Diagnóstico de infecciones fúngicas
invasivas: desafíos y avances recientes
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Wenjie Fang ,
Junqi Wu ,
Mingrong Cheng ,
Xinlin Zhu ,
Mingwei Du ,
Chang Chen ,
Wangqing Liao ,
Kangkang Zhi y
Pan Weihua
Revista de ciencia biomédica volumen 30 , Número de
artículo: 42 ( 2023 ) Citar este artículo
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Abstracto
Fondo
La carga global de infecciones fúngicas invasivas (IFI) ha mostrado un aumento en los
últimos años debido a la mayor carga de pacientes inmunocomprometidos que padecen
diversas enfermedades. El papel del diagnóstico temprano y preciso en la contención
agresiva de la infección por hongos en las etapas iniciales se vuelve crucial, evitando así el
desarrollo de una situación potencialmente mortal. Con las demandas cambiantes de la
micología clínica, el campo del diagnóstico de hongos ha evolucionado y ha recorrido un
largo camino desde los métodos tradicionales de microscopía y cultivo hasta herramientas
más avanzadas no basadas en cultivos. Con la llegada de enfoques más potentes, como
nuevos ensayos de PCR, T2 Candida, tecnología de chips de microfluidos, secuenciación
de próxima generación, biosensores de nueva generación, herramientas basadas en
nanotecnología, modelos basados en inteligencia artificial, La cara del diagnóstico de
hongos cambia constantemente para mejor. Todos estos avances han sido revisados aquí
brindando la última actualización a nuestros lectores en el flujo más ordenado.
Texto principal
El equipo realizó un estudio detallado de la literatura seguido de la recopilación de datos, la
extracción de los datos pertinentes, el análisis en profundidad y la composición de las
distintas subsecciones y la revisión final. La revisión es única en su tipo ya que analiza los
avances en los métodos moleculares; avances en métodos basados en serología; avances en
tecnología de biosensores; y avances en modelos basados en aprendizaje automático, todo
bajo un mismo techo. Hasta donde sabemos, no ha habido ninguna revisión que cubra todos
estos campos (especialmente la tecnología de biosensores y el aprendizaje automático
mediante inteligencia artificial) con relevancia para las infecciones fúngicas invasivas.
Conclusión
Sin duda, la revisión ayudará a actualizar la comprensión de la comunidad científica sobre
los avances más recientes que están en el horizonte y que pueden implementarse como
complementos a los algoritmos de diagnóstico tradicionales.
Fondo
Las infecciones fúngicas invasivas (IFI) se definen como infecciones sistémicas resultantes
del establecimiento de levaduras o mohos en tejidos profundos. A diferencia de las
infecciones fúngicas superficiales, las IFI son enfermedades mortales con altas tasas de
morbilidad y mortalidad [ 1 ]. Las infecciones invasivas más comunes identificadas son las
provocadas por especies de Candida , especies de Aspergillus , especies de Cryptococcus ,
especies de Pneumocystis , etc.
Además, Blastomyces , Histoplasma , Paracoccidioides y Coccidioides.Son cepas de
hongos endémicos que también se han implicado en la causa de infecciones sistémicas
graves en pacientes inmunodeprimidos [ 2 ]. La población en riesgo de contraer una
infección fúngica oportunista incluye receptores de trasplantes de órganos, pacientes
hematológicos que requieren trasplante de células madre, pacientes con SIDA, diabéticos,
pacientes quemados, pacientes con enfermedades neoplásicas, pacientes en terapia
inmunosupresora a largo plazo y aquellos con enfermedades respiratorias crónicas, entre
otros. otros [ 3 ].
Si observamos las estadísticas recientes, alrededor de 1,9 millones de pacientes contraen
una infección fúngica invasiva aguda (IFI) cada año, mientras que se estima que 3 millones
de personas en todo el mundo padecen infecciones fúngicas crónicas graves. Muchas de
ellas son infecciones potencialmente mortales, y se estima que más de 1,6 millones de
muertes por año se atribuyen a todas las enfermedades fúngicas [ 4 ]. Casi el 70% de todas
las IFI en el mundo son causadas por candidiasis invasiva (CI), seguida de criptococosis
(20%) y aspergilosis (10%) [ 4 , 5 ]. Según los datos de vigilancia de los CDC, la
mortalidad hospitalaria por todas las causas (cruda) de los pacientes que padecen
candidemia es superior al 25% [ 6], mientras que la aspergilosis invasiva (IA), detectada en
personas inmunocomprometidas, tiene una tasa de mortalidad extremadamente alta que
oscila entre el 40 y el 90% [ 7 , 8 ]. Otro motivo añadido de preocupación es la aparición
mundial de especies de hongos resistentes a múltiples fármacos, que empeoran los
resultados del tratamiento y aumentan las tasas de mortalidad. Muchas especies de hongos
han desarrollado resistencia a las cuatro clases de fármacos antifúngicos, es decir, los
polienos, los azoles, las equinocandinas y el análogo de pirimidina 5-flucitosina, y algunas
cepas de hongos son intrínsecamente resistentes a estos agentes antifúngicos, mostrando
una alta tolerancia a los antifúngicos [ 9 ]. Debido al número limitado de fármacos
antimicóticos que pueden usarse sistémicamente, el tratamiento de las IFI es un gran
desafío clínico.
El escenario antes mencionado requiere una identificación rápida y precisa de los hongos
causales, ya que la rapidez en el diagnóstico es el factor clave para mejorar el resultado del
paciente. Aunque las pruebas de cultivo convencionales siguen siendo la piedra angular del
diagnóstico de infecciones por hongos, los desafíos asociados con estas pruebas son
muchos. Estos incluyen una sensibilidad relativamente baja, un tiempo de respuesta lento,
un proceso laborioso y la naturaleza invasiva de las muestras necesarias para la prueba
[ 10 , 11 ]. La sensibilidad de los hemocultivos para levaduras oscila entre el 50 y el 95 por
ciento, mientras que los mohos tienen valores de sensibilidad aún más bajos que oscilan
entre el 1 y el 5 por ciento [ 12]. En el caso de candidiasis invasiva, el hemocultivo se
considera un estándar de oro, pero el largo tiempo de respuesta (en el caso de levaduras,
hasta cinco días; y mohos, hasta cuatro semanas) puede poner al paciente en mayor riesgo
debido al retraso en la delinear el plan de tratamiento necesario [ 13 , 14 ]. En el caso de las
IFI, los estudios muestran aumentos diarios significativos en la mortalidad y los costos de
hospitalización por cada día sin los medicamentos antimicóticos adecuados, lo que destaca
la gravedad de dichos retrasos [ 15 , 16 ]. Además de esto, muchas especies de hongos
crípticas no pueden aislarse ni cultivarse en medios de cultivo de hongos, por lo que
escapan a la detección convencional. Por ejemplo, Fontecha y su equipo [ 17 ] identificaron
cuatro Candidacepas ( C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis y C. haemulonii ) a las que
denominaron crípticas, ya que no eran cultivables en medios fúngicos convencionales y se
identificaron con base en métodos moleculares. De manera similar, Arastehfar y su equipo
[ 18 ] identificaron nueve especies crípticas de Candida mediante PCR multiplex de un solo
paso.
Además de los inconvenientes anteriores, está la naturaleza invasiva de la muestra de
tejido, es decir, biopsias de tejidos profundos o fluidos tisulares extraídos especialmente de
pacientes muy ancianos, o de recién nacidos, o de pacientes con neoplasias hematológicas
malignas. Además, todos los métodos convencionales, incluida la microscopía, la
histopatología y las pruebas basadas en cultivos, dependen en gran medida de personal con
altos niveles de experiencia en la identificación y detección de hongos, y esto prácticamente
no es posible en todos los entornos. Estas limitaciones de las pruebas convencionales
respaldan el hecho de que las pruebas estándar de oro están lejos de ser perfectas, lo que
enfatiza la necesidad y la importancia de los métodos sin cultivo (p. ej., anticuerpos
fúngicos, detección de antígenos, detección de ácidos nucleicos, etc.). Así, aunque todavía
se necesitan herramientas de diagnóstico microbiológico e histopatológico para un
diagnóstico final,
Las presentes revisiones tienen como objetivo destacar las investigaciones más recientes e
innovadoras en el campo del diagnóstico de hongos. La revisión comienza con una breve
discusión del desafío de la resistencia a los antifúngicos que conduce a un aumento de las
infecciones por hongos. Luego, el artículo se centra en los avances recientes en: (a)
diagnóstico basado en serología; (b) diagnósticos de base molecular; (c) ensayos basados en
biosensores; y (d) nuevos enfoques combinados (por ejemplo, uso de aprendizaje
automático, inteligencia artificial, etc.). Los avances recientes se han discutido en detalle
dentro del contexto clínico relevante. Se comprende bien la necesidad imperativa de
investigar nuevas tecnologías que puedan satisfacer los requisitos en situaciones clínicas
tanto ricas como limitadas en recursos, y esta revisión presenta una visión integral de la
misma.
Resistencia a los antifúngicos: una descripción general
Una de las principales razones para el diagnóstico temprano y oportuno de patógenos
fúngicos es el aumento de las tasas de mortalidad que se producen debido a la aparición de
patógenos fúngicos que no responden a los fármacos antifúngicos comúnmente
utilizados. Patógenos fúngicos pertenecientes a Candida, Aspergillus,
Cryptococcus y Pneumocystis spp. han mostrado tasas notables de resistencia a los
antifúngicos en todo el mundo, lo que hace que la resistencia a los medicamentos
antifúngicos sea una grave preocupación tanto en el espacio como en el tiempo
[ 19 , 20 ]. De estos, Candida auris y Aspergillus fumigatus ahora figuran oficialmente en
la lista urgente de amenazas de resistencia a los antimicrobianos (RAM) publicada por los
CDC de EE. UU. [ 21]. Según los datos de los CDC, ha habido un aumento significativo de
casos clínicos de C. auris (una levadura emergente resistente a múltiples fármacos) de 329
en 2018 a 1012 en 2021 [ 22 ].
En cuanto a los agentes antimicóticos disponibles, hay escasez de medicamentos
antimicóticos a diferencia de los antibióticos. En términos generales, los fármacos
pertenecen a cuatro clases principales, que incluyen azoles (luconazol, itraconazol,
voriconazol, posaconazol e isavuconazol), polienos, análogos de pirimidina y
equinocandinas (caspofungina, micafungina y anidulafungina). Ya existe una selección
limitada de medicamentos, lo que hace que el tratamiento de la infección causada por una
cepa resistente sea aún más desafiante. Al analizar brevemente el modo de acción de las
clases de antifúngicos, encontramos que los triazoles, que son los antifúngicos más
utilizados, funcionan dirigiéndose a un paso específico (unión para unirse
a Erg11 en Candida y Cyp51A en especies de Aspergillus) .) en la síntesis de ergosterol, un
componente esterol crítico de la membrana celular fúngica [ 23 , 24 ]. Los polienos como la
anfotericina B se unen al ergosterol y esto provoca la desestabilización de la membrana de
las células fúngicas y, finalmente, la muerte celular. La tercera clase, es decir, los análogos
de pirimidina, como la 5-fluorocitosina (5-FC), se convierten en metabolitos de pirimidinas
fluoradas que luego desestabilizan el ADN/ARN inhibiendo un mayor crecimiento
[25 ] . Las equinocandinas funcionan bloqueando la subunidad catalítica de la β-1,3
glucano sintasa y, por lo tanto, interfieren con la producción de β-1,3- D -glucano, un
componente importante de la pared celular [ 23 ]. Por lo tanto, estos fármacos adoptan un
método de acción fungicida o fungistático.
El mecanismo de adquisición de resistencia a los antifúngicos por parte de los hongos es un
tema muy amplio y actualmente, discutirlo en detalle está fuera del alcance de la presente
revisión. Brevemente, discutir los mecanismos de resistencia adoptados por la cepa fúngica
incluye (a) disminuir la concentración efectiva del fármaco, (b) modificación del objetivo
y/o (c) estrategia de derivación metabólica [26 ] . El método utilizado para disminuir la
concentración eficaz del fármaco incluye la presencia de sistemas de eflujo activos, como
los transportadores del casete de unión de ATP (ABC) y los transportadores de la
superfamilia de facilitadores principales (MFS). Se ha informado que C. albicans contiene
28 proteínas ABC y 96 transportadores potenciales de MFS [ 27 ], A. fumigatusContiene 45
proteínas ABC y 275 transportadores MFS potenciales [ 26 ], mientras
que Cr. neoformans contiene 29 proteínas transportadoras ABC y 192 MFS,
respectivamente [ 28 ]. C. auris , una levadura emergente resistente a múltiples fármacos,
también tiene numerosos genes para las proteínas ABC y MFS que confieren resistencia a
los azoles [ 29 ]. La segunda estrategia para disminuir las concentraciones de fármacos que
se observa comúnmente es la sobreexpresión de los objetivos de los fármacos. En esto, los
hongos tienden a sobreexpresar los objetivos del fármaco y, por lo tanto, se requiere más
fármaco para unirse a ellos, lo que da como resultado la ineficacia del fármaco y se
establece resistencia. Por ejemplo, la regulación positiva de ERG11 en C. albicans
resistente a los azoles y en C. albicans resistentes a los azoles.C. tropicalis [ 30 , 31 ], la
regulación positiva de Cyp51A en aislados de A. fumigatus resistentes a los azoles [ 32 ]
entran en esta categoría. Los hongos patógenos también secuestran fármacos dentro de los
compartimentos extracelulares, como se observa con las cepas productoras de biopelículas
de Candida spp . donde la matriz de biopelícula ayuda en el secuestro del fármaco [ 33 ] y,
por lo tanto, disminuye la concentración general del fármaco.
La alteración del objetivo del fármaco es otro mecanismo comúnmente informado para los
azoles (el objetivo del fármaco es la 14α-lanosterol desmetilasa) y las equinocandinas (el
objetivo del fármaco es la β-1,3 glucano sintasa) [26 ] . En caso de resistencia a las
equinocandinas, muchos aislados clínicos de C. albicans , C. glabrata, C. auris, C.
tropicalis y C. krusei han mostrado modificación del gen diana en dos regiones principales
del gen FKS1 , es decir, Hot Spot 1 y 2 o HS1. y regiones HS2 [ 34 , 35 ]. Los análogos de
pirimidina, como la 5-flucitosina (5-FC), inhiben la síntesis de ADN y ARN. Se ha
informado que Candida spp escapa del 5-FC mediante mutaciones puntuales en el gen
diana FCY1. El último es el mecanismo de derivación metabólica, que es un mecanismo
compensatorio. El mejor ejemplo es la pérdida de función de las mutaciones en el
gen ERG3 que codifica una esterol Δ5,6 desaturasa. Cepas de Candida resistentes a los
azoles . Este producto genético, si está activo, puede convertir los esteroles 14α-metilados
que surgen de la exposición a los azol en un producto tóxico de 3,6-diol que las células
fúngicas no pueden tolerar. Los hongos aquí desvían los efectos tóxicos por la pérdida de
función de la mutación en el gen ERG3 y son incapaces de producir este metabolito, lo que
resulta en un estado de resistencia [ 36 , 37] .]. Además del uso generalizado de
medicamentos antimicóticos en medicina, estos medicamentos también se usan
ampliamente para la protección de plantas y cultivos contra hongos patógenos comunes en
las plantas en la agricultura. Además, muchos hongos patógenos oportunistas se encuentran
comúnmente en nuestros entornos de vida cercanos. Esto proporciona una vía fácil para la
entrada y propagación de especies resistentes a la cadena humana [ 38 ].
Sin embargo, para mitigar el problema de la creciente resistencia a los medicamentos, la
comunidad científica está explorando nuevas alternativas que incluyen agentes
fitoquímicos, nanopartículas, extractos de hierbas, etc. [ 39 , 40 , 41 , 42 ], pero los nuevos
medicamentos que llegan al mercado clínico aún no están disponibles. escaso. Este
escenario enfatiza la necesidad de un diagnóstico temprano y preciso de los hongos
patógenos antes de que surjan desafíos de resistencia que hagan que las opciones de
tratamiento sean limitadas y aún más difíciles. La revisión ahora se centra en presentar la
discusión detallada sobre los avances en diferentes métodos de diagnóstico.
Avances en el diagnóstico basado en serología
Las pruebas serológicas representan una forma más rápida de detectar los hongos causales,
ayudando en el proceso de toma de decisiones diagnósticas. Estas pruebas se realizan para
demostrar antígenos o anticuerpos en suero o fluidos corporales de una sospecha de
infección por hongos. La ventaja de realizar pruebas basadas en serología son los resultados
rápidos obtenidos, a diferencia de los métodos de cultivo, y la naturaleza no invasiva de la
muestra (es decir, sangre, orina, esputo, etc.), al tiempo que actúa como un posible
marcador de pronóstico [43 ] . Una prueba de serología puede dar un resultado positivo
incluso si la prueba de cultivo es negativa o la especie de hongo no es cultivable o la
muestra es difícil de tomar del paciente debido a alguna condición subyacente [ 44 , 45 ].
Una limitación importante de las pruebas basadas en anticuerpos se observa en pacientes
inmunocomprometidos o inmunosupresores que no pueden obtener niveles adecuados de
anticuerpos y pueden mostrar resultados falsos negativos [ 46 ]. Sin embargo, la detección
de antígenos fúngicos en estos pacientes ofrece la solución. Los polisacáridos o proteínas
(antígenos fúngicos) secretados durante el crecimiento de los hongos pueden terminar en
diferentes fluidos corporales, lo que los hace ideales para la detección como posibles
marcadores de enfermedades tanto en personas inmunocompetentes como
inmunocomprometidas [44 ] . Aún así, las pruebas basadas en serología tienen sus propios
inconvenientes, lo que indica un margen sustancial para mejorar, y lo mismo se ha
discutido en cada subsección.
Este ensayo se basa en la detección de (1,3)-β- D -glucano (BDG), un componente
polisacárido de la pared celular de los hongos. BDG es un antígeno panfúngico presente
en Candida spp., Pneumocystis
jivoveci , Aspergillus spp., Acremonium spp., Fusarium spp. (Las excepciones
son Cryptococcus spp., Mucrorales y la fase de levadura de Blastomyces dematitidis )
[ 47 ]. El único ensayo BDG aprobado por la FDA es el ensayo Fungitell (Associates of
Cape Cod, MA, EE. UU.). Se ha demostrado que es útil para diagnosticar candidiasis
intraabdominal y casos de neumonía por pneumophila con hemocultivos negativos
[ 48]. En un estudio de metanálisis, la sensibilidad y especificidad sérica del BDG para la
CI fueron del 75 al 80% y del 60 al 80%, respectivamente [ 48 , 49 ]. En la candidiasis
profunda, la sensibilidad y la especificidad fueron del 65% y el 75%, respectivamente
[ 50 , 51 , 52 ]. El ensayo BDG se realiza en formato colorimétrico o turbidimétrico y se ha
incluido en la definición de EORTC-MSG para infección por hongos [ 53 ]. Hasta la fecha,
hay muchos ensayos de BDG disponibles además de Fungitell, es decir, Fungitec-G, Beta
Glucan-BGStar, Beta-Glucan test (Mauha, Japón) y cada ensayo tiene diferentes valores de
corte, sensibilidad y especificidad según la cepa de hongo involucrada. población de
pacientes y plataforma de ensayo utilizada.
El ensayo Fungitell tiene valores de sensibilidad y especificidad de 69,9 a 100% y 73 a
97,3% para IC e IA, respectivamente, mientras que el mismo ensayo tiene una sensibilidad
de 81 a 93% y una especificidad de 77,2 a 99,5% [54 , 55 ] . . El ensayo Fungitell ha estado
disponible durante dos décadas como prueba complementaria en el diagnóstico de IFI
[ 56 ]. La prueba está disponible en un formato de placa de microtitulación rápida con
pruebas por lotes de 21 muestras de una sola vez. Aunque esto puede resultar beneficioso
para grandes instituciones o laboratorios de referencia que procesan un gran número de
muestras cada día, también se requiere un formato de lote bajo [ 57 ].
Con este objetivo en mente, Fungitell STAT™ se creó como una adaptación del kit
original, lo que representa una opción simple para un solo paciente para verificar los
niveles séricos de BDG en un formato de valor índice, lo que permite clasificar
rápidamente a los pacientes como positivos, negativos o indeterminados. Al igual que el
ensayo Fungitell clásico, el nuevo formato utiliza reactivos basados en lisado de
amebocitos de Limulus (LAL) para cuantificar la tasa de liberación de paranitroanilina
(pNA) como resultado de la hidrólisis mediante zimógenos de proteasa sensibles a BDG
activados. En un estudio reciente, D'Ordine y su equipo [ 57] comparó las características de
rendimiento de Fungitell STAT™ y Fungitell en 488 muestras de pacientes en términos de
linealidad de respuesta en el rango de Fungitell, cálculo de acuerdo porcentual positivo
(PPA) y acuerdo porcentual negativo (NPA) con y sin la zona indeterminada, junto con la
reproducibilidad analítica (varianza inter e intralaboratorio). Los valores de PPA y NPA
nos dicen cuántos positivos y negativos identifica una prueba que concuerdan con otra
prueba utilizada en las mismas muestras. Se demostró una buena linealidad con más de 250
muestras de pacientes únicas y muestras de laboratorio enriquecidas con Fungitell
STAT™. El valor de PPA con la inclusión de indeterminado fue de 74% y sin
indeterminado fue de 99%, mientras que NPA fue de 91% con valor indeterminado y 98%
sin valor indeterminado. De este modo, Fungitell STAT™ tiene una gran capacidad para
distinguir entre negativos y positivos en presencia o ausencia de muestras ambiguas de
Fungitell. El ensayo Fungitell STAT™ representa una buena opción para realizar pruebas
de rutina de lotes bajos con excelente rendimiento, bajas tasas de falsos positivos y alta
reproducibilidad.
Otra desventaja del BDG es que es un biomarcador panfúngico no específico con valores de
sensibilidad bajos y altos resultados falsos positivos debido a la reactividad cruzada. Racil
et al. [ 58 ] informaron un 75% de valores falsos positivos observados en pacientes
atribuidos a bacteriemia concurrente, uso de hemodiálisis o tratamiento con
inmunoglobulina humana. En 2018, se introdujo un segundo ensayo comercial para detectar
BDG en muestras de plasma. Se trataba de la prueba Wako-glucano (GT) [Fujifilm Wako
Pure Chemical Corporation, Osaka, Japón], que se introdujo como alternativa a Fungitell en
el mercado europeo. En un estudio de Friedrich et al. [ 59 ], se utilizaron muestras de suero
para comparar el rendimiento del ensayo GT con Fungitell en pacientes con IC
y Pneumocystis jivoreci.neumonía (PJP). La especificidad del ensayo GT superó la de
Fungitell para la candidemia (98 % frente a 85 %), pero el ensayo Fungitell fue mayor en
sensibilidad, es decir, 86,7 % en comparación con el ensayo GT (42,5 %) para pacientes
con CI y pacientes con neumonía. , el ensayo Fungitell mostró una sensibilidad del 100 %
frente al 88,9 % observado con GT. Sin embargo, en un estudio separado realizado por De
Carolis y su equipo [ 60] en un gran estudio de cohorte con sueros de pacientes con IA (n =
40), IC (n = 78) y PJP (n = 17) con respecto a sueros de pacientes control (n = 187)
demostró que al disminuir el valor de corte cuando se utilizó la prueba de Wako, la
sensibilidad mejoró mientras que la especificidad permaneció igual, es decir, 97,3%. Al
reducir el punto de corte a 7,0 pg/mL para el GT, la sensibilidad y especificidad fueron del
80,0% y 97,3% para el diagnóstico de IA, del 98,7% y 97,3% para el diagnóstico de IC, y
del 94,1% y 97,3% para el diagnóstico de PJP, respectivamente. Por lo tanto, después de
optimizar el valor de corte de GT para la positividad, la prueba de Wako-glucano funcionó
casi tan bien como la Fungitell en un entorno clínico. Las observaciones adicionales del
equipo fueron que GT era técnicamente menos complejo de operar que el Fungitell, más
simple de ejecutar e interpretar,
Además, el kit de detección de hongos (1–3)-β- D -GLUCAN GOLDSTREAM ® (ERA Biology,
Tianjin, China) se ha utilizado ampliamente en aplicaciones clínicas para la detección de
BDG, y también se utiliza la colorimetría del reactivo Limulus. Se comparó el rendimiento
diagnóstico de Goldstream ® y Wako para IFD en casos de infecciones
por
Candida , Aspergillus y Pneumospora . En general, la sensibilidad y especificidad de
Goldstream ® para el diagnóstico de IFD fue menor que la de Wako (39,6% frente a 43,8%,
83,5% frente a 94,9%) [ 61 ]. Sin embargo, otro estudio que utilizó Goldstream ®midieron
la BDG sérica en 50 pacientes con PCP, 15 pacientes con candidiasis, 6 pacientes con
candidiasis crónica diseminada, 15 pacientes con aspergilosis invasiva, 10 pacientes con
mucormicosis y 40 controles. Cuando el valor de corte de Goldstream ® se estableció en 60
pg/mL, la sensibilidad y especificidad de Goldstream ® para el diagnóstico de PCP fueron
del 86% y 68%, respectivamente. Cuando el valor de corte se estableció en 31,25 pg/ml, la
sensibilidad fue de hasta el 92 %. La especificidad, el valor predictivo positivo y el valor
predictivo negativo fueron del 55%, 72% y 85%, respectivamente [ 62 ]. La sensibilidad de
Goldstream ® fue del 68%, la especificidad del 91%, el valor predictivo positivo fue del
66% y el valor predictivo negativo fue del 91% para pacientes pediátricos con
candidiemia.63 ] (Liu et al. 2015). En otro estudio relacionado con la candidiasis invasiva
en recién nacidos, el kit de detección de hongos Goldstream ® (1–3) -β- D -GLUCAN
(MÉTODO CROMOGÉNICO) TUVO UNA SENSIBILIDAD DEL 76% Y UNA ESPECIFICIDAD DEL 71,4%
[ 64 ]. Goldstream ® coincide con IGL-800/IGL-200 (lector de tubos cinéticos
completamente automático, ERA Biology, Tianjin, China), que es adecuado para
laboratorios con diferentes muestras. En 2020, se lanzó el kit de detección de hongos ( 1–3)
-beta -D -GLUCAN (CLIA) FUNGIXPERT ® (ERA Biology, Tianjin, China), tecnología de inmunoensayo de quimioluminiscencia con
detección automática y reducción del tiempo de detección a 50 minutos.
Aunque FungiXpert ® Fungus (1–3)-β- D-El kit de
detección de glucano (CLIA) se ha utilizado gradualmente en clínica; su rendimiento
diagnóstico para IFD aún necesita más respaldo de datos.
Es necesario mencionar una referencia especial a la detección de cepas de hongos
dimórficos. Las cepas de hongos dimórficos se refieren a la capacidad de un hongo para
generar dos tipos de células vegetativas, ya sea de levadura o de hifas en morfología, y este
cambio está modulado por las condiciones ambientales, principalmente la temperatura
[65 ] . Hay datos limitados sobre el uso de Fungitell para la detección de BDG en suero
para diagnosticar micosis endémicas. En un estudio realizado por Girouard G y su equipo
[ 66 ], los investigadores probaron diferentes muestras de suero de pacientes con
histoplasmosis activa comprobada ( Histoplasma capsulatum ) y blastomicosis
( Blastomyces dermatitidis) .). Ocho de los nueve sueros de pacientes con histoplasmosis
diseminada activa confirmada por cultivo dieron positivo, pero la prueba tuvo un mal
desempeño para blastomicosis, posiblemente debido a los bajos niveles innatos de BDG en
Blastomyces s pp. Sin embargo, los resultados sugirieron que Fungitell puede detectar BG
de manera confiable en casos de histoplasmosis diseminada. Pero, como informaron Myint
et al. [ 67 ], el BDG del líquido cefalorraquídeo (LCR) no fue sensible ni específico para
respaldar el diagnóstico de meningitis causada por H. capsulatum . El conocimiento
limitado del papel potencial de la detección de BDG para el diagnóstico de micosis
endémicas enfatiza la necesidad de estudios adicionales en esta dirección.
Ensayo de galactomanano (GM) Una herramienta de diagnóstico útil es la prueba de los
constituyentes de la pared celular de las especies de Aspergillus , como el
galactomanano. La medición de los componentes de la pared celular de las especies
de Aspergillus , como el galactomanano, es una herramienta de diagnóstico útil. GM es el
principal antígeno detectado en casos de IA y puede detectarse fácilmente en el lavado
bronquioalveolar (BAL) y el líquido cefalorraquídeo (LCR), etc. [ 68 ]. Los valores
generales de sensibilidad y especificidad de este ensayo oscilaron entre el 67 y el 100 por
ciento y entre el 86 y el 100 por ciento, respectivamente [ 69 , 70 ]. GM es específico
para Aspergillus, a diferencia del marcador BDG panfúngico, y la mayoría de los centros
médicos utilizan GM para el diagnóstico de rutina y la vigilancia de pacientes con riesgo de
IA. Actualmente, solo existe un ensayo aprobado por la FDA para la detección
de Aspergillus GM ( inmunoensayo enzimático (EIA) de Platelia Aspergillus ; Bio-Rad,
Marnes-la-Coquette, Francia) en muestras de suero y lavado broncoalveolar (BAL) de
pacientes. Desde entonces, ha habido varios intentos de mejorar o desarrollar nuevas
pruebas basadas en serología para detectar IA. Thorton et al desarrollaron un anticuerpo
monoclonal de ratón llamado JF5. [ 71 ] que se une a un epítopo proteico en un antígeno
glicoproteico extracelular liberado por Aspergillusdurante su crecimiento activo. Basándose
en esto, el equipo desarrolló un dispositivo de flujo lateral (LFD), que se analizará en una
sección separada.
Dichtl y sus colegas se centraron en desarrollar un nuevo ensayo basado en JF5 para
detectar IA, el ELISA de galactomanoproteína (GP), y compararon su rendimiento con el
ELISA de antígeno de Platelia Aspergillus convencional [ 72 ] . El estudio se basó en 267
muestras de 49 casos de IA probable (n = 4) o probada (n = 45). El equipo observó una
fuerte correlación, es decir, R = 0,82, entre los resultados de las mediciones de ambas
pruebas, según lo determinado por la correlación de Pearson. Además, se tomaron 156
muestras de suero ( Aspergillus-grupo de control negativo) se utilizaron para determinar las
especificidades de GM y GP. Las especificidades para GM (límite 0,3) y GP ELISA (límite
0,2) fueron del 96% y 76%, respectivamente. Cuando se utilizó el valor de corte fabricado
de 0,5 para GM, la especificidad de la prueba GM fue del 99 % con un caso falso positivo,
mientras que para la prueba GP con un límite de 0,4, la especificidad fue del 97 % con
cinco casos falsos positivos. Por lo tanto, según los puntos de corte recomendados y
optimizados (0,5 para el análisis GM y 0,4 para el análisis GP), la sensibilidad de la prueba
GM y la prueba GP fue del 40%. En conclusión, se encontró que el nuevo GP ELISA era
similar al Platelia GM ELISA en términos de sensibilidad y especificidad. Sin embargo,
debido a la baja sensibilidad de las dos pruebas, los pacientes con riesgo de desarrollar IA
pueden requerir pruebas seriadas. El nuevo GP ELISA funciona tan bien como el GM
ELISA, por lo que puede usarse para diagnosticar y realizar un seguimiento de la IA en
pacientes de alto riesgo. También es confiable y específico.
La escasa reproducibilidad y la necesidad de repetibilidad es un inconveniente observado
con Platelia GM-EIA [ 73 ]. Gallet y su equipo [ 74 ] evaluaron el rendimiento de un nuevo
ensayo EIA de muestra única basado en fluorescencia para detectar niveles
de Aspergillus GM en el suero de un paciente para diagnosticar IA con el objetivo de
proporcionar un ensayo sólido rápido y fácil de usar. El equipo desarrolló una nueva prueba
de muestra única, es decir, VIDAS ® GM-EIA (Biomerieux) empaquetada en una tira
dispensable lista para usar, y probó el rendimiento en comparación con Platelia GM-EIA
utilizando 126 sueros (44 muestras frescas y 82 congeladas). ). El área bajo la curva (AUC)
bajo las curvas ROC demostró un rendimiento diagnóstico comparable para
VIDAS ®Ensayos GM y Platelia (0,892% y 0,894% para los ensayos VIDAS ® GM y
Platelia, respectivamente). Las curvas ROC y el mejor índice de Youden (es decir, el mejor
equilibrio entre sensibilidad y especificidad) revelaron un punto de corte de VIDAS ® GM de
0,36, correspondiente a una sensibilidad del 95,7% y una especificidad del 85,7%.
El principal beneficio de VIDAS ® GM es que
es una opción sencilla, lista para usar, que proporciona resultados rápidos (70 min), y este
enfoque se puede utilizar para diagnosticar o examinar de forma rutinaria poblaciones de
alto riesgo en un corto período de tiempo. para iniciar la terapia de intervención lo antes
posible.
Otra mejora ha sido el lanzamiento de un nuevo ensayo GM-EIA desarrollado por
IMMY. En el EIA de Bio-Rad GM, se ha utilizado un único anticuerpo monoclonal de rata
denominado EB-A2 que se une al galactomanano fúngico. El nuevo ensayo IMMY GMEIA (al igual que el kit de flujo lateral IMMY) implica el uso de dos anticuerpos
monoclonales, uno de los cuales se une a un epítopo GM similar al de EB-A2 y el otro se
une a un objetivo nuevo. En el estudio de White et al. [ 14], evaluaron el recién lanzado
IMMYGM-EIA en un estudio retrospectivo de casos y controles. El equipo descubrió que
IMMY GM-EIA mostraba una sensibilidad del 71% y una especificidad del 98%,
respectivamente, con un umbral positivo de 0,5. Sin embargo, al reducir el umbral a 0,27,
se alcanzó el 90% y el 92%, respectivamente, de la sensibilidad y especificidad
producidas. Con un valor de concordancia de muestra observado del 94,7 % y una
estadística kappa de 0,820, IMMY y BioRad GM-EIA mostraron una excelente
concordancia, y IMMY GM-EIA parece ser una alternativa comparable para analizar
muestras de sangre. Además, el diseño del ensayo basado en placas admite pruebas de lotes
grandes con la posibilidad de automatización para reducir aún más el error manual.
Ensayo con dispositivo de flujo lateral (LFA): nuevos avances El desarrollo de una prueba
basada en LFA para la detección del antígeno criptocócico ha sido un logro histórico y ha
revolucionado el diagnóstico de la infección criptocócica, especialmente en entornos con
recursos limitados. Cryptococcus neoformans es un hongo dimórfico con sus diferentes
morfotipos que permiten a este patógeno oportunista adaptarse mejor y exhibir diferentes
niveles de patogenicidad en varios huéspedes [ 75 ]. En las poblaciones de África
subsahariana, la meningitis criptocócica (CM) es una de las principales causas de
meningitis en adultos y representa más del 15% de las muertes relacionadas con el SIDA
[ 76 , 77] .]. El antígeno criptocócico, o CrAg, se puede encontrar en fluidos biológicos,
incluidos la sangre y el líquido cefalorraquídeo, o se puede detectar mediante la técnica de
cultivo tradicional. Además de esto, la tinción de muestras de pacientes con tinta china
también se ha utilizado ampliamente para el diagnóstico de Cryptococcus neoformans en
muestras de LCR. Se utilizaron tinta china y 2% de cromo-mercurio en un procedimiento
de modificación que permitió identificar claramente algunas de las estructuras exteriores e
interiores del organismo [ 78 ]. Sin embargo, la tinta china, tiene una baja sensibilidad que
podría dar lugar a situaciones de diagnóstico erróneo, lo que elevaría las tasas de
mortalidad [ 79]. CrAg también se puede detectar mediante pruebas de aglutinación de
látex y inmunoensayo enzimático (EIA) con una sensibilidad superior al 99%. Sin embargo,
todavía existe el requisito de utilizar una prueba basada en el punto de atención (POC)
(POC es una prueba que se realiza cerca o en el lugar de un paciente y cuyo resultado
conduce a un posible cambio en la atención del paciente). . Las pruebas POC son
ventajosas para zonas rurales y distantes, ya que se pueden realizar sin equipos o
instalaciones de laboratorio [ 80 ]. Esto llevó al desarrollo de CrAg-LFA. CrAg-LFA es una
prueba POC que emplea una tira reactiva con anticuerpos monoclonales que puede detectar
el antígeno capsular en los cuatro serotipos (A, B, C y D) del complejo de
especies patógeno Cryptococcus neoformans y C. gattii .complejo de especies. El tiempo
de respuesta es de menos de diez minutos y no necesita herramientas complicadas ni
trabajadores altamente cualificados. El principal beneficio de esta prueba es su capacidad
para detectar niveles extremadamente bajos de CrAg circulante durante la fase prodrómica
(alrededor de 22 días antes de los síntomas), lo que permite un tratamiento rápido y, por lo
tanto, reduce las tasas de mortalidad generales [81 , 82 ] . Muchas empresas han participado
en el desarrollo de CrAg-LFA, de las cuales CrAg LFA de Immuno-Mycologics, Inc.
(IMMY; Norman, OK) es la única aprobada por la FDA.
En 2014 se introdujo otra tira reactiva CrAg LFA, llamada Dynamiker Cryptococcal
Antigen LFA (Tianjin Co., Ltd.). Es un ensayo inmunocromatográfico tipo sándwich con
tira reactiva para la detección de antígenos de polisacáridos capsulares del complejo de
especies de Cryptococcus ( Cryptococcus neoformans y Cryptococcus gattii ) en suero
humano y líquido cefalorraquídeo (LCR), como se muestra en la Fig. 1 . Kwizera et
al. [ 83] evaluó el rendimiento del Dynamiker CrAg-diagnostic LFA en muestras de sangre,
plasma y LCR de pacientes con VIH sintomáticos y asintomáticos en comparación con el
IMMY CrAg-LFA (estándar de referencia). Los investigadores examinaron la eficacia del
ensayo Dynamiker utilizando 113 muestras de suero de personas con sospecha de
antigenemia criptocócica asintomática y 150 muestras de suero, 115 de plasma y 100 de
líquido cefalorraquídeo (LCR) de pacientes con VIH con meningitis sintomática. Según los
hallazgos, Dynamiker CrAg LFA tiene una sensibilidad del 98 % en suero, 100 % en
plasma, 100 % en LCR de pacientes sintomáticos y 96 % en suero de pacientes
asintomáticos en comparación con IMMY CrAg LFA. Sin embargo, la especificidad fue
sólo del 66% en el suero de pacientes sintomáticos, del 61% en el plasma de pacientes
asintomáticos, del 91% en el LCR de pacientes sintomáticos. y 86% en suero de pacientes
asintomáticos. Cuando se probó Dynamiker CrAg LFA por duplicado, la repetibilidad entre
ensayos fue del 100 % en los cuatro tipos de muestras, sin que se observaran resultados
discrepantes. La prueba Dynamiker, sin embargo, reveló niveles significativos de falsos
positivos, con un 11% para el suero de pacientes sintomáticos y suero de pacientes
asintomáticos, así como un 14% para el plasma de pacientes sintomáticos. En otro estudio
de Noguera y su equipo [84 ], los resultados fueron ligeramente diferentes en cuanto a la
especificidad. El equipo evaluó Dynamiker CrAg LFA utilizando 162 muestras de suero
criopreservadas de pacientes con VIH asintomáticos y IMMY CrAg-LFA como estándar de
referencia. El equipo informó una fuerte concordancia entre las dos pruebas, con una
sensibilidad del 100 %, una especificidad razonable registrada del 89,9 % y una precisión
del 90,7 % para Dynamiker LFA. Además de esto, los kits Dynamiker CrAg LFA están
empaquetados individualmente, lo que reduce cualquier posible contaminación que pueda
ocurrir cuando se abre un recipiente varias veces para recuperar una tira. Sin embargo, estas
alternativas de POC son la necesidad del momento, ya que ofrecen una técnica crucial para
reducir la morbilidad y mortalidad de la criptococosis meníngea, especialmente en áreas
donde la prevalencia de la enfermedad es más alta.
Figura 1
Flujo de trabajo del ensayo de flujo lateral (LFA) de antígeno criptocócico
Dynamiker para la detección de antígenos de polisacáridos capsulares del complejo
de especies de Cryptococcus en suero y líquido cefalorraquídeo (LCR) humanos
[Imagen creada en Biorender.com]
Imagen a tamaño completo
Se ha informado que la confiabilidad de CrAg LFA disminuye recientemente, lo que
dificulta un tratamiento eficaz de las infecciones criptocócicas y provoca una pérdida de
tiempo. Shi et al. [ 85 ] evaluaron cuatro LFA disponibles comercialmente con un conjunto
de C. gattii/C bien definido . complejos de especies neoformans . En este estudio, las siete
especies patógenas de Cryptococcus fueron detectadas por IMMY CrAg LFA y FungiXpert
Cryptococcal Capsular PolysaccharideDetection K-Set LFA (FungiXpert, Era Biology,
Tianjin, China). Sin embargo, Cryptococcus bacillisporus y algunos Cryptococcus
tetragattiiLas cepas no pudieron ser detectadas por Biosynex LFA. Esto implica la
importancia de considerar la taxonomía criptocócica revisada en la configuración y
validación del producto. Además, Liu et al. [ 86 ] evaluaron el rendimiento diagnóstico de
FungiXpert LFA y IMMY CrAg LFA utilizando ocho muestras de líquido cefalorraquídeo
(LCR) y 119 muestras de suero/plasma. En comparación con IMMY CrAg LFA,
FungiXpert LFA demostró una sensibilidad del 99,1 % y una especificidad del 98,9 % en la
prueba cualitativa. El coeficiente de correlación intraclase de los resultados
semicuantitativos de las pruebas de títulos de CrAg mediante los dos ensayos fue de
0,976. Esto indica que FungiXpert LFA también es un método de detección rápido para el
diagnóstico y tratamiento eficaz y práctico de la criptococosis.
Otro patógeno importante asociado con la infección por hongos potencialmente mortal en
pacientes inmunocomprometidos es Pneumocystis jirovecii (PJP) [ 87 , 88 ]. Esta cepa de
hongo, anteriormente llamada P. carinii , es una de las infecciones oportunistas asociadas al
VIH más comunes [ 89 , 90 ] (Huang et al. 2011; Almaghrabi et al. 2019). Además de los
pacientes con VIH, los pacientes con neoplasias malignas subyacentes, trastornos
inflamatorios y tratamientos autoinmunes también tienen un alto riesgo de infectarse con
PJP [ 91 , 92] .]. Pneumocystis no se puede cultivar fácilmente en el laboratorio basándose
en los ensayos de diagnóstico, ya que es un patógeno extracelular que normalmente se
localiza en la cavidad alveolar. El método de referencia para el diagnóstico se basa
principalmente en la detección microscópica de quistes en muestras respiratorias, aunque
tiene baja sensibilidad [ 93 ]. Esto implica el uso de tecnologías costosas y laboriosas
(tinción citoquímica o inmunofluorescente y/o PCR) aplicadas a muestras respiratorias y el
uso posterior de técnicas invasivas, como la broncoscopia, complica todo el proceso,
especialmente en niños o en pacientes con insuficiencia respiratoria progresiva.
[ 94 , 95]. Estos desafíos llevaron al desarrollo de un prototipo basado en LFA que ofrece
una técnica no invasiva simple, rápida y fácil de usar sin necesidad de instrumentación o
experiencia de alta gama, lo que permite una alternativa de bajo costo en el punto de
atención para pacientes con PJP. Tomas y su equipo desarrollaron un LFA basado en
nanopartículas de oro (AuNP) para el diagnóstico de PJP [ 96 ] como diagnóstico en el
lugar de atención. En esto, la principal glicoproteína de superficie (Msg) y la serina
proteasa similar a la kexina (Kex1) de P. jiroveciiSe sintetizaron como antígenos sintéticos
recombinantes (RSA) y se purificaron. Estos conjugados AuNP-RSA luego se
caracterizaron mediante electroforesis en gel de agarosa para mejorar su capacidad de
interactuar específicamente con anticuerpos IgM anti-P séricos. Finalmente, estos dos
prototipos (AuNps conjugadas con Msg y AuNps conjugadas con Kex1) se crearon y
examinaron utilizando conjuntos de sueros de individuos con y sin PJP. Ambas inmunotiras
funcionaron como se esperaba, mostrando una línea roja de prueba y de control con una
muestra positiva y solo una línea roja de control con una muestra negativa. Esto respalda el
desarrollo continuo, tanto en regiones ricas como pobres en recursos, para un diagnóstico
rápido y sencillo de PJP en sueros de pacientes. Evitar la necesidad de muestreos invasivos
(como sangre o lavado broncoalveolar) también ha sido una opción favorable. La orina en
lugar de BAL o sangre parece una opción favorable de muestreo sin invasión. Marr y su
equipo [97 ] mejoró un prototipo de un kit de flujo lateral de orina con forma de varilla
reactiva para realizar pruebas de IA rápidas y sencillas. El kit de inmunoensayo consta de
mAb476 conjugado con nanopartículas de oro de 40 nm secadas en una cinta de poliéster y
los resultados se leen en un formato semicuantitativo como positivo alto (++), positivo bajo
(+) o negativo. El kit de inmunoensayo se basa en un nuevo anticuerpo anti- Aspergillus
fumigatus específico de galactofuranosa con prueba de concepto demostrada en modelos de
IA en ratones y cobayas [ 98]. Se realizó una cohorte de 78 sujetos que estaban siendo
evaluados por sospecha de IFI. El positivo visual reproducible fue visible en el modelo
prototipo de tira reactiva de orina en concentraciones de antígeno superiores a 0,2 g/ml y
superiores. Se logró una sensibilidad del 80 % (intervalo de confianza [IC] del 95 %, 61,4–
92,3 %) en toda la población cuando 24 de 30 participantes con IA comprobada o probable
tuvieron lecturas positivas de la tira reactiva. Una lectura de tira reactiva de dos de los 25
controles también fue positiva, lo que arrojó una especificidad del 92 % (IC del 95 %, 74–
99 %). La LFD en orina demostró una sensibilidad estimada del 89,5 % (IC del 95 %, 66,7–
98,7 %) y una especificidad del 90,9 % (IC del 95 %, 58,7–99,8 %) para personas con
neoplasias malignas hematológicas u otros cánceres. Los prometedores resultados indican
claramente el éxito de la adopción de este ensayo útil y sencillo de ejecutar como protocolo
de detección regular para la UCI y para pacientes de alto riesgo sin la necesidad de ningún
procedimiento de muestreo invasivo. La tecnología de tira reactiva requiere una
preparación mínima de la muestra con una fácil interpretación visual en 30 minutos y
requiere poca habilidad de laboratorio. Esto puede ser ideal para aplicar dichos kits como
herramientas de detección habituales en entornos rurales y con recursos limitados donde la
complejidad técnica y el personal de laboratorio capacitado pueden ser una limitación. Sin
embargo, el ensayo muestra reactividad cruzada con Esto puede ser ideal para aplicar
dichos kits como herramientas de detección habituales en entornos rurales y con recursos
limitados donde la complejidad técnica y el personal de laboratorio capacitado pueden ser
una limitación. Sin embargo, el ensayo muestra reactividad cruzada con Esto puede ser
ideal para aplicar dichos kits como herramientas de detección habituales en entornos rurales
y con recursos limitados donde la complejidad técnica y el personal de laboratorio
capacitado pueden ser una limitación. Sin embargo, el ensayo muestra reactividad cruzada
conHistoplasma capsulatum y se deben realizar más estudios para comprender mejor este
parámetro.
Avances en métodos de diagnóstico de base molecular
El campo de la micología ha visto recientemente muchos avances en métodos moleculares
para ayudar en la detección y el diagnóstico de hongos. Los métodos moleculares
representan un método de detección con menos variaciones y un resultado de alto
rendimiento, dando resultados más rápidos que las pruebas de cultivo. Además, son la
opción preferida para la identificación de resistencia a fármacos antifúngicos, así como para
la detección de especies crípticas o no cultivables. Como lo demuestran los grandes ensayos
comerciales disponibles para la identificación de hongos (Tabla 1) las pruebas de PCR para
hongos se han desarrollado, validado y estandarizado ampliamente. Desde la discusión de
los nuevos ensayos de PCR y los avances relacionados, hasta el uso de enfoques más
nuevos como el metacódigo de barras de ADN, la evolución de nuevas secuenciaciones y
herramientas bioinformáticas, la presente sección detallará paso a paso los recientes
desarrollos o mejoras en los métodos de base molecular. haciéndolos más precisos en la
identificación de patógenos fúngicos.
Tabla 1 Lista de ensayos basados en PCR disponibles comercialmente para la
detección de hongos
mesa de tamaño completo
Candida T2 para el diagnóstico rápido de candidemia en sangre total Con una tasa de
mortalidad estimada que oscila entre el 25 y el 40%, la candidemia es la cuarta causa más
común de infecciones del torrente sanguíneo asociadas a hospitales [ 99 ]. Aunque el
hemocultivo sigue siendo el estándar de oro, un hemocultivo puede resultar positivo sólo en
el 50% de los casos de candidemia [ 100 ]. El rendimiento del hemocultivo clásico está
lejos de ser ideal debido al largo tiempo de positividad y supresión por parte de los agentes
antifúngicos. Candida albicans, Candida tropicalis y Candida parapsilosis generalmente se
detectan dentro de las 36 h, mientras que los cultivos con Candida glabrata (un organismo
difícil de crecimiento lento) pueden tardar hasta 80 h [ 101] .]. Se ha ideado un nuevo
método para reducir el tiempo necesario para el diagnóstico de la candidiasis invasiva,
teniendo en cuenta la posibilidad de que la candidemia pueda causar sepsis debido a un
diagnóstico tardío y el hecho de que el tiempo es esencial durante la sepsis. La
Administración de Alimentos y Medicamentos de EE. UU. (FDA) aprobó la plataforma
cualitativa no basada en cultivos T2Candida en 2014 para el diagnóstico de
candidemia. Esta prueba puede identificar rápidamente las cinco especies de Candida más
prevalentes a partir de sangre total en aproximadamente 5 h. Joshi y Shenoy [ 102] se han
referido a T2 Candida como el diagnóstico revolucionario de las infecciones fúngicas
invasivas, ya que detallan sus ventajas y su potencial para reducir la mortalidad debido al
diagnóstico temprano. La prueba se basa tanto en resonancia magnética como en métodos
moleculares (es decir, PCR) y, al ser de naturaleza molecular, se ha incluido en esta
sección. Brevemente, analizando el funcionamiento de T2 Candida, el proceso implica: (a)
se extrae sangre completa del paciente en presencia de EDTA, (b) se insertan directamente
tubos de sangre completa en el instrumento T2Dx totalmente automatizado (T2Biosystems,
Inc., Wilmington , MA, EE. UU.), (c) T2Dx lisa las células de Candida mediante estrés
mecánico, (d) la amplificación se realiza utilizando polimerasa termoestable y cebadores
para el ADN ribosomal de Candida, (d) el producto de ADN de Candida amplificado se
detecta mediante aglomeración de nanopartículas superparamagnéticas que llevan sondas
complementarias al objetivo y (e) la agrupación de nanopartículas provoca cambios en el
tiempo de relajación de T2, que se detecta mediante resonancia magnética de T2
(T2MR). El producto resultante se informa como positivo o negativo para la identificación
de las 5 especies comunes de Candida (C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C.
krusei y C. glabrata ) que representan> 95% de los casos de candidemia
[ 103 , 104 , 105 ]. La prueba se puede realizar con sólo 2 a 4 ml de sangre total, por lo que
también se puede utilizar en pediatría. El tiempo de respuesta medio es < 5 h y el límite de
detección es tan bajo como 1 a 3 UFC/ml de sangre completa en comparación con 100 a 1
000 UFC/ml que normalmente se requieren para los métodos convencionales basados en
PCR. La sensibilidad y especificidad generales de T2 Candida es del 91,1% y 99,4%
respectivamente y un VPN del 99,4% según un ensayo multicéntrico dada una prevalencia
de candidemia del 5% en un hospital general/UCI [ 106]. Definitivamente, estos parámetros
sobresalientes hacen que T2 Candida cambie las reglas del juego, acelerando así el inicio de
la terapia antimicótica antes de que el panorama se ponga feo tanto para el paciente como
para el médico. Además, T2MR no solo cubre las cinco especies de Candida, sino que
también puede detectar rápidamente seis bacterias comunes (los llamados patógenos
"ESKAPE", incluidos Escherichia coli, Staphylococcus aureus,
Klebsiella pneumoniae , Acinetobacter baumanii , Pseudomonas aeruginosa y Enterococcu
s ) . faecium ) [ 107 ].
Bilir et al. [ 108 ] estimó que el panel T2 Candida tiene un enorme impacto económico al
emplear un modelo de árbol de decisión de 1 año. El modelo calculó que el ahorro
potencial por paciente con candidemia en un hospital con 5.100 pacientes de alto riesgo al
año sería de 26.887 dólares, o una reducción del 48,8% en los gastos
hospitalarios. Evitando al mismo tiempo el 60,6% de la mortalidad provocada por la
candidemia. Además, la rápida identificación de Candida mostró el potencial de salvar más
de 30 vidas al año en un entorno hospitalario típico, lo que se traduce en una reducción de
la mortalidad del 60,6%. Un avance importante ha sido el desarrollo del nuevo panel T2
C.auris por parte de T2 biosystems. C. aurisha sido reconocido por los CDC como una
grave amenaza para la salud mundial debido a su resistencia a múltiples fármacos, las
principales clases de fármacos antimicóticos. En comparación con los métodos de cultivo,
que requirieron 14 días, el panel T2Cauris mostró ventajas de tiempo considerables (5 h) y
la incapacidad de detectar cantidades bajas de C. auris . En comparación con las pruebas de
diagnóstico molecular existentes para C. auris , el panel T2Cauris tiene un aumento de
sensibilidad superior a 100 veces y puede detectar niveles tan bajos como 5 UFC/mL
[ 109 , 110 ].
No hace falta decir que la T2-MR es definitivamente una tecnología innovadora para la
detección de candidemia con impactos significativos en las tasas de mortalidad y
morbilidad de los pacientes, las estancias hospitalarias y los costos hospitalarios. Dados sus
excelentes parámetros de rendimiento, se recomienda encarecidamente la incorporación de
T2Candida en algoritmos y directrices de diagnóstico junto con hemocultivos para guiar el
tratamiento de pacientes con sospecha de candidiasis invasiva, especialmente en entornos
de UCI u otros entornos de alta prevalencia. Además, el alto VPN permite a los médicos
suspender o reducir con confianza la medicación antimicótica para iniciar otras terapias de
tratamiento a tiempo. Por lo tanto, los resultados positivos de T2MR deben evaluarse a la
luz de la prevalencia prevista de la enfermedad en el escenario clínico particular.106].
Las infecciones profundas se originan por siembra hematógena o por introducción no
hematógena de Candida en sitios estériles, más comúnmente la cavidad abdominal
después de una alteración del tracto gastrointestinal o mediante un catéter peritoneal
infectado [ 100 ]. Sin embargo, es posible que los hemocultivos no puedan detectar la
cándida y den resultados negativos. Esto puede deberse a que las concentraciones de células
de Candida viables son insuficientes para ser detectadas en una muestra recolectada, o a
que hay una liberación intermitente o transitoria en el torrente sanguíneo y los tiempos de
cultivo no coinciden [ 111]. Se ha demostrado que T2 Candida brinda resultados
prometedores en la detección de candidiasis invasiva (CI) profundamente arraigada en
pacientes cuyos hemocultivos fueron negativos y luego se confirmó positivo mediante
biopsia de tejido [ 104 ]. Aún así, se necesitan más estudios para determinar el rendimiento
de la T2MR en el diagnóstico de candidiasis invasiva sin candidemia.
Avances en los ensayos de PCR en el diagnóstico de hongos La PCR fue el primer método
de amplificación de ácidos nucleicos que se desarrolló. Desde entonces, se han creado
variaciones de PCR nuevas y avanzadas, incluidas PCR anidada, PCR en tiempo real, PCR
multiplex, etc. La plataforma de pruebas e identificación micológica se ha beneficiado de
mejoras en las técnicas basadas en PCR. Se han utilizado cebadores específicos de hongos
para PCR y amplificación cuantitativa por PCR en tiempo real para el diagnóstico
de infecciones por Aspergillus , Candida, Mucorales y Pneumocystis jirovecii [ 112]. Un
ensayo de PCR para la detección de ácidos nucleicos fúngicos puede ser la mejor estrategia
de diagnóstico porque (a) es más sensible que los métodos actuales basados en cultivos, (b)
comparativamente consume menos tiempo que las pruebas de cultivo, (c) se aplica a
muchos tipos de muestras clínicas. (sangre, fluidos corporales, BAL, LCR, etc.) y (d)
aplicado para la detección de especies no cultivables o cuando las pruebas de cultivo son
negativas debido al inicio temprano de antifúngicos. Los lectores deben saber que no es
posible discutir todos los avances realizados en las diversas variantes de la PCR, por lo que
en esta sección enfatizaremos los desarrollos más recientes (de 2015 en adelante)
relacionados con el diagnóstico de hongos patógenos invasivos.
Avances en la PCR múltiple El concepto de PCR múltiple (m-PCR) no es nuevo. Con el
objetivo de superar los problemas inherentes al alto coste y mejorar aún más la capacidad
diagnóstica de la PCR, se introdujo una variante denominada PCR múltiple. Una m-PCR
permite la detección simultánea de múltiples objetivos en un solo pocillo de reacción, con
un par diferente de cebadores para cada objetivo. Esto ahorra costos, tiempo y esfuerzos,
pero sin comprometer la utilidad de la prueba. Una PCR múltiple en tiempo real puede
detectar simultáneamente entre dos y cinco especies patógenas utilizando cebadores y
sondas específicos de cada especie marcadas con varios tintes fluorescentes para cada
especie objetivo [ 113 , 114 , 115] .]. Además, la m-PCR puede distinguir entre organismos
muy estrechamente relacionados con suficiente especificidad para detectar múltiples
patógenos, lo que reduce significativamente los gastos. Hay una gran cantidad de kits
comerciales de m-PCR disponibles en el mercado para la detección de patógenos fúngicos
comunes (Tabla 1 ), pero pocos ensayos comerciales valen la pena mencionar. Tenemos
kits, por ejemplo, SeptiFast (Roche Diagnostics) y MycAssay Aspergillus . que no
requieren cultivo fúngico previo y la amplificación del ADN se realiza directamente a partir
de muestras clínicas ahorrando un paso adicional. SeptiFast m-PCR utiliza un protocolo de
extracción de ADN modificado que permite obtener una mayor sensibilidad (90,5%) para
detectar patógenos en volúmenes de sangre tan bajos como 100 μL, lo que permite el uso
del kit en casos de diagnóstico de sepsis neonatal por hongos en los que se obtienen
volúmenes de sangre más altos. de recién nacidos y prematuros es una limitación
[ 116 ]. Otro avance de la PCR es AsperGenius (PathoNostics, Maastricht, Países Bajos),
un ensayo de PCR múltiple en tiempo real exclusivo que consta de dos PCR múltiples en
tiempo real, uno para identificar el Aspergillus clínico .especies en la muestra, y una
segunda m-PCR para detectar la mutación en el gen CYP51A de A. fumigatus que causa
resistencia a los azoles. Por lo tanto, AsperGenius es en realidad un enfoque genial que
detecta simultáneamente el agente causal y encuentra la presencia de resistencia a los
medicamentos a partir de la muestra de BAL del paciente. El kit mostró una sensibilidad,
especificidad, VPP y VPN generales del 84,2%, 91,4%, 76,2% y 94,6%, respectivamente
[ 117 ]. A continuación, tenemos el panel FilmArray Meningitis/Encephalitis (ME)
(BioFire Diagnostics, Salt Lake City, UT), la primera aprobación de la FDA que recibió m
en octubre de 2015. El panel FilmArray Meningitis/Encephalitis detecta un objetivo
fúngico, Cryptococcus neoformans/Cryptococcus gattii . , además de objetivos bacterianos
y virales en el LCR [ 118]. De interés es el nuevo ensayo de PCR comercial para detectar
mucormicosis invasiva (IMM), es decir, MucorGenius (PathoNostics). El kit está diseñado
para detectar el gen multicopia 28S en las especies clínicamente relevantes más
prevalentes: ADN panMucorales, Rhizopus spp., Mucor spp., Lichtheimia spp., Cunninghamella spp.
y Rhizomucor spp. El kit permite la detección directa en muestras de BAL y resultados
rápidos en menos de 3 h [ 119 , 120 ]. El ensayo también se evaluó para detectar IMM en
muestras de suero o tejido [ 119] y los resultados mostraron una sensibilidad del 91% en
muestras de tejido IMM. Además, se detectó ADN mucorales en suero de pacientes con
IMM probable/probada (100%) y en el 29% de los casos posibles. En otro estudio
retrospectivo multicéntrico [ 121 ], MucorGenius se probó en 106 muestras de sangre de 16
pacientes con mucormicosis invasiva con cultivo positivo y encontró una sensibilidad
general del 75%. Los resultados positivos del kit precedieron a un cultivo positivo por una
duración promedio de 81 días, lo que indica que el ADN de Mucorales se puede detectar en
pacientes con sospecha de IMM mucho antes y en las etapas iniciales de la infección (a
diferencia de las pruebas tradicionales), lo que brinda tiempo suficiente para tener un mejor
control. para resolver la infección por hongos del sistema huésped. Una ventaja específica
de MucorGenius ®El ensayo es que puede realizarse en paralelo con un ensayo
específico de Aspergillus del mismo fabricante (AsperGenius ® ). Por lo tanto, en una sola
ejecución, la muestra BAL se puede probar para detectar la presencia de ambos mohos
simultáneamente usando cuatro canales de detección diferentes (verde, amarillo, naranja y
rojo para AsperGenius®, y amarillo y rojo para MucorGenius® ) . Este enfoque podría ser
muy relevante en un entorno clínico al detectar coinfecciones con ambos mohos y guiar la
terapia de tratamiento óptima. Las coinfecciones o infecciones mixtas con múltiples mohos
son una razón importante para que los resultados del tratamiento no sean óptimos. Se han
destacado casos de infección mixta en pacientes inmunocomprometidos con SARS-CoV-2
[ 122 , 123] .]. Esto requiere un alto grado de precisión y la implementación de ensayos de
diagnóstico precisos que cubran un panel más amplio de cepas fúngicas sospechosas. Con
este objetivo, Carvalho-Pereira y su equipo [ 124 ] desarrollaron una nueva PCR múltiple
que consta de dos paneles, es decir, Candida Panel (para identificar C. albicans, C.
parapsilosis, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis ) y los hongos filamentosos. Panel (para
identificar A. fumigatus, A. flavus, A. terreus, A. niger y R. arrhizus) utilizando cebadores
específicos de especies. Este es uno de sus tipos únicos de m-PCR diseñado que cubre la
identificación de las diez especies de hongos clínicamente más relevantes que causan
enfermedades invasivas a partir de hemocultivos positivos, así como de muestras de tejidos
de biopsias o de sitios estériles, etc. Además, la novedad de este enfoque radica en el hecho
de que el ensayo utiliza cebadores específicos de especies fuera del ADN mitocondrial o
ribosómico, lo que reduce la amplificación cruzada de especies no objetivo. El ensayo no
mostró reactividad cruzada con especies no objetivo y exhibió un límite de detección de 10
a 1 pg de ADN y mostró una detección prometedora de ADN fúngico a partir de suero
humano enriquecido sin interferencia del ADN humano. Más, Esta m-PCR de panel dual
utilizó una visualización sencilla de los resultados finales que se basa en la presencia de un
fragmento de tamaño correcto y el color fluorescente específico, descartando
amplificaciones inespecíficas. La personalización del ensayo para ampliar el panel e incluir
nuevas especies según la epidemiología de la región geográfica específica puede ser una
posibilidad futura.
En el futuro, a la luz de la resistencia emergente a los fármacos fúngicos, la detección
simultánea de las especies fúngicas clínicas junto con la detección de la resistencia fúngica
sería una ventaja adicional en el mismo plazo, tiempo y recursos. Con este objetivo, se
diseñó un ensayo de PCR multiplex de panel dual para detectar las principales especies de
hongos causantes de infecciones invasivas y también identificar especies
resistentes. Cebadores específicos de género para Candida,
Aspergillus y Fusarium spp. aislados y cebadores específicos de especies para C. glabrata,
C. krusei y A. terreusfueron diseñados y optimizados para la detección múltiple de
objetivos fúngicos. Mientras que el ensayo específico de especie identificó 10 pg–1 ng de
ADN, el ensayo de PCR múltiple específico de género tuvo un límite de detección de 0,1–1
ng de ADN [ 125 ]. Estas versiones de PCR de panel dual permitirían una diferenciación
rápida y confiable entre especies resistentes, así como la detección de hongos clínicamente
significativos, lo que ayudaría en la implementación temprana de un régimen antimicótico.
En otro enfoque novedoso, se optimizó un sistema de detección de PCR cuantitativa
múltiple en tiempo real para el diagnóstico rápido de C. auris , un patógeno oportunista
multidrogas emergente directamente a partir de muestras de suero enriquecidas [ 18 ]. La
m-PCR mostró una alta especificidad y sensibilidad analítica, es decir, 100% de
especificidad y sensibilidad de hasta diez genomas de C. auris con buena
reproducibilidad. Dado que C. auris continúa presentándose como una levadura oportunista
resistente a múltiples fármacos en entornos clínicos, esta nueva m-PCR tiene el potencial de
ser un enfoque prometedor debido a su capacidad para detectar directamente C. auris y
especies estrechamente relacionadas a partir de muestras de suero de
personas sospechosas . pacientes.
PCR en gotas La PCR en gotas digital (ddPCR) es una forma relativamente nueva de PCR
con una amplia gama de aplicaciones. El principio se basa en la amplificación de ácidos
nucleicos como una PCR normal, pero la característica distintiva es que una PCR en gotas
separa la mezcla de reacción en cientos o millones de particiones y detecta la amplificación
en tiempo real o en el punto final. La muestra objetivo se divide masivamente en gotas de
veinte mil nanolitros utilizando el ácido nucleico plantilla. Estas gotitas contienen
secuencias objetivo. Cada gota es una muestra de PCR en lugar de una sola. Después de la
amplificación, las gotitas se analizan para ver si contienen la secuencia deseada (gotitas
positivas) (gotitas negativas). La fracción de gotas positivas determina la concentración de
la plantilla en la muestra original utilizando una distribución de Poisson [ 126, 127 ]. A
diferencia de qPCR, ddPCR no requiere extrapolación, curvas estándar ni muestras de
referencia. La cuantificación absoluta lograda al final de la amplificación, una vez
finalizado el experimento, es la base de este enfoque. Además, la ddPCR es menos sensible
que la qPCR a la falta de coincidencia entre el cebador y la plantilla, la presencia de
inhibidores de la PCR (muchas muestras clínicas contienen inhibidores) y la eficiencia de
amplificación variada [ 128 ]. La cantidad de muestras y reactivos necesarios es modesta,
los volúmenes de reacción en ddPCR están en el rango de nanolitros y picolitros, y esto
reduce aún más el costo general de ejecutar una ddPCR. Estas ventajas de la PCR en gotas
también se han aprovechado para la detección y cuantificación absoluta de patógenos
fúngicos. Se ha utilizado DD-PCR para detectar A. fumigatusy A. terreus en muestras de
vías respiratorias. El equipo comparó directamente la técnica qPCR con la técnica ddPCR
probando ambas en 20 muestras de esputo con un estado conocido de Aspergillus . La
ddPCR fue superior para la detección de A. terreus , particularmente con una abundancia
de ADN muy baja, con mayor resistencia a las inhibiciones de la PCR en comparación con
la qPCR. Chen y compañeros de trabajo [ 129] también encontró resultados superiores al
aplicar ddPCR para la detección de ADN de Candida en sangre completa en comparación
con qPCR. Esta nueva técnica pudo detectar tan solo 4,5 copias de ADN por reacción en
muestras de sangre con alta especificidad y buena reproducibilidad. La ddPCR también
mostró una mayor sensibilidad del 94 % frente al 69 % para el cultivo y el 79 % para el
método qPCR, lo que recomienda su aplicación en el diagnóstico temprano de cándida con
volúmenes de sangre mínimos necesarios. También se ha probado la eficacia de la ddPCR
en infecciones fúngicas invasivas neonatales [ 130 ]. La tasa de mortalidad debida a IFI
neonatales en la UCI neonatal puede llegar hasta el 36% [ 131]. Además, una IFI progresa
rápidamente, lo que hace que el diagnóstico temprano y preciso sea tan crucial. Basado en
la secuencia del gen 18S rRNA de hongos altamente conservado, se estableció un sistema
de detección de ddPCR mediante el diseño de cebadores y la optimización del sistema. El
estudio se realizó en 83 pacientes neonatales con factores de alto riesgo y/o síntomas
clínicos de IFI. La ddPCR mostró una especificidad del 100 % y una alta sensibilidad al
detectar hasta 3,2 copias/μL de sangre analizada con buena repetibilidad. Además, debido a
los volúmenes de sangre mínimos requeridos en ddPCR, la técnica es apta para pacientes
neonatales, especialmente bebés prematuros.
Enfoques de PCR combinadosEsta subsección está dedicada a los desarrollos en los que se
ha combinado la PCR con técnicas para obtener precisión y exactitud de alto orden. La
plataforma Sepsis flow Chip y ePlex son dos de esos enfoques que vale la pena
mencionar. Sepsis Flow Chip (Master Diagnostica, España) es una plataforma para la
detección de los patógenos más prevalentes en infecciones sistémicas a partir de
hemocultivos positivos. Combina PCR multiplex con una hibridación por transferencia
puntual inversa. El Espacio Económico Europeo ha certificado el ensayo Sepsis flow
basado en microarrays de ADN como una herramienta de diagnóstico in vitro adecuada. El
trabajo implica una amplificación por PCR múltiple con cebadores biotinilados, seguido de
una hibridación inversa automática en una membrana que contiene sondas particulares para
detectar los patógenos de infección del torrente sanguíneo más importantes y los
determinantes de resistencia genética más importantes en los microbios. Está diseñado para
la detección simultánea de 40 patógenos, incluidas cepas de bacterias resistentes y, entre
levaduras, especies de Candida. Este ensayo de diagnóstico permite la detección rápida de
microbios que causan infecciones en el torrente sanguíneo y sus indicadores clave de
resistencia a los antibióticos directamente a partir de hemocultivos positivos en un tiempo
de respuesta de tres horas. La prueba mostró altos valores de sensibilidad (93%) y
especificidad (100%) con respecto a las especies de Candida, respectivamente. Este ensayo
de diagnóstico permite la detección rápida de microbios que causan infecciones en el
torrente sanguíneo y sus indicadores clave de resistencia a los antibióticos directamente a
partir de hemocultivos positivos en un tiempo de respuesta de tres horas. La prueba mostró
altos valores de sensibilidad (93%) y especificidad (100%) con respecto a las especies de
Candida, respectivamente. Este ensayo de diagnóstico permite la detección rápida de
microbios que causan infecciones en el torrente sanguíneo y sus indicadores clave de
resistencia a los antibióticos directamente a partir de hemocultivos positivos en un tiempo
de respuesta de tres horas. La prueba mostró altos valores de sensibilidad (93%) y
especificidad (100%) con respecto a las especies de Candida, respectivamente.132].
A continuación, el sistema ePlex ® de GenMark Diagnosis, con sede en EE. UU ., es una
plataforma completamente automatizada para el análisis de hemocultivos positivos que
combina técnicas de microfluidos, PCR y detección electroquímica, todo en uno. Este
ensayo aprobado por la FDA es único en su tipo y cubre un total de 16 especies/géneros de
hongos simultáneamente (panel BCID-FP), además de patógenos bacterianos y marcadores
de resistencia relacionados. Este gran panel de hongos patógenos incluye: especies de
Candida ( C. albicans, C. auris, C. dubliniensis, C. famata, C. glabrata, C. guilliermondii,
C. kefyr, C. lusitaniae, C. parapsilosis, C. tropicalis C. krusei ), Cryptococcus
neoformans , C. gattii , Fusarium spp y Rhodotorula spp [133 ]. El ensayo de cartucho de
un solo paso ePlex se basa en un paso de preparación de muestra diferente, es decir, que
utiliza el fenómeno microfluídico de la tecnología de electrohumectación seguido de
extracción, amplificación y digestión de ácido nucleico multiplexado. En la
electrohumectación, las gotas discretas en la superficie de una placa de circuito impreso con
un recubrimiento hidrofóbico son manipuladas directamente por campos eléctricos, lo que
permite un ciclo térmico rápido [ 134]. Sin embargo, el objetivo final se detecta utilizando
el método patentado de detección electroquímica de ácido nucleico llamado tecnología
eSensor. La tecnología eSensor se basa en el principio de hibridación competitiva de ADN
y detección electroquímica. Brevemente, la tecnología eSensor recluta derivados de
ferroceno en la superficie de electrodos chapados en oro mediante un método "sándwich"
de oligonucleótidos. Después del termociclado por PCR, se producen amplicones
monocatenarios mediante digestión con exonucleasa, que luego se hibridan con sondas de
señal que se conjugan con ferroceno. Las sondas de captura están unidas a los electrodos de
oro y las sondas de señal mantienen un saliente de amplicón que es complementario a las
sondas de captura. Ahora, el ADN del paciente se mezcla con la solución de la sonda de
señal y, si el ADN objetivo está presente, se produce una hibridación rápida con la sonda de
señal. Luego, la solución se bombea a través de la cámara del cartucho y las sondas de
señal/ADN objetivo comienzan a competir con las sondas de captura preensambladas en los
electrodos de oro. Con esto, se producen cambios en el ciclo hierro-redox en cada electrodo
y estos cambios son detectados por un software de detección electroquímica que indica la
presencia o ausencia del ADN objetivo que estamos buscando en el
paciente.135 , 136 ]. Dado que la tecnología eSensor es altamente específica para su ADN
objetivo, esta prueba es menos propensa al riesgo de contaminación de la muestra y no
requiere pasos de lavado que requieren mucho tiempo. Además, el requisito de hibridación
repetida de oligonucleótidos para producir una señal electroquímica mejora la especificidad
diagnóstica general. El rápido diagnóstico es posible gracias a la velocidad a la que se
reconocen los amplicones y al corto tiempo necesario para transmitir un voltaje a través de
los electrodos individuales. ePlex muestra una especificidad del 100% y una sensibilidad
que oscila entre el 99,8 y el 100% para patógenos fúngicos [ 137 ]. Al realizar pruebas en
105 muestras clínicas, el PPA fue del 92,4 % y el NPA fue del 99,9 % [ 138]. El panel
puede distinguir fácilmente entre contaminantes e infecciones reales con mayor rapidez, lo
que permite una rápida reducción y alta de los pacientes con infecciones del torrente
sanguíneo 2 a 3 días antes que con los enfoques tradicionales [133 ] . La combinación de
hemocultivo y ePlex podría acortar el tiempo de respuesta para detectar hongos de la sepsis
de 72 a 96 a 10 h [ 139 ], y esto puede ser un valor agregado para el tratamiento clínico de
pacientes con infecciones del torrente sanguíneo y posible sepsis mucho antes de tiempo.
De interés, otro enfoque combinado es el ensayo de ligadura por proximidad (PLA) para la
detección temprana de aspergilosis invasiva (IA). PLA combina la especificidad del
reconocimiento anticuerpo-antígeno con la sensibilidad de la detección por PCR en tiempo
real (qPCR). Brevemente, el principio de funcionamiento implica la utilización de dos
sondas de proximidad biotiniladas basadas en el anticuerpo monoclonal específico de
Aspergillus JF5 dirigido a manoproteínas antigénicas. Estos dos anticuerpos monoclonales
conjugados con oligonucleótidos no complementarios se añaden a la muestra de prueba. A
continuación, cuando los dos anticuerpos se unen a epítopos próximos entre sí, un
oligonucleótido aglutinante se hibrida con ambas cadenas, creando así una única cadena de
ADN que puede amplificarse mediante PCR e identificarse mediante qPCR [140] .]. No se
observó reactividad cruzada entre los antígenos solubles de las
especies Candida , Mucor , Fusarium , Rhizopus , Lichtheimia o Cryptococcus , lo que
indica que el ensayo fue muy específico. En muestras de suero y solución salina
enriquecidas, se estableció PLAability ® para detectar la proteína objetivo de Aspergillus ,
con una sensibilidad de 10 a 100 veces mayor que el ensayo GM y mejor sensibilidad que
el LFD, que utiliza el mismo Mab [ 141] .]. Esto tiene implicaciones importantes para el
diagnóstico temprano y el tratamiento específico de la IA. El flujo de trabajo de varios
avances basados en PCR discutidos anteriormente en esta sección se detalla
esquemáticamente en la Fig. 2 .
Figura 2
Flujo de trabajo de diversas tecnologías avanzadas basadas en PCR que son de uso
potencial en el campo del diagnóstico (PLA: Proximity ligation assay; VIC:
florophore). [La figura ha sido creada en Biorender.com]
Imagen a tamaño completo
Metabarcodificación de ADN La codificación de barras de ADN es un método bien
conocido de identificación de especies que utiliza una secuencia corta de ADN de un gen o
genes específicos. El concepto fundamental detrás de los códigos de barras de ADN es que
al comparar cada secuencia individual con una biblioteca de referencia de estos segmentos
de ADN, comúnmente denominados "secuencias", es posible hacer coincidir
específicamente un organismo a nivel de especie. Metabarcoding es una extensión de los
códigos de barras que permite identificar especies a partir de muestras mixtas utilizando
técnicas de secuenciación de alto rendimiento [ 156 , 157 ]. Las regiones genéticas pueden
servir como códigos de barras biológicos para varios organismos. La "brecha de códigos de
barras", o la diferencia entre la variación intraespecífica (dentro de la especie) e
interespecífica (entre especies), es la razón por la que se seleccionaron estas áreas
genéticas.158 , 159 ]. El espaciador interno transcrito (ITS) del ADN nuclear, que tiene
varios números de copias, ofrece la mejor precisión a nivel de especie y permite la creación
de cebadores universales y fúngicos [ 160 , 161 ]. Por lo tanto, las subregiones ITS1 e ITS2
se han aplicado como marcadores de metabarcodes [ 160 , 162 ]. La integridad de las
secuencias de referencia es crucial para la implementación exitosa de códigos de
barras/metabarras de ADN, y las bases de datos seleccionadas como UNITE, MaarjAM,
ISHAM DNA barcoding y NCBI RefSeq desempeñan un papel importante
[159 , 160 , 163 ] .
Sin embargo, una deficiencia importante de la región ITS incluye su incapacidad para
distinguir entre especies filogenéticamente relacionadas con secuencias potencialmente
idénticas o apenas distinguibles [ 164 , 165 ]. Sólo alrededor del 75% de todas las especies
de hongos pueden identificarse de manera confiable a nivel de especie mediante el locus
genético ITS1/2. Se ha propuesto el gen del factor de elongación de translocación 1 alfa
(TEF1) como código de barras del ADN fúngico secundario. La capacidad de crear
cebadores universales como EF1-1018F y EF1-1002F y su alta discriminación de especies
entre taxones de hongos llevó a la selección del factor de alargamiento traslacional 1
(TEF1) [ 166]. La base de datos de códigos de barras de ISHAM también se ha ampliado
para incluir secuencias para ambas regiones de códigos de barras, lo que permite
implementar prácticamente el esquema de códigos de barras duales en la práctica clínica
para acomodar este código de barras de ADN fúngico secundario [167] .]. El esquema de
códigos de barras de ADN de hongos duales es el resultado de la combinación de ambos
loci (ITS y TEF), lo que condujo a la generación de 270 nuevas secuencias de códigos de
barras de hongos secundarios. Cuando se analizó la diversidad de nucleótidos de 43
especies diferentes de hongos, se descubrió que la región TEF es menos diversa que la
región ITS y que la variación intraespecie del gen TEF1 suele ser inferior al 1,5 %, lo que
lo convierte en un marcador más discriminante. Los sistemas duales proporcionan una
mejor identificación de especies que usar un solo código de barras, ya que la combinación
de los dos códigos de barras mejora considerablemente el poder discriminatorio, lo que
permite una identificación más precisa. El equipo también propuso un esquema de
metacódigo de barras que utiliza ambos tipos en un entorno de diagnóstico. Después de
recibir una muestra clínica seguida de una evaluación inicial basada en sus características
morfológicas y/o bioquímicas, la muestra se somete a un código de barras de ADN fúngico
primario (región ITS1/2); si la secuencia muestra menos del 98,5% de identidad con una
secuencia de referencia ITS determinada en la base de datos, se realiza un código de barras
de ADN fúngico secundario (TEF1). Por lo tanto, la discusión anterior aboga firmemente
por el uso del esquema dual de códigos de barras de ADN fúngico para la identificación de
patógenos fúngicos y su implementación en los diagnósticos de rutina.
Secuenciación de próxima generación (NGS)
En principio, los conceptos detrás de Sanger y las tecnologías de secuenciación de próxima
generación (NGS) son similares. Pero la NGS, también conocida como “secuenciación de
alto rendimiento” (HTS), es enormemente paralela y ofrece la capacidad de secuenciar de
cientos a miles de genes o regiones genéticas simultáneamente al mismo
tiempo. Identificando los nucleótidos de las muestras clínicas y comparándolos con una
biblioteca de catálogos [ 168 , 169 ]. Debido a su capacidad para detectar con precisión y
rapidez múltiples dianas genéticas estrechamente relacionadas con patógenos [ 170 , 171 ],
la NGS sin duda está marcando el comienzo de la nueva era de la medicina de precisión. En
la Fig. 3 se muestra un diagrama esquemático que muestra el flujo de trabajo de NGS .
Fig. 3
Diagrama esquemático que muestra el flujo de trabajo de NGS para su aplicación
en el diagnóstico de patógenos fúngicos. [La figura ha sido creada en
Biorender.com]
Imagen a tamaño completo
En las últimas dos décadas, múltiples técnicas nuevas de secuenciación de alto rendimiento
(HTS) y nuevas plataformas de secuenciación han renovado el escenario de NGS. Estos
HTS incluyen los métodos de secuenciación de “lectura corta” de próxima generación y de
“lectura larga” de tercera generación. Las tecnologías de lectura corta han surgido desde
1994 y se comercializaron en 2005. Utiliza plataformas miniaturizadas y paralelizadas para
la secuenciación de 1 millón a 43 mil millones de lecturas cortas (50 a 400 bases cada una)
por ejecución del instrumento. Estos incluyen los potentes secuenciadores de sobremesa, es
decir, Illumina MiSeq, Illumina HiSeq, Ion Torrent: secuenciación Proton/PGM, SOLiD,
cPAL, etc. El Illumina NextSeq500 es capaz de proporcionar datos masivos mediante la
secuenciación de 30 a 40 genomas de hongos en una sola ejecución [ 172]. Sin embargo,
para leer un tramo largo mediante los secuenciadores de primera generación, las hebras
deben fragmentarse y amplificarse, y luego se utilizan programas informáticos para
ensamblar estos clones aleatorios en una secuencia continua [173 ] . Para superar este
desafío, salieron a la luz los métodos de secuenciación de “lectura larga” de tercera
generación. Las tecnologías de secuenciación de lectura larga son capaces de leer
longitudes más largas, de entre 5.000 y 30.000 pares de bases. Esto elimina el sesgo de
amplificación y, por lo tanto, genera una longitud razonable para superponer una secuencia
para un mejor ensamblaje de la secuencia [ 174]. El secuenciador de molécula única en
tiempo real (SMRT) (desarrollado por Pacific Biosciences) puede secuenciar longitudes
superiores a 10.000 bases en menos de dos horas. En un secuenciador SMRT, la ADN
polimerasa se coloca en la parte inferior de un chip de guía de ondas de modo cero. Este
chip es una nanoestructura fabricada en una fina película metálica capaz de confinar un
volumen de excitación al rango de attolitros. La molécula de ADN forma una estructura
circular monocatenaria formada por dos adaptadores dentro de cada chip de guía de ondas
de modo cero. La ADN polimerasa se utiliza para secuenciar un par de cadenas
complementarias y los nucleótidos se encuentran midiendo la fluorescencia [ 175]. El
siguiente es el secuenciador Oxford Nanopore. Se trata de una tecnología única y escalable
que permite el análisis directo y en tiempo real de fragmentos largos de ADN o ARN. Su
principio de funcionamiento se basa en monitorear los cambios en una corriente eléctrica a
medida que los ácidos nucleicos pasan a través de un nanoporo de proteína. Luego, la señal
resultante se decodifica, dando la secuencia específica de ADN o ARN [ 176 , 177 ].
Metagenomics NGS (mNGS) es una poderosa plataforma en el campo del diagnóstico
micológico clínico. El primer caso en el que se utilizó NGS fue en un paciente de 61 años
que presentaba síntomas de neumonía eosinofílica acompañada de asma bronquial. El
análisis directo de muestras de esputo mediante secuenciación escopeta confirmó la
coinfección con Aspergillus fumigatus y Schizophyllum commune . La NGS se ha empleado
con éxito en el diagnóstico de patógenos fúngicos y muchos de ellos han informado de la
presencia de más de una cepa de hongos implicada
[ 177 , 178 , 179 , 180 , 181 , 182 , 183 ].
De interés es el diagnóstico de Pneumocystis jirovecii , que es un hongo patógeno no
cultivable y cuya presentación clínica inespecífica dificulta su diagnóstico. Zhang et
al. [ 184 ] informaron 13 casos de neumonía por Pneumocystis (PCP) detectados mediante
secuenciación metagenómica de escopeta. Los 13 pacientes incluidos tenían neumonía de
etiología desconocida. 11 de los 13 casos tenían Enterococcus spp., Nocardia, Virus del
herpes humano, Candida spp. y Aspergillus.especies infecciones, que también fueron
detectadas por NGS metagenómica (mNGS). Además, en tres casos en los que los pacientes
no pudieron tolerar los exámenes de broncoscopia u otros procedimientos invasivos, NGS
pudo detectar directamente el patógeno en muestras de sangre periférica. Esto sugiere que
para los pacientes gravemente enfermos que no pueden soportar procedimientos invasivos,
la secuenciación de alto rendimiento ofrece una alternativa confiable. Chen y su equipo han
demostrado la sensibilidad inadecuada de las plataformas de diagnóstico convencionales
para el diagnóstico de PCP [ 183] .]. El estudio informó el caso de una mujer de 27 años
con trasplante renal que desarrolló neumonía cuatro meses después de su cirugía de
trasplante. Los análisis de sangre revelaron un recuento bajo de CD4. El examen
microscópico del BAL y el esputo no mostró ninguna morfología fúngica. Además, las
pruebas serológicas, de cultivo y de hemocultivo fueron todas negativas. Los niveles
séricos de galactomanano y BDG eran ambos normales. El día 13 de hospitalización, la
tinción diff-Quick para Pneumocystis jirovecii todavía era negativa y el cultivo BALF no
reveló crecimiento de bacterias u hongos; el nivel de galactomanano estaba en el rango
normal. Finalmente, se enviaron 3 ml de muestra de BAL a la plataforma MGISeq 2000
para NGS. Los resultados revelaron la presencia de 10 especies bacterianas, una especie de
hongo dominante, es decir, Pneumocystis jirovecii.y una especie viral. Esta confirmación
condujo al inicio del régimen de tratamiento correcto con resolución efectiva del
paciente. Con base en los resultados, el equipo ha defendido la necesidad de agregar la
profilaxis de la PCP a las Directrices de diagnóstico y tratamiento de las IFI en receptores
de trasplantes de órganos sólidos en China. También se han realizado otros estudios que
informaron el uso exitoso de mNGS para diagnosticar infecciones pulmonares que
involucran a P. jirovecii [ 177 , 185 , 186 , 187 ], destacando la sensibilidad inadecuada del
examen microscópico de muestras y del ensayo de BDG en suero para diagnosticar PCP.
De manera similar, Cryptococcus es otro patógeno fúngico invasivo que ha sido detectado
con éxito mediante técnicas NGS, según lo informado por trabajadores anteriores. La
criptococosis es causada por dos complejos de especies hermanas, Cryptococcus
neoformans y Cryptococcus gattii . Ambas especies tienen diferencias significativas en su
epidemiología, manifestaciones clínicas, progresión y estrategias de tratamiento. C.
gattii afecta a pacientes sin VIH con complicaciones neurológicas más graves, peor
respuesta a los fármacos antimicóticos y un período de tratamiento más prolongado
requerido [ 188 , 189] .]. En la actualidad, los métodos tradicionales de diagnóstico de
laboratorio, incluida la tinción con tinta china y la detección del antígeno criptocócico
(CrAg) en el LCR, no pueden distinguir las dos especies de criptococos. El uso de medios
que contienen dopamina, es decir, agar de flor de plátano desarrollado por Khayhan et
al. [ 190 ] puede ayudar a enriquecer el crecimiento del complejo y diferenciarlo de otras
levaduras, pero no puede diferenciar entre las dos. NGS es una técnica que puede ayudar
fácilmente a distinguir las dos especies. Esto ayudará a proporcionar información útil sobre
las especies involucradas, esencial para guiar una correcta toma de decisiones.
En un estudio comparativo, Xing y su equipo [ 191 ] evaluaron el rendimiento diagnóstico
de mNGS con tinción con tinta china convencional y ensayo de cultivo en muestras de LCR
de 12 pacientes no infectados por el VIH con meningitis criptocócica (CM). Aunque la tinta
china y el cultivo del LCR fueron positivos para Cryptococcus en el 83,333% (10/12) de las
muestras, el mNGS fue capaz de detectar ADN en el 75,3% de las muestras (9/12). Sin
embargo, el ADN de C. neoformans sl y C. gattiisl se detectó simultáneamente en el
33,333% (4/12). La capacidad de distinguir entre especies es un beneficio adicional que
ofrece la NGS, lo que informa la elección de cursos de tratamiento antimicótico
apropiados. En un estudio reciente similar, se probó el rendimiento diagnóstico de la NGS
en 197 pacientes sin VIH con sospecha de infecciones del sistema nervioso central
[ 192 ]. De los 197 casos, 46 fueron confirmados como casos de CM. Además, 43 casos
fueron de infecciones por Cryptococcus neoformans y 3 de infecciones por Cryptococcus
gattii . La sensibilidad y especificidad fueron del 93,5% y del 96,0%, que fue superior a la
de las pruebas de tinta china y cultivo, pero ligeramente inferior a la de la detección de
CrAg mediante ELISA. Cabe destacar que solo mNGS pudo identificar Cryptococcusa
nivel de especie. La mNGS del LCR puede considerarse una prueba complementaria para
diagnosticar la CM, pero futuras investigaciones para mejorar la sensibilidad pueden
centrarse en la eliminación de secuencias humanas y el posible enriquecimiento de
secuencias de patógenos. Además de detectar CM, Zhang et al. [ 180 ] informaron que la
mNGS también pudo detectar un caso raro de osteomielitis criptocócica en dos pacientes
sin VIH en los que se sospechaba que tenían una neoplasia de tejidos blandos. Al ser
negativo el cultivo microbiológico, la mNGS pudo identificar Cryptococcus neoformans y,
con el tratamiento oral solo con fluconazol, las infecciones se erradicaron con éxito.
NGS tiene el potencial de descubrir hongos patógenos raros, especialmente aquellos que no
pueden aislarse fácilmente o aquellos que tienen una incidencia muy baja en áreas no
endémicas. Estos casos tienen una mayor probabilidad de ser mal diagnosticados o
subdiagnosticados por el médico. Por ejemplo, la histoplasmosis es una enfermedad
endémica que se presenta principalmente en América del Norte y es rara en China. En uno
de esos estudios, un hombre chino de 27 años presentó lesiones pulmonares crónicas
durante más de un año, seguidas de lesiones que llegaban a la epiglotis y provocaban dolor
faríngeo progresivo. Después de una serie de pruebas, a los pacientes se les diagnosticó
epiglotitis aguda y sospecha de tuberculosis (TB). Pero, con el empeoramiento de los
síntomas, finalmente se realizó un análisis mNGS del tejido de la epiglotis y del BAL, que
identificó H. capsulatum.dentro de las 96 h. Los pacientes recibieron itraconazol durante 12
semanas y, después del tratamiento, la TC de tórax mostró una regresión completa de las
lesiones y una resolución efectiva de la infección. Por lo tanto, aunque la incidencia de
histoplasmosis laríngea es rara, la mNGS aún debe aprovecharse para lograr un diagnóstico
preciso en los casos en los que continúan apareciendo sombras persistentes de densidad en
vidrio esmerilado en las exploraciones por imágenes con empeoramiento de los
síntomas. Además, también se puede tener en cuenta el historial clínico del paciente con
inmunodeficiencia adquirida o cualquier error congénito de la inmunidad. Además, la NGS
también puede ser una herramienta de seguimiento útil para estudiar la progresión de la
enfermedad y evaluar la eficacia de la terapia antifúngica, ya que la NGS realizada durante
visitas de seguimiento consecutivas se puede analizar comparando la abundancia de
lecturas de secuencia con la recuperación clínica del paciente.193].
Con la capacidad de diagnosticar casos raros y atípicos, muestras con baja carga fúngica y
de detección simultánea de múltiples agentes etiológicos de diferentes taxones (bacterias,
virus y hongos patógenos) en una sola muestra (en casos de infecciones mixtas), NGS
representa una herramienta útil en el arsenal de diagnóstico. Sin embargo, adolece de
desafíos que obstaculizan la implementación rutinaria de la tecnología NGS en los planes
de diagnóstico de las IFI y, por el momento, el alto costo es el principal obstáculo que debe
reducirse para una mayor aceptabilidad [ 194]. Además, el análisis de datos de NGS para la
identificación de múltiples patógenos utilizando bases de datos de secuencias de
nucleótidos como datos de referencia requiere sistemas informáticos de mayor tamaño de
memoria, y el análisis de NGS diario por parte de laboratorios clínicos definitivamente
requeriría mejoras importantes en las capacidades de procesamiento de datos [195 ] . A
partir de ahora, la NGS se puede utilizar como una herramienta de diagnóstico adicional y
los resultados deben compararse con los resultados de las pruebas de diagnóstico
tradicionales y con la condición del paciente.
Avances en pruebas de diagnóstico de hongos basadas en biosensores
Según la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC), los biosensores se
definen como “dispositivos receptor-transductor integrados que proporcionan información
analítica cuantitativa o semicuantitativa utilizando un elemento de reconocimiento
biológico” [ 196]. Un biosensor tiene tres componentes principales sobre los que funcionan:
(a) un elemento de reconocimiento que distingue un analito particular o un grupo de
analitos; (b) un elemento transductor que produce una señal; y (c) el procesador de
señales. Funcionan cuando los componentes transductores y de reconocimiento del
biosensor cooperan para proporcionar una señal cuantificable. Los biosensores han
revolucionado la atención sanitaria y el diagnóstico desde su desarrollo. La tecnología de
biosensores se puede utilizar para crear dispositivos económicos y desechables para el
punto de atención o para proporcionar un seguimiento continuo de diferentes
biomarcadores de la forma menos invasiva posible [197, 198 ] .]. Los avances en la
tecnología de biosensores, que ya lo han hecho y seguirán haciéndolo, también han
beneficiado el diagnóstico de hongos invasivos, como se destaca en esta
sección. Dependiendo del tipo de sistema de generación de señal o transductor, los
biosensores se clasifican en: (i) electroquímicos, (ii) ópticos, (iii) piezoeléctricos o (iv)
termométricos. Discutiremos los nuevos avances en los distintos tipos utilizados en la
identificación de especies de hongos invasores.
Biosensores electroquímicos Los biosensores electroquímicos analizan el contenido de una
muestra biológica basándose en la conversión directa de una reacción biológica en una
señal electrónica medible, por ejemplo, cambios en la impedancia (espectroscopia de
impedancia electroquímica), cambios en la corriente (amperométrica) o en la diferencia de
potencial (potenciométrica) [ 199 ]. Pero hasta ahora sólo unas pocas publicaciones hablan
de cómo se pueden utilizar para diagnosticar hongos. Para detectar
directamente C.albicans , Kwansy et al. [ 200] creó un biosensor sencillo basado en
impedancia electroquímica. El biosensor pudo capturar directamente células de levadura en
electrodos específicamente funcionalizados con anticuerpos anti-Candida, provocando
cambios en la espectroscopia de impedancia electroquímica. La ventaja de utilizar esta
técnica es que el biosensor puede detectar células de levadura en la muestra de prueba en
menos de una hora, ahorrando tiempo para decidir la terapia antimicótica. La resistencia de
carga de transferencia aumentó al aumentar la concentración de células de levadura (es
decir, valores Rct de 350, 500 y 578 ohmios para 10, 100 y 1000 UFC/mL,
respectivamente) con un ajuste de linealidad de R 2 = 0,916 y una sensibilidad demostrada
de captura tan baja como 10 UFC/ml en una muestra de PBS. El equipo está trabajando
para seguir perfeccionando y probando el biosensor en muestras clínicas. En un trabajo
diferente, un equipo describió la creación de un biosensor electroquímico para detectar el
gen objetivo patógeno glip, que puede usarse para diagnosticar IA [ 201 ]. El gen glip
codifica una toxina fúngica (es decir, gliotoxina) que se encuentra exclusivamente
en Aspergillus.especies. Las monocapas autoensambladas de 1,6-hexanoditiol producidas
en el electrodo de oro se utilizaron para inmovilizar la sonda glip sobre nanopartículas de
oro estabilizadas con quitosano (AuNP) para el biosensor electroquímico. A partir de la
reacción de hibridación y de la señal producida utilizando azul de toluidina como molécula
indicadora, se examinó la capacidad del sensor para detectar glip-T. En tampón estándar y
muestra real, el límite de detección del biosensor glip fue 0,32 0,01 × 10–14 M y 0,81 0,01
× 10–14 M, respectivamente. El biosensor desarrollado fue capaz de detectar glip-T en
solo 20 minutos, lo que ofrece una detección rápida de cepas de Aspergillus fumigatus que
causan IA y producen gliotoxinas.. Además, la tecnología demostró una gran reutilización,
lo que la convierte en una opción financieramente ventajosa para su conversión en un
dispositivo compacto de mano para la detección in situ de glip-T de pacientes con IA.
Biosensores ópticos Estos biosensores en particular son los más populares y utilizados con
frecuencia de todos. Un biosensor óptico consta de un componente de detección de
biorreconocimiento combinado con un sistema de transductor óptico. El biosensor es
compatible con una variedad de biomoléculas (enzimas, anticuerpos, antígenos, receptores,
ácidos nucleicos y células completas como elementos de biorreconocimiento). El sistema
transductor puede basarse en resonancia de plasmón superficial (SPR) o fluorescencia de
ondas evanescentes, o dispersión dinámica de luz, refractometría, etc. [ 202 ]. Estos ofrecen
ventajas sobre otros métodos analíticos, ya que nos permiten lograr una detección del
analito sin etiquetas, así como permitir observaciones en tiempo real. Cai y colegas [ 203]
utilizó un cristal fotónico (PC) basado en el reconocimiento específico de proteínas y
carbohidratos para detectar la presencia de C. albicans . La reacción del analito se basó en
la interacción específica entre la concanavalina A (Con A) y el manano presente en la pared
celular de los hongos. Para ello, se crearon matrices de PC bidimensionales (2D)
monodispersas de hidrogeles de proteína ConA pura reticulando soluciones de Con A con
glutaraldehído. Finalmente, un desplazamiento hacia el azul legible de la difracción de la
matriz 2D que era proporcional a la carga fúngica resultó del entrecruzamiento que ocurrió
como resultado del reconocimiento de múltiples grupos manosa por parte de las proteínas
Con A del hidrogel. Esta reducción y disminución del espacio entre partículas de la matriz
2D fue el paso final. El sensor tenía un buen límite de detección de 32 UFC/mL para C.
albicansy pudo distinguir específicamente entre células de C. albicans y otros
microorganismos. Para aumentar la sensibilidad y acortar los períodos de detección, el
equipo ha estado optimizando y trabajando aún más en el empleo de hidrogeles más
delgados y menos reticulados. No obstante, este estudio proporciona una prueba de
concepto de que las interacciones basadas en lectinas y antígenos de carbohidratos pueden
formar la base para diseñar biosensores potentes que sean rápidos, fáciles de usar y
económicos al mismo tiempo. Además de ConA, existe otra lectina de tipo C, es decir, la
lectina-2 asociada a células dendríticas (dectina-2), que se sabe que se une al manano
fúngico [ 203] .]. Dectin-2 se une a estructuras con alto contenido de manosa y su unión
conduce a una serie de respuestas inflamatorias. La capacidad de explotar las propiedades
de la dectina-2 en el desarrollo de biosensores basados en dectina es otra posibilidad
[ 204 ].
En un estudio reciente de 2022, un equipo de científicos informó sobre el desarrollo de un
novedoso nanobiosensor óptico basado en el método de dispersión dinámica de la luz
(DLS) para el diagnóstico de IA basado en la detección de Aspergillus galactomanano en
fluidos biológicos adecuados para el diagnóstico rápido de POC . . Dichos biosensores
determinan la presencia de un analito en solución mediante la detección de la agregación de
nanopartículas funcionalizadas con receptores para el analito objetivo. En este estudio de
[ 205], se funcionalizaron nanopartículas de oro con anticuerpos de alta afinidad contra el
galactomanano (GM), que se utilizaron como sondas. Los investigadores utilizaron el
diámetro hidrodinámico de las nanopartículas funcionalizadas y la tasa de conteo de los
pulsos de luz dispersados como dos señales analíticas separadas. Claramente, esto se hizo
para mejorar la precisión y confiabilidad de los nanosensores basados en dispersión
dinámica de luz (DLS). Se compararon los datos para el diámetro hidrodinámico y la tasa
de conteo, y esto reveló una buena correlación entre los dos. Al medir con muestras clínicas
de BAL, el coeficiente de determinación entre los valores del diámetro hidrodinámico y
absorbancia de ELISA fue R 2 = 0,9705, y entre los valores de tasa de conteo y
absorbancia, fue R 2 = 0,998, mostrando buena correlación entre biosensor y ELISA. Los
límites de detección para la evaluación del calibrador GM en plasma fueron 0,2 ng/ml
según los datos del diámetro hidrodinámico y 0,1 ng/ml según los datos de la tasa de
recuento. El límite de detección de GM en muestras de BAL fue de 3 ng/mL cuando se
detectó por el diámetro hidrodinámico y de 0,4 ng/mL cuando se detectó por la tasa de
conteo de pulsos de luz dispersados. Con una competencia comparable a la de ELISA, la
mayor ventaja es la rapidez, ya que esta técnica sin lavado fue capaz de procesar y medir 10
muestras en menos de 100 minutos. Los resultados justifican una exploración futura del
método propuesto para diseñar diagnósticos rápidos en el punto de atención.
Además de los biosensores anteriores, los biosensores piezoeléctricos y los biosensores
térmicos también tienen un gran potencial para ser explotados en la detección de
hongos. Un biosensor piezoeléctrico tiene un cristal piezoeléctrico. Las oscilaciones de la
superficie del cristal piezoeléctrico varían cuando el analito se une a ella [ 206 , 207 ]. La
señal analítica se mide utilizando este cambio (caída) en la frecuencia oscilatoria, que es
proporcional a la masa unida al cristal. La operación sin etiquetas en tiempo real y el
monitoreo del crecimiento de hongos pueden ser posibles mediante la detección masiva
[ 208 ]. De manera similar, los biosensores térmicos monitorean el cambio de calor que
resulta de una reacción biológica en un medio [ 204 , 209] .]. Aún no se ha informado que
se utilicen biosensores piezoeléctricos o térmicos para la detección de especies de hongos
invasores. En un estudio de 2005, Nugaeva y sus colegas [ 210 ] crearon un biosensor
micromecánico en voladizo para la detección cuantitativa rápida de Saccharomyces
cerevisae y Aspergillus niger . No hace falta decir que es necesario realizar más
investigaciones para explorar estos tipos de biosensores en el campo de la detección de
patógenos fúngicos para establecer una prueba de concepto. Además de lo anterior, se han
realizado estudios anteriores centrados en materiales de tamaño nanométrico (como puntos
de carbono, nanotubos de carbono, nanocables, liposomas, etc.) que pueden incorporarse al
diseño de biosensores novedosos y únicos, lo que permite una mayor precisión y rapidez.
detección de cepas de hongos invasores [211 , 212 , 213 ] como se muestra en la Tabla 2 .
Tabla 2 Materiales de tamaño nanométrico utilizados en la detección de hongos
mesa de tamaño completo
Detección basada en microfluidos Los métodos basados en microfluidos están ganando
importancia en el campo del diagnóstico de hongos [ 214 , 215]]. La microfluídica implica
el procesamiento de pequeñas cantidades de fluidos mediante el uso de fuerzas diminutas
en la dimensión de microescala. Esta técnica se basa en el control y la manipulación
precisos de fluidos que están geométricamente restringidos a pequeña escala. Las
propiedades del fluido cambian y las fuerzas superficiales dominan las fuerzas volumétricas
a esta escala. El chip de microfluidos es un patrón de microcanales que ha sido moldeado o
grabado. Una serie de orificios de varios tamaños perforados a lo largo del chip de
microfluidos conectan esta red de microcanales con el macroentorno. Tiempos de reacción
más rápidos, mejor control de la temperatura, portabilidad, integración de procedimientos
de laboratorio en un solo dispositivo (laboratorio en un chip), automatización e
informatización más sencillas para lograr capacidades analíticas de alta precisión hacen que
valga la pena explorar esta tecnología [216] ., 217 , 218 ]. Al investigar el papel de los
chips de microfluidos en la detección de patógenos fúngicos, Asghar y su equipo [ 219 ]
han contribuido en esta dirección. Informaron sobre el diseño de un innovador dispositivo
de microfluidos de base inmunológica para la detección rápida de C. albicans a partir de
solución salina tamponada con fosfato (PBS) y sangre humana completa. El chip de
microfluidos está hecho de poli (metacrilato de metilo) (PMMA), adhesivo de doble cara
(DSA) y una cubierta de vidrio cortada con láser con precisión para contener tres canales,
entradas y salidas de microfluidos. Los anticuerpos anti-Candida se inmovilizaron en la
superficie mediante una química de superficie basada en la proteína G. Luego, el equipo
utilizó anticuerpos monoclonales y policlonales para evaluar la eficacia de la captura de C.
albicans . a partir de muestras enriquecidas dentro de canales de microfluidos. Los
anticuerpos policlonales anti-Candida mostraron valores superiores (77,4 ± 4,4%) que los
anticuerpos monoclonales anti-Candida (48,6 ± 2,8%). En muestras de PBS enriquecidas,
hubo un aumento en la eficacia de captura al aumentar la carga fúngica, es decir, al
aumentar la carga de 10 3 , 10 4 y 10 5 UFC/ml, las eficiencias de captura también
aumentaron a 61 ± 12,7 %, 70 ± 13,2 % y 77,4 ± 4,4%, respectivamente. A 10 2 UFC/ml, la
eficacia de captura disminuyó inicialmente, pero el equipo descubrió que al aumentar el
volumen de la muestra (de 50 µL a 1 ml), se observaron altas eficiencias de captura durante
10 2 UFC/mL (78 ± 13,2%) y 10 UFC/mL (75 ± 21,1%). Para la sangre completa
enriquecida, la eficiencia de captura fue del 40,5 ± 4,7%, posiblemente debido a la gran
cantidad de células sanguíneas que dificultan la interacción Candida-anticuerpo. Por lo
tanto, el equipo lisa la muestra de sangre enriquecida, como resultado de lo cual la
eficiencia de captura aumentó significativamente a 74,6 ± 6,8%. Todo el proceso tomó un
promedio de 1 a 5 a 2 h. Además de esto, el enfoque de microfluidos permite la captura y
aislamiento de células Candida completas (ya que Candia no se lisa en el protocolo), por lo
que pueden ser posibles pruebas de resistencia y susceptibilidad a los
medicamentos. Además, las técnicas de microchip se pueden integrar con imágenes basadas
en teléfonos inteligentes [ 220 ] para permitir pruebas en el punto de atención, así como
pruebas y atención remota de pacientes. En líneas similares, Bras et al. [ 221] también
estudió el uso de un enfoque basado en microfluidos para la detección multiplexada en el
punto de necesidad de patógenos fúngicos de plantas que infectan cultivares de uva.
Los datos revisados sobre el uso de la tecnología de biosensores en esta sección enfatizan el
hecho de que el diagnóstico de hongos basado en biosensores representa una nueva era que
vale la pena explorar y tiene un inmenso potencial para cambiar la cara del diagnóstico de
hongos. Al combinar e integrar elementos de reconocimiento diferentes y cruciales en una
plataforma de biosensores multiplexados, se pueden superar los desafíos de sensibilidad,
especificidad y reproducibilidad. Los biosensores pueden acelerar el análisis, acortar los
tiempos de preparación de muestras y ofrecer una herramienta de diagnóstico sencilla y de
bajo costo para registrar los datos. Esto hace posible realizar diagnósticos en el punto de
atención (POC) utilizando biosensores. Pueden ser colocados como soldados de primera
línea (como parte de la detección de rutina) en el régimen de diagnóstico, eliminando la
necesidad de analizar cada muestra de prueba sospechosa y realizar rondas de pruebas
largas y exhaustivas. pruebas laboriosas y costosas (pruebas de cultivo, PCR,
inmunoensayos, ELISA, etc.). Los avances en la investigación de biosensores, las pruebas
en el lugar de atención y el monitoreo en tiempo real de los marcadores de hongos y el
crecimiento de hongos ayudarían a la detección oportuna del patógeno fúngico, brindando
tiempo para comenzar el curso de intervención más apropiado lo antes posible.
Inteligencia artificial y aprendizaje automático: una nueva era en el
diagnóstico de hongos y la atención al paciente
La inteligencia artificial (IA) es la simulación de procesos de inteligencia humana mediante
máquinas, especialmente sistemas informáticos, y esta simulación incluye aprendizaje,
razonamiento y autocorrección. El aprendizaje automático (ML) es una rama de la
inteligencia artificial y la informática que se centra en el uso de datos y algoritmos, lo que
permite que la aplicación de software sea más precisa a la hora de predecir resultados tal
como lo hacen los humanos. Los algoritmos de ML utilizan datos históricos como entrada
para predecir nuevos valores de salida con mayor precisión. El aprendizaje profundo se
define además como un subconjunto de técnicas de aprendizaje automático que enseñan a
las computadoras a hacer lo que es natural para los humanos, es decir, aprender con el
ejemplo y a partir de grandes conjuntos de datos [ 227 ].
Durante la última década, los métodos de IA, desde el aprendizaje automático hasta el
aprendizaje profundo, han contribuido enormemente a acelerar la digitalización en la
atención sanitaria. La atención sanitaria digitalizada ofrece menos errores humanos, lo que
mejora los resultados clínicos y permite el seguimiento en tiempo real de los datos de los
pacientes, etc. [ 228 , 229]]. La mayor ventaja que ofrecen los modelos basados en IA y ML
es que ayudan a los médicos a tomar decisiones más rápidas y precisas mediante un
procesamiento y análisis rápidos de datos masivos y complejos. Un médico se basa en
tomografías computarizadas (TC) o imágenes de resonancia magnética para su posterior
análisis, mientras que un modelo de inteligencia artificial haría el mismo trabajo y
detectaría las características del área enferma en una fracción de segundo. La IA y el
aprendizaje automático se han convertido en herramientas poderosas para ayudar al
diagnóstico y proporcionar un diagnóstico más preciso, ayudando al médico a tomar
decisiones correctas. La detección basada en IA también permite identificar pacientes con
enfermedades infecciosas subdiagnosticadas, latentes o subclínicas. Ha habido un estudio
que muestra varios casos con la aparición de infecciones cutáneas profundas por hongos,
meses o años después del trasplante en los sitios curados,230 ]. Este puede ser el caso
cuando los hongos permanecen abiertos y brotan sólo cuando la neutropenia y los
medicamentos inmunosupresores alteran las defensas inmunitarias lo suficiente como para
permitir la reactivación y la proliferación fúngica. Con los modelos de IA para la detección
de enfermedades, existe una amplia oportunidad de impulsar un diagnóstico más temprano
para los pacientes que lo necesitan, guiando así el tratamiento correcto en una etapa más
temprana de su enfermedad [ 231]. En esta sección, detallamos y mejoramos nuestra
comprensión del uso de modelos basados en IA y ML para ayudar a una detección precisa y
más rápida de IFI. Hemos seguido utilizando terminología simple, teniendo en cuenta que
los lectores no tienen una formación básica en informática. Sin embargo, no se ha cubierto
una discusión detallada de los diversos algoritmos utilizados, las redes neuronales y su
funcionamiento o modo de operación, los principios de procesamiento y análisis de
imágenes y los clasificadores utilizados para la interpretación de datos porque está fuera del
alcance de esta revisión.
Una descripción básica de cómo funciona el ML De la forma más sencilla, el aprendizaje
automático clásico utiliza algoritmos (un método paso a paso para resolver un problema)
para ser más preciso en sus predicciones. Estos algoritmos de ML pueden procesar grandes
cantidades de datos y extraer información útil. Continúan mejorando sus iteraciones
anteriores aprendiendo de los datos que se les proporcionan [ 227 , 232].]. Hay cuatro
enfoques básicos: aprendizaje supervisado, aprendizaje no supervisado, aprendizaje
semisupervisado y aprendizaje por refuerzo. En el aprendizaje supervisado (basado en
tareas), que es la forma más básica de ML, el científico de datos proporciona a los
algoritmos datos de entrenamiento etiquetados y un conjunto de datos más pequeño para
entrenar. El conjunto de datos ya ha definido variables que el algoritmo debe evaluar para
determinar las correlaciones. Se especifican tanto la entrada como la salida del
algoritmo. Al final del entrenamiento, el algoritmo tiene una idea de cómo funcionan los
datos y la relación entre la entrada y la salida. Luego, el algoritmo se prueba en el conjunto
de datos real o final. Estos algoritmos continúan mejorando después de su implementación,
descubriendo nuevos patrones y relaciones a medida que se entrenan con nuevos datos
[ 233 , 234] .].
El enfoque de aprendizaje no supervisado (basado en datos) utiliza algoritmos que se
entrenan con datos sin etiquetar. El algoritmo busca en conjuntos de datos en busca de
conexiones significativas. El beneficio del aprendizaje automático supervisado es su
capacidad para operar con datos sin etiquetar. Esto significa que no se necesita intervención
humana para que el conjunto de datos sea legible por máquina, lo que permite que el
programa funcione en conjuntos de datos mucho más grandes. La tercera categoría, es
decir, semisupervisada, es una combinación de los dos primeros tipos. Los científicos de
datos pueden proporcionar un algoritmo con datos de entrenamiento en su mayoría
etiquetados, pero el algoritmo también puede examinar los datos de forma independiente y
llegar a sus propias conclusiones sobre el conjunto de datos. Finalmente, el aprendizaje por
refuerzo (aprender del error) imita directamente cómo las personas aprenden a partir de
datos en su vida diaria. Tiene un algoritmo de superación personal que se adapta a nuevas
circunstancias y aprende de los errores. [233 , 234 , 235 ]. Los resultados positivos se
“refuerzan” o alientan, mientras que los resultados negativos se “castigan” o
desalientan. Lo mismo se ha explicado en la Fig. 4 .
Figura 4
Diagrama esquemático de los tres paradigmas básicos del aprendizaje
automático: a Aprendizaje supervisado, b Aprendizaje no supervisado
y c Aprendizaje por refuerzo explicado en términos de detección de especies de
hongos basado en imágenes microscópicas como conjuntos de datos [La figura ha
sido creada en Biorender.com]
Imagen a tamaño completo
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Los pasos básicos involucrados en cualquier modelo basado en ML incluyen:
Paso 1: Necesitamos descubrir cuál es el problema y qué queremos lograr.
Paso 2: Debemos recopilar datos sin procesar, también conocido como paso de adquisición
de datos.
Paso 3: Debemos limpiar/manipular los datos (para valores atípicos, valores nulos,
corrección de errores, etc.) para poder utilizarlos en nuestra capacitación de aprendizaje
automático. Además, lo dividiremos en un conjunto de datos de entrenamiento y un
conjunto de datos de prueba final.
Paso 4: Necesitamos elegir el algoritmo.
Paso 5: Necesitamos entrenar el algoritmo elegido (entrenamiento de modelos) utilizando
conjuntos de datos de entrenamiento para mejorar la capacidad de nuestro modelo para
predecir el resultado deseado.
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Paso 6: Necesitamos probar o evaluar el algoritmo en un conjunto de datos de prueba
(prueba de modelo) para obtener el rendimiento del modelo. Esta métrica nos permite ver
cómo podría funcionar el modelo frente a datos que aún no ha visto.
Paso 7: Ajuste fino del algoritmo para mejorar los parámetros de rendimiento.
Se han definido algunos términos utilizados en los estudios citados para una comprensión
más clara, y estos incluyen:
Red neuronal artificial (RNA): Este es un modelo computacional que consta de varios
elementos de procesamiento que reciben entradas y entregan salidas en función de sus
funciones de activación predefinidas. Esto está inspirado en las redes neuronales biológicas
del cerebro humano.
Red neuronal convolucional (CNN): debido a su capacidad para reconocer patrones en
imágenes, CNN es un tipo de red neuronal artificial que se utiliza principalmente para el
reconocimiento y procesamiento de imágenes.
Redes neuronales profundas (DNN): se trata de un tipo de red neuronal artificial con cierto
nivel de complejidad, normalmente al menos dos capas ocultas entre la capa de entrada y la
de salida.
Las máquinas de vectores de soporte (SVM) son algoritmos de aprendizaje supervisados
que analizan datos para su clasificación y regresión.
Procesamiento del lenguaje natural (PNL): es un subcampo de la inteligencia artificial que
se ocupa de las interacciones entre las computadoras y el lenguaje humano, es decir, cómo
los programas informáticos procesan y analizan grandes cantidades de datos del lenguaje
natural.
Bolsa de palabras: Es una representación simplificada utilizada en el procesamiento del
lenguaje natural y la recuperación de información (RI). En este, un texto (oración o
documento) se representa como una bolsa (conjunto múltiple) de sus palabras, sin tener en
cuenta la gramática ni el orden de las palabras.
Un clasificador en aprendizaje automático: es un tipo de algoritmo de aprendizaje
automático que se utiliza para asignar los datos de entrada a una categoría específica, es
decir, asignar una etiqueta de clase a una entrada de datos.
Un modelo de clasificación intenta sacar alguna conclusión a partir de los valores de
entrada dados para el entrenamiento. Predecirá las etiquetas de clase y categorías para los
nuevos datos.
ImageNet es la colección de bases de datos visuales más grande diseñada para su uso en la
investigación de software de reconocimiento de objetos visuales con más de 14 millones de
imágenes anotadas a mano.
Se han explorado muchos modelos basados en IA y ML para ayudar en muchos niveles en
el diagnóstico de hongos. Esto incluye: (a) asistencia en el análisis de imágenes
microscópicas para una detección precisa; (b) asistencia en el análisis de portaobjetos
histopatológicos (c) asistencia con exploraciones de imágenes médicas (rayos X, resonancia
magnética, tomografía computarizada, etc.) y (d) otros. Discutiremos todos estos con
pruebas de concepto de estudios recientes.
Asistencia mediante análisis microscópico automatizado de imágenes El diagnóstico inicial
de infecciones fúngicas todavía se basa en el examen microscópico de hongos o estructuras
fúngicas. Sin embargo, en muchos casos, no permite una identificación inequívoca de la
especie debido a similitudes visuales. Es posible que se requieran pruebas bioquímicas o
enfoques moleculares adicionales, como PCR o secuenciación, lo que aumenta el costo y el
tiempo total. En el futuro, los sistemas de microscopía asistidos por IA estarán en la
primera línea del seguimiento e investigación de microorganismos. Zielinski et al. [ 236]
presentó un concepto novedoso de uso de redes neuronales profundas para clasificar
imágenes microscópicas de varias especies de hongos. El algoritmo de varios pasos se
utilizó para producir características de imagen sólidas utilizando DNN previamente
entrenado, agregarlas mediante el enfoque de bolsa de palabras y clasificarlas con SVM. El
enfoque fue capaz de identificar especies de apariencia morfológicamente similar (o
especies mal clasificadas, especialmente aquellas que pertenecen al género
Candida, Cryptococcus, y Saccharomyces) basado en parámetros visuales establecidos
entrenados para el clasificador, que incluían brillo, tamaño, forma, disposición, color,
cantidad, forma, etc. Tal enfoque definitivamente eliminaría la última etapa de la
identificación bioquímica, acortando así el proceso de identificación. en 2-3 días y acelerar
el siguiente curso de acción por parte del médico, ahorrando tiempo y mejorando la
atención al paciente. Por motivos similares, Lv et al. [ 237] desarrolló un sistema
inteligente basado en un algoritmo de aprendizaje profundo para diagnosticar
automáticamente la queratitis fúngica basándose en imágenes de microscopía confocal in
vivo (IVCM). El modelo incluyó 2088 imágenes IVCM en el conjunto de datos de
entrenamiento (que consta de imágenes con y sin hifas de hongos) y un total de 535
imágenes en el conjunto de datos de prueba. En el conjunto de datos de prueba, 515
imágenes se diagnosticaron correctamente y 20 se diagnosticaron erróneamente, lo que dio
una precisión del 96 % en la detección de hifas fúngicas. Estos algoritmos de aprendizaje
profundo tienen el potencial de cambiar el modo actual de diagnóstico de
enfermedades. Definitivamente es necesario probar estos modelos y evaluar su
aplicabilidad realizándolos en una base de datos más grande de muestras en estudios de
investigación multicéntricos.
Koo y colegas [ 238] desarrolló un modelo de aprendizaje profundo para la detección
automática de estructuras hifales con las ventajas de tener una técnica más rápida,
conveniente, consistente y automatizada. Para desarrollar este modelo de autodetección, el
equipo primero generó conjuntos de datos de entrenamiento utilizando videos grabados de
imágenes procesadas mediante tinción con KOH. Se generaron Dataset-100, Dataset-40 y
Dataset-all con las imágenes microscópicas capturadas de 100, 40 y 100 y 40,
respectivamente. El vídeo grabado se convirtió en imágenes cuadro por cuadro y se anotó la
ubicación de las hifas del hongo. Luego se entrenó la red YOLO-v4 (con un servidor de
aprendizaje profundo de unidad de procesamiento multigráfico) utilizando los conjuntos de
datos de entrenamiento, seguido de una evaluación de imágenes de diapositivas en
conjuntos de datos de validación y prueba. Para la detección e interpretación final, se
diseñaron dos enfoques: Clasificación de imágenes y determinación de objetos. Si la
imagen de microscopía contiene hifas, el sistema de clasificación de imágenes arroja un
resultado positivo; si no, devuelve un resultado negativo. En el enfoque de detección de
objetos, el sistema encuentra objetos similares a hifas y evalúa la similitud de los objetos
encontrados con conjuntos de datos entrenados previamente. El enfoque de detección de
objetos es más sofisticado y proporciona información detallada sobre la ubicación y el
tamaño del objeto presente con forma de hifa. La sensibilidad y especificidad generales en
el modelo de datos combinado (100 + 40) fue del 93,2 % y 89 %, respectivamente, lo que
indica que el modelo de hifas de autodetección de aprendizaje profundo era altamente
sensible y específico y que las hifas podían detectarse rápidamente con una precisión
confiable. Este enfoque puede resultar útil en el caso de lotes grandes de muestras
microscópicas para análisis. También,239 , 240 ]. La detección rutinaria con modelos
rápidos basados en IA puede ayudar al médico en el tratamiento temprano de este tipo de
infecciones de la piel que, de otro modo, llegarían fácilmente a capas más profundas
(debido a un sistema inmunológico debilitado), convirtiéndose eventualmente en una
IFI. En el futuro, los sistemas de microscopía asistidos por IA estarán en la primera línea
del seguimiento e investigación de microorganismos.
La asistencia mediante análisis histopatológico automatizado de muestras de tejido es una
herramienta de diagnóstico esencial. Sin embargo, la detección de hongos individuales en
portaobjetos para diagnosticar cepas de hongos puede llevar mucho tiempo a los patólogos,
y la sensibilidad siempre sigue siendo una preocupación. Se han desarrollado sistemas
asistidos por IA para ayudar en la detección rápida de portaobjetos de histopatología
[ 241 , 242].]. Las redes neuronales están compuestas por capas de unidades de
procesamiento llamadas neuronas que realizan cálculos matemáticos. Una CNN se utiliza
específicamente para el procesamiento de imágenes, pero requiere una gran cantidad de
datos para el entrenamiento, que no siempre está disponible, especialmente en el campo
médico. Por lo tanto, se ha informado que las redes de segmentación basadas en U-NET
(U-NET) se utilizan con éxito en histopatología digital. U-NET es una subcategoría de
CNN desarrollada específicamente para la segmentación de imágenes biomédicas con 23
capas convolucionales, y puede funcionar con menos imágenes de entrenamiento y producir
segmentaciones más precisas [ 243 ]. Al analizar secciones histológicas digitalizadas de
muestras de uñas humanas, Jansen et al. [ 242] desarrolló un modelo de segmentación
basado en U-NET para la detección precisa de oncomicosis. Para ello, el equipo utilizó un
total de 644 imágenes histológicas de portaobjetos completos (WSI) de cuatro laboratorios
diferentes, y estas fueron digitalizadas. Luego se anotaron manualmente los portaobjetos de
histología. Se desarrolló un modelo de aprendizaje automático basado en U-NET para
predecir la presencia de hongos para cada píxel en un WSI con segmentación de imágenes
para una localización precisa y se entrenó en los WSI anotados. El modelo pudo detectar el
90,5% de las WSI con los hongos y mostró un valor de sensibilidad del 93% y un valor de
especificidad del 77%. El resultado del modelo ML demostró una buena precisión del 86,49
%, lo que se correlaciona bien con la precisión media del 87,84 % lograda con los once
dermatopatólogos certificados.
Otros modelos de ML Además de lo anterior, se ha evaluado el uso de modelos basados en
redes neuronales artificiales para una detección directa precisa a partir de imágenes
humanas y conjuntos de datos. El hongo negro es un patógeno raro que ganó popularidad
durante la pandemia de COVID-19, ya que afectó a grandes sectores de poblaciones
inmunocomprometidas. Los mucormicetos del orden Mucorales, clase Zygomycetes, son
los responsables de la enfermedad fúngica. El moho mucormiceto ingresa por la boca, la
nariz o la piel quemada o dañada. Los hongos pueden propagarse fácilmente a los ojos, la
piel, los pulmones y el cerebro, provocando trombosis vascular que puede provocar
necrosis tisular [ 244 , 245 ]. Las tasas de mortalidad con afectación de los pulmones y el
cerebro son altas (más del 60%) [ 246]. De ahora en adelante, la detección temprana es la
clave del éxito. Trabajo reciente de Karthikeyan y colegas [ 247] se centró en desarrollar un
clasificador de redes neuronales híbrido basado en el aprendizaje (HLNNC) para la
identificación rápida del hongo negro. Primero, se creó un conjunto de datos personalizado
único utilizando imágenes tomadas de registros en tiempo real de pacientes con COVID, y
luego se agregó el hongo negro (junto con imágenes que incluían casos no
afectados). Utilizando el HLNNC, las muestras se entrenaron tanto en imágenes normales
como afectadas. El HLNNC identificó el hongo negro basándose en la adquisición de
imágenes, el preprocesamiento, la extracción de características y la clasificación o
categorización de imágenes en función de los contornos de un objeto, la intensidad de los
píxeles y la variación en las intensidades de los píxeles de la imagen, etc. El modelo de
aprendizaje híbrido propuesto ofreció el mayor índice de precisión de aproximadamente
99,5%, lo que recomienda su exploración futura para su uso en entornos clínicos.
Existe otro enfoque denominado Nariz Eléctrica (e-Nose) que se refiere a un dispositivo
sensor electrónico destinado a detectar olores o sabores utilizando conjuntos de sensores y
sistemas de reconocimiento de patrones. E-nose es un dispositivo en línea rápido, no
invasivo, compuesto por una serie de sensores de gas y un software de reconocimiento de
patrones apropiado [ 248 ]. Muchos hongos emiten compuestos volátiles que forman la base
para la detección olfativa y la identificación de estos organismos mediante la nariz
electrónica (e-nose) [ 249 ]. Al monitorear la resistencia de sensores de gas no específicos
expuestos al olor, una e-Nose puede detectar e incluso distinguir entre olores de dos
especies de hongos diferentes. Actualmente, la tecnología e-Nose se ha utilizado para
detectar Aspergillus spp [ 250 ],Aspergillus fumigatus y Candida
albicans [ 251 ], Fusarium y Rhizoctonia solani [ 248 ].
En un estudio de Borowik et al. [ 248 ], el equipo integró la tecnología e-Nose de bajo costo
con un modelo ML para la identificación de dos hongos patógenos, es decir, Fusarium
oxysporum y Rhizoctonia solan . Se diseñaron dos modelos de construcción de e-Nose
utilizando sensores de gas de óxido metálico. Se aplicó una colección de características que
caracterizan las formas de las curvas de respuesta en función de cómo respondían los
sensores a la presencia de olores. Finalmente, se distinguieron dos especies de hongos
examinadas mediante un modelo de clasificación de aprendizaje automático desarrollado y
entrenado mediante el método de regresión logística. En función de los olores volátiles que
emiten las especies de hongos, esta nariz electrónica integrada en varios modelos de ML se
puede utilizar para detectarlos e identificarlos.
Los estudios destacados en esta sección enfatizan el hecho de que la IA y los sistemas de
aprendizaje automático representan ayudas rápidas y útiles para que el médico o el
investigador determinen el método más eficaz para detectar el agente fúngico
involucrado. La IA, que consta de una serie de algoritmos, análisis, aprendizaje profundo y
redes neuronales, es un campo en constante expansión y, sin embargo, se requiere mucho
trabajo para entrenar los sistemas basados en IA a fin de mejorar la precisión de la
predicción.
Sin embargo, los modelos basados en ML adolecen de algunos inconvenientes
importantes. Por ejemplo, en ML, el algoritmo final se elige en función de resultados
precisos después de ejecutar los resultados en todos los algoritmos posibles. Durante el
entrenamiento final y las pruebas de grandes cantidades de datos, los errores son inevitables
y, en ocasiones, eliminarlos se convierte en una tarea casi tediosa para los expertos que
requiere mucho tiempo para resolverla. Además, elegir el algoritmo correcto es manual y,
en ocasiones, puede llevar más tiempo del esperado. Además de esto, las preocupaciones
éticas sobre la confianza en los algoritmos y los resultados también son un problema
importante. Dado que los algoritmos son desarrollados por humanos, están sujetos a sesgos
en cualquier nivel de desarrollo [ 252 , 253].]. Ningún médico puede confiar únicamente en
estos algoritmos porque los resultados de las evaluaciones de la IA son solo un posible
diagnóstico que debe ser verificado por la inteligencia humana.
Conclusión
La revisión nos ha permitido dar una idea de los avances y mejoras realizadas en las
herramientas de diagnóstico .es decir, los métodos no culturales, para hacer frente a la cara
cambiante del diagnóstico tanto en entornos ricos como limitados en recursos. El
diagnóstico oportuno de IFI es necesario para prevenir la alta morbilidad y mortalidad
asociadas con las infecciones fúngicas sistémicas, ya que el diagnóstico tardío siempre
equivale a un mal pronóstico. Esta razón es suficiente para que se realicen más estudios,
estandaricen las tecnologías ya desarrolladas y profundicen el conocimiento de
herramientas novedosas (como nuevos ensayos de PCR, nuevos ensayos rápidos de POC,
T2Candida, PCR/ESI–MS, modelos automáticos o de aprendizaje profundo, etc.). tanto
más necesario. Contamos con una gama de técnicas más nuevas que han surgido
recientemente y disfrutan de los beneficios de ser más sencillas de realizar, con un tiempo
de respuesta más corto y pueden aplicarse adecuadamente para la detección de rutina en
entornos de alta prevalencia, lo que resulta mejor para las pruebas POC. Por otro
lado, Contamos con ensayos más complejos y avanzados desarrollados que incorporan
sistemas multiplexados con alta precisión e índices de exactitud que podrían restringirse a
casos con pruebas POC positivas, teniendo en cuenta el costo y la sofisticación
involucrada. La creciente experiencia con ensayos de PCR para detectar hongos
directamente en muestras clínicas, los ensayos de PCR comerciales con rendimiento
mejorado y estudios de validación clínica de respaldo han permitido la inclusión de pruebas
moleculares en la segunda revisión de EORTC/MSGGERC para enfermedades fúngicas
invasivas. Sin embargo, para la incorporación y colocación de los nuevos ensayos
desarrollados en los algoritmos de diagnóstico se requieren más datos de validación en
cohortes de pacientes más grandes a través de estudios multicéntricos bien
diseñados. Además, estos nuevos enfoques deben combinarse con los ensayos
convencionales,