium, Micrococcus, Staphylococcus, Enterococcus Batteri alofili Pesce sotto sale Halobacterium, Halococcus Microrganismi lipolitici Formaggi, burro, grassi vegetali, carne e derivati, salumi Batteri: Pseudomonas, Alcaligenes, Micrococcaceae Formaggi, burro, grassi vegetali, carne e derivati, salumi, cacao, semi oleaginosi, spezie Miceti: Aspergillus, Mucor, Penicillium, Rhizopus, Candida, Hansenula, Rhodotorula, Yarrowia Yogurt, burro, formaggi freschi, marmellate, puree e preparati a base frutta, succhi di frutta, bibite analcoliche, ortaggi e frutta fresca Lieviti e muffe Latte in polvere, cereali, farine e sfarinati, pane e prodotti da forno lievitati, marmellate e confetture, legumi, cacao, caffè, spezie, semi oleaginosi, alimenti a ridotta aw Muffe Muffe termoresistenti Conserve vegetali a base di frutta Byssochlamys Malattie del vino e della birra Vino, birra, sidro Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, batteri acetici Batteri sporigeni Eumiceti prio valore di aw, cioè un contenuto minimo di acqua libera che deve essere disponibile nel substrato: al di sotto di tale soglia il microrganismo non può sopravvivere (tabella 8.4). Esistono microrganismi adattati a vivere in ambienti estremamente poveri di acqua come le muffe xerofile; i lieviti sono mediamente più esigenti, mentre i batteri sono i microrganismi che mostrano maggiori esigenze in fatto di acqua. Queste considerazioni sono alla base delle tecniche di conservazione degli alimenti basati sulla sottrazione di acqua: la congelazione (che la trasforma in ghiaccio), l’essiccamento, l’alta concentrazione di sale (sa- 124 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario CONTAMINAZIONI MICROBIOLOGICHE E CHIMICHE DEGLI ALIMENTI 8 Tabella 8.4 Valori minimi di aw per alcuni microrganismi lamoie) o zucchero (marmellate) che toglie acqua alle cellule microbiche r temperatura: i microrganismi richiedono per la loro sopravvivenza valori ottimali di temperatura diversi e possono essere suddivisi in mesofili, termofili e psicrofili (figura 8.4). La conoscenza di questi parametri è importante nella scelta dei trattamenti e delle modalità di conservazione r potenziale redox: questo parametro è un indice della tendenza di un substrato a cedere o acquistare elettroni, il cui passaggio determina una differenza di potenziale (ddp) misurabile in mV (millivolt). Quando un substrato cede elettroni si ossida e presenta un potenziale redox positivo (Eh positivo); nel caso contrario subisce una riduzione, con la formazione di un potenziale redox negativo (Eh negativo). Lo sviluppo dei germi aerobi è favorito da ambienti ossidati con valori positivi di Eh, mentre quello degli anaerobi richiede preferibilmente valori di Eh negativi. Alimenti freschi come i vegetali presentano valori positivi di Eh, per cui si svilupperanno su di essi preferibilmente germi aerobi; le carni invece mostrano di solito un potenziale redox negativo, con tendenza a favorire lo sviluppo di microrganismi anaerobi. Le carni macinate e quelle appena macellate rappresentano un’eccezione, in quanto hanno di solito valori positivi di Eh r pH del substrato: rappresenta un parametro molto importante e in grado di svolgere azione discriminante nei confronti della sopravvivenza dei microrganismi. Anche se la gran parte dei microrganismi vive in ambiente con pH prossimo alla neutralità, molte specie rilevanti in campo alimentare e/o sani- MICRORGANISMI VALORI DI aw Batteri 0,91 Lieviti 0,88 Muffe 0,80 Muffe batteri alofili 0,75 Muffe xerofile 0,65 Lieviti osmofili 0,60 tario sopportano o prediligono ambienti acidi (per es. i batteri lattici) o sono in grado di sopravvivere anche a valori di pH decisamente alcalini (come i vibrioni). Le muffe vivono su substrati con un ampio intervallo di valori di pH, mentre i lieviti preferiscono ambienti piuttosto acidi. Queste particolari esigenze in fatto di pH vengono sfruttate per la coltivazione selettiva dei microrganismi in laboratorio. Un importante aspetto legato al pH è costituito dalla possibilità di sviluppo e di elaborazione della tossina botulinica da parte di Clostridium botulinum. Questo batterio anaerobio non è in grado di produrre la sua potentissima neurotossina se il pH del mezzo è inferiore a 4,5, a prescindere da tutte le altre condizioni. Le conserve di pomodoro (che potrebbero essere un substrato ideale) hanno un pH intorno a 3, quindi sono “sicure”. Se nell’alimento però si sviluppano muffe che alzano il pH, ecco che la situazione può diventare molto pericolosa. Psicrofili Termofili Mesofili Ipertermofili Animali e piante Microrganismi eucariotici Bacteria e Archaea -12 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 Temperatura di crescita (°C) Figura 8.4 Intervalli di temperatura ottimale dei viventi. 125 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario CONTAMINAZIONI MICROBIOLOGICHE E CHIMICHE DEGLI ALIMENTI 8.6 Contaminazione chimica degli alimenti La contaminazione chimica degli alimenti può derivare da residui di sostanze presenti in quantità anche molto piccole (ppm: parti per milione; ppb: parti per miliardo) provenienti da: r pratiche agronomiche (pesticidi/fertilizzanti) r attività zootecniche (ormoni/tireostatici/antibiotici) r cessione da parte di macchinari e contenitori PARAMETRI TOSSICOLOGICI L’impiego su larga scala dei pesticidi e degli xenobiotici in generale provoca problemi di inquinamento ambientale nei vegetali, nel suolo, nelle acque; alterazione degli equilibri ecologici, fenomeni di tossicità acuta e cronica negli animali e nell’uomo. La tossicità acuta consiste nella capacità di una sostanza di provocare sintomi tossici entro breve tempo. Si esprime come DL50 (quantità di sostanza in grado di uccidere la metà degli animali da esperimento su cui è saggiata). Più il valore DL50 è basso, ovviamente maggiore è la tossicità della sostanza. La tossicità cronica è conseguente all’assunzione della sostanza per lungo tempo in dosi anche minime. La concentrazione soglia o dose soglia di una sostanza corrisponde a quella al di sotto della quale, in base all’esame di specifiche curve dose/risposta (figura 8.5), non si evidenziano effetti negativi dovuti alla sua assunzione negli animali da esperimento: immediatamente al di sotto di tale valore si colloca la NOEL (no observable effects level), cioè la dose più elevata di una sostanza che può essere assunta senza conseguenze negative. In pratica, i due concetti si equivalgono e vengono spesso usati in modo intercambiabile. La NOEL viene espressa non solo in base al peso corporeo, ma anche in base alla quantità di assunzione giornaliera, cioè in mg/kg/die, soprattutto quando si tratta di valutare il rischio legato a un’assunzione o esposizione cronica allo xenobiotico. Nel trasferire all’uomo i dati della sperimentazione sugli animali il valore NOEL viene prudenzialmente diviso per un fattore di sicurezza (safety factor, SF) di 100. Il valore risultante costituisce la dose ADI (accettable daily intake) o r coadiuvanti tecnologici impiegati nelle produzioni alimentari r inquinamento ambientale di origine umana e industriale. Contaminazione da pesticidi I pesticidi sono sostanze utilizzate in agricoltura per eliminare organismi dannosi per le colture. Dose Giornaliera Ammessa (DGA), definita come la quantità che può essere assunta senza conseguenze per la salute, espressa in mg/kg di peso/die. ADI (DGA) = NOEL/100 Secondo l’opinione di molti tossicologi sarebbe consigliabile abbassare ulteriormente il valore ADI fino a NOEL/1000. Nell’impiego dei pesticidi è fondamentale rispettare il “tempo di decadimento” (tempo occorrente alla pianta per metabolizzare e, per quanto possibile, degradare il composto chimico) in base al quale viene stabilito un intervallo di sicurezza, cioè il tempo che deve obbligatoriamente intercorrere fra il momento del trattamento e quello della raccolta del prodotto trattato. 100 Risposta % 8 50 0 A B DL50 C Log dose Figura 8.5 Curva dose-risposta. A-B-C rappresentano tre diverse concentrazioni di una stessa sostanza, mentre la DL50 è la dose di sostanza capace di uccidere il 50% degli animali a cui è stata somministrata. 126 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario CONTAMINAZIONI MICROBIOLOGICHE E CHIMICHE DEGLI ALIMENTI Tabella 8.5 Prodotti organici di sintesi CLASSE PRODOTTI Clororganici DDT, PCB Fosforganici Parathion, malathion (esteri fosforici) Azotorganici Carbammati, ditiocarbammati Azotosolforganici Atrazina, simazina In base al loro impiego i pesticidi possono essere classificati in: r insetticidi: agiscono per contatto, inalazione o ingestione r fungicidi o anticrittogamici: impiegati contro le crittogame, cioè le muffe e i funghi in genere r diserbanti r fitormoni/fitoregolatori: agiscono interferendo nei processi fisiologici delle piante. In base alla composizione chimica si distinguono: r prodotti inorganici: composti di rame e zolfo, fosfoderivati, clorati, composti arsenicali r prodotti organici naturali (nicotina, piretro) r prodotti organici di sintesi (tabella 8.5). Impiego di ormoni anabolizzanti e antibiotici In molti Paesi è consentito l’impiego di ormoni e antibiotici per promuovere un più rapido sviluppo ponderale degli animali d’allevamento. L’uso di queste sostanze è vietato in Italia. Gli anabolizzanti ormonali sono derivati da ormoni sessuali, che agiscono accelerando la crescita dell’animale. Si tratta di sostanze di origine: r naturale (estrogeni, progesterone, androgeni) r artificiale, quali lo stilbestrolo e derivati, con un’attività anche superiore a quella degli estrogeni naturali. Gli estrogeni agiscono influenzando altri ormoni che intervengono nel metabolismo: ormone della crescita, insulina, ormoni della tiroide. Gli androgeni agiscono direttamente sulle fibre muscolari e indirettamente su altri ormoni metabolici. In sostanza, androgeni ed estro- 8 geni in associazione promuovono un più alto accumulo di proteine a livello muscolare. Gli antibiotici per uso veterinario vengono largamente impiegati per igienizzare gli allevamenti e a scopo terapeutico, ma anche illecitamente come promotori della crescita, azione peraltro di efficacia non sempre provata. L’impiego incontrollato di antibiotici nell’alimentazione animale ha diverse conseguenze: dai falsi negativi nell’esame batteriologico delle carni, all’insorgenza di fenomeni allergici e di ceppi batterici antibiotico-resistenti negli stessi animali e nell’uomo. Contaminazione da contenitori I contenitori impiegati nell’industria alimentare sono di varia natura: r metallo: l’acciaio inox ha ottime caratteristiche; l’alluminio deve essere anodizzato o altrimenti protetto; la banda stagnata richiede un’ulteriore protezione con vernici r ceramica: ha l’inconveniente della possibile presenza di ossidi di piombo e cadmio che vengono portati in soluzione da alimenti acidi r vetro: è un ottimo materiale per il confezionamento dei cibi r carta/cartone: vengono impiegati per i “brick” dopo l’aggiunta di cera, paraffina o altri materiali impermeabilizzanti r materie plastiche: la gamma di materie plastiche utilizzate nei contenitori per alimenti è molto ampia (tabella 8.6). La ricerca ha messo a punto “plastiche verdi”, ottenute cioè da carboidrati di origine vegetale, per esempio dal mais, dall’acido polilattico o da altre sostanze, che presentano buoni valori di biodegradabilità. In laboratorio si effettuano prove di migrazione globale e di migrazione specifica (per singoli contaminanti) dai contenitori ai cibi contenuti al loro interno. Contaminazione da coadiuvanti tecnologici Vengono definiti come “sostanze non consumate come ingredienti alimentari in sé, utilizzate nella trasformazione 127 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 8 CONTAMINAZIONI MICROBIOLOGICHE E CHIMICHE DEGLI ALIMENTI Tabella 8.6 Materie plastiche impiegate per la fabbricazione di contenitori per alimenti MATERIA UTILIZZO PE (polietilene) Costituisce più del 60% di tutta la plastica. Impiegato per sacchetti, pellicole, accoppiato con carta o alluminio in contenitori di vario tipo PP (polipropilene) Contenitori, pellicole PVC (polivinil cloruro) Bottiglie (no gas). Il monomero di base (CVM, cloruro di vinile monomero) è sicuramente cancerogeno. Limiti di migrazione specifica: CVM = 0,01 pp; PVC = 1 ppm PS (polistirolo) Contenitori per yogurt e gelati PTFE (teflon) Utilizzato per utensili da cucina PET (polietilentereftalato) Bottiglie per bevande anche gasate PA (poliammide/nylon) Film per imballaggio; oggettistica PC (policarbonato) Contenitori di pregio di materie prime, prodotti alimentari o loro ingredienti, al fine di rispettare un determinato obiettivo tecnologico in fase di lavorazione o trasformazione”. Esse comprendono: r enzimi: la papaina è un enzima proteolitico usato per l’intenerimento delle carni; il caglio è utilizzato nella produzione dei formaggi. Si ottengono per mezzo di microrganismi geneticamente modificati r solventi: esano, per l’estrazione di oli di semi e sanse; acetato di etile impiegato per la decaffeinizzazione del caffè r chiarificanti: gelatina, caseina, bentonite, silice impiegati in enologia r demetallizzanti: il potassio ferrocianuro allontana il ferro dal vino r decoloranti: carbone attivo per la rettifica degli oli r agenti di distacco: silicone, oli minerali, polietilenglicol impiegati in pasticceria e nei prodotti da forno r lubrificanti: impiegati nei macchinari e negli impianti r detergenti e disinfettanti: ipoclorito e clorammine sono utilizzati nella pulizia delle carcasse di animali; acidi, alcali e tensioattivi nella pulizia di impianti e contenitori. Contaminazione da metalli pesanti Il meccanismo d’azione dei metalli pesanti è basato sulla loro reazione con i gruppi −SH di proteine ed enzimi, con conseguente danno cellulare sia a livello strutturale che metabolico. I metalli pesanti, al pari dei pesticidi, si accumulano negli strati superficiali del suolo, vengono assorbiti dalle radici e contaminano gli alimenti di origine vegetale. Nei mari e negli oceani il mercurio subisce prima una bioconcentrazione nei tessuti dei pesci, quindi una biomagnificazione lungo la catena alimentare fino ai grandi predatori marini e da questi all’uomo: il 95% del mercurio ingerito deriva dai prodotti ittici. Fra i composti del mercurio, quello dotato di maggior tossicità per l’uomo è il metilmercurio: l’intossicazione provoca gravi alterazioni del sistema nervoso, anemia, danni renali, atrofia muscolare; il mercurio inoltre può attraversare la barriera placentare e raggiungere il feto. L’intossicazione da piombo (saturnismo) è una malattia professionale, ma tutta la popolazione è ormai sottoposta a inalazione di microdosi da inquinamento ambientale. Il piombo si accumula nei depositi di grasso e nelle ossa, da cui può passare a fegato, reni, muscoli e cervello. Conseguenze dell’intossicazione cronica sono, fra le altre, cirrosi epatica e danni cerebrali. Il cadmio è impiegato nell’industria metallurgica per la fabbricazione di leghe speciali, nella produzione delle vernici e della plastica. Arriva all’uomo da alimenti come i molluschi, i crostacei, i visceri dei vertebrati, oltre che dall’acqua e dal fumo di tabacco. Provoca osteoporosi, danni ai reni e al sistema nervoso. 128 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario ESERCIZI DI VERIFICA 1. Le qualità nutrizionali degli alimenti comprendono elementi: A sensibili ai metodi di conservazione B apprezzabili attraverso i sensi C possibili cause di malattia 2. Elenca almeno quattro categorie di sostanze chimiche che influiscono sulla qualità degli alimenti: ........................................................................... ........................................................................... ........................................................................... ........................................................................... 3. Le qualità nutrizionali di un alimento: A sono analoghe per tutti gli organismi B devono tenere conto di intolleranze o allergie dei singoli casi C devono tenere conto anche dell’aspetto del cibo 4. Le qualità organolettiche comprendono: A Le sostanze organiche presenti negli ingredienti B Elementi che rendono un alimento più o meno gradito C Elementi che influiscono sulla digeribilità dell’alimento 5. Una conservazione non idonea può influire su: A qualità organolettiche B qualità nutrizionali C entrambi i parametri indicati 6. Le qualità tecnologiche di un alimento riguardano A i metodi di conservazione B le caratteristiche delle materie prime impiegate C la presenza di vitamine e proteine 7. La putrefazione si verifica su alimenti: A proteici B ricchi di vitamine e lipidi C vegetali 8. La principale fonte di mercurio introdotta con gli alimenti è costituita da: A carne B pesci C uova D latte e latticini 9. La contaminazione da metalli pesanti negli organismi viventi è: A maggiore in quelli di grande taglia per il fenomeno del bioaccumulo B più elevata in quelli piccoli perché i metalli pesanti sono più concentrati C indipendente dalle dimensioni dell’organismo 10. I coadiuvanti tecnologici alimentari sono: A sostanze vietate per legge B integratori per l’alimentazione umana e animale C sostanze impiegate per dare al prodotto precise caratteristiche 129 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 9 LA CONSERVAZIONE DEGLI ALIMENTI 9.1 La conservazione degli alimenti 9.2 Conservazione con mezzi fisici 9.3 Conservazione con mezzi chimici 9.4 Impiego di additivi e conservanti Gli alimenti lasciati a sé vanno naturalmente incontro a una progressiva degradazione a opera di microrganismi, enzimi, agenti fisici e chimici, che rendono ben presto gli alimenti inutilizzabili o ne fanno veicoli di infezioni, intossicazioni o tossinfezioni (capitolo 11). Fin dai tempi antichi l’uomo ha cercato di prevenire il deterioramento dei cibi per poterne disporre anche a distanza di tempo. Le modificazioni socio-economiche che dall’inizio dell’Ottocento hanno portato, con la nascita della civiltà industriale e dei grandi centri urbani, al progressivo spopolamento delle campagne e all’allontanamento dai luoghi di produzione di gran parte dei consumatori, hanno determinato un rapido sviluppo delle industrie di preparazione, trasformazione e conservazione degli alimenti. Ciò è stato possibile grazie al parallelo progresso delle conoscenze scientifiche e all’affinamento delle capacità tecnologiche che consentono oggi di disporre di alimenti sicuri e di qualità anche a notevole distanza di tempo dalla loro preparazione e dal loro confezionamento. 9.1 La conservazione degli alimenti Impianto di pastorizzazione del latte. I fattori responsabili delle alterazioni degli alimenti sono riconducibili all’azione di un’ampia varietà di microrganismi e di loro prodotti metabolici, all’azione di numerosi enzimi, dell’ossigeno, della luce e alla presenza di acqua libera. I microrganismi responsabili delle più comuni alterazioni sono rappresentati soprattutto da batteri, muffe e lieviti (tabella 9.1). Gli obiettivi perseguiti nelle tecniche di conservazione degli alimenti consistono essenzialmente nel blocca- 130 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 9 LA CONSERVAZIONE DEGLI ALIMENTI Tabella 9.1 Microrganismi alterativi in vari settori alimentari SETTORE RISCHIO DA BATTERI RISCHIO DA MUFFE E LIEVITI Lattiero-caseario Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus Mucor, Penicillium chrysogenum Yogurt e formaggi freschi Cladosporium, Candida Salumificio Listeria monocytogenes, E. coli Macelleria Listeria monocytogenes, E. coli Ristorazione collettiva Listeria monocytogenes, Salmonella Prodotti da forno Salmonella, E. coli Aspergillus niger, Wallemia sebi Dolciario Staphylococcus Penicillium chrysogenum Bevande, succhi di frutta Penicillium expansum, Aspergillus glaucus Penicillium expansum, micotossine Cereali, magazzini di insilamento Salmonella Aspergillus fumigatus Conservazione frutta e vegetali Erwinia carotovora Botrytis, Penicillium expansum Pollame, uova Salmonella, Enterococcus hirae Aspergillus fumigatus, Cladosporium Allevamento animale Salmonella Aspergillus fumigatus, Aspergillus corymbifera re l’attività degli enzimi, nell’eliminare i microrganismi eventualmente presenti o comunque arrestarne la riproduzione. Le tecniche di conservazione possono essere le più diverse: la scelta viene effettuata, in ottemperanza alla vigente normativa, in base a fattori quali la natura dell’alimento, la necessità di mantenere inalterate le sue caratteristiche organolettiche e di impiegare trattamenti o sostanze non dannosi per il consumatore. I trattamenti possono essere effettuati a più livelli: r sulle materie prime, sugli ingredienti, sul loro immagazzinamento e stoccaggio r nei riguardi del personale addetto al trasporto, alla manipolazione, alla lavorazione e al confezionamento di materie prime e ingredienti, che deve essere convenientemente preparato e sensibilizzato riguardo all’inderogabile necessità della più scrupolosa osservanza delle norme igieniche r nei locali di trasformazione, con particolare riguardo alla temperatura (che non deve superare i 12-14 °C) e allo stato igienico dell’aria ambiente r sulle attrezzature e superfici di lavoro, di cui è fondamentale controllare periodicamente la carica microbica ed escludere la presenza di patogeni. È possibile distinguere fra trattamenti fisici e trattamenti chimici. 9.2 Conservazione con mezzi fisici I trattamenti con mezzi fisici comprendono: impiego di alte o basse temperature, disidratazione, liofilizzazione, irradiazione, atmosfera controllata e modificata, affumicatura. Alte temperature Le alte temperature hanno azione battericida e inattivano gli enzimi per denaturazione. Il trattamento può essere energico fino a giungere alla sterilizzazione del prodotto, ma con la contropartita di un decadimento notevole delle caratteristiche organolettiche, in particolare dei principi nutritivi. La scelta viene quindi effettuata in base alla natura dell’alimento e all’obiettivo da raggiungere, con un compromesso fra sicurezza igienico-sanitaria (assenza di rischi per il consumatore) e salvaguardia delle caratteristiche organolettiche. Le diverse combinazioni di tempi e temperature di trattamento vengono scelte in base alle esigenze produttive e alla termoresistenza dei microrganismi che ci si propone di eliminare. La crescita microbica può, salvo casi di microrganismi “estremi”, avvenire fra i −5 °C e i +90 °C; in gene131 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 9 LA CONSERVAZIONE DEGLI ALIMENTI TERMORESISTENZA DEI MICRORGANISMI Il calore uccide i microrganismi inattivando gli enzimi cellulari. I vari microrganismi mostrano livelli diversi di resistenza alle alte temperature, anche in relazione a molteplici fattori ambientali: una conoscenza particolarmente approfondita di questi fenomeni è richiesta a chi si occupa della lotta ai microrganismi a livello industriale, per esempio nella preparazione e nella conservazione di alimenti (carne, pesce, legumi in scatola) e bevande (latte pastorizzato e UHT, succhi di frutta). In microbiologia industriale si tiene conto di alcuni parametri, importanti per decidere a quale temperatura e per quanto tempo trattare un campione per ottenere gli obiettivi desiderati. I parametri principali sono: r il Punto di Morte Termica (TDP = thermal death point): indica la temperatura minima necessaria per eliminare in 10 min tutti i batteri in una sospensione liquida con una concentrazione standard di 105 cellule/mL Tabella 9.2 TDT di alcuni microrganismi trattati con calore umido MICRORGANISMO TEMPERATURA (°C) TEMPO (min) Batteri non sporigeni Salmonella typhosa Staphylococcus aureus Escherichia coli Lactobacillus bulgaricus 60 60 60 71 4,3 18,8 20-30 30 Batteri sporigeni Bacillus anthracis Bacillus subtilis Clostridium sporigenes Clostridium botulinum 100 100 100 100 1,7 15-20 60-120 120-360 r il Tempo di Morte Termica (TDT = thermal death time): indica il tempo necessario per eliminare tutti i batteri in una sospensione liquida con una concentrazione standard di 105 cellule/mL in condizioni di temperatura e ambientali prefissate (tabella 9.2) r il Tempo D o di riduzione decimale: corrisponde al tempo necessario per ridurre del 90% (o al 10% del valore iniziale) il numero di batteri presenti in una sospensione a una temperatura prefissata (tabella 9.3) r il valore Z: indica la temperatura in gradi centigradi necessaria per eliminare il 90% dei microrganismi presenti in una sospensione. I valori D e Z dei microrganismi più pericolosi sono noti, per cui, dopo aver pianificato le condizioni entro cui operare e gli obiettivi da raggiungere in termini di sicurezza alimentare (ragionevole certezza che l’alimento non rappresenti rischio biologico per il consumatore), si potranno scegliere le più opportune combinazioni fra tempo e temperatura di trattamento per garantire, da una parte, la sicurezza microbiologica del prodotto e, dall’altra, la migliore conservazione delle sue caratteristiche organolettiche. Tabella 9.3 Valore D di alcuni microrganismi MICRORGANISMO TEMPERATURA (°C) D (min) Staphylococcus aureus 70 0,2-2 Salmonella spp. 65,5 0,02-0,25 Lieviti e muffe (forme vegetative) 65,5 0,5-3 Spore di Bacillus subtilis 100 11 Notare che non tutte le spore batteriche hanno la stessa resistenza al calore. re comunque si verifica nell’intervallo fra 0 °C e 60 °C (figura 9.1). Ogni specie microbica ha, comunque, un proprio intervallo ottimale di sopravvivenza, così come varia la temperatura necessaria per uccidere i microrganismi: in genere i Gram-positivi sono più resistenti dei Gram-negativi; le muffe, i lieviti e le loro spore sono piuttosto sensibili al calore, al contrario di quelle batte- riche che mostrano un’elevata resistenza alle alte temperature. L’effetto delle alte temperature sui microrganismi è condizionato da diversi fattori, fra cui: r la fase di sviluppo microbico: i batteri in fase di accrescimento logaritmico mostrano una sensibilità più elevata di quelli in fase di quiescenza 132 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 9 LA CONSERVAZIONE DEGLI ALIMENTI 4 4 2 Figura 9.1 Temperatura e tempi di generazione microbica per mesofili e psicrofili. Entrata fluido freddo r la carica microbica dell’alimento: quanto più è elevata, tanto più energico deve essere il trattamento termico r il pH dell’alimento: un substrato acido aumenta l’efficacia del trattamento termico r il contenuto di acqua libera (aw) dell’alimento: valori bassi di aw aumentano la termoresistenza dei microrganismi r la presenza di sostanze ad azione antimicrobica (per es. nitriti). Uscita fluido freddo Le modalità di trasmissione del calore sono: r conduzione: passaggio del calore per contatto da un corpo più caldo a uno più freddo tra due superfici solide o all’interno di un solido per effetto della trasmissione dei moti di oscillazione delle molecole r convezione: si verifica in un fluido per effetto dello spostamento delle molecole dalle zone più calde a quelle più fredde r irraggiamento: il calore si propaga da un corpo riscaldato attraverso radiazioni elettromagnetiche che vengono assorbite da un corpo più freddo e convertite in calore. L’irraggiamento si può verificare anche nel vuoto (cioè in assenza di materia); le radiazioni infrarosse sono quelle più facilmente assorbite e convertite in calore. Le microonde agiscono su sostanze che contengono molecole d’acqua o che hanno struttura polare. Fattori importanti in un trattamento termico sono la conducibilità termica dell’alimento e del contenito- 3 4 1 4 2 a) Uscita fluido caldo Entrata fluido caldo b) Figura 9.2 Scambiatori di calore a piastre e a tubi. (a) Scambiatore a tubi: il fluido passante per i tubi scambia calore con il fluido esterno; 1) diaframma che rallenta la velocità del fluido esterno e sostiene i tubi; 2) piastre di fissaggio dei tubi; 3) involucro esterno; 4) bocche di alimentazione e deflusso. (b) Scambiatore a piastra: le piastre sono sagomate con scannellature trasversali e longitudinali. re e la velocità di penetrazione del calore. Il prodotto non viene riscaldato contemporaneamente in tutte le sue parti: occorre tener conto del fatto che affinché la temperatura voluta raggiunga anche la parte centrale, definita “punto freddo”, è necessario un tempo di trattamento più lungo. Natura, tipo e dimensioni dei contenitori influenzano in modo significativo i tempi di esposizione necessari a garantire l’efficacia del trattamento termico. Nell’industria alimentare il riscaldamento diretto per iniezione di vapore si effettua raramente: vengono solitamente impiegati scambiatori di calore, sia per fornire che per sottrarre calore. Si tratta di sistemi in cui una parete metallica separa il fluido scaldante o refrigerante dal prodotto da trattare; le tipologie più frequentemente utilizzate sono scambiatori di calore a piastre o a tubi (figura 9.2) costruiti solitamente in acciaio inox a garanzia di una maggiore igiene e facilità di pulizia. L’utilizzo delle alte temperature in campo alimentare è una tecnica assai diffusa e comprende pastorizzazione e sterilizzazione. 133 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 9 LA CONSERVAZIONE DEGLI ALIMENTI Pastorizzazione La pastorizzazione è un trattamento termico di sanitizzazione che ha l’obiettivo di eliminare i batteri patogeni, buona parte della flora microbica saprofita nonché di disattivare gli enzimi, mantenendo inalterate le caratteristiche organolettiche dell’alimento. La pastorizzazione viene impiegata soprattutto per latte, vino, birra, succhi di frutta: quella del latte si effettua generalmente a 7275 °C per 15 s con il trattamento rapido HTST (high temperature short time), che ha sostituito quello lento a 65 °C per 30 min. Poiché le temperature raggiunte non CONSERVE E SEMICONSERVE Le conserve e le semiconserve sono alimenti trattati termicamente dopo essere stati chiusi in contenitore ermetico. Le conserve sono portate a temperatura di sterilizzazione (121 °C) dopo il confezionamento; le semiconserve, per la natura e composizione degli alimenti, non possono essere sottoposte a sterilizzazione. Presentano di conseguenza un certo contenuto microbico, tenuto sotto controllo (impossibilità di riproduzione) dal pH acido dell’alimento, da additivi ad azione batteriostatica o dalla bassa temperatura di conservazione, che comunque è garantita solo per un breve periodo (in genere alcuni mesi). La conservazione in contenitori sigillati è stata ideata dal francese Appert (da cui il nome di appertizzazione con cui è nota) agli inizi del XIX secolo, poi perfezionata successivamente con l’uso dell’autoclave, che permette trattamenti a temperature superiori a 100 °C. Questa tecnica viene impiegata per la conservazione di alimenti vegetali e animali (carne bovina, suina, prodotti della pesca), di sughi e minestre e altri prodotti simili. Le procedure prevedono una prima preparazione del prodotto (cernita, lavaggio, taglio ecc.), un pretrattamento termico (precottura o scottatura), il confezionamento (sigillando i contenitori con l’alimento caldo e poi lasciando raffreddare per eliminare l’aria), infine il trattamento termico vero e proprio che si differenzia per gli alimenti con pH < 4,5 e quelli con pH > 4,5. L’obiettivo principale è infatti scongiurare la possibile presenza di Clostridium botulinum (figura 9.3) e eliminano i microrganismi termofili e nemmeno le spore, il prodotto pastorizzato va conservato in ambiente refrigerato per un periodo di tempo limitato a qualche giorno, onde limitarne o quanto meno rallentarne lo sviluppo. La pastorizzazione è di solito seguita da un rapido raffreddamento; i prodotti pastorizzati possono essere definiti semiconserve. Nel caso del latte sono impiegati attualmente anche trattamenti termici ripetuti o più energici (latte pastorizzato a temperatura elevata: 80-135 °C) o di microfiltrazione (capitolo 12). il pH rappresenta un fattore di grande importanza: valori di pH inferiori a 4,5 impediscono la germinazione delle spore del Clostridium botulinum. Nelle conserve definite acide (pH < 4,5) quindi sopravvivono solo germi acidofili, uccisi a temperature comprese fra 60 e 100 °C. Questa caratteristica è sfruttata nella preparazione delle conserve casalinghe di frutta o di verdura (naturalmente acide o acidificate con aceto o altri acidificanti) per le quali è possibile utilizzare l’immersione in acqua bollente (100 °C) per tempi sufficientemente lunghi. Le conserve con un minor grado di acidità (pH superiore o uguale a 4,5) devono invece subire una vera e propria sterilizzazione fra 100 e 121 °C per un tempo variabile. Dopo il raffreddamento e l’eventuale periodo di maturazione (nel caso del pesce l’olio e il sale devono penetrare uniformemente nei tessuti) le confezioni in scatola si possono conservare anche per alcuni anni. Figura 9.3 Clostridium botulinum (fonte: CDC/Dr. Holdeman). 134 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario LA CONSERVAZIONE DEGLI ALIMENTI 9 Sterilizzazione Refrigerazione Per definizione, la sterilizzazione elimina da un substrato ogni forma microbica, incluse le spore batteriche, notoriamente le forme più resistenti. Una sterilizzazione efficace si realizza con un trattamento a 121 °C per 20 min, ma nel settore alimentare si può attribuire a questo termine un significato più “elastico”. Si può parlare infatti di sterilizzazione commerciale, intesa come trattamento termico impiegato per distruggere i microrganismi che si possono riprodurre nell’alimento durante lo stoccaggio e la distribuzione. Si può accettare quindi la presenza di spore nell’alimento in scatola, ma a condizione che queste non siano in grado di germinare. Una sterilizzazione completa comporterebbe, per le alte temperature impiegate e i lunghi tempi di esposizione, gravi alterazioni delle caratteristiche organolettiche e dei principi nutritivi degli alimenti. Si possono effettuare dunque trattamenti che impiegano temperature fra i 115 e i 150 °C circa, per periodi di tempo diversi ma dell’ordine dei secondi, in base alle caratteristiche dell’alimento da trattare e degli obiettivi che si intendono perseguire. Nel caso del latte a lunga conservazione, per esempio, il trattamento UHT (uperizzazione) prevede temperature di 140/150 °C mantenute per 1 o 2 s. Con questa tecnica l’alimento viene raffreddato e mantenuto a temperature fra 0 e +6 °C, anche sottovuoto o in atmosfera controllata (vedi oltre). Si tratta di una tecnica ad amplissima diffusione, utilizzata per le materie prime, per i semilavorati e per la distribuzione e conservazione di una grande varietà di prodotti alimentari nella ristorazione collettiva e domestica. La refrigerazione non può impedire lo sviluppo di tutti i microrganismi: ne consegue che la conservabilità di un prodotto refrigerato è limitata nel tempo e l’entità della contaminazione microbica delle materie prime impiegate assume rilevanza fondamentale. Trattandosi di ambiente refrigerato, particolare rilievo assume la presenza di germi psicrofili in grado di resistere e proliferare alle basse temperature: ciò risulta particolarmente evidente nella conservazione dei prodotti ittici, che mostrano una conservabilità più ridotta rispetto alle carni, in quanto contaminati da germi acquatici, naturalmente tendenti alla psicrofilia. In ogni caso si può affermare che più bassa è la temperatura di refrigerazione (prossima quindi a 0 °C) tanto più lunga sarà la conservabilità dell’alimento. In un simile contesto è importante sottolineare che estremamente dannosi risultano gli sbalzi di temperatura: una volta che i microrganismi hanno ripreso a riprodursi per un improvviso aumento della temperatura, il processo in genere non si arresta quando la temperatura viene riportata ai livelli di partenza. Fra i fattori che possono condizionare la conservabilità di un prodotto refrigerato vengono inclusi soprattutto: r il tipo di microrganismi contaminanti r la velocità di penetrazione del freddo (quanto più elevata, tanto più lunga risulta la conservabilità) r l’umidità presente nel prodotto, in particolare quella superficiale. Basse temperature Le basse temperature hanno un effetto batteriostatico, agiscono cioè bloccando la riproduzione dei microrganismi, in quanto non permettono il regolare svolgimento delle reazioni enzimatiche cellulari. In molti casi, quando la temperatura scende a livelli estremamente bassi, sopravviene la morte delle cellule microbiche (effetto battericida), anche se l’effetto prevalente del freddo rimane comunque quello di un rallentamento dello sviluppo. L’impiego del freddo ha avuto un notevole sviluppo in seguito alla diffusa commercializzazione dei prodotti alimentari trasformati industrialmente, che necessitano di una ininterrotta catena del freddo per tutto il periodo della loro conservazione fino al momento del consumo. A seconda dell’esigenza di una conservazione protratta per periodi di tempo più o meno lunghi vengono impiegate temperature di trattamento diverse. Si tenga presente che diversi germi sono in grado di sopravvivere all’interno delle celle frigorifere: è quindi opportuno che gli alimenti non vengano a contatto con le superfici interne delle celle o con altri prodotti che vi stazionano già da molto tempo. La refrigerazione può essere accompagnata dal confezionamento del prodotto in atmosfera protettiva, sostituendo la normale atmosfera con una miscela di gas a diversa composizione. Si può realizzare con due tecniche diverse: r atmosfera controllata, all’interno di celle frigorife135 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 9 LA CONSERVAZIONE DEGLI ALIMENTI re stagne per la conservazione di frutta (per es. pere e mele) e fiori. In questo caso la composizione risulta essere mediamente la seguente: azoto 92/95% − anidride carbonica 2/4% − ossigeno 3/4% e viene costantemente tenuta sotto controllo per tutto il periodo di conservazione r atmosfera modificata, all’interno di confezioni sigillate e pronte alla vendita, con miscele di gas in proporzioni variabili: Figura 9.4 Conservazione dei cibi sottovuoto. anidride carbonica/ossigeno CO2/azoto CO2/N/O La CO2 è un discreto antimicrobico, in particolare se associata all’impiego di basse temperature; l’azoto rallenta l’irrancidimento dei grassi e possiede allo stesso tempo una certa azione antisettica; la percentuale di ossigeno presente impedisce lo sviluppo di germi anaerobi e mantiene più a lungo il colore rosso delle carni. La composizione dell’atmosfera modificata non viene ulteriormente controllata durante la conservazione, e può subire variazioni conseguenti all’assorbimento o all’emissione di gas per la non perfetta tenuta del contenitore, in genere un film plastico, e la “respirazione” del prodotto. In questi casi si realizza piuttosto un’atmosfera modificata in equilibrio, soprattutto nelle confezioni di frutta e vegetali in genere. Le tecniche di conservazione in atmosfera protettiva hanno consentito di superare i limiti tecnologici del confezionamento sottovuoto, che come noto consiste nell’introdurre il prodotto in sacchetti di plastica per poi togliere l’aria presente al suo interno (figura 9.4). Questa tecnica, che viene convenientemente impiegata per diversi prodotti (caffè, riso ecc.) e che ha il vantaggio innegabile di impedire lo sviluppo dei germi aerobi più frequentemente responsabili delle alterazioni degli alimenti (Pseudomonas, Bacillus, muffe ecc.), non può essere estesa indiscriminatamente a tutti i prodotti, in particolare a quelli freschi o precucinati, per ragioni legate alla tipologia del prodotto e alla sua presentazione commerciale. Congelamento Il congelamento fa penetrare il freddo all’interno dell’alimento fino a portarlo a temperature intorno ai −40 °C. La penetrazione del freddo non deve obbligatoriamente avvenire in modo veloce (ciò che differenzia il congelamento dalla surgelazione). La lentezza del processo penalizza le caratteristiche organolettiche dell’alimento così trattato, in quanto porta alla formazione di cristalli di ghiaccio di dimensioni tali da danneggiare l’integrità di cellule e tessuti. La conservazione dei prodotti congelati si prolunga fino a diversi mesi, ma si deve sottolineare che molti enzimi, tossine e spore non vengono completamente eliminati. Surgelazione Prevede che il freddo venga fatto penetrare molto velocemente nell’alimento, che deve essere preventivamente confezionato in contenitore sigillato. Devono essere raggiunti i −18 °C in profondità entro un tempo massimo di 4 h, con una velocità di penetrazione del freddo pari a 2 cm/h. La temperatura di −18 °C deve essere mantenuta ininterrottamente fino al momento della vendita del prodotto e per tutto il periodo di conservazione fino al consumo. La surgelazione è qualitativamente superiore al congelamento, in quanto cellule e tessuti non subiscono danni rilevanti: ciò è dovuto soprattutto alla formazione di cristalli di ghiaccio di piccole dimensioni e alla contemporanea congelazione di tutti i liquidi presenti, sia quelli endocellulari che quelli interstiziali. Le caratteristiche organolettiche originali del prodotto vengono in tal modo preservate in maniera pressoché ottimale. 136 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 9 LA CONSERVAZIONE DEGLI ALIMENTI LO SCONGELAMENTO DEGLI ALIMENTI Congelati e surgelati si conservano in freezer a −18 °C fino alla data di scadenza. La qualità di un surgelato dipende, oltre che dalle condizioni igieniche di partenza, dal mantenimento ininterrotto della catena del freddo. Sono da scartare surgelati ricoperti di brina o in blocchi compatti, che potrebbero indicare un precedente parziale scongelamento. Ortaggi come piselli o fagiolini devono infatti apparire ben separati gli uni dagli altri all’interno delle confezioni. Etichette particolari che cambiano colore in caso di scongelamento accidentale in magazzino o sul banco vendita segnalano la trasformazione di ghiaccio in acqua. Lo scongelamento dei cibi surgelati o congelati è un’operazione da effettuarsi con accortezza, per dare modo all’acqua di ritornare in soluzione e nei sistemi colloidali ed evitare la perdita di liquidi interstiziali (tabella 9.4). A livello domestico si può lasciare l’alimento a temperatura ambiente o in frigorifero oppure utilizzare le microonde. È da evitare l’impiego di acqua calda o fredda. Le microonde sono onde elettromagnetiche con frequenza da 300 MHz a 300 GHz. Nell’industria e nei forni domestici si impiegano due frequenze: 915 MHz (λ = 33 cm) e 2450 MHz (λ = 12 cm). Le microonde causano una violenta agitazione delle molecole polari (in primo luogo l’acqua) con aumento dell’energia cinetica e produzione di calore. Poiché la radiazione penetra nel substrato, viene immediatamente convertita in calore: i tempi di trattamento sono molto più brevi rispetto ai sistemi tradizionali. L’industria conserviera utilizza le microonde per diversi scopi: per scongelare surgelati e congelati (il processo avviene in modo più uniforme e pratico), per l’essiccamento e la liofilizzazione, per trattamenti di pastorizzazione e sterilizzazione, per la cottura degli alimenti. Pesce, carne, prodotti da forno, frutta, verdura da consumare cruda, piatti precucinati devono essere scongelati completamente. Gli ortaggi e la frutta da cuocere possono essere scongelati a metà. Alcuni ortaggi, carni o pesce impanati e pronti per la frittura possono essere cucinati senza scongelarli. Una volta scongelato, il prodotto va subito utilizzato e non deve essere ulteriormente congelato, pena il consistente decadimento delle proprietà organolettiche per formazione di macrocristalli. Tabella 9.4 Scheda comparativa tra alimenti congelati e surgelati ALIMENTI CONGELATI ALIMENTI SURGELATI t$POHFMBNFOUPVMUSBSBQJEPPSBQJEP t$POHFMBNFOPVMUSBSBQJEP t5FNQFSBUVSBBMiDVPSFwEFMMBMJNFOUPWBSJBCJMF JOHFOFSF t5FNQFSBUVSBBMiDVPSFwEFMMBMJNFOUPOPOTVQFSJPSFB OPOJOGFSJPSFBo¡$$POTFSWB[JPOFFUSBTQPSUP o¡$EBMNPNFOUPEFMMBQSPEV[JPOFýOPBMMBWFOEJUB BUFNQFSBUVSBõo¡$ õo¡$QFSJMQFTDF QFSJMDPOTVNP t/POÒPCCMJHBUPSJBMBDPOGF[JPOFPSJHJOBMF*MQSPEPUUP QVÛFTTFSFBODIFWFOEVUPBUBHMJP t0CCMJHPEFMMBDPOGF[JPOFPSJHJOBMFBQSJCJMFTPMPEBM DPOTVNBUPSF QFSJQSPEPUUJEFTUJOBUJBMDPOTVNPEJSFUUP t1SPEPUUJEFTUJOBUJBMDPOTVNPEJSFUUPFTPQSBUUVUUPBMMF JOEVTUSJFEJUSBTGPSNB[JPOF t1SPEPUUJEFTUJOBUJBMDPOTVNPEJSFUUPFOPO Irradiazione Si tratta di una tecnica che prevede l’impiego di radiazioni (onde elettromagnetiche che trasportano energia), il cui assorbimento da parte della materia vivente comporta nelle molecole l’espulsione di elettroni o la loro eccitazione facendo compiere agli elettroni salti di livello energetico. Si distinguono radiazioni ionizzanti, come i raggi γ generati da isotopi radioattivi (cobalto 60) e i raggi X (fasci di elettroni ad alta energia), e radiazioni non ionizzanti come i raggi ultravioletti (UV). Le radiazioni ionizzanti hanno un elevato contenuto energetico e provocano la ionizzazione di atomi e molecole, in particolare di quelle dell’acqua da cui si formano radicali liberi Hr e OHr con forte azione ossidante. Agiscono direttamente sulle molecole biologiche “ber137 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 9 LA CONSERVAZIONE DEGLI ALIMENTI saglio” oppure indirettamente attraverso i radicali liberi che si formano dalle molecole dell’acqua e che interagiscono con le molecole bersaglio. Queste sono rappresentate dalle macromolecole biologiche e in particolare dal DNA. Le radiazioni ultraviolette (a lunghezza d’onda maggiore cui corrisponde un minore contenuto energetico) causano alterazioni nel DNA con la formazione di dimeri timina-timina o timina-citosina. Nell’industria alimentare l’impiego delle radiazioni per la conservazione degli alimenti desta molto interesse poiché provoca la morte dei microrganismi contaminanti senza alterare le caratteristiche organolettiche. Non tutti gli alimenti possono essere trattati con le radiazioni ionizzanti; il loro impiego è limitato, almeno nel nostro Paese, al trattamento di patate e aglio come antigermogliante, erbe aromatiche essiccate, spezie, condimenti vegetali, mentre in altri Paesi vengono utilizzate in modo meno restrittivo. La materia è disciplinata a livello internazionale dal Codex Alimentarius della FAO/WHO (Food and Agricoltural Organization, World Health Organization), mentre a livello nazionale si fa riferimento al D. Lgs. 94/2001. Le perplessità relative all’impiego delle radiazioni ionizzanti in campo alimentare riguardano naturalmente la possibile radioattività indotta negli alimenti, pur non essendo emerse fino ad ora risultanze relative a effetti negativi sulla salute. Le organizzazioni sopra ricordate indicano in ogni caso le dosi massime di energia da non superare nei trattamenti. Disidratazione/essiccamento Sottrarre l’acqua disponibile (aw) ai microrganismi contaminanti rappresenta un ottimo mezzo per la conservazione dei cibi. Molti alimenti di origine vegetale o animale esposti per un periodo più o meno lungo all’aria secca e al sole perdono gran parte del loro contenuto di acqua e possono venire conservati a lungo. È il caso per esempio di funghi e pomodori fra i vegetali e dello stoccafisso fra il pesce. Lo stoccafisso (figura 9.5) è il merluzzo essiccato all’aria fredda e con scarsissima umidità delle coste norvegesi (isole Lofoten e Westeralen). A livello industriale il processo viene effettuato negli essiccatoi ad aria calda, con la polverizzazione in camera di essiccamento o con l’essiccamento sottovuoto. Liofilizzazione Questo procedimento consiste nel trattare l’alimento, preventivamente congelato, in una camera di sublima- Affumicatura La lenta combustione di alcuni tipi di legname libera un fumo contenente aldeidi, eteri e acidi a cui vengono esposti cibi come carni e pesce. Tali sostanze hanno un effetto conservante, ma anche aromatizzante e conferiscono al cibo sapore e odore particolari e lo rendono in alcuni casi anche particolarmente pregiato. Il trattamento di affumicatura può essere condotto a caldo fra i 60 e i 100 °C (in prossimità della fonte di calore e con una blanda cottura dell’alimento) oppure a freddo a una temperatura di circa 25 °C e con un’esposizione più prolungata al fumo. Il trattamento non risulta molto efficace per alcuni batteri, fra cui Listeria e alcuni batteri lattici, ma agisce su enterobatteri e alcune specie del genere Bacillus. Figura 9.5 Essiccazione dello stoccafisso. Il merluzzo OFMMFDPTUFOPSWFHFTJWJFOJFTTJDDBUPBMMBSJBGSFEEBFDPO scarsissima umidità (fonte: www.wikipedia.com). 138 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario LA CONSERVAZIONE DEGLI ALIMENTI zione, per cui l’acqua presente passa direttamente dallo stato solido a quello di vapore (freeze drying). Gli alimenti liofilizzati mantengono le proprietà nutritive inalterate rispetto a quelli freschi e si conservano per anni, riacquistando le loro tipiche caratteristiche organolettiche con la semplice aggiunta di acqua (per es. caffè o preparati per zuppe o minestre). 9.3 Conservazione con mezzi chimici I trattamenti che impiegano mezzi chimici comprendono salagione, zuccheraggio, conservazione con aceto o con olio, con alcol, mediante fermentazione, con l’impiego di additivi e conservanti. Salagione, zuccheraggio Una delle tecniche più antiche per la conservazione dei cibi è la salagione, che porta alla creazione di un ambiente osmoticamente sfavorevole alla sopravvivenza dei germi provocando la fuoriuscita di acqua dalle loro cellule. I microrganismi alofili sono comunque in grado di sopportare concentrazioni saline piuttosto elevate e possono quindi sopravvivere facilmente rappresentando un pericolo. La salagione può essere effettuata in due modi: r a secco, come nel caso dei prosciutti che vengono accuratamente cosparsi di sale in superficie per sfregamento; oppure alternando strati di sale e di carne o pesce come nel caso del baccalà (merluzzo salato) o di altri tipi di pesce r a umido per mezzo di salamoie con concentrazioni di NaCl dal 10 al 30% circa. Il trattamento viene effettuato con l’immersione diretta dell’alimento nella soluzione salina oppure con l’iniezione della salamoia nella massa dell’alimento. La composizione della salamoia può subire variazioni nel tempo per lo sviluppo di sostanze secondarie (ammoniaca e acidi diversi), per cui deve essere periodicamente rinnovata. L’aggiunta di zucchero in concentrazioni del 60% circa permette di conservare alimenti diversi (per es. marmellate e gelatine di frutta) sulla base dello stesso principio della salagione. 9 Conservazione con aceto o con olio L’olio impedisce il contatto dei cibi con l’ossigeno, quindi questa modalità di conservazione non si basa su alcun effetto battericida. I germi anaerobi (soprattutto il pericoloso Clostridium botulinum) riescono perciò agevolmente a sopravvivere, le loro spore a germinare (se si tratta di germi sporigeni e se il pH non è troppo acido: per il botulino deve essere uguale o superiore a 4,5) e a produrre tossine. L’impiego dell’olio è quindi sicuro solo se abbinato ad altri procedimenti: pastorizzazione, sterilizzazione, acidificazione con aceto, salagione. Molti vegetali conservati sott’olio devono preventivamente essere cotti in aceto; il tonno viene cotto e inscatolato con olio d’oliva, quindi le scatolette vengono sigillate, lavate e sterilizzate a 121 °C. Le conserve sott’aceto vengono impiegate per alcuni ortaggi e per certi tipi di pesce. L’ambiente acido impedisce od ostacola fortemente la proliferazione della maggior parte dei microrganismi potenzialmente contaminanti, ma è comunque opportuno sbollentare preventivamente l’alimento per poi conservarlo in un contenitore non a contatto con l’aria. Conservazione con alcol L’alcol etilico al 70% è un buon conservante, anche se inefficace nei confronti delle spore batteriche. Viene impiegato per la conservazione di ciliegie e uva; agisce solubilizzando i lipidi di membrana e, per la sua azione disidratante e denaturante, sulle proteine. Conservazione mediante fermentazione La creazione di un ambiente acido (inospitale per gran parte dei microrganismi) conseguente all’attività fermentativa di particolari microrganismi è una tecnica antica ed efficace. La trasformazione del latte in prodotti acidi (yogurt e latti fermentati) ad opera di batteri lattici e la conservazione di cavoli, cetrioli e olive sono esempi molto comuni. Anche gli insaccati (salami) vengono preparati e conservati aggiungendo fermenti lattici; i foraggi vengono conservati per mezzo dell’insilamento con la creazione di ambiente acido che impedisce la putrefazione del fieno. Un presupposto imprescindibile 139 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 9 LA CONSERVAZIONE DEGLI ALIMENTI per questo tipo di conservazione è rappresentato dalla comune esigenza di sottoporre gli alimenti (la materia prima) a un pretrattamento: così per la preparazione di salami e altri insaccati le carni devono essere macinate, mentre i foraggi vanno trinciati prima di immagazzinarli in un silos. L’azione acidificante può essere provocata da microrganismi presenti naturalmente nell’alimento o dall’inoculazione di ceppi selezionati, come avviene comunemente nelle preparazioni industriali (insaccati, yogurt, formaggi). Questi argomenti sono trattati nei capitoli 6 e 12. 9.4 Impiego di additivi e conservanti Vengono definiti additivi alimentari quelle sostanze non utilizzate come ingredienti e aggiunte intenzionalmente agli alimenti per un fine tecnologico nelle diverse fasi della filiera produttiva. Si tratta, in altre parole, di sostanze che hanno lo scopo di prolungare la conservabilità di un alimento, preservarne la qualità, migliorarne l’aspetto e la consistenza: renderlo cioè più accettabile e ricercato dal consumatore. In alcuni alimenti non è consentito l’impiego di additivi: olio vergine d’oliva, latte fresco pastorizzato, yogurt naturale, zucchero, miele, paste secche alimentari. Per ogni additivo impiegato deve essere valutata la tossicità acuta, quella a breve (15-30 giorni) e a medio termine (30-90 giorni), nonché la tossicità cronica. È necessario stabilire inoltre la “dose giornaliera ammessa” (DGA). Gli additivi impiegati devono risultare in etichetta, con la denominazione della categoria di appartenenza, del nome o del numero CE. Conservanti ad azione antimicrobica Acido benzoico (E 210) e i suoi sali di Na (E 211), di K (E 212) e di Ca (E 213). Insieme all’acido sorbico e al PHB si trova in marmellate, gelatine, gomme da masticare, salse e minestre, maionese, merendine di cereali, bibite analcoliche. Ha massima efficacia in ambiente acido, mentre risulta inattivo a pH neutro o basico. Viene eliminato con le urine come acido ippurico legato alla glicina. Esteri dell’acido p-idrossibenzoico (PHB, E214E219). Sono addizionati alle gelatine nei prodotti a base di carne, agli snack a base di cereali e patate, agli integratori alimentari liquidi. Il loro uso è fortemente limitato dalle alterazioni che possono provocare nel sapore degli alimenti. Acido sorbico (E200) (figura 9.6) e suoi sali di K (E202) e Ca (E203). È aggiunto ai prodotti da forno, nel pane in cassetta, nella margarina, nei grassi, nei formaggi, nella maionese, nelle olive. È efficace fino a pH 6, non è adatto per la conservazione degli alimenti basici. Viene metabolizzato come un acido grasso naturale, quindi risulta innocuo se impiegato entro i limiti di legge. Poiché non altera i sapori, i colori naturali e le vitamine degli alimenti, è uno dei conservanti più impiegati. Anidride solforosa (E220) e suoi derivati: solfito di sodio (E221), bisolfito di Na (E222) e altri (E223-E228). È attiva contro muffe e batteri; impiegata in enologia come agente selettivo tollerato da saccaromiceti a concentrazioni proibitive per gli altri microrganismi. La SO2 viene aggiunta oltre che nei mosti anche all’aceto, ai succhi di frutta, alla birra e alle bevande analcoliche, a marmellate e gelatine di frutta. Può provocare allergie e deve essere dichiarata in etichetta insieme agli altri solfiti se la sua concentrazione è superiore a 10 mg/L. Difenile (E230), fenilfenolo (E231) e fenilfenato di Na (E232): sono utilizzati per il trattamento della buccia degli agrumi. Nisina (E234). È un antibiotico prodotto naturalmente da Streptococcus lactis e S. cremoris e si trova nei prodotti caseari. Può essere impiegato nei formaggi, nelle conserve vegetali e nelle creme di pasticceria. È il solo antibiotico che può essere immesso nella massa dell’alimento. H3C OH O Figura 9.6 Acido sorbico. 140 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 9 LA CONSERVAZIONE DEGLI ALIMENTI Conservanti secondari R1 O Sono additivi usati in origine per scopi diversi ma che hanno comunque un effetto antimicrobico. N N R2 Anidride carbonica (E290). Usata come acidulante e per gasare acqua, vino e bevande analcoliche, ha una blanda azione antisettica e conservante. Acido lattico (E270) e suoi sali di Na (E325), di K (E326) e di Ca (E327). È presente naturalmente nello yogurt e nel vino e viene addizionato come acidulante agli impasti per la panificazione, alle conserve vegetali, al caglio. Acido propionico (figura 9.7) (E280) e suoi sali di Na (E281), di K (E283) e di Ca (E282). Addizionato ai prodotti da forno e nella pasticceria, negli estratti di malto e per il trattamento superficiale nei formaggi. Ha azione fungistatica. Acido acetico (E260) e suoi sali di K (E261), di Na (E262) e di Ca (E263). Ha un’azione acidulante e antibatterica nella panificazione: i lieviti sono microrganismi acidofili e quindi non vengono inibiti. Nitrato di Na (E251) e di K (E252) e nitrito di Na (E250) e di K (E249). Sono contenuti naturalmente in alimenti animali e vegetali (tabella 9.5). Vengono addizionati a insaccati, prosciutti, würstel, mortadella, carni in scatola, nei prodotti caseari e nel pesce marinato, con limiti stabiliti dalla legge. Sono impiegati nelle carni per mantenere il colore rosso, dovuto a formazione di nitroso mioglobina e nitroso emoglobina, per migliorarne l’aroma, come antibatterico nei confronti di Clostridium botulinum e degli enterobatteri e per favorire invece lo sviluppo di lattobacilli e micrococchi responsabili della maturazione degli insaccati crudi. I nitriti (e l’acido nitroso che da questi deriva) reagiscono nello stomaco con le ammine che derivano dal O O CH3 CH2 C OH OH Figura 9.8 Nitrosammine. catabolismo dei composti azotati, formando le nitrosammine (figura 9.8), sostanze cancerogene. Fonti di nitrosammine sono anche la birra, il whisky, i formaggi, la carne e i pesci conservati, nonché sistemi di cottura come la frittura e la grigliatura. L’acido ascorbico (vitamina C), i tannini e i flavonoidi presenti nella frutta fresca, nel tè, nel vino, contrastano la formazione delle nitrosammine. I vegetali ricchi di nitrati come gli spinaci non vengono dati ai neonati prima dell’ottavo mese di vita perché il loro pH gastrico più alto dell’adulto favorisce l’attecchimento di batteri anche nello stomaco, con aumento del tasso di riduzione dei nitrati a nitriti. Ciò favorisce la formazione nel sangue di metaemoglobina, prodotto di ossidazione irreversibile dell’emoglobina. Le conseguenze possono essere mortali. Tabella 9.5 Contenuto in nitrati e nitriti dei principali alimenti freschi NO3– mg/kg NO2– mg/kg Spinaci 1860 2,7 Bietola 2760 6 Rape 1369 = Sedano 2340 0,5 Lattuga 850 0,4 Cavoli 635 0,5 Zucchine 413 0,7 ALIMENTI Melanzane 302 0,5 Fagioli 253 0,9 Carote 119 0,8 Finocchi 66 4 Farina 45 2 Patate 119 0,4 Carne bovina 1,1 = Pesce fresco 3,7 2,7 Latte bovino 0,7 = Parmigiano 0,2 = Figura 9.7 Acido propionico. 141 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 9 LA CONSERVAZIONE DEGLI ALIMENTI Antiossidanti Hanno la funzione di proteggere gli alimenti dall’ossidazione, che si manifesta essenzialmente con l’irrancidimento dei grassi e cambiamenti di colore. Agiscono ossidandosi al posto degli alimenti. Acido l-ascorbico (E300), i suoi sali di Na (E301), di Ca (E302) e l’estere palmitico (E304). La vitamina C viene addizionata a molti prodotti: birra, gelatine, confetture, marmellate, insaccati, succhi di frutta, prodotti dolciari, vino, liquori e molti altri. Negli insaccati previene la formazione di nitrosammine. Tocoferoli (E306-E309). Si trovano soprattutto nei grassi vegetali, sono molto sensibili ai raggi UV e si ottengono dagli oli vegetali ma anche per sintesi chimica. Vengono addizionati ai grassi, agli oli tranne che a quello d’oliva, agli insaccati freschi insieme con l’acido l-ascorbico. Acido citrico (E330) e i suoi sali di Na (E331), di K (E332) e di Ca (E333). Utilizzato in caramelle, confetti, frutta, ortaggi, carne macinata preconfezionata. Acido tartarico (E334) e i suoi sali di Na (E335), di K (E335) e di Na/K (E337). Impiegato anche come acidulante e correttore del pH in enologia, nelle bevande gassate, nelle conserve vegetali, nelle caramelle e nei confetti. Nella panificazione e nei prodotti dolciari è impiegato come polvere lievitante. Acido ortofosforico (E338) e i suoi sali di Na (E339), di K (E340) e di Ca (E341); polifosfati di Na e K (E450). Utilizzati sia come antiossidanti che acidulanti nelle bevande analcoliche, come addensanti e sali di fusione. Un eccesso di queste sostanze influisce sul contenuto di fosforo nelle ossa, legato a quello del calcio, con rischio di osteoporosi. Addensanti Gli addensanti o stabilizzanti hanno la funzione di conferire all’alimento una maggior consistenza e omogeneità. Comprendono molti polisaccaridi, fra cui la pectina (E440), l’alginato di Na (E401) e di K (E402), l’agar- agar (E406), la gomma arabica (E414) e la gomma adragante (E413), la gelatina, le carragenine (E407), le farine di semi di carrube e di guar. La pectina (estere dell’acido galatturonico) è l’unico addensante consentito nella preparazione di marmellate, confetture e gelatine di frutta. Si estrae dalla frutta, soprattutto dalle mele. Bollita in acqua forma un gel soprattutto in ambiente acido, per cui nella preparazione di marmellate casalinghe è opportuno aggiungere agli estratti pectinici o a una certa quantità di mele un po’ di succo di limone. L’agar-agar si scioglie a caldo sopra gli 80 °C e solidifica al di sotto dei 45 °C: viene usato nei budini, nei dolciumi, nelle glasse per torte. È la sostanza gelificante più impiegata nei terreni di coltura per microbiologia. La gelatina deriva dall’idrolisi del collagene animale, si ottiene dalla bollitura della pelle e delle ossa degli animali macellati, dopo evaporazione ed essiccamento; si scioglie in acqua calda e solidifica al di sotto dei 30 °C. Emulsionanti Gli emulsionanti sono sostanze che servono a rendere stabile un’emulsione, cioè a miscelare tra di loro due componenti non miscibili (per es. olio e acqua). Per assolvere a questa funzione le sostanze emulsionanti sono anfotere: hanno un’estremità polare idrosolubile e un’altra apolare liposolubile. Sono quindi dei tensioattivi: in pratica agiscono come i saponi. Vengono impiegati nella maionese, nella margarina, nella cioccolata, nelle creme e nei gelati: a questi prodotti conferiscono caratteri particolarmente graditi come la “palatabilità” o la cremosità. Gli emulsionanti più usati sono le lecitine (E322) e i mono- e digliceridi degli acidi grassi (E471). Esaltatori di sapidità Il glutammato monosodico (E621) (figura 9.9) viene usato per esaltare il sapore di molti alimenti ed è estratto dalle barbabietole o prodotto per sintesi chimica. È il responsabile del quinto sapore fondamentale (oltre all’amaro, al dolce, all’acido, al salato) definito come “umami”. Il suo potere viene ulteriormente esaltato dai composti chimici presenti negli estratti di carne, per cui gli esaltatori di sapore sono prevalentemente una misce- 142 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario LA CONSERVAZIONE DEGLI ALIMENTI O O O-Na+ HO NH2 9 coloranti sintetici, più stabili ed economici, destano molte perplessità sulla loro innocuità. Quelli più discussi sono gli azoici, caratterizzati dalla presenza del gruppo –N=N−. Figura 9.9 Glutammato monosodico. Edulcoloranti la di questi due componenti. È l’ingrediente principale dei dadi da brodo. Un suo consumo eccessivo può provocare disturbi temporanei al fegato (sindrome da ristorante cinese) in individui particolarmente predisposti. Il glutammato è presente naturalmente in diversi alimenti e abbondante in alcune alghe impiegate nella cucina cinese e giapponese. Impiegati in sostituzione dello zucchero (saccarosio), comprendono sostanze naturali o natural-derivate (sorbitolo, xilitolo, mannitolo) e sintetiche (saccarina, ciclammati, aspartame). Coadiuvanti tecnologici Coloranti Vengono distinti in naturali (estratti da prodotti vegetali o prodotti in laboratorio con formula uguale a quelli naturali) e sintetici (prodotti in laboratorio). I Impiegati per “rispettare determinati obiettivi tecnologici” (D.M. 209/96) nella preparazione o trasformazione degli alimenti, possono lasciare residui nel prodotto finito. Si tratta di enzimi, solventi, chiarificanti, decoloranti, demetallizzanti, agenti di distacco ecc. 143 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario ESERCIZI DI VERIFICA 1. La pastorizzazione del latte prevede il riscaldamento a: A 120 °C per 1 min B 72 °C per pochi s C 48 °C per 30 min 2. Il trattamento UHT prevede il riscaldamento a: A 220 °C per 2 s B 180 °C per 1 s C 140 °C per 2-5 s 3. Il latte UHT: A si conserva a temperatura ambiente per 8 mesi B si conserva a temperatura ambiente per 90 giorni C non si conserva a temperatura ambiente 4. Il latte pastorizzato si conserva a temperatura ambiente: A poche ore B alcuni giorni C per 3 mesi dalla data di confezionamento 5. Le spore del bacillo botulino germinano solo: A a pH inferiore a 4,5 B a pH superiore a 4,5 C quando il pH raggiunge valori uguali a quello delle cellule vegetative 6. Nella surgelazione la velocità di penetrazione del freddo deve risultare: A inferiore a quella che si verifica nella congelazione B superiore a quella che si verifica nella congelazione C uguale a quella di refrigerazione 7. Nella liofilizzazione gli alimenti vengono prima: A congelati B polverizzati finemente C riscaldati 8. Rispondi alle seguenti domande: Sai spiegare la differenza fra conserve e semiconserve? Spiega la differenza fra atmosfera controllata e atmosfera modificata. Cosa sono i conservanti secondari? Puoi fare alcuni esempi? Per quale motivo i nitrati e i nitriti addizionati ai cibi possono essere pericolosi? Come agiscono gli antiossidanti impiegati nei prodotti alimentari? Cosa sono e come agiscono gli emulsionanti? 144 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 10 NORMATIVE E CONTROLLI PER LA SICUREZZA E LA QUALITÀ ALIMENTARE 10.1 Sicurezza degli alimenti: normative e certificazioni 10.2 Il “pacchetto igiene” 10.3 Il sistema HACCP nell’industria alimentare 10.4 La shelf-life degli alimenti 10.5 Il challenge test La sicurezza alimentare è oggetto di numerose norme emanate dall’Unione Europea in materia di igiene degli alimenti al fine di tutelare i consumatori, il benessere degli animali e la salute delle piante. Un aspetto di grande rilevanza è rappresentato inoltre dalle norme che prescrivono un’adeguata etichettatura dei prodotti, per fornire una corretta informazione sulla natura, la provenienza, le modalità di conservazione e la scadenza degli alimenti. L’approccio globale che ha ispirato le iniziative legislative comunitarie in questo settore è noto con la formula “dai campi alla tavola” per sottolineare il complesso di normative volte a garantire un elevato standard di sicurezza in tutte le fasi della filiera produttiva. 10.1 Sicurezza degli alimenti: normative e certificazioni Certificazione alimentare (Shutterstock Images LLC). I riferimenti normativi cui le industrie produttrici di tutti i settori merceologici sono tenute a uniformarsi per garantire la sicurezza e la qualità dei loro prodotti sono emanati da vari organismi a livello nazionale, comunitario e internazionale. L’Organizzazione Internazionale per la Standardizzazione (International Organization for Standardization, ISO) ha da tempo emanato gli standard mondiali di riferimento in tutti i settori produttivi. La normativa ISO 9000, nelle sue varie parti, costituisce il punto di riferimento internazionale con cui le aziende produttrici devono confrontarsi per potersi fregiare della certificazione di conformità (rilasciata 145 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 10 NORMATIVE E CONTROLLI PER LA SICUREZZA E LA QUALITÀ ALIMENTARE da enti titolati a farlo) che attesta che un prodotto o un servizio è conforme alle specifiche dettate. La normativa ISO 22 000, ispirata ai criteri di ISO 9000 e che comprende i principi del sistema HACCP, riguarda la sicurezza nel settore alimentare. A livello comunitario l’ente preposto a emettere norme di standardizzazione è il CEN (Comitato Europeo di Normazione), mentre in Italia opera l’Ente Unitario Italiano di Unificazione, che emette le norme UNI. In molti casi le certificazioni sono obbligatorie (in termine tecnico si dicono “cogenti”), per esempio per i prodotti che devono rispondere a caratteristiche specifiche stabilite da Direttive Europee, che di conseguenza possono utilizzare il marchio CE. Esclusivamente laboratori accreditati ed enti di certificazione che rispondono alle norme europee EN 45 000 (in Italia UNI EN 45 000) sono autorizzati a rilasciare attestati di omologazione e a certificare che tale omologazione sia mantenuta nel tempo. I sistemi di qualità delle aziende sono valutati e certificati da specifici laboratori secondo le norme UNI EN 29 000. In campo alimentare assume particolare importanza il controllo e la certificazione del rispetto di precise norme igieniche, allo scopo di garantire al consumatore la qualità e la sicurezza del prodotto, intesa come assenza di rischi per la salute. Tradizionalmente, anche se la normativa viene periodicamente aggiornata secondo le acquisizioni più recenti della microbiologia degli alimenti, il controllo dell’igiene lungo tutta la filiera produttiva viene effettuato con la ricerca e il conteggio di microrganismi indicatori di inquinamento fecale: coliformi, Escherichia coli, enterococchi, clostridi solfito-riduttori. I controlli della sicurezza di un alimento si effettuano, secondo il Regolamento CE 2073/2005, per escludere la presenza di batteri patogeni, fra cui soprattutto Salmonella e Listeria, di enterotossine (in particolare quelle stafilococciche) e di alcune sostanze chimiche (come l’istamina nei prodotti ittici). Il Regolamento CE 178/2002 si occupa di sicurezza alimentare nel significato più ampio del termine e, a tutela della salute dei consumatori, intende responsabilizzare allevatori, agricoltori, produttori di mangimi, operatori del settore alimentare (OSA). Istituisce inoltre l’EFSA (Autorità Europea per la Sicurezza Alimentare). Esso stabilisce: “i principi e i requisiti generali della legislazione alimentare, dispone l’obbligo della rintracciabilità lungo tutte le fasi di produzione, trasformazione e commercializzazione degli alimenti e dei mangimi, istituisce l’Autorità Europea per la Sicurezza Alimentare e fissa procedure nel campo della sicurezza alimentare.” Uno degli aspetti più importanti dei vari regolamenti che si sono succeduti nel tempo è rappresentato dalla necessità che i controlli sulla sicurezza alimentare siano affidati sia a enti certificatori esterni alle aziende che a un responsabile interno, in modo da responsabilizzare maggiormente tutti gli operatori all’interno della filiera produttiva. 10.2 Il “pacchetto igiene” Con l’emanazione del cosiddetto “pacchetto igiene”, in vigore dal 2006, la Commissione Europea ha aggiornato e riorganizzato la precedente e complessa normativa in tema di sicurezza e qualità alimentare. Si tratta di una raccolta di norme, inizialmente quattro (Regolamenti CE 852/2004 − CE 853/2004 − CE 854/2004 − CE 882/2004), poi portate a nove con il Regolamento 183/05, che stabilisce i requisiti per l’igiene dei mangimi, e con i Regolamenti CE 2073, 2074, 2075 e 2076/2005 in materia di criteri microbiologici e organizzazione dei controlli. Questi nove regolamenti emanati tra il 2004 e il 2005, insieme con il Regolamento 178 del 2002, fissano i principi comunitari in materia di igiene e sicurezza degli alimenti e dei mangimi e disciplinano il regime dei controlli. Gli obiettivi fondamentali che si intendono perseguire con l’emanazione di queste direttive sono: r garantire la salute del consumatore attraverso la commercializzazione di alimenti sicuri e sani r uniformare la legislazione dei Paesi membri in materia di sicurezza alimentare r standardizzare le procedure di controllo in tutta la Comunità Europea. Il problema della sicurezza alimentare viene affrontato a tutti i livelli della filiera produttiva (“approccio di filiera dal campo alla tavola”), a iniziare dalle materie prime (prodotti agricoli e d’allevamento, della caccia e della pesca) per proseguire con le varie fasi della trasformazione, della distribuzione e della vendita. 146 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario NORMATIVE E CONTROLLI PER LA SICUREZZA E LA QUALITÀ ALIMENTARE I Regolamenti 852 e 853 si rivolgono agli Operatori del Settore Alimentare (OSA), identificandoli come unici responsabili della sicurezza e qualità dei prodotti; i Regolamenti 854 e 882 riguardano le autorità cui competono i controlli lungo l’intera filiera. Il Regolamento 852 stabilisce norme igieniche relative a tutti i prodotti alimentari che prevedono obbligatoriamente l’adozione del sistema HACCP. Si tratta in pratica di esercitare un continuo autocontrollo per prevenire o minimizzare i rischi inerenti la produzione, mettere a punto interventi di neutralizzazione e verificare che tali interventi siano efficaci. Vengono fissate norme riguardanti i locali, le attrezzature, il confezionamento, il trasporto, la gestione dei rifiuti. Gli OSA sono inoltre tenuti a conoscere le materie prime con cui è stato preparato l’alimento e a chi viene fornito: si stabilisce così un principio di rintracciabilità del prodotto (Regolamento CE 178/2002, figura 10.1), in vigore dal gennaio 2005 e definito come: “la possibilità di ricostruire e seguire il percorso di un alimento o di una sostanza destinata o atta a entrare a far parte di un alimento attraverso tutte le fasi della produzione, della trasformazione e della distribuzione.” Nel Regolamento 853/2004 sono stabilite norme igieniche riguardanti in modo specifico la produzione di Figura 10.1 Etichettatura degli alimenti. L’immagine riporta un esempio di etichettatura degli alimenti, procedimento utile per la rintracciabilità di un prodotto. 10 alimenti di origine animale nelle aziende di grandi dimensioni che commercializzano i loro prodotti sull’intero territorio della Comunità Europea o nei Paesi extracomunitari. I prodotti commercializzati devono essere dotati di marchio o bollo di conformità sanitaria che ne certifica la provenienza CEE. Altre norme riguardano aspetti igienici di alimenti quali carni, molluschi bivalvi vivi, prodotti della pesca, latte e prodotti a base di latte, ovoprodotti, cosce di rana e lumache, grassi animali trasformati, gelatine, collagene. Per quanto attiene ai controlli, i Regolamenti 854/2004 (prodotti di origine animale) e 882/2004 (tutti i prodotti alimentari) stabiliscono norme riguardanti: r la corretta applicazione delle norme igieniche di lavorazione r l’efficacia delle misure di autocontrollo r l’applicazione di marchi e bolli, fondamentali anche per il sistema di rintracciabilità r la valutazione dei risultati delle analisi di laboratorio sui campioni prelevati. Il Regolamento 183/2005 stabilisce i requisiti per l’igiene dei mangimi; il Regolamento 2073/2005 e successive modifiche detta i criteri microbiologici applicabili ai prodotti alimentari (capitolo 12). Si tratta di un complesso di norme particolarmente interessanti in quanto fissano parametri di accettabilità e sicurezza microbiologica degli alimenti. Il Regolamento 2074/2005 stabilisce le modalità di attuazione relative a taluni prodotti di cui al Regolamento 853/2004 e all’organizzazione dei controlli ufficiali. Il Regolamento 2075/2005 riguarda norme specifiche applicabili ai controlli ufficiali relativi alla presenza di trichine nelle carni. Il Regolamento 2076/2005 reca disposizioni transitorie per l’attuazione dei Regolamenti 853/2004, 854/2004 e 882/2004 e la modifica dei Regolamenti 853/2004 e 854/2004. Una delle innovazioni contenute nel “pacchetto igiene” è l’estensione anche alla produzione primaria di norme e procedure basate sull’applicazione di corrette prassi igieniche e non più sui principi di analisi dei rischi del sistema HACCP. Per produzione primaria si intendono tutte le fasi della produzione, allevamento e 147 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 10 NORMATIVE E CONTROLLI PER LA SICUREZZA E LA QUALITÀ ALIMENTARE coltivazione delle materie prime, compresi il raccolto, la mungitura e l’allevamento di animali da macello. Sono produzioni primarie anche la caccia, la pesca e la raccolta di funghi, bacche, lumache ecc. 10.3 Il sistema HACCP nell’industria alimentare Al fine di prevenire la diffusione di malattie infettive legate alla commercializzazione e al consumo di prodotti alimentari non idonei sia dal punto di vista chimico che microbiologico, le aziende produttrici sono tenute ad adottare procedure di autocontrollo per garantire qualità e sicurezza dei prodotti. Il sistema è noto con l’acronimo HACCP (Hazard Analysis and Critical Control Point, Analisi dei Rischi e Controllo dei Punti Critici) ed è stato ideato dalla statunitense FDA (Food and Drug Administration) (figura 10.2). L’adozione del sistema HACCP consente, quando correttamente applicato, di prevenire o minimizzare inconvenienti non solo di ordine chimico o biologico (contaminazioni), ma anche di garantire un prodotto qualitativamente ineccepibile sotto ogni altro profilo. Il sistema HACCP individua all’interno di un processo produttivo i punti di criticità operativa sui quali è opportuno e comunque conveniente effettuare controlli (tabella 10.1). In questo modo si raggiunge la ragionevole sicurezza che il prodotto finito corrisponda ai criteri di qualità prefissati. Un punto critico (critical point) è infatti definibile come una fase produttiva o un trattamento su cui effettuare un controllo (control) allo scopo di eliminare o almeno minimizzare un pericolo (hazard). L’attribuzione di criticità a un punto della produzione (tabella 10.2) deve essere compiuta con cauTabella 10.1 Analisi dei pericoli e punti di criticità Hazard analysis (analisi dei pericoli) Identificare dove e come un problema di sicurezza dell’alimento può rendersi evidente Critical control points (punti critici per il controllo e la gestione dei pericoli) Identificare, verificare e valutare la correttezza e l’idoneità dei modi di produzione Documentare la loro corretta applicazione Figura 10.2 HACCP. L’HACCP è un sistema di controllo nel settore della sicurezza alimentare. Tabella 10.2 Guida per individuare i punti critici (CCP) Il punto esaminato è in grado di eliminare o ridurre un potenziale pericolo? Sì ➝ CCP No ➝ in corrispondenza del punto in esame potrebbe nascere un nuovo pericolo? No ➝ Non CCP Sì ➝ nelle successive fasi della produzione esiste un altro momento in grado di eliminare o ridurre il pericolo identificato? No ➝ CCP Sì ➝ Non CCP tela evitandone la sovrabbondanza. I punti critici hanno infatti carattere ultimativo: il pericolo individuato non deve poter essere gestito in ulteriori fasi della lavorazione. Ridurre i punti critici a quelli indispensabili può aiutare a mantenerli effettivamente sotto controllo. Le materie prime devono essere verificate attraverso la selezione dei fornitori e la conformità alle caratteristiche di qualità, igiene e sicurezza alimentare. Il ciclo produttivo in cui si realizza la trasformazione della materia prima presenta sicuramente in molte delle sue fasi altrettanti punti critici, sui quali va effettuato un attento e costante controllo. I controlli sul prodotto finito si eseguono attraverso analisi a campione che verificano la rispondenza delle caratteristiche chimiche, microbiologiche e organoletti- 148 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario NORMATIVE E CONTROLLI PER LA SICUREZZA E LA QUALITÀ ALIMENTARE 10 Tabella 10.3 Analisi dei pericoli 1 Preparare una lista delle fasi della produzione in cui si possono verificare ingresso, sopravvivenza e proliferazione di sostanze chimiche e/o microrganismi indesiderati 2 Identificare per ogni possibile pericolo la relativa causa 3 Descrivere le procedure operative in atto in corrispondenza dei punti di pericolo e valutare se e quali possono avere influenza sulla causa del pericolo che del prodotto sia alle norme vigenti che agli standard qualitativi adottati dall’azienda produttrice. Nel controllo degli alimenti una fase molto importante è costituita dai piani di campionamento (capitolo 12) che possono essere di severità diversa a seconda degli obiettivi più o meno categorici o stringenti che ci si pone in termini di qualità. Il sistema HACCP è fondato su 7 principi basilari, riportati anche nel Regolamento 852/2004: r identificazione dei rischi inerenti la produzione di un alimento attraverso tutte le fasi produttive, valutazione della possibilità che il rischio si verifichi e identificazione delle misure preventive per tenere il rischio sotto controllo r identificazione dei punti o fasi di produzione su cui è possibile esercitare un controllo (dalle materie prime al loro trasporto, al trattamento, alla conservazione, alla vendita) allo scopo di eliminare i possibili rischi o di minimizzarli r definizione dei limiti di criticità per ogni CCP r predisposizione di un sistema di monitoraggio (test) da effettuare per ogni CCP r predisposizione delle azioni correttive da intraprendere se un CCP risulta fuori norma r predisposizione delle prove di verifica per il funzionamento complessivo del sistema HACCP predisposto r allestimento di un’appropriata, completa e aggiornata documentazione dell’intero sistema e delle relative procedure. 10.4 La shelf-life degli alimenti La shelf-life di un alimento può essere intesa come “vita commerciale”, “vita di scaffale” o “stabilità durante la conservazione”. Figura 10.3 Shelf-life. Misure della shelf-life della lattuga attraverso riscaldamento del contenitore. In altre parole questo parametro indica per un dato prodotto, in determinate condizioni di conservazione, il tempo limite entro il quale si possono verificare al suo interno lievi modificazioni della qualità, comunque ancora accettabili dal punto di vista della sicurezza al consumo. Nel settore alimentare le aziende produttrici devono essere in grado di stimare quale possa essere la shelf-life dei loro prodotti: gli alimenti sono infatti sottoposti a condizioni di trasformazione, confezionamento, distribuzione e conservazione estremamente variabili. La valutazione della shelf-life di un prodotto alimentare si basa su parametri diversi, fra cui la presenza di alcuni microrganismi indicatori o di loro metaboliti e l’andamento temporale della loro concentrazione. Nello studio di valutazione il prodotto viene sottoposto a trattamenti che simulano in modo accelerato le condizioni ambientali “standard” in cui si troverà negli scaffali del punto vendita (figura 10.3). Il monitoraggio riguarda solitamente la conta microbica, la ricerca e la conta di muffe e lieviti, quella di alcuni microrganismi patogeni (in relazione alla tipologia dell’alimento) e dei germi indicatori di igiene (per es. gli indicatori di inquinamento fecale), la determinazione di alcuni parametri chimici (pH, aw ecc.) e sensoriali (caratteri organolettici). Lo 149 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 10 NORMATIVE E CONTROLLI PER LA SICUREZZA E LA QUALITÀ ALIMENTARE L’INSALATA RUSSA Un esempio concreto di applicazione di procedura HACCP alla produzione di alimenti può essere fornito dalla preparazione dell’insalata russa (figura 10.4). Per ottenere dati concreti, è possibile prendere in considerazione due parametri: la gravità del danno e la probabilità che questo si verifichi. Entrambi i parametri sono espressi da coefficienti che vanno da 0 a 3. Moltiplicando fra loro i due coefficienti assegnati, si ottiene un valore identificato come gravità del rischio (GR). Nell’esempio indicato all’ingrediente “maionese” viene attribuito un GR = 9, in quanto la gravità del possibile danno è massima (3: salmonellosi) così come massima è la probabilità che si verifichi (fattore di rischio 3: utilizzo di uova crude; esigenza di perfetta igiene nella manipolazione delle uova, di perfetta pulizia delle attrezzature e del piano di lavoro, di accurato lavaggio delle mani da parte dell’operatore ecc.). scopo è quello di prevedere la possibile evoluzione temporale dei parametri analizzati rispetto al “tempo zero” di riferimento. I test di conservabilità e il challenge test sono orientati al raggiungimento di questo obiettivo, ma ad essi si affianca anche la microbiologia predittiva, che attraverso l’utilizzo di modelli matematici e il ricorso a specifici database si propone di “descrivere e prevedere la risposta dei microrganismi al loro ambiente”. Va in ogni caso precisato che la shelf-life di un prodotto può non coincidere esclusivamente con la sua data di scadenza. Questo termine infatti è legato a parametri di sicurezza igienica e di stabilità imposti dalla normativa, mentre l’apprezzamento di un alimento coinvolge fattori psicologici e sensoriali che determinano nel consumatore un complesso di aspettative nei riguardi del prodotto. Nel caso poi di alimenti “freschi” che non hanno una data di scadenza (per es. frutta o verdura) entrano in gioco valutazioni soggettive, per cui un consumatore può rifiutare un prodotto che per un altro non è ancora “invecchiato”. In definitiva, risulta spesso difficile determinare con precisione quale sia l’effettiva shelf-life di un alimento e si preferisce parlare di probabilità che il consumatore ritenga più o meno accettabile un prodotto dopo un certo periodo di tempo. Per le verdure impiegate nella preparazione di un’insalata russa il rischio sussiste ugualmente, ma il GR è sicuramente inferiore in quanto si utilizzano verdure cotte: il trattamento termico elimina gran parte del rischio microbico. Figura 10.4 Insalata russa. 10.5 Il challenge test Il challenge test è in pratica una simulazione di laboratorio di quello che può accadere a un prodotto durante la preparazione, la distribuzione, la conservazione. Si tratta di una prova che fornisce informazioni importanti sull’andamento dell’eventuale sviluppo di microrganismi in un determinato prodotto (non solo alimentare; viene effettuato, per esempio, anche sui cosmetici) allo scopo di: r poterne prevedere con sufficiente ragionevolezza la durata nel tempo (shelf-life) r monitorare il suo comportamento in termini di qualità microbiologica in conseguenza di un processo produttivo r verificare l’efficacia del sistema conservante, per la valutazione della stabilità microbiologica del prodotto finito r verificare l’efficacia di trattamenti impiegati per ridurre la carica microbica delle materie prime, dei semilavorati o dei prodotti. Il test è basato sull’inoculo nel prodotto di un alto numero di microrganismi scelti fra i patogeni o fra gli indicatori di uno scarso livello igienico per poter valutare, in condizioni ambientali controllate, se l’alimento possa 150 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario NORMATIVE E CONTROLLI PER LA SICUREZZA E LA QUALITÀ ALIMENTARE arrivare a rappresentare un rischio per la salute dei consumatori. Il challenge test può essere effettuato per valutazioni in merito al: r processo produttivo: si inocula con il microrganismo prescelto la materia prima e si procede al monitoraggio del prodotto nei vari passaggi del processo r prodotto finale: si inocula il prodotto finito, lo si confeziona nelle stesse condizioni in cui viene com- 10 mercializzato e se ne valutano gli sviluppi durante la shelf-life. I microrganismi utilizzati più di frequente per l’esecuzione di un challenge test sono Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Streptococcus spp., Aspergillus niger. ESERCIZI DI VERIFICA 1. Rispondi alle seguenti domande: Quali aziende possono contrassegnare i loro prodotti con il marchio CE? Che cosa prevede il regolamento CEE 2073/2005 ai fini della certificazione di igiene e sicurezza dei prodotti alimentari? Spiega in che cosa consiste il “pacchetto igiene” e quali sono gli obiettivi che si intendono perseguire Cosa si intende con l’acronimo HACCP? Cosa differenzia l’HACCP rispetto a un controllo compiuto esclusivamente al termine di un processo produttivo? Quali sono i principi su cui si fonda l’HACCP? Come si giunge all’individuazione corretta di un “punto critico”? Cosa si intende per shelf-life di un alimento? Come si può arrivare a stimare correttamente quale può essere la shelf-life di un alimento? Spiega cosa è e come può essere eseguito un challenge-test. 151 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 11 MALATTIE TRASMESSE CON GLI ALIMENTI 11.1 Infezioni, intossicazioni, tossinfezioni 11.2 Intossicazione da stafilococchi patogeni 11.3 Tossinfezione da Escherichia coli 11.4 Shigellosi 11.5 Salmonellosi 11.6 Tifo e paratifo 11.7 Tossinfezione da Yersinia enterocolitica 11.8 Intossicazione da Clostridium botulinum 11.9 Tossinfezione da Clostridium perfringens 11.10 Infezione da Bacillus cereus e altri bacilli 11.11 Infezione da Vibrio parahaemolyticus Le malattie trasmesse con alimenti e bevande comprendono infezioni, intossicazioni e tossinfezioni. I fattori più importanti che agiscono nel determinare le caratteristiche di queste malattie sono da individuare soprattutto nella virulenza dei microrganismi, nella carica microbica dell’alimento, nelle modalità di consumo, nello stato delle difese immunitarie dell’organismo e nelle sue capacità di risposta. Maggiore è la virulenza di un microrganismo (cioè il suo grado di patogenicità), più facilmente sarà in grado di provocare una patologia caratteristica anche in presenza di basse cariche microbiche. D’altra parte il consumo di alimenti con cariche microbiche elevate rende più probabile il superamento della dose minima infettante, cioè del numero minimo di microrganismi necessario a determinare l’infezione. Una permanenza prolungata dell’alimento contaminato nello stomaco permette una certa azione microbicida dei succhi gastrici nei confronti dei microrganismi: l’assunzione di bevande contaminate a stomaco vuoto facilita l’infezione. 11.12 Colera 11.13 Listeriosi 11.14 Brucellosi 11.15 Tossinfezione da Campylobacter 11.16 Micotossicosi 11.17 Epatite infettiva (epatite A) 11.18 Infezione da Entamoeba histolytica 11.1 Infezioni, intossicazioni, tossinfezioni Il requisito fondamentale di un prodotto alimentare è indubbiamente la sua sicurezza, intesa come assenza di rischi per la salute dei consumatori. La pericolosità di un alimento è legata alla possibilità di provocare infezioni, intossicazioni, tossinfezioni. Nel caso delle intossicazioni, tossine di origine animale o vegetale possono essere presenti negli animali e 152 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario MALATTIE TRASMESSE CON GLI ALIMENTI 11 nelle piante utilizzati come cibo, oppure essere prodotte da microrganismi (batteri, muffe, alghe) che si siano sviluppati negli alimenti o ancora che abbiano accidentalmente contaminato l’alimento durante le fasi di produzione, trasformazione, conservazione e trasporto. È ovvio che affinché un microrganismo possa produrre tossine deve prima essere in grado di: r contaminare l’alimento r trovare le condizioni adatte al proprio sviluppo. Sono questi i due punti fondamentali su cui bisogna agire per approntare un’efficace azione di prevenzione. Le infezioni alimentari sono causate dall’ingestione di microrganismi patogeni presenti nell’alimento. La stragrande maggioranza degli alimenti ospita una certa carica microbica, che può aumentare in relazione ai processi di lavorazione o conservazione cui l’alimento viene sottoposto: tali microrganismi derivano dall’ambiente, dagli utensili, dalle superfici di lavoro, dal personale. Un aumento considerevole della carica microbica può portare, nel caso più semplice, alla rapida degradazione dell’alimento rendendolo non più adatto al consumo, ma può anche essere la premessa per lo sviluppo di microrganismi patogeni, pericolosi per la salute dei consumatori. Per causare un’infezione, i microrganismi presenti nell’alimento devono potere invadere i tessuti dell’ospite-consumatore: tipico il caso di batteri che invadono la mucosa intestinale esercitando in loco la loro attività patogena oppure superano questa barriera e si localizzano in altre sedi. Nel caso di tossinfezioni di origine alimentare si registra sia l’ingestione e la presenza di batteri che la produzione nell’organismo ospite delle relative tossine. 11.2 Intossicazione da stafilococchi patogeni Gli stafilococchi sono batteri ubiquitari, diffusi in tutti gli ambienti, dall’acqua al suolo, alla pelle, e quindi in grado di contaminare molto facilmente gli alimenti. Fanno parte della flora microbica commensale delle vie respiratorie e gastroenteriche. Sono cocchi Gram-positivi con disposizione a grappolo (figura 11.1), immobili e asporigeni, caratterizzati dalla capacità di sopportare concentrazioni saline fino al 10-15%. Sono tutti positivi al test della catalasi, mentre solo le specie patogene sono positive a quelli Figura 11.1 Staphylococcus aureus. Immagine al microscopio (fonte: CDC/Janice Carr; Jasmine Hageman). della coagulasi e della termonucleasi e sono contraddistinte dalla capacità di fermentare il mannitolo. Sviluppano a temperature comprese fra 15 e 45 °C; non si riproducono e non elaborano tossine a pH < 5. Comprendono specie saprofite ed altre patogene (Staphylococcus aureus, nome che deriva loro dal caratteristico colore giallo-oro delle colonie in agar) in grado di provocare svariate patologie come foruncoli, ascessi, endocarditi, artriti, meningiti. Gli stafilococchi producono vari tipi di tossine ad attività citolitica (leucocidine, emolisine). Alcuni ceppi patogeni elaborano una enterotossina (tossina ad azione intestinale) in grado di provocare, se ingerita con gli alimenti, una sindrome gastroenterica con vomito e diarrea, raramente con febbre. I sintomi compaiono a breve distanza di tempo dall’ingestione degli alimenti contaminati (2-4 h) e la guarigione è solitamente la norma. La tossina viene prodotta dopo che gli stafilococchi, che hanno contaminato l’alimento provenendo il più delle volte dal personale addetto alla preparazione dei cibi, hanno avuto la possibilità di riprodursi attivamente raggiungendo cariche microbiche piuttosto elevate. Simili evenienze si possono verificare facilmente nel caso di una cattiva conservazione del cibo (permanenza per un paio d’ore a temperature di 30-40 °C e oltre, oppure per una decina di ore a temperatura ambiente). Occorre tenere presente che gli stafilococchi vengono facilmente eliminati dall’esposizione al calore (50-60 °C), mentre le tossine da essi prodotte sono termoresistenti e vengono inattivate solo da un trattamento a 100 °C per almeno 30 min o a 60 °C per almeno 3 h. Il semplice riscaldamento dell’alimento al cui interno siano state prodotte tossine o anche una sua incompleta cottura non sempre quindi è in grado di eliminare la tossina. Gli stafilococchi e le tossine possono inoltre rimanere a lungo negli 153 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 11 MALATTIE TRASMESSE CON GLI ALIMENTI alimenti, anche se conservati in ambiente refrigerato a −10/−30 °C. Nella maggior parte dei casi fonte di infezione sono i soggetti con faringite, acne e infezioni cutanee, otiti o congiuntiviti sostenute da stafilococchi patogeni, coinvolti in qualche modo nella manipolazione del cibo. Gli alimenti vengono contaminati dal contatto con le mani non lavate o dall’aerosol microbico diffuso con starnuti o colpi di tosse. Da non sottovalutare anche la contaminazione da contatto con gli utensili di cucina. Gli alimenti che più frequentemente si dimostrano veicolo dell’intossicazione sono le creme e i gelati, i prodotti freschi di pasticceria in genere, le uova e le preparazioni a base di uova crude (per es. maionese), i prodotti ittici, la carne macinata, il latte e i latticini freschi. 11.3 Tossinfezione da Escherichia coli Il genere Escherichia fa parte degli enterobatteri (bacilli Gram-negativi aerobi/anaerobi facoltativi e asporigeni ad habitat intestinale degli animali a sangue caldo) e comprende l’unica specie E. coli (figura 11.2). All’interno di questa specie si distinguono peraltro alcune centinaia di varietà o sierotipi diversi, ciascuno caratterizzato da una diversa combinazione degli antigeni O (somatico polisaccaridico dello strato lipidico LPS), H (proteico flagellare), K (polisaccaridico della capsula). I ceppi patogeni di E. coli possono essere raggruppati nelle seguenti classi: r EPEC enteropatogeni r ETEC enterotossinogeni r EIEC enteroinvasivi r EHEC o VTEC (Vero Toxinogen E. Coli) enteroemorragici. Ci sono poi ceppi opportunisti, normalmente non patogeni nel loro consueto habitat intestinale, ma che lo diventano quando migrano in altri distretti dell’organismo: esempio tipico le cistiti da E. coli. La causa più frequente di tossinfezione da E. coli consiste nel consumo di bevande o alimenti come carni crude o poco cotte contaminate da ceppi patogeni, in grado di invadere la mucosa intestinale e/o di produrre potenti tossine. I ceppi invasivi non producono enterotossine, ma aderiscono alla parete intestinale e vi penetrano provocando ulcerazioni della mucosa con diarrea emorragica. Gli stipiti enterotossici rimangono adesi alla parete Figura 11.2 Escherichia coli. Immagine al microscopio elettronico del batterio Escherichia coli (fonte: CDC/Janice Carr). intestinale provocando dissenteria (sono i maggiori responsabili della “diarrea del viaggiatore”); quelli enteropatogeni causano lesioni nella parete intestinale e la “sindrome diarroica” con dissenteria acquosa prolungata. Ai ceppi enteroemorragici EHEC o VTEC appartengono fra i tanti altri E. coli O157:H7 e quello denominato O104:H4, responsabili di casi molto gravi di tossinfezione, di cui alcuni con esito letale (sindrome uremicoemolitica). Le tossine elaborate da tali ceppi sono denominate anche SLT (Shiga-like toxin) 1 e 2. I ceppi VTEC provengono il più delle volte dall’intestino dei bovini da cui sono stati spesso isolati: ciò deve far riflettere sulla pericolosità del consumo di carne poco cotta, in particolare quella macinata con cui vengono preparati gli hamburger, più soggetta a possibili contaminazioni. Escherichia coli è il più tipico rappresentante dei coliformi, un raggruppamento che non ha valore tassonomico, ma che comprende vari generi di Enterobacteriaceae (Escherichia, Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella, Yersinia e altri) caratterizzati dalla capacità di fermentare il lattosio con produzione di acido e gas. I primi quattro generi sono denominati coliformi fecali, in grado di crescere anche alla temperatura di 44 °C. I coliformi, insieme con enterococcchi (streptococchi fecali) e clostridi solfito-riduttori sono universalmente considerati i più specifici indicatori di inquinamento fecale nelle acque e negli alimenti. 11.4 Shigellosi Le shigelle sono enterobatteri responsabili di una sindrome diarroica severa con conseguenze anche letali 154 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario MALATTIE TRASMESSE CON GLI ALIMENTI (dissenteria bacillare da Shigella dysenteriae) con infiammazione intestinale, diarrea con muco, sangue e pus; o forme meno gravi da S. flexneri e S. boydii. La patologia è ascrivibile alla produzione di un’endotossina: i microrganismi non si diffondono al di là della parete intestinale nel sangue e in altri organi, ma si moltiplicano nel colon. Le shigelle si sviluppano fra i 10 e 40 °C e vengono uccise dalla pastorizzazione; la conservazione dei cibi in ambiente refrigerato a +4 °C ne blocca la moltiplicazione. Il periodo d’incubazione si aggira intorno alle 24 h e gli alimenti più frequentemente responsabili sono acqua, latte e latticini freschi, carne, pollo e pesce, contaminati generalmente dalla manipolazione da parte di portatori sani. 11.5 Salmonellosi Anche il genere Salmonella fa parte degli enterobatteri. Le salmonelle (figura 11.3) producono endotossine che si liberano nell’ambiente extracellulare dopo la morte della cellula e la sua conseguente lisi, ma un ruolo importante nel determinare il tipico quadro patologico è da attribuire anche alla presenza dei microrganismi vivi che invadono la mucosa intestinale causandone l’ulcerazione: per questo il termine di tossinfezione appare quello più appropriato. Le patologie infettive da salmonelle sono così schematizzabili: r sindrome gastroenterica o tossinfettiva (salmonellosi) r febbre tifoide r febbre paratifoide. Mentre nelle gastroenteriti l’azione patogena delle salmonelle è limitata all’ambito gastrointestinale, tifo e paratifo sono malattie sistemiche e interessano anche altri organi. Le tossinfezioni da Salmonella si trasmettono tipicamente attraverso il circuito oro-fecale: l’uomo contrae l’infezione dall’ambiente esterno ingerendo i batteri con acqua o alimenti e quindi elimina con le feci i microrganismi diffondendo l’infezione. Le salmonelle sono diffuse nei corsi d’acqua e nel terreno umido, dove vengono disseminate dalle feci sia degli animali che dell’uomo e dove possono persistere anche per lunghi periodi. Particolarmente pericolosi sono i portatori sani, che diffondono l’infezione inconsapevolmente e possono sfuggire ai controlli. Ne consegue come risulti fondamentale, so- 11 Figura 11.3 Salmonella. Immagine al microscopio elettronico di Salmonella, batterio responsabile di tossinfezioni (fonte: CDC/Janice Carr). prattutto nel settore delle produzioni alimentari e della ristorazione collettiva, la più scrupolosa osservanza delle norme igieniche (in primo luogo il semplice ma frequente lavaggio delle mani) da parte di tutti gli operatori coinvolti a ogni livello del processo produttivo. Le tipiche salmonellosi sono gastroenteriti che si manifestano a breve distanza dall’ingestione dei cibi contaminati e hanno in genere decorso benigno. Una corretta cottura dei cibi elimina ogni problema dal momento che la maggior parte dei ceppi viene inattivata alla temperatura di 60 °C per pochi minuti, mentre la pastorizzazione a 72 °C per 15 s ne provoca la morte. I ceppi più frequentemente responsabili di tossinfezione si sono rivelati S. typhimurium e S. enteritidis, ma numerosi altri stipiti sono coinvolti in episodi di gastroenteriti ed epidemie collettive. Gli alimenti in cui più facilmente si sviluppano le salmonelle sono soprattutto la carne macinata (hamburger e salsicce), le uova, la maionese, i latticini, il pesce, i frutti di mare crudi o poco cotti. Le salmonelle possono essere presenti all’origine in molti alimenti: carni provenienti da animali nutriti con mangimi di carne o pesce contaminati, uova in cui le salmonelle penetrano attraverso il guscio durante la deposizione, frutti di mare. Questi ultimi sono organismi filtratori e, se provengono da acqua contaminata da scarichi fognari, possono concentrare nei loro tessuti elevatissime cariche microbiche assai pericolose, eliminabili esclusivamente con una corretta cottura. Sintomi della tossinfezione sono quelli tipici delle gastroenteriti con nausea, vomito, diarrea con presenza di sangue nelle feci e febbre. 155 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 11 MALATTIE TRASMESSE CON GLI ALIMENTI 11.6 Tifo e paratifo La febbre tifoide, o tifo addominale, è causata da Salmonella typhi, di cui l’uomo è l’unico serbatoio naturale. Si tratta di una malattia sistemica, che cioè coinvolge vari distretti dell’organismo: l’infezione si contrae solitamente con l’ingestione di cibi o bevande contaminate da materiale fecale in cui è presente S. tiphy. Spesso l’infezione è trasmessa da portatori sani che manipolano gli alimenti, sintomo evidente di un’igiene personale e/o ambientale assai carente. La patologia può risultare severa: ha in media un’incubazione di 1 o 2 settimane e si manifesta con febbre alta, splenomegalia, caratteristico esantema addominale a chiazze rosa, infiammazione intestinale con dissenteria e ulcerazioni della mucosa, diffusione ematica della tossina. Le salmonelle ingerite con gli alimenti penetrano nella mucosa intestinale e raggiungono i linfonodi mesenterici da cui, attraverso i vasi linfatici e il dotto toracico, vengono riversate nel sangue. Segue la diffusione in vari organi: fegato, milza, polmoni, midollo osseo. Dal fegato le salmonelle raggiungono la colecisti e con la bile vengono nuovamente riversate nell’intestino. Qui causano emorragie e perforazioni della parete intestinale con conseguente peritonite. Le complicazioni possono essere anche molto gravi. Il paratifo è sostenuto dai ceppi A, B e C di Salmonella paratyphi; è una patologia molto simile al tifo ma di minore gravità. La prevenzione viene attuata mediante vaccinazione, con vaccino costituito da microrganismi uccisi o anche con batteri vivi e attenuati. 11.7 Tossinfezione da Yersinia enterocolitica Yersinia enterocolitica (figura 11.4) è un enterobatterio in grado di sopravvivere e moltiplicarsi negli alimenti anche in ambiente refrigerato a +4 °C a condizione che il pH si mantenga sopra 5,4. È in grado di sopravvivere lungamente nelle acque, mentre nelle carni salate lo sviluppo risulta inibito anche a temperatura ambiente dalla presenza combinata di sale e batteri lattici. I ceppi di Yersinia pericolosi per l’uomo devono la loro azione patogena all’invasività e alla produzione di una enterotossina termoresistente, in grado di resistere per tre ore alla temperatura di 121 °C, collegabile alla tossina ST di E. coli. Tale tossina può essere prodotta in alcuni casi anche da ceppi Figura 11.4 Yersinia enterocolitica. Immagine al microscopio elettronico (© Dennis Kunkel Microscopy, Inc.). non patogeni e provoca una patologia di tipo enterocolitico. La tossinfezione si trasmette per via oro-fecale con l’ingestione di alimenti (soprattutto quelli a base di carne suina) e la successiva eliminazione del batterio con le feci. 11.8 Intossicazione da Clostridium botulinum La neurotossina prodotta da Clostridium botulinum (famiglia Bacillaceae) è la più potente che si conosca, in grado di provocare intossicazioni che spesso hanno esito letale (10 microgrammi possono uccidere un uomo). C. botulinum è un bacillo Gram-positivo sporigeno anaerobio, di cui si conoscono sette tipi sierologici diversi, indicati con le lettere dalla A alla G. Di questi, i tipi A, B, E sono quelli che interessano la patologia umana. Le spore di C. botulinum hanno un’ampia diffusione ambientale (suolo e acque, feci animali, vegetali in decomposizione) e possono contaminare molti alimenti. Sono molto resistenti al calore (vengono eliminate con trattamenti di almeno 15 min a 160 °C di calore secco, 5 h a 100 °C di calore umido, 3 min a 121 °C in autoclave); in particolare la resistenza per 5 h a 100 °C deve far riflettere sui tempi di bollitura da impiegare nella preparazione delle conserve casalinghe o artigianali. È però noto che le spore non possono germinare e le cellule vegetative non elaborano tossina se il pH dell’alimento conservato è inferiore a 4,5 (capitolo 9). Quando trovano condizioni adatte (ambiente anaerobio, pH > 4,5, sufficiente umidità e sostanze nutritive disponibili) le spore di C. botulinum germinano originando le 156 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario MALATTIE TRASMESSE CON GLI ALIMENTI corrispondenti cellule vegetative in grado di elaborare la tossina. Le condizioni per la moltiplicazione vegetativa e la produzione della tossina sono così riassumibili: r anaerobiosi r temperatura compresa fra 3 e 48 °C r sufficiente disponibilità di acqua r pH compreso fra 4,5 e 8,3 r assenza di sostanze ad azione inibente, come NaCl, saccarosio o nitriti ad alte concentrazioni r contaminazione dell’alimento da parte di altri microrganismi (muffe in particolare, caso tipico nelle conserve di pomodoro) in grado di provocare variazioni del pH, inizialmente acido, verso l’alcalinità. Ciò crea le condizioni per lo sviluppo dei clostridi e la produzione di tossina. La tossina botulinica può essere inattivata da un trattamento alla temperatura di 100 °C per 15 min o di 30 °C per 30 min: ne consegue che una corretta cottura dei cibi scongiura ogni pericolo. Responsabili di intossicazione sono più frequentemente cibi insaccati (il nome del batterio deriva dal latino botulus, salsiccia), le conserve di carne e vegetali in scatola, il pesce affumicato, i prodotti lattiero-caseari. Particolarmente pericolose risultano essere le preparazioni artigianali/domestiche, in quanto a livello industriale viene esercitata una vigilanza molto attenta sui parametri che condizionano la sopravvivenza del germe e la produzione della tossina. In ogni caso, la presenza di bolle d’aria e un sapore acido devono far sorgere il sospetto di contaminazione e impongono l’eliminazione del cibo. Si tratta di una tossina neurotropa, che agisce attaccando il sistema nervoso centrale e periferico. Il punto d’azione è costituito dalle giunzioni (sinapsi) neuromuscolari, dove la tossina blocca la liberazione di acetilcolina, mediatore chimico dell’impulso nervoso: sintomi caratteristici dell’intossicazione botulinica sono diplopia (visione doppia), paralisi della faringe e dei muscoli, compresi quelli respiratori come il diaframma (paralisi flaccida). In assenza di intervento terapeutico, che consiste nella somministrazione di anti-tossina, l’esito è spesso infausto. Il periodo di incubazione si aggira fra le 12 e le 36 h. 11 e animali e possono facilmente contaminare gli alimenti. Dall’intestino possono penetrare nelle masse muscolari degli animali (bovini e pollame in particolare) durante le operazioni di macellazione ed eviscerazione. Anche in questo caso, quindi, è sconsigliabile cibarsi di carne cruda o poco cotta. Queste spore resistono infatti alla temperatura di 100 °C per 2 ore e sono stimolate alla germinazione se esposte per 10 min a 80 °C (shock termico). La germinazione delle spore, con il conseguente sviluppo delle cellule vegetative, si verifica a temperature comprese fra 30 e 45 °C, mentre risulta bloccata in ambiente refrigerato a +4 °C. Preparazioni più a rischio sono i prodotti carnei, in particolare le carni “arrotolate” in cui le superfici esterne nella fase di preparazione del prodotto vengono poi portate all’interno della massa dove l’ossigeno è più carente e il calore penetra più lentamente e con difficoltà. La tossinfezione da C. perfringens si manifesta in genere con dolori addominali, febbre, vomito e diarrea, dopo un’incubazione di alcune ore. Esso è uno degli agenti della gangrena gassosa, grave infezione di ferite causata da un complesso di tossine necrotiche tissutali. 11.10 Infezione da Bacillus cereus e altri bacilli Bacillus cereus è un batterio sporigeno aerobio-anaerobio facoltativo ad ampia diffusione ambientale, le cui spore sono inattivate a 100 °C per 30 min, e indotte a germinare se esposte alla temperatura di 60-70 °C per 10 min. Le cellule vegetative che ne derivano si moltiplicano se esposte alla temperatura di 28-35 °C per diverse ore: ne consegue 11.9 Tossinfezione da Clostridium perfringens Le spore di Clostridium perfringens (figura 11.5) si rinvengono nel suolo, nelle acque e nell’intestino di uomo Figura 11.5 Clostridium perfringens. Nell’immagine sono visibili le spore, (fonte: CDC/Don Stalons). 157 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 11 MALATTIE TRASMESSE CON GLI ALIMENTI l’opportunità del consumo immediato degli alimenti possibile fonte di infezione o di una loro sollecita conservazione in frigorifero, in particolare le creme, il latte, la carne cotta, il brodo, il riso bollito o le frittelle di riso. Le tossine prodotte da B. cereus sono essenzialmente quella diarroica e quella emetizzante: la prima provoca forti dolori addominali e diarrea; la seconda nausea e vomito. I sintomi compaiono in entrambi i casi dopo alcune ore. Altre specie del genere Bacillus possono rendersi responsabili di tossinfezioni alimentari con sintomatologia gastroenterica: B. subtilis, B. polimixa, B. megaterium. 11.11 Infezione da Vibrio parahaemolyticus Vibrio parahaemolyticus (famiglia Vibrionaceae) (figura vive in ambiente marino prossimo alla costa e può contaminare pesci, molluschi e crostacei. È un bacillo a virgola aerobio-anaerobio facoltativo, alofilo (resiste a concentrazioni di NaCl dell’11%). Richiede un pH superiore a 6: le carni di tonni e sgombri, che hanno pH inferiori, non hanno mai mostrato contaminazione da parte di tale batterio. È sufficiente trattare gli alimenti a 100 °C per almeno 1 minuto per uccidere il vibrione, per cui l’infezione è spesso la conseguenza del consumo di pesce e frutti di mare crudi. I sintomi sono tipicamente gastroenterici (nausea, vomito, diarrea, febbre) con un’incubazione di circa 15 h. 11.6) 11.12 Colera Il colera è una grave tossinfezione il cui agente eziologico, Vibrio cholerae, è un caratteristico bacillo a virgola che sviluppa a 37 °C e a pH alcalini (prossimi a 8): tale caratteristica viene sfruttata in laboratorio per il suo isolamento selettivo. Antigeni specifici sono quello somatico polisaccaridico O e quello proteico flagellare H. L’antigene O comprende 6 tipi diversi: al tipo O1 appartengono i ceppi Ogawa, Inaba e Hikojima; altro sierogruppo patogeno per l’uomo è l’O139. Sulla base delle diverse combinazioni antigeniche è possibile individuare 140 sierotipi di V. cholerae con due biotipi: classico ed El Tor. I vibrioni, eliminati con le feci da ammalati o portatori, trovano soprattutto nelle acque un ambiente favorevole alla loro riproduzione e, in quanto moderatamente alofili, sopravvivono generalmente anche nell’acqua del Figura 11.6 Vibrio parahaemolyticus. Immagine al microscopio elettronico di Vibrio parahaemolyticus, vibrione responsabile di intossicazione da pesci e frutti di mare crudi (© Dennis Kunkel Microscopy, Inc.). mare. Poiché i vibrioni vengono eliminati dall’esposizione a 100 °C per 1 min, il consumo di pesce e molluschi crudi o appena “scottati” o anche quello di acqua contaminata da scarichi fognari sono le cause prime della diffusione della tossinfezione. I vibrioni assunti con cibo e bevande arrivano all’intestino dove elaborano la tossina colerica: un’enterotossina proteica termolabile che agisce sul sistema enzimatico adenilato-ciclasi. L’enzima induce un’eccessiva produzione di AMP-ciclico, molecola che regola l’equilibrio idrosalino a livello intestinale: l’alterazione che ne consegue provoca una massiccia perdita di liquidi ed elettroliti con diarrea “ad acqua di riso”. Le conseguenze sono molto gravi: massiccia disidratazione, acidosi nel sangue e nei tessuti, collasso cardiocircolatorio che può sfociare, in assenza di opportuna terapia, nel coma e nella morte. Il colera è una malattia endemica in alcuni paesi sottosviluppati, ma può presentarsi in forma sporadica o epidemica dovunque si creino condizioni precarie di igiene per le cause più diverse (conflitti, disastri naturali ecc.). 11.13 Listeriosi Listeria monocytogenes è un corto bacillo Gram-positivo aerobio-anaerobio facoltativo diffuso nell’ambiente e in particolare nelle acque luride, nel suolo, nei vegetali e come ospite saprofita nell’intestino di uomo e animali. Il batterio è stato isolato da molti alimenti di origine animale fra cui il latte, dove può arrivare sia provenendo 158 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario MALATTIE TRASMESSE CON GLI ALIMENTI dalle mammelle di animali con mastite inapparente che per contaminazione secondaria durante la mungitura da portatori sani che ospitano il batterio nell’intestino. Altri alimenti più spesso responsabili di infezione risultano essere formaggi e uova. Il batterio viene comunque ucciso dalla temperatura di pastorizzazione, anche se alcuni Autori riportano per qualche ceppo una certa termoresistenza fino a 75-76 °C. Il periodo di incubazione della listeriosi è variabile da un giorno ad alcune settimane, e si manifesta con meningite ed encefalite. L’infezione può essere trasmessa anche per via transplacentare al feto. 11.14 Brucellosi Le brucellose vengono trasmesse all’uomo attraverso l’ingestione di latte e latticini provenienti da animali infetti (caprini, ovini, suini, bovini). Sono peraltro descritti numerosi casi d’infezione riguardanti personale addetto alla lavorazione delle carni, per cui non si può escludere anche una via transcutanea di penetrazione del germe. Sono inoltre riportati casi di trasmissione da aerosol di colture microbiche di brucelle tra il personale tecnico addetto alle analisi. La malattia prende anche il nome di febbre maltese o ondulante, a indicare sia il luogo dove si verificarono i primi casi e dove fu studiata (Malta) sia una delle sue caratteristiche salienti: la febbre ricorrente. Le brucelle sono coccobacilli Gram-negativi aerobi di piccole dimensioni, difficili da coltivare in laboratorio a causa delle loro complesse esigenze nutrizionali. Le specie patogene per l’uomo sono Brucella melitensis, B. abortus e B. suis, che si differenziano per le diverse combinazioni degli antigeni di superficie M e A, caratteristici di questi batteri. Le brucelle giungono con gli alimenti nell’intestino e di qui passano nel torrente circolatorio (batteriemia) con episodi febbrili intermittenti. I microrganismi si localizzano quindi nel fegato, nella milza e nelle linfoghiandole, di cui provocano necrosi parenchimale. La termoresistenza delle brucelle non è elevata: vengono infatti eliminate dal normale trattamento di pastorizzazione. 11 dei vibrioni (figura 11.7), responsabile di molti episodi di gastroenterite soprattutto in età infantile. Questi batteri vivono come commensali nell’intestino di bovini, ovini, caprini, polli, cani, gatti e uccelli (in particolare uccelli migratori acquatici) e vengono eliminati con le feci. Sono in grado di produrre diverse tossine. Gli alimenti possono venire contaminati nella fase di produzione, trasformazione e conservazione. Campylobacter viene ucciso dalla pastorizzazione, per cui i casi d’infezione sono da far risalire al consumo di carne poco cotta, soprattutto di pollo o di maiale. Anche il latte crudo o non correttamente pastorizzato può diventare veicolo d’infezione. Inoltre cani e gatti possono diffondere l’infezione in ambiente domestico. Il periodo d’incubazione della tossinfezione varia dai 2 ai 10 giorni, i sintomi sono cefalea, dolori addominali, febbre e diarrea con presenza di sangue nelle feci. Solitamente la guarigione avviene in una decina di giorni. 11.16 Micotossicosi Alcune muffe producono sostanze tossiche per l’uomo e gli animali note come micotossine. Muffe e micotossine sono causa di gravi problemi nella produzione e commercializzazione delle granaglie, sia per gli allevatori che le utilizzano per l’alimentazione degli animali dei quali provocano morie, sia per le industrie alimentari che corrono il rischio di produrre alimenti preparati con farine contaminate. Le muffe si sviluppano su substrati in cui sia disponibile una minima quantità di acqua libe- 11.15 Tossinfezione da Campylobacter Campylobacter jejuni è un batterio ricurvo Gram-negativo asporigeno e microaerofilo, il cui aspetto ricorda quello Figura 11.7 Campylobacter jejuni. Immagine al microscopio elettronico del batterio Campylobacter jejuni, commensale dell’intestino di diversi animali e produttore di tossine (fonte: www.wikipedia.it). 159 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 11 MALATTIE TRASMESSE CON GLI ALIMENTI ra (tabella 11.1), con temperature comprese fra i 15 e i 37 °C. Una volta prodotte, non vengono eliminate dalla cottura dei cibi data la loro termoresistenza. L’azione cancerogena, teratogena e mutagena (capitolo 15) delle tossine è documentata per l’uomo e gli animali in seguito all’ingestione di alimenti o mangimi preparati con cereali o farine contaminati, ma anche, nel caso dell’uomo, in seguito a quella di carne proveniente da animali nutriti con mangimi contaminati. Nell’uomo provocano raramente fenomeni di intossicazione acuta, ma mostrano piuttosto tossicità cronica per la tendenza ad accumularsi nel fegato provocando epatite, cirrosi, tumori. Le micotossine più note sono le aflatossine prodotte da Aspergillus flavus, Aspergillus orizae, Aspergillus parasiticus. Aspergillus ochraceus produce ocratossina, Penicillium expansum produce patulina, Fusarium produce fumosine e zearalenone. 11.18 Infezione da Entamoeba histolytica L’amebiasi è un esempio d’infezione alimentare provocata dall’ingestione di bevande e alimenti contaminati dal protozoo Entamoeba histolytica. Questo protozoo si presenta in forma di cellula vegetativa (trofozoite), dotata di movimento attivo e della possibilità di riprodursi, o di cisti (figura 11.8), forma di resistenza analoga alle spore batteriche. Le cisti vengono ingerite con acqua e alimenti; giunte nell’intestino si trasformano in trofozoiti in grado di perforare la mucosa intestinale e di provocare lesioni ulcerative. Cisti e trofozoiti vengono emessi con le feci. L’amebiasi si manifesta con diarrea profusa, perdita di sangue e muco. Se le amebe si localizzano nel fegato possono dare luogo a un ascesso epatico. 11.17 Epatite infettiva (epatite A) L’epatite infettiva (epatite A) è un esempio di infezione di origine alimentare trasmessa attraverso il circuito oro-fecale da un virus (virus HAV, Haepatitis A Virus) che dall’intestino raggiunge il tessuto epatico provocando una necrosi cellulare. Attraverso il sangue il virus può raggiungere altri organi ed è espulso con le feci, cui arriva attraverso la bile. La malattia ha un’incubazione variabile da una decina di giorni a due mesi circa, cui segue ittero (colorazione giallastra della cute e delle sclere). Gli alimenti attraverso cui si può trasmettere l’epatite A sono soprattutto l’acqua, le verdure e i frutti di mare contaminati e consumati crudi: il virus HAV è inattivato dall’ebollizione a 100 °C per 5 min. Figura 11.8 Entamoeba histolytica. L’immagine mostra cisti di Entamoeba histolytica (fonte: CDC/Dr. L.L.A. Moore, Jr.). Tabella 11.1 Esigenze minime di aw di alcune muffe micotossinogene MICRORGANISMO aw minima per la crescita aw minima per la produzione di tossina Aspergillus flavus 0,780 0,840 (aflatossine) Aspergillus ochraceus 0,800 0,850 (ocratossina) Aspergillus parasiticus 0,810 0,850 (aflatossine) Penicillium cyclopium 0,830 0,890 (ocratossina) 160 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario ESERCIZI DI VERIFICA 1. I coliformi sono: A tutti i batteri intestinali B quelli che producono anidride carbonica C quelli che fermentano il lattosio con produzione di anidride carbonica D quelli che non fermentano il lattosio E quelli che non fermentano il lattosio ma producono anidride carbonica 2. La carica microbica infettante è: A il numero di batteri presenti in tutto l’alimento B la carica batterica totale per grammo di alimento C il numero di batteri necessario affinché si scateni un’infezione 3. Le salmonelle sono responsabili di: A infezioni di ferite B infezioni respiratorie C tossinfezioni alimentari 4. I veicoli di infezione sono: A topi B insetti C oggetti 5. Tifo e salmonellosi sono causati: A dallo stesso batterio B da batteri dello stesso genere C da batteri della stessa specie 7. Le salmonelle: A producono endotossine B producono esotossine C non producono tossine 8. Il colera si contrae: A per contatto diretto B ingerendo cibi o bevande contaminati da salmonelle C attraverso il circuito oro-fecale 9. Le salmonelle fanno parte dei coliformi: A vero B falso 10. La virulenza di un microrganismo indica: A la capacità di produrre malattie B il grado di patogenicità C la capacità di essere invasivo 11. La tossina botulinica deve la sua pericolosità al fatto di essere: A termoresistente B termosensibile C non rilevabile in laboratorio 12. La tossina botulinica inibisce: A la contrazione muscolare B il rilassamento dei muscoli C il passaggio dei farmaci antitossina 6. Il tifo è una: A gastroenterite B malattia sistemica (interessa tutto l’organismo) C malattia respiratoria 161 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 12 CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI 12.6 Le carni Il controllo microbiologico degli alimenti ha lo scopo di prevenire la trasmissione di tossinfezioni, infezioni e intossicazioni sostenute da microrganismi patogeni o loro tossine. Poiché la contaminazione microbica può verificarsi in ogni punto della filiera produttiva, dalle materie prime alla loro trasformazione, confezionamento, trasporto e stoccaggio, i controlli devono essere estesi a tutte le fasi. I controlli microbiologici vengono effettuati attraverso la ricerca di microrganismi indicatori per i quali, in base a specifiche normative, viene prescritta la completa assenza o viene tollerata una concentrazione massima ammissibile. 12.7 Conserve e semiconserve in recipienti a chiusura ermetica (prodotti in scatola) 12.1 Tecniche analitiche tradizionali e innovative 12.1 Tecniche analitiche tradizionali e innovative 12.2 Criteri microbiologici 12.3 I piani di campionamento 12.4 Microrganismi indicatori 12.5 Le frodi alimentari 12.8 I salumi 12.9 Latte e derivati 12.10 Yogurt e latti fermentati 12.11 I gelati 12.12 Uova e derivati 12.13 Prodotti della pesca 12.14 Miele 12.15 Paste alimentari Le tecniche analitiche impiegate nei laboratori di controllo sono indicate dalle normative ISO di riferimento. Può trattarsi delle classiche tecniche di indagine microbiologica, ma si fa spesso ricorso a metodi messi a punto dalla ricerca biotecnologica, più rapidi e precisi. Fra questi: r tecniche immunologiche (EIA, ELISA), basate sulla specificità di legame fra anticorpi monoclonali e antigeni microbici r tecniche immunomagnetiche (IMS). Impiegano particelle magnetiche ricoperte di anticorpi specifici per determinati antigeni di batteri oggetto della ricerca. La successiva applicazione di un campo magnetico è in grado di separare e porre in coltura esclusivamente i batteri legati a tali particelle 162 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI 12 a) cDNA cRNA fluorescente Marcatura Ibridazione Scanner Sonde specifiche b) Misurazione del pattern di fluorescenza Figura 12.1 Microarray. a) Schema della tecnica di ibridazione; b) pattern di fluorescenza. r impiego di sonde a DNA o RNA. Individuano sequenze geniche specifiche dei microrganismi ricercati. Queste sonde (DNA o RNA probes) sono assemblate in laboratorio e sono complementari a sequenze polinucleotidiche specifiche (target) dei patogeni ricercati. L’ibridazione sonda/target viene rivelata da reazioni colorimetriche o di chemioluminescenza. Utilizzando un microarray, su di un singolo supporto si possono fissare anche decine di migliaia di sequenze polinucleotidiche con cui cimentare il DNA del microrganismo da identificare (figura 12.1) r tecniche di amplificazione molecolare (PCR). La polymerase chain reaction permette di amplificare una determinata sequenza nucleotidica presente anche in tracce minime. Ottenuta una quantità sufficiente di materiale, si procede con l’identificazione mediante ibridazione con sonde DNA/RNA o con tecniche immunoenzimatiche r tecniche di bioluminescenza: si basano sul dosaggio dell’ATP prodotto dai microrganismi, rivelato dalla reazione fra l’enzima luciferasi e lo specifico substrato (luciferina). La reazione provoca l’emissione di luce con intensità proporzionale alla disponibilità dell’ATP contenuto nelle cellule microbiche vive presenti nel campione r tecniche di impedenzometria: i microrganismi producono metaboliti (in particolare acidi organici) in grado di modificare l’impedenza o conduttanza del substrato in misura proporzionale al loro sviluppo. L’impedenza si può definire come la resistenza opposta al passaggio di una corrente variabile. La conduttanza è il suo reciproco r analisi degli acidi grassi (fatty acid methyl ester: FAME). È basata sulla separazione cromatografica degli esteri metilici degli acidi grassi dei singoli microrganismi (figura 12.2). 163 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 12 CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI Estrazione diretta degli acidi grassi dal campione Metilazione CH3 Gas cromatografia Intensità relativa 10 26 27 25 5 11 6 3 8 2 0 9 1 12 7 14 12 18 13 14 19 21 15 22 16 17 20 23 16 24 29 28 18 20 Tempo di ritenzione (min) Figura 12.2 Schema della tecnica FAME. Queste tecniche affiancano e spesso sostituiscono, laddove possibile, quelle tradizionali basate sull’impiego dei terreni di coltura generici o selettivi e sui test biochimici di identificazione, che rimangono comunque alla base di ogni indagine microbiologica. 12.2 Criteri microbiologici Un programma di controllo microbiologico di prodotti alimentari deve predisporre adeguati piani di campionamento e stabilire criteri microbiologici sulla cui base effettuare opportune indagini di laboratorio. Un criterio microbiologico definisce l’accettabilità di un prodotto o di un processo produttivo, in base all’assenza, alla presenza o al numero di microrganismi e/o in base alla concentrazione delle relative tossine o metaboliti, per unità di massa, volume, area o partita. Per ogni alimento considerato un criterio microbiologico deve individuare: r quali microrganismi possono rappresentare un rischio sanitario r i metodi specifici di analisi r il piano di campionamento r il tipo di campione rappresentativo di un lotto o partita di prodotto r i limiti microbiologici relativi al prodotto e ai microrganismi oggetto di ricerca r il punto della catena produttiva o di trasformazione in cui si applica r le azioni da intraprendere nel caso di mancato rispetto dei limiti. Gli scopi dei criteri microbiologici sono la valutazione della sicurezza igienica di un alimento; il controllo della “buona prassi di fabbricazione”; la valutazione della probabile shelf-life degli alimenti deperibili (tempo per il quale un prodotto può essere commercializzato); il controllo dell’idoneità degli ingredienti impiegati. Il Regolamento CE 2073/2005 (e successive modifiche) stabilisce per le varie categorie di alimenti: r i criteri di sicurezza alimentare: definiscono l’accettabilità di un prodotto o di una partita di prodotti alimentari nei confronti di un potenziale rischio biologico (presenza di patogeni) r i criteri di igiene di processo: definiscono il funzionamento accettabile del processo di produzione. 12.3 I piani di campionamento I campioni scelti per il controllo devono rappresentare un’intera partita produttiva. Elementi fondamentali nel controllo microbiologico degli alimenti sono: r l’unità campionaria: aliquota di prodotto o singola confezione, scelta a caso, su cui effettuare il controllo r il lotto: quantità di un alimento (unità di vendita) prodotte e confezionate in circostanze praticamente identiche r il campione rappresentativo: quello in cui sono mantenute le caratteristiche medie del lotto da cui viene prelevato r il campione casuale: insieme delle unità campionarie selezionate da un lotto. I piani di campionamento devono essere predisposti in base ai criteri microbiologi indicati dalla normativa, allo scopo di stabilire il numero di unità campionarie da analizzare, il numero limite di microrganismi ammessi, il numero di unità in cui i limiti non devono essere superati. Occorre in primo luogo stabilire la “severità” del piano, ossia il numero di unità campionarie da analizzare. Maggiore è il rischio, tanto più severo e rigido deve risultare di conseguenza il piano di campionamento predisposto. Nei piani di campionamento viene stabilito: 164 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI r il numero di campioni da analizzare, cioè le unità campionarie (n) r il numero di unità campionarie sulle quali si può esprimere una tolleranza (c) r il numero limite di microrganismi al di sotto del quale il risultato è soddisfacente (m) r il limite massimo di accettabilità, al di sopra del quale il risultato è insoddisfacente (M). I piani di campionamento possono essere: ❖ a due classi. Il sistema di giudizio in questo caso è di tipo qualitativo (presenza/assenza), rivolto alla ricerca di patogeni (di cui è richiesta la completa assenza) in un certo numero n di unità campionarie. Nella ricerca dei patogeni (per es. salmonelle) il numero di unità campionarie n è consistente (per es. 10 campioni) e si pone c = 0 (tolleranza zero): il microrganismo deve risultare assente in tutti i campioni esaminati ❖ a tre classi. La qualità del prodotto viene apprezzata con criteri quantitativi, si fa cioè riferimento al numero di microrganismi presenti. Un piano a tre classi offre maggiore flessibilità: si presuppone in questo caso che sia accettabile una certa contaminazione da germi saprofiti e il campione viene assegnato a tre diverse classi di qualità, indicate come accettabile, parzialmente accettabile, inaccettabile. Quando è ritenuto importante il numero dei microrganismi, come nella determinazione della carica batterica o nel conteggio dei coliformi, il numero di unità campionarie da esaminare può essere inferiore rispetto a un piano a due classi (n = 5) e il risultato dell’analisi viene rapportato ai seguenti parametri: r un livello al di sotto del quale l’alimento è ritenuto accettabile, espresso come valore m r un livello al di sopra del quale l’alimento è ritenuto inaccettabile, indicato come valore M r un intervallo di tolleranza nel quale l’alimento è ancora accettabile o parzialmente accettabile, quando per un certo numero c di campioni il risultato è compreso fra m e M. 12 alcuni patogeni (per es. salmonelle, Listeria o altri) la cui presenza nell’alimento deve essere esclusa perché indicatori di rischio biologico (sicurezza sanitaria), o a quella di microrganismi indicatori dello stato igienico del prodotto, la cui presenza o la cui concentrazione oltre limiti prestabiliti indica un potenziale pericolo. Questi indicatori sono legati alla scadente qualità igienica del prodotto, ma indicano comunque anche la probabile presenza di patogeni. I microrganismi considerati indicatori devono possedere caratteristiche precise: r essere associati costantemente ed esclusivamente all’identica fonte di provenienza dei patogeni r essere di facile e rapida reperibilità e individuazione con tecniche di laboratorio relativamente semplici e di basso costo r essere agevolmente distinguibili dagli altri microrganismi. Gli indicatori di inquinamento fecale sono quelli di più comune impiego in campo alimentare: r coliformi (bacilli Gram-negativi che fermentano il lattosio con produzione di acido e di gas) r coliformi fecali r E. coli r streptococchi fecali (enterococchi) r clostridi solfito-riduttori. Anche se i coliformi costituiscono tradizionalmente il principale gruppo di microrganismi indicatori, si preferisce impiegare piuttosto E. coli come sicuro indicatore di inquinamento fecale, in quanto costantemente correlato con la presenza della generalità dei patogeni che hanno habitat intestinale. La ricerca specifica di E. coli ha sostituito quella dei coliformi fecali, definiti in origine come i coliformi di più sicura provenienza fecale, in quanto la loro identificazione non si è dimostrata sufficientemente precisa con i terreni selettivi disponibili. 12.5 Le frodi alimentari 12.4 Microrganismi indicatori Il controllo microbiologico può essere rivolto, in base a quanto sopra esposto, all’individuazione specifica di Commette una frode chi, con l’inganno o l’imbroglio, si sottrae a disposizioni di legge o a obblighi contrattuali. In campo alimentare è possibile distinguere frodi sanitarie, che trasformano gli alimenti in sostanze nocive 165 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 12 CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI per la salute pubblica, e frodi commerciali, che procurano un danno economico a chi le subisce, acquistando per esempio un prodotto di poco pregio venduto al posto e al prezzo di uno più pregiato. È opportuno conoscere il significato giuridico di alcuni termini che spesso vengono usati impropriamente: r alterazione: consiste nel degradamento delle caratteristiche organolettiche e nutritive e si verifica generalmente in seguito a una conservazione non corretta r adulterazione: si verifica quando viene modificata la composizione originale di un prodotto alimentare r sofisticazione: consiste nell’aggiungere a un alimento sostanze estranee per migliorarne l’aspetto, mascherandone alcuni difetti. Se il prodotto viene addizionato con sostanze permesse, la sofisticazione consiste nel superare le dosi consentite dalla legge r falsificazione: si verifica quando un alimento viene sostituito totalmente con un altro (olio di semi invece di olio d’oliva, margarina per burro) r contraffazione: consiste nella commercializzazione di un prodotto con indicazioni o marchi che possono trarre in inganno il consumatore (spumante etichettato come champagne). 12.6 Le carni La carne costituisce indubbiamente un’ottima risorsa nutritiva per l’alto contenuto di aminoacidi essenziali, di proteine, di ferro e di vitamine del gruppo B. Dal punto di vista dietetico non va però considerata la migliore oppure l’unica fonte di queste sostanze: altri alimenti (legumi, pesce, uova, latte, latticini) sono sorgenti di proteine altrettanto valide e preziose per un’alimentazione equilibrata. La carne viene definita come l’insieme delle masse muscolari e dei tessuti connessi degli animali da macello come ovini, bovini, suini, equini, caprini; di animali di bassa corte o da cortile (pollame, tacchini, conigli); di selvaggina. Le cosiddette frattaglie comprendono cuore, fegato, milza, reni, polmone, cervello; le animelle sono costituite da pancreas, timo e ghiandole salivari; con il nome di trippa si intendono lo stomaco e il primo tratto dell’intestino dei ruminanti. I muscoli sono costituiti da: tessuto connettivo: forma un sistema di membrane ❖ (epimisio, perimisio, endomisio) che avvolgono i fasci muscolari e che alle due estremità del muscolo formano i tendini ❖ tessuto muscolare: è formato da fasci muscolari a loro volta costituiti da fibrocellule allungate contenenti proteine contrattili (actina e miosina). Sono presenti altre importanti proteine come il collagene e l’elastina (figura 12.3). Nella carne è presente una certa quota di lipidi (8-9%) che formano il grasso muscolare e quello adiposo, concentrato soprattutto nel tessuto sottocutaneo e nella cavità addominale. Sono presenti sali minerali, vitamine, composti di riserva energetica come la fosfocreatina, molti enzimi e la mioglobina, pigmento respiratorio dei muscoli. L’acqua rappresenta il 50-80% del muscolo. Poche ore dopo la macellazione di un animale subentra il rigor mortis o irrigidimento cadaverico, dovuto al succedersi di una serie di eventi biochimici che hanno come causa principale l’esaurirsi delle riserve energetiche di ATP muscolare: l’actina e la miosina si legano formando actomiosina, che fa accorciare e irrigidire i muscoli. In queste condizioni la carne non è ancora adatta al consumo, in quanto deve prima subire un processo di frollatura, che richiede 10-15 giorni, al termine del quale la carne si presenta tenera e pronta al consumo. La frollatura della carne è un processo biochimico-biofisico in cui fenomeni di autolisi, determinati dall’azione combinata di enzimi endocellulari che si liberano dopo la morte cellulare e di microrganismi, causano una parziale degradazione del tessuto connettivo e muscolare. La contaminazione microbica delle carni da macello è una diretta conseguenza delle condizioni di allevamento, dello stato di salute dell’animale al momento della macellazione e naturalmente di quelle di lavorazione, lavaggio (toelettatura) e conservazione delle carcasse. Carni fresche e refrigerate Le carni degli animali in vita sono molto probabilmente sterili, condizione che viene inevitabilmente persa con la macellazione. Le operazioni e le lavorazioni subite dalle carcasse (eviscerazione, scuoiamento ecc.) porta- 166 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 12 CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI Un muscolo scheletrico è costituito da fasci di fibre muscolari. Fasci di fibre muscolari Tendini Tessuto connettivo Muscolo Nuclei Membrana plasmatica Miofibrilla Singola fibra muscolare (cellula) Ogni fibra muscolare è una cellula multinucleata che contiene numerose miofibrille, a loro volta formate da filamenti spessi di miosina e filamenti sottili di actina molto ordinati. Mitocondri Banda M Linea Z Banda I Singola miofibrilla I sarcomeri sono le unità di contrazione. Linea Z Zona H Banda A Singolo sarcomero Filamento di actina Filamento di miosina Titina Figura 12.3 Struttura di un muscolo scheletrico. no a una progressiva contaminazione delle masse muscolari, che comunque non si può ritenere pericolosa. Lo stoccaggio delle carni in ambiente refrigerato (da 0 a +4 °C) blocca in modo considerevole la proliferazione microbica, impedendo lo sviluppo di germi mesofili. Nella carne refrigerata possono accrescersi pressoché esclusivamente germi psicrofili, quali Flavobacterium, Achromobacter, Acinetobacter, Brochothrix thermosphacta, Mycobacterium e diverse specie di Pseudomonas. Il genere Pseudomonas si può ritenere uno fra i maggiori responsabili di alterazione delle carni fresche, anche se il più delle volte si tratta di fenomeni a carico di un’ampia gamma di microrganismi. Nelle carni conservate in blocchi i microrganismi si sviluppano preva167 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 12 CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI I GERMI PSICROFILI Brochothrix thermosfacta è un bacillo Gram-positivo, aerobio/anaerobio facoltativo, asporigeno, ossidasi negativo. È un batterio psicrofilo non patogeno, ma può causare fenomeni degradativi nella carne se in concentrazione elevata. L’isolamento si effettua su STAA agar. Pseudomonas è un bacillo Gram-negativo mobile, aerobio obbligato, ossidasi positivo, asporigeno, ad ampia diffusione ambientale e con un elevato grado di versatilità metabolica. Alcune specie producono pigmenti blu/verdi (piocianiana, pioverdina) e sono frequentemente responsabili di alterazione degli alimenti. Il genere annovera specie patogene opportuniste per l’uomo e altre importanti per la biodegradazione di sostanze inquinanti come i derivati del petrolio. Achromobacter (figura 12.4) è un bacillo Gram-negativo aerobio obbligato, mobile, presente nel suolo e nelle acque. Figura 12.4 Achromobacter. L’immagine mostra il batterio Achromobacter (fonte: CDC/Dr. Rodney M. Donlan). lentemente in superficie, mentre in quelle macinate i germi si sviluppano molto facilmente in tutta la massa e la contaminazione risulta generalmente più elevata. Il confezionamento della carne refrigerata può avvenire utilizzando film plastici permeabili o impermeabili all’ossigeno, per cui si avrà lo sviluppo preferenziale di germi aerobi, anaerobi o facoltativi a seconda dei casi. Se in aerobiosi prevalgono batteri quali Pseudomonas e Brochothrix, in ambiente tendenzialmente anaerobio è prevedibile lo sviluppo di Lactobacillus. Le alterazioni più comuni dovute a germi aerobi consistono nella comparsa di colorazioni anomale e di odori sgradevoli, aspetto viscoso e mucillaginoso della superficie, mentre nel caso di sviluppo di germi prevalentemente anaerobi si hanno fenomeni putrefattivi e di inacidimento (tabella 12.1). Le sostanze prodotte sono generalmente composti solforati volatili, esteri degli acidi acetico e butirrico, ammine. Carni congelate Le caratteristiche organolettiche, di stabilità (per un periodo che non dovrebbe superare i 18 mesi) e di accettabilità (momento in cui il consumatore non giudica più accettabile l’alimento) della carne congelata dipendono essenzialmente, oltre che dalle qualità intrinseche dell’alimento, dalla temperatura raggiunta al momento del trattamento e da quella di conservazione, nonché dalla velocità di penetrazione del freddo. Nel processo di congelazione si raggiungono temperature di −40 °C o anche inferiori, ma la bassa velocità di penetrazione del freddo non riesce a impedire la formazione di grossolani cristalli di ghiaccio che compromettono l’integrità delle membrane cellulari, con una degradazione della qualità della carne rispetto all’alimento fresco. Laddove invece, come nella surgelazione, il freddo viene fatto penetrare molto velocemente (capitolo 9) si raggiungono al massimo temperature di −18 °C, il periodo di conservazione è indubbiamente più breve, ma le caratteristiche organolettiche vengono salvaguardate a tutto vantaggio della qualità dell’alimento, paragonabile a quella del fresco. Ciò è possibile perché i cristalli di ghiaccio che si formano sono di dimensioni molto inferiori e non provocano alterazioni nelle strutture cellulari. Dal punto di vista microbiologico occorre sottolineare come praticamente nessun microrganismo sia in grado di moltiplicarsi a temperature così basse, che letteralmente “congelano” lo stato microbico della carne a livello originario quando si rispettino ininterrottamente le stesse temperature per tutto il periodo di conservazione. In realtà questo non sempre avviene: inconvenienti o malfunzionamenti delle celle frigorifere durante il trasporto espongono la carne a contaminazione da parte di germi psicrofili come lieviti e muffe che spesso si rinvengono all’interno di questi ambienti. Aumenti anche modesti della temperatura accompagnati da un minimo di umidità disponibile possono innescare una più o meno 168 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI 12 Tabella 12.1 Fenomeni alterativi nelle carni O2 MICRORGANISMI ALTERAZIONE Presente Batteri Patina batterica superficiale (stime); colorazioni anomale; odori sgradevoli; decomposizione dei Iipidi Presente Lieviti Patina batterica superficiale; colorazioni anomale; odori sgradevoli; decomposizione dei lipidi Presente Muffe Callosità e ife fungine superficiali; colorazioni anomale; odori sgradevoli; decomposizione dei Iipidi Assente Batteri Putrefazione con produzione di odori sgradevoli e nauseabondi; produzione di gas; irrancidimento Tabella 12.2 Controlli microbiologici consigliati per le carni bovine/ovine TIPOLOGIA: CARNI BOVINE FRESCHE CONFEZIONATE – CARNI OVINE FRESCHE CONFEZIONATE PARAMETRI MICROBIOLOGICI LIMITI VALORI GUIDA FONTE BIBLIOGRAFICA RIFERIMENTI NORMATIVI Carica microbica totale M = 106 m = 105 n=5c=2 Tiecco-1997 ISS 1985 Ordinanza del Ministero della Sanità del 7/12/93 - GU n. 291 del 13/12/93 Escherichia coli M = 102 m = 10 n=5c=2 Tiecco-1997 ISS 1985 Ordinanza del Ministero della Sanità del 7/12/93 - GU n. 291 del 13/12/93 Stafilococco aureo M = 102 m = 10 n=5c=2 Tiecco-1997 ISS 1985 Ordinanza del Ministero della Sanità del 7/12/93 - GU n. 291 del 13/12/93 Anaerobi solfito-riduttori < 5 · 102/g D.P.R. 01/03/92 n. 227 Salmonella spp. Assenza in 25 g n=5c=2 D.P.R. 01/03/92 n. 227 Legge n. 283/62 art. 5 Listeria monocytogenes ≤ 11/g in 1 u.c. ≤ 110/g in 2 u.c. n=3c=2 O.M. 07/12/93 Per i criteri microbiologici in vigore vedi il Reg. CE 2073/2005 (Allegati 1 e 2) e successive modifiche, reperibile come approfondimento on-line. Legenda: M (UFC/g) = valore limite m (UFC/g) = valore guida n (UFC/g) = unità campionarie utilizzate c (UFC/g) = numero delle unità campionarie il cui valore può essere compreso tra m e M u.c. = unità campionarie rapida riproduzione degli psicrofili. Questi microrganismi poi riescono a riprodursi in modo veloce o addirittura tumultuoso al momento dello scongelamento, che non sempre viene fatto in modo corretto. Lo scongelamento infatti dovrebbe avvenire molto lentamente e a bassa temperatura: al contrario processi troppo rapidi portano a perdite della consistenza e del colore caratteristici delle carni. Carne di pollo La qualità microbiologica delle carni di pollame e dei volatili in genere riflette quella delle condizioni di allevamento: poiché infatti la pelle rimane sempre parte integrante dell’alimento fino al momento del consumo, la popolazione microbica superficiale è quella maggiormente responsabile del tipo e dell’entità delle conta169 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 12 CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI Tabella 12.3 Controlli microbiologici consigliati per le carni di pollame TIPOLOGIA: CARNI AVICOLE (prelievo effettuato su massa muscolare) PARAMETRI MICROBIOLOGICI LIMITI VALORI GUIDA FONTE BIBLIOGRAFICA RIFERIMENTI NORMATIVI Carica microbica totale M = 107 m = 106 n=5c=2 Gelosa L in Industrie Alimentari - 1998; Ordinanza del Ministero della Dossier Emilia Romagna, CDS Az. USL Sanità del 7/12/93 - GU n. 291 Città di Bologna e Ravenna “Centri di del 13/12/93 Produzione pasti”, guida per l’applicazione del sistema HACCP Escherichia coli M = 103 m = 102 n=5c=2 Gelosa L in Industrie Alimentari - 1998; Ordinanza del Ministero della Dossier Emilia Romagna, CDS Az. USL Sanità del 7/12/93 - GU n. 291 Città di Bologna e Ravenna “Centri di del 13/12/93 Produzione pasti”, guida per l’applicazione del sistema HACCP Anaerobi solfito-riduttori M = 103 m = 102 n=5c=2 Gelosa L in Industrie Alimentari - 1998; Ordinanza del Ministero della Dossier Emilia Romagna, CDS Az. USL Sanità del 7/12/93 - GU n. 291 Città di Bologna e Ravenna “Centri di del 13/12/93 Produzione pasti”, guida per l’applicazione del sistema HACCP Stafilococco aureo M = 103 m = 102 n=5c=2 Gelosa L in Industrie Alimentari - 1998; Ordinanza del Ministero della Dossier Emilia Romagna, CDS Az. USL Sanità del 7/12/93 - GU n. 291 Città di Bologna e Ravenna “Centri di del 13/12/93 Produzione pasti”, guida per l’applicazione del sistema HACCP Salmonella spp. Assenza in 25 g n=5c=2 Legge n. 283/62 art. 5 Listeria monocytogenes ≤ 11/g in 1 u.c. ≤ 110/g in 2 u.c. n=5c=2 O.M. 07/12/93 Per i criteri microbiologici in vigore vedi il Reg. CE 2073/2005 (Allegati 1 e 2) e successive modifiche, reperibile come approfondimento on-line. minazioni microbiche (tabella 12.3). Le operazioni di eviscerazione e toelettatura delle carcasse possono rappresentare altrettante fonti di contaminazione, soprattutto nei riguardi delle contaminazioni da Salmonella, di cui i polli sono assai spesso veri e propri serbatoi. Pseudomonas e Achromobacter sono i batteri che più spesso si rendono responsabili di alterazioni superficiali come la formazione di mucillagini e viscosità spesso accompagnate dallo sviluppo di odori disgustosi. Tali alterazioni compaiono in genere quando la carica microbica di superficie raggiunge o supera valori di 108 UFC/cm2 di pelle. Lo stoccaggio delle carcasse adeguatamente preparate a una temperatura refrigerata di 2-3 °C permette una conservazione di circa una settimana, prima che si verifichino i primi sintomi di alterazione microbica. Nelle carcasse congelate il rischio è rappresentato soprattutto dall’eventuale sviluppo di muffe. Carni salate Le carni salate comprendono vari prodotti di salumeria, quali i prosciutti (crudi o cotti), la lonza, il capocollo, il bacon. Affinché questi prodotti risultino di buona qualità sia dal punto di vista microbiologico che organolettico occorre che altrettanto buone siano le condizioni della carne all’origine, e che ovviamente non subiscano contaminazioni pericolose durante la lavorazione e la stagionatura. È opportuno perciò l’utilizzo di carni prodotte in modo ottimale, nonché l’impiego di salamoie mantenute a bassa temperatura e il loro periodico, frequente rinnovo (capitolo 9). Il cloruro di sodio e il potassio nitrito (salnitro) sono gli ingredienti delle salamoie, impiegate a secco (per sfregamento superficiale) o per immersione del prodotto in una soluzione di NaCl (10-30%), nitrati e nitriti (< 1%). L’azione del 170 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI sale determina un ambiente osmoticamente sfavorevole alla sopravvivenza dei microrganismi, nitrati e nitriti contribuiscono a mantenere il colore rosso alle carni ed esercitano anch’essi una certa azione antimicrobica. Bassi valori di pH e di aw (intorno a 0,8) rappresentano altri fattori selettivi e di inibizione nei confronti di molti microrganismi: i batteri alofili quali stafilococchi, micrococchi e vibrioni generalmente sono gli unici che sopravvivono nelle salamoie. I principali fenomeni alterativi cui sono soggette le carni salate vanno da odori e colorazioni anormali all’irrancidimento (formazione di grasso giallastro nei prosciutti) alla putrefazione, che rappresenta il fenomeno più grave (souring o putrefazione acre-mefitica) dovuto allo sviluppo di germi proteolitici. Vibrio, Alcaligenes, Proteus, Clostridium, Bacillus sono i batteri più frequentemente responsabili di tale alterazione. Il prosciutto crudo può essere contaminato da clostridi quando la carne non viene mantenuta a temperatura refrigerata prima della salatura. 12.7 Conserve e semiconserve in recipienti a chiusura ermetica (prodotti in scatola) Dal punto di vista merceologico sono definiti conserve (figura 12.5) i prodotti di origine animale, vegetale o misti che vengono sigillati ermeticamente in contenitori e quindi sottoposti a trattamento termico che inattiva i microrganismi e blocca le attività enzimatiche. Dal punto di vista microbiologico è corretto distinguere (capitolo 9): ❖ semiconserve: prodotti in contenitore sigillato a trattamento termico moderato (70-80 °C o comunque inferiore ai 100 °C) che non uccide tutti i microrganismi, ma elimina soprattutto i patogeni. Questi prodotti si conservano per alcuni mesi in quanto la presenza del contenitore evita il contatto con l’aria e la possibilità di contaminazioni, ma anche per l’azione di additivi, per l’acidità del prodotto, per l’impiego di basse temperature di conservazione o per l’insieme di tutti questi fattori ❖ conserve: prodotti in contenitore sigillato sottoposti a trattamento termico effettuato a temperatura elevata, superiore a 100 °C. La sterilizzazione (121 °C/15-20 min) elimina tutti i microrganismi comprese le spore. La conservabilità in questo caso 12 Figura 12.5 Semiconserve. L’immagine mostra diversi tipi di semiconserve (fonte: Shutterstock images, LLC). si prolunga per anni ed è garantita dall’integrità del contenitore che impedisce la ricontaminazione. In realtà il significato stesso da attribuire al concetto di trattamento di sterilizzazione genera spesso in ambito merceologico-alimentare una certa confusione. Occorre precisare che per le conserve alimentari molto spesso la sterilità è intesa in senso merceologico o commerciale e non microbiologico, anche se una tale distinzione non appare concettualmente corretta e coerente. È d’altra parte intuitivo rendersi conto che i trattamenti termici molto energici e relativamente lunghi propri della sterilizzazione portano a una degradazione delle qualità nutritive e delle caratteristiche organolettiche del prodotto, di entità variabile in relazione alla composizione e alla natura del prodotto stesso. Il concetto di sterilità commerciale accetta quindi la presenza di spore nell’alimento in scatola, a condizione che queste non siano in grado di germinare, producendo le corrispondenti cellule vegetative che possono elaborare tossine e causare intossicazioni o tossinfezioni. I prodotti alimentari in contenitore sigillato (conserve e semiconserve) devono quindi risultare stabili nel tempo previsto di conservazione: in altre parole non devono manifestare fenomeni di alterazione durante il periodo di commercializzazione se conservati nelle normali condizioni. Il pH del prodotto è un parametro di fondamentale importanza sotto il profilo igienico-sanitario e della conservabilità, al fine di evitare gravi rischi biologici. Per questo le conserve acide (pH < 4,5) sono sicure anche se non subiscono trattamenti termici energici superiori ai 100 °C. Le spore di Clostridium botulinum non germi171 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 12 CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI nano e non viene prodotta tossina se il pH dell’alimento è inferiore a 4,5. La presenza di sale, di nitriti e nitrati, nonché di bassi valori di aw contribuiscono a diminuire la termoresistenza dei microrganismi. I controlli di stabilità delle conserve vengono eseguiti su un certo numero di campioni incubati a temperature adatte a permettere lo sviluppo dei germi eventualmente sopravvissuti al trattamento termico. Più precisamente si incubano le confezioni in termostato a 30-32 °C per 20-30 giorni (germi mesofili) e a 55 °C per 7-10 giorni (germi termofili). Durante l’incubazione i germi eventualmente presenti sviluppano, causando il più delle volte rigonfiamenti e bombaggi nelle scatole. Al termine dell’incubazione si valutano: r modificazioni del contenitore r alterazioni delle caratteristiche organolettiche del prodotto e, nel caso della carne in scatola, liquefazione irreversibile della gelatina r variazioni del pH. I controlli di stabilità delle semiconserve vengono condotti dopo incubazione a 30 °C per 4-5 giorni. La stabilità di questi prodotti è garantita in buona misura, oltre che dal trattamento termico, anche dall’aggiunta di additivi e dalla temperatura di refrigerazione prevista per la conservazione. In entrambi i casi è consigliabile procedere anche a indagini microbiologiche per l’isolamento e l’identificazione dei microrganismi eventualmente presenti. Carni in scatola Nel nostro Paese la produzione di carne in scatola risale al 1881 ad opera di P. Sada, un cuoco che, riprendendo le esperienze del francese Appert, sterilizzava la carne inscatolata in soluzioni saline a 100-115 °C. L’industria della carne in scatola nacque nel 1926, anno di fondazione della Simmenthal (dal nome della razza svizzera di bovini da cui venivano ottenute le carni) ad opera di uno dei suoi figli. La preparazione della carne in scatola prevede il taglio delle carni, la loro precottura, l’eliminazione di buona parte del grasso e l’inscatolamento insieme con la gelatina del brodo di cottura. Si procede poi alla chiusura ermetica, alla sterilizzazione, al raffreddamento e all’etichettatura. Nella carne in scatola sono ammessi diversi additivi: nitrati e nitriti per mantenere il colore rosso, antiossidanti, addensanti e gelificanti (agar-agar), glutammato di sodio come esaltatore di sapidità (capitolo 9). La conservazione della carne in scatola è garantita dalla sterilizzazione con temperature e tempi variabili a seconda delle dimensioni del prodotto e delle scelte operative del produttore, con un trattamento minimo di 121,1 °C per 3 min. 12.8 I salumi I prodotti che corrispondono alla definizione di salumi sono molteplici e comprendono: r insaccati freschi: salsicce r insaccati stagionati: salami e cotechini r insaccati cotti: mortadella, würstel, zampone r non insaccati: prosciutto, bresaola, pancetta. Gli insaccati sono costituiti da due componenti: r l’impasto, preparato prevalentemente con carni suine (a cui si possono aggiungere percentuali diverse di carni bovine, equine, di bufalo, pecora o capra), addizionato di condimenti (droghe o spezie: pepe, chiodi di garofano, noce moscata, cannella, paprica) e additivi (polifosfati, coloranti, saccarosio, polvere di latte, glutammato, acido ascorbico) r un involucro naturale o artificiale. Gli involucri naturali sono costituiti da porzioni di intestino (“budelli”) o altre membrane dei visceri di suino e bovino accuratamente lavate e preparate, quelli artificiali sono generalmente di origine vegetale (derivati della cellulosa) o da film plastico. Dalle caratteristiche igieniche e di qualità dell’involucro dipende in larga misura la qualità dell’insaccato. Le caratteristiche microbiologiche degli insaccati freschi riflettono quelle delle materie prime con cui sono preparati, dell’ambiente di lavoro, degli utensili impiegati, dell’igiene degli operatori: le manipolazioni che subisce l’impasto sono ottime occasioni di contaminazione. I microrganismi presenti in questi prodotti sono soprattutto coliformi, micrococchi, Pseudomonas, clostridi, lieviti e muffe, che possono raggiungere cariche microbiche fino a 108 UFC/g o superiori (tabella 12.4). D’altra parte gli insaccati freschi devono essere consumati cotti, per cui i rischi per il consumatore dovrebbero essere 172 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI 12 PREPARAZIONE DEGLI INSACCATI I salami vengono distinti in molte tipologie merceologiche in base alla composizione dell’impasto. Milano (carne suina, bovina e lardo); Fabriano (carne suina, bovina, lardo a cubetti, pesto); Felino (solo carne e grasso di suino); Napoletano (suino, bovino, grasso suino, aglio, pepe, vino); Cacciatorino (impasto da salame non specificato, carne equina). I salami vengono definiti prodotti fermentati ad opera di colture starter di microrganismi (D.M. 28/12/94) a concentrazione massima di 107 UFC/g di prodotto per evitare sovramaturazione. Sono ammesse colture di Lactobacillus, Pediococcus, Micrococcus, Debaryomyces, stafilococchi coagulasi negativi. Dopo l’insacco possono venire distribuite sui budelli colture starter di Penicillium. Il cotechino viene confezionato con carne suina, grasso, cotenna, lardo, pesto. Per tutte le tipologie la stagionatura è di alcuni mesi (2-10). Figura 12.6 Mortadella (fonte: www.wikipedia.com). Lo zampone è preparato con carne suina, cotenna lessata, grasso suino. I würstel contengono carne bovina e grasso suino salvo diversa indicazione. La mortadella (figura 12.6) è preparata con carne mista (suino, equino, bovino), polvere di latte, albumina, gelatina, vino bianco, pepe, aromi. Tabella 12.4 Controlli microbiologici consigliati per gli insaccati Alimento Prodotti salati, crudi e interi (prosciutto, pancetta, bresaola ecc.) Prodotti crudi affettati Prodotti cotti interi (salame e salamelle, spalla, mortadella, lingua salmistrata ecc.) Prodotti cotti affettati Prosciutto cotto intero Prosciutto cotto affettato Salami Salsiccia di maiale, cotechino ecc. 300 000 1 000 1 000 Microrganismi Salmonella anaerobi solfi- /25 g to-riduttori/g 100 25 Assente 1 000 000 1 000 1 000 100 25 Assente 30 000 100 100 100 25 Assente 500 000 100 100 100 25 10 000 100 50 50 5 Assente 10 000 3 000 000 Batteri lattici 30 000 000 Batteri lattici e micrococchi 1 000 000 1 000 50 50 5 Assente 1 000 100 100 25 Assente 10 000 10 000 1 000 100 Assente Microrganismi aerobi/g Coliformi/g Streptococchi fecali/g Staphylococcus aureus/g 173 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 12 CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI minimi. Negli insaccati stagionati il periodo di stagionatura serve a “maturare” quei prodotti che non vanno consumati freschi: l’alimento subisce in questo modo importanti modificazioni di carattere fisico, biochimico e microbiologico. Il pH si stabilizza su valori acidi (5,5) anche per l’aggiunta di microrganismi starter come i lattobacilli, ma l’evento più importante è la modificazione della flora microbica. Gli enterobatteri praticamente scompaiono dopo una decina di giorni, così come molti altri Gram-negativi; le forme vegetative degli sporigeni diminuiscono notevolmente, mentre le loro spore non riescono a germinare; micrococchi e lattobacilli aumentano in modo considerevole e questi ultimi determinano il progressivo abbassamento del pH; le muffe non si rinvengono nell’impasto. Lattobacilli e micrococchi rappresentano quindi la componente microbica preponderante degli insaccati al termine del periodo di stagionatura: le particolari caratteristiche organolettiche degli insaccati stagionati e pronti al consumo si devono alla loro azione di selezione e d’inibizione nei confronti degli altri microrganismi. Tale selezione si realizza attraverso la creazione e il mantenimento di bassi valori di pH e una rapida fermentazione degli zuccheri presenti, oltre a un insieme di altre complesse modificazioni che si succedono nell’impasto. Salumi non insaccati Il prosciutto crudo stagionato rappresenta indubbiamente un prodotto di salumeria di alto valore nutritivo (28 g di proteine/100 g di prodotto). Viene prodotto con le cosce del maiale sottoposte a toelettatura, asportazione del grasso superfluo e salagione con massaggiamento in superficie con sale grosso (addizionato di pepe e nitrati all’1%). L’operazione viene ripetuta più volte a distanza di qualche giorno. Dopo la sosta di un mese in celle frigorifere a 1-4 °C, i prosciutti vengono lavati in acqua calda e posti a stagionare per 1014 mesi in ambienti ben aerati. Durante il periodo di stagionatura si verificano modificazioni biochimiche e microbiologiche dovute soprattutto ai batteri lattici e alla patina di muffa bianca che si sviluppa in superficie, che conferiscono al prodotto le tipiche caratteristiche organolettiche. La bresaola è un salume prodotto con carne di manzo salata e stagionata che viene consumata cruda. 12.9 Latte e derivati Latte e latticini rappresentano una fonte alimentare molto importante per i principi nutritivi che apportano alla dieta. La produzione di latte, yogurt e altri probiotici, quella dei formaggi, della ricotta, del burro e della panna, dei gelati hanno enorme rilevanza anche sul piano economico. Il latte La definizione merceologica del latte è la seguente: “prodotto integrale della mungitura totale e ininterrotta di una femmina lattifera sana, ben nutrita e non affaticata. In assenza di altre specificazioni per latte deve intendersi il latte di vacca”. Il latte può essere di vacca, pecora, capra, bufala; nel mondo viene utilizzato anche latte di cavalla, renna, cammella e altre specie animali. Il latte contiene, oltre all’acqua, glucidi, protidi, lipidi, vitamine, sali minerali. Gli zuccheri, rappresentati dal disaccaride lattosio (glucosio e galattosio) si trovano in soluzione acquosa con sali minerali e vitamine; le proteine (caseina, lattoalbumina e lattoglobulina) sono allo stato colloidale, i lipidi sono emulsionati. Il residuo secco del latte, che si ottiene dopo aver rimosso l’acqua, è composto da glucidi per il 4,8%, da proteine per il 3,3%, da lipidi per il 3,8% e da sali minerali per lo 0,2%. Fra le proteine, la caseina assume importanza fondamentale per la produzione dei formaggi (figura 12.7): viene infatti fatta coagulare per azione del “caglio”, un complesso enzimatico tradizionalmente estratto dallo stomaco di vitelli lattanti, ma oggi ottenuto da ceppi batterici geneticamente modificati. La cagliata viene poi trasformata nei tanti tipi diversi di formaggio con l’innesto di microrganismi selezionati (fermenti lattici e/o muffe) e in seguito a una più o meno lunga stagionatura in ambienti dedicati. Dalla cagliata si libera il siero o latticello, fonte di proteine e da cui si può ottenere per acidificazione la ricotta. Importante anche dal punto di vista dei controlli analitici è la presenza di enzimi, in particolare la perossidasi e la fosfatasi, la cui determinazione viene effettuata per il controllo dei trattamenti termici cui viene sottoposto il latte crudo, e la reduttasi per un rapido controllo della carica microbica: 174 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI r la fosfatasi, un enzima che agisce nella scissione catalitica di esteri fosforici, è normalmente presente nel latte crudo. Viene inattivata alla temperatura di 72 °C, corrispondente a quella di pastorizzazione, per cui deve risultare assente nel latte pastorizzato r la perossidasi catalizza la riduzione di perossidi e viene inattivata da temperature superiori a 79 °C. Assume importanza fondamentale a garanzia di un trattamento di pastorizzazione corretto, cioè non effettuato ad alta temperatura: deve essere presente nel latte pastorizzato; il latte “fresco” deve risultare positivo al test della perossidasi e negativo a quello della fosfatasi r la reduttasi è un enzima legato all’attività metabolica dei microrganismi presenti nel latte, che consumano ossigeno e producono sostanze riducenti: quanto maggiore è il contenuto microbico di un campione, tanto più rapida è la decolorazione di uno specifico indicatore redox (blu di metilene o resazurina). Tempi di riduzione inferiori alle 2 h indicano una qualità microbiologica inaccettabile del prodotto. Il lattosio è lo zucchero principale del latte. Costituito da glucosio e galattosio, questo disaccaride viene sintetizzato nella mammella a partire dal glucosio ematico. L’intestino umano non può utilizzare direttamente gli zuccheri complessi, che devono essere preventivamente scissi nei monosaccaridi componenti. In molti adulti il complesso di enzimi che assolvono a questa funzione (indicato complessivamente come “lattasi”) non viene sintetizzato o viene sintetizzato in quantità insufficiente. Questi soggetti presentano quindi un’intolleranza al latte, la cui ingestione provoca notevoli disturbi intestinali (meteorismo e dissenteria). Poiché si tratta di un enzima inducibile, la cui sintesi avviene esclusivamente in presenza del substrato da degradare (in questo caso il lattosio), l’intolleranza può essere la conseguenza di una protratta disassuefazione al consumo di latte. In questi casi si può utilizzare latte delattosato (in cui la scissione del disaccaride è compiuta artificialmente) o anche yogurt e prodotti analoghi, in cui gran parte del lattosio è stato fermentato e trasformato in acido lattico dai microrganismi di fermentazione. I lipidi presenti nel latte sono essenzialmente gliceridi, fosfolipidi e colesterolo, che si trovano in emulsione ma che tendono spontaneamente ad affiorare formando uno strato superficiale di panna o crema. Nel processo di 12 Figura 12.7 Cagliatura del latte (fonte: www.wikipedia.com). omogeneizzazione, cui viene normalmente sottoposto il latte, i globuli di grasso vengono frammentati e le loro ridotte dimensioni ne impediscono l’affioramento. Il latte è un alimento pressoché completo, ricco di vitamine (A, B12, tiamina, riboflavina, acido pantotenico), calcio, fosforo e potassio, ma risulta carente di ferro e rame, elementi che il feto accumula durante la vita intrauterina e le cui riserve sono sufficienti per i primi 6 mesi circa di vita, dopodiché devono essere apportati dalla normale alimentazione. È interessante notare come le femmine di ogni specie di mammiferi producano un latte adatto alle caratteristiche della propria prole: l’uomo è l’unica specie che si nutre anche del latte di specie diverse. Nel latte crudo sono presenti anche cellule di provenienza ematica, soprattutto linfociti e granulociti, in concentrazione mediamente di 300 000-500 000/mL di latte. Una bassa concentrazione di cellule depone a favore di tecniche di allevamento e mungitura condotte con un elevato standard igienico e di corretta conservazione del latte alla stalla (uno dei criteri per definire il latte “di alta qualità”). Aspetti microbiologici Il latte rappresenta un ottimo terreno di coltura per molti microrganismi: lasciato a sé, va incontro a una mas175 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 12 CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI siccia proliferazione microbica che in un paio di giorni lo rende inutilizzabile. Il latte possiede una certa attività antibatterica naturale, dovuta alla presenza di sostanze che agiscono esclusivamente nelle ore immediatamente successive alla mungitura, ma esauriscono la loro attività dopo qualche ora. Tali sostanze sono: r lactenine 1 e 2, batteriostatici che agiscono contro streptococchi e lattobacilli r agglutinine, anticorpi presenti nel colostro: oltre che nei confronti di streptococchi e lattobacilli hanno una discreta attività anche contro i coliformi r lisozima, enzima ad ampio spettro batteriostatico r sostanze inibitrici diverse, attive verso germi sporigeni anaerobi. I microrganismi che si possono rinvenire nel latte hanno varia provenienza: r dalla mammella delle femmine lattifere in seguito a patologie specifiche (mastiti) sostenute in massima parte da streptococchi dei gruppi A, C e D: Streptococcus agalactiae, S. mastidis e S. uberis, o anche S. pyogenes. Anche E. coli e altri coliformi sono frequentemente agenti di mastite r germi di provenienza esterna che entrano nei dotti galattofori dall’ambiente d’allevamento o da operazioni di mungitura igienicamente scorrette. In un simile contesto appaiono di estrema importanza sia le condizioni igieniche d’allevamento che l’immediata refrigerazione del latte dopo la sua mungitura: alla stalla, durante il trasporto e allo stabilimento di lavorazione deve essere mantenuto a +4 °C. Il latte che viene raccolto nei vari luoghi di produzione e da qui inviato agli stabilimenti per essere trasformato in latte pronto al consumo presenta dunque una certa carica microbica in relazione ai fattori sopra ricordati, nel cui ambito è possibile distinguere: r microrganismi psicrofili: indesiderabili, appartenenti alle famiglie Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae e ai generi Alcaligenes, Achromobacter, Flavobacterium. Vi sono comprese specie proteolitiche, aerobie e anaerobie, sporigene o meno, e specie lipolitiche (tabella 12.5) r microrganismi acidificanti: fermenti lattici (Lactobacillus, Streptococcus, Pediococcus, Streptobacillus) e propionici. Questi germi acidificanti hanno una valenza positiva poiché, sviluppando acidità dalla Tabella 12.5 Microrganismi psicrofili nel latte GENERE MICRORGANISMI Enterobacteriaceae Escherichia, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter (cloacae, aerogenes, liquefaciens), Hafnia, Serratia, Proteus, Erwinia Pseudomonadaceae Pseudomonas (fluorescens, aeruginosa, putida, putrefaciens), Aeromonas Achromobacteriaceae Alcaligenes, Achromobacter Flavobacteriurn fermentazione degli zuccheri inibiscono lo sviluppo di altri germi dannosi, in particolare quelli proteolitici del gruppo Coli-Aerogenes e di quelli butirrici che producono acido butirrico, acetico, idrogeno e anidride carbonica. I batteri propionici (Propionibacterium jensenii, P. thoenii, P. acidipropionici) sono indispensabili nella produzione e maturazione di formaggi particolari come l’emmenthal, in cui sono responsabili della caratteristica “occhiatura” e del particolare sapore dovuto alla produzione di prodotti secondari della loro attività metabolica: aldeide acetica e propionica, alcol etilico e propilico r lieviti e muffe si sviluppano piuttosto lentamente nel latte: alcuni generi sono impiegati per la preparazione di formaggi e latti fermentati come il kefir, uno yogurt leggermente alcolico. I trattamenti che il latte subisce prima di essere immesso al consumo ne modificano lo stato fisico e ne garantiscono il risananamento microbiologico. Con la filtrazione viene eliminato il sudiciume, con la centrifugazione vengono dissolti gli ammassi microbici, l’omogeneizzazione rende più piccoli e uniformi i globuli lipidici, conferendo al latte una maggiore digeribilità. La sanitizzazione del latte si effettua con la pastorizzazione o la sterilizzazione. Le malattie che più frequentemente sono trasmesse attraverso l’ingestione di latte (e latticini) contaminati e non pastorizzati sono: r intossicazioni da tossina stafilococcica, a brevissimo tempo d’incubazione (6 h) 176 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI TRATTAMENTI TERMICI DEL LATTE I trattamenti termici che può subire il latte al fine di garantirne la sicurezza al consumo sono la pastorizzazione e la sterilizzazione. Si distinguono secondo le vigenti normative 5 tipologie di latte pastorizzato: r fresco pastorizzato di alta qualità r fresco pastorizzato r pastorizzato microfiltrato r pastorizzato r pastorizzato a temperatura elevata. Per legge (Legge n. 169/89) il latte fresco pastorizzato è quello che ha subìto un unico trattamento di pastorizzazione a bassa temperatura (72 °C/15 s), confezionato entro 48 dalla mungitura, con fosfatasi negativa e perossidasi positiva. Può essere intero o scremato, con un contenuto in sieroproteine solubili non denaturate non inferiore al 14% delle proteine totali. Quello fresco di alta qualità è solamente intero con un superiore contenuto proteico (in sieroproteine solubili non denaturate non inferiori al 15,5% delle proteine totali) e con caratteristiche microbiologiche particolari (alla stalla CM < 100 000 UFC/mL); allo stabilimento CM < r gastroenteriti da enterobatteri (salmonellosi, shigellosi ecc.) r tossinfezioni da Clostridium perfringens r infezioni da Pseudomonas r infezioni da micobatteri (micobatteri tubercolari) r brucellosi. Infezioni, tossinfezioni e intossicazioni alimentari sono trattate nel capitolo 11. La crema o panna di latte La panna si ottiene per centrifugazione o per un processo di affioramento naturale, lasciando a riposo il latte intero e attendendo che i globuli di grasso risalgano in superficie. L’affioramento spontaneo richiede in media 15 h alla temperatura di circa 15 °C e da questo si ottiene panna acida con il 20% circa di grasso. La centrifugazione, con cui si ottiene la panna “dolce” perché il latte non fa in tempo ad acidificare, rende più veloce e completo 12 300 000 UFC/mL). Può quindi subire una pastorizzazione più blanda (circa 2 °C inferiore a quella standard) ma comunque igienicamente sicura. Prima di essere pastorizzato il latte può subire anche una microfiltrazione su membrane filtranti in ceramica con pori di diametro pari a 1-2 μ. Il latte pastorizzato a temperatura elevata non si può definire fresco perché può subire due trattamenti di pastorizzazione a 72 °C oppure uno solo a temperature comprese fra 80 °C e 135 °C per un tempo molto breve (per es. 121 °C per 2-4 s oppure 135 °C per 1 s) con inattivazione della perossidasi, quindi confezionato asetticamente in contenitori. La conservazione si prolunga fino a 15 giorni in ambiente refrigerato. Latte trattato ad alta temperatura Latte “a lunga conservazione”: il trattamento UHT (uperizzazione) prevede temperature di 140/150 °C mantenute per 1 o 2 s. Il prodotto si conserva chiuso nella propria confezione per 180 giorni a temperatura ambiente; una volta aperta la confezione, il latte va mantenuto in frigorifero e consumato entro qualche giorno. Latte sterilizzato a 121 per 15 min: si conserva fino a 6 mesi anche a temperatura ambiente. il processo. La panna si può ottenere anche dal siero di latte residuato dalla caseificazione. Viene pastorizzata come il latte previa una sua disacidificazione e può essere consumata direttamente, utilizzata per produrre formaggi come il mascarpone o in pasticceria come panna montata, oppure per produrre il burro. Il controllo microbiologico della crema di latte prevede l’esclusione della presenza di E. coli. Un controllo più completo può essere effettuato con la determinazione della carica microbica totale, la ricerca e il conteggio dei coliformi, l’esecuzione del test al blu di metilene (reduttasi) dopo incubazione a 20 °C per 17 h. Il burro Il burro viene prodotto partendo dalla crema di latte o panna dopo la sua pastorizzazione per eliminare batteri patogeni eventualmente presenti. Si ottiene il burro di panna dolce dalla lavorazione della panna come tale, oppure la si può far acidificare naturalmente o con l’in177 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 12 CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI nesto di microrganismi selezionati dei generi Leuconostoc e Streptococcus. La panna così “maturata” conferisce al burro qualità organolettiche migliori e una più lunga conservabilità. Per diventare burro la panna subisce un’operazione di zangolatura, consistente in un vigoroso e prolungato sbattimento che ha come conseguenza la coalescenza dei globuli di grasso in agglomerati, con l’interposizione di vacuoli che contengono acqua, lattosio e sali minerali. Il successivo impasto di questi granuli forma una massa compatta e omogenea, cioè il burro. Nel burro i microrganismi non riescono ad accrescersi facilmente e le alterazioni cui può andare incontro il prodotto sono prevalentemente di natura chimica (irrancidimento). Dalla burrificazione della crema di latte residua il latticello, che viene utilizzato nell’alimentazione dei polli e dei maiali. Il controllo microbiologico del burro (tabella 12.6) prevede la determinazione della carica batterica totale, la ricerca dei coliformi, di Listeria monocytogenes, degli stafilococchi patogeni e delle salmonelle. Questi batteri devono risultare assenti. Possono essere ricercati anche microrganismi alterativi come i batteri proteolitici e lipolitici. I formaggi Il formaggio è il prodotto della maturazione della cagliata, ottenuta per azione enzimatica o acida. Per la produzione dei formaggi viene impiegato latte di vacca, pecora, capra, bufala o misto: dalla qualità intrin- seca del latte e dalla sua provenienza, oltre che dalle tecniche di preparazione e stagionatura, dipendono le caratteristiche finali del prodotto. Si può impiegare latte intero, a cui può essere aggiunta anche una certa percentuale di panna, oppure completamente o parzialmente scremato. I formaggi da consumare freschi richiedono la preventiva pastorizzazione del latte, mentre per quelli a lunga maturazione le modificazioni che intervengono durante la stagionatura garantiscono l’eliminazione dei patogeni eventualmente presenti, a condizione di rispettare le norme di igiene e di buona prassi di produzione. La caseina, principale proteina del latte, viene fatta precipitare con l’aggiunta del caglio o presame, complesso multienzimatico (rennina, pepsina ecc.) estratto dall’abomaso di vitelli lattanti, agnelli o capretti. Oggi si impiegano enzimi di origine microbica, ottenuti da ceppi batterici geneticamente modificati. La caseina precipita assumendo in ambiente acido una consistenza gelatinosa, la cagliata (paracaseinato di calcio), da cui si separa una parte liquida (il siero di latte). La caseificazione viene effettuata in caldaie di grandi dimensioni, dove la cagliata forma un ammasso consistente ed elastico. La cagliata può essere cotta o meno, quindi subisce una salatura, l’eventuale innesto di microrganismi selezionati e una stagionatura per periodi diversi che portano alla produzione del formaggio maturo e pronto al consumo. Durante la stagionatura l’impasto subisce trasformazioni ad opera di enzimi e di microrganismi che ne modificano aspetto, consistenza, odore, sapore e aro- Tabella 12.6 Controlli microbiologici consigliati per il burro TIPOLOGIA: BURRO PARAMETRI MICROBIOLOGICI LIMITI VALORI GUIDA RIFERIMENTI NORMATIVI Coliformi M = 10 m=0 n=5c=2 D.P.R. 14/01/1997 n. 54 Stafilococco aureo < 102/g Allegato al titolo IV del Reg. Loc. Ig. BURL 15/05/1993 Muffe < 102/g Allegato al titolo IV del Reg. Loc. Ig. BURL 15/05/1993 Listeria monocytogenes Assenza in 1 g D.P.R. 14/01/1997 n. 54 Salmonella spp. Assenza in 25 g n=5c=0 D.P.R. 14/01/1997 n. 54 178 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI 12 ma, conferendo a ogni formaggio i caratteri tipici che lo contraddistinguono. La produzione di acido lattico ad opera di fermenti lattici modifica il pH rendendolo inadatto allo sviluppo di batteri putrefattivi e rende contemporaneamente la pasta più elastica e compatta. In formaggi particolari come il groviera e l’emmenthal l’azione di batteri propionici è all’origine della tipica occhiatura della pasta per sviluppo di CO2. Fenomeni di degradazione proteica e lipidica portano allo sviluppo dei composti responsabili del gusto e dell’aroma del prodotto maturo (aminoacidi, chetoacidi, acidi grassi a corta catena). Si distinguono formaggi: r freschi (crescenza, taleggio) a breve maturazione e con alto contenuto di acqua; a media o lunga stagionatura r crudi, cotti o semicotti (grana) a basso contenuto in acqua e lunga stagionatura r a pasta filata (mozzarella, caciocavallo, scamorza, provolone), preparati con la “filatura” della cagliata, particolarmente elastica, in acqua calda (75-90 °C) r fusi, ottenuti dalla fusione di altri formaggi in caldaia sottovuoto a 70-75 °C. sono naturalmente più a rischio di quelli stagionati, nei quali il periodo di maturazione porta a una selezione microbica che tende a eliminare le specie patogene. In formaggi a pasta molle come le mozzarelle (formaggio cotto a pasta filata) e nei tanti formaggi crudi si possono rinvenire enterobatteri, micobatteri, stafilococchi coagulasi positivi, oltre a lattobacilli e streptococchi lattici. Questi prodotti si devono comunque considerare facilmente contaminabili. Nei formaggi a pasta dura le condizioni microbiologiche sono mediamente migliori. Il controllo microbiologico dei formaggi prevede (tabella 12.8): r la determinazione della carica microbica totale a 32 °C r il conteggio dei coliformi r la ricerca di miceti, di E. coli, di Salmonella, degli stafilococchi coagulasi positivi, oltre all’eventuale ricerca di Brucella, Shigella, Clostridium botulinum, Listeria monocytogenes. Nelle produzioni industriali standardizzate vengono di norma impiegati ceppi di colture selezionate che sostituiscono i microrganismi utili eliminati dal trattamento di pastorizzazione. Si tratta di ceppi di Streptococcus lactis, S. cremoris, S. thermophilus, Lactobacillus casei, L. bulgaricus, L. helveticus. Batteri propionici vengono impiegati nella produzione dell’emmenthal, mentre muffe quali Penicillium roqueforti e P. glaucum sono utilizzati nella preparazione del roquefort e del gorgonzola (tabella 12.7). Dalla rottura della cagliata si ottiene il siero di latte, ancora ricco di lattoalbumina, grassi e lattosio, con una percentuale di acqua del 93% circa. Questo importante sottoprodotto della produzione del formaggio può essere nuovamente acidificato con latte acido e cotto nuovamente a 80 °C per ottenere la ricotta, che per definizione non è propriamente un formaggio ma che, per il suo ridotto contenuto in grassi (12%) e per le proteine presenti è da considerarsi un alimento ottimo e molto digeribile. Il siero di latte viene anche utilizzato per la produzione di acido lattico e nell’alimentazione del bestiame. Dal punto di vista microbiologico i formaggi freschi La produzione di latte fermentato, yogurt e formaggi è diffusa in molte regioni del mondo, ognuna caratterizzata dall’impiego di latte di diversa origine (vacca, pecora, capra, giumenta, cammella ecc.) e di tecniche diverse, tradizionali o moderne. Anche in questo caso l’origine di queste trasformazioni risale a tempi remoti e a produzioni che sicuramente ebbero origine da eventi casuali, probabilmente dalla constatazione che il latte, acidificando, cambiava consistenza e sapore ma poteva essere conservato più a lungo (paragrafo 6.5). 12.10 Yogurt e latti fermentati Yogurt La produzione dello yogurt prevede innanzitutto la pastorizzazione del latte (che rappresenta la materia prima) e la successiva inoculazione con ceppi selezionati di Lactobacillus bulgaricus e Streptococcus thermophilus (nella proporzione ottimale di 1:1), che rappresentano i fermenti lattici di riferimento. Per la produzione di altri prodotti probiotici si possono impiegare anche altri microrganismi, fra cui Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus acidophilus e L. casei. 179 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 12 CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI Tabella 12.7 Alcuni formaggi e relativi microrganismi produttori MICRORGANISMI IMPIEGATIa FORMAGGIO (PAESE DI ORIGINE) FASI INIZIALI DELLA PRODUZIONE FASI TERMINALI DELLA PRODUZIONE Lactococcus lactis L. cremoris, L. diacetylactis, S. thermophilus Lactobacillus bulgaricus S. thermophilus, Lactobacillus bulgaricus Leuconostoc cremoris Molle, stagionato Brie (Francia) Lactococcus lactis, L. cremoris Camembert (Francia) L. lactis, L. cremoris Penicillium camemberti, P. candidum, Brevibacterium linens Penicillium camemberti, Brevibacterium linens Semimolle Blue (Francia) Brick (Stati Uniti) Limburger (Belgio) Monterey (Stati Uniti) Muenster (Stati Uniti) Roquefort (Francia) Lactococcus lactis, L. cremoris L. lactis, L. cremoris L. lactis, L. cremoris L. lactis, L. cremoris L. lactis, L. cremoris L. lactis, L. cremoris Penicillium roqueforti Brevibacterium linens Brevibacterium linens Duro, stagionato Cheddar (Gran Bretagna) Colby (Stati Uniti) Edam (Olanda) Gouda (Olanda) Swiss (Svizzera) Lactococcus lactis, L. cremoris, E. durans L. lactis, L. cremoris, E. durans L. lactis, L. cremoris L. lactis, L. cremoris, L. diacetylactis L. lactis, L. helveticus, S. thermophilus Lactobacillus casei, L. plantarum L. casei Lactococcus lactis, L. cremoris, S. thermophilus Lactobacillus bulgaricus Molle, non stagionato Tipo “cottage” Cremoso Mozzarella (Italia) Molto duro, stagionato Parmigiano (Italia) Brevibacterium linens Penicillium roqueforti Propionibacterium shermanii, P. freudenreichii a Lactococcus lactis sta per L. lactis spp. cremoris, e Lactococcus diacetylactis per L. lactis spp. diacetylactis. Fonte: Adattata da Prescott et al. cit. Dal punto di vista biochimico la produzione dello yogurt consiste essenzialmente nella fermentazione lattica, con la trasformazione del lattosio in acido lattico ad opera dei microrganismi inoculati. Il disaccaride lattosio viene innanzitutto demolito nei monosaccaridi componenti (glucosio e galattosio) ad opera della β-galattosidasi (lattasi), cui segue la conversione del galattosio in glucosio (figura 12.8). Al termine della glicolisi l’acido piruvico, che ne rappresenta il prodotto finale, viene trasformato dalla lattico-deidrogenasi in acido lattico e dalla piruivato-decarbossilasi in acetaldeide, che impartisce allo yogurt il caratteristico sapore e aroma. Acetilmetilcarbinolo e diacetile sono altri prodotti secondari del catabolismo del lattosio. L’intero processo Lattosio CH2OH O CH2OH O HO O OH + OH H2O OH OH OH OH CH2OH HO OH O OH + OH Galattosio CH2OH β-galattosidasi O OH OH HO Glucosio Figura 12.8 Idrolisi del lattosio. 180 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario OH CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI 12 Tabella 12.8 Controlli microbiologici consigliati per alcuni formaggi e per la ricotta di vacca TIPOLOGIA: CRESCENZA/MOZZARELLA (formaggi freschi a pasta molle) PARAMETRI MICROBIOLOGICI LIMITI VALORI GUIDA RIFERIMENTI NORMATIVI Escherichia coli M = 103 m = 102 n=5c=2 Allegato al titolo IV del Reg. Loc. Ig. BURL 15/05/1993 D.P.R. 14/01/1997 n. 54 Coliformi (a 30 °C) M = 105 m = 104 n=5c=2 D.P.R. 14/01/1997 n. 54 Stafilococco aureo M = 103 m = 102 n=5c=2 Allegato al titolo IV del Reg. Loc. Ig. BURL 15/05/1993 D.P.R. 14/01/1997 n. 54 Salmonella spp. assenza in 25 g n=5c=0 D.P.R. 14/01/1997 n. 54 Listeria monocytogenes assenza in 25 g n=5c=0 D.P.R. 14/01/1997 n. 54 TIPOLOGIA: RICOTTA DI VACCA Escherichia coli < 10/g 2 Allegato al titolo IV del Reg. Loc. Ig. BURL 15/05/1993 Stafilococco aureo < 10 /g Allegato al titolo IV del Reg. Loc. Ig. BURL 15/05/1993 Salmonella spp. Assenza in 25 g Allegato al titolo IV del Reg. Loc. Ig. BURL 15/05/1993 D.P.R. 14/01/1997 n. 54 Listeria monocytogenes Assenza in 1 g D.P.R. 14/01/1997 n. 54 porta anche a una parziale demolizione delle proteine, che aumenta la digeribilità del prodotto. Il latte impiegato per la preparazione di yogurt può essere intero o scremato, deve avere una bassa carica microbica e risultare esente da sostanze antibatteriche, presentare un alto contenuto in proteine e un contenuto lipidico fra lo 0,5 e l’1%. Lo yogurt deve avere acidità compresa fra 4 e 4,5 con un contenuto in acido lattico non inferiore allo 0,8%. L’associazione di Lactobacillus bulgaricus e Streptococcus thermophilus nella preparazione dello yogurt può essere considerata una forma di simbiosi o quanto meno di cooperazione: infatti S. termophilus richiede la presenza di aminoacidi, fra cui la valina, e di peptidi. Questi componenti sono assenti come tali nel latte, ma vengono forniti dai lattobacilli, che possiedono aminopeptidasi e proteasi che li rendono disponibili. D’altra parte L. bulgaricus richiede una certa concentrazione di CO2, acido piruvico e acido formico, che vengono messi a disposizione dall’attività metabolica iniziale da S. thermophilus. Lo sviluppo di entrambi i batteri si arti- cola in due fasi: nella prima, avvantaggiato dall’attività proteolitica dei lattobacilli, si sviluppa più velocemente S. thermophilus, mentre nella seconda fase di sviluppo è favorito L. bulgaricus, che può utilizzare le sostanze messe a disposizione dagli streptococchi. La crescita di questi ultimi viene fra l’altro inibita dall’ambiente acido creatosi. La formazione di acido lattico dalla fermentazione del lattosio crea un ambiente a pH di circa 4,6 che provoca la destabilizzazione del complesso calciofosforo-caseinato e la formazione del coagulo. I fermenti lattici sopra ricordati sono in grado di produrre polisaccaridi, che quando sono in eccesso determinano un aspetto viscoso e filante dello yogurt: è importante quindi selezionare e scegliere ceppi medio-acidificanti e basso-produttori di polisaccaridi. Un’eccessiva acidificazione può portare alla presenza di siero alla superficie del coagulo, mentre se è troppo scarsa si produce yogurt di consistenza troppo liquida. Ceppi microbici non adatti o in qualche modo inquinati (quindi non più colture pure) possono portare a yogurt di consistenza 181 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 12 CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI e tessitura non omogenea, sabbiosa e con presenza di granulazioni. La produzione dello yogurt (figura 12.9) comprende una prima fase comune a tutte le tipologie di prodotto, che si articola nella scelta del latte da utilizzare, nella sua filtrazione, concentrazione e omogeneizzazione (la concentrazione influisce decisamente su consistenza e densità dello yogurt), in un trattamento di pastorizzazione (90-95 °C per 5 min) e nel successivo raffreddamento a 36-44 °C, che rappresenta l’intervallo di temperatura ottimale per i fermenti lattici. Temperature più basse (40 °C) favoriscono gli streptococchi e la produzione di yogurt meno acido, mentre quelle superiori (44 °C) sono più favorevoli ai lattobacilli e danno generalmente un prodotto caratterizzato da maggior acidità. La prima fase termina con l’inoculo delle colture starter nella proporzione dell’1-3% di latte. La seconda fase della produzione si differenzia in base al tipo di yogurt che si desidera ottenere; a questo punto inoltre si può effettuare l’aggiunta di frutta in pezzi o come succo. Per ottenere yogurt a coagulo compatto o intero si fa avvenire la fermentazione direttamente nella singola confezione di vendita per un tempo variabile da 2 a 10 h a 43 °C di temperatura media; lo yogurt viene poi raffreddato a 6 °C e conservato a 4 °C. Lo yogurt cremoso o a coagulo rotto viene prodotto in fermentatore con rottura lenta e uniforme del coagulo, raffreddato e quindi confezionato in vasetti e conservato a 4 °C. Lo yogurt da bere è prodotto in condizioni simili al precedente ma subisce un’omogeneizzazione a 250 atmosfere che rende il coagulo molto fluido, quindi è raffreddato, confezionato e conservato a 6 °C. Latti fermentati probiotici LATTE Filtrazione Titolazione Evaporazione Omogenizzazione a circa 200 atm Pastorizzazione a 90-95 °C per 5-6 min Raffreddamento a 45 °C circa Inoculo con starter L. delbrueckii e S. thermophilus in rapporto 1/1 o 1/2 Eventuale aggiunta di frutta e fermentazione nelle confezioni per 8-14 h a 43-44 °C Eventuale aggiunta di frutta e fermentazione nei tank per 8-12 h a 43-44 °C Eventuale aggiunta di frutta e fermentazione nei tank per 8-14 h a 43-44 °C Raffreddamento a 15-20 °C Raffreddamento a 15-20 °C e confezionamento Raffreddamento a 15-20 °C e confezionamento Yogurt compatto o a coagulo intero Yogurt cremoso o a coagulo rotto Yogurt da bere Figura 12.9 Schema del processo di produzione dello yogurt. Con il termine di microrganismi probiotici si indicano i microrganismi in grado di superare la barriera gastrica, aderire alla mucosa intestinale e riprodursi. Tali batteri sono contenuti in una variegata gamma di prodotti a base di latte. Fra questi i più utilizzati sono Lactobacillus casei, L. acidophilus e il genere Bifidobacterium, abbondante nell’intestino del neonato. Quest’ultimo, insieme al genere Bacteroides e con altri batteri anaerobi presenti nell’intestino dell’adulto, costituisce una comunità di microrganismi che, aderendo alla mucosa intestinale, svolge un’azione difensiva contro dismicrobismi intestinali e malattie correlate, mantenendo il corretto equilibrio delle funzioni intestinali e fornendo anche all’organismo vitamine e altri elementi utili. I prodotti probiotici sono principalmente latti fermentati o yogurt contenenti bifidobatteri (Bifidobacterium bifidus, longum, infantis), Lactobacillus acidophilus e altri batteri lattici in grado di arrivare e sopravvivere vitali nell’intestino. Non si confondano i probiotici con i prebiotici, denominazione riferita a fibre non digeribili che favoriscono indirettamente l’attecchimento, la proliferazione e l’attività benefica dei microrganismi probiotici a livello intestinale. Le caratteristiche di qualità dello yogurt sono legate essenzialmente a quella del latte impiegato e alla presenza di un congruo numero di fermenti lattici (ta- 182 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI 12 Tabella 12.9 Controlli microbiologici consigliati per lo yogurt TIPOLOGIA: YOGURT CONFEZIONATO PARAMETRI MICROBIOLOGICI LIMITI VALORI GUIDA RIFERIMENTI NORMATIVI Batteri lattici < 106/g Allegato al titolo IV del Reg. Loc. Ig. BURL 15/05/1993 Rapp. ISTISAN 26/63 Coliformi ≤ 10/mL Allegato al titolo IV del Reg. Loc. Ig. BURL 15/05/1993 Rapp. ISTISAN 26/63 Stafilococco aureo ≤ 10/mL Allegato al titolo IV del Reg. Loc. Ig. BURL 15/05/1993 Rapp. ISTISAN 26/63 Listeria monocytogenes Assenza in 1 g D.P.R. 14/01/1997 n. 54 Salmonella spp. Assenza in 25 g n=5c=0 D.P.R. 14/01/1997 n. 54 bella 12.9). Valori accettabili si aggirano, sia per lattobacilli che per streptococchi, intorno a 109 cellule/mL. Non devono naturalmente essere presenti batteri saprofiti indesiderabili, coliformi, muffe o lieviti. Le muffe agiscono alcalinizzando il substrato e preparando la colonizzazione da parte di germi proteolitici, mentre i lieviti si rinvengono soprattutto negli yogurt alla frutta, dove sono responsabili di produzione di gas e aromi sgradevoli. Kefir Il kefir è una bevanda ottenuta dall’azione fermentativa congiunta di batteri lattici, acetici e lieviti. Il kefir ha caratteristiche organolettiche peculiari, dovute alla presenza di acido lattico, acido acetico ed etanolo. I microrganismi che si rinvengono nelle colture starter sono innumerevoli (tabella 12.10) e formano i “granuli di kefir” di consistenza gelatinosa la cui matrice è composta da polisaccaridi e proteine. La popolazione microbica forma un ecosistema complesso, formato da batteri lattici (in maggioranza lattobacilli omofermentanti, da 106 a 109 UFC/mL), batteri acetici, lieviti (Candida kefyr e Kluyveromyces marxianus in grado di fermentare il lattosio, oltre a Saccharomyces che non lo fermenta). La presenza dei lieviti è responsabile della produzione di alcol etilico (0,1-2%), di vitamine, aminoacidi e fattori di crescita diversi utilizzati dai batteri, che a loro volta cedono ai lieviti diversi metaboliti utili. I lieviti contribuiscono inoltre in modo determinante a conferire al prodotto l’aroma caratteristico. Osservazioni al microscopio elettronico hanno evidenziato come i rapporti fra le due comunità microbiche siano in effetti assai stretti, al punto che ogni cellula di lievito appare circondata da un notevole numero di cellule batteriche. La produzione del kefir prevede le seguenti fasi: r pastorizzazione del latte per evitare possibile antagonismo microbico con i microrganismi del kefir r omogeneizzazione r inoculo con granuli di kefir in ragione del 5-10% r fermentazione (18-24 h a 20 °C) r raffreddamento a 10 °C r filtrazione e confezionamento Tabella 12.10 Alcuni fra i principali microrganismi dei granuli di kefir BATTERI LIEVITI Lactobacillus spp. Kluyveromyces marxianus Lactococcus spp. Candida kefyr Streptococcus thermophilus Saccharomyces cerevisiae Leuconostoc mesenteroides Torulospora delbrueckii Pediococcus spp. Pichia fermentans Micrococcus spp. Brettanomyces anomalus Acetobacter spp. 183 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 12 CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI Tabella 12.11 Controlli microbiologici consigliati per i gelati TIPOLOGIA: GELATO A BASE DI LATTE PARAMETRI MICROBIOLOGICI LIMITI VALORI GUIDA RIFERIMENTI NORMATIVI Carica microbica totale 32 °C M = 105 m = 105 n=5c=2 D.P.R. 14/01/1997 n. 54 Coliformi totali M = 102 m = 10 n=5c=2 D.P.R. 14/01/1997 n. 54 Stafilococco aureo M = 102 m = 10 n=5c=2 D.P.R. 14/01/1997 n. 54 Salmonella spp. Assenza in 25 g n=5c=0 D.P.R. 14/01/1997 n. 54 Listeria monocytogenes Assenza in 1 g D.P.R. 14/01/1997 n. 54 r maturazione (24 h a 4 °C). In questa fase il kefir matura e affina le proprie caratteristiche organolettiche r conservazione a 4 °C fino a un massimo di 10 giorni. La composizione del kefir può variare in relazione all’area geografica di produzione; è considerato comunque una bevanda acido-alcolica con proprietà probiotiche, profilattiche e terapeutiche. Risulta nutriente per la presenza di aminoacidi essenziali e peptidi vari e anche molto digeribile. Gli vengono attribuite anche proprietà antitumorali e ipocolesterolizzanti. 12.11 I gelati Questi derivati del latte vengono conservati a −25/−30 °C, temperature alle quali alcuni microrganismi possono sopravvivere. Le possibili contaminazioni riguardano le diverse fasi della lavorazione, a partire dalle materie prime utilizzate: in primo luogo latte, uova, panna e burro. La massima attenzione deve essere posta all’igiene personale degli addetti alla lavorazione e alla vendita, a quella degli ambienti di lavoro e a quella dei contenitori e utensili utilizzati. I controlli da effettuare riguardano la determinazione della CBT, la ricerca e il conteggio di E. coli e dei coliformi, quella di Staphylococcus aureus, quella delle salmonelle (tabella 12.11). 12.12 Uova e derivati Le uova sono un alimento ad alto valore nutritivo, ricche di proteine e aminoacidi essenziali nonché di lecitine, vitamine, calcio, ferro, fosforo. Sono costituite da guscio, albume e tuorlo. Il tuorlo è una cellula-uovo, costituita pressoché totalmente dal citoplasma. Dovendo provvedere alla nutrizione dell’embrione, è molto ricco di sostanze nutritive (lipoproteine e fosfoproteine, trigliceridi, lecitine, colesterolo). Sul tuorlo si trova la vescicola germinativa, corrispondente al nucleo femminile: da questa si sviluppa l’embrione quando l’uovo viene fecondato. Il tuorlo è racchiuso da una sottilissima membrana e circondato dall’albume, mantenuto in posizione centrale da due cordoni (calaze). Durante il passaggio nell’ovidutto il tuorlo viene circondato dall’albume e quindi ricoperto dal guscio. L’albume è formato in massima parte di proteine (ovoalbumina), ma contiene anche sali minerali, vitamine ed enzimi. Il guscio è formato da tre strati di materiale: una cuticola esterna, uno strato intermedio e una membrana testacea (formata a sua volta da due foglietti di cheratina) che lo separa dall’albume. La camera d’aria che si trova a uno dei poli dell’uovo si forma per separazione di un tratto dei due foglietti, e aumenta di volume con l’invecchiamento dell’uovo. Il guscio costituisce una riserva di calcio ed è una barriera protettiva ma allo stesso 184 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 12 CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI Tabella 12.12 Controlli microbiologici consigliati per le uova Alimento Microrganismi aerobi/g Coliformi/g Streptococchi fecali/g Staphylococcus aureus/g Microrganismi anaerobi solfitoriduttori/g Salmonella/25 g Uova crude 500 0005 000 000 500 50 50 Assenti Assente tempo permeabile, per consentire gli scambi respiratori al pulcino. Le uova sono un alimento nutritivo e risultano facilmente digeribili se cotte senza l’aggiunta di grassi, ma controindicate nella calcolosi biliare: possono provocare infatti in questo caso spasmi assai dolorosi (coliche). Va sottolineato che la composizione delle uova è influenzata dal tipo di alimentazione della gallina: aumentando per esempio la quota di mais e soia si ottengono uova più ricche di acidi grassi insaturi come il linolenico, da preferire quindi ad altri alimenti che ne sono carenti. Un’alimentazione ricca di olio di pesce aumenta nelle uova la quota di acidi grassi omega-3 che hanno un’azione protettiva nei confronti delle patologie cardiovascolari, mentre fornendo alle ovaiole gli adatti precursori (per es. α-tocoferoli) si può aumentare la concentrazione di vitamine A ed E. Dal punti di vista merceologico (D. Lgs. 11/12/2009) si distinguono uova: r di categoria A, fresche e destinate al consumo diretto r di categoria B, destinate alle industrie alimentari e non. La contaminazione microbica delle uova può verificarsi prima della deposizione da parte di microrganismi che infettano la gallina o per successivi contatti con l’ambiente esterno (tabella 12.12). Le condizioni igieniche dell’allevamento e un’assidua vigilanza sanitaria sulle produttrici sono i primi requisiti per ottenere prodotti di qualità. Occorre quindi verificare lo stato di salute degli animali, l’idoneità delle strutture, effettuare periodici controlli sull’eventuale presenza di infezioni microbiche, adottare le misure per circoscrivere ed eliminare le situazioni di rischio. Le salmonelle sono il più delle volte di provenienza esterna, dalle feci delle galline o dalla lettiera, ma si localizzano di frequente nell’ovaio e nell’ovidotto. In questo caso le difese naturali dell’uovo (albumina, avidina, lisozima e ovotrasferrina), peraltro di breve durata e che contrastano la penetrazione di germi dall’esterno, sono inefficaci. Oltre a Salmonella i microrganismi più spesso evidenziabili risultano essere Listeria monocytogenes, E. coli, Bacillus, Campylobacter e stafilococchi coagulasi positivi. Per Salmonella, si ipotizza che la carica microbica infettante nelle uova possa variare fra 105 e 1011 UFC/g. Pseudomonas, Proteus e coliformi sono in grado di causare nelle uova fenomeni putrefattivi. Il lavaggio delle uova è materia controversa: se da una parte ne favorisce la pulizia, dall’altra aumenta la permeabilità del guscio favorendo l’ingresso dei microrganismi. Si può procedere con una soluzione di NaOH 0,35% in acqua a 70 °C. Prodotti d’uovo Sono i prodotti ottenuti dalle uova private dal guscio, largamente impiegati nell’industria dolciaria e nei pastifici. Tali prodotti si presentano come liquidi, concentrati, disidratati, cristallizzati, congelati, surgelati o coagulati. Tutti devono subire la pastorizzazione o un idoneo trattamento termico: nelle uova in polvere non pastorizzate sono state rinvenute spesso salmonelle. 12.13 Prodotti della pesca I prodotti ittici comprendono pesci, molluschi (cefalopodi, gasteropodi, bivalvi) e crostacei. Il pesce è un alimento ricco di proteine ad alto valore biologico e di alta digeribilità, attribuibile in parte al basso contenuto di tessuto connettivo. Alta è la percentuale di acidi grassi insaturi, calcio e iodio e di vitamine, in particolare A e D, superiore a quella della carne. La qualità microbiologica del pesce è strettamente legata a quella delle acque in cui vive. È inoltre esperienza comune come nei pesci, molluschi e crostacei i fenomeni degradativi e di alterazione si verifichino assai più velocemente che in altri alimenti: ciò sembra 185 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 12 CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI Tabella 12.13 Controlli microbiologici consigliati per i prodotti ittici Alimento Microrganismi aerobi/g Coliformi/g Streptococchi fecali/g Staphylococcus aureus/g Microrganismi anaerobi solfitoriduttori/g Salmonella/25 g Pesce intero o a tranci refrigerato o surgelato 500 000 1 000 1 000 100 5 Assente Molluschi (cozze, vongole, seppie ecc.) già puliti e surgelati 100 000 100 100 100 5 Assente Baccalà già lavorato (dissalato) pronto da cucinare 1 000 000 1 000 1 000 100 5 Assente dovuto alla composizione chimica e al pH poco acido dei tessuti. La pesca in acque profonde e fredde fornisce mediamente prodotti di qualità migliore rispetto a quelli che provengono da acque costiere, che più facilmente risentono della prossimità di scarichi non adeguatamente depurati. Le possibilità di contaminazione polimicrobica del pesce sono inoltre moltiplicate dalle operazioni inerenti alla lavorazione e all’esposizione del pescato sui banchi di vendita. Assume importanza strategica in questo settore l’immediata refrigerazione sul luogo di pesca a bordo delle navi, che aumenta notevolmente la conservabilità del prodotto. Nei processi alterativi del pesce si formano ammine, in particolare la trimetilammina, H2S, indolo, scatolo e mercaptani, prodotti tipici delle putrefazioni. Particolare attenzione va posta a proposito dei molluschi bivalvi (cozze, ostriche, vongole) che, in quanto organismi microfiltratori, trattengono e concentrano i microrganismi che si trovano nelle acque in cui vivono (enterococchi, enterobatteri, vibrioni, virus). La legge consente la commercializzazione esclusivamente dei molluschi che hanno subìto un trattamento di stabulazione in acque controllate per un periodo prestabilito di risanamento e depurazione. La carica microbica presente normalmente nel pesce si aggira intorno a valori di 103-106 UFC/cm2 sulla pelle e nelle branchie. I germi che si rinvengono più di frequente sono Pseudomonas, Flavobacterium, Achromobacter, Micrococcus, Clostridium, enterobatteri e vibrioni: molti di questi batteri sono psicrofili e alotolleranti. Possono essere presenti anche lieviti e muffe. Le masse muscolari sono normalmente sterili al momento della pesca, ma vanno ben presto incontro a contaminazione in seguito ai traumi della cattura, che causa batteriemia e diffusione dei microrganismi nelle carni. La valutazione della freschezza e qualità del pesce si effettua innanzitutto con metodi sensoriali per apprezzarne le caratteristiche organolettiche. Le tecniche microbiologiche permettono di valutare la carica microbica (che denuncia fenomeni alterativi quando raggiunge e supera valori di 5 × 106 UFC/cm2) e altri parametri come la ricerca di alcuni enzimi (tabella 12.13). Indagini di tipo chimico sono rivolte a verificare il pH, la concentrazione di istamina, indolo e H2S. 12.14 Miele Il miele è definito un “prodotto alimentare ricavato da api mellifere dal nettare dei fiori o da secrezioni di parti vive di piante (melata) raccolto, trasformato, addizionato di sostanze specifiche, immagazzinato e lasciato maturare dalle api nei favi dell’alveare”. La composizione tipica del miele è la seguente: r acqua, non superiore al 18%, onde evitare la proliferazione di lieviti fermentativi. Una percentuale inferiore al 15% rende invece il miele troppo consistente e cristallizzabile in masse troppo dure r glucidi (95-99%), rappresentati da glucosio e fruttosio. Una delle caratteristiche peculiari del miele è la presenza di zucchero “invertito” cioè i monosaccari- 186 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI di come tali, in quanto il saccarosio destrogiro viene scisso dall’enzima invertasi delle api in una miscela di glucosio e fruttosio (levogira) in parti uguali. Questa caratteristica fa sì che lo zucchero del miele sia molto più digeribile e di pronta assimilazione rispetto al normale zucchero da tavola r acidi, che conferiscono al miele un pH prossimo a 3,9 r proteine, presenti peraltro in modesta quantità r altri componenti. I microrganismi che si possono rinvenire nel miele generalmente provengono dal nettare o dalla melata, dalle api (in particolare Bacillus cereus, componente della loro flora intestinale), da miele fermentato presente nell’alveare, da contaminazioni nel processo di lavorazione. I difetti microbiologici del miele sono ascrivibili in 12 genere a lieviti fermentanti, in particolare Zygosaccharomyces. Questi microrganismi, per la loro adattabilità a sopravvivere in ambiente osmoticamente sfavorevole come il miele per l’alta concentrazione zuccherina, e i bassi valori di aw e di pH, provocano fermentazioni con produzione di acidi, alcol etilico e CO2, che generano sapori sgradevoli, schiuma e macchie biancastre. Cariche lievitiformi preoccupanti sono dell’ordine di 104 UFC/mL. Altrettanto importante è l’assenza di antibiotici, che spesso lasciano residui nel miele in quanto impiegati per combattere malattie infettive delle api o parassiti che possono penetrare all’interno dell’alveare. La ricerca dei residui di antibiotici nel miele può essere eseguita in modo analogo a quella del PAR test nel latte, ma occorre tener presente che nel miele sono presenti alcune sostanze naturali con un blando potere antimicrobico. Tabella 12.14 Controlli microbiologici consigliati per le paste alimentari TIPOLOGIA: PASTA DI SEMOLA DI GRANO DURO/PASTA ALL’UOVO SECCA PARAMETRI MICROBIOLOGICI LIMITI VALORI GUIDA RIFERIMENTI NORMATIVI Carica microbica totale ≤ 104 UFC/g su 3 u.c. ≤ 105 UFC/g su 2 u.c. Cir. Min. San. 03/08/85 n. 32 Rapp. ISTISAN 89/9 Stafilococco aureo ≤ 102 UFC/g su 3 u.c. ≤ 103 UFC/g su 2 u.c. Cir. Min. San. 03/08/85 n. 32 Rapp. ISTISAN 89/9 Salmonella spp. Assenza in 25 g su 5 u.c. Legge n. 283/62 art. 5 Cir. Min. San. 03/08/85 n. 32 Rapp. ISTISAN 89/9 Listeria monocytogenes ≤ 11/g in 1 u.c. ≤ 110/g su 2 u.c. O.M. 07/12/93 TIPOLOGIA: GNOCCHI E PASTA FARCITA INDUSTRIALE (pasta fresca confezionata) Carica microbica totale ≤ 105 UFC/g su 3 u.c. ≤ 106 UFC/g su 2 u.c. Cir. Min. San. 03/08/85 n. 32 Rapp. ISTISAN 89/9 Stafilococco aureo ≤ 102 UFC/g su 4 u.c. ≤ 5 × 102 UFC/g su 1 u.c. Cir. Min. San. 03/08/85 n. 32 Rapp. ISTISAN 89/9 Clostridium perfringens ≤ 102 UFC/g su 4 u.c. ≤ 103 UFC/g su 1 u.c. Cir. Min. San. 03/08/85 n. 32 Rapp. ISTISAN 89/9 Salmonella spp. Assenza in 25 g su 5 u.c. Legge n. 283/62 art. 5 Cir. Min. San. 03/08/85 n. 32 Rapp. ISTISAN 89/9 Listeria monocytogenes ≤ 11/g in 1 u.c. ≤ 110/g in 2 u.c. O.M. 07/12/93 Bacillus cereus ≤ 104 UFC/g Nota Rapp. ISTISAN 89/9 187 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 12 CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI 12.15 Paste alimentari Le paste alimentari sono quelle preparate da un impasto di semola di grano duro (capitolo 6) e acqua, dopo opportuna trafilatura, laminazione ed essiccamento. La legge italiana impone l’esclusivo impiego del grano duro per la produzione delle paste alimentari (secche), mentre in altri Paesi è consentito anche l’impiego di grano tenero, meno costoso ma meno pregiato. La pasta viene prodotta miscelando semola e acqua, che ha la funzione di idratare l’amido e formare il glutine, una lipoproteina derivante da gliadine e glutenine, due proteine dell’endosperma del frumento (o grano) e che si forma quando le due proteine vengono a contatto con l’acqua. Il glutine rende elastico e coeso l’impasto. Si distinguono diversi tipi di paste: r secche (o semplici, prodotte con grano duro) r fresche per la cui preparazione è permesso l’impiego di grano tenero r speciali, preparate con grano duro (secche) o tenero (fresche). Sono tutte paste all’uovo (minimo 4 uova; 200 g di uovo/kg di semola) e possono contenere anche altri ingredienti (spinaci, concentrato di pomodoro ecc.). Le paste farcite hanno un ripieno a base di carne, formaggio, verdure, funghi ecc. ste a essiccazione ad alta temperatura, sono tali da non presentare solitamente aspetti di contaminazione. Completamente diverso si presenta il caso delle paste fresche e farcite, in cui le occasioni di contaminazione microbica sono legate al maggior contenuto di acqua, alla presenza delle uova e dei vari ingredienti che compongono l’impasto e il ripieno. Il trattamento termico cui viene eventualmente sottoposto il prodotto dopo il confezionamento, la conservazione in atmosfera modificata e in ambiente refrigerato possono diminuire le occasioni di contaminazione. Particolare attenzione deve essere naturalmente posta al rigoroso rispetto delle norme igieniche da parte degli operatori, alla pulizia degli ambienti e delle superfici di lavoro, alle apparecchiature utilizzate. Le indagini microbiologiche da effettuare riguardano (tabella 12.14): r la carica microbica mesofila aerobia a 32 °C: valori mediamente accettabili devono risultare non superiori a 103 UFC/g per le paste secche e a 104 UFC/g per quelle fresche r la ricerca di Salmonella, che deve risultare assente in 25 g di campione per tutte le tipologie r la ricerca e il conteggio dello Staphylococcus aureus, che non deve risultare superiore a 102 UFC/g per le paste secche e a 103 per quelle fresche. Le caratteristiche microbiologiche delle paste secche, che hanno un basso contenuto di acqua e sono sottopo- 188 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario ESERCIZI DI VERIFICA 1. Rispondi alle seguenti domande: Cosa si intende per “criterio microbiologico”? In che cosa consiste un piano di campionamento? Quali sono le differenze fra un piano di campionamento a due classi e un altro a tre classi? Che cosa rappresentano i microrganismi indicatori? A quali caratteristiche devono rispondere? Spiega la differenza fra alterazione, adulterazione e sofisticazione alimentare. In che cosa consiste la frollatura delle carni? Come si ottiene il formaggio? Quali fenomeni biochimici sono alla base della sua produzione a partire dal latte? Spiega il significato della presenza o assenza degli enzimi perossidasi e fosfatasi nel latte pastorizzato. Perché alcuni soggetti devono assumere latte a ridotto contenuto di lattosio? Come viene prodotto lo yogurt? Quali sono le differenze fra alimenti prebiotici e probiotici? 189 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 13 SPERIMENTAZIONE DI NUOVI FARMACI, COMPOSTI GUIDA E FARMACOVIGILANZA 13.1 Alcune definizioni 13.2 Come nasce un farmaco 13.3 La fase di ricerca preclinica (fase 0) 13.4 La sperimentazione clinica (clinical trials) 13.5 Le tre fasi dei clinical trials 13.6 La registrazione del farmaco e l’immissione in commercio Quando vengono avviati gli studi sperimentali per la ricerca di un nuovo farmaco è necessario valutarne il requisito fondamentale, cioè l’efficacia, ma è altrettanto importante monitorarne gli eventuali effetti tossici, quelli collaterali e quelli inattesi. Vengono quindi adottati protocolli appositamente dedicati per quanto riguarda la sperimentazione delle nuove molecole e la raccolta di tutte le informazioni possibili da parte del medico che prescrive il farmaco, della casa farmaceutica che lo ha prodotto e dei pazienti che lo assumono. È quindi necessario distinguere una fase di sperimentazione e una di vigilanza sul farmaco dopo la sua registrazione e l’immissione sul mercato. 13.7 Farmacovigilanza 13.1 Alcune definizioni È opportuno premettere alcune definizioni schematiche di argomento farmacologico al fine di agevolare la comprensione degli argomenti trattati nei successivi paragrafi. FARMACOLOGIA: si occupa dello studio delle interazioni fra sostanze di varia natura e sistemi biologici per valutarne possibili applicazioni terapeutiche. PRINCIPIO ATTIVO: il termine indica una sostanza che possiede una certa attività biologica, in senso positivo (un farmaco possiede un’attività terapeutica) o negativo (un veleno ha un’azione tossica). Fonte: Shutterstock Images, LC. ECCIPIENTI: nella composizione di un farmaco sono tutte le sostanze diverse dal principio attivo, impiegate 190 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario SPERIMENTAZIONE DI NUOVI FARMACI, COMPOSTI GUIDA E FARMACOVIGILANZA Sito d’azione “recettori” legato 13 Depositi tissutali libero legato libero Circolazione sistemica Assorbimento Farmaco libero Escrezione Metaboliti Farmaco legato Biotrasformazione Figura 13.1 Relazioni fra i parametri di farmacocinetica di un farmaco. allo scopo di ottimizzarne la formulazione, facilitarne la somministrazione e favorirne l’assorbimento da parte dell’organismo, assicurarne la stabilità e prolungarne la conservazione. FARMACOCINETICA: studia i meccanismi con i quali un farmaco viene assorbito, trasformato, dove e come si localizza e come viene eliminato dall’organismo (figura 13.1). La farmacocinetica si occupa di: r vie di somministrazione: vengono scelte in base al minor grado di pericolosità possibile, alla facilità nel raggiungere l’organo bersaglio, alla concentrazione con cui vi giunge (tabella 13.1). Esiste una via enterale (ingestione orale o sublinguale, introduzione rettale), una via parenterale (iniezione sottocutanea, intramuscolare, endovenosa) e un’applicazione topica (sulle mucose, sulla cute, nell’occhio) r assorbimento: riguarda la velocità e l’entità del trasferimento del farmaco dal luogo di somministrazione verso l’organo bersaglio Può avvenire mediante diffusione passiva (passaggio da una zona a maggior concentrazione verso un’altra meno concentrata) oppure per trasporto attivo mediato da proteine carrier che rendono possibile il passaggio attraverso le membrane cellulari. In genere i farmaci vengono assorbiti nell’apparato gastroenterico per diffusione passiva r biodisponibilità: indica la quota di principio attivo che effettivamente viene resa disponibile nella cir- colazione sanguigna o linfatica e quindi è in grado di giungere integra ai siti recettori delle cellule bersaglio. In effetti non tutta la quota disponibile corrisponde alla dose somministrata: il farmaco assorbito a livello intestinale passa attraverso il fegato prima di arrivare alla circolazione sistemica. Se una parte della dose somministrata viene inattivata dal metabolismo epatico, questa non risulta più disponibile per l’effetto terapeutico r distribuzione: riguarda la velocità e i meccanismi con cui il farmaco passa dai capillari sanguigni agli spazi intracellulari e da qui all’interno delle cellule. In questo passaggio sono in gioco molte variabili, dalla permeabilità dei capillari a quella delle membrane cellulari, al legame che il farmaco stabilisce con le proteine plasmatiche e dei tessuti. Altri fattori in grado di influenzare la velocità e l’efficacia della distribuzione sono le dimensioni molecolari del farmaco (un alto peso molecolare rappresenta un ostacolo al passaggio attraverso i pori delle membrane cellulari), il comportamento del farmaco come acido o base deboli, la sua liposolubilità o il suo carattere idrofilo r biotrasformazione: i farmaci subiscono nell’organismo trasformazioni metaboliche che avvengono nell’apparato digerente, nel rene, ma soprattutto a livello epatico, dove agisce un gruppo di enzimi noti come citocromo P450 (capitolo 15). Le reazioni di biotrasformazione convertono il farmaco in metaboliti inattivi dotati di un più alto carattere 191 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 13 SPERIMENTAZIONE DI NUOVI FARMACI, COMPOSTI GUIDA E FARMACOVIGILANZA Tabella 13.1 Vie di somministrazione e assorbimento dei farmaci VIE DI SOMMINISTRAZIONE Endovenosa TIPO DI ASSORBIMENTO UTILITÀ SPECIFICA LIMITAZIONI E PRECAUZIONI Assorbimento evitato Grande nelle situazioni di emergenza Aumentato rischio di effetti collaterali Consente la titolazione del dosaggio Di regola le soluzioni devono essere iniettate lentamente Effetti potenzialmente immediati Non consigliabile per soluzioni Solitamente necessaria per oleose o sostanze insolubili farmaci proteici e peptidici con elevato peso molecolare Sottocutanea Rapido, dalla soluzione acquosa Lento e sostenuto dalle preparazioni deposito Intramuscolare Rapido, dalla soluzione acquosa Lento e sostenuto dalle preparazioni deposito Orale Variabile: dipendente da molti fattori Consigliabile nel caso di alcune sospensioni insolubili e per l’impianto di pellet Non consigliabile in caso di grossi volumi Consigliabile nel caso di volumi modesti, veicoli oleosi e alcune sostanze irritanti Preclusa durante trattamento con anticoagulanti La più conveniente ed economica Richiede la collaborazione del paziente Solitamente la più sicura Disponibilità potenzialmente irregolare e incompleta nel caso di farmaci scarsamente solubili, assorbiti lentamente, instabili o estesamente metabolizzati dal fegato e/o dal canale digerente di polarità e, quindi, più idrosolubili, che vengono poi eliminati dall’organismo. Le biotrasformazioni comprendono reazioni di fase I e II (figura 13.2). Nel primo caso si tratta in genere di reazioni redox e di idrolisi che portano alla perdita dell’attività farmacologica. Le reazioni di fase II sono reazioni di coniugazione fra gruppi funzionali della molecola del farmaco e l’acido glucuronico, il solfato o la glicina. I composti glucuronati sono privi di attività biologica, assumono carattere di spiccata polarità e vengono eliminati con le urine e le feci, a cui giungono con la bile. r escrezione: l’eliminazione dei farmaci avviene per via renale (la più importante), con la bile attraverso le feci o con altre vie come il sudore, il latte materno, la saliva. L’escrezione renale si realizza con i meccanismi fisiologici caratteristici delle varie parti del nefrone: filtrazione glomerulare, secrezione a Possibile insorgenza di dolore e necrosi provocate da sostanze irritanti Possibile interferenza con l’interpretazione di alcuni test diagnostici (per es. della creatina chinasi) livello del tubulo prossimale, riassorbimento nel tubulo distale. La prima eventualità si realizza per quei farmaci che, non legati a composti macromolecolari quali le proteine plasmatiche di trasporto (albumina), fuoriescono dai capillari arteriosi del glomerulo nella capsula di Bowman insieme con il filtrato glomerulare. Le molecole che non subiscono filtrazione possono venire escrete nel tubulo prossimale. Nel tubulo contorto distale del nefrone il farmaco può essere riassorbito (nel sangue) se liposolubile e non in forma ionizzata, oppure eliminato con le urine se ionizzato e non liposolubile. FARMACODINAMICA: studia gli effetti specifici di un farmaco e le sue modalità d’azione nei confronti di un organo o sistema biologico e sui relativi meccanismi fisiologici di funzionamento, nonché la relazione fra concentrazione o dose del farmaco e suo effetto (figura 192 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario SPERIMENTAZIONE DI NUOVI FARMACI, COMPOSTI GUIDA E FARMACOVIGILANZA 13 Alcuni farmaci subiscono direttamente il metabolismo di Fase II Farmaco Fase I Ossidazione, riduzione e/o idrolisi A seguito della Fase I il farmaco può risultare attivato, immodificato o, nella maggior parte dei casi, inattivo Fase II Prodotti di coniugazione Il farmaco coniugato solitamente è inattivo Figura 13.2 Biotrasformazione dei farmaci. 13.3). È basata quindi sulle caratteristiche biochimiche del farmaco (che prende il nome di “ligando”) e sul suo modo di interagire con i relativi recettori cellulari con cui si lega. Comprende: r meccanismo d’azione: un farmaco altera la funzionalità dello specifico recettore nelle cellule bersaglio; la formazione di un complesso farmaco-recettore provoca di conseguenza un effetto biologico (risposta). Un farmaco che si lega a un recettore cellulare è definito “agonista” r relazione dose/risposta: dipende dalla concentrazione del farmaco a livello del recettore, e la risposta è più intensa se la concentrazione è maggiore. Si stabilisce così una curva dose/risposta con andamento graduale e progressivo. CLEARANCE DEL FARMACO: la clearance di una sostanza è il rapporto fra la sua concentrazione nel sangue e la concentrazione della stessa sostanza nelle urine. In altri termini, essa esprime la capacità dell’organismo di allontanare dal sangue un determinato composto. Poiché l’organo emuntore per eccellenza è il rene, assume particolare importanza in medicina la clearance renale per la valutazione della funzionalità di questi organi. Si parla però anche di clearance epatica quan- do una sostanza viene eliminata con le feci (attraverso la bile prodotta dal fegato e riversata nella cistifellea, da dove arriva poi nell’intestino). Nel caso dei farmaci, la clearance di un farmaco è dunque la quantità di plasma da cui il farmaco viene allontanato nell’unità di tempo (mL/min). TEMPO DI EMIVITA: esprime il tempo necessario affinché la concentrazione massima di un farmaco nel sangue diminuisca del 50%. Si misura in ore o minuti e si indica con t/2. È un parametro importante per ottimizzare i tempi di somministrazione, in base alla constatazione che mediamente la fase di plateau della concentrazione nel sangue si raggiunge in 5 volte t1/2, mentre l’eliminazione totale del farmaco è pressoché totale in un tempo pari a 7 volte t1/2. ACCUMULO DI UN FARMACO: si verifica quando un farmaco viene somministrato a intervalli di tempo regolari, per cui la sua concentrazione nel sangue e nei tessuti aumenta progressivamente. Il fenomeno è la conseguenza della somministrazione nell’unità di tempo di una quantità di sostanza maggiore di quella che l’organismo può eliminare. 193 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 13 SPERIMENTAZIONE DI NUOVI FARMACI, COMPOSTI GUIDA E FARMACOVIGILANZA Farmaco legato a proteina Assorbimento Farmaco legato al tessuto Distribuzione Dose Concentrazione plasmatica Concetrazione tissutale Eliminazione Metabolismo Escrezione Farmaco nel compartimento dell’effettore Farmaco legato al recettore/effettore FARMACOCINETICA Eventi Post-recettoriali Effetto biochimico Risposta farmacologica FARMACODINAMICA Figura 13.3 Relazione tra processi farmacocinetici e farmacodinamici. 13.2 Come nasce un farmaco La creazione di un nuovo farmaco è un evento complesso che richiede energie da reclutare in campi diversi: r medicina e biologia, per la conoscenza dei meccanismi che sono alla base del funzionamento degli organismi viventi r chimica, per quanto riguarda la conoscenza delle proprietà delle molecole e la loro sintesi r farmacologia, per lo studio degli effetti sugli organi bersaglio r ingegneria e chimica industriale, per la progettazione degli impianti di produzione. smo biochimico su cui dirigere l’intervento e i possibili organi-bersaglio, la messa a punto del principio attivo, una fase preclinica di sperimentazione in laboratorio e sugli animali, quindi una fase clinica sperimentale sull’uomo. Solo al termine di un processo della durata di diversi anni (in media una decina) si arriva alla registrazione e alla commercializzazione del farmaco, cui segue comunque il successivo costante controllo degli effetti collaterali (farmacovigilanza). Gli obiettivi che la ricerca farmacologica si pone nell’ideazione di un nuovo farmaco sono volti a individuare: r l’area terapeutica verso cui indirizzare la ricerca r la patologia specifica su cui il farmaco deve agire r il meccanismo biologico su cui il farmaco deve intervenire. Il percorso di un farmaco Il percorso che porta alla nascita di un nuovo farmaco è lungo e articolato e prevede la definizione del meccani- Il primo passo è costituito dall’identificazione e caratterizzazione del principio attivo: la ricerca ha inizio con l’individuazione di un composto che i ricercatori riten- 194 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario SPERIMENTAZIONE DI NUOVI FARMACI, COMPOSTI GUIDA E FARMACOVIGILANZA gono dotato di qualche attività favorevole nei confronti di una determinata patologia, che sia cioè in grado di modificare un processo biologico. Occorre innanzitutto individuare il bersaglio farmacologico, cioè il meccanismo biologico coinvolto nella patologia allo studio e su cui dirigere l’intervento farmaceutico. Gli esempi di bersagli farmacologici sono numerosi e di varia natura: può trattarsi del microrganismo responsabile di una specifica malattia infettiva, della degenerazione delle cellule nervose cerebrali nell’Alzheimer, dell’insufficiente produzione di ormoni in alcune malattie metaboliche. Purtroppo non è mai semplice individuare il punto o i punti su cui intervenire, anche in considerazione della notevole complessità della maggior parte delle patologie. A seconda del punto di intervento e della tipologia del bersaglio i risultati sono sostanzialmente diversi: se il bersaglio svolge la propria azione come “causa prima” della malattia (il virus responsabile di un’infezione), il farmaco può portare alla guarigione; se, al contrario, il bersaglio farmacologico è un meccanismo biologico secondario, il farmaco non può intervenire sull’origine della malattia e ne modificherà soltanto alcuni aspetti e per un periodo di tempo limitato. Si può scegliere di agire anche in via preventiva quando il bersaglio è coinvolto indirettamente nella possibile insorgenza della patologia: un caso esemplare è rappresentato dal colesterolo nel sangue che, se presente in alta concentrazione, diventa fattore predisponente per aterosclerosi e infarto del miocardio. Una volta individuato il bersaglio, si ricercano le sostanze che sono in grado di interferire con esso e di ottenere un effetto terapeutico: si tratta di trovare quelli che vengono chiamati composti guida o lead compounds. Sono queste sostanze i veri e propri precursori del farmaco definitivo. Si tratta di composti con attività biologica la cui struttura chimica di base può essere convenientemente modificata per cercare di migliorarne l’efficacia, la selettività dell’azione farmacologica, i parametri farmacocinetici (assorbimento, distribuzione, metabolismo ed escrezione). A volte è il caso che porta all’individuazione di una molecola utile: è noto che Alexander Fleming notò l’attività antibiotica della muffa Penicillium notatum dopo che questa aveva casualmente inquinato un terreno di coltura con colonie di Staphylococcus aureus. A parte le scoperte che si fanno in modo del tutto fortuito, una tecnica che è possibile seguire consiste in 13 una paziente procedura di screening (setaccio), cioè nel passare in rassegna con il criterio della casualità (random) un numero molto alto di composti per individuare fra questi una o più molecole potenzialmente interessanti per l’impiego terapeutico mirato. Può trattarsi di sostanze estratte da piante, derivate da invertebrati o da organismi marini, di prodotti della fermentazione microbica, di molecole già sintetizzate ma scartate in studi precedenti perché non rispondenti ai requisiti allora richiesti, di molecole completamente nuove, di sostanze di cui casualmente si scopre l’importanza terapeutica. Questo tipo di operazione, estremamente lunga e indaginosa, si può rendere più veloce e diretta utilizzando la tecnica denominata High Throughput Screening (screening ad alta capacità), basata sullo studio della relazione fra la struttura tridimensionale di una molecola e la sua attività biologica. Si individuano cioè i gruppi funzionali responsabili di un determinato effetto sull’organismo e si concentrano su di essi gli sforzi per migliorarne l’attività. Tecnologie informatiche assai sofisticate permettono di ideare nuovi composti potenzialmente utili sulla base di descrittori molecolari (corrispondenti ad altrettante proprietà chimiche, fisiche, biologiche), quali l’orientamento spaziale degli atomi, la solubilità, la capacità di attraversare le membrane cellulari e le barriere biologiche, e di creare modelli molecolari che in qualche modo si avvicinino alle caratteristiche richieste dal progetto. Lo screening ad alta capacità permette di studiare migliaia di composti con prove multiple (fino a 50 in contemporanea). L’utilizzo di tecniche robotizzate e piastre microtiter (a microtitolazione o microdosaggio) con un elevato numero di pozzetti permette di velocizzare ulteriormente la ricerca. Un metodo molto efficace per l’ottimizzazione della ricerca di nuovi farmaci è la chimica combinatoriale, per mezzo della quale viene ottenuto ed esaminato un gran numero di molecole o composti secondo tutte le combinazioni possibili dei reagenti utilizzati, senza procedere per sintesi sequenziali successive. Questa tecnica permette di sintetizzare simultaneamente un numero molto elevato (centinaia o migliaia) di molecole affini ma diverse (librerie) da sottoporre a screening. Uno schema estremamente semplificato del metodo per ottenere una libreria di composti è descritto di seguito. Si abbiano, per esempio, due classi diverse di composti (A e B). Alla classe A appartengono le molecole A1 e A2, mentre a quella B le molecole B1 e B2. Partendo dai 195 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 13 SPERIMENTAZIONE DI NUOVI FARMACI, COMPOSTI GUIDA E FARMACOVIGILANZA 4 composti base si potranno avere le combinazioni A1B1; A1-B2; A2-B1; A2-B2: A1 A2 B1 A1-B1 A2-B1 B2 A1-B2 A2-B2 Un progresso decisivo è stato compiuto, anche in campo farmacologico, con l’introduzione delle biotecnologie. La manipolazione del DNA e le tecniche di trasferimento di geni hanno aperto nuove prospettive alla ricerca farmacologica. Sostanze in passato estratte da piante o ottenute per sintesi chimica vengono oggi prodotte da batteri ingegnerizzati (per es. l’insulina e altri ormoni) con un alto grado di purezza e in quantità elevate. Oggi almeno il 20% dei nuovi farmaci registrati annualmente è di origine biotecnologica. Rimane comunque molto lungo il tempo che intercorre fra la scoperta di una molecola promettente e la sua commercializzazione, a testimonianza dell’inderogabile necessità di un periodo di sperimentazione del farmaco per studiarne, oltre agli aspetti positivi, anche tutti i possibili effetti collaterali. La sperimentazione prevede una fase preclinica (in genere sugli animali) e una fase clinica sull’uomo articolata a sua volta in tre step (figura 13.4). 13.3 La fase di ricerca preclinica (fase 0) Questa prima fase di sperimentazione preclinica si svolge in laboratorio e persegue questi obiettivi principali: r stabilire con la massima approssimazione possibile lo spettro di attività del farmaco, valutarne l’efficacia e trarre indicazioni di massima sulla sua eventuale tossicità nei confronti dell’organismo r indagare gli aspetti legati alla farmacodinamica del farmaco e studiare la sua formulazione più adatta all’impiego sull’uomo. D’importanza fondamentale in questa fase si rivelano i modelli sperimentali della patologia, cioè sistemi biologici in cui si ricreano artificialmente le medesime condizioni della malattia cui il farmaco è dedicato. A questo scopo si utilizzano modelli in vitro, in genere colture di cellule eucariotiche, oppure modelli in vivo Scoperta Test di laboratorio Test preclinici Test di laboratorio e su animali Fase I Test su ~40 volontari Fase II Test clinici su 300-400 pazienti Fase III Test su migliaia di pazienti Approvazione Controllo della FDA o altri enti europei 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Anni Figura 13.4 Tempi e fasi di sviluppo e commercio di nuovi farmaci. intesi come animali da esperimento. È evidente che solo in quest’ultimo caso è possibile valutare gli aspetti farmacocinetici dei composti sotto esame e dedurre parametri fondamentali quali la relazione dose/effetto, stabilire la dose letale per gli animali da laboratorio, la tossicità acuta e cronica, la dose massima tollerabile, i fenomeni di accumulo nei tessuti dell’organismo. Dall’esito di questa sperimentazione e dall’analisi accurata dei dati disponibili si può avere una prima idea degli effetti sull’uomo, con la massima cautela dettata dal passaggio dalla sperimentazione sugli animali a quella sull’uomo. Aspetti imprescindibili da approfondire con la massima attenzione nella fase sperimentale sono i rischi genetici (azione sul DNA), mutageni (induzione di mutazioni), cancerogeni (induzione di tumori) e teratogeni (induzione di malformazioni) di cui la molecola allo studio può rendersi responsabile direttamente o indirettamente. Per ragioni etiche la ricerca tende quando possibile a evitare l’impiego degli animali da esperimento. Nella fase preclinica, che può durare anche 2 o 3 anni, la selezione fra le molecole allo studio è molto severa: si può ragionevolmente calcolare che solo 1 su 104 possa superare questa prima fase, e di queste solo 1 su 10 abbia qualche probabilità di superare la sperimentazione clinica successiva e diventare un farmaco vero e proprio. 13.4 La sperimentazione clinica (clinical trials) Una volta superata la fase di ricerca preclinica, il possibile futuro farmaco viene avviato alla sperimentazione clinica. 196 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario SPERIMENTAZIONE DI NUOVI FARMACI, COMPOSTI GUIDA E FARMACOVIGILANZA Questa fase prevede una serie di studi che hanno l’obiettivo di investigare nell’organismo umano sia gli aspetti legati all’azione farmacodinamica del farmaco (efficacia terapeutica, effetti collaterali o tossici, meccanismo d’azione) che a quella farmacocinetica, cioè assorbimento, distribuzione, metabolismo ed escrezione della molecola. Ogni nuovo farmaco dovrebbe consentire un significativo miglioramento rispetto a quelli già disponibili per la cura della stessa patologia, sia in termini di specifica efficacia terapeutica che come minori effetti collaterali indesiderati. Anche gli aspetti economici sono importanti: l’obiettivo perseguito può essere in questo senso quello di ottenere dal nuovo farmaco lo stesso successo terapeutico ma a costi inferiori. Una sperimentazione clinica può essere infatti rivolta sia a farmaci già in commercio che a nuove molecole. La sperimentazione clinica deve essere condotta in ottemperanza a norme stabilite per legge, secondo le regole della “Buona Pratica Clinica” (GCP: good clinical practice) recepite nel nostro Paese dal D.M. 15/7/1997 e successive modifiche. Alle GCP si affiancano le GLP (good laboratory practice) per i test tossicologici e le GMP (good manufactoring practice) per la fase produttiva. Le regole della buona pratica clinica devono garantire: r il benessere e la sicurezza dei pazienti che partecipano alla sperimentazione r l’attendibilità dei dati, che devono essere riferiti integralmente e con il criterio della massima trasparenza r una loro verifica indipendente r la riservatezza delle informazioni. Per condurre una sperimentazione clinica o uno studio sperimentale è richiesta l’autorizzazione (ASC, Autorizzazione alla Sperimentazione Clinica o, in Italia, Parere Unico) rilasciata dal Comitato Etico del Centro di Coordinamento dello studio (per farmaci già in uso sull’uomo) o dall’Istituto Superiore di Sanità per i farmaci di nuova formulazione. I Comitati Etici sono strutture indipendenti e multidisciplinari, composte da esperti che valutano l’etica e la metodologia della sperimentazione per tutelare i diritti dei pazienti che partecipano ai trials clinici, fornendo loro ogni informazione disponibile, e per ottenere dagli stessi il consenso informato al trattamento. Tale consenso è definito come “decisione del candidato a essere sottoposto a 13 una sperimentazione clinica dopo essere stato informato in merito a natura, significato, conseguenze e rischi della sperimentazione e dopo averne ricevuta adeguata documentazione”. La normativa in vigore fa riferimento alla dichiarazione di Helsinki recepita dalla WMA (World Medical Association) nel 1964 e aggiornata nel 2000, nonché alle norme adottate dalla FDA (Food and Drug Administration) statunitense. La sperimentazione clinica adotta principi e metodi standard, fra cui in particolare (tabella 13.2): r la scelta casuale (random) o mirata dei soggetti sani o malati che partecipano alla sperimentazione r il confronto fra l’efficacia del farmaco sperimentale e quella di un placebo (sostanza che non ha alcun effetto) o di un farmaco noto e già in uso per la stessa patologia r cross-over: alternanza di periodi di somministrazione del farmaco allo studio con altri in cui si somministra placebo o farmaco già noto. In questo modo si cerca di compensare la fluttuazione dei vari stadi di riacutizzazione o remissione della malattia r studio in aperto (open label): somministratore e paziente sono informati della natura del prodotto r singolo cieco: solo lo sperimentatore sa che cosa sta somministrando (farmaco o placebo) r doppio cieco: nessuna delle parti sa se sta utilizzando un farmaco nuovo, un altro già in uso oppure un placebo. 13.5 Le tre fasi dei clinical trials I clinical trials si svolgono in tre fasi (figura 13.4): r studio preliminare (farmacologia clinica) r studio terapeutico pilota (studio di efficacia) r studio terapeutico su larga scala (studio multicentrico). Lo studio preliminare (fase I) La fase preliminare dei clinical trials ha lo scopo di indagare sicurezza e modalità d’azione del farmaco, e viene effettuata su un numero relativamente piccolo di volontari sani. La sperimentazione viene invece condotta, per i farmaci antitumorali, su soggetti già ammalati di tumore, innanzitutto per la non trascurabile tossicità degli antitu197 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 13 SPERIMENTAZIONE DI NUOVI FARMACI, COMPOSTI GUIDA E FARMACOVIGILANZA Tabella 13.2 Caratteristiche e obiettivi principali delle tre fasi dei clinical trials e della farmacovigilanza FASE I SOGGETTI N° TIPO DI STUDIO No random < 20 “In aperto” Sani e malati OBIETTIVI Risposta al farmaco Farmacocinetica Tollerabilità (sicurezza; dose massima tollerata) II No random 10-200 Singolo cieco Malati Effetti tossici Efficacia terapeutica: confronto con placebo o farmaco noto Preclusa durante trattamento con anticoagulanti Possibile interferenza con l’interpretazione di alcuni test diagnostici (per es. della creatina chinasi) III Malati 1000/3000 Doppio cieco Cross-over Farmacovigilanza Malati (IV) Tutti coloro che assumono il farmaco (milioni). Enorme numero di variabili non precedentemente prevedibili morali, ma anche per dare a questi pazienti un’ulteriore possibilità di remissione della patologia. A parte quest’ultimo caso, in generale nella fase preliminare dei trials clinici non si tratta di studiare l’efficacia vera e propria di un nuovo farmaco, quanto piuttosto di verificarne la sicurezza. In pratica, si cerca di appurare come e in che misura possa venire tollerato dall’organismo e di conoscere quale possa essere la sua farmacocinetica, cioè come venga assorbito, metabolizzato ed escreto. Questi dati si ottengono somministrando a un numero limitato di volontari, sotto costante controllo medico, dosi progressivamente più elevate di farmaco per verificarne la tollerabilità. È importante sottolineare che in questa fase è ancora possibile modificare la molecola allo studio, perché se ciò avvenisse in quelle successive occorrerebbe riprendere la procedura di sperimentazione dall’inizio, per evitare il pericolo che intervengano modificazioni in grado di provocare effetti inattesi e indesiderati. Si calcola che in media circa il 70% di molecole venga comunque eliminato in questa fase a causa dell’esito sfavorevole dei test. Controllo post-marketing Conferma efficacia – affinamento dosaggi e formulazione – effetti secondari poco frequenti – sicurezza a lungo termine Effetti tossici rari (1:10 000) e a lunga latenza Lo studio terapeutico pilota (fase II) Questa fase (che può richiedere un periodo medio di 2 anni) coinvolge un certo numero di pazienti affetti dalla patologia per curare la quale il farmaco è allo studio. Si prende in esame quella che viene definita “attività del farmaco”, cioè la sua capacità di produrre nell’organismo le modificazioni desiderate. Punti importanti che vengono definiti in questa fase sono la dose giornaliera e la periodicità della somministrazione, nonché la durata della terapia. Si possono approntare studi di confronto con farmaci di riferimento o con placebo. Lo studio terapeutico su larga scala (fase III) Se il composto allo studio supera la seconda fase, può essere avviato un programma a più ampio raggio anche su base internazionale e su un campione molto più ampio di 198 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario SPERIMENTAZIONE DI NUOVI FARMACI, COMPOSTI GUIDA E FARMACOVIGILANZA pazienti, che potrà fornire risultanze statisticamente probanti in merito all’efficacia del trattamento e agli eventuali effetti collaterali. Ci si rivolge anche a fasce particolari di soggetti, come anziani o bambini, o anche persone affette da patologie particolari, per valutare possibili interferenze o effetti crociati della nuova molecola con altri farmaci impiegati per quelle determinate malattie. 13.6 La registrazione del farmaco e l’immissione in commercio Durante le varie fasi della sperimentazione clinica, compresa la fase III, il farmaco non può essere commercializzato, ma può essere utilizzato solo in ambito ospedaliero sui pazienti che partecipano alla sperimentazione. Una volta superata la fase III, il produttore deve richiedere l’autorizzazione all’immissione in commercio (AIC), che in Italia viene concessa con Decreto Ministeriale dal Ministero della Salute, dopo approvazione dell’Agenzia Italiana del Farmaco (AIFA). Tale autorizzazione vale solo per il paese in cui la sperimentazione è stata condotta: a livello europeo è di competenza dell’EMEA (European Agency for Evaluation of Medicinal products) che rilascia autorizzazioni alla commercializzazione in tutta l’Europa. L’autorizzazione deve essere concessa o respinta entro un termine massimo di 210 giorni. Il nuovo farmaco, dopo il controllo delle autorità sanitarie, viene quindi registrato e immesso in commercio con un nome “di fantasia” che lo contraddistingue. Il foglietto illustrativo che accompagna la confezione riporta in modo schematico e riassuntivo le informazioni raccolte durante le fasi di sperimentazione. L’autorizzazione ha una durata di 5 anni, dopodiché deve essere presentata una nuova richiesta: il rinnovo della concessione, dopo opportuna rivalutazione del rapporto fra rischi e benefici nell’impiego del farmaco da parte degli enti predisposti, ha durata illimitata. L’autorizzazione decade in seguito a mancata commercializzazione del prodotto entro 3 anni o alla sua assenza dal mercato per 3 anni consecutivi. 13.7 Farmacovigilanza Per ogni farmaco registrato e messo in commercio viene esercitata un’azione di vigilanza, che in pratica si può configurare come una fase IV di sperimentazione. 13 L’uso del farmaco da parte di un numero molto alto di pazienti diversi per sesso, età e possibili patologie concomitanti offre una panoramica più esauriente e statisticamente assai significativa in merito soprattutto alla sua sicurezza. Ogni effetto collaterale, anche se è fra quelli già elencati nel foglietto illustrativo allegato, deve essere segnalato al medico, che a sua volta lo trasmetterà al Dipartimento per la farmacovigilanza. Le segnalazioni vengono controllate e valutate e costituiscono uno dei motivi del periodico aggiornamento delle schede e dei foglietti che accompagnano la confezione del farmaco. La farmacovigilanza ha lo scopo di monitorare rischi e benefici dei farmaci una volta che questi siano già entrati in commercio, con particolare attenzione verso quelli di recente introduzione, e coinvolge quindi non solo i ricercatori, ma anche e soprattutto i medici che hanno l’obbligo di osservare nei pazienti cui hanno prescritto il farmaco sia il reale effetto terapeutico che le reazioni inattese e gli eventuali effetti tossici, riportando ai competenti organi di riferimento i risultati della loro azione di monitoraggio. Le procedure di farmacovigilanza si fanno decorrere storicamente dai tragici eventi legati all’assunzione del talidomide in donne gravide (vedi scheda). Le reazioni avverse e gli effetti collaterali possono essere catalogati come: r rari, distinguibili a loro volta in specifici e aspecifici. Nel primo caso si tratta di reazioni legate inequivocabilmente al farmaco in osservazione, nel secondo riguardano reazioni avverse da mettere in relazione con patologie naturalmente diffuse nella popolazione. In questo caso occorre essere in grado di valutare l’aumento di incidenza di tali malattie attribuibile con ogni probabilità al farmaco. È necessario in altri termini misurare la differenza fra l’incidenza naturale della malattia e l’incidenza della medesima malattia indotta dal farmaco e se tale differenza abbia o meno significatività statistica r successivi a trattamenti prolungati, per cui è necessario condurre studi per un periodo di tempo molto lungo, cui teoricamente non è possibile porre un limite (manifestazioni avverse possono intervenire anche dopo molti anni di trattamento) r a lunga latenza, che si rivelano dopo un periodo di tempo tale da rendere difficile individuare il nesso con l’assunzione del farmaco. Un esempio è costituito da patologie giovanili a carico di figli per assunzio199 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 13 SPERIMENTAZIONE DI NUOVI FARMACI, COMPOSTI GUIDA E FARMACOVIGILANZA LA VICENDA DEL TALIDOMIDE Il talidomide (figura 13.5) venne prodotto nel 1950 come farmaco sedativo e antivomito, commercializzato con nomi diversi, e prescritto frequentemente alle donne in gravidanza. Fu ritirato dal commercio nel 1961 in seguito all’evidenza dei suoi effetti teratogeni: le donne che avevano assunto il farmaco partorivano infatti bambini focomelici, con riduzione delle ossa lunghe degli arti o con la completa assenza di braccia o gambe. Responsabile dell’azione teratogena è uno degli enantiomeri (coppia di molecole immagini speculari l’una dell’altra e quindi non sovrapponibili) della molecola, che agisce inibendo la formazione dei vasi sanguigni e compromettendo il regolare sviluppo dell’embrione. Prima di giungere al ritiro dal commercio si scontrarono per una decina d’anni opinioni contrastanti in merito alla possibile tossicità del talidomide, con studi (poi risultati parziali e condotti in modo non sempre corretto) che ne testimoniavano l’innocuità. I primi studi che ne dimostravano l’effetto teratogeno furono pubblicati nel 1961, riportando alla luce anche casi di malformazioni fetali collegabili ne di un certo farmaco da parte delle madri durante la gravidanza (adenocarcinoma in conseguenza di trattamento della madre con dietilstilbestrolo in gravidanza) r da interazione con altri farmaci, reazioni avverse causate dall’impiego contemporaneo di più farmaci diversi nello stesso paziente r relativi a specifici gruppi a rischio. In quest’ultimo caso la farmacovigilanza deve comprendere il confronto fra le reazioni evidenziate in specifiche fasce di popolazione (anziani, bambini ecc.) con quelle in soggetti scelti a caso fra la popolazione. Gli studi descrittivi ai fini del monitoraggio dei farmaci si basano essenzialmente su: r segnalazioni spontanee da parte dei pazienti al proprio medico che le trasmette ai centri specializzati per la farmacosorveglianza r indagini senza controllo parallelo in cui non è previsto il confronto con un gruppo di pazienti di controllo. Questi schemi di monitoraggio sulla tollerabilità dei farmaci dopo la loro registrazione sono al talidomide risalenti al 1957. A distanza di 50 anni (settembre 2012), l’azienda produttrice del farmaco si è scusata con una dichiarazione dell’A.D: “Chiediamo perdono per il fatto che, in quasi 50 anni, non abbiamo trovato un modo per parlarvi, da essere umano a essere umano. Chiediamo che si consideri il nostro lungo silenzio un segnale dello shock che quello che vi accadde provocò in noi”. Gli studi su questa molecola non sono stati comunque abbandonati: sono in corso sperimentazioni per il suo impiego, con formula modificata, nella terapia dell’AIDS e di alcuni tipi di tumore. O N O N H O O Figura 13.5 Formula chimica del talidomide. articolati in più modalità di immissione in commercio: registrata (commercializzazione dopo 5 anni di valutazione), limitata (rilevamento dei ricoveri ospedalieri e dei decessi), controllata (follow up dei pazienti mediante questionari), ristretta (coinvolge solo medici selezionati, in ambito ospedaliero o ambulatoriale). Il metodo di valutazione retrospettiva della tollerabilità del farmaco prevede la raccolta e l’indagine sulle prime 100 000 ricette del nuovo farmaco e l’identificazione di 10 000 pazienti r analisi dei registri nazionali, in cui vengono memorizzate le segnalazioni relative agli eventi patologici che potrebbero essere messi in relazione all’impiego di un certo farmaco. Fonte di informazione privilegiata sono i registri ospedalieri e l’incrocio dei dati riportati (record linkage). Importante l’esperienza inglese iniziata negli anni ’60 del secolo scorso (Oxford record linkage study) e quella finlandese basata sull’incrocio dei dati desunti dai registri nazionali dei tumori, delle malformazioni congenite, delle dimissioni ospedaliere, delle reazioni avverse a farmaci, degli assistiti dal sistema sanitario nazionale. 200 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario ESERCIZI DI VERIFICA 1. Rispondi alle seguenti domande: Cosa si intende in farmacologia per “principio attivo” e per “eccipiente”? Illustra le fasi in cui si articola la cinetica di un farmaco. Di cosa si occupa la farmacodinamica? Quali sono le vie di escrezione dei farmaci? Spiega il concetto di “clearance” di un farmaco. Che cosa si intende per tempo di emivita di un farmaco? In che cosa consiste la sperimentazione preclinica? Illustra le varie fasi dei clinical trails. In che cosa consiste la farmacovigilanza? Come si realizza in pratica? Spiega cosa si intende con i termini di: studio “in aperto”, a singolo cieco, a doppio cieco. 201 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 14 LE CELLULE STAMINALI 14.1 Le prime fasi di sviluppo dell’embrione: il differenziamento cellulare 14.2 Le cellule staminali 14.3 Cellule staminali emopoietiche 14.4 Cellule staminali emopoietiche dal sangue del cordone ombelicale 14.5 Trapianti di cellule staminali emopoietiche (TCSE) 14.6 Patologie in cui è ritenuto valido l’impiego di cellule staminali 14.7 Recenti acquisizioni: le staminali pluripotenti indotte (iPS) 14.8 Riprogrammazione cellulare tramite REAC Le cellule di ogni organismo vivente vanno incontro a progressivi processi fisiologici di usura, in modo differenziato e più o meno rapido a seconda del tessuto di cui fanno parte. Traumi esterni e malattie contribuiscono ad accelerare i fenomeni di invecchiamento, per cui le cellule che muoiono devono essere rimpiazzate. La produzione di nuove cellule che sostituiscano quelle morte non è propria di tutti i tessuti: quello epatico può rigenerarsi velocemente se subisce un danno, l’epitelio del tratto digerente e le cellule del sangue si rinnovano continuamente, nel tessuto epidermico la capacità di rigenerazione e proliferazione cellulare è molto pronunciata. Al contrario le cellule nervose, tranne casi di lentissima rigenerazione degli assoni neuronali in presenza di un corpo cellulare integro, e quelle del muscolo cardiaco perdono la loro capacità rigenerativa dopo la nascita. Le possibilità di rigenerazione di un tessuto dipendono dalla permanenza al suo interno di cellule staminali indifferenziate e da fattori diversi che ne bloccano il differenziamento. 14.1 Le prime fasi di sviluppo dell’embrione: il differenziamento cellulare Cellule staminali embrionali (foto: Nissim Benvenisty). Il differenziamento cellulare consiste nell’acquisizione di caratteri diversi e funzioni specializzate al fine di realizzare una divisione di compiti e funzioni, tipica degli organismi pluricellulari, al contrario di ciò che avviene negli organismi unicellulari in cui tutte le funzioni vitali sono svolte da un’unica cellula. Gli organismi pluricellu- 202 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario LE CELLULE STAMINALI Segmentazione dello zigote: stadio a due cellule (giorno 1) Stadio a quattro cellule (giorno 2) 14 Corpuscolo polare Blastomeri Zona pellucida Nucleo Citoplasma a) Morula (giorno 4) Blastocisti, veduta esterna (giorno 5) Blastocisti, veduta interna (giorno 5) Massa cellulare interna Cavità della blastocisti b) Figura 14.2 Formazione dello zigote dalla blastocisti. Dallo stadio a 8 cellule, morula (a) l’embrione si compatta diventando una blastocisti (b). Trofoblasto Figura 14.1 Primi stadi dello sviluppo embrionale. lari derivano anch’essi da un’unica cellula, l’uovo fecondato, ma questa si trasforma ben presto in una struttura complessa, l’embrione, che dà origine a tessuti e organi specializzati per svolgere funzioni diverse (figura 14.1). Lo sviluppo dell’embrione è innescato dalla fecondazione, durante la quale lo spermatozoo (pronucleo maschile) si fonde, una volta penetrato nel citoplasma dell’uovo, con il pronucleo femminile dando inizio alla divisione cellulare. Le dimensioni dell’uovo sono assai maggiori di quelle dello spermatozoo, dovendo fornire la maggior parte delle sostanze nutritive richieste per lo sviluppo embrionale. L’uovo è circondato da una sottile membrana trasparente chiamata zona pellucida. Immediatamente dopo la fecondazione, il DNA va incontro a ripetuti e rapidi cicli biosintetici cui segue l’avvio della divisione cellulare, detta segmentazione in quanto il citoplasma (l’uovo) si divide all’interno del proprio involucro senza aumentare di dimensioni. Si forma così un ammasso di cellule a forma di mora, che prende appunto il nome di morula. Fra gli stadi di 8 e 16 cellule la superficie della morula diviene più liscia per il progressivo compattamento delle cellule fino a diventare simile a una sfera, mentre gli spazi intercellulari più interni si allargano a formare una cavità centrale o blastocele, ripiena di liquido (figura 14.2). A questo punto la morula è diventata una blastula o blastocisti, in cui si individua un gruppo più consistente di cellule addossate a un polo della sfera (massa cellulare interna), mentre le altre cellule formano il trofoectoderma. Queste ultime, una volta eliminata la membrana pellucida che le ricopre, entrano in strettissimo contatto con la parete dell’utero in cui l’uovo si è impiantato, dando luogo alla placenta, mentre dalla massa cellulare interna derivano l’embrione vero e proprio e alcuni annessi embrionali come il sacco vitellino. In uno stadio successivo alcune cellule, con una complessa serie di movimenti, subiscono un’invaginazione (gastrulazione), mentre compaiono i primi segni della differenziazione morfologica. Di qui in avanti si vanno delineando i tre strati germinativi (foglietti embrionali) che daranno origine a tutte le strutture e i tessuti dell’organismo: 203 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 14 LE CELLULE STAMINALI (A) Solco neurale Piega neurale Placca neurale (B) Notocorda Ectoderma Mesoderma Endoderma Intestino Mesoderma Tubo neurale Notocorda Celoma Cellule della cresta neurale Tubo neurale Intestino (C) Figura 14.3 La neurulazione e lo sviluppo del tubo neurale nella rana. ❖ endoderma, il foglietto più interno da cui traggono origine apparato digerente e respiratorio, pancreas e fegato ❖ mesoderma, lo strato intermedio da cui si formano muscoli, ossa, cuore, vasi sanguigni, apparato urogenitale ❖ ectoderma, il più esterno, che dà origine a epidermide e relativi annessi, sistema nervoso e organi di senso. Dopo la gastrulazione nell’embrione compaiono la notocorda, che darà origine alla colonna vertebrale, e il tubo neurale, che anteriormente è destinato a formare l’encefalo mentre la parte rimanente formerà il midollo spinale (figura 14.3). Fino allo stadio di 8 cellule invece qualsiasi cellula dell’embrione può dare origine a una qualunque parte dell’embrione e dell’adulto. Si tratta quindi di cellule totipotenti in quanto assolutamente indifferenziate. r possono dividersi illimitatamente (capacità di autorinnovamento) e attivamente, dando origine a cloni cellulari (cellule figlie uguali fra di loro e identiche alla cellula madre) r quando si dividono, possono diventare altre cellule staminali, e quindi indifferenziate, oppure avviarsi verso il differenziamento e la specializzazione funzionale. Il differenziamento è espressione di attività geniche diverse e implica la sintesi di proteine specifiche. Le cellule staminali si possono catalogare in base alla loro “potenzialità”: r sono cellule unipotenti quelle che possono dare origine a un solo tipo di cellule differenziate (la cellula staminale epidermica dà origine a cellule cheratinizzate dell’epidermide; le cellule epatiche possono dare origine esclusivamente a cellule epatiche e riescono a ricostituire la massa completa dell’organo partendo appena da ¼ della massa originaria) r sono multipotenti le staminali che possono dare origine ad alcuni tipi di cellule (staminali multipotenti del midollo osseo emopoietico originano più tipi di staminali unipotenti: quelle da cui derivano i globuli rossi e quelle che generano i vari tipi di leucociti e le piastrine) r le staminali pluripotenti possono dare origine a molti tipi cellulari diversi, come nel caso delle cellule del feto e del cordone ombelicale r le cellule staminali totipotenti possono generare ogni tipo di cellula dell’organismo. È importante ricordare che le cellule vegetali possono in certe condizioni compiere il percorso a ritroso tornando da uno stadio differenziato a uno indifferenziato. 14.2 Le cellule staminali Le cellule indifferenziate sono cellule staminali, progenitrici di tutte le cellule di un organismo, caratterizzate dalle seguenti proprietà: r non svolgono attività specifiche, ma costituiscono una sorta di riserva di cellule di ricambio Figura 14.4 Cellule staminali embrionali (fonte: gettyimages). 204 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 14 LE CELLULE STAMINALI bianchi (linfociti, monociti, granulociti) e piastrine. Tali cellule ricreano la popolazione originaria del midollo osseo emopoietico danneggiato in seguito a gravi patologie (aplasia midollare), per esposizione a radiazioni ionizzanti o in seguito a chemio- o radioterapia per il trattamento delle neoplasie. Il sistema emopoietico (figura 14.6) è deputato a generare e rigenerare le cellule del sangue (rossi, bianchi e piastrine). Si calcola che ogni giorno vengano distrutte e ricreate oltre un miliardo di cellule. Le staminali emopoietiche appartengono alle cellule staminali adulte, e si trovano nel sangue periferico, nel midollo osseo e nel sangue del cordone ombelicale, nelle percentuali seguenti: r midollo osseo 1-3% r sangue periferico 0,01-0,1% r sangue cordonale 0,04-0,1% nelle ossa piatte (bacino, sterno, coste, scapole, cranio) e alle estremità delle ossa lunghe come il femore e l’omero. Nel midollo osseo si trovano anche cellule staminali non emopoietiche che producono cellule del tessuto adiposo, cartilagineo e osseo (cellule mesenchimali). Le cellule staminali emopoietiche si prelevano dal midollo osseo, dal sangue periferico (dopo opportuno trattamento farmacologico sul donatore, nel cui sangue di conseguenza le cellule staminali aumentano notevolmente rispetto alla concentrazione standard) o anche dal sangue prelevato dal cordone ombelicale. Le cellule staminali emopoietiche possono essere prelevate da un donatore sano e trapiantate per infusione in un soggetto sottoposto a trattamento chemio- o radioterapico o colpito da gravi malattie del sangue. È da sottolineare che le indicazione terapeutiche per un trapianto di midollo osseo si vanno continuamente ampliando dal lontano 1957, quando Thomas e i suoi collaboratori effettuarono i primi tentativi di intervento. Il problema fondamentale da risolvere è indubbiamente quello della compatibilità fra donatore e ricevente: per questo i donatori vengono in primo luogo ricercati fra i Il principale e più importante organo emopoietico è il midollo osseo, che svolge questa funzione a iniziare dal 5°-6° mese della vita fetale. L’attività emopoietica è a carico del midollo rosso, che nella vita adulta si trova Linfocita T Immunità cellulare Plasmacellula Linfocita B Precursore linfoide Immunità umorale Cellula natural killer (K) Cellula staminale pluripotente Attività citolitica Cellula dendritica Stabiliscono contatti con il microambiente e presentano gli antigeni ai linfociti T. Azione fagocitaria ? Neutrofilo Precursore granulocita/ monocita Precursore mieloide Eosinofilo Difesa contro i parassiti e intervento nelle allergie Basofilo Infiammazione e reazioni allergiche Azione fagocitaria Monocita Macrofago Coagulazione del sangue Precursore megacariocita/ eritrocita Megacariocita Piastrine Trasporto dell’ossigeno e della CO2 Eritrocita Figura 14.6 Il sistema emopoietico. Le cellule del sangue derivano da cellule staminali pluripotenti del midollo osseo da cui originano, in primo luogo le linee cellulari linfoide e mieloide e, in secondo luogo, i diversi tipi cellulari. 206 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario LE CELLULE STAMINALI consanguinei (fratelli o sorelle). Purtroppo una ricerca di questo tipo ha risultati positivi solo in un quarto circa dei casi: occorre allora effettuare la ricerca nel registro internazionale dei donatori di midollo osseo. 14.4 Cellule staminali emopoietiche dal sangue del cordone ombelicale La ricerca di donatori compatibili incontra notevoli difficoltà anche perché richiede tempi molto lunghi (anche mesi) prima che sia coronata da successo. Per superare queste difficoltà sono state utilizzate fin dal 1988 cellule staminali embrionali prelevate dal cordone ombelicale. Le cellule del sangue cordonale permettono infatti di superare, anche se non completamente, i problemi di compatibilità in virtù della loro relativa immaturità immunologica, consentendo di effettuare trapianti anche fra soggetti non completamente compatibili. Viene bypassato in questo modo il requisito essenziale e imprescindibile nel caso dei trapianti con cellule staminali di tipo adulto. Per rendere più funzionale il sistema dei trapianti sono state create vere e proprie banche, dove vengono inviate le unità di sangue cordonale raccolte in sala parto e condotte opportune analisi per verificarne la conservabilità e stabilirne il profilo immunologico ai fini della compatibilità. Questi dati vengono quindi trasmessi al Registro Internazionale dei Donatori di Midollo Osseo che li rende universalmente disponibili e consultabili. La rete italiana comprende 18 banche del sangue cordonale tutte in ambito pubblico, la cui attività è coordinata dal Centro Nazionale Sangue e dal Centro Nazionale Trapianti. Le unità di sangue cordonale conservate in queste banche sono destinate a trapianti allogenici: sono cioè a disposizione della società, o anche per impiego riservato a familiari del nascituro che mostrino patologie curabili con tali cellule, oppure a pazienti provenienti da famiglie a rischio di avere figli affetti da malattie genetiche. 14.5 Trapianti di cellule staminali emopoietiche (TCSE) Il trapianto di cellule staminali emopoietiche consiste nella loro infusione endovena in un soggetto ricevente. In tali 14 pazienti viene precedentemente indotta per via farmacologica un’aplasia midollare massiva e irreversibile, con la conseguente soppressione dell’autonoma funzione emopoietica. Il midollo osseo del paziente contiene infatti, insieme con le cellule ancora sane, le cellule neoplastiche acquisite per malattia o preesistenti per un difetto genetico. Tutto il tessuto emopoietico viene quindi eliminato e sostituito con le cellule emopoietiche del donatore sano. Un simile tipo di trapianto viene definito allogenico (cellule provenienti da un donatore compatibile) per distinguerlo da quello di tipo autogenico, in cui le cellule trapiantate sono prelevate e reinfuse nello stesso paziente. Questa tecnica ha aspetti e problematiche particolari e verrà discussa più avanti. La tecnica del trapianto allogenico prevede l’infusione di un elevato numero di cellule staminali sane (almeno 108 cellule per kg di peso corporeo del ricevente). Il paziente che deve ricevere il midollo deve essere adeguatamente preparato al trapianto, e viene sottoposto per questo a un trattamento chemio- e radioterapico per la soppressione della propria attività midollare emopoietica. Tale trattamento prende il nome di regime di condizionamento: rappresenta infatti la condizione sine qua non per il successo del trapianto. L’obiettivo del condizionamento è duplice: eliminare le cellule midollari malate e disattivare il sistema immunitario del ricevente. In questo modo le cellule staminali emopoietiche del donatore hanno la possibilità di attecchire, fenomeno reso evidente nel soggetto ricevente dalla ricomparsa in circolo prima dei granulociti (globuli bianchi), poi di piastrine e infine dei globuli rossi. Le cellule sane trapiantate svolgono due funzioni: r sostituiscono quelle del midollo emopoietico distrutto dal condizionamento r eliminano le cellule malate eventualmente residue dopo il trattamento chemio- e radioterapico. Questo compito è svolto da alcuni tipi di globuli bianchi: i linfociti e i granulociti. Nel trapianto allogenico il midollo emopoietico può provenire da: r un componente dello stesso nucleo familiare del ricevente, preferibilmente un fratello o una sorella. Se il donatore è un gemello omozigote il trapianto viene definito singenico r un soggetto estraneo volontario iscritto al Registro dei Donatori di Midollo Osseo 207 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 14 LE CELLULE STAMINALI ANALISI PER LA COMPATIBILITÀ Il successo di un trapianto di cellule staminali emopoietiche dipende in primo luogo dalla compatibilità tissutale fra donatore e ricevente. Nel determinare il grado di istocompatibilità intervengono le proteine MHC, la cui sintesi è codificata dai geni del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC, major histocompatibility complex) presente in tutti i mammiferi. Il sistema MHC (tabella 14.1) è localizzato sul cromosoma 6 e comprende 140 geni; è caratterizzato da un elevato polimorfismo, dal momento che ogni gene può essere presente in più forme alleliche. Nell’uomo le proteine MHC vengono anche chiamate antigeni HLA (human leukocytes antigen) e sono suddivise in classi: r proteine MHC di classe I (antigeni HLA di classe I). Si trovano sulla membrana di tutte le cellule dell’organismo, caratterizzano i tessuti di ogni individuo e sono responsabili del rigetto dei trapian- ti. Presentano gli antigeni ai linfociti T citotossici (processazione e presentazione degli antigeni) r proteine MHC di classe II (antigeni HLA di classe II). Sono presenti solo su alcuni tipi cellulari come i linfociti B, i macrofagi e le cellule dendritiche. Queste ultime si trovano in vari tessuti dell’organismo con la funzione di catturare gli antigeni e di esporli insieme alle proteine MHC. Le proteine MHC di classe II presentano gli antigeni ai linfociti T helper e facilitano l’attivazione dei linfociti B r proteine MHC di classe III: proteine citotossiche, componenti del complemento e citochine. Le reazioni di rigetto dei trapianti sono tanto minori quanto più donatore e ricevente risultano compatibili per il sistema MHC/HLA oltre che per quelli AB0 e Rh. Questi sistemi sono identici solo nei gemelli omozigoti. Tabella 14.1 Caratteristiche delle proteine MHC di classe I e II CLASSE I CLASSE II Loci genetici H-2K, H-2D, H-2L nel topo; HLA-A, HLA-B, HLA-C nell’uomo Gruppi H-2A e H-2E nel topo; DP, DQ, DR e molte altre nell’uomo Distribuzione cellulare Maggior parte delle cellule nucleate Cellule che presentano l’antigene (comprese le cellule B), cellule epiteliali timiche, alcune altre Coinvolte nella presentazione dell’antigene Cellule T citotossiche Cellule T helper Origine dei frammenti peptidici Proteine prodotte nel citosol Membrane plasmatiche endocitate e proteine extracellulari Domini polimorfici α1 + β2 α1 + β1 r un’unità di sangue del cordone ombelicale conservata in una banca di sangue cordonale. Il trapianto autogenico (autologo) consiste nel prelievo di midollo emopoietico da un paziente immediatamente dopo un ciclo di chemioterapia, periodo in cui le cellule tumorali sono presumibilmente ancora poche. Il paziente viene quindi sottoposto a un ulteriore trattamento di chemioterapia ad alte dosi e/o a una radioterapia prima di procedere alla reinfusione delle cellule staminali precedentemente prelevate. Tale procedimento terapeutico si applica a determinate patologie, con l’obiettivo di consolidare l’effetto dei trattamenti chemio- e radioterapici, ma presenta inconvenienti legati alla probabile permanenza di cellule malate nel midollo reinfuso e nella pressoché completa assenza della reazione citotossica nei confronti delle residue cellule malate, che non possono essere riconosciute come estranee da quelle reinfuse dal momento che appartengono allo stesso soggetto. Queste considerazioni non depongono al momento a favore della conservazione del sangue del proprio cordone ombelicale in vista di un eventuale suo riutilizzo per il verificarsi di possibili future patologie. 208 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario LE CELLULE STAMINALI La conservazione del sangue cordonale è invece indicata quando se ne preveda l’utilizzo in ambito intrafamiliare (conservazione dedicata), nel caso di famiglie a rischio di specifiche patologie e in cui un membro sia già colpito da una malattia congenita per cui è indicato il trapianto di midollo emopoietico. Un caso emblematico è rappresentato dalla talassemia. 14.6 Patologie in cui è ritenuto valido l’impiego di cellule staminali Le patologie per cui fin dall’inizio delle ricerche dedicate alle cellule staminali è stata raccomandata la tecnica del trapianto di midollo emopoietico sono le leucemie mieloidi e linfoidi acute. Nelle leucemie croniche il trapianto è indicato solo nel caso di fallimento della terapia medica, considerati gli enormi progressi fatti registrare in questo campo. Le indicazioni terapeutiche si sono progressivamente allargate a comprendere molte patologie diverse, ma i trapianti di midollo si dimostrano validi soprattutto nelle terapie di recupero dopo l’esposizione dei pazienti a dosi elevate di chemio- e radioterapia. In questi casi la terapia non viene indirizzata in modo primario sul midollo osseo: quest’ultimo viene distrutto o gravemente danneggiato come effetto collaterale delle massicce dosi di chemioterapia o radioterapia dirette verso altri organi o tessuti colpiti da neoplasie. Se non supportati da trapianto midollare, questi trattamenti provocherebbero con ogni probabilità la morte del paziente. Il midollo osseo è infatti uno dei tessuti più sensibili alle attuali terapie antineoplastiche. Il trapianto di cellule staminali emopoietiche ha dato risultati positivi anche nel mieloma multiplo o plasmocitoma, patologia in cui le cellule tumorali producono una proteina anomala. Anche la talassemia o anemia mediterranea può essere vantaggiosamente curata con TCSE, così come alcuni rari errori congeniti del metabolismo. Un’altra indicazione terapeutica riguarda le malattie autoimmuni che non rispondono alle cure convenzionali. Si riporta di seguito un elenco delle patologie per cui risulta indicato il trapianto di midollo (fonte: Ministero della Salute): r aplasia midollare r leucemie acute linfoidi e mieloidi r r r r r r r r r r r 14 leucemia mieloide cronica mielofibrosi con metaplasia mieloide linfoma non-Hodgkin linfoma di Hodgkin leucemia linfatica cronica mielodisplasia mieloma multiplo neuroblastoma sarcoma dei tessuti molli immunodeficienze alcune malattie autoimmuni. 14.7 Recenti acquisizioni: staminali pluripotenti indotte (iPS) Il premio Nobel per la medicina 2012 è stato assegnato all’inglese John Gurdon e al giapponese Shinya Yamanaka (figura 14.7) per i loro studi sulla riprogrammazione cellulare. La scoperta, che può a buon diritto essere definita rivoluzionaria, riguarda l’inserimento di geni nel nucleo di cellule adulte (mature) che possono venire “riprogrammate” per diventare embrionali pluripotenti. Le motivazioni che hanno spinto questi scienziati a intraprendere la strada della riprogrammazione cellulare ha preso le mosse dalla necessità di superare due criticità che limitano l’impiego delle cellule staminali embrionali. La prima motivazione è di ordine immunologico, in quanto queste cellule vengono riconosciute come estranee dall’organo in cui vengono trapiantate scatenando quindi una reazione immunitaria; la seconda è di natura etica: la manipolazione di cellule embrionali provoca necessariamente la distruzione dell’embrione stesso. Figura 14.7 I premi nobel per la Medicina 2012. A sinistra l’inglese John Gurdon e a destra il giapponese Shinya Yamanaka. 209 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 14 LE CELLULE STAMINALI La scoperta che possono essere ottenute cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) attraverso una riprogrammazione nucleare può permettere di superare brillantemente questi limiti. L’idea da cui lo scienziato giapponese e il collega inglese (noto per ricerche sulla clonazione) sono partiti prende le mosse dalla clonazione della famosa pecora Dolly, resa possibile dal trasferimento del nucleo di una cellula somatica adulta nell’ovulo denucleato di una pecora “ospite” nel cui utero l’ovulo così trasformato è stato impiantato. Il nucleo della cellula adulta così trasferito può riprogrammarsi trasformandosi in cellula embrionale da cui può trarre origine un intero organismo (come è appunto avvenuto nel caso della pecora Dolly). Le ricerche hanno portato alla scoperta di quattro geni fondamentali che governano la vita delle cellule staminali. Questi geni sono stati isolati dagli ovociti di topo e trasferiti all’interno del nucleo di cellule adulte prelevate dalla pelle di topo. Queste ultime si sono trasformate in cellule embrionali, denominate cellule staminali pluripotenti indotte (iPS). La tecnica prevede il prelievo di cellule cutanee (fibroblasti) con una piccola biopsia cutanea e la loro coltura in piastra. I geni che inducono la riprogrammazione vengono introdotti nel nucleo di queste cellule per mezzo di vettori retrovirali (capitolo 7). Nel tempo di un mese queste cellule diventano iPS, occorrono poi almeno due settimane per la loro espansione in coltura e altre quattro per ottenere la loro differenziazione, che si può realizzare in direzione di qualsiasi tessuto. La scoperta sembra aprire nuove prospettive nella terapia dell’infarto del miocardio con la sostituzione di nuovi cardiomiociti (cellule della muscolatura contrattile del cuore) al posto di quelli morti. Le cellule iPS possono essere indotte a differenziarsi anche come neuroni: questo lascia intravvedere la possibilità di riparare lesioni spinali. Un aspetto che può rivelarsi decisivo nella possibile riparazione delle menomazioni neuronali spinali è rappresentato dalla necessità di intervenire con urgenza, il che è possibile solo se si dispone di una riserva di iPS sempre disponibili. Si può quindi ipotizzare di creare vere e proprie “banche di iPS”, come avviene per le banche del sangue, anche se esiste una differenza sostanziale fra i gruppi sanguigni (quattro) e i tipi cellulari diversi (oltre diecimila). L’ideale sarebbe trovare una sorta di tipo cellulare paragonabile al gruppo sanguigno 0 (zero), che come noto è donatore universale. Si calcola comunque che con almeno 150 tipi di iPS si possa coprire il 90% della popolazione. Uno degli aspetti più significativi di questa scoperta consiste nella possibilità di introdurre le cellule originate da iPS nello stesso paziente da cui sono state prelevate le cellule da riprogrammare, eliminando in questo modo all’origine i problemi di incompatibilità immunologica. È possibile quindi ottenere cellule sane da individui malati. Nuovi indirizzi di ricerca sono volti alla individuazione di vettori non retrovirali, da impiegare per l’introduzione dei geni all’interno delle cellule da riprogrammare, al fine di evitare qualsiasi rischio di dereprimere o comunque indurre l’espressione di geni oncògeni (oncogèni) che potrebbero indurre tumori. Sono in ogni caso da chiarire diversi aspetti ancora non sufficientemente delineati, quali la possibilità che vengano trapiantate cellule iPS non completamente differenziate. Anche questo potrebbe scatenare l’insorgenza di tumori, che infatti in ultima analisi sono eventi derivati da una riprogrammazione del nucleo cellulare. 14.8 Riprogrammazione cellulare tramite REAC Nel novembre 2012 sono stati annunciati dal team di ricercatori dell’Università di Bologna guidati da Carlo Ventura i risultati degli studi (pubblicati su Cell transplantation) relativi a una nuova tecnica di riprogrammazione delle cellule adulte che sembra costituire l’evoluzione delle scoperte dei Nobel Yamanaka e Gurdon. Gli scienziati bolognesi hanno ottenuto una riprogrammazione cellulare diretta di fibroblasti adulti verso destini cellulari diversi (cardiaco, muscolare, neuronale) senza la necessità di fare prima regredire le cellule adulte a uno stadio embrionale. La riprogrammazione cellulare diretta è stata ottenuta per mezzo di campi radioelettrici a bassissima intensità (REAC, radio electric asymmetric conveyer). Questa tecnica aggira sia l’uso di vettori virali che di tecniche di ingegneria genetica, evitando quindi rischi tumorali o di altro tipo, legati alla modulazione dell’espressione genica, e rende disponibili cellule staminali immediatamente utilizzabili e sicure. Anche questa scoperta sembra confermare che proprio utilizzando i fibroblasti e con meccanismi di riprogrammazione come il REAC si può arrivare a processi generali di riparazione e rigenerazione di organi e tessuti danneggiati da varie patologie. 210 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario ESERCIZI DI VERIFICA 1. Rispondi alle seguenti domande: Spiega il significato dei termini morula, blastula e gastrula. Come vengono chiamati i tre foglietti embrionali e a quali tessuti e organi danno origine? Quali sono le proprietà delle cellule staminali? Come vengono classificate le cellule staminali in base alla loro potenzialità? Cosa sono e dove si trovano le cellule staminali emopoietiche? Dove si possono trovare nell’uomo le cellule staminali adulte? Cosa si intende per trapianto autogenico (autologo) e allogenico? In che cosa consiste il “regime di condizionamento” in un paziente che deve subire un trapianto di cellule staminali? Come si può stabilire la compatibilità tissutale per un trapianto di cellule staminali? Che cosa sono le cellule staminali pluripotenti indotte (IPS)? 211 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 15 INQUINANTI XENOBIOTICI E MUTAGENESI AMBIENTALE 15.1 Genotossicità e cancerogenesi 15.2 Le mutazioni: alcune nozioni indispensabili 15.3 Mutageni fisici 15.4 Mutageni chimici 15.5 Fonti di esposizione a sostanze chimiche Gli organismi viventi sono quotidianamente esposti all’azione di composti sia di origine naturale che di sintesi, prodotti artificialmente dall’uomo e per questo denominati xenobiotici, cioè estranei alla composizione dell’ambiente naturale. Una delle conseguenze più preoccupanti dell’esposizione alle sostanze xenobiotiche diffuse nell’ambiente è la loro capacità di indurre modificazioni nel genoma degli organismi con cui vengono a contatto: i possibili effetti mutageni di queste sostanze, che molto spesso hanno come conseguenza modificazioni cellulari in senso neoplastico, costituiscono oggetto degli studi di mutagenesi ambientale. 15.6 Meccanismi di riparazione del DNA 15.7 Destino degli xenobiotici nell’organismo 15.8 Metabolismo degli xenobiotici 15.9 Tossicogenetica e polimorfismi metabolici 15.10 Esempi di attivazione metabolica 15.11 Controlli di genotossicità su matrici ambientali 15.1 Genotossicità e cancerogenesi Un agente tossico, naturale o meno, provoca nell’organismo effetti negativi più o meno gravi, a volte anche con esito letale. Gli agenti genotossici inducono cambiamenti nel DNA: l’informazione genetica subisce in qualche misura modificazioni (mutazioni) che, se non vengono riparate dai sistemi cellulari di riparazione, diventano stabili. La valutazione di genotossicità di un agente chimico o fisico equivale quindi a verificare la sua capacità di alterare la struttura del DNA o i suoi meccanismi di replicazione. Il verificarsi di mutazioni somatiche può scatenare fenomeni di cancerogenesi, cioè dare origine a tumori, patologie riconducibili a qualche alterazione del DNA. Se quindi nell’ambiente si diffondono agenti mutageni, ci si può purtroppo attendere fenomeni di genotossicità 212 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario INQUINANTI XENOBIOTICI E MUTAGENESI AMBIENTALE e un conseguente rischio cancerogeno. La relazione di interdipendenza fra mutagenicità e cancerogenicità è confermata dal test di Ames, che impiega ceppi batterici su cui vengono saggiate sostanze chimiche o agenti fisici per valutarne l’azione mutagena e quindi la potenziale cancerogenicità. Se le mutazioni riguardano la linea germinale possono essere ereditate. Le conseguenze non si osserveranno nell’individuo che le ha subite, ma nella progenie a cui sono trasmesse, con effetti anche molto gravi: gli agenti teratogeni inducono anomalie nello sviluppo embrionale, nel feto o nel neonato. Agenti fisici (radiazioni), molte sostanze chimiche e alcuni farmaci, se assunti durante la gravidanza, possono avere effetto teratogeno. I danni provocati al regolare sviluppo dell’embrione possono condurre all’aborto o a malformazioni congenite di varia gravità. Quando le mutazioni si verificano nelle cellule somatiche, come in effetti avviene più di frequente, non vengono naturalmente trasmesse alle generazioni successive. 15.2 Le mutazioni: alcune nozioni indispensabili La variabilità genetica, che si verifica con i processi di ricombinazione e con le mutazioni, è alla base dei fenomeni di selezione naturale. Le mutazioni consistono in cambiamenti all’interno del genoma che, in quanto tali, sono trasmessi alla progenie: si tratta di fenomeni rari, improvvisi e casuali. Negli organismi con corredo cromosomico diploide i cromosomi di ogni coppia (cromosomi omologhi) contengono gli stessi geni disposti nello stesso ordine lungo il filamento di DNA, anche se i geni di ogni coppia di cromosomi omologhi (alleli) possono non essere uguali. Si può ragionevolmente pensare che le varie forme alleliche di un gene siano generate da altrettante mutazioni. Il genotipo è espresso in modo manifesto nel fenotipo (l’insieme delle caratteristiche visibili) e poiché gli alleli possono essere dominanti o recessivi, le mutazioni dominanti vengono espresse fenotipicamente anche nella condizione eterozigote (presenza in un solo allele), mentre quelle recessive sono espresse solo allo stato omozigote (mutazione presente in entrambi gli alleli). Quanto sopra non vale per gli organismi aploidi (batteri, virus), in cui il cromosoma è unico e le mutazioni vengono 15 espresse sempre e comunque nella stessa generazione in cui si verificano. Le mutazioni possono riguardare le cellule somatiche o quelle germinali (figura 15.1). Se le mutazioni somatiche coinvolgono geni che regolano la crescita cellulare, si può avere la trasformazione della cellula in senso tumorale. Mutazioni somatiche generano cloni di cellule che possono coesistere in uno stesso tessuto con cellule normali non mutate; tali mutazioni non sono ovviamente trasmissibili alla discendenza. Le mutazioni che si verificano nelle cellule germinali sono trasmesse in tutte le cellule dell’embrione generato da quelle cellule germinali. Le mutazioni nella linea germinale non hanno quindi effetto nell’individuo colpito, ma possono manifestarsi nella discendenza come gravi malattie genetiche. Si possono distinguere tre tipi fondamentali di mutazioni: ❖ geniche: interessano singoli geni e si possono verificare per sostituzione, inserzione o delezione di basi. Queste ultime (mutazioni frameshift) portano allo scorrimento (shift) del modulo o cornice (frame) di lettura delle triplette di basi a valle del sito di mutazione, con conseguente profonda alterazione del messaggio genetico ❖ cromosomiche: hanno un bersaglio più ampio e riguardano la struttura di interi cromosomi (aberrazioni cromosomiche) ❖ genomiche: interessano l’intero genoma e consistono in variazioni del numero complessivo di cromosomi: poliploidia (numero di cromosomi multiplo di quello caratteristico della specie) e aneuploidia (quando manca un esponente di una coppia oppure un membro è presente più volte). Le mutazioni si distinguono in spontanee e indotte. Le prime avvengono senza l’intervento di agenti esterni con una frequenza molto bassa (1/10–4–1/10–9). Quelle indotte sono causate da numerosi agenti mutageni, chimici o fisici. Le mutazioni spontanee nell’organismo umano possono rientrare nel normale processo di turnover cellulare dei tessuti oppure, caso ovviamente molto grave, indirizzare la cellula verso la trasformazione tumorale: la cancerogenesi è attivata dall’accumulo di mutazioni che possono rendersi evidenti solo dopo molti anni, per cui la probabilità di ammalarsi di tumore aumenta con l’età. 213 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario INQUINANTI XENOBIOTICI E MUTAGENESI AMBIENTALE Vento Freddo Pioggia Caldo Acqua Ventilazione Gas Ventilazione Materiale da costruzione Scarico Pressione Diffusione Figura 15.2 ll radon nelle abitazioni. Fonti di radon (A) e sistemi di dispersione (A). 15 Gli effetti biologici delle radiazioni sono diversi da quelli causati da agenti chimici. Sono infatti indipendenti dal metabolismo, dal tipo di organismo che subisce l’esposizione e dalla sua complessità strutturale: le radiazioni agiscono direttamente sul DNA cellulare. Gli effetti delle radiazioni sono diversi a seconda del loro contenuto energetico: quelle ionizzanti (raggi X e γ) trasferiscono alte quantità di energia e provocano la ionizzazione degli atomi, cioè la perdita definitiva di uno o più elettroni. Le radiazioni a energia inferiore (UV) non riescono a spezzare il legame fra nucleo ed elettrone, ma si limitano a eccitare l’atomo: provocano in pratica la transizione reversibile di elettroni da un’orbita a un’altra senza destabilizzare l’atomo. Radiazioni ionizzanti Le radiazioni ionizzanti come i raggi X e i raggi γ provocano un danno diretto sul DNA causando nelle strutture biologiche alterazioni dovute alla capacità di strappare Figura 15.3 Lo spettro elettromagnetico. 215 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 15 INQUINANTI XENOBIOTICI E MUTAGENESI AMBIENTALE Effetto indiretto Fo to n e e- dove i simboli con un pallino nero indicano radicali liberi. È indispensabile tenere presente che, se da una parte il danno si verifica in tempi velocissimi, dall’altra gli effetti biologici dell’azione dei radicali liberi si manifestano anche dopo molti anni. p+ Radiazioni non ionizzanti Effetto diretto Fo e to n ep+ 1 nm 2 nm Figura 15.4 Radiazioni. In figura sono mostrati i danni diretti e indiretti delle radiazioni. elettroni da atomi o molecole, oppure ionizzano altri atomi o molecole diverse dagli acidi nucleici che, a loro volta, agiscono sul DNA (danno indiretto, figura 15.4). Una delle conseguenze delle radiazioni ionizzanti è la formazione di radicali liberi: atomi, molecole, gruppi atomici in cui sull’orbita elettronica esterna è presente un elettrone spaiato dopo che l’altro è stato “strappato” dall’energia di ionizzazione. I radicali liberi sono specie chimiche altamente instabili e reattive, che tendono a riacquistare l’elettrone mancante o a cedere quello spaiato a molecole con ruolo biologico centrale come DNA, enzimi, proteine: il danno innesca nelle strutture cellulari reazioni a catena complesse e imprevedibili. Se si considera per esempio che le strutture biologiche sono composte in gran parte di acqua, appare estremamente importante nella formazione di radicali liberi il fenomeno noto come fotolisi dell’acqua, che consiste nell’assorbimento da parte della molecola di energia sufficiente a provocare l’allontanamento di un elettrone: irradiazione + H2O H2O+ + e– – e + H2O H2O– + + H2O H + OHt – H2O Ht + OH– Sono rappresentate dalle radiazioni UV, che vengono distinte in radiazioni UVA (> 315 nm), UVB (280-315 nm), UVC (< 280 nm). Tali radiazioni determinano la liberazione di energia quando un elettrone, eccitato e quindi passato su un’orbita più esterna, torna nell’orbita primitiva restituendo l’energia accumulata come aumento di temperatura. Ciò può attivare reazioni fotochimiche che non potrebbero altrimenti avvenire. Fonti di esposizione sono il sole, le cui radiazioni UV più dannose a corta e media lunghezza d’onda sono filtrate dallo strato di ozono, ma che comunque, se l’esposizione è intensa e prolungata, possono provocare tumori alla pelle; le lampade UV, costruite con quarzo al posto del vetro (impermeabile agli UV) e contenenti vapori di mercurio, xenon o idrogeno. Gli effetti biologici si registrano sul DNA e consistono nella formazione di dimeri fra le basi pirimidiniche. Danni biologici delle radiazioni I danni biologici delle radiazioni si manifestano a livello molecolare o cellulare. Danni molecolari Si possono distinguere in base all’effetto di eccitazione o di ionizzazione che sono in grado di provocare: r le radiazioni UV (non ionizzanti) provocano negli acidi nucleici la formazione di dimeri fra due timine adiacenti sullo stesso filamento di DNA r le radiazioni ionizzanti provocano l’eliminazione di basi azotate o legami crociati DNA-proteine ad opera dei radicali liberi. Danni cellulari Comprendono alterazioni a livello delle strutture cellulari (membrane plasmatiche, citoplasma e nucleo). Le membrane plasmatiche vengono danneggiate da pro- 216 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario INQUINANTI XENOBIOTICI E MUTAGENESI AMBIENTALE Luce ultravioletta T A T A Dimero di timina A T T A G C 15 il meccanismo con cui in primo luogo si esercita la loro cancerogenicità. È possibile distinguere fra: r mutageni diretti, sostanze chimiche che interagiscono direttamente con il DNA r promutageni, molecole di per sé non reattive ma che lo diventano ad opera delle trasformazioni subite nel metabolismo r mutageni indiretti, in grado di interagire con molecole o strutture biologiche interessate alla replicazione del materiale genetico. Molti mutageni indiretti vengono utilizzati come antitumorali. Mutageni diretti cessi di perossidazione dei lipidi e di ossidazione dei gruppi sulfidrilici delle proteine. Ciò conduce a pesanti modificazioni della fluidità e della permeabilità delle membrane con conseguente morte della cellula. Tale evento finale si può verificare come incapacità riproduttiva in cellule che dovrebbero attivamente riprodursi (cellule staminali del midollo emopoietico) oppure come attivazione dell’apoptosi. L’apoptosi è una sorta di morte cellulare programmata (suicidio cellulare) che si verifica normalmente nello sviluppo embrionale o nell’adulto per evitare la trasformazione neoplastica di cellule, che vengono così avviate all’autoeliminazione. In tali cellule si assiste alla condensazione del DNA in masse che funzionano come segnale di riconoscimento per i fagociti che quindi le digeriscono. Queste sostanze agiscono direttamente sul DNA anche senza l’intervento di sistemi metabolici. Comprendono: r analoghi delle basi: sostanze dotate di una qualche analogia di struttura con le basi azotate e che vengono erroneamente incorporate nel DNA (5-bromouracile; 2-aminopurina) r agenti che reagiscono con il DNA: acido nitroso; idrossilammina; idrazine (industria chimica, propellenti e chemioterapici); agenti alchilanti; psoraleni (presenti negli agrumi o sintetici, subiscono fotoattivazione da UV formando addotti con il DNA e bloccandone la replicazione: vengono impiegati per la terapia della psoriasi, malattia dell’epidermide con iperproliferazione cellulare); epossidi (di etilene e di propilene nelle resine epossidiche, nei processi di verniciatura e incollaggio, pesticidi come il dieldrin e l’eldrin, intermedi metabolici di IPA e stirene); aldeidi (mobili, pitture murali e detergenti contengono formaldeide che forma addotti con i gruppi aminici delle basi azotate e provoca mutazioni puntiformi nonché inibizione di RNA e DNA polimerasi) r agenti intercalanti: le acridine (sostanze coloranti come l’arancio di acridina) e il bromuro di etidio sono mutageni fra i più noti, inducono inserzione o delezione di basi provocando mutazioni da scivolamento nello schema di lettura. 15.4 Mutageni chimici Promutageni La varietà delle sostanze chimiche cui è esposto l’organismo è enorme e la loro azione mutagena sembra essere Comprendono sostanze che sono convertite in derivati reattivi da parte di reazioni metaboliche: G C T A T A A C G C Figura 15.5 Formazione di dimeri di timina. 217 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 15 INQUINANTI XENOBIOTICI E MUTAGENESI AMBIENTALE r ammine aromatiche: impiegate nell’industria come antiossidanti, nella preparazione di coloranti, nell’industria petrolchimica e della gomma, si originano dalla combustione di materiale organico (cottura alimenti e fumo di sigaretta). Composti correlati con le ammine aromatiche sono gli azocoloranti e le ammine eterocicliche (per es. il colorante rosso metile) r IPA: benzo[a]pirene, antracene, fenantrene ecc. r benzene, stirene: presenti nel fumo di sigaretta, nei gas di scarico degli autoveicoli, prodotti durante la cottura di alcuni cibi. Si trasformano in nitroderivati per azione degli ossidi d’azoto atmosferici r aflatossine, sostanze genotossiche e cancerogeni epatici tra i più potenti, prodotte da Aspergillus spp. nelle granaglie e nei cibi contaminati da queste muffe r nitrosammine si originano per nitrosazione delle ammine a opera dei nitriti nello stomaco o per il metabolismo batterico intestinale (tabacco, alimenti conservati con l’impiego di nitrati e nitriti) r carbammati, impiegati come anticrittogamici e, in particolare, i ditiocarbammati utilizzati nell’industria della gomma, in quella tessile e degli adesivi r idrocarburi alogenati utilizzati in agricoltura e nell’industria chimica, si possono formare nella potabilizzazione dell’acqua quando viene impiegato cloro. Il cloruro di vinile viene biotrasformato nell’organismo dal citocromo P450 e forma addotti con il DNA, altri alcheni formano epossidi altamente genotossici. Mutageni indiretti Comprendono agenti chimici utilizzati come antimetaboliti o inibitori della crescita: r bleomicina: chemioterapico per la cura dei linfomi e altri carcinomi. Reagisce con il DNA in presenza di ioni ferro e ossigeno dando origine alla forma attivata r mitomicina: un antibiotico impiegato come antitumorale isolato da Streptomyces caespitosus r antracicline: gruppo di sostanze fra cui l’adriamicina, farmaco antineoplastico r antimetaboliti: sostanze simili ai normali metaboliti, cui si sostituiscono bloccando le vie metaboliche in cui sono coinvolti (metatrexato, utilizzato per la psoriasi e come immunosoppressore; analoghi pirimidinici e purinici come la 6-mercaptopurina impiegata come antileucemico) r inibitori della mitosi: il taxolo da Taxus brevifolia (figura 15.6), la vincristina e la vinblastina dalla pervinca sono impiegati nei linfomi e nelle leucemie. 15.5 Fonti di esposizione a sostanze chimiche L’organismo è quotidianamente esposto a una miriade di sostanze chimiche, le cui fonti si collocano in diversi ambienti e contesti professionali. Ambiente esterno Figura 15.6 Taxus brevifolia (fonte: www.wikipedia.it). Le attività antropiche sono sicuramente le maggiori responsabili del rilascio di xenobiotici nelle matrici ambientali. Nell’aria la combustione di carburanti fossili costituisce la fonte principale di inquinamento: stabilimenti industriali, riscaldamento domestico, autoveicoli e inceneritori di rifiuti. Il benzene, gli IPA e i loro nitroderivati sono i principali composti genotossici nell’ambiente urbano. Le acque superficiali vengono contaminate dagli scarichi dei reflui industriali e civili non adeguatamente depurati, le acque profonde (di falda) da pesticidi e fertilizzanti impiegati in agricoltura. Il cloro impiegato 218 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario INQUINANTI XENOBIOTICI E MUTAGENESI AMBIENTALE nella potabilizzazione può reagire con altre sostanze presenti nelle reti di distribuzione idrica formando composti genotossici. I suoli agricoli sono contaminati da acque irrigue che contengono residui di pesticidi e fertilizzanti o direttamente dall’impiego di erbicidi (atrazina, diazzine e triazine), anticrittogamici (carbammati e ditiocarbammati), insetticidi (DDT) e idrocarburi alogenati. 15 tà e cancerogenicità dei metalli pesanti non è però solo un problema professionale, perché queste sostanze vengono continuamente emesse nelle matrici ambientali (aria, acque, suolo) dalle industrie metallurgiche, dalle discariche di rifiuti, dal traffico autoveicolare, fenomeni che causano l’esposizione generalizzata dell’intera popolazione. Esposizione professionale Ambiente confinato Interessa in tutto il mondo milioni di lavoratori, esposti per molte ore al giorno al contatto con: r polveri e particolato: polvere di carbone nelle miniere, polvere di legno, residui della combustione dei motori diesel r fibre di vetro, impiegate nell’isolamento termico e acustico. Causano danni citogenetici e trasformazione cellulare r asbesto (amianto) cancerogeno a lunga latenza che agisce sul DNA direttamente o indirettamente con la formazione di radicali liberi. Provoca asbestosi (fibrosi parenchimale del polmone), mesotelioma pleurico, carcinoma polmonare r fumi, composti chimici: fonte di IPA genotossici è l’asfalto, soprattutto quando raggiunge temperature intorno ai 150 °C a cui il rischio di volatilità dei composti è molto più alto. La saldatura provoca liberazione di gas contenenti ossidi e sali di metalli. Parrucchieri e lavoratori della cosmesi sono a contatto prolungato con le tinture per capelli che contengono ammine aromatiche, amminofenoli, amminoantrachinoni, azocoloranti ecc. r gas: i gas utilizzati in chirurgia espongono gli operatori a rischi di mutagenesi, con aumento nella frequenza di aborti spontanei, riduzione della fertilità e presenza di sostanze mutagene nelle urine r metalli pesanti: i metalli pesanti e i metalloidi (arsenico) sono responsabili dell’induzione di tumori in ambito professionale; l’azione cancerogena di arsenico, nichel e cadmio sembra essere indiretta e si fa risalire all’inibizione dei meccanismi riparatori del DNA. Il cromo agisce come mutageno genico a livello del DNA, mentre a livello cellulare provoca il blocco del ciclo cellulare, apoptosi e trasformazione neoplastica. Cancerogeni sono anche cobalto e composti inorganici del piombo. La tossicogenici- Anche all’interno delle abitazioni, delle scuole, dei luoghi di lavoro dove non si effettui una frequente ventilazione si possono liberare miscele di sostanze mutagene composte da IPA, ammine e nitrosammine, asbesto, formaldeide. Derivano dal fumo dei camini e delle sigarette, da particolari metodi di cottura dei cibi, da componenti dei mobili e da tinture per le pareti. Se si considera che gran parte della popolazione trascorre molto tempo in ambienti confinati, che durante l’inverno le norme sul risparmio energetico (con l’impiego di serramenti ad alto coefficiente di isolamento) impediscono l’ingresso di aria esterna e che nella stagione calda sono molto diffusi gli impianti di climatizzazione, se ne può dedurre che un efficace e frequente ricambio di aria all’interno degli edifici può risultare spesso insufficiente. Alimentazione Mutageni e cancerogeni presenti negli alimenti possono essere di origine naturale, come per esempio le micotossine (aflatossine, fumosine, ocratossine) prodotte da alcune muffe. È purtroppo frequente negli alimenti la contaminazione da xenobiotici di derivazione ambientale, dagli scarichi degli autoveicoli ai residui di pesticidi, ai metalli pesanti. Negli alimenti si ritrovano molti additivi e sostanze che si originano durante la cottura dei cibi, fra cui soprattutto: r nitrosammine (tabella 15.1) r IPA: vengono prodotti quando la carne viene cotta direttamente sulla fiamma libera e derivano dalla pirolisi dei grassi. Questi composti si formano anche durante l’affumicatura di carne e pesce r ammine eterocicliche (AEC): si formano da reazioni dei costituenti della carne (proteine, zuccheri, creatina, acidi nucleici) durante la cottura. All’aumento 219 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 15 INQUINANTI XENOBIOTICI E MUTAGENESI AMBIENTALE Tabella 15.1 Nitrosammine negli alimenti NITROSAMMINE TIPO DI ALIMENTO (mg/kg) N-nitroso-dimetilammina Seppia in conserva (300), carne salata (54), pesce affumicato (32), carni conservate (22), bacon (17), salsiccia (12), birra (8), formaggio (5), latte in polvere (4,5) Dietilammina Formaggio (20), salsiccia (10), pesce conservato (4,8), pane di mais (4,8) Pirrolidina Bacon fritto (100), salsiccia (54), prosciutto (36), carne affumicata (10) Piperidina Salsiccia (50), mortadella (50), pesce conservato (23), carne affumicata speziata (9) Metilbenzilammina Pane di mais (> 100) della temperatura, i precursori di AEC migrano verso la superficie della carne e i composti genotossici si formano per condensazione e ciclizzazione quando si raggiungono temperature critiche e la carne si disidrata. Qualsiasi tipo di cottura della carne porta in grado variabile alla formazione di AEC, per cui l’unico modo di diminuire l’introduzione di xenobiotici biologicamente attivi è quello di ridurne il consumo. Il pretrattamento con microonde della carne prima della cottura riduce da tre a nove volte la produzione di AEC, diminuendo del 95% la loro mutagenicità. Alcune sostanze naturali sembrano invece agire come inibitori della cancerogenesi, come la salsa di soia fermentata, la curcumina dietetica e il wasabi (spezia giapponese) r fenoli: presenti nel modo vegetale, vengono impiegati come additivi e alcuni di essi hanno dimostrato azione genotossica; altri, al contrario, sembrano avere effetto protettivo sulla cancerogenesi. 15.6 Meccanismi di riparazione del DNA Il DNA umano possiede meccanismi di riparazione che in alcuni casi riescono a rimuovere il danno subìto. Tali meccanismi, frutto dell’evoluzione, tentano di ripristinare la corretta sequenza nucleotidica oppure permettono in qualche modo la sopravvivenza delle cellule. I principali meccanismi conosciuti di riparazione sono: r excisione di nucleotidi r excisione di basi r ricombinazione r modifica degli appaiamenti errati. L’excisione di nucleotidi consiste nell’apertura della doppia elica nel tratto danneggiato per denaturazione, rimozione dell’oligonucleotide danneggiato, sintesi riparativa sullo stampo dell’elica complementare integra, ligazione della catena neosintetizzata al DNA. La riparazione per excisione di basi richiede l’intervento della DNA glicosidasi, che rompe il legame fra la base danneggiata e il desossiriboso. La base anomala viene liberata e sostituita con una corretta, che viene poi inserita nella catena da una DNA polimerasi. La riparazione per ricombinazione interviene negli eucarioti per riparare le rotture della doppia elica causate soprattutto da radicali liberi, radiazioni ionizzanti e agenti ossidanti, e coinvolge la sintesi di una copia identica di DNA costituita da un cromatidio fratello. La modifica degli appaiamenti errati è operata da un sistema noto come MMR (mismatch repair) che agisce immediatamente dopo ogni replicazione del DNA correggendo gli errori della DNA polimerasi. Alcuni danni possono essere riparati direttamente per mezzo della fotoriattivazione, che ripara i danni da raggi UV, e della transmetilazione, che ripara quelli da agenti alchilanti. La fotoriattivazione consiste nell’utilizzo dell’energia luminosa per rompere l’anello di ciclobutano che lega fra di loro le due basi pirimidiniche (dimeri di timina). La transmetilazione rimuove la Ometilguanosina, che può accoppiarsi indifferentemente con l’adenina o la citosina, la cui formazione è indotta da agenti metilanti o farmaci chemioterapici. La riparazione viene effettuata da una metiltransferasi. 15.7 Destino degli xenobiotici nell’organismo Vengono definite xenobiotiche le sostanze estranee all’organismo, possibili cause di effetti indesiderati. Il loro potenziale tossico non è determinato solo dalle 220 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 15 INQUINANTI XENOBIOTICI E MUTAGENESI AMBIENTALE Assorbimento Distribuzione Bioaccumulo e rilascio Biotrasformazione Eliminazione Figura 15.7 Tossicocinetica. In figura sono illustrati i principali processi che influenzano la cinetica di una sostanza nell’organismo. loro proprietà intrinseche, ma anche dal tipo di reazione che l’organismo ha nei loro confronti, che dipende dall’assorbimento, dalla distribuzione, dall’accumulo e dall’eliminazione di queste sostanze. Per questi processi viene usato in farmacologia il termine “farmacocinetica” e in questo caso, trattandosi di sostanze tossiche, di “tossicocinetica” (figura 15.7). Parametri fondamentali nel determinare la pericolosità di uno xenobiotico sono la dose, le modalità di esposizione, che può risultare acuta, ripetuta o cronica, e le vie di penetrazione. Un aspetto molto rilevante è rappresentato dai meccanismi di biotrasformazione che riguardano le trasformazioni che le sostanze estranee subiscono nell’organismo ad opera degli enzimi metabolici. La funzione delle biotrasformazioni è essenzialmente quella detossificante, ma in molti casi questi processi contribuiscono ad accrescere il potenziale tossico degli xenobiotici. L’organismo può entrare in contatto con le sostanze estranee attraverso (figura 15.8): r ingestione di cibi e bevande contaminate r inalazione di sostanze volatili come gas o particolato molto fine (fumo e inquinanti dispersi in atmosfera) r contatto cutaneo diretto r iniezione endovena o intramuscolo (farmaci, droghe). Anche se l’epidermide integra e impermeabile all’acqua rappresenta un’efficace barriera che l’organismo op- pone all’ingresso delle sostanze estranee, è altrettanto vero che soluzioni di continuo o la natura stessa degli xenobiotici, che spesso sono sostanze lipofile, possono favorirne l’assorbimento, facilitato a volte anche dalla presenza di solventi o detergenti. Una volta assorbito e penetrato nei capillari sanguigni, il tossico viene trasportato in circolo e raggiunge i vari tessuti dove può distribuirsi e concentrarsi in relazione al tipo di tessuto e alla presenza o meno di barriere particolari, come quella ematoencefalica o placentare. Alcune sostanze mostrano capacità di bioconcentrazione in determinati tessuti, come accade ai metalli pesanti nelle ossa. Pesticidi come il DDT, i PCB (bifenili policlorurati) e le diossine si accumulano nel tessuto adiposo. Le sostanze volatili (etanolo, benzene ecc.) inalate attraverso le vie respiratorie vengono in parte espulse con l’aria espirata, ma possono facilmente essere assorbite e immesse in circolo, in relazione alla loro concentrazione nell’aria ambiente e alle differenze di pressione parziale dei gas a livello degli alveoli polmonari. Le sostanze ingerite possono a volte essere chimicamente modificate per idrolisi nell’ambiente acido dello stomaco e passare attraverso l’intestino senza essere assorbite, quindi eliminate con le feci. Le vie principali di eliminazione sono quella urinaria, quella biliare con le feci e quella polmonare. L’escrezione biliare si verifica solo per sostanze polari che possono essere sciolte nella bile. Molte sostanze esogene sono eliminate dopo aver subìto una trasformazione chimica mediata da enzimi e che ha luogo principalmente nel fegato, ma anche nei reni e nei polmoni (figura 15.9). Cibi e bevande Polveri e liquidi Apparato digerente Pelle Gas e vapori Fumi Inquinamento atmosferico Apparato respiratorio Sangue Farmaci Sostanze d’abuso Figura 15.8 Vie di esposizione agli xenobiotici. 221 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 15 INQUINANTI XENOBIOTICI E MUTAGENESI AMBIENTALE Fegato Circolo sanguigno Circolo enteroepatico Intestino Latte Pelle Polmoni Feci Ghiandole mammarie Aria espirata Reni Urine Sebo Sudore Cellule desquamate Peli Unghie Figura 15.9 Vie di eliminazione delle sostanze esogene. 15.8 Metabolismo degli xenobiotici Le sostanze esogene (inclusi i farmaci) vengono metabolizzate nell’organismo attraverso due processi mediati da reazioni enzimatiche, denominati rispettivamente: r fase I (di funzionalizzazione), in cui vengono inseriti nella molecola gruppi funzionali reattivi elettrofili o nucleofili, attraverso reazioni di ossidazione, di riduzione o di idrolisi r fase II (di coniugazione), caratterizzata da reazioni di sintesi o coniugazione con gruppi chimici, quali glutatione, acetile, solfato, glucuronide, di provenienza endogena. Nel complesso, gli enzimi di fase I e II catalizzano molte reazioni che hanno l’obiettivo comune di facilitare e promuovere l’escrezione degli xenobiotici trasformandoli in molecole con un maggior grado di polarità e quindi più idrosolubili. Si tratta quindi di processi di difesa dell’organismo tendenti a ridurre il potenziale tossico o genotossico dei composti chimici, un sistema utile ed efficace utilizzato anche nel metabolismo dei farmaci. Nel corso delle biotrasformazioni possono però formarsi alcuni intermedi metabolici molto più instabili delle molecole da cui derivano, quindi assai più reattivi e pericolosi. Questo fenomeno prende il nome di attivazione metabolica o bioattivazione. Reazioni di fase I Le reazioni di fase I sono mediate da enzimi appartenenti a varie classi: le monossigenasi citocromo P450 dipendenti (CYP) rappresentano il gruppo più numeroso, sono localizzate a livello delle membrane dei mitocondri e del reticolo endoplasmatico, si trovano in particolare (ma non esclusivamente) nelle cellule epatiche. L’attività specifica di questi enzimi ossidativi, che possiedono come gruppo prostetico un gruppo eme, consiste nell’introdurre nel substrato un atomo di ossigeno. Di particolare interesse in tossicologia sono gli isoenzimi (capitolo 1) CYP1A1 (indicato anche come AHH, aryl hydrocarbon hydroxylase), attivo nel tessuto polmonare sugli idrocarburi aromatici, e CYP1A2 a localizzazione soprattutto epatica. Questo enzima ha fra i propri substrati (quindi interviene nella sua detossificazione) l’aflatossina B1 di Aspergillus flavus, una micotossina ad alta potenzialità cancerogena a livello epatico. L’attività cancerogena dell’aflatossina B1 è legata alla formazione del relativo epossido, un intermedio metabolico che forma addotti al DNA (un addotto è costituito dal legame covalente di una molecola con il DNA). Gli enzimi della famiglia CYP2 sono i più numerosi e comprendono enzimi coinvolti nel metabolismo di inquinanti ambientali e di molti farmaci antipertensivi, antidepressivi, antistaminici e analgesici. L’enzima CYP2A6 presente anche nell’apparato respiratorio è coinvolto nel metabolismo della nicotina, potente cancerogeno dei prodotti derivati dal tabacco (figura 15.10). Fra gli enzimi di fase I, le alcol-deidrogenasi e le aldeide-deidrogenasi sono coinvolte nel metabolismo dell’etanolo. L’alcol etilico, che come noto rappresenta un composto esogeno di larghissimo uso, viene deidrogenato ad acetaldeide dall’alcol-deidrogenasi poi convertito ad acido acetico dall’aldeide-deidrogenasi. Reduttasi batteriche della flora commensale del trat- 222 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario INQUINANTI XENOBIOTICI E MUTAGENESI AMBIENTALE H H N N N+ CYP2A6 CH3 Nicotina N CH3 Ione nicotin-imminio Aldeide ossidasi H OH H H N N CH3 Idrossicotinina O N CYP2A6 N O CH3 Cotinina Figura 15.10 Metabolismo della nicotina. La biotrasformazione della nicotina ha inizio con un’ossidazione e procede con una successiva reazione che porta alla formazione di cotinina, escreta con le urine. to intestinale possono catalizzare reazioni di riduzione sui nitrocomposti aromatici dando origine a idrossilammine aromatiche, precursori di composti a elevata genotossicità. Reazioni di fase II Le reazioni di fase II sono mediate, fra gli altri, da enzimi appartenenti alle glutatione-S-transferasi (GST) e Nacetiltransferasi (NAT), che catalizzano reazioni di sintesi e di coniugazione. Anche le reazioni di fase II hanno lo scopo di detossificare gli xenobiotici inattivandone le proprietà biologiche ma, a volte, si ottiene l’effetto opposto: nel caso di alcuni derivati N-coniugati delle ammine aromatiche si genera lo ione nitronio, cancerogeno che si forma nell’ambiente relativamente acido delle urine. Questo fenomeno può spiegare la relazione fra esposizione alle ammine aromatiche e tumore alla vescica. La suddivisione fra reazioni di fase I e II è da considerare una semplificazione del complesso delle trasformazioni che si verificano nel metabolismo, che in realtà consiste in una rete estremamente articolata di reazioni interconnesse dalla presenza di metaboliti comuni a più vie. Da una molecola si possono formare molti intermedi metabolici con caratteristiche e proprietà diverse; il corredo enzimatico specifico di un tessuto o di un or- 15 gano rispetto a un altro modifica inoltre in una certa direzione gli equilibri metabolici che in esso si creano. Questi ed altri ancora sono i motivi per cui un composto esogeno svolge la propria azione tossica su un bersaglio preferenziale: metaboliti attivi in un distretto organico piuttosto che in un altro possono spiegare per esempio perché il benzene provochi leucemie e linfomi, le ammine aromatiche possano causare tumore alla vescica, mentre gli idrocarburi policiclici aromatici (IPA) provochino tumori al polmone. Molteplici fattori possono influenzare in varia misura il metabolismo: fra questi il sesso (in relazione ai diversi quadri ormonali), l’età e lo stato di salute. Patologie o disfunzioni epatiche o renali alterano l’attività metabolica di questi importanti organi-filtro, con il possibile accumulo di metaboliti tossici nel sangue o nei tessuti. Dieta, fumo, alcol, farmaci, condizioni di stress, attività fisica, stato di nutrizione sono tutti fattori che hanno effetti sulle attività metaboliche dell’organismo. L’alcol ha un elevato potere di induzione sull’attività degli enzimi che lo metabolizzano, così come le benzodiazepine e i barbiturici; PCB e diossine attivano gli enzimi che ossidano gli xenobiotici. Come sopra esposto, le conseguenze delle biotrasformazioni possono essere talvolta anomale, con la formazione di intermedi instabili e iperreattivi, potenzialmente o notoriamente cancerogeni. Al contrario, sostanze normalmente presenti nella dieta come la caffeina, i flavonoidi di cui sono ricchi la frutta e i vegetali, componenti del vino rosso come il resveratrolo, farmaci come il paracetamolo e l’acido acetilsalicilico sono tutti inibitori dell’attività dei sistemi enzimatici di bioattivazione. 15.9 Tossicogenetica e polimorfismi metabolici Alcuni enzimi di fase I e II coinvolti nel metabolismo degli xenobiotici sono codificati da geni polimorfici, cioè presenti nella popolazione in più forme alleliche. Queste varianti alleliche sono originate da mutazioni puntiformi, il cui risultato pratico è una forte variabilità sia nella sintesi che nella modulazione dell’attività enzimatica controllata: si può andare dall’aumento di attività a una sua riduzione fino all’assenza completa. Questo fenomeno può spiegare come la capacità metabolica di un individuo sia da far risalire in ultima analisi al suo 223 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 15 INQUINANTI XENOBIOTICI E MUTAGENESI AMBIENTALE corredo genetico e come, quindi, ci si possa attendere una forte variabilità nel metabolismo degli xenobiotici. Le prime evidenze di tali fenomeni sono legate alla comparsa, con una frequenza superiore a quanto ragionevolmente atteso, di reazioni indesiderate in seguito alla somministrazione di farmaci di largo impiego e comunemente ben tollerati. In questi casi i soggetti presentano difetti enzimatici che non permettono o permettono solo in misura limitata, e quindi insufficiente, la detossificazione del farmaco, che di conseguenza persiste più a lungo in circolo (più lungo periodo di emivita, cioè del tempo necessario a dimezzarne la concentrazione iniziale nel sangue o nelle urine) mostrando gli effetti indesiderati. Esempi sono l’isoniazide (un antitubercolare) e la debrisochina (un antipertensivo). Il polimorfismo del gene che codifica per la debrisochina-idrossilasi è la causa di una notevole variabilità nella risposta al farmaco, da soggetti a metabolizzazione lenta nei quali il farmaco permane a lungo in circolo, con rischio di collasso, ad altri a metabolizzazione rapida che manifestano una risposta normale. Il difetto enzimatico può manifestarsi anche come mancato effetto terapeutico, quando il farmaco viene somministrato in forma inattiva, che deve essere trasformata in quella attiva da uno specifico sistema enzimati- co, come nel caso del farmaco antiepilettico carbamazepina. Se l’enzima deputato alla sua trasformazione nella forma attiva è carente, la terapia non risulta efficace, a meno che la carbamazepina non venga somministrata direttamente in forma attiva. 15.10 Esempi di attivazione metabolica Vengono di seguito riportati degli esempi di come il metabolismo di alcuni xenobiotici possa trasformarli in derivati genotossici e cancerogeni. Metabolismo del benzene Principali fonti di esposizione dell’organismo al benzene (il più piccolo degli idrocarburi aromatici) sono sicuramente le emissioni degli autoveicoli, l’evaporazione durante il rifornimento di carburante, il fumo di sigaretta attivo (stimabile in 2 mg/pacchetto) e passivo. Il benzene inalato e non allontanato con l’espirazione subisce un’attivazione metabolica in fase I, quindi una detossificazione in fase II (figura 15.11). H OH CYP2E1 Benzene EH O O Benzene ossido H OH Diidrodiolo Benzene ossepina EH OH OH OH OH CYP2E1 OH Idrochinone O CYP2E1 OH Fenolo OH OH Catecolo MPO NQO1 O p-Benzochinone OH 1,2,4-Triidrossibenzene o benzenetriolo Figura 15.11 Metabolismo del benzene. In figura sono schematizzati i passaggi del metabolismo ossidativo del benzene. 224 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario INQUINANTI XENOBIOTICI E MUTAGENESI AMBIENTALE Si tratta in origine di un composto stabile e poco reattivo, che può subire però una bioattivazione. Il suo metabolismo inizia con l’ossidazione da parte di monossigenasi P-450-dipendenti a benzene-ossido, che viene poi convertito a fenolo. Da questo si formano catecolo, idrochinone e 1,2,4-benzenetriolo ad opera dell’enzima CYP2E1. L’esposizione al benzene ha gravi conseguenze a livello ematologico e linfatico: causa infatti leucemie mieloidi, linfomi, anemia aplastica. Responsabile principale di queste patologie sembra essere il benzochinone, un intermedio reattivo derivato dall’idrochinone, che agisce a livello del midollo osseo emopoietico. I vari prodotti dell’ossidazione del benzene sono coniugati in fase II con il glutatione, convertiti in acidi mercapturici, che sono poi eliminati con le urine. Si può verificare in alternativa l’apertura dell’anello aromatico con formazione di muconaldeide, un intermedio tossico che può dare origine ad addotti al DNA. La sua ulteriore ossidazione porta all’acido trans, trans-muconico eliminato con le urine. 15 Benzo[a]pirene Benzo[a]pirene-7,8-epossido O Benzo[a]pirene-7,8-diidrodiolo HO OH Metabolismo degli IPA Gli idrocarburi policiclici aromatici (IPA) sono in origine composti relativamente inerti, ma vengono convertiti in fase I dalla monossigenasi CYP1A1 (AHH) in prodotti di ossidazione (epossidi) altamente instabili, che reagiscono con proteine e DNA, a meno che non vengano immediatamente trasformati nelle reazioni idrolitiche e di coniugazione della fase II (figura 15.12). In fase I si formano così composti quali il BPDE (benzo[a]pirene-7,8-diidrodiolo-9,10-epossido), che è il principale metabolita cancerogeno del benzopirene e in grado di formare addotti al DNA, cioè molecole di acido nucleico legate al BPDE. Le reazioni di fase II possono prevenire la formazione di BPDE, ma anch’esse possono dare origine in alcuni casi a intermedi (esteri solfato) che si decompongono facilmente generando molecole altamente cancerogene. In ultima analisi l’ossidazione degli IPA ad opera dell’AHH che avviene a livello polmonare è un evento centrale nella formazione di composti altamente genotossici e cancerogeni, responsabili principali del tumore al polmone. Benzo[a]pirene-7,8-diidrodiolo-9,10-epossido O HO OH Addotto alla guanosina O N N N N R HO NH HO OH Figura 15.12 Formazione del benzo[a]pirene7,8-diidrodiolo9,10-epossido (BPDE). 225 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 15 INQUINANTI XENOBIOTICI E MUTAGENESI AMBIENTALE Metabolismo delle ammine aromatiche Le ammine aromatiche, derivate dall’ammoniaca dove uno o più atomi di idrogeno sono sostituiti da un radicale aromatico (per es. benzene, naftene, difenile), hanno come capostipite l’anilina. Altre ammine aromatiche sono la benzidina, la 2-naftilamina, la o-toluidina, la 3-3ʹ-diclorobenzidina, la 4-cloro-o-toluidina e la 4-cloroanilina. Vengono utilizzate nella produzione di coloranti, nell’industria della gomma e delle materie plastiche, in quella petrolchimica. Attraverso varie reazioni di ossidazione e di deaminazione ossidativa le ammine aromatiche possono dare origine ad aldeidi, ammoniaca e idroperossidi, idrossilammine e acidi idrossiamminici. Nel corso di queste trasformazioni, catalizzate da enzimi della fase I (monossigenasi CYP1A2 e ciclossigenasi), si generano intermedi molto più reattivi dei composti di partenza. La detossificazione avviene in fase II con l’intervento di specifici enzimi che portano a N-acetati, N-glucoronidi, N-solfati. Alcuni di questi composti sono però instabili e si decompongono spontaneamente generando ioni nitronio che si legano alle proteine e formano addotti del DNA. 15.11 Controlli di genotossicità su matrici ambientali Gli studi di monitoraggio su matrici ambientali (aria, acqua e suolo) per valutare tossicità e/o genotossicità vengono effettuati con varie procedure: r test in vitro su batteri luminescenti (Vibrio fischeri e Vibrio harvey), di cui viene misurata la variazione di intensità nell’emissione di luce. La bioluminescenza è in relazione al consumo di ATP e quindi è un indicatore del tasso di attività metabolica. Si utilizza un ceppo mutante che ha perso la capacità di emettere luce. La presenza di sostanze mutagene ripristina la funzionalità del gene responsabile della bioluminescenza r test di Ames, uno dei più noti test in vitro su colture batteriche. Si tratta di un test di reversione su mutanti istidina-negativi (richiedono l’aggiunta dell’aminoacido al terreno di coltura) di Salmonella typhimurium, che hanno la possibilità di retromutare al ceppo “selvatico” (istidina positivo) originario quando esposti a sostanze chimiche mutagene r test citogenetici per l’evidenziazione di aberrazioni cromosomiche si possono effettuare su vegetali, in particolare su tessuti meristematici, foglie o cellule gametiche e somatiche coltivate di Tradescantia, Hordeum vulgare, Allium cepa, scelte perché provviste di un numero ridotto di cromosomi di grandi dimensioni su cui è più facile condurre osservazioni r animali e organismi marini sono utilizzati come bioindicatori: molluschi bivalvi del genere Mitilus, particolarmente adatti in quanto organismi filtratori e in grado di bioconcentrare i contaminanti ambientali nei loro tessuti. Anche alcuni pesci vengono impiegati in test di tossicità (Dicentrarchus labrax, Seranus cabrilia). Aria L’inquinamento atmosferico ha origini naturali e antropiche. Nel primo caso deriva da eruzioni vulcaniche, incendi, polveri e gas prodotti dal metabolismo; nel secondo ne sono responsabili le attività umane. Le sorgenti principali dell’inquinamento atmosferico di origine antropica sono i processi di combustione e il traffico veicolare. Vengono immessi in atmosfera enormi quantità di nerofumo, ceneri, polvere di carbone, gas tossici (CO, CO2, SO2, NO, NO2, NO3) e vari idrocarburi. Oltre a ciò, occorre tenere conto delle reazioni che si verificano tra i vari inquinanti presenti, che possono dar luogo a intermedi altamente reattivi e tossici come il perossiacetilnitrato (PAN). Il particellato atmosferico (sostanze chimiche inorganiche e organiche che aderiscono a microparticelle di carbone e silice con funzione aggregante) è uno degli inquinanti più importanti. La constatazione di una maggior incidenza statistica di tumori polmonari fra la popolazione urbana rispetto a quella rurale non ha fatto che confermare la relazione esistente fra contaminazione dell’aria e tossigenicità degli inquinanti. Per il monitoraggio vengono effettuati test: r in vitro: raccolta del particellato, estrazione delle sostanze ritenute mutagene, esposizione di cellule animali o batteriche a tali sostanze r in situ: esposizione diretta nel luogo di indagine di determinati organismi (soprattutto vegetali) sensibili agli agenti mutageni. Per il campionamento del microparticellato, su cui si procede poi all’estrazione delle varie sostanze, si impiegano 226 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario INQUINANTI XENOBIOTICI E MUTAGENESI AMBIENTALE Tabella 15.2 Principali inquinanti chimici da controllare nelle acque superficiali (D. Lgs. 11.5.1999 n. 152) Cadmio Aldrin Cromo totale Cloroformio Mercurio DDT Nichel 1,2-Dicloroetano Piombo Dieldrin Rame Endrin Zinco Esaclorobenzene Esaclorobutadiene Esaclorocicloesano Isodrin Pentaclorofenolo Percloroetilene Tetracloruro di carbonio Triclorobenzene Tricloroetilene particolari filtri che permettono il calcolo del volume d’aria filtrato e sono dotati di selettori di dimensione delle particelle. Questi apparecchi ripetono la situazione di filtrazione fisiologica dell’apparato respiratorio umano. I risultati sono espressi come “potenza mutagena specifica” (numero di mutazioni per unità di peso di estratto organico) o anche come “attività mutagena specifica” (numero di mutazioni per unità di volume di aria). Acqua I principali inquinanti chimici da controllare nelle acque superficiali e nei sedimenti sono elencati nelle tabelle 15.2 e 15.3. Vi sono compresi metalli pesanti, diossine e DDT (composti organoclorurati), IPA, PCB e il gruppo di composti noti come POP (persistent organic pollutants) di difficile degradazione. In ambiente acquatico assumono particolare importanza i fenomeni di: r bioaccumulo: concentrazione più elevata di un contaminante all’interno dell’organismo rispetto all’ambiente esterno. Il fenomeno è particolarmente significativo per sostanze lipofile come PCB e DDT, che raggiungono nei tessuti concentrazioni anche decine di migliaia di volte maggiori rispetto all’ambiente r biomagnificazione: progressivo aumento di con- 15 centrazione di un inquinante nei passaggi da un livello della catena alimentare a quello superiore. Questo fenomeno è da tenere nella massima considerazione, perché spiega come un inquinante, immesso nell’acqua in concentrazione minimale e a prima vista ininfluente, possa in realtà presentarsi per biomagnificazione a concentrazioni elevatissime e con effetti irreversibili ai livelli più alti della catena trofica (uomo, grandi predatori). Gli effetti biologici dell’esposizione degli organismi acquatici agli inquinanti tossici e genotossici sono stati studiati in vari programmi di ricerca da cui è emerso come questi si possano verificare a tutti i livelli di organizzazione, da quello cellulare all’ecosistema. In termini generali si va dall’induzione di tumori in animali nei cui tessuti sono parallelamente state trovate alte concentrazioni di DDT, IPA, PCB, a conseguenze sulla capacità riproduttiva, a effetti a lunga scadenza sulla biodiversità degli ecosistemi. Un esempio indicativo proviene da ricerche svolte su molluschi bivalvi in zone fortemente contaminate da pesticidi nella costa del Maine (USA), nei quali si è riscontrata un’alta incidenza di tumori nei tessuti germinali (germinomi) parallelamente a una percentuale molto superiore alla media di tumori alle gonadi anche nella popolazione della medesima area. Ciò ha suggerito il possibile impiego di questi bivalvi come indicatori di rischio tumorale per l’uomo. I danni relativi alla biodiversità (numero, varietà e variabilità delle specie viventi all’interno di un ecosistema) si esprimono ovviamente nel senso di una sua progressiva riduzione. Anche nelle acque potabili sono presenti sostanze dotate di possibile cancerogenicità o mutagenicità, preTabella 15.3 Principali microinquinanti da ricercare nei sedimenti (D. Lgs. 11.5.1999 n. 152) Arsenico Policlorobifenili (PCB) Cadmio Diossine (TCDD) Zinco Idrocarburi policiclici aromatici (IPA) Cromo totale Pesticidi organoclorurati Mercurio Nichel Piombo Rame 227 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 15 INQUINANTI XENOBIOTICI E MUTAGENESI AMBIENTALE senti all’origine o derivate da processi di potabilizzazione. Il cloro universalmente impiegato è molto reattivo e produce, reagendo con sostanze naturalmente presenti come gli acidi umici e fulvici, composti organici clorurati tossici o cancerogeni (clorofenolo, acidi cloroacetici, trialometani ecc.). Il rischio per la salute umana è comunque considerato irrilevante, anche in considerazione del sempre più ridotto uso del cloro e della sua possibile sostituzione con ozono e acido peracetico. Suolo La contaminazione dei suoli deriva principalmente da discariche abusive o non adeguate, dalla non corretta gestione di sostanze pericolose che possono percolare nel terreno da siti minerari o militari abbandonati e non bonificati, da contaminazioni accidentali (tabella 15.4 e figura 15.13). Gli inquinanti che giungono al suolo vengono in parte dilavati, in parte assorbiti dai vegetali, possono subire fotodecomposizione, possono venire degradati per via chimica o dal metabolismo microbico. Si possono distinguere: r inquinanti inorganici: metalli pesanti (piombo, mercurio, cadmio, rame, arsenico) r inquinanti organici: si legano alle particelle solide del suolo o sono disciolti nell’acqua o dissolti nell’aria fra gli interstizi delle particelle. Sono soprattutto diossine, furani policlorurati, IPA, PCB, pesticidi. Gli IPA derivanti dal traffico autoveicolare rappresentano probabilmente la maggior fonte di Tabella 15.4 Sostanze contaminanti del suolo e loro fonti di derivazione SORGENTI SOSTANZE INQUINANTI Tecniche agricole moderne: fertilizzazione, lotta antiparassitaria, allevamenti zootecnici, irrigazione Nitrati, fosfati e metalli pesanti contenuti nei concimi Metalli pesanti e altri microinquinanti contenuti nei fanghi di depurazione e nei liquami delle deiezioni animali Pesticidi (biocidi) Acque irrigue inquinate (in particolare metalli pesanti) Sanità pubblica: lotta contro gli insetti vettori di malattie Pesticidi Impianti termici e industriali: inquinamento atmosferico Ossidi di zolfo Ossidi di azoto Idrocarburi Metalli pesanti (contenuti nelle particelle sospese) Trasporti (nelle zone adiacenti le vie di comunicazione) Ossidi di azoto Idrocarburi Pb, Cd Prodotti utilizzati per la manutenzione delle vie di comunicazione (sali ecc.) Smaltimento nel suolo e sul suolo di rifiuti urbani e industriali Fanghi e rifiuti solidi urbani e industriali Acque reflue (“percolato”) Inceneritori di rifiuti Zn, Pb, Al, Fe, Cd, Br, Cr, Cu, Ca, K, Mg, Na, S, N, SO2, NO2, HCl Composti organici volatili (VOC) quali benzene, metano ecc. Composti organici alogenati quali policlorodibenzo-diossine (PCDD) e policlorodibenzo-furani (PCDF) Policlorobifenoli (PCB) Clorobenzeni e clorofenoli Centrali termonucleari; esplosioni nucleari Gas e polveri radioattivi Rifiuti radioattivi volatili, liquidi e solidi Varie Tensioattivi Oli usati 228 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario INQUINANTI XENOBIOTICI E MUTAGENESI AMBIENTALE Volatilizzazione Applicazione di pesticidi 15 Trasporto eolico Fotodecomposizione Scorrimento Degradazione chimica Lisciviazione Assorbimento radicale Assorbimento Degradazione microbica Figura 15.13 Distribuzione e degradazione di contaminanti del suolo. sostanze genotossiche nel suolo. I pesticidi annoverano sostanze a elevata attività genotossica. In base alla loro natura chimica molto varia, questi composti hanno tempi di attività e di permanenza molto diversi. La progressiva messa al bando dei POP, 12 sostanze ritenute estremamente dannose per gli ecosistemi e l’uomo, è stata concordata a livello internazionale nel 2001. Di queste, ben 9 sono pesticidi organoclorurati (DDT, Dieldrin, Aldrin, Endrin, Mirex, Toxafene, Eptaclor, Clordane, HCB o esaclorobenzene). Questi composti mostrano una tossicità acuta relaTabella 15.5 Persistenza di pesticidi TIPO ATTIVITÀ PERSISTENZA Organofosforici 1-12 settimane Non persistenti Carbammati 1-18 mesi Moderatamente persistenti Organoclorurati a base di Hg, As, Pb 2-5 anni Residui permanenti Persistenti Permanenti tivamente bassa, ma effetti cancerogeni sul sistema immunitario e riproduttivo, conseguenti all’esposizione a basse dosi per lunghi periodi di tempo. Per il DDT, in considerazione del suo indispensabile impiego per la prevenzione della malaria in molti Paesi, vengono solo previste alcune cautele e limitazioni nell’impiego. Il contatto diretto con suoli contaminati, l’inalazione di polvere o microparticelle di suolo si possono verificare nelle discariche ma, in modo subdolo e pericoloso in quanto inconsapevole, anche in seguito al cambio di destinazione d’uso di siti industriali o ex discariche che divengono aree abitative, scolastiche o parchi. In campo alimentare è preoccupante e costantemente da monitorare la pericolosità della presenza di residui di pesticidi nei prodotti agricoli come cereali, patate e verdure, frutta. I metalli pesanti possono accumularsi nei vegetali: il cadmio inibisce la biosintesi degli acidi nucleici e delle proteine, il cromo induce mutazioni geniche, blocco della riproduzione cellulare, fenomeni di apoptosi; la mutagenicità del nichel si manifesta con la rottura dei filamenti di DNA. 229 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario ESERCIZI DI VERIFICA 1. Rispondi alle seguenti domande: Definisci il significato dei termini: mutageno, genotossico, cancerogeno. Spiega in che cosa consistono le mutazioni somatiche e quelle germinali e quali conseguenze possono avere. Illustra le differenze fra mutazioni geniche, cromosomiche e genomiche. Come agiscono le radiazioni ionizzanti? E quelle non ionizzanti? Come si possono manifestare i danni biologici delle radiazioni? Come possono essere distinti i mutageni chimici? Come agiscono gli analoghi delle basi? Quali sono i meccanismi di riparazione del DNA? Attraverso quali fasi si realizza nell’organismo il metabolismo delle sostanze esogene? In che cosa consiste il fenomeno dell’attivazione metabolica? 230 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 16 ESPOSIZIONE PROFESSIONALE E VALUTAZIONE DEL DANNO DA XENOBIOTICI 16.1 Esposizione professionale e biomarcatori 16.2 Biomarcatori 16.3 Aspetti normativi e linee guida comunitarie La valutazione del rischio conseguente all’esposizione a determinate sostanze chimiche e la valutazione realistica del loro grado di genotossicità e cancerogenicità richiede ovviamente un approccio meditato. Una valutazione obiettiva deve essere fondata sull’esame di un numero consistente di dati attendibili e verificabili che devono scaturire da metodi standardizzati e validati. L’impiego di test su microrganismi, colture cellulari e animali da laboratorio consente di eseguire prove in vivo per estrapolare poi i risultati e applicarli, laddove sia possibile, sull’organismo umano. 16.1 Esposizione professionale e biomarcatori Addotto di DNA generato dal benzo[a]pirene, il maggiore agente mutageno presente nel fumo di tabacco (fonte: Richard Wheeler). I test e le simulazioni condotte in laboratorio rappresentano un approccio sostanzialmente corretto e spesso anche l’unico possibile per poter disporre di dati in un tempo ragionevole. È indubbio però che il monitoraggio diretto su particolari fasce di popolazione, quali gli addetti a certe lavorazioni o i cittadini esposti in qualche modo al danno (radiazioni, fumi e polveri ecc.), è la soluzione migliore in termini di effettiva valutazione diretta per poter adottare le necessarie e specifiche misure di prevenzione. Si impiegano biomarcatori di esposizione, di effetto e di suscettibilità, indirizzando studi e ricerche su alcune cellule e tessuti in particolare: i linfociti ma anche l’epitelio di esfoliazione vescicale, quello della bocca, gli spermatozoi. Sono stati studiati dapprima gli effetti delle radiazioni ionizzanti e non ionizzanti, che hanno dimostrato inequivocabilmente la loro relazione con il 231 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 16 ESPOSIZIONE PROFESSIONALE E VALUTAZIONE DEL DANNO DA XENOBIOTICI danno cromosomico, quindi le ricerche sono state estese ai composti xenobiotici come cloruro di vinile e benzene che causano gli stessi effetti, per poi essere ampliate a ossido di etilene, ammine aromatiche e acrilonitrile, che provocano la formazione di addotti emoglobinici. Le esposizioni professionali sono naturalmente oggetto dei più approfonditi studi di mutagenesi e cancerogenesi, che hanno permesso di determinare specifici valori-soglia per le singole lavorazioni, al di sotto dei quali non si dovrebbero avere conseguenze per la salute nemmeno in seguito a esposizioni prolungate. Allo stesso modo sono oggetto di monitoraggio l’assunzione di farmaci, le abitudini alimentari, l’inquinamento atmosferico, le conseguenze anche a lungo termine di “incidenti” industriali (veri e propri disastri sotto ogni punto di vista) come quelli di Seveso, Bophal e Chernobyl, per non citare che quelli più tristemente noti. trasformazioni o bioattivazioni degli xenobiotici all’interno dell’organismo e permettono di ripercorrere le fasi biochimiche della transizione dall’esposizione al tossico fino al danno biologico conclamato. La valutazione di rischio utilizza sistemi di indagine, modelli di previsione e protocolli di ricerca basati sull’impiego di biomarcatori (figura 16.1). I biomarcatori sono suddivisi in tre tipologie diverse: r biomarcatori di esposizione: mettono in relazione concentrazione degli xenobiotici e presenza di addotti r biomarcatori di effetto biologico: indicano una conseguenza dell’esposizione allo xenobiotico attraverso l’alterazione di funzioni biologiche r biomarcatori di suscettibilità: preesistono alla presenza dello xenobiotico e sono indipendenti dall’esposizione; indicano la probabilità che un individuo manifesti la patologia in seguito all’esposizione. 16.2 Biomarcatori Biomarcatori di esposizione Per completare i dati derivati dal monitoraggio degli xenobiotici a livello ambientale (capitolo 15) si possono utilizzare indagini su campioni biologici. Queste analisi sono in grado di fornire dati fondamentali sulle bio- Riguardano le possibili vie di esposizione dell’organismo umano (cute, apparato respiratorio e digerente) e le trasformazioni metaboliche cui possono andare incontro i composti esogeni. Uno xenobiotico può agire pres- MONITORAGGIO BIOLOGICO Esposizione Malattia Biomarcatori di suscettibilità Geni per il metabolismo Dose interna Sostanze e metaboliti in sangue urine ssuti Geni di stabilità del DNA Dose biologicamente efficace Addotti alle proteine Addotti al DNA Biomarcatori di esposizione Geni per l’immunocompetenza Risposta efficace Mutazioni somatiche Cambiamenti cinogenetici aberrazioni micronuclei aneuploidia Cambiamenti morfofunzionali Spettro mutazionale nei tumori Biomarcatori di effetto Figura 16.1 Schema dei parametri di monitoraggio biologico di popolazione esposta a rischi genotossici. 232 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario ESPOSIZIONE PROFESSIONALE E VALUTAZIONE DEL DANNO DA XENOBIOTICI 16 Tabella 16.1 Biomarcatori di esposizione e relativi parametri misurabili CAMPIONE BIOLOGICO ESPOSIZIONE PARAMETRO MISURABILE Sangue intero Benzene, toluene, xilene, nitrobenzene, tricloroetilene Benzene, toluene, xilene, anilina, tricloroetano Siero Idrocarburi clorurati lipofili (PCB, DDT) Lindano, esaclorobenzene, PCB, DDT Urine Benzene Stirene Cloruro di vinile Parathion Metalli (As, Cd, Hg, Cr, Al) Triossido di cromo Tricloroetilene Fenolo Acido mandelico e acido fenilgliossilico Acido tiodiglicolico p-nitrofenolo As, Cd, Hg, Cr, Al Cromo Acido tricloroacetico Aria alveolare Solventi organici, per esempio tetracloroetilene Tetracloroetilene Latte materno DDT, PCB, metalli Metaboliti stabili DDE, PCB Feci Metalli, sostanze organiche Derivati glutationici Capelli, unghie Mercurio Metilmercurio Placenta Cadmio, piombo, mercurio Cadmio, piombo, mercurio soché esclusivamente a livello locale, ma di norma viene veicolato dal sangue e raggiunge i tessuti. Vengono quindi misurate le concentrazioni di xenobiotici e dei loro metaboliti nei liquidi biologici, nelle cellule o nei tessuti (biomarcatori di dose interna); nonché l’eventuale formazione di addotti al DNA e alle proteine, indicati invece come biomarcatori di dose biologica efficace. Le sostanze mutagene (genotossiche) o i loro metaboliti possono essere ricercati nel sangue, nelle urine, nelle feci, nella saliva, nella placenta, nei capelli (i metalli pesanti si legano ai gruppi sulfidrilici della cheratina) o anche nell’aria espirata (per le sostanze volatili inalate) (tabella 16.1). Se uno xenobiotico si ritrova nelle urine, ciò significa evidentemente che è già stato assorbito nel sangue e accumulato nei tessuti, dove può esercitare effetti mutageni. Le urine vengono prima concentrate, quindi si procede in genere con il test di Ames. Gli addotti al DNA sono sostanze chimiche che possono formare legami covalenti con gli acidi nucleici (figura 16.2): la presenza di un addotto al DNA in un campione biologico testimonia che uno xenobiotico genotossico (o qualche suo metabolita) ha raggiunto il DNA e può esercitare la propria azione mutagena. Gli xenobiotici possono formare addotti anche con le proteine, reagendo in particolare con siti di reazione degli aminoacidi istidina, cisteina e valina (catene alfa e beta dell’emoglobina). Emoglobina e albumina sono le proteine in cui viene preferibilmente effettuata la ricerca di addotti. I metodi di indagine più utilizzati sono soprattutto gas cromatografici (HPLC) e immunologici (ELISA). Biomarcatori di effetto biologico Sono marcatori che indicano la vera e propria risposta biologica alla presenza di xenobiotici genotossici. Si O N N NH N O –O P OH –O HO O O NH H H O H P O HO OH OH Figura 16.2 Addotto al DNA. Esempio di addotto al DNA derivato dalla reazione del benzo[a]pirene con il DNA e marcato con 32P (*) per il dosaggio con autoradiografia. 233 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 16 ESPOSIZIONE PROFESSIONALE E VALUTAZIONE DEL DANNO DA XENOBIOTICI tratta quindi di individuare nei campioni biologici (soprattutto linfociti di sangue periferico, ma anche cellule delle mucose respiratorie) la presenza di mutazioni geniche, cromosomiche o genomiche. Si eseguono a questo scopo analisi di citogenetica, ricercando aberrazioni cromosomiche, presenza di micronuclei (frammenti cromosomiali non incorporati nelle cellule figlie durante la mitosi), scambi fra cromatidi fratelli, oppure danni al DNA come rotture della doppia elica o formazione di legami crociati (legami fra le due eliche del DNA o fra DNA e proteine). 16.3 Aspetti normativi e linee guida comunitarie Biomarcatori di suscettibilità Classificazione degli agenti mutageni L’enorme variabilità nell’ambito della popolazione umana è un parametro molto influente per quanto riguarda le differenze individuali nella sensibilità e nella risposta biologica alle sostanze genotossiche. I biomarcatori di suscettibilità si propongono di identificare i soggetti con una maggior probabilità di manifestare gli effetti negativi dell’esposizione a xenobiotici ambientali. Sul piano pratico tali soggetti possono venire individuati sulla base di una più scarsa capacità nella riparazione dei danni a carico del DNA e/o della presenza di alleli polimorfi, notoriamente coinvolti nella biotrasformazione metabolica degli xenobiotici in derivati bioattivi potenzialmente cancerogeni. Gli agenti mutageni vengono classificati in tre categorie in base alla loro probabilità di indurre genotossicità nell’organismo umano (tabella 16.2): r nella categoria 1 sono comprese le sostanze di cui è nota l’attività mutagena sugli esseri umani r nella categoria 2 sono elencate le sostanze da considerare mutagene pur senza una chiara evidenza diretta r in categoria 3 si trovano le sostanze che devono essere considerate con preoccupazione. La legislazione comunitaria fa riferimento alle Direttive 67/548/EEC; 76/769/EEC; 94/60/EC e successive modifiche e aggiornamenti (2003/36) riguardanti la classificazione, l’imballaggio e l’etichettatura delle sostanze tossiche, mutagene e cancerogene. Vengono indicati i criteri per definire le proprietà tossiche, eco-tossicologiche e chimico-fisiche delle sostanze chimiche e le “frasi di rischio” da apporre in etichetta. In categoria 1 (mutageni umani), basata sull’evidenza epidemiologica di effetti genetici trasmissibili (che fino a ora manca), non si trova nessuna sostanza. L’inserimento nelle categorie 2 e 3 è dedotto da test sugli animali. Tabella 16.2 Classificazione delle sostanze mutagene in base alla Direttiva 67/548/EEC DEFINIZIONI CRITERI DI CLASSIFICAZIONE Categoria 1 Sostanze di cui si conoscono gli effetti mutageni sugli esseri umani Prove positive derivanti da studi epidemiologici sulle mutazioni negli esseri umani Categoria 2 Sostanze che dovrebbero considerarsi mutagene per gli esseri umani Risultati positivi ottenuti in prove che dimostrino (a) effetti mutageni o (b) altre interazioni cellulari relative alla mutagenicità nelle cellule germinali di mammiferi in vivo, o (c) effetti mutageni sulle cellule somatiche dei mammiferi in vivo, unitamente a prove evidenti che la sostanza o un metabolita raggiungano le cellule germinali Categoria 3 Sostanze da considerare con sospetto per possibili effetti mutageni Risultati positivi da test che dimostrino (a) effetti mutageni o (b) altre interazioni cellulari relative alla mutagenicità nelle cellule somatiche dei mammiferi in vivo, normalmente confermate con risultati positivi ottenuti in prove di mutagenicità in vitro 234 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario ESPOSIZIONE PROFESSIONALE E VALUTAZIONE DEL DANNO DA XENOBIOTICI Linee guida comunitarie per la valutazione degli effetti mutageni In ambito CEE sono previste normative specifiche per la valutazione del rischio mutageno di pesticidi, additivi alimentari, mangimi, cosmetici, farmaci, sostanze a contatto con gli alimenti, biocidi, prima che i prodotti siano immessi in commercio. È fatto obbligo al produttore di procedere alla valutazione del rischio secondo le linee guida contenute nel documento TGD (technical guidance document), che illustra la strategia di saggio da seguire (tabelle 16.3 e 16.4). Sono previsti un test di mutazione genetica su batteri e un test su cellule di mammifero per evidenziare danni cromosomici. Entrambi i test sono effettuati in vitro. Per le sostanze positive a una o a entrambe le tipologie dei saggi in vitro sono previsti saggi su animali (test citogenetici sul tessuto emopoietico di roditori e saggi di danno e riparazione del DNA in fegato di ratto). La negatività a entrambi i test depone per una valutazione di rischio da effettuarsi caso per caso, tenendo nel debito conto una serie di variabili che possono influenzare la decisione finale. Se almeno uno dei test in vivo è positivo, la sostanza viene definita mutagena a livello 16 somatico e ne va valutata l’eventuale mutagenicità anche a livello germinale. Tale possibilità è teoricamente prevedibile in base alle caratteristiche tossicocinetiche e tossicodinamiche della sostanza, che permettono di non effettuare ulteriori inutili esperimenti. La sostanza viene quindi definita mutagena. In mancanza di elementi sufficienti per una decisione motivata, si dovrà procedere a ulteriori indagini su cellule germinali. Classificazione delle sostanze cancerogene La direttiva 93/72/CEE suddivide le sostanze cancerogene in tre categorie: r categoria 1, in cui sono inserite le sostanze di cui è noto l’effetto cancerogeno r categoria 2 che comprende sostanze che dovrebbero essere considerate cancerogene per l’uomo, sulla base soprattutto di studi a lungo termine effettuati sugli animali r categoria 3 che comprende sostanze sospette cancerogene, pur in assenza di informazioni sufficienti a classificarle in categoria 2. Tabella 16.3 Metodi di saggio di effetti mutageni SET DI BASE (DIRETTIVA 92/69/EEC) B.10 Test citogenetico su cellule di mammifero in vitro (OECD 473) B.11 Analisi metafasica in cellule di midollo osseo in vivo (OECD 475) B.12 Test del micronucleo in vivo (OECD 474) B.13/B.14 Reversione della mutazione in Escherichia coli/Salmonella typhimurium (OECD 471) TEST SUPPLEMENTARI (DIRETTIVA 96/54/EC) B.15 Mutazione genica: Saccharomyces cerevisiae B.16 Ricombinazione mitotica: Saccharomyces cerevisiae B.17 Cellule di mammifero in vitro: saggio di mutazione genica B.18 Danno e riparazione del DNA: sintesi non programmata del DNA in cellule di mammifero in vitro B.19 Saggio degli scambi tra cromatidi fratelli in vitro B.20 Saggio dei letali recessivi legati al sesso: Drosophila melanogaster B.21 Saggio in vitro di trasformazione di cellule di mammifero B.22 Saggio dei letali dominanti nei roditori B.23 Analisi citogenetica delle cellule germinali di mammiferi in vivo B.24 Saggio delle macchie (spot test) nel topo 235 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 16 ESPOSIZIONE PROFESSIONALE E VALUTAZIONE DEL DANNO DA XENOBIOTICI Tabella 16.4 Strategia europea per la valutazione delle proprietà mutagene di sostanze chimiche SET DI BASE (PER TUTTE LE SOSTANZE > 1 tpa) TEST SU BATTERI ULTERIORE SPERIMENTAZIONE TEST PER EFFETTI CROMOSOMICI Neg. Neg. Set di base completato; ulteriore sperimentazione (in vitro o eventualmente in vivo) richiesta solo in caso di elevati livelli di produzione (> 100 tpa) o di significativa esposizione umana Pos. Neg. Verificare l’attività mutagena in cellule di mammifero con altri test (per es. mutazione genica o UDS in vitro, test in vivo) e possibili meccanismi specifici per i batteri Neg. o Pos. Pos. Selezionare test in vivo in base all’effetto osservato in vitro e la disponibilità sistemica: per sostanze disponibili, test citogenetici su midollo o UDS nel fegato; altrimenti, test al sito di contatto (test della cometa, test di mutazione su animali transgenici) In caso di risultati positivi in vivo, considerare la possibilità di effetti trasmissibili, preliminarmente in base a proprietà tossicocinetiche e tossicodinamiche * tpa = tonnellata per anno Le sostanze comprese nelle categorie 1 e 2 (benzene, benzidina, benzopirene, amianto ecc.) devono essere contrassegnate con le sigle R45 (può provocare il cancro) o R49 (può provocare il cancro per inalazione). Le sostanze in categoria 3 (fra cui aldeide formica, ossido di etilene, benzoantracene) devono essere contrassegnate con la sigla R40 (possibili effetti cancerogeni – prove insufficienti). ESERCIZI DI VERIFICA 1. Rispondi alle seguenti domande: Spiega la differenza fra i processi di biotrasformazione e bioattivazione di uno xenobiotico. Quali sono le caratteristiche dei biomarcatori di esposizione e di effetto biologico? Che cosa indicano i biomarcatori di suscettibilità? Quali parametri misurano i biomarcatori di dose interna? Descrivi in che cosa consiste il test di Ames. Che cosa si intende per “addotto al DNA”? Quali sostanze mutagene sono comprese nella categoria 1 della classificazione secondo la direttiva 67/458/EEC? 236 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 17 1 BIODEGRADAZIONE DEI COMPOSTI ORGANICI NATURALI E DI SINTESI 17.1 Biodegradabilità e fattori condizionanti 17.2 Biodegradazione dei derivati del petrolio 17.3 Biodegradazione aerobica degli idrocarburi 17.4 Biodegradazione aerobica dello xilene 17.5 Biodegradazione degli idrocarburi policiclici aromatici (IPA) 17.6 Biodegradazione anaerobica degli idrocarburi Il problema fondamentale dell’inquinamento ambientale consiste sostanzialmente nell’immissione nella biosfera di enormi quantità di rifiuti organici, che possono essere di origine naturale o di sintesi (sostanze xenobiotiche: estranee ai componenti naturali della biosfera). La degradazione di alcuni di questi composti, a prescindere dalla loro origine, può essere vantaggiosamente effettuata da molti microrganismi. Uno degli obiettivi delle biotecnologie, in particolare con le tecniche di trasferimento di geni (ingegneria genetica), è quello di modificare o creare specie microbiche in grado di degradare in maniera sempre più efficiente le sostanze inquinanti. 17.1 Biodegradabilità e fattori condizionanti 17.7 Biodegradazione degli xenobiotici 17.8 Biodegradazione dei composti organici alogenati 17.9 Biodegradazione dei PCB 17.10 Aspetti genetici del metabolismo biodegradativo Una sostanza si definisce biodegradabile quando può essere metabolizzata e trasformata da microrganismi. I microrganismi, nella loro grande varietà, possiedono un ampio ventaglio di strategie metaboliche che conducono alla completa trasformazione delle sostanze organiche in elementi semplici quali CO2, H2O o anche CH4 e altre piccole molecole a corta catena carboniosa. In questo caso (degradazione completa della sostanza organica) la biodegradazione equivale alla mineralizzazione, con il rientro dei prodotti metabolici finali nei cicli biogeochimici della materia. Anche una biodegradazione che non porta alla completa mineralizzazione può essere comunque considerata accettabile dal punto di vista ecologico-ambientale se il composto in oggetto perde la sua tossicità. 237 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 17 BIODEGRADAZIONE DEI COMPOSTI ORGANICI NATURALI E DI SINTESI Quando invece una sostanza non è suscettibile di degradazione più o meno completa, si parla di recalcitranza e la sostanza stessa viene definita persistente se è in grado di rimanere inalterata nell’ambiente per periodi anche molto lunghi. È ovvio che il pericolo risulta maggiore se la sostanza è dotata anche di una tossicità più o meno elevata. La biodegradabilità di alcuni composti organici naturali, compresi alcuni componenti del petrolio come gli idrocarburi, è spiegabile in termini evolutivi quando si consideri il lunghissimo tempo che i microrganismi hanno avuto a disposizione per mettere a punto le opportune e specifiche strategie metaboliche. La comparsa molto più recente di un’enorme varietà di xenobiotici immessi in ambiente, non ha evidentemente consentito ai microrganismi una parallela evoluzione metabolica. A conferma di queste considerazioni rimane comunque il fatto che la biodegradabilità dei composti xenobiotici è tanto maggiore quanto più questi ultimi assomigliano ai composti naturali. La figura 17.1 illustra quale può essere il destino metabolico dei composti organici di sintesi. La possibilità di biodegradazione di un composto organico risulta legata a una serie di fattori condizionanti, così schematizzabili: r la presenza di microrganismi in grado di metabolizzarlo e il reale possesso di vie metaboliche che permettano la degradazione del composto r le caratteristiche della molecola da degradare r le condizioni ambientali in cui si verifica l’immissione della sostanza, in quanto fondamentali per la sopravvivenza dei microrganismi e la creazione di condizioni adatte allo sviluppo ottimale delle loro potenzialità metaboliche (temperatura, pH, esigenze gassose ecc.). Le caratteristiche che rendono una molecola più o meno biodegradabile sono in relazione a una serie di elementi chimico-fisici, quali la presenza di molte ramificazioni (come avviene per es. nelle molecole dei detergenti anionici), le grandi dimensioni molecolari e la struttura polimerica (che richiede la capacità microbica di produrre innanzitutto enzimi in grado di liberare i monomeri costituenti), la presenza di sostituenti alogeni (Cl, Br, I, Fl) o di gruppi nitro (−NO2). Tutte queste caratteristiche influenzano in modo negativo la biodegradabilità di un composto e la rendono problematica e spesso impossibile (figura 17.2). Dal punto di vista fisico la solubilità in acqua delle Composti organici di sintesi Simili a composti naturali Strutture non esistenti in natura Attaccabili dai microorganismi Mineralizzazione Co-ossidazione: parziale ossidazione del composto in presenza di un composto degradabile strutturalmente analogo CICLO DELLA MATERIA Bioaccumulo o polimerizzazione Integrazione nelle matrici ambientali Recalcitranti: composti che tendono a mantenere inalterate le loro caratteristiche chimico-fisiche Persistenza Inquinamento Figura 17.1 Destino dei composti organici di sintesi. 238 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 17 BIODEGRADAZIONE DEI COMPOSTI ORGANICI NATURALI E DI SINTESI Cl Cl CH3 Cl Cl Cl Cl Cl O3N NO3 Cl O Cl Cl O Cl Cl NO3 Esaclorocicloesano Trinitrotoluene (TNT) Tetraclorodibenzodiossina Policlorobifenile (PCB) Figura 17.2 Xenobiotici non biodegradabili. La non biodegradabilità è dovuta alla presenza di sostituenti cloro e nitro. molecole inquinanti è una caratteristica assai importante: poiché i microrganismi sono attivi soprattutto in ambiente acquoso o comunque in substrati con valori elevati di aw (activity water), ne consegue che composti idrosolubili sono degradabili più facilmente di altri. Informazioni dettagliate su inquinanti e vie metaboliche microbiche per la loro degradazione sono reperibili all’indirizzo http://umbbd.msi.umn.edu nel “Biocatalysis and Biodegradation database” (Minnesota University). 17.2 Biodegradazione dei derivati del petrolio Il petrolio deriva dalla trasformazione anaerobia di materiali vegetali in condizioni di elevata temperatura e pressione. È costituito da una miscela di idrocarburi (componenti maggioritari), acidi naftenici, fenoli e composti eterociclici che contengono azoto e zolfo. Gli idrocarburi (molecole formate da carbonio e idrogeno) possono essere suddivisi in (figura 17.3): ❖ aromatici, in cui sono presenti uno o più anelli benzenici ❖ alifatici, costituiti da catene lineari o ramificate oppure a struttura ciclica. Comprendono idrocarburi saturi (alcani) e insaturi (alcheni e alchini). Dal punto di vista fisico gli idrocarburi a più basso PM sono gassosi, gli altri sono liquidi o solidi a temperatura ambiente. Poiché il petrolio è un prodotto di origine naturale, è comprensibile che l’evoluzione abbia selezionato microrganismi capaci di degradare alcuni dei suoi compo- H H H H H H C C C C H H H H H C H H H H CH3 H H C H3C H a) b) c) Figura 17.3 Idrocarburi. Formula del butano, un alcano (a); del butene, un alchene (b); del benzene, un aromatico (c). nenti più semplici (cioè a minor peso molecolare), come gli idrocarburi. Tali microrganismi, procarioti, sono indicati con il nome di batteri idrocarburo-ossidanti e sono in grado di utilizzare gli idrocarburi come unica fonte di carbonio e sorgente di energia. Poiché il petrolio ha un ruolo così centrale nella società industrializzata e non sono rari i casi di contaminazione accidentale dell’ambiente (soprattutto acquatico) durante l’estrazione e il trasporto del greggio, lo studio dei microrganismi in grado di operare la mineralizzazione degli idrocarburi ha assunto un’enorme importanza nel settore biotecnologico, con l’obiettivo di selezionare e creare i ceppi e le varietà più efficienti in tal senso. La biodegradazione degli idrocarburi è stata particolarmente studiata relativamente ai processi aerobi, che si sono rivelati più veloci e redditizi rispetto a quelli anaerobi, che pur esistono. Tale degradazione richiede la presenza nei batteri di catene di trasporto degli elettroni che convogliano il potenziale riduttivo (NADH) fino all’accettore finale, che è appunto l’ossigeno (metabolismo respiratorio). Si producono CO2 ed energia, ma dal processo i batteri ricavano anche piccole molecole a 2 o 4 atomi di C che utilizzano per le biosintesi. I batteri che si sono rivelati più efficienti in queste degradazioni 239 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 17 BIODEGRADAZIONE DEI COMPOSTI ORGANICI NATURALI E DI SINTESI a) Monossigenasi: catalizzano l’incorporazione di un solo atomo di ossigeno molecolare sul substrato 1) Monossigenasi aromatiche R O2 H2O 2) Monossigenasi di gruppi alchilici R O2 OH NADH + H+ H2O R—(CH 2 ) n—CH 3 R—(CH 2 ) n—CH 2—OH NADH + H+ NAD+ NAD+ b) Diossigenasi: catalizzano l’incorporazione di entrambi gli atomi di ossigeno molecolare sul substrato 1) Diossigenasi di attivazione dell’anello aromatico R 2) Diossigenasi di apertura dell’anello aromatico R O2 O2 OH OH H H OH OH NADH + H+ COOH COOH NAD+ Figura 17.4 Reazioni catalizzate da monossigenasi (a) e diossigenasi (b). metaboliche appartengono al genere Pseudomonas, facilmente coltivabili in laboratorio. Altri batteri interessanti in questo ambito sembrano essere alcuni attinomiceti, attivi soprattutto in ambiente tellurico caratterizzato da una concentrazione di inquinanti non eccessivamente elevata. 17.3 Biodegradazione aerobica degli idrocarburi La capacità biodegradativa dei batteri idrocarburo-ossidanti è da far risalire in primo luogo al possesso di particolari enzimi, le ossigenasi. Gli enzimi appartenenti a questa classe sono monossigenasi (o ossigenasi a funzione mista), che agiscono su idrocarburi alifatici e aromatici, e diossigenasi, che agiscono prevalentemente su idrocarburi aromatici (figura 17.4). Le ossigenasi introducono ossigeno nella molecola da degradare, rendendola più reattiva e aumentandone l’idrosolubilità. Si tratta di enzimi endocellulari complessi a più componenti, che risultano attivi esclusivamente all’interno della cellula batterica: ne consegue che gli idrocarburi devono in ogni caso essere introdotti nell’ambiente endocellulare per poter subire la successiva degradazione. La degradazione degli idrocarburi alifatici avviene generalmente per ossigenazione del gruppo metilico (−CH3) terminale della catena e con la conseguente trasformazione in gruppo alcolico (figura 17.5). Successive ossidazioni portano alla sua trasformazione in gruppo aldeidico e quindi carbossilico. Si ottiene in pratica un acido grasso, che come tale viene degradato con un processo di β-ossidazione. Gli idrocarburi aromatici devono in primo luogo subire modificazioni dell’anello benzenico, che portano comunque alla sua apertura. Il processo inizia con una sorta di destabilizzazione dell’anello attraverso introduzione di almeno due gruppi ossidrilici, con la formazione di intermedi diidrossilati (difenoli) da cui si 240 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario BIODEGRADAZIONE DEI COMPOSTI ORGANICI NATURALI E DI SINTESI CH3—(CH2)n—CH3 n-alcano NADH + H+ O2 NAD+ H 2O Alcano monossigenasi CH3—(CH2)n—CH2OH Alcol NAD+ NADH + Alcol deidrogenasi H+ CH3—(CH2)n—CHO Aldeide NAD+ Aldeide deidrogenasi NADH + H+ CH3—(CH2)n—COOH Acido carbossilico β-ossidazione Figura 17.5 Degradazione di un idrocarburo alifatico. La degradazione avviene mediante ossidazione del gruppo metilico terminale. originano composti lineari che possono entrare nel ciclo degli acidi tricarbossilici (ciclo di Krebs). È da notare che le reazioni iniziali del processo possono non essere energeticamente produttive (come del resto avviene nella glicolisi), ma sono comunque indispensabili per le successive tappe ossidative che permettono una resa energetica elevata. 17.4 Biodegradazione aerobica dello xilene Gli xileni sono idrocarburi formati da un anello benzenico con 2 sostituenti metilici in posizione variabile. Fanno parte della miscela di idrocarburi denominata BTEX, componenti principali delle benzine e impiegati anche come solventi e nella produzione di vernici e plastiche. I tre isomeri dello xilene sono praticamente identici come proprietà chimico-fisiche, ma vengono degradati in modo diverso. L’o-xilene viene degradato attraverso l’introduzione diretta di ossigeno da monoe diossigenasi. Se questo si verifica negli isomeri meta e para, l’intermedio formatosi non può subire ulteriore degradazione con la conseguente morte della cellula. 17 Nel caso di questi due isomeri, la degradazione procede per ossidazione progressiva di un gruppo metilico con successivo allontanamento come CO2 (figura 17.6). 17.5 Biodegradazione degli idrocarburi policiclici aromatici (IPA) La degradazione di questi composti si presenta più complessa di quella che avviene negli idrocarburi monoaromatici. La biodegradazione microbica è relativamente efficiente per i composti formati da un massimo di tre anelli, mentre i composti con un numero di anelli maggiore risultano pressoché non biodegradabili. Questo fenomeno è attribuibile alla loro idrofobicità e alle loro dimensioni, che ne rendono in pratica impossibile l’introduzione nella cellula batterica. La degradazione, laddove possibile, prevede l’intervento delle diossigenasi. 17.6 Biodegradazione anaerobica degli idrocarburi Anche se le conoscenze sulle vie di degradazione degli idrocarburi in anaerobiosi non sono ancora sufficientemente approfondite, si può senza dubbio affermare che diversi batteri appartenenti al gruppo dei solfato-riduttori (anaerobi obbligati) o denitrificanti (facoltativi), nonché alcuni batteri rossi non sulfurei (Rhodopseudomonas) sono attivi in questo senso. La degradazione anaerobica non può ovviamente prevedere gli stessi meccanismi di attivazione degli idrocarburi che si verificano nel caso del metabolismo aerobico. Per quanto riguarda gli idrocarburi alifatici, è noto il sistema di attivazione per addizione di acido fumarico che porta alla produzione di acidi grassi (figura 17.7). Gli idrocarburi aromatici sono stati studiati utilizzando molecole-modello come il benzene o il toluene e si ritiene che l’evento centrale dell’attivazione microbica consista nella conversione in benzoil-CoA. Le tappe prevedono la riduzione dei doppi legami, l’addizione di una molecola di H2O, la formazione di un chetone e la successiva apertura dell’anello per idrolisi. Si forma un acido grasso che, attraverso un meccanismo di β-ossidazione produce infine acetil-CoA, molecola centrale del metabolismo cellulare. 241 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 17 BIODEGRADAZIONE DEI COMPOSTI ORGANICI NATURALI E DI SINTESI Ossidazione del metile (via TOL) Ossidazione dell’anello aromatico CH3 CH3 CH3 CH3 C2,3O Apertura dell’anello OH OH 3,4-dimetil catecolo o-xilene CH2OH CH3 CH3 3-metil benzilalcol CH2OH CH3 CH3 CH3 HO OH 3,5-dimetil catecolo m-xilene CH3 CH3 OH CH3 CH3 4-metil benzilalcol p-xilene OH CH3 3,6-dimetil catecolo Figura 17.6 Vie di degradazione degli xileni. Il simbolo ––I indica che la reazione non avviene o porta a metaboliti improduttivi per la degradazione. CH3—CH2—CH2—CH2—CH2—CH3 Esano + COO——CH=CH—COO— CH3—CH—CH2—CH2—CH2—CH3 COO——CH—CH2—COO— 1-metilpentilsuccinato Fumarato Figura 17.7 Addizione di fumarato nella degradazione anaerobica degli idrocarburi alifatici. 17.7 Biodegradazione degli xenobiotici Con il nome di xenobiotici (dal greco, xenos = estraneo) vengono indicati i composti organici che possiedono una struttura non rilevabile in alcun composto di origine naturale. Appartengono a questa categoria composti insetticidi e pesticidi e polimeri utilizzati nella produzione di oggetti in plastica. Una delle caratteristiche di questi prodotti è la stabilità chimica, la capacità cioè di non subire modificazioni: questo ha come contropartita la loro permanenza in ambiente per tempi lunghissimi, fino a rivelarsi pressoché perenne. Il problema è parti- 242 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 17 BIODEGRADAZIONE DEI COMPOSTI ORGANICI NATURALI E DI SINTESI OCH2—COOH OCH2—COOH Cl Cl Cl Cl Cl 2,4-Diclorofenossiacetico (2,4-D) (4-5 giorni) 2,4,5-Triclorofenossiacetico (2,4,5-T) (20 giorni) RE C AL C I T R AN Z A CH2—CH3 COCH2Cl NHCOOCH(CH3)2 N CH2OCH3 CH2—CH3 Propham (5-15 giorni) Alachlor (15-30 giorni) RE C AL C I T R AN Z A CH3—O CH O—CH3 Cl Cl CH CCl3 CCl3 Methoxychlor (6-12 mesi) DDT (2-12 anni) RE C AL C I T R AN Z A CO—NH—CH3 Cl O Cl CH2 Cl-C-Cl Cl Carbaryl (1-3 mesi) Cl Aldrin (2-10 anni) Figura 17.8 Xenobiotici e biodegradabilità. La resistenza alla biodegradazione aumenta con l’aumentare del numero di sostituenti; in parentesi è indicato il tempo medio di emivita nel suolo. colarmente grave nel caso in cui questi composti siano tossici, cancerogeni o mutageni. Alcune di queste molecole, come il DDT, subiscono inoltre una bioconcentrazione nei tessuti animali fino a raggiungere concentrazioni molto superiori a quelle registrate nell’ambiente in cui l’animale vive, e sono soggette a biomagnificazione passando da un livello tro- fico a quello successivo nelle catene alimentari. Simili considerazioni hanno spinto la ricerca verso la sintesi di composti con tempi di permanenza in ambiente più brevi: confrontando molecole datate con altre molto simili ma di sintesi più recente si può notare come spesso la resistenza alla biodegradazione sia legata a un alto numero di sostituenti (figura 17.8). 243 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario 17 BIODEGRADAZIONE DEI COMPOSTI ORGANICI NATURALI E DI SINTESI 17.8 Biodegradazione dei composti organici alogenati In questi composti la possibilità di biodegradazione è legata all’attività di microrganismi in grado di allontanare l’alogeno, rendendo disponibile la parte restante della molecola per altri microrganismi in grado di utilizzarla. Spesso la degradazione dei composti alogenati è un fatto casuale, originato da processi di co-metabolismo: con questo termine si indica la trasformazione metabolica di una sostanza ad opera di enzimi in realtà destinati a catalizzare altre reazioni. Il microrganismo non trae da questa attività catabolica alcun vantaggio in termini energetici; questo fenomeno si verifica perché spesso il composto così metabolizzato assomiglia per analogia di struttura al nutriente che il microrganismo introduce per la propria crescita. 17.9 Biodegradazione dei PCB I PCB (bifenili policlorurati) sono composti impiegati come pesticidi, lubrificanti e isolanti, la cui utilizzazione è stata proibita in molti paesi per la loro tossicità, ma che permangono ancora in ambiente. Anche se non sembra che esistano microrganismi in grado di compierne la degradazione, sono noti tuttavia alcuni casi di trasformazione microbica parziale di tali composti. La degradazione aerobica implica una sorta di consorzio microbico in cui intervengono batteri aerobi appartenenti ai generi Pseudomonas, Burkholderia, Rhodococcus, Achromobacter. Questi microrganismi, che utilizzano il bifenile come unica fonte di carbonio e di energia, si sono dimostrati in grado di attaccare, oltre al bifenile, anche il 4,4′-diclorobifenile. Tale composto, però, non può subire una degradazione completa, e produce intermedi metabolici che si accumulano con effetti negativi sulla po- polazione batterica. La capacità degradativa si deve alla produzione dell’enzima bifenile-diossigenasi, in grado di introdurre gruppi ossidrile nel composto. In alcuni casi il processo porta contestualmente all’allontanamento del cloro (dealogenazione). Sono stati osservati anche altri gruppi di batteri (presenti nei sedimenti) in grado di compiere la degradazione anaerobica dei PCB. 17.10 Aspetti genetici del metabolismo biodegradativo Le coltivazione in laboratorio dei ceppi batterici coinvolti nelle vie metaboliche di degradazione degli idrocarburi (principalmente Pseudomonas e generi affini) ha permesso di approfondire le conoscenze sulla genetica dei ceppi interessati e, aspetto assai importante, ha costituito la base per la loro manipolazione genetica alla ricerca di varietà metabolicamente più efficienti. Si conoscono e vengono studiati gli operoni che in Pseudomonas recano i geni interessati alla degradazione metabolica di diversi idrocarburi. Nella maggior parte dei casi questi geni sono raggruppati in uno stesso operone e quindi trascritti insieme in un unico RNA messaggero. Più raramente tali geni si trovano in operoni distinti. In entrambi i casi la loro collocazione può essere cromosomica o plasmidica. Gli enzimi per la degradazione degli idrocarburi sono in genere enzimi inducibili, vengono cioè prodotti solo in presenza dello specifico substrato da degradare. Un esempio è costituito da due ceppi di Pseudomonas: il ceppo F1, in grado di metabolizzare il benzene aprendone l’anello aromatico, e il ceppo B13 in grado di degradare composti clorati (clorocatecoli). Impiegando come agente selettivo 1,4-diclorobenzene, è stato isolato un ceppo ricombinante che utilizza questo composto come unica fonte di carbonio ed energia. 244 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario ESERCIZI DI VERIFICA 1. Rispondi alle seguenti domande: Qual è la differenza fra biodegradazione e mineralizzazione? Indica quali sono i fattori che influiscono sulla biodegradabilità di una sostanza. Quali caratteristiche molecolari rendono una molecola organica più o meno biodegradabile? Per quale motivo esistono microrganismi in grado di biodegradare alcuni componenti del petrolio? Che cosa sono, dove hanno sede e come agiscono le ossigenasi? Quali processi sono alla base della biodegradazione degli idrocarburi alifatici? E di quelli aromatici? Che cosa si intende con l’acronimo BTEX? Quali batteri sono attivi nella biodegradazione anaerobica degli idrocarburi? Che cosa si intende per co-metabolismo? Perché si verifica? Gli enzimi microbici per la biodegradazione degli idrocarburi sono in genere inducibili o costitutivi? Illustra il significato dei termini. 245 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario BIBLIOGRAFIA C. Baird, M. Cann, Chimica ambientale, Zanichelli, 2006. P. Barbieri, G. Bestetti, Microbiologia ambientale, Casa Editrice Ambrosiana, 2008. M. Manzoni, Microbiologia industriale, Casa Editrice Ambrosiana, 2005. L. Migliore, Mutagenesi ambientale, Zanichelli, 2004. B. Biavati, C. Sorlini, Microbiologia agroambientale, Casa Editrice Ambrosiana, 2008. A. Pavone, R. Paolucci, Biologia e microbiologia dell’ambiente e degli alimenti, Zanichelli 2012. B. Biavati, C. Sorlini, Microbiologia generale e agraria, Casa Editrice Ambrosiana, 2007. A. Tagliaferri, C. Grande, Biotecnologie e chimica delle fermentazioni, Zanichelli, 2002. P. Cappelli, V. Vannucchi, Chimica degli alimenti, Zanichelli, 2005. M. Stefani, N. Taddei, Chimica, biochimica e biologia applicata, Zanichelli, 2008. D. Crommelin, R. Sindelar, Biotecnologie farmaceutiche, Zanichelli, 2000. Come nasce un farmaco, Ministero dell’Università e della Ricerca – Istituto Nazionale di ricerca sul cancro, Genova, 2006. S. Donadio, G. Marino, Biotecnologie microbiche, Casa Editrice Ambrosiana, 2008. M.G. Fiorin, Biologia e microbiologia ambientale e sanitaria, Zanichelli, 2012. Normative Europee “pacchetto igiene”, EFSA (Agenzia Europea per la Sicurezza Alimentare), www.europass.parma.it E. Lanciotti, Biologia e microbiologia sanitaria, Zanichelli, 2012. 246 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario INDICE ANALITICO A acclimatazione, 110 aceto balsamico tradizionale di Modena e Reggio Emilia, 96 Acetobacter, 21 Achromobacter, 169 acidi grassi insaturi, 63 acido acetico, 141 l-ascorbico, 142 benzoico, 140 citrico, 142 clavulanico, 88 fenilacetico, 37 fenossiacetico, 37 gluconico, 61 glutammico, 65 lattico, 59, 141 ortofosforico, 142 piruvico, 7 poli-beta-idrossibutirrico, 58 polilattico, 60 propionico, 141 sorbico, 140 tartarico, 142 acidophilus milk, 100 aconitasi, 60 acqua, 97 acqua libera, 123 acque profonde, 219 superficiali, 219 acridine, 25 activity water (aw), 123 adattamento indotto, 13 addensanti, 102 addizione di acido fumarico, 243 adsorbimento, 46 adulterazione, 167 aerazione, 40 aerobiosi, 67 affinità di un enzima per uno specifico substrato, 16 affioramento naturale, 178 aflatossina B1, 223 aflatossine, 161, 219 agar-agar, 142 agente tossico, 213 agenti che migliorano la solubilità, 74 che reagiscono con il DNA, 218 di distacco, 128 genotossici, 213 intercalanti, 218 Agrobacterium tumefaciens, 107 AIC, 200 air-lift a circolazione esterna, 43 a circolazione interna, 43 alcani, 241 alcheni, 241 alchini, 241 alcol-tolleranza, 62 algoritmo di screening, 24 alimenti deperibili, 120 semideperibili, 120 stabili, 120 allele, 214 ALT, 15 alterazione, 167 amebiasi, 161 amido, 34, 35 α-amilasi, 15 amilasi, 12, 66 aminoglicosidici, 88 ammine aromatiche, 219 eterocicliche, 220 ammostamento o saccarificazione, 98 AMP-ciclico, 159 anabolizzanti ormonali, 127 analisi cromatografica, 24 analoghi delle basi, 25, 218 anatossine, 76 androgeni, 86 anello tiazolidinico, 89 anello β-lattamico, 89 anidride carbonica, 141 anidride solforosa, 140 anilina, 226 antibiotici 37, 53, 127 β-lattamici, 87 naturali, 87 semisintetici, 87 anticorpi monoclonali, 70, 79, 113 anticrittogamici, 127 antigeni ricombinanti per la produzione di vaccini, 113 antimetaboliti, 218 antiparassitari, 91 antitumorali, 91 antracicline, 219 apiculati, 94 247 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario INDICE ANALITICO apoenzima, 12 apoptosi, 217 applicazione topica, 191 Arthrobacter, 21 asbesto, 219 ASC, 197 asparaginasi, 66 Aspergillus niger, 60 assorbimento, 191 AST, 15 atmosfera controllata, 135 modificata in equilibrio, 136 protettiva, 135 ATP, 3 attinomiceti, 241 attivazione metabolica, 222 attività degli enzimi, 16 attività fermentativa, 120 auxine, 110 azione meccanica, 43 B Bacillus, 21, 57 Bacillus thuringiensis, 57, 109 baffles, 43 banche, 208 batteri, 21, 26 idrocarburo-ossidanti, 239 lattici, 174 rossi non sulfurei, 242 benzene, 218 bersaglio farmacologico, 195 bifenile-diossigenasi, 244 bilancio energetico complessivo, 5 bioaccumulo, 227 bioattivazione, 222 biocatalizzatori, 11, 30 bioconcentrazione, 221, 243 bioconversione, 30, 38, 84 biodegradazione, 237 degli idrocarburi, 239 biodisponibilità, 191 bioetanolo, 62 bioindicatori, 226 bioluminescenza, 163 biomagnificazione, 227, 243 biomarcatori, 231 di dose biologica efficace, 233 di dose interna, 233 biomasse microbiche, 37, 53 bioreattore a fibre cave, 79 ad agitazione pneumatica, 43 biosensori 48 biotecnologie microbiche, 11 biotrasformazione, 49, 191, 221 blastocele, 203 blastocisti, 203 blastula, 203 bleomicina, 218 Bordetella pertussis, 78 Brochothrix thermosfacta, 168 BTEX, 241 C cadmio, 128 caffeina, 223 cagliata, 178 callo cicatriziale, 107 campione, 24 biologico, 232 casuale, 164 rappresentativo, 164 carbammati, 218 carenza nutrizionale, 31 carica microbica, 123 carotenoidi, 68 caseina, 174 catalasi, 66 catena respiratoria, 4 cefalosporine, 87 cellulasi, 35 cellule di mammifero, 72 microbiche, 11 multipotenti, 204 staminali, 204 staminali adulte, 205 staminali embrionali, 205 staminali emopoietiche, 206 staminali pluripotenti indotte (iPS), 210 totipotenti, 204 tumorali di mieloma, 79 cellulosa, 35 CEN, 146 Centro Nazionale Sangue, 207 Centro Nazionale Trapianti, 207 ceppi enteroemorragici, 154 ceppi invasivi, 154 ceppo B13, 244 ceppo F1, 244 certificazione di conformità, 143 challenge test, 150 chemioautotrofi, 4 chemioeterotrofi, 4 chemiolitotrofi, 4 chemiorganotrofi, 4 chemiostato, 45 chemiotrofi, 4 chimica combinatoriale, 195 ciclo di Krebs, 4 cisti, 160 citochine, 80 citochinine, 110 classe I, 208 classe II, 208 classe III, 208 clearance renale, 193 Clostridium, 21 Clostridium botulinum, 156 Clostridium perfringens, 157 Codex Alimentarius, 138 coefficiente di resa (Y), 45 coenzimi, 12, 13 cofattori, 12, 13 coliformi, 154 coltura discontinua, 44 di batteri azotofissatori, 38 starter, 38 co-metabolismo, 244 complesso intermedio EnzimaSubstrato (ES), 16 componente biologica, 48 elettronica, 48 composti inorganici, 34 composti-guida, 195 condizioni di aerazione, 32 condizioni igieniche d’allevamento, 176 conducibilità termica, 133 conduzione, 133 congelamento, 74 coniugazione, 26, 222 conservanti, 74 conservazione dedicata, 209 conserve sott’aceto, 139 conserve, 134, 171 contaminazione microbica delle uova, 185 primaria, 119 248 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario INDICE ANALITICO quaternaria, 119 secondaria, 119 terziaria, 119 contraffazione, 166 controlli, 147 di stabilità delle conserve, 172 di stabilità delle semiconserve, 172 in ingresso, 45 convezione, 133 cordone ombelicale, 205 Corynebacterium glutamicum, 21 costante di Michaelis-Menten, 16 costitutivi, 12 cottura dei cibi, 219 CPK, 15 cremoso o a coagulo rotto, 182 criteri di igiene di processo, 164 criteri di sicurezza alimentare, 164 criterio microbiologico, 164 critical point, 148 cromosomica, 244 cross-over, 199 CTP, 3 D decoloranti, 128 decozione, 98 degradazione, 237 deidrogenasi, 12 deidrogenazione, 4 demetallizzanti, 128 denitrificanti, 241 detergenti, 128 difenile, 140 differenziamento cellulare, 202 digitossina, 115 diosgenina, 86 diossigenasi, 240 Dipartimento per la farmacovigilanza, 199 diserbanti, 127 disinfettanti, 128 distribuzione, 191 DNA polimerasi, 67 doppio cieco, 197 downstream, 31 E ectoderma, 204 effetto biologico, 232 biologico delle radiazioni, 215 batteriostatico, 135 Crabtree, 55 Pasteur, 62 teratogeno, 200 Eh negativo, 125 Eh positivo, 125 EHEC, 154 EIA, 162 EIEC, 154 elettronici, 48 elettroporazione, 27 eliminazione di basi azotate, 216 ELISA, 163 ematocrito (Ht), 84 embrione, 203 emicellulosa, 35 emulsionanti, 102 endoderma, 204 energia di attivazione, 12 enteropatogeni, 154 enterotossina, 153 Entner-Doudoroff, 8 enzimi, 11, 38, 128 di superficie, 66 endocellulari, 66 extracellulari, 66 pectinolitici, 66 EPEC, 154 eritropoiesi, 83 ES, 13 Escherichia, 154 Escherichia coli, 21 escrezione, 192 esochinasi, 17 esosofosfato, 8 espianto, 110 esposizione, 232 essiccamento I, 74 essiccamento II, 74 esteri dell’acido p-idrossibenzoico, 140 estratto di lievito, 35 estratto di malto, 33 estrogeni, 86 ETEC, 154 eterocarion, 26 eucarioti, 26 eventi provocati, 24 ex vivo, 115 excisione di nucleotidi, 220 extracellulari, 12 F falsificazione, 166 FAME, 163 farina di semi di soia e di cotone, 35 farina, 100 farmaci antineoplastici, 113 farmacocinetica, 197 farmacodinamica, 197 fase clinica, 194 downstream, 31 I, 90, 222 II, 90, 222 IV, 199 preclinica, 194 upstream, 31 FDA, 148 febbre maltese, 159 paratifoide, 155 tifoide, 155, 156 fed-batch, 32 a ciclo unico, 45 ripetuto, 46 feedback, 18 fenoli, 220 fenomeni alterativi, 119 naturali, 24 fermentazione, 6 acida, 99 acido-mista, 7 alcolica, 7 butandiolica, 7 butirrica, 7 eterolattica, 7 lenta, 98 omolattica, 7 propionica, 7 tumultuosa, 98 fermenti lattici, 179 FIA, 48 fibre di vetro, 219 filtrazione, 49, 176 fitormoni/fitoregolatori, 127 flavonoidi, 223 flocculazione, 50 flottazione, 50 foglietti embrionali, 203 fosfatasi, 175 alcalina, 15 249 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario INDICE ANALITICO fosforilazione, 3 a livello del substrato, 3 ossidativa, 3 fotoautotrofi, 4 fotoeterotrofi, 4 fotofosforilazione, 3 fotolitotrofi, 4 fotorganotrofi, 4 fotoriattivazione, 220 fototrofi, 4 freeze drying, 139 fresco di alta qualità, 177 fresco pastorizzato, 177 frodi commerciali, 166 sanitarie, 165 frollatura, 166 fumi, 219 funghi filamentosi, 21 fuseloil, 64 G β-galattosidasi, 66 gas, 219 gastrulazione, 203 GCP, 197 gelatina, 142 gelatinizzazione, 35 gelificanti, 102 gene marcatore, 108 operatore, 19 polimorfico, 223 promotore, 19, 108 regolatore, 19 repressore, 19 strutturale, 19 genomica funzionale, 111 strutturale, 111 germi patogeni, 119 psicrofili, 135 gibberelline, 110 gliadina, 99 glicerina, 64 glicolisi, 4, 6 glicoproteine, 71 GLP, 198 glucochinasi, 17 glucocorticoidi, 86 Gluconobacter oxydans, 86 glutammato monosodico, 142 glutenina, 99 glutine, 99 GMP, 197 good manufactoring practices, 73 GPT, 15 GTP, 3 GUS, 108 H HACCP, 148 hazard, 148 High Throughput Screening, 195 hit, 24 HLA, 208 HTST, 134 I ibridazione dei caratteri, 27 ibridoma, 79 idiofase, 37, 89 idoneità degli ingredienti, 164 idrocarburi, 239 alifatici, 240 alogenati, 218 aromatici, 240 idrolisi delle maltodestrine, 35 idrosolubili, 67 imatinib, 113 immobilizzazione, 45 immunoseparazione, 80 impedenzometria, 163 impellers, 43 inattivattori, 18 incapsulamento, 46 inclusione in gel, 46 indicatori di inquinamento fecale, 154, 165 di processo, 121 di qualità, 122 di rischio biologico, 165 indice chimico di alterazione, 123 induttore, 19 infezioni alimentari, 121 infusione, 98 inibitori della mitosi, 218 inibizione a feedback, 20 competitiva, 18 non competitiva, 18 per analogia di struttura, 18 inquinamento atmosferico, 226 inquinanti inorganici, 228 organici, 228 insaccati cotti, 172 freschi, 172 stagionati, 172 insetticidi, 127 insulina, 81 interazione con altri farmaci, 200 interazioni covalenti, 46 interferoni, 70, 80 intermedi diidrossilati, 240 intossicazioni alimentari, 121 ione nitronio, 223 ionizzazione degli atomi, 215 IPA, 218, 219 irraggiamento, 133 ISO 22000, 146 ISO 9000, 145 ISO, 145 isolamento di colture, 23 selettivo, 26 K kefir, 100 Km, 16 kos, 100 kumis, 100 L Lactobacillus, 21 Lactobacillus delbrueckii, 59 latte a lunga conservazione, 177 delattosato, 175 pastorizzato, 177 pastorizzato a temperatura elevata, 177 lattobacilli, 174 lattosio, 175 LDH, 14 lead compounds, 195 lecitine, 142 legami ad alta energia, 3 leg-emogobina, 57 leucemia mieloide cronica, 114 librerie, 195 250 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario INDICE ANALITICO lieviti, 21, 97 lieviti selezionati, 38 lignina, 35 limite di accettabilità, 122 linea germinale, 213 lipasi, 66 lipidi, 175 liposolubili, 67 liquefazione, 35 liquido amniotico, 205 liscivio solfitico, 33 LT, 79 lubrificanti, 128 luppolo, 97, 98 M macrolidi, 88 malattia di Lyme, 79 malattie autoimmuni, 209 maltazione, 97 malto, 98 maltodestrine, 35 marchio CE, 146 marker, 28 materie plastiche, 127 mazun, 100 melassi, 33 mercurio, 128 mesoderma, 204 metaboliti, 49 endocellulari, 49 extracellulari, 49 primari, 37 secondari, 37 metalli pesanti, 219 metilmercurio, 128 metodi biologici, 49 mezzi chimici, 50 diagnostico, 80 fisici, 49 MHC, 208 micotossine, 160 microbiologia industriale, 6 microbiologiche, 119 micrococchi, 174 microfiltrazione, 177 microonde, 137 micropropagazione, 110 microrganismi acidificanti, 176 alofili, 139 geneticamente modificati (MGM), 21 indicatori, 162 probiotici, 182 psicrofili, 176 uccisi o inattivati, 76 vivi ma attenuati, 76 midollo osseo, 206 mieloma multiplo, 29 mineralcorticoidi, 86 mineralizzazione, 237 mitomicina, 218 modalità di conservazione, 123 modalità di recupero, 49 molecole farmacologicamente attive, 106 monitoraggio su matrici ambientali, 226 monossigenasi citocromo P450 dipendenti (CYP), 222 morte cellulare programmata, 217 morula, 203 mosto, 63, 96 muffa bianca, 174 muffe, 159 mutagenesi, 23 ambientale, 212 inserzionale, 116 mutageni diretti, 217 indiretti, 217 mutanti auxotrofi, 31 mutazioni, 213 cromosomiche, 25, 213 geniche, 25, 213 genomiche, 214, 26 indotte, 25 somatiche, 212 spontanee, 25 Mycobacterium, 21 N NAD+, 13 NIF (nitrogen fixation), 109 nisina, 140 nitrato, 141 nitrito, 141 nitrogenasi, 57 nitrosammine, 141, 220, 219 notocorda, 204 novobiocina, 88 O ocratossina, 160 olio, 139 oloenzima, 12 omogeneizzazione, 176 opanoidi, 63 operone, 19, 244 opine, 107 ormoni, 81 β-ossidazione, 240 ossidazione, 4 ossigenasi, 240 P packaging di espressione, 116 paratifo, 156 paste fresche e farcite, 188 paste secche, 188 pastorizzazione, 99 patulina, 160 PCB, 244 PCR, 163 pectina, 142 PEG, 79 penicillina, 87 acilasi, 66 G, 37 V, 37 peptoni, 35 periodo di emivita, 224 perossidasi, 175 pH, 125, 134 piani di campionamento, 164 piante geneticamente modificate, 107 piombo, 128 piridossalfosfato, 14 polifosfati, 142 poliidrossialcanoati, 58 polimeri biodegradabili, 60 polveri e particolato, 219 potenziale redox, 125 potere riducente, 6 prebiotici, 182 pretrattamenti, 33 processi a membrana, 50 anaerobi, 6 in continuo, 45 produttivi, 151 prodotti alimentari, 38 251 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario INDICE ANALITICO complessi, 38 fermentati, 173 inorganici, 127 metabolici, 11 organici, 127 probiotici, 182 finali, 151 produzione dello yogurt, 182 in immersione, 96 in superficie, 96 industriale, 95 promutageni, 217 proteasi alcaline, 66 proteina anomala, 114 ad attività catalitica, 11 glicosilata, 71 immunogena, 77 ricombinanti, 113 protoplasti, 27 protozoo, 160 Pseudomonas, 168, 240 punto di dimezzamento, 14 Punto di Morte Termica, 132 putrefazione, 119 Q qualità dello yogurt, 182 igienica, 119 microbiologica, 119 sanitaria, 119 R radiazioni ionizzanti, 137 non ionizzanti, 137 UV, 216 radicali liberi, 216 radicazione, 110 radon, 214 raggi X, 25, 215 raggi γ, 215 rancidità, 120 reattore anaerobico, 42 recalcitranza, 238 record linkage, 200 reduttasi, 175 refrigerazione del latte, 176 regime di condizionamento, 207 relazione dose/risposta, 193 resa, 45 respirazione aerobia, 4 anaerobia, 5 resveratrolo, 223 Rhizopus, 21 riciclaggio, 45 ricombinazione genetica, 107 rifamicine, 88 rintracciabilità, 147 riparazione per excisione di basi, 220 per ricombinazione, 220 risposta biologica, 233 RNA, 163 RNA polimerasi, 19 S saccarosio, 35 Saccharomyces, 21 Saccharomyces cerevisiae, 54 saggi di attività, 24 salagione, 139 salami, 173 Salmonella, 155 Salmonella typhi, 156 salmonellosi, 155 sanitizzazione, 176 scambiatori di calore, 133 SCP (single cell proteins), 54 screening, 23, 195 primario, 23 secondario, 23, 24 segmentazione, 203 selezione casuale, 26 seme sessato, 112 semiconserve, 134, 171 semole, 100 shelf-life, 122, 149, 164 Shiga-like toxin, 154 Shigella dysenteriae, 155 shunt dell’esomonofosfato, 8 sicurezza, 120 igienica, 164 nel settore alimentare, 146 singolo cieco, 197 sintesi chemio-enzimatiche, 86 sistema a perfusione, 79 sistemi aperti, 45 chiusi, 45 di qualità delle aziende, 146 sito allosterico, 18 attivo, 12 slant, 39 sofisticazione, 166 solfato-riduttori, 241 solventi, 128 somatostatina, 81 somatotropina, 82 somministrazione parenterale, 74 per via orale, 75 sonde a DNA, 163 geniche, 114 sorting, 112 sostanza dopante, 84 sostanze nutritive in eccesso, 31 spore, 156 stabilizzanti, 102 statine, 91 sterilizzazione, 110 commerciale, 135 separata, 44 stigmasterolo, 86 stirene, 218 STR, 43 Streptococcus, 21 Streptomyces, 21 substrato comune, 7 suoli agricoli, 219 suscettibilità, 232 T talassemia, 209 tamponi, 74 Taq polimerasi, 67 TDP, 132 TDT, 132 tecniche immunomagnetiche, 162 temperatura, 125 Tempo D, 132 Tempo di Morte Termica, 132 tempo totale di reazione, 16 teratogeni, 213 termostatazione, 40 test citogenetici, 225 test di Ames, 225 tetracicline, 88 252 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario INDICE ANALITICO TGD, 235 Ti (tumor inducing), 107 tocoferoli, 142 toette, 100 tossina botulinica, 121, 158 colerica, 78 stafilococcica, 121 tossinfezioni alimentari, 121 tracciabilità, 113 transaminasi GOT, 15 transferasi, 12 transgeni, 107 transmetilazione, 220 trapianto autogenico, 208 trasduzione, 26 trasformazione, 26 traslocazione bilanciata, 114 trattamento di sterilizzazione, 171 trofoectoderma, 203 trofofase, 37, 89 trofozoite, 161 tubo neurale, 204 turbidostato, 45 U UHT, 135, 177 unipotenti, 204 unità campionaria, 164 UTP, 3 V vaccini polisaccaridici, 76 ricombinanti, 70 valore Z, 132 variabilità somatica clonale, 110 velocità di penetrazione, 133 di reazione, 15 vettore innocuo, 77 vettori di farmaci, 80 non retrovirali, 210 retrovirali, 210 virali, 116 via enterale, 192 parenterale, 191 Vibrio cholerae, 158 vie di somministrazione, 191 vinificazione in bianco, 94 in rosso, 94 naturale, 94 virus HAV, 161 vitamina B12, 67 B2, 68 C, 86 Vmax, 16 VTEC, 154 Y yogurt, 179 a coagulo compatto o intero, 182 da bere, 182 Z zangolatura, 178 Zymomonas, 21 253 Fabio Fanti BIOLOGIA, MICROBIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE © Zanichelli 2013 Biotecnologie di controllo sanitario Idee per il tuo futuro Fabio Fanti Biologia, microbiologia e biotecnologie Biotecnologie di controllo sanitario Nel libro • Le biotecnologie sanitarie. Il testo è destinato all’ultimo anno dell’articolazione «Biotecnologie sanitarie» e tratta le biotecnologie utilizzate nella produzione e nella conservazione degli alimenti, il controllo microbiologico degli alimenti, le biotecnologie impiegate in campo biomedico, le produzioni di microbiologia industriale e le applicazioni delle biotecnologie in campo zootecnico, agrario e farmaceutico. • Il laboratorio Laboratorio di microbiologia contenente una raccolta di esperienze di laboratorio e ambientale. Idee per il tuo futuro 3TAI PER lNIRE LA SCUOLA CHE COSA FARE ADESSO t 6ALE LA PENA LAUREARSI t #HE COSA CHIEDONO AI TEST DI AMMISSIONE t % SE VOLESSI STUDIARE ALLESTERO t #OME SI SCRIVE UN CURRICULUM )N QUESTO LIBRO OTTO PAGINE PER LORIENTAMENTO E NEL SITO www.ideeperiltuofuturo.it DATI INFORMAZIONI E CONSIGLI SULLUNIVERSITÌ E IL MONDO DEL LAVORO L’accesso alle risorse digitali protette è personale e non condivisibile.