제 1 장 ㄴ 미 생 물 (Microorganism) 목적 이 실험의 목적은 미생물의 배양을 통해 염색법을 통한 미생 물 구조를 확인하고, 배양된 미생물을 이용하여 사용하고자 하 는 시료의 항균력을 확인하고자 한다. - 1 - 미생물은? 맨눈으로 관찰할 수 없는 작은 생물이며, 영어로 “Microorganism”이라고 하는데. “Micro“는 그리스어로 ”작다“라는 의미를 갖는다. 미생물에 대한 연구는 1673년 네덜란드 과학자인 안토니 반 레벤후크가 현미경을 발명하면서부터 본격적으로 시작되었다. 일반적으로 진균(Fungi), 원생동물(Protozoa), 세균(Bacteria), 바이러스(Virus), 조류(Algae)등을 포함한다. 미생물의 분류는 세포의 종류에 따라 원핵미생물, 진핵미생물, 비세포성 미생물(바이러스)로 분류할 수 있다. 1. 미생물의 배양 가. 미생물의 배양(Culture) 미생물을 배양(culture)한다는 것은 작은 시료를 그것들이 증식할 수 있는 양 양배지(medium)에 심는 것을 의미하며 배양을 위해 시료 채취와 접종에 쓰이는 도구들은 항상 무균적이어야 한다. 배양의 방법에는 단일 미생물 종을 배양하는 방법으로 한 가지 미생물을 관리할 수 있기 때문에 실험실 연구에서 흔히 사용하 는 방법인 순수배양과 아주 적은 양의 세포가 또 다른 배지 용기에 운반된 후 배 양되는 방법인 계대배양이 있으며 둘 이상의 동정된 미생물을 쉽게 구분할 수 있 는 종의 미생물을 한 배지에 담는 혼합배양이 있다. 본 교재에서는 실험실 연구에 서 흔히 사용하는 순수배양에 대해 논의할 예정이다. (1) 순수배양 분리배양에 이어서 또는 이전에 순수배양하여 얻어진 균을 더욱 증식하여 하 나의 균에서 증식된 균집락을 이용하기 위한 배양방법이다. 특히 생화학 시험을 하고자 할 때에는 순수배양이 되어 있지 않으면 혼합된 균에 의한 시험결과를 얻 게 되어 다른 결과를 얻게 된다. - 2 - (가) 도말 평판법 (Spread plate method) 한천배지를 부어 멸균된 페트리디쉬에 평판을 만들어 굳힌 다음 중앙에 소량 (약 100ul)의 미생물이 담긴 시료를 넣고 멸균된 유리막대로 고루 펼쳐서 군집된 미생물(colony)를 얻을 수 있는 방법이다. 또한 순수분리를 위해서 특정 콜로니를 분리배양 할 수 있다. (나) 주입 평판법 (Pour plate method) 미생물 시료를 희석시킨 후에 시료의 일부를 굳기 전의 고체배지 (45 ~ 47 oC) 에 혼합하여 평판 접시에 함께 부어 굳힘으로서 콜로니를 확인하는 방법인데 이 런 경우엔 배지의 표면과 안쪽에 콜로니가 생긴다. (다) 획선 평판법 (Streak plate method) 분리하고자 하는 미생물의 시료를 백금이에 묻혀 고체 평판 배지의 한쪽에서 부터 S자형으로 가볍게 그어 배지 전면에 회 선을 그어 콜로니를 확인하는 방법 이다. 획 선 시작 부위는 미생물의 수가 많지만 획 선 마지막 부분에서는 미생물 의 수가 1 ml 당 1~2개 되도록 하며 일반적으로 균을 분리 하는데 가장 널리 쓰 이는 방법이다. - 3 - 그림1. 도말 평판법 그림2. 주입 평판법 - 4 - 그림3. 획선 평판법 - 5 - 나. 미생물의 멸균 원하는 미생물의 접종 또는 배양을 위해서 사용되는 모든 물질 또는 물체에 다른 미생물이 존재하지 않도록 모든 생명체가 제거되었거나 죽은 상태를 의미한 다. 멸균은 미생물을 배양하기 위해 도말하거나 또는 채취를 할 때 필수적으로 거 쳐야 하는 과정이다. 멸균이란 물리적인 방법으로 미생물을 사멸시키는 것을 의미 하면 멸균법에는 다양한 종류가 있다. (1) 건열 (Dry heat) 건조한 상태에서 높은 온도를 유지시켜 세균을 제거하는 방법을 의미하며 건 열방법에는 건열멸균법과 화염멸균법이 있다. (가) 건열멸균법 (Dry heat sterilization) Dry oven에서 170 ~ 180 oC 의 고열로 60 ~ 90동안 멸균을 하는 것으로 시험 과, 플라스크, 페트리디쉬 등과 같은 유리기구의 멸균에 사용한다. 건열을 이용하 기 때문에 멸균 후에도 기구가 젖지 않는다. 습열 멸균 장치에 건조 기능이 있어 대신 이용하는 경우가 많다. (나) 화염멸균법 (Flaming sterilization) 알코올램프 또는 burner의 화염을 이용하여, 미생물을 화염으로 직접 태워 멸 균하는 방법이다. 대상은 백금이, 핀셋, 시험관 또는 삼각플라스크와 같은 용기의 입구 등에 이용하며 백금이의 경우 화염에 비스듬히 세워서 백금선 (또는 니크롬 선)이 빨갛게 달구어 질 때까지 한다. - 6 - 그림4. 화염멸균법 (2) 습열 (Moist heat) (가) 자비멸균법 (Sterilization by boiling) 완전한 멸균은 기대하지 못하지만, 가장 간편한 멸균방법중 하나이다. 병원체 는 일반적으로 62 ~ 65 oC로 30분간 끓이면 죽는데, 이와 같이 끓는 물속에서 살 균하는 방법이고 끓일 때 1%의 탄산나트륨 (Na2CO3)을 넣으면, 살균력이 증가되 며, 금속류에 녹이 스는 것(부식)을 억제해준다. (나) 저온살균법 (pasteurization) 열에 감수성이 큰 식품인 우유나 파괴되기 쉬운 식품에 포함된 미생물을 제거 하는데 사용하는 살균방법이다. 파스퇴르에 의해 고안된 멸균법으로 62 ~ 65oC에 서 30분간 또는 75oC에서 15분간 가온하여 영양가와 맛을 최대한 유지하며 아포 를 형성하지 않는 병원성 세균을 죽이는 방법. 결핵균, 살모넬라균, 소 유산균 등 의 감염방지를 목적으로 식제품 (특히 유제품)멸균에 사영되며 주류의 부패방지에 도 이용된다. - 7 - (다) 간헐멸균법 (Intermittent Sterilization) 100oC 이상에서 파괴되는 미생물을 멸균할 때 사용되는 방법이다. 100oC로 하 루에 한번 30분씩 연속 3회에 걸쳐 간헐적으로 멸균 하는 방법이고 시간이 많이 소요됨에 따라 불편하여 요즈음은 거의 사용하지 않는 방법이다. (3) 고압증기멸균법 (Steam sterilization) 고압증기 멸균기계 autoclave는 압축된 증기법으로 물품을 멸균하는 기계로서, 기기 안의 압력이 15 pound로 증가하면 250oF(oC)까지 상승한 상태에서 15~20분간 멸균하는 방법이다. autoclave에 의한 고열은 대부분의 세균을 즉시 사멸시키며 저항력이 강한 아포 형성 세균도 20분 내에 사멸을 한다. 각종 배지 및 의류, 각 종겁체, 실험 기구 등을 멸균하는데 사용하며 현재 가장 많이 사용되는 멸균방법 이다. (4) 가스멸균 (Gas sterilization) 멸균제를 가스 상태나 분무 상태로 분무시켜 미생물을 멸균 시키는 화학적 살 균방법으로 주사기나 고형재료, 기구, 장치, 식품 및 밀폐 공간 등에 존재하는 미 생물을 사멸시키는 방법이다. (가) Ethylene oxide (E.O gas) 액체상태의 살균제와 같이 작용은 신속하지 못하지만 광범위한 미생물에 대하 여 수용액 상태나 가스 상태에서도 살균작용을 한다. 열에 약한 제품 멸균 시 이 용하나, 피부손상이나 점막을 자극시킬 수 있다. (나) Propylene oxide (P.O gas) - 8 - 미생물에 대해 광범위한 살균력을 가지고 있으나, 세균 포자에 대해서는 살균 력이 약한다. 곰팡이, 효모, 무포자 세균 살균에 이용하며, E. O. gas 보다 살균력 은 약하나 잔류 독성은 적다. 60% 이상 고습에서 살균력이 크다. (다) Methyl bromide (M.B gas) 주로 살충제로서 광범위하게 이용하며, 살균력은 E.O gas의 1/10이다. 공기보 다 3배 무겁고, 눈을 강하게 자극하고, 호흡장애를 유발시킨다. 포박한계가 좁아 발화가 쉽다. (5) 여과멸균 (Filter sterilization) 박막 여과 장치를 이용하는 방법으로, 열에 의해 파괴될 수 있는 효소 제제나, 이열성 화학물질, 배지 등에 사용하는 방법이다. 여과지는 hamberland filter, Berkefeld filter, Seitz filter가 있으며, 최근에는 Millipore filter를 많이 사용한다, 크기는 보통 0.2~0.5㎛이다. 필요에 따라 선택하여 사용하며 초 여과법으로 바이 러스까지도 걸러낼 수 있다. 그림5. 여과멸균 - 9 - (6) 자외선 살균법 (Ultraviolet, UV) 자외선 살균법은 각 전자파가 미생물에 미치는 장해작용은 비슷하여 흡수된 세포내에서 높은 에너지는 방출해 이온화되어 멸균효과가 나타난다. (가) 자외선 조사 멸균 자외선으로 멸균하는 방법이고 아포에는 효과가 약하다. 가장효과적인 파장은 260~280nm를 이용하는 것이다. 침투성이 약한 것이 결점이다.(직접 닿는 부분만 멸균된다.) 주로 밀폐된 공간의 멸균에 이용된다. (나) X-ray 조사 멸균 물질에 대하여 침투력이 매우 강하나 에너지가 요구되며, 비경제적이고 발암 작용 등이 있으므로 주의가 필요하다. (다) Nutrions(중성자) 조사 멸균 살균력이 매우 강하나 값이 비싸고 취급이 위험하다는 문제점이 있다. (라) Cathod(음극선) 조사 멸균 식품, 공업 상품의 표면에 부착된 미생물 살균에 이용된다. 침투력이 제한되어 이용도가 낮다. (7) 소각 멸균법 병원체를 불꽃에 태워버리는 방법으로 안전한 방법이며 수술한 적출물, 법정 전염병으로 죽은 가축이나 전염병으로 인해 오염된 물품도 처리할 수 있는 방법 이다. - 10 - 2. 미생물의 구조 가. 원핵 미생물 (원핵 세포)의 구조와 기능 (1) 일반적인 특징 원핵미생물이란? 원핵미생물은 진핵미생물에 비해 단순한 구조이며, 형태가 원시적인 미생물을 말한다. 우선 핵과 세포기관이 없고, 유전물질이 핵막에 둘러 싸여 있지 않고 세포질의 핵양체 (원핵세포가 가지고 있는 핵의 구조, DNA가 단 백질과 RNA와 함께 존재)에 위치해 있다. 보통 하나의 환성 (circular)의 DNA 분 자이다. 세균과 원핵조류가 여기에 속하며. 세균 같은 원핵생물은 막으로 둘러싸 인 핵이나 막으로 둘러싸인 세포소기관들이 없다. 세포의 외부는 보통 글리코카릭 스(glycocalyx), 편모(flagellum), 핌브리아 (fimbriae)와 선모(pili)를 가지고 있다. 이 러한 원핵미생물은 크기, 모양, 배열에 따라 구균, 간균, 나선균, 휘어진 간균, 극 미세세균 등으로 나눌 수 있다. 그림6. 원핵 미생물의 기본 구조 - 11 - 그림7. 원핵세포 (a) 포도상구균, (b) 연쇄상구균, (c) 간균, (d) 나선균, (e) 휘어진 간균 - 12 - (2) 세포막 세포막은 모든 세포가 가지고 있는 구성요소이며, 세포 내부와 외부를 서로 구분해준다. 세포막은 인지질 및 단백질 분자로 구성된 얇고 구조적인 인지질 이 중층으로 되어 있으며, 선택적인 투과성을 지닌다. 세포막에는 외재성 (peripheral) 단백질과 막내재성 (integral protein)이 존재한다. 이외에도 다른 기능을 수행하는 단백질들도 존재하며, 이러한 단백질은 세포 기능 및 조직 구성을 항시 일정하게 유지하는 데 매우 중용한 역할을 담당한다. 동물세포에서, 세포막은 이러한 역할 을 홀로 수행하는 반면 표모, 세균, 식물에서는 세포벽이 최외각 경계를 형성하 며, 형태를 유지는 물리적인 방호력을 제공한다. 세포막은 대략 10nm 두께이며, 투과 전자 현미경으로 희미하게 구분할 수 있다. 세포막의 또 다른 중요한 역할은 세포전위를 유지하는 것이다. (3) 세포질 세포질은 세포막과 핵양체 사이의 물질로 대부분 물로 구성되어 있으며, 봉입 체(inclusion body), 액포(vacuole), 리보솜(ribosome)등을 함유하고 있다. 봉입체 (inclusion body)는 물질저장을 통해 세포의 영양 상태에 따라 수가 변화한다. 액포 (vacuole)는 내부 공기주머니로 부력제공 및 미생물이 이동하는 것을 조절한다. 리 보솜(ribosome)운 단백질과 RNA의 복합체로서 세포질 속에서 단백질을 합성하는 역할을 한다. 원핵 미생물의 경우 70S 리보솜이며 진핵 미생물의 경우엔 80S 리보 솜이다. (4) 핵양체 (Nucleoid)와 플라스미드 핵양체(Nucleoid)는 유전물질인 DNA를 보관하는 장소로 불규칙한 모양을 지니 고 있다. 이러한 핵양체는 일반적으로 세포막엔 연결되어 있으며 세포 분열 시 막 의 역할을 하여 DNA를 분리한다. 플라스미드(plasmid)는 세균의 세포 내에 복제되 어 독자적으로 증식할 수 있는 염색체 이외의 환형 이중 나선 DNA 분자를 총칭 하는 말로, 1952년 조슈아 레더버그 박사가 처음 제안한 말이다. 모양은 고리모양 - 13 - 을 띠고 있다. 플라스미드는 세균의 생존에 필수적이지는 않으며, 다른 종의 세포 내에도 전달될 수 있다. 이런 성질을 이용해 유전공학에서는 세균 내 플라스미드 를 세포 밖으로 빼내고 제한효소로 자른 뒤 필요로 하는 유전자를 삽입하여 이를 다시 세균에 넣어 배양하는 유전자 재조합 기술을 사용한다. 그림8. 핵양체 (a) 분열중의 핵양체, (b) E. coli의 핵양체, (c) 분열중인 E. coli 핵양체 모형 (5) 세포벽 원핵세포의 세포벽은 원형질막의 외부에 위하며 세포를 구조적으로 단단하게 지지하여 형태를 이루게 한다. 또한 세포벽은 외부환경으로부터 세포를 보호한다. 세포는 영양성분을 함유한 액상의 세포내 구성성분으로부터 압력을 받게 된다. 이 때 세포벽은 마치 풍선이 팽창될 때의 압력을 풍선외벽이 지지하는 것과 똑 같은 - 14 - 방식으로 세포내부의 압력을 지지한다. 만약 세포 내의 압력이 너무 크면 세포는 터지게 되는데, 이를 용군 (lysis)이라고 한다. 세포벽의 주성분은 peptidoglycan이 며, peptidoglycan의 구조는 다당류의 짧은 펩티드 고리가 결합한 화합물이다. 그림9. Peptidoglycan 구조 모형 (6) 세포외부 구성요소 (가) 협막 (Capsule) 협막(capsule)은 일부 원핵 미생물의 세포벽 바깥에 나타나는 굉장히 큰 구조 를 가지고 있다. 협막은 단단히 짜여진 층으로서, 쉽게 씻겨나가지 않으며, 여러 질병의 원인이 되기도 한다. 이러한 협막은 숙주식세포의 식균작용으로부터 보호 하는 기능과, 물 분자를 포함하고 있어 건조방지를 하는 기능이 있다. 또한 소수 성 독성물질로부터 침투방지도 한다. - 15 - (나) 글리코카릭스(glycocalyx) 글리코카릭스(glycocalyx)는 폴리펩티드나 다당류로 구성된 세포를 둘러싸고 있는 끈끈한 (sticky) 당질의 외피이다. 글리코카릭스는 하나 혹은 두 가지 상태로 발견된다. 세포의 표면 에 단단히 부착되어 있는 것을 캡슐(capsule)이라고 하며, 느슨하게 부착되어 있는 것을 점질층(slime layer)이라고 한다. 점질층은 물에 용 해되며 원핵세포들이 세포외부의 표면에 부착되는데 이용된다. 글리코카릭스는 원핵세포가 여러분 몸의 면역체계로부터 공격당할 때 대항하기 위해 사용된다. 이의 예로서 충치균의 일종인 Streptococcus mutants를 들 수 있 는데 이 세균은 치아에서 집락을 형성하여 산을 분비함으로써 치아를 부식시킨다. 정상적으로는 여러분 몸의 면역체계가 이 세균을 둘러싸서 결국은 죽이지만, Streptococcus mutants의 경우는 이와 같은 일이 일어나지 않는다. 이 세균은 글 리코카릭스 캡슐(glycpcalyx capsule)로 둘러싸여있는데, 이는 여러분의 몸의 면역 체계가 Streptococcus mutants를 외부에서 유래된 미생물로 인식하는 것을 막아준 다. 이 결과로 나타나는 것이 충치(cavity)이다 (다) Slime layer 슬림 레이어는 넓게 퍼져 있으며 특정구조는 없고 쉽게 제거가 가능하다. (a) - 16 - (b) (c) 그림10. 원핵세포의 mcapsule, glycocalyx 구조. (a) 염색된 capsule (Klebsiella pneumoniae), (b) Bacteroides의 glycocalyx, (c) 내장벽에 연결된 세균의 glycocalyx (라) 편모(flagellum) 편모는 단백질로 구성되어 있으며, 모양은 긴 꼬리모양으로 보인다. 이것들은 원핵세포들이 운동성을 갖는데 사용된다. 편모는 미생물들이 위험한 곳으로부터 멀어지고 먹이가 있는 방향으로 움직일 수 있도록 추진력을 가지게 하는 데 이를 주성이라고 한다. 운동성은 빛이나 화학적 자극에 반응하여 일어나며, 빛의 자극 에 의해 일어나는 운동성을 주광성이라고 하고, 화학적 자극은 주화성이 일어나게 한다. - 17 - 표1. 편모의 형태들 형태 단편모 (monotrichhous) 속편모 (lophotrichous) 양극성편모 (amphitrichous) 주편모 (peritrichous) 내편모 (endoflagellum) 구성 한 개의 편모 세포의 한쪽 끝에 있는 2개 혹은 다수의 편모 세포의 양쪽 끝에 있는 편모 전 세포를 둘러싸고 있는 편모 스피로헤타 (spirochete) 주위를 단단하게 감싸고 있는 양극성 편모의 한 형태 (마) 핌브리아 (fimbriae) 핌브리아(fimbreae)는 단백질이며, 점액성이고, 억센 털(bristle-like) 모양으로 뻗어 나와 있는데 세포가 서로 간에 혹은 세포를 둘러싸고 있는 어떤 물체에 부 착될 때 사용된다. 임질균(Neisseria gonorrhoeae)은 임질을 일으키는 세균으로서 몸에 부착하여 세균 세포의 군집을 만들 때 핌브리아를 사용한다 (바) 선모(pili) 선모(pili)는 항공기의 연료 튜브처럼 하나의 세포에서 다른 세포로 DNA를 운 반할 때 사용된다. 때로는 세포끼리 서로 부착될 때도 사용된다. 이 관(tubule)은 단백질로 되어 있으며 편모보다는 길이가 짧고 핌브리아보다는 길다. - 18 - 나. 진핵 미생물 (진핵 세포)의 구조와 기능 (1) 일반적인 특징 진핵 미생물은 보다 복잡한 구조를 가진 진화된 미생물을 말한다. 뚜렷한 핵 막과 세포기관을 갖고 있으며, 모든 동식물의 세포는 진핵 미생물이며, 조류 (원 핵조류 제외), 균류, 원생동물 등의 고등 미생물이 여기에 속한다. 세포소기관 중 미토콘드리아나 엽록체는 과거 진화 과정에서 외부의 원핵세포들이 세포내 공생 체로 도입된 경우로 생각되며, 그 외의 소기관들도 각각 특정한 업무를 수행하도 록 분화되어 있다. 원핵세포의 DNA와는 달리, 진핵세포의 DNA에는 필요 없는 부 분(인트론)이 대단히 많이 존재하며, 따라서 필요한 부분(엑손)을 이어서 mRNA를 만들게 된다. 또한 리보솜은 원핵세포보다 큰 80S이다. 진핵생물은 단계통군으로 나타나며, 3개의 생물 도메인 중의 하나를 구성한다. 나머지 2개의 도메인은 세균 과 고세균으로써 원핵생물로 불리며 이상과 같은 특징을 갖고 있지 않다. 진핵생 물은 모든 생명체 중에서는 일종의 소수이다. 심지어 인체에는 사람의 세포수보다 10배나 많은 미생물이 들어 있다. 그림11. 진핵 미생물의 기본 구조 - 19 - (2) 세포질, 미세섬유, 미세소관 (가) 세포질 (Cytoplasm) 세포질(cytoplasm)은 세포 내부를 채우고 있는 균일하고, 일반적으로는 투명한 점액 형태의 물질이다. 세포질은 세포핵을 제외한 세포액과 세포소기관으로 이루 어진다. 세포액은 수분, 염분, 세포소기관을 이루는 분자, 그리고 반응 촉매로 작 용하는 효소로 구성된다. pH는 6.8에서 7.1 사이이다. (나) 미세섬유 (Microfilament) 미세섬유(microfilament)란 세포내에 있고, 세포의 형태를 유지하거나 형태를 변화시키거나 세포내의 물질 이동을 담당하고 있는 세포골격을 구성하는 섬유 중 하나다. 단백질인 액틴이 섬유장에 중합해서 할 수 있는 집합체로, 섬유장 액틴(F 액틴)으로 불리는 고분자가 주된 구성 성분이다. 그리하여 미세섬유는 종종 액틴 섬유로 불리기도 하지만, 액틴만으로 구성된 섬유 구조는 아니기 때문에, 액틴 섬 유라고 말할 때는 주의가 필요하다. 미세섬유를 구성하는 액틴은 줄기에 포함되는 α액틴과는 형태가 다른 β액틴이다. 외경은 6nm정도 된다. 이중 나사 구조로 되 어 있어 액틴 분자 13.5개, 35nm로 정확히 한 번 비틀 수 있다. 미세섬유는 전자 현미경에 의해 직접 관찰하는 것 외에 액틴과 결합하는 성질을 가진 팔로이딘이 라고 하는 분자를 이용해서 관찰할 수 있다. 로다민 등의 형광색소를 결합시킨 팔 로이딘을 액틴에 작용해 액틴 섬유를 염색하여 형광 현미경에서 관찰할 수 있다. (다) 미세소관 (Microtubule) 진핵세포의 세포골격을 구성하는 세포 구조의 하나이다. 미세소관은 튜불린 단백질의 이합체가 지름 25 나노미터의 원통 모양으로 이루어진 구조이다. 미세소 관에는 방향성이 있어서 튜불린이 붙기 쉬운 쪽을 +쪽으로 두고, 해리되기 쉬운 쪽을 -로 둔다. 속도는 유리 튜불린의 농도로 결정되며 고농도에서는 어느 곳에서 도 붙기 쉬워지고 저농도에서는 해리되기 쉬워진다. 미세소관은 세포에 운동성을 - 20 - 그림12. 포유류세포의 미세섬유 제공한다. 대표적으로 편모와 섬모는 미세소관으로 구성되어 있으며 세포의 운동 을 담당하는 세포 기관이다. 그 외에도 미세소관은 세포내 수송을 담당하며, 미토 콘드리아나 소포와 같은 세포소기관을 운반하며, 식물에서는 세포벽의 합성에도 관여한다. 그림13. 포유류세포의 미세소관 (라) 중간섬유 (Intermediate filament) 세포골격 단백질의 한 집단으로 구성된 구조로 이루어져 있다. 중간섬유는 액 틴(미세섬유)와 미세소관의 중간 정도의 크기(약 10nm)다. 중간 섬유의 대부분의 - 21 - 형태는 핵막과 세포막 사이에 있는 세포질 기질에 위치해 있다. 핵 라민은 세포핵 에 위치해 있다. 단백질 이합체가 두 개씩 모여 긴 가닥을 이루고, 다시 여러 가 닥이 길게 꼬여있는 구조다. 세포질 내의 지지대로 작용해서 3개의 섬유 세포중 가장 녹기 어렵고 세포의 모양을 잘 유지해준다. 중간섬유는 각질섬유, 뉴로섬유, 데스민, 비멘틴, (GFAP)등이 있다. 세포의 종류에 따라서 각각 다른 중간섬유를 가지게 된다. 즉 세포 특이성이 있다. (3) 소포체 (Endoplasmic reticulum, ER) 소포체(endoplamic reticulum)은 모든 진핵세포에서 발견되는 세포소기관의 하 나로 소포세관(tubule), 소포(vesicle), 시스터나(cisterna)가 그물모양으로 이루어져 있다. 소포체는 단백질을 만들어서 세포 곳곳에 전달한다.(원핵세포는 세포소기관 을 가지고 있지 않으며, 따라서 소포체 역시 가지고 있지 않다.) 소포체의 기본 구조 및 구성은 비록 핵막의 연장(내막계(Endomembrane System))이지만 일반적인 세포막과 비슷하다. 소포체는 세포막의 일부가 될 단백질(막횡단 수용체 나 막내 부 단백질)을 비롯하여 세포 밖으로 분비될 단백질(즉 소화 효소, 칼슘 흡착, 글리 코겐과 스테로이드 또는 고분자물질의 합성/저장)의 합성, 단백질 2차 구조 형성, 수송이 이루어지는 곳이다. 근육에서의 소포체는 근소포체(sarcoplasmic reticulum) 로 불린다. (가) 조면소포체 조면소포체는 세포막, 세포소기관에서 사용될 단백질 및 세포 밖으로 분비될 단백질을 합성하고 운반한다. 해당 단백질에 대한 mRNA의 번역은 조면소포체에 붙은 리보솜에서 이루어진다. 단백질이 합성되고 잠시 뒤, 대부분의 단백질은 소 포를 통해 골지체로 이동한다. 조면소포체는 골지체와 협력하여 단백질의 표적을 정하여 단백질이 제자리에 갈 수 있도록 한다. (나) 활면소포체 - 22 - 활면소포체는 핵막과 연결되어 있으며 세포형태에 따라 다양한 물질대사 기능 을 수행한다. 세포막의 인지질을 포함한 여러 지질 및 지방산, 호르몬 등의 스테 로이드의 합성에 관여하며, 또한 탄수화물 대사, 세포 독성의 해독, 칼슘 저장 등 에도 중요한 역할을 수행한다. 스테로이드 호르몬을 생산하는 세포, 해독을 수행 하는 간 세포, 근육세포(신호전달물질로서의 칼슘이온 저장소)에서 활면소포체가 잘 발달해있다. 또한 세포 내부에서 영양 분자를 수송하는 일도 담당한다./ 활면 소포체는 표면적이 넓게 확장되어 있기 때문에 중요한 효소와 그 산물의 저장과 기능을 촉진시킬 수 있다. (다) 근소포체 근소포체는 근육 세포 중 가로무늬근(횡문근)에 존재하며, 근수축 과정에서 칼 슘 이온의 저장 및 방출에 특수화되어 사용된다. 방출 과정은 전압 개폐 칼슘 통 로에 의해 이루어지며, 저장은 근소포체로 퍼내는 Ca ATPase에 의해 이루어진다. 실 모양의 근육에서, 근소포체는 근원섬유를 둘러싸고 있다. (4) 골지체 (Golgi body, Golgi appartus) 식물, 동물, 균류 등의 대부분의 진핵세포에서 발견되는 세포소기관이다. 골 지장치의 이름은 이를 1898년에 처음으로 발견한 이탈리아 해부학자 카밀로 골지 (Camillo Golgi)의 이름을 따서 명명된 것이다. 골지장치의 주요한 기능은 세포막, 리소좀, 엔도좀으로 향할 단백질을 처리하며, 소포에 정렬하는 것이다. 그러므로 세포의 중추 전달 체계라고도 할 수 있다. 조면소포체를 떠나는 대부분의 전송 소 포는 골지장치로 전달되어서, 수정, 정렬, 최종 목적지로의 운반이 수행되게 된다. 골지장치는 대부분의 진핵세포에 존재하지만, 분비될 물질이 많은 곳에서 더더욱 역할이 중요해진다. 골지체는 지질 및 단백질 등을 받아들이고, 또한 적절한 위치 로 내보내는 역할을 수행한다. 골지체에서 세포막의 합성을 진행하여 수송 후 리 소좀 생성에 필요한 단백질을 수송하기도 한다. - 23 - 그림14. 진핵세포 골지체와 물질수송 (5) 리소좀 (Lysosome) 리소좀(Lysosome)은 단백질 분해 효소가 들어있는 세포 내의 작은 주머니이 다. 일반적으로 오래되어서 못 쓰게 된 세포소기관을 파괴하거나 외부에서 탐식작 용을 통해 먹어 치운 바이러스나 박테리아 같은 외부 물질, 음식물 조각들을 파괴 하는 데에 사용된다. 일반적으로 리소좀 내부는 상당히 낮은 pH 조건을 유지하고 있다. 1955년 드 뒤브 등은 쥐의 간세포 파쇄액을 원심 분리하자 미토콘드리아보 다 약간 가볍고, 마이크로좀보다 약간 무거운 미소 과립을 얻을 수 있다는 것을 발견했다. 그들은 이 과립을 리소좀이라고 불렀다. 리소좀에는 여러 종류의 산성 가수분해 효소(산성 포스파타아제·산성 리보뉴클레아제 따위)가 들어 있다. 리소 좀은 전자 현미경으로 보면 한 겹의 막으로 싸인, 지름 0.5μm 정도의 공모양이 다. 리소좀은 0.1~1.2μm까지 다양한 크기를 가지고 있다. 리소좀과 유사한 구조 를 가진 것으로 마이크로바디라는 과립이 있다. 이 소체는 과밀화 효소를 함유하 고 있기 때문에 파오키시좀이라고도 한다. 따라서 리소좀을 전자 현미경적으로 고 정하려면 산성 포스파타아제의 활성이 있고, 더욱이 한 겹의 외막을 가진 것을 확 인하면 된다. 왜냐하면 리소좀을 함유하는 모든 효소를 세포 화학적으로 검출하기 - 24 - 는 매우 어렵기 때문이다. 리소좀은 동물의 여러 가지 세포에 널리 분포하지만 식 물 세포에서는 아직 확실하지 않다. 리소좀은 식세포나 백혈구 등 식작용이 활발 한 세포에 많이 있다. 리소좀의 기능은 약산성 (pH 3.5 - 5.0)하에서 소화에 관계 하며 식세포작용 (phagocytosis)와 음세포작용 (pinocytosis)을 한다. 리소좀이 가지 고 있는 주요 효소들에는 지질을 분해하는 라이페이스, 아밀로오스, 전분, 그리고 말토덱스트린을 분해하는 아밀라아제, 단백질을 분해하는 프로테아제, 핵산을 분 해하는 뉴클레아제가 있다. 리소좀의 효소들은 조면소포체에서 합성되고 리소좀으 로 가라는 만노오스-6-인산 꼬리표를 골지체에서 단다. 일탈적인 리소좀의 표적화 는 효소가 리소좀에게 도달하지 못하게 한다. 따라서 세포기관에는 불필요한 물질 들이 축적된다. 그림15. lysosome의 형성과 물질분해 - 25 - (6) 리보솜 (Ribosome) 리보솜은 지름이 약 20 nm(200 Å)이고 65%의 리보솜 RNA와 35%의 리보솜 단백질로 구성되어 있다. 고세균, 진정세균 및 진핵생물의 리보솜은 서로 다른 다 양한 단백질과 RNA로 구성되어 있다. 리보솜은 전령 RNA의 코돈을 번역하여 운 반 RNA에 연결된 아미노산을 배열하여 단백질을 형성한다. 리보솜은 또한 효소로 서 작용하기도 하는데 이 때문에 리보자임이라 불리기도 한다. 리보솜은 별도의 막이 없는 세포소기관이다. 단백질을 형성하지 않는 동안 RNA는 내부 원형질인 시토졸에 존재한다. 리보자임으로 작용할 때에는 RNA로부터 구성되는데, 이는 RNA 세계의 흔적으로 추정된다. 리보좀은 1950년대 중반 루마니아 생물학자인 게 오르그 에밀 팔라데에 의해 최초로 관찰되었다. 팔라데는 전자현미경을 이용하여 세포를 관찰하던 중 리보솜을 발견하였고, 이 공로로 1974년 노벨 생리학·의학상 을 수상하였다. 리보솜이라는 이름은 1958년 리처드 B. 로버트가 명명하였다. 리 보솜은 60S와 40S로 이루어진 80S 구조로 이루어져 있으며 RER이나 세포질에 존 재하여 단백질을 합성한다. 그림16. 리보솜 - 26 - (7) 미토콘드리아 (Mitochondria) 미토콘드리아 (mitochondria)는 유기물질에 저장된 에너지를 산화적 인산화 과 정을 통하여 생명활동에 필요한 아데노신삼인산(ATP)의 형태로 변환하기 때문에 미토콘드리아는 세포의 발전소라고 할 수 있다. 보통 미토콘드리아는 세포의 25% 의 세포질을 차지하고 있으나 그 크기와 수가 세포의 종류와 역할에 따라 다양하 다. 자체적인 DNA(mtDNA:mitochondirial DNA)를 가지고 있다. 자체적인 DNA의 존재와 이중막 구조 및 리보솜을 가지고 있어 자체단백질을 합성한다. 미토콘드리 아의 이중막 구조는 전자전달 및 산화적 인산화를 담당하는 내막과 TCA회로와 지방산 산화를 담당하는 외막으로 구성되어 있다. 그림17. 미토콘드리아 (8) 핵 (Nucleus) 진핵생물에서 발견할 수 있는 세포 내의 세포 기관 중 하나로, 히스톤 단백질 과 같이 염색체를 구성하는 다양한 단백질 복합체로 된 긴 선형의 DNA로 된 유 전자중 대부분의 정보를 담고 있다. 핵은 유전자가 변형되지 않게 유지하고 유전 자 발현을 조절함으로써 세포의 활성을 조절하는 역할을 하며 세포 분열과 유전 에 관여한다. 공 모양이거나 타원 모양인 경우가 많다. 크기는 지름이 수μ에서 - 27 - 20~30μ 정도가 보통이다. 전자 현미경에 의한 관찰에서 핵은 안팎 2층으로 이루 어진 핵막으로 둘러싸여 있고, 여기에 핵공이라는 다수의 구멍이 있는 것으로 알 려져 있다. 대부분의 분자들은 핵막을 통과할 수 없고 작은 분자들이나 이온은 핵 공을 통해 이동한다. 단백질과 같은 큰 분자들의 경우 운반체 단백질에 의해 조절 되는 능동수송으로 이동한다. 또, 핵막의 바깥쪽 막은 그 일부가 세포질 쪽으로 튀어나와 소포체의 막과 연결되어 있어서, 핵과 소포체를 잇는 구조로서 주목되고 있다. 핵 속에는 핵액과 핵소체, 염색사가 들어 있다. 핵소체는 그 주성분이 단백 질과 RNA로서, 리보솜을 만드는 리보솜 RNA를 생성하는 장소로 알려져 있다. 염 색사는 실 모양을 하고 있으며, 핵 내부에 고르게 분포되어 있다. 그러나 핵분열 을 시작하면, 이것이 꼬이면서 응축되고 굵어져서 생물의 종류에 따라 특수한 모 양과 일정한 추의 염색체가 되므로, 광학 현미경으로 똑똑히 관찰할 수 있는 상태 가 된다. 핵은 핵분열 때의 염색체 활동에 의해, 유전정보를 원래의 세포에서 새 로 생기는 세포에 전하는 활동을 하지만, 정지핵 상태에서도 유전자의 본체인 DNA(디옥시리보핵산)를 바탕으로 유전정보의 발현에 관여하고 있다. 즉 DNA가 가진 유전 정보가 그 DNA의 구조에 따라 만들어지는 RNA에 전달되고, 이 RNA 가 다시 활동하여 유전 정보에 맞는 단백질이 만들어지는데, 이와 같은 단백질 합 성 과정의 설명은 근대 유전학에 있어서의 큰 성과이다. 그림18. 핵 - 28 - 표2. 원핵 미생물과 진핵 미생물의 비교 특징 원핵 미생물 진핵 미생물 1. 핵 구조와 기능 핵막 없음 있음 인 없음 있음 하나의 분자: 여럿 또는 많은 염색체로 DNA histone과 연결 안됨 존재. Histone과 복잡 분열 무사분열 유사분열 정상과정:감수분열;염색체 유성생식 절단과정:감수분열 없음 의 보충 2. 세포질 구조와 구성 원형질막 보통 sterol이 없음 보통 sterol이 있음 내부막 비교적 간단 복잡:소포체, 골지체 리보솜 70S 80S (미토콘드리아 70S) 세포내 소기관 없음 액포, 리소좀, 등 호흡계 원형질막 부분 미토콘드리아 일반적으로 작으며, 보통 큼, 2 ~ 100 um 크기 보통 2 um 직경보다 직경 작음 - 29 - 다. 비세포성 미생물 (바이러스)의 구조와 기능 (1) 일반적인 특징 바이러스는 다른 종류의 미생물과 달리, 세포가 아니며, 세포막도 없다. 유전 물질과 단백질 껍질만으로 이루어져 있다. 세균보다 수백 배 이상 작아서 거름종 이를 통과할 정도다. 한자 표현은 거름종이를 통과하는 특성에서 딴 여과성 병독. 일종의 단세포 생물로 기능하는 세균보다도 더 구조가 간단하다. 흔히 생물과 무 생물의 중간에 있다고 하며 반생물이라고 부르기도 한다. 현미경과 함께 17세기 중반 존재가 알려지기 시작한 초현미경적 생물이며 여과성 병원체이다. 크기는 0.01~0.2μm정도이며 세균과는 달리 너무 작아서 19세기 말에 와서야 작아서 보 이지 않는 무언가가 병을 일으킨다는 것을 알았으며, 20세기 들어 전자현미경이 개발된 뒤에야 드디어 모습을 볼 수 있었다. 프리온이 발견되기 전까지 인간이 파 악하고 있는 병원체 가운데 구조가 가장 간단한 병원체였다. 바이러스는 크기도 작고 빠른 속도로 변화할 뿐만 아니라 살아있는 세포를 통해서만 번식하므로 일 반적인 배지에서 배양할 수 없는 등의 문제가 있어서 상대적으로 연구하기 어렵 다. 그러나 바이러스는 분자생물학 실험에서 없어서는 안되는 중요한 도구이다. 유전정보가 단순한 까닭에 조작하기 쉽고 효과가 높아 많이 쓰이고 있다. (2) 구성 구성은 핵산과 단백질로 구성되어 있으며, 핵산은 DNA와 RNA중 어느 한 가 지만 가지고 있다. 유전자 정보가 담긴 물질을 단백질 껍질이 둘러싼 간단한 구조 며, 스스로는 번식을 못 하는 분자 덩어리일 뿐이지만 숙주 세포에 침투하면 숙주 의 효소와 세포기관들을 이용해서 자신의 유전 정보를 복제하며 급속히 번식한다. 기생하지 않을 때는 생물체의 기능을 전혀 하지 않고, 결정 상태로 추출할 수도 있다. 바이러스는 생물과 비생물의 중간형이다. 생물적 특징으로는 활물기생, 자 기복제, 돌연변이 등을 들 수 있고, 비생물적 특징으로는 조절물질(효소)가 없다는 점, 공기중에 나오면 단백질 결정으로 추출이 가능한 점, 세포 구조물이 없다는 - 30 - 점 등을 들 수 있다. 그림19. 바이러스 구조 (a) 단백질이 핵산을 감싸지 않은 형태, (b) 단백질이 핵산을 감싸고 있는 형태 - 31 - 3. 미생물 염색법 미생물 염색법이란? 미생물을 관찰하는 것은 미생물이 작고 수용액 상의 배지에 있을 때 거의 투명하기 때문에 매우 어려운 점이 많다. 따라서 염색을 통해 세균의 동정과 분류의 지표인 그람 양성균과 음성균을 구분하고 분별염색의 원리와 조작법을 습득, 단순염색을 통해 세균의 형태, 크기 및 배열상태를 관찰할 수 있다. 미생물 염 색에는 단순염색 (simple staining)과 분별 염색 (Differential staining) 방법 등이 있으 며 실제 실험에서는 분별 염색을 많이 사용한다. 미생물 염색에 사용되는 염료는 대부분 벤젠(benzene) 유도체인 합성 아닐린계 (aniline) 염료로, 염색시약은 색깔이 있는 이온인 발색단(chromophore)과 발색단의 전 하를 중화시키기 위한 counter ion으로 구성되어 있다. 예를 들면 메틸렌 블루 (methylene blue)는 Methylene blue chloride ⇌ Methylene blue+ + Cl로 해리되며, methylene blue+가 색깔을 띠는 발색단이다. 염료의 발색단 부분이 세포의 단백질이나 핵산 같은 거대분자와 결합하여 세포 성 분이 착색된다. 세포의 성분이 착색되면 대비력이 높아지므로 현미경으로 쉽게 관찰 할 수 있다. 가. 염료 및 염색의 종류 (1) 염료의 종류 염료는 발색단의 전하에 따라 염기성 염료(basic dye, cationic dye), 산성 염료 (acidic dye, anionic dye), 중성 염료(neutral dye)가 있다. 매염제(mordant)는 염료가 세 포 성분과 잘 결합할 수 있도록 도와주는 역할을 한다. 세균 세포의 표면은 중성에서 음으로 하전되어 있으므로, 세균 세포를 직접 염색하 여 관찰하기 위해서는 methylene blue, basic fuchsin 또는 crystal violet와 같은 염기 성 염료가 적합하다. 염기성 염료는 세포벽을 통과 침추하여 세균 세포의 음전하 물 질과 약한 이온결합을 형성하여 세포를 착색시킨다. Nigrosin과 같은 산성 염료는 세 - 32 - 균을 직접 염색시킬 수 없으나 바탕을 염색시킬 수 있으므로 세포의 겉모양(outline)을 관찰하는데 유용하게 사용된다. ① 염기성 염료(basic or cationic dyes) methylene blue, crystal violet, safranin, fasci fuchsin, green, gentian violet, methyl violet, rosaniline, malachite hematoxylin ② 산성 염료(acidic or anionic dyes) nigrosin, eosin, erythrosin, picric acid, orantia, organge G ③ 중성 염료(neutral dyes) Sudan III, Giemsa, Wright, Leishman ④ 매염제(mordant) iodine, ferrous sulfate, phenol, tannic acid (2) 염색의 종류 염색에 한 가지의 염료만을 사용하는 단순 염색(simple staining)과 두 종류 이상의 염료를 사용하여 특별한 목적으로 염색하는 분별 염색(differential staining)이 있다. 단 순 염색은 세포의 크기, 형태 및 배열을 관찰하는데 사용되며, 분별 염색에는 그람 염 색, 항산성 염색 등과 같이 특정 종류의 세균만을 염색시키므로 세균의 분류 및 동정 에 이용되는 것과 편모 염색, 포자 염색, 협막 염색 등과 같이 세균의 미세구조를 관 찰하는 데 이용되는 것이 있다. (가) 단순 염색 세균을 slide에 도말, 공정한 후 한가지 염색약으로 염색하는 방법을 의미하며, metylen blue, crystal violet, carbol fuchsin 등의 염기성 시료를 주로 사용하는데 염기 성 시료는 ribosome이 많은 부분인 원형질을 염색한다. 단순염색을 하면 기본적인 세 - 33 - 균의 모양, 크기 배열상을 알 수 있다. 액체 배양액에 있는 균을 관찰하고자 할 때는 균체를 멸균된 희석수에 적당히 희석하든지 혹은 희석하지 않고 백금이로 균을 떠서 잘 도말한 후 염색과정을 시작할 수 있겠지만 고체 배양액의 경우 희석액을 한 방울 떨어뜨린 후 균을 떠서 희석액과 함께 도말하는 방법이다. (나) 분별 염색 분별염색은 한 세균 그룹과 다른 세균 그룹을 구별하기 위해 사용된다. 가장 흔히 사용되는 두 가지 분별염색법에는 그람염색과 항산성염색이 있다. ① 그람염색 그람염색이 세균의 염색에 있어서 현재까지 가장 널리 사용되는 방법이다. 이 방 법은 세균을 그람양성과 그람음성 두 개의 큰 그룹으로 나눌 수 있는 방법이며 이 두 그룹 간에 염색의 차이를 보이는 이유가 세포벽의 화학적 구조의 근본적인 차이에서 기인한다고 알려져있다. ② 항산성 염색 항산성염색은 염색약을 잘 흡수하지 않는 몇 그룹의 미생물들을 염색하기 위한 방법이다. 이들 중에는 결핵을 유발하는 종과 한센병을 유발하는 종을 포함하는 마이 코박테리움속에 속하는종들이 있다. 이 세균들의 세포벽은 고농도의 지질을 함유하고 있어서 그람염색에 사용되는 것들을 포함하여 여러 가지 염색약의 흡수를 방해한다. 따라서 이들을 염색하기 위해서는 더 강력한 염색법을 필요로 하지만 일단 염색이 되 기만 하면, 이 세포돌은 탈색에도 내성이 매우 강하낟. ③ 편모염색 편모는 원핵세포에서 가장 보편적인 운동기작을 제공하는 세포부속물이나, 보통 너무 얇아서 광학현미경으로는 보이지 않는다. 편모염색법은 염색시약이 편모에 부착 - 34 - 하여 코팅을 함으로써 편모의 직경을 효과적으로 크게 만듦으로써 광학현미경으로 보 일 수 있도록 착색제를 사용한다. 모든 세균이 편모를 갖는 것이 아니고, 편모를 갖는 세균들도 세포 주위에 다양한 모양으로 편모를 갖기 때문에 편모의 존재와 분포는 세 균을 동정하는데 사용되기도 한다. ④ 아포염색 아포염색은 세균아포의 형태 및 위치 관찰을 위한 염색법이다. 아포염색은 침투력 을 높이기 위해 가온 염색하여 아포 염색을 하며 색소가 아포에 침투되면 아포는 균 체에 비해 탈색제에는 어느 정도 내성이 생겨 탈색이 잘 되지 않는다. 그래서 탈색된 영양세포에 대조 염색하여 관찰 할 수 있다. ⑤ 협막염색 어떤 균종은 세포벽의 외층에 협막이라 불리는 겔라틴성 물질이나 점질층으로 둘 러싸여 있으며 협막은 일반염색을 하면 균체 주위가 불투명하고 명확히 구분되지 않 는다. 협막의 성분은 주로 폴리사카라이드, 폴리펩타이드 글라이코프로테인으로 구성 되어있으며, 숙주의 방어작용 및 백혈구의 탐색 작용에 저항하여 병원성과 관계된다. 협막은 현미경 관찰 시 이물질과 혼동되기 쉬우며 고정하기 위하여 열을 가할 때 세 포가 위축되어 나타나는 것으로 보이며, 매염제로 CuSO4를 사용하는데 매염효과 이외 에 약간의 탈수현상을 일으킨다. ⑥ 미토콘드리아염색 야누스그린 B를 사용하여 미토콘드리아의 시트크롬 C oxidase에 의존하여 염색하 는데 농도가 너무 높으면 효소에 독성을 일으켜 잘 염색되지 않는다. 야누스그린 B는 살아있는 세포의 미토콘드리아만 염색이 가능하며 염색이 잘되면 원형의 실같은 구조 로 청색을 띄게 된다. - 35 - 단순염색 (simple stain) 형태 및 크기 관찰(구균, 간균, 나선균) 배열 관찰(연쇄상, 포도상, 쌍구균, 사련구균) 세균의분류 염색 감별 염색 (differential stain) 그람염색(gram stain) 항산성 염색(acid fast stain) 편모염색(flagella atain) 아포염색(spore stain) 특수구조 관찰 협막염색(capsule stain) 미토콘드리아염색(mitochond ria stain) 나. 실험 : 도말 표본 제작(Smear preparation) 세균을 염색하여 현미경으로 관찰하기 위해서는 도말(smearing) → 건조(drying) → 고정(fixation) → 염색(staining) → 세척(washing) → 건조(drying) → 검경(현미경 관찰) 과정을 거쳐야 한다. 도말은 세균 부유액을 슬라이드 글라스 위에 얇게 펴서 공기 중에서 건조시키는 과 정으로, 도말이 잘 되어야 세균의 형태나 배열을 정확하게 관찰할 수 있다. 도말 표본 은 균체가 슬라이드 글라스 표면에 단단하게 부착되어 있지 않아 염색 과정에서 균체 가 유실될 염려가 있다. 이러한 현상을 방지하기 위해서 건조 도말 표본을 분젠 버너 의 불꽃 위로 2～3번 정도 빨리 통과시키는 것을 열고정(heat fixation)이라 한다. 열고 정을 하면 세포의 단백질이 열에 의해 변성되어 응고되면서 균체가 슬라이드 글라스 표면에 단단히 고정된다. 열고정 대신에 화학약품을 이용한 고정을 할 수도 있다. - 36 - 다. 실험 : 단순 염색(Simple staining) 세균의 기본적인 형태, 크기, 배열을 관찰할 때에는 단순 염색을 한다. 단순 염색 은 슬라이드 글라스 위에 균체를 한 가지 염색약으로 염색하는 방법으로 세균의 핵산 과 단백질은 대체로 음전하를 띠므로 이들과 강하게 결합할 수 있는 염기성 염색시약 을 쓰면 염색이 잘 된다. 일반적으로 쓰는 염색시약은 methylene blue, crytal violet, carbol fuchsin 등이 있다. 라. 실험 : 매질 염색(Negative staining) 산성 염료인 eosin 또는 nigrosin을 사용하면 음전하를 띠는 세균는 염색되지 않고 배경만 염색이 되어 세포의 형태를 관찰할 수 있다. 이 방법은 열고정이나 화악약품 처리를 하지 않으므로 세균의 원래 형태를 변형시키지 않고 그대로 관찰할 수 있다는 장점이 있으며, 염기성 염료로 염색이 잘 되지 않는 나선균(spirochaetes)의 관찰에 유 용하게 사용된다. 마. 실험 : 그람 염색(Gram staining) 그람 염색은 대표적인 분별염색법으로 세균의 분류 및 동정에 아주 유용한 염색 법으로 1884년 Hans Christian Gram에 의해 고안되었다. 그람 염색에 의해 모든 세 균은 그람 양성균(Gram positive)과 그람 음성균(Gram negative)으로 구별된다. 그람 양성균과 음성균은 세포벽의 화학적, 물리적 성질이 다르며, 이에 따라 그람 염색액에 대한 투과성이 차이가 생긴다. 그람 양성균의 세포벽은 두껍고 단순한 펩티도글리칸 (peptidoglycan)으로 구성되어 있어 1차 염색에서 crystal violet로 염색한 후 알코올로 처리하면 세포벽의 탈수와 수축에 의해 염색액이 쉽게 유실되지 않는다. 그러나 그람 음성균의 세포벽은 펩티도글리칸층이 얇고, 주로 지방과 단백질로 구성된 외막층 (outer membrane)을 가지고 있어 1차 염색 후 알코올로 처리하면 지방층이 용해되어 염색액이 쉽게 유실된다. 대응 염색약인 safranin으로 염색하면 그람 양성균은 1차 염 색약인 crystal violet의 색인 짙은 청색을 띠며, 그람 음성균은 대응 염색약인 safranin - 37 - 의 색인 분홍색을 띠게 된다. 그람 염색은 배양 24시간 이내의 균으로 하여야 하며, 오랫동안 배양된 균을 사용하면 그람 양성균이 그람 음성균으로 판별되기도 한다. 염 색과정에서 가장 중요한 것은 1차 염색액의 탈색으로, 과도한 탈색은 그람 양성균도 탈색되어 음성균으로 잘못 판명될 우려가 있으며, 탈색이 불충분하면 그람 음성균이 양성균으로 잘못 판명될 수 있다. 그림21. 그람 염색 과정 - 38 - 3. 미생물의 항균 활성 항균활성은 세균, 곰팡이 등에 대해 시간에 따른 미생물의 수 증가, 즉 밀도의 증가나 생합성 저해로 세포 분열을 저해을하는 것을 의미한다. 활성의 측정은 직 접 미생물의 수를 세거나, 균밀도를 측정 (light scattering)을 이용하여 확인할 수 있고 생육저해는 가역 또는 비가역에 따라 정균작용과 살균작용으로 나뉠 수 있 다. 일반적으로 항균활성을 규정하는 것은 미생물의 생육을 저해하는데 필요한 최 저 농도 MIC (minimal inhibitory concentration)를 흡광으로 측정하여 확인을 하거 나 고체 배지상에서의 측정하는 방법 등으로 나뉠 수 있다. 항균활성을 위해 대체 적으로 그람 양성균의 대표적 균주인 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)과 그 람 음성균의 대표적 균주인 대장균(Escherichia coli)를 사용하여 항균활성 테스트 를 진행한다. 가.액제 배지상에서의 측정 방법 (1) 흡광도 측정 방법 항균활성을 위해 미생물을 액체상에서 배양한 후 배양된 상태의 미생물에 항 균활성을 갖는지 여부를 확인하고자 하는 시료를 비율에 맞게 섞어서 본배양을 진행하면서 흡광도를 확인하여 항균활성을 확인하는 방법이다. 실험이 간단하다는 장점이 있고 빠르게 확인하는 방법이 있지만 단일 미생물의 경우 오염이 되었을 경우, 정확한 항균활성을 확인하지 못하는 단점을 가진다. 흡광도 측정을 위해 사 용되는 기기는 spectrophotometer 나 흡광도 측정 기기인 micro plate reader 기 등을 사용하여 흡광도를 확인할 수 있다. - 39 - 나. 고체 배지상에서의 측정 방법 (1) Paper disc 방법 (Agar diffusion assay) 항균활성에서 paper disc 방법은 한천 확선법이라고도 한다. 이 방법은 두 가 지 방법으로 진행이 가능하다. 우선 미생물 배양기술 중 도말평판 배양을 사용한 방법도 있고 주입평판 배양을 사용한 방법도 있지만 시간을 절약하기 위해 도말 평판 배양을 주로 사용한다. 이 paper disc 방법은 사전 제작된 고체배지에 항균 활성으로 사용할 미생물을 도말한 후 그 위에 3M paper (지름 1cm)를 원으로 자 른 후 시료를 약 200ul에서 1ml을 떨어뜨린 후 12 ~ 18시간 이후에 clear zone을 확인하는 방법이다. 그림23. 항균실험 Paper disc법 - 40 - (2) 도말평판 방법(Spreading plate method) paper disc방법에 있어 미생물을 미리 도말하여 그 위에 원하고자 하는 시료 를 페이퍼에 올려 clear 존을 확인하는 간접적 방법이지만, 도말평판 방법은 고체 배지에 미생물과 원하고자 하는 시료를 사전에 섞어 도말하는 방법을 말한다. 이 때 미생물의 농도가 너무 높다면 항균 시료의 항균 활성이 아예 나타나지 않을 수 있으며 균주의 농도가 너무 낮다면 항균활성이 나타났는지 아닌지를 확인하기 가 어렵다. 따라서 원하고자 하는 시료의 항균활성을 제대로 확인하기 위해서 미 생물의 농도를 10-1 ~ 10-6까지 넓은 농도에서 확인할 필요가 있다. 그 때 항균활 성에 대한 수치를 정확하게 계산할 수 있다. 페이퍼 디스크 방법보다 좀 더 정확 한 수치를 계산할 수 있다. (a) 무처리군 (b) 처리군 그림24. 항균실험 도말평판 방법 - 41 - 나. 항균 실험 (1) Paper disc 방법 ① 항균실험에 사용하고자 하는 미생물을 미리 준비한다. (대장균, 황색포도상구 균 : 종배양:12시간, 본배양 2시간) ② 준비된 고체 배지를 실험전에 물기제거를 위해 섭씨 37도에서 incubator에 2-3 시간 정도 둔다 ③ 본배양된 미생물을 agar plate에 200 ul를 농도에 맞게 도말한다. (농도가 너무 높으면 항균력을 확인할 수 없으며, 너무 낮으면 항균력이 있는지 확인하기 쉽지 않다. 따라서 본배양 후 미생물의 흡광도 값이 0.5 ~ 0.7 정도 (2시간 ~ 2시간 30 분 배양) 되었을 때 10-3 ~ 10-6 농도를 모두 같이 진행한다.) ④ 도말된 고체배지 위에 Disk (3M paper)를 핀셋을 이용하여 올려 놓는다. ⑤ 대조군 아무것도 처리하지 않고 실험군은 Disk가 촉촉해질 때까지 처리한 후, 미생물이 성장온도조건에 맞추어 incubator에서 반응시킨다. (대장균, 황색포도상 구균: 섭씨 37도 12시간) ⑥ 반응 후 고체배지에 생성된 clear zone (inhibition zone)을 확인한다. (2) 도말평판 방법(Spreading plate method) ① 항균실험에 사용하고자 하는 미생물을 미리 준비한다. (대장균, 황색포도상구 균 : 종배양:12시간, 본배양 2시간) ② 준비된 고체 배지를 실험전에 물기제거를 위해 섭씨 37도에서 incubator에 2-3 시간 정도 둔다 - 42 - ③ 본배양된 미생물을 각 농도에 맞게 희석한 후 항균 시료를 잘 섞어준다. ④ 섞어준 혼합시료를 고체배지 위해 200 ul를 뿌린 후 유리막대 (spreader)를 이 용하여 뻑뻑해질 때까지 도말해준다. ⑤ 도말 후 미생물이 성장온도조건에 맞추어 incubator에서 반응시킨다. (대장균, 황색포도상구균: 섭씨 37도 12시간) ⑥ 콜로니가 자랄 때까지 고체배지를 incubator에 반응시킨 후 생성된 콜로니를 확인하여 대조군과 비교 후 항균력을 확인한다. (3) 흡광도 측정 방법 ① 항균실험에 사용하고자 하는 미생물을 미리 준비한다. (대장균, 황색포도상구 균 : 종배양:12시간, 본배양 2시간) ② 준비된 액체 배지에 미생물을 넣는다. (농도별 희석하여 약 100 ul 씩) ③ 항생물질의 농도별 처리하여 넣는다. ④ 처리된 시료를 incubator에 배양하면서 시간대 별로 흡광도를 측정한다. (흡광 도는 595 nm에서 측정한다.) ⑤ 시간대별로 확인한 흡광도 값을 그려 미생물 growth curve를 그린다. - 43 - 주차별 실험방법 * Xanthomonas, Staphylococcus aureus는 병원성 균이니 각별히 주의한다. * 실험 단계마다 알코올 스프레이로 실험대와 손, 실험기구를 소독한다. * 실험 단계마다 플라스크 병 입구와 피펫 팁, 백금이 등을 알코올램프로 소독한 다. 첫째 주 : 배양 사전준비 : LB plate 60개(학생 한 명당 2개 균주, 여유분), X과 S의 cell stock 2개 씩 총 4개(한 조당 2개 균주) 배지 만들기 준비물 : 알코올램프, 라이터, 네임펜, 1L 삼각플라스크 1개, 1L 메디아병 1개, 메 스실린더, 약수저, 유산지, 호일, 전자저울, petri dish 20개, 백금이, 팁 Yeast extract, Tryptone, NaCl, Agar, 증류수 1. autoclave에 물이 있는지 확인하고 예열한다. 2. 1L 삼각플라스크는 고체배지, 1L 메디아병은 액체배지 제조에 사용한다. 전자 저울 위에 유산지를 올려놓고 영점을 맞춘다. 아래 표를 참고하여 yeast extract(0.5%), tryptone(1%), NaCl(1%), Agar(1.5%)를 재어 플라스크와 병 안에 넣는다. 메스실린더로 증류수를 넣고 잘 섞어준다. - 44 - 삼각플라스크 메디아병 고체배지(g) 액체배지(g) 2.5 5 Tryptone 5 10 NaCl 5 10 Agar 7.5 × 500ml 1000ml Yeast extract 증류수 3. 삼각플라스크의 입구를 호일로 감싸고, 뚜껑을 완전히 닫지 않은 상태의 메디 아병의 입구를 호일로 감싼 후 autoclave에 넣고 121℃, 15분간 멸균해준다. 이때, 다음 주에 사용할 250ml 삼각플라스크 4개를 같이 멸균한다. >>> 4. 멸균 후 autoclave 온도가 60℃로 떨어지면 autoclave를 열어서 고체배지와 액 체배지를 꺼낸다. 액체배지는 사용 전까지 냉장보관(4℃)한다. 클린벤치 안에 알코올램프를 켜 놓는다. 고체배지는 클린벤치에서 petri dish에 부어(petri dish 높이 반절까지) 굳을 때 까지 놓는다. 완전히 굳은 후 뒤집어서 냉장고에 냉장 보관한다. >>> - 45 - 미생물 배양 사전 준비한 LB plate 40개와 X,S의 cell stock을 사용한다. 알코올램프 반경 30cm clean zone에서 실험한다. 1. LB plate에 균, 날짜, 조, 이름을 네임펜으로 표시한다. 2. 백금이를 알코올램프에 백금선이 빨갛게 달구어질 때까지 화염멸균하고 흔들어 서 충분히 식힌 후(후후 불어 식히지 않는다), 균주의 cell stock에 넣어 시료를 묻혀 LB plate에 S자 형으로 가볍게 긋는다(streaking). 이때, agar 표면이 파이 지 않도록 주의한다. 3. streaking 후 LB plate를 반드시 뒤집어서 incubator에 보관한다. ( X :26℃, S :37℃ ). 결과 보고 streaking한 다음 날, LB plate의 colony를 관찰하여 사진 찍고 그려서 보고서 제 출한다. LB plate는 호일로 감싼 후 냉장 보관하여 둘째 주에 사용한다. - 46 - 둘째 주 : 그람 염색 하루 전, 종배양(seed culture) 준비물 : conical tube 2개, 마이크로피펫, 백금이, 팁 1. conical tube 뚜껑에 균, 날짜, 조를 표시한다. 2. 마이크로피펫으로 첫째 주에 제조한 액체배지 3000㎕를 conical tube에 넣고, 첫째 주에 배양한 X,S LB plate의 colony를 멸균한 백금이로 떠서 액체배지가 들어있는 conical tube에 접종한다. 3. incubator(shaker)에 보관하여 배양한다. 그람염색(gram staining) 준비물 : slide glass 2개, 네임펜, 알코올램프, 백금이, 팁, 스포이드, 와이프스, 1L 비커, 호일 시약 : 1차 염색약(Crystal violet), 매염제(Gram’s iodine 용액), 탈색액(95% ethanol), 대응염색약(Safranin 용액) * 위 염색약은 매우 해로우므로 인체에 닿지 않도록 주의한다. 1. slide glass에 균이름과 균을 도말할 부분을 표시한다. - 47 - 2. 표시한 면의 반대 면을 화염멸균 한 후, 어제 종배양한 conical tube에서 균을 멸균한 백금이로 채취하여 도말한다. 넓게 도말해야 빨리 마른다. 3. 도말한 균이 마를 때까지 기다린 후, 도말한 반대 면을 알코올램프 위로 가볍 게 세 번 지나가며 열고정 한다. 4. 1차 염색약(Crystal violet)을 도말 표본에 충분히 가하여 1분간 염색 후 증류수 로 세척하고 slide glass에 남은 물을 와이프스로 제거한다. 증류수로 세척할 때, 도말한 표면에 증류수가 직접 닿으면 cell이 떨어져나갈 수 있으므로 주의 한다. 5. Gram’s iodine 용액을 도발 표본에 충분히 가하여 1분간 염색 후 증류수로 세 척하고 남은 물을 제거한다. 6. slide glass를 기울인 후 탈색액(ethanol)을 한 방울씩 흘린다. 흐르는 탈색액이 무색이 될 때까지 약 15초간 계속한다. 흐르는 탈색액이 무색이 되면 증류수로 세척하고 남은 물을 제거한다. 7. 대응염색약(Safranin 용액)을 도말 표본에 충분히 가하여 30초간 염색 후 증류 수로 세척하고 남은 물을 제거한다. 8. 완전히 건조한 후, 현미경으로 관찰한다. - 48 - 다음주 실험 준비과정 첫째 주에 멸균한 본배양용 250ml 삼각플라스크 2개에 액체배지 100ml 씩 담아서 냉장 보관한다. 종배양용 conical tube 2개에 마이크로피펫으로 액체배지를 3000㎕씩 담아서 냉장 보관한다. 마이크로피펫 사용 시 팁이 tube에 닿지 않도록 주의하며, 닿았다면 그 팁을 버리고 새 팁을 사용한다. 실험 후 처리방법 폐수(염색약 등)는 B11 폐수통에 버린다. 균이 닿은 slide glass, 피펫 팁, 스포이드는 autoclave로 멸균 처리하여 버린다. 결과 보고 현미경 관찰 결과를 사진 찍어서 보고서 제출한다. - 49 - 셋째 주 : 항균 시험 하루 전, 종배양(seed culture) 1. 둘째 주에 준비한 종배양용 conical tube에 X,S LB plate의 colony를 멸균한 백금이로 따서 넣는다. 2. incubator(shaker)에 보관하여 배양한다. 3시간 전, 본배양(main culture) 1. 둘째 주에 준비한 본배양용 삼각플라스크(액체배지 100ml)에 어제의 종배양 tube 내용물을 다 넣는다. 2. incubator에 보관하여 배양한다. 항균력 테스트 준비물 : 알코올램프, 마이크로피펫, tube 4개, spreader, 비커, 핀셋, disk, 에탄올, LB plate 1. 첫 번째 uv cell에 액체배지를 넣고, 두 번째 uv cell에 X 본배양액을 넣고, 세 번째 uv cell에 S 본배양액을 넣는다. 이때, uv cell에 거품이 생기지 않도록 주 의한다. 2. 액체배지 uv cell을 blank 클릭하여 흡광도를 측정하고, X uv cell을 sample1, S uv cell을 sample2클릭하여 흡광도를 측정한다. 3. sample1과 sample2의 흡광도 값이 0.6~0.8임을 확인하고, 본배양액을 100배 희 석한다. 10배 희석 : A tube에 마이크로피펫으로 액체배지 900㎕, 본배양 100㎕를 넣는 다. 이때, 배지와 배양액을 잘 섞어주기 위해 파이펫팅(마이크로피펫 으로 뽑아올리고 내보내고 다시 뽑아올리고) 10번 한다. - 50 - 100배 희석 : B tube에 마이크로피펫으로 액체배지 900μl, A tube 100μl를 넣 는다. 이때, 배지와 배양액을 잘 섞어주기 위해 파이펫팅 10번 한다. 4. 희석된 균 200㎕를 spreader를 사용하여 LB plate에 도말한 후, 도말된 X, S LB plate 위에 각각 Disk 2개씩 핀셋으로 올려놓는다(Disk : filter paper를 펀치 로 오려내어 멸균한 조각). spreader는 에탄올에 담궈서 소독하고, 사용하기 전에 알코올램프로 화염 멸균 한 뒤 충분히 식힌다. 에탄올이 흘러내려 불나지 않도록 주의한다. 5. 대조군 disk에는 아무 처리를 하지 않고, 실험군 disk에는 향균소재(에탄올, 데 톨,...)를 한 방울 떨어뜨리고 incubator에 보관한다. 실험 후 처리방법 폐수는 B11 폐수통에 버린다. 균이 닿은 tube, 피펫 팁, 스포이드는 autoclave로 멸균 처리하여 버린다. uv cell에 에탄올을 담아 소독한다. - 51 - 결과 보고 반응 후 LB plate에 생성된 clear zone(inhibition zone)을 확인하고, 보고서 제출한 다. 참고 문헌 Ricki Lewis 외, LIFE, 6th Ed, Graw Hill, 2009, Campbell et al, Biology, ,8th Ed. Pearson, 2008 Willey, Sherwood, Wooverton , 미생물학, 2008, 제7호, P557. 오계헌 외, (brock의) 미생물학, 제 14판, 바이오사이언스, 2016 Keyword 미생물, 원핵미생물, 진핵미생물, 그람양성, 그람음성, 염색법, 항 균활성 Microorganism, Prokaryote, Eukaryote, Antibacterial activity - 52 - Staining method, 화학공학기초실험 2 02 아스피린의 제조 및 반응 실험 목적 아스피린(Aspirin)의 제조를 통하여 에스테르화 반응을 이해하고 반응속도와 반응 속도 상수를 구할 수 있다. 또한, 분광기기를 이용한 정량분석법과 정성분석법을 학습한다. - 53 - 1. 아스피린의 제조 및 반응 이론적 배경 반응차수 구하기 속도 법칙을 모를 때 반응차수를 어떻게 구하는지 알아보자. 실제 반응을 보기 전에, 다음 반응에서 물질 와 가 어떤 과정을 거치는지 알아보도록 하자: → 일반적인 항으로 속도 법칙을 쓰면 속도 과 의 값을 구하려면 한 반응물의 농도를 고정시키고, 다른 반응물의 농도를 변화시키는 일련의 실험을 해야 하고, 각각의 경우가 초기 속도에 미치는 영향을 측정해야 한다. 표 1.1에 결과가 나와 있다. 표 1.1 A와 B의 반응에서 초기 속도 실험 초기속도(mol/L·s) 초기 [A](mol/L) 초기 [B](mol/L) 1 1.75 × 10-3 2.50 × 10-2 3.00 × 10-2 2 3.50 × 10-3 5.00 × 10-2 3.00 × 10-2 3 3.50 × 10-3 2.50 × 10-2 6.00 × 10-2 4 7.00 × 10-3 5.00 × 10-2 6.00 × 10-2 1. 에 대한 차수 구하기. 가 상수이고 가 두 배로 되는 실험 1과 2를 비교하면, 을 구할 수 있다. 우선, 이 두 실험에 대한 일반적인 속도 법칙의 비 를 취한다: - 54 - 화학공학기초실험 2 속도 속도 여기서 는 실험 2에서 의 농도이고, 은 실험 1에서 의 농도이며, 다른 항도 이와 같이 정의한다. 가 상수이고 는 두 실험에서 변하지 않으므로, 이 항들은 상쇄된다: 속도 속도 표 1.1에 있는 값으로 치환하면, 다음과 같다. × · × × · × 변끼리 나누면 , 따라서 반응은 에 대해 1차인데, 가 두 배로 될 때 속도도 2배가 되기 때문 이다. 2. 에 대한 차수 구하기. 을 구하기 위해서는 가 고정되어 있고 가 두 배로 되는 실험 3과 1을 비교한다: 속도 속도 전과 같이 는 상수이고, 이 실험들에서 가 변하지 않으므로, 이 항들은 상쇄 - 55 - 1. 아스피린의 제조 및 반응 되고 다음을 얻는다. 속도 속도 실제 값을 대입하면 × · × × · × 변끼리 나누면 , 따라서 반응은 B에도 1차인데, 가 두 배로 될 때 속도도 두 배가 되기 때문이 다. 이 결론은 실험 4를 사용하여 확인해 볼 수 있다: 와 둘 다 두 배가 되면 속도가 4배로 되어야 하는데, 실제로 그렇다는 것을 알 수 있다. 따라서 과 이 1인 속도 법칙은 속도 균형 잡힌 화학 반응식에서 의 계수가 2이지만, 에 대한 차수가 1임에 주목하 라. 전에도 언급한 것처럼, 반응차수는 실험으로부터 결정되어야 한다. 속도 상수 결정 와 의 반응에서 속도 상수를 구해보자. 속도, 반응물 농도, 그리고 반응 차 수를 알고 있다면, 속도 법칙에서 미지의 상태로 남아 있는 것은 속도상수 () 뿐 이다. - 56 - 화학공학기초실험 2 표 1.2의 어느 실험 자료를 사용해도 를 구할 수 있다. 예를 들어 실험 1을 사 용하면, 와 간 반응의 초기 속도 표 1.2 초기 반응물 농도(mol/L) 실험 초기속도(mol/L·s) 1 3.21 × 10-3 1.10 × 10-2 1.30 × 10-2 2 6.40 × 10-3 2.20 × 10-2 1.30 × 10-2 3 12.8 × 10-3 1.10 × 10-2 2.60 × 10-2 4 9.60 × 10-3 3.30 × 10-2 1.30 × 10-2 5 28.8 × 10-3 1.10 × 10-2 3.90 × 10-2 속도 속도 × · × × × · × · × 일련의 실험에 대해 구한 값이 실험 오차 이내에서 변하지 않는지를 항상 확인 하라. 유효 숫자를 3개로 맞추면, 표 1.2 의 다섯 실험에서 의 평균값은 × ·이다. 농도를 , 반응 속도를 ·시간 단위로 표시하면 의 단위는 반응 차 수와 시간의 단위에 따라 달라진다. 이 반응의 경우 반응 속도의 단위가 · 로 나와야만 의 단위는 ·가 된다: × × · · 시간의 단위가 초로 주어진다면 전체가 3차인 반응에서 속도 상수는 항상 위와 - 57 - 1. 아스피린의 제조 및 반응 같은 단위를 가진다. 표 16.4에는 전체 차수가 정수인 경우 의 단위가 나와 있 다. 그러나 이 단위는 항상 수학적으로 결정할 수 있다 표 1.3 몇 가지 전체 반응 차수에 대한 속도 상수 의 단위 전체 반응 차수 의 단위 (는 초 단위) 0 mol/L·s (또는 mol L-1 s-1) 1 1/s (또는 s-1) 2 L/mol·s (또는 L mol-1 s-1) 3 L2/mol2·s (또는 L2 mol-2 s-1) 일반 공식: 치수 의 단위 의 단위 자외선 분광법 수용액 중의 용질의 농도를 알아내기 위한 기기 분석 방법 중의 하나로 분광분 석법이 널리 사용되고 있다. 분광분석법은 물질이 특정한 파장에 해당하는 전자기 복사선을 얼마나 흡수 혹은 방출하는가를 이용하여 그 물질의 농도를 측정하는 방법이다. 모든 화합물은 저마다의 고유한 전자 구조로 이루어져 있기 때문에 전 자기 복사선(특히, 가시광선이나 자외선)을 흡수하는 특성이 다르게 나타난다. 분 자는 그것을 이루고 있는 전자들의 에너지 준위 차이와 같은 에너지(hν)를 가지 는 빛을 흡수한다. 이러한 성질을 이용하여 물질이 흡수하는 빛의 파장과 그 크기 에 의해 그 물질의 종류와 용액 중에 포함된 그 물질의 농도를 알아낼 수 있다. Lambert-Beer의 법칙(혹은 Beer의 법칙)은 앞에서 말한 것처럼 물질이 특정한 파 장에서 빛을 흡수하는 정도(흡광도)와 그 물질의 농도와의 관계를 나타낸 것으로 다음과 같은 수식으로 표현된다. A = εLc (식 1) 여기서 A는 흡광도(absorbance)이며 A =-log(I/I0)로 정의된다. I0는 시료를 통과하 기 전의 빛의 세기이며 I는 시료를 통과한 후의 빛의 세기이다. L은 빛이 시료가 담긴 용기(cuvette)을 통과한 거리이며 ε는 그 물질의 고유한 양으로서 몰흡광계 수(molar absorptivity)이며, c는 그 시료의 몰농도(molar concentration)이다. - 58 - 화학공학기초실험 2 L과 ε를 알고 있을 때 용액의 흡광도(A)를 측정함으로써 용질의 농도를 얻을 수 있다. Beer’s Law를 이용한 물질의 농도 측정 그러나 L과 ε를 알지 못하더라도 일정한 값일 때는 농도를 구할 수 있다. L과 ε가 상수(constant)인 경우 흡광도는 농도에 비례하므로 농도에 대한 흡광도의 관계 즉, 검정곡선(plot)을 얻으면 미지의 농도에 대한 흡광도 측정을 통해 그 농 도를 구할 수 있게 된다. 이를 수식으로 표현하면 (식 1)에서 k=εL로 두면 A=kc 가 되고 변형하여 c=A/k라는 흡광도에 대한 농도 관계식을 얻게 된다. 이것을 도 식화 한 것을 검정곡선이라고 부르며 이 검정곡선(plot)에서 기울기(slope)에 해당 하는 k(=εL)는 L이 일정하므로 ε에 의해 결정되는 값으로 물질마다 다른 값을 가지게 된다. 검정곡선의 기울기(slope)에 해당하는 k(=A/c)를 얻기 위해서 여러가 지의 기지의 농도의 용액과 그 용액에 대한 흡광도 수치가 필요하다. 이 때 흡광 도는 특정한 파장에서의 것을 사용해야 하는데 물질마다 갖는 고유한 흡수 피크 (peak)를 나타내는 파장을 선정해야 한다. 왜냐하면 이 파장에서 그 물질의 농도 에 대한 흡광도의 변화의 특성을 가장 잘 나타내주기 때문이다. - 59 - 1. 아스피린의 제조 및 반응 실험 이론 <아스피린의 제조> 살리실산은 작용기가 2개 존재하여, 페놀류(Ph-OH)이면서 카르복실산류 (Ph-COOH)이기 때문에, 2 종류의 반응을 일으킬 수 있다. 즉, 살리실산은 알코올 이나 카르복실산으로서 작용하여 에스테르화반응을 일으킬 수 있다. 예를 들면, 아세트산 무수물(acetic anhydride)과의 반응으로부터 acetyl salicylic acid가 생성되 며, 과량의 메탄올과의 반응으로부터는 methyl salicylate가 생성된다. 본 실험에서는 acetic anhydride와의 반응으로부터 acetyl salicylic acid를 제조하 고자 한다. 이 반응에서는 부산물로서 고분자가 생성될 수 있다. Acetyl salycylic acid는 NaHCO3와 반응하여 수용성 염을 생성하는 반면에, 고분자 부산물은 bicarbonate 용액에 용해되지 않는다. 이러한 거동 차이가 아스피린의 정제에 활 용된다. 반응생성물에 가장 존재하기 쉬운 불순물은 살리실산인데, 여러 정제 과 정과 최종 재결정 과정에서 제거 된다. 살리실산은 다른 대부분의 페놀류와 마찬 가지로 FeCl3와 반응하여 purple 계열 색을 띠는 complex를 생성하기 때문에, 아 스피린에 그러한 불순물의 존재는 쉽게 확인이 가능하다. - 60 - 화학공학기초실험 2 <자외선 분광법을 이용한 정량분석-반응속도 구하기> 살리실산 이온용액에 Fe3+를 첨가하면 saliclyate-Fe(Ⅲ) complex가 생성되는데, 이 물질은 최대 흡광파장(λmax)이 530nm이며 보라색을 띤다. 따라서 이 물질의 농도에 대한 흡광도 검정곡선을 구할 때 이 파장에서의 흡광도를 이용하면 된다. 아스피린의 합성 과정 중간에 시료를 채취하여 살리실산 양을 위의 방법을 통해 정량화할 수 있다. 시약 살리실산, 아세트산 무수물, H2SO4, Fe(Ⅲ)Cl3 기구 및 장비 250 mL 비커, 100 mL 코니컬 플라스크, 뷰흐너 깔때기, 항온조 분석장비 자외선 분광기, UV 램프 - 61 - 1. 아스피린의 제조 및 반응 실험 방법 첫째 주 : 아스피린의 제조 1) 항온수조를 사용해 물중탕을 준비한다. 2) 100mL 코니컬 플라스크에 아래 표와 같은 양을 사용하여 두 물질을 섞는다. 반응 살리실산 아세트산 무수물 살리실산 아세트산 무수물 양 (g) 양 (mL) 몰수 (mol) 몰수 (mol) 1 4.9 5 3.55×10-2 5.32×10-2 2 5.88 5 4.26×10-2 5.32×10-2 3 4.9 6 3.55×10-2 6.39×10-2 4 5.88 10 4.26×10-2 10.65×10-2 3) 아세트산 무수물의 가수분해를 막기 위해 코니컬 플라스크는 완전히 건조시킨 후 사용한다. 4) 진한 H2SO4를 촉매로서 2~3방울 넣는다. 5) 시료를 흔들어 섞은 후, 70℃로 물중탕 온도를 유지하면서 5분 후에 1~3번 시 료를 상온으로 냉각시킨 후 일주일간 상온에서 보관한다. 4번 용액은 10분 더 가 열한다. 이때 투명한 노란색으로 된다. - 4번 용액 추가 실험 순서 (아스피린 제조 수율 측정) 1) 물중탕에서 꺼낸 후 증류수 10mL을 첨가해 미반응 아세트산 무수물을 가수분 해한다. (약간은 혼탁해지다가 다시 원래로 돌아온다.). 2) 약간 흔들고 상온까지 식힌 뒤 증류수 약 25mL를 첨가하고 흔들어준다. 이때 흰색 결정이 생기지 않으면 유리 막대로 비커 안쪽을 긁어주거나 흐르는 물(혹은 얼음 물)에서 냉각한다. 3) 완전히 냉각시킨 후 결정을 뷰흐너 깔때기를 사용하여 감압 여과한다. 고형물 을 소량의 냉각된 증류수로 2-3회 세척한다(잔류 황산과 초산 제거). 4) 침전물을 비커에 넣어 0.5N-sodium bicarbonate(NaHCO3) 수용액 100mL(4.2g/100mL)으로 녹인 후, 고상으로 존재하는 고분자를 여과하여 제거한다 (미반응 살리실산과 아스피린은 염을 형성하여 물에 용해됨.). - 62 - 화학공학기초실험 2 5) 고분자가 제거된 반응용액에 3M-HCl 17mL를 가하여 중화시킨 후, 침전물(아스 피린)을 감압 여과한다. 6) 고형물을 소량의 냉각 증류수로 2-3회 세척한다(잔류 HCl 제거). 7) 고형분 소량을 채취하여 에탄올에 용해시키고 FeCl3 수용액을 첨가하여, 미반 응 살리실산의 존재 여부를 확인한다(보라색 발현 관찰). 만일 미반응 살리실산이 존재하면 재결정법으로 제거해야 한다. 8) 가열된 ethyl acetate를 최소량 이용하여 고형물을 코니컬 플라스크에 용해시키 고(필요에 따라서는 hot plate에서 잠시 가열), 용액을 실온으로 냉각시킨다. 용액 이 냉각되면 아스피린이 결정화된다(결정이 관찰되지 않으면 유리막대로 코니컬 플라스크의 안쪽 면을 긁어서 결정화 유도). 결정이 생성되지 않으면 증류수를 첨 가하여(~5 mL 씩 추가) 결정을 유도한다. 결정체는 진공 여과한다(플라스크 벽에 남아있는 물질은 냉각된 ethyl acetate 혹은 petroleum ether를 사용하여 옮긴다.) 소량의 냉각 증류수로 2-3회 세척한다(표면에 존재 가능한 살리실산 제거). 고형 분 소량을 채취하여 에탄올에 용해시키고 FeCl3 수용액을 첨가하여, 미반응 살리 실산의 존재 여부를 확인한다. 9) 결정체는 오븐에서 건조시킨다. 건조된 시료의 질량을 측정하여 합성된 아스피 린의 수율을 계산한다. 고분자 부산물도 건조하여 동일하게 처리한다. 11) 생성물의 융점을 측정한다. (셋째주) 둘째 주 : 아스피린의 반응속도 측정 <조당 준비물> : 100mL 비이커, 1L 부피플라스크 1개, 500mL 부피플라스크 1 개, 100mL 부피플라스크 7개, 피펫 10mL 3개 피펫 휠러 <살리실산의 정량 분석> 1. FeCl3 수용액과 살리실산 표준 용액 준비 1) 3.22g의 FeCl3을 100mL 비커에 담은 후 3N-HCL 용액 20mL를 넣어 녹인다(후 드에서 실시). 녹은 용액을 1L 부피플라스크에 옮겨 담고 증류수로 표지선까지 채 우면 0.020 M FeCl3 수용액이 제조된다. - 63 - 1. 아스피린의 제조 및 반응 2) 살리실산 0.138g(0.001mol)을 95% 에탄올 수용액에 녹여 500mL 부피플라스크에 넣어서 2mM 살리실산 수용액을 제조한다(증류수에는 살리실산이 용해되지 않음.) 3) 2번에서 제조된 살리실산 용액에서 5/10/20mL를 취하여 각각 100mL 부피플라 스크에 넣고, 0.020 M FeCl3 수용액으로 표지선까지 채워 살리실산 표준용액 3개 를 제조한다. 2. 흡광도 측정 시료 준비 1) 일주일 간 보관한 1~3번 반응용액으로부터 각 1g씩을 채취하여 95% 에탄올 20mL에 녹인 후, 100mL 부피플라스크에 넣고 위에서 제조한 0.020 M FeCl3 수용 액으로 표지선까지 채운다. 3. UV-visible 분광기를 이용하여 흡광도 측정하기 1) 0.020 M FeCl3 용액으로만 UV 셀을 채운 후 기준 스펙트럼을 얻는다. 2) 살리실산 표준용액 3개와 반응용액에 대한 530nm에서의 흡광도를 측정한다. 3) 표준용액의 흡광도 검정곡선을 이용하여 반응용액에 존재하는 미반응 살리실 산의 농도를 구한다. - 64 - 화학공학기초실험 2 UV 사용 방법 1. 자외선 분광기 뒷면의 전원버튼을 누른다. 2. PC 전원을 켠다. 3. UV 측정 프로그램을 실행시킨다. - 65 - 1. 아스피린의 제조 및 반응 4. Title : Untited-1, Comment : X, Sample Name : 조이름, Experiment Type : Find Peak/Valley Mode 선택 5. Experiment Setup : Find Peak/Valley Mode Date Type : Absorbance, Sampling : Single Cell Holder, Mode : Faster - 66 - 화학공학기초실험 2 6. Baseline Correction : Use : No 7. Find Peak/Valley Yes, 0.02, 2, 10, Yes, 7, Yes, 7, 300, 800 - 67 - 1. 아스피린의 제조 및 반응 8. UV cell에 0.02M FeCl3 수용액을 담고 셀 홀더에 셀 넣기 Measure-Run Blank 버튼 누른다. 9. UV cell에 샘플 용액을 담고 셀 홀더에 셀 넣은 후, Measure-Run Sample 버튼 누른다(샘플 총 6개: 살리실산 표준용액 3개, 반응용액 3개). 10. 530nm에서의 흡광도를 측정한다. - 68 - 화학공학기초실험 2 셋째 주 : 아스피린의 순도분석 융점측정기 사용 방법 1. 전원을 꽂고 옆에 전원버튼을 누른다. 2. 시료를 모세관 넣는다. 모세관 막힌 부분으로부터 2mm정도 높이가 되도록 한 다. 모세관이 깨질 수 있으니 주의한다. 3. 막힌 쪽을 안쪽방향으로 그림의 6번 통로로 집어넣는다. 7번 렌즈를 눈으로 보 아 동그랗게 막힌 끝부분과 시료가 잘 보이는 위치에 놓는다. 모세관에 넣은 시 료 2개 이상 준비한다. ※ 온도보정 할 수 있도록, 융점을 알고 있는 표준시료도 1개 준비한다. (예) 살리실산 융점 : 158.6℃ 4. 3번 버튼과 4번 버튼을 동시에 눌러, 최고 높일 수 있는 온도를 250℃가량으로 맞춘다. 5. 측정을 시작하기 위해 1번을 누르면, 디스플레이창에 온도가 올라가는 것을 볼 수 있다. 6. 시료가 녹기시작하면(액체방울 생성) 디스플레이 차에 있는 온도를 기록한다. 7. 시료가 다 녹으면(모든 분말이 액상으로 변함), 2번 버튼을 눌러 종료한다. 8. 50℃이하로 온도가 떨어지면, 다른 시료의 융점을 동일한 방법으로 측정한다. 처음 측정했던 온도에서 식히지 않고 넣을 경우, 바로 녹아버리므로 정확한 융점 을 측정할 수 없다. - 69 - 1. 아스피린의 제조 및 반응 실험시 주의사항 1) 미반응 아세트산 무수물을 분해시킬 때 아세트산의 증기가 발생할 수 있으므 로 조심해야한다. 아세트산 무수물은 냄새가 독하므로 환기를 시키고 눈이 따가우 므로 반드시 goggle을 착용하고 실험하도록 한다. 2) 결정 석출시 oil phase로 분리되기도 한다. 그러나 잘 흔들어주면 결정이 석출 된다. 3) 진한 황산의 첨가와 물중탕 가열 시에 주의한다. - 70 - 화학공학기초실험 2 실험 보고서 아스피린의 제조 및 반응 학부 전공 학번 성명 실험 조 : 실험 일자 : 담당 교수 : 담당 조교 : 1. 아스피린의 제조반응 - 생성물의 무게 : - 수율계산 : - 고분자 부산물의 무게 : 2. 살리실산의 정량분석 표준용액으로부터 구한 검정선을 통하여 반응 중 남은 살리실산의 양 구하기 표 1. 흡광도를 이용한 살리실산의 정량 표준용액속의 용액 흡광도 반응 중 남은 시료 살리실산의 농도(mol/L) 표준용액 1 표준용액 2 표준용액 3 * 표 1로부터 구한 검정선 : y=ax+b 흡광도 살리실산의 농도(mol/L) 시료 1 시료 2 시료 3 3. 반응속도 및 반응차수 구하기 표 2. 반응속도 반응 1 2 3 4 초기 살리실산 초기 아세트산 몰수 (mol) 몰수 (mol) 3.55×10-2 4.26×10-2 3.55×10-2 4.26×10-2 5.32×10-2 5.32×10-2 6.39×10-2 10.65×10-2 반응중살리실산몰수 초기살리실산 몰수 반응속도 ∙ - 71 - 1. 아스피린의 제조 및 반응 위의 표 2를 이용하여 반응차수 m, n과 반응속도상수 k 를 구하시오. 4. 아스피린의 순도분석 - 최종 정제된 아스피린의 융점 : - 최종 정제된 아스피린과 FeCl3의 반응 결과 : 고찰할 내용 1. 진한 황산을 첨가하는 이유는 무엇인가? 2. 부산물로 얻어지는 고분자의 화학구조는 무엇인가? 3. 아스피린의 재결정시에 물은 사용하지 않는다. 그 이유는 무엇인가? - 72 - 화학공학기초실험 2 실험 보고서 참고 ※ 이하 살리실산은 SA, 아세트산 무수물은 AA라 칭한다. 1. 표준용액 속의 SA의 양 계산 채취용량 (mL) SA의 농도 5 0.1 10 0.2 20 0.4 (mM) 2. 샘플 중의 반응 후 남은 SA 양 계산 1) 위의 그래프의 직선 추세선을 구한다. ex) 2) 검량선으로부터 농도파악 (C1) : 샘플의 흡광도 값을 위 추세선에 넣어 시료 1g 중 남은 SA의 농도 계산 ex) 샘플①의 Abs=0.26094라면 ∴ × 3) 1.0에 존재하는 미반응 SA의 몰수 = C1×0.1L = a mol ex) × × × × - 73 - 1. 아스피린의 제조 및 반응 4) 반응물에 존재하는 미반응 SA의 몰수 = a mol×[반응물의 총무게(g)/1g] 각 샘플의 총량(g) = SA의 무게(g) + (AA의 부피×AA의 밀도) ex) 샘플①의 경우 × × × × 3. 각 반응의 반응속도 구하기 반응종료 후 의몰수 초기 의몰수 4. 반응차수 m 구하기 속도 의 초기농도 m =[1.2]m 속도 의 초기농도 5. 반응차수 n 구하기 속도 의 초기농도 n =[1.2]n 속도 의 초기농도 참고 문헌 1. Donald L. Pavia, "Introduction to organic laboratory techniques", 2nd Ed., CBS College Publishing (1982). 2. John E. McMurry, "Organic chemistry", 8th Ed., Cole, Cengage Learning, (2008). 3. 권중근, 박영조,“최신 대학화학실험”, (2007) Keyword 아스피린, 살리실산, 아세트산, 속도상수, 반응차수 - 74 - 화학공학기초실험 2 03 에너지화학공학기초실험 -전기화학 Ⅰ/Ⅱ 실험 목적 리튬이차전지의 용량, 작동 전압을 측정 및 평가하기 위해서는 여러가지 방법이 사용될 수 있는데 가장 많이 사용하는 방법은 전류를 일정하게 흘려주어 전압의 변화를 측정하는 정전류 충·방전법 (galvanostatic charge-discharge)과 순환전압 주사법(cyclic voltammetry, CV) 등이 있다. 정전류 충·방전법을 이용하여 2차 전지의 충·방전 용량과 방전 속도에 따른 용량을 확인한다. - 75 - 충·방전 효율, 충 전기화학 실험 이론 1. 이차전지의 원리 및 응용 서론 IT (information technology) 기술이 눈부시게 발달함에 따라 다양한 휴대형 정 보통신 기기의 환산이 이뤄짐으로써, 21세기는 시간과 장소에 구애 받지 않고 고품격질의 정보서비스가 가능한 ‘유비쿼터스 사회’ 로 반전되고 있다. 이러 한 유비쿼터스 사회로의 발전 기반에는 1990년대 초에 상용화된 리튬이차전지 가 매우 중요한 위치를 차지하고 있다. 리튬이차전지는 다른 이차전지에 비해 작동 전압 및 에너지 밀도가 높을 뿐만 아니라 오래 사용할 수 있어 기기의 다 양화와 복잡화에 따른 복잡한 요구조건을 충족시킬 수 있는 우수한 특성을 지 니고 있다. 최근 기존의 리튬이차전지 기술을 더욱 발전시켜 전기자동차 등 친 환경 수송시스템뿐만 아니라, 전력저장, 의료, 국방 등으로 그 응용분야를 확대 하기 위한 노력이 전 세계적으로 활발히 진행되고 있다. 이와 같은 리튬이차전지 기술의 지속적인 발전과 더불어 기술의 혁신을 위해 서는 리튬이차전지 전반에 대한 근본적이고 체계적인 이해가 필수적이다. 전지의 역사 전지(battery)란 전기화학 반응을 이용하여 전극 물질의 화학에너지를 전기에너 지로 직접 변화하는 시스템으로 정의할 수 있다. 전지에 대한 최초의 기록은 1800년에 이탈리아 파비아(Pavia) 대학의 볼타(Volta)가 런던 왕립학회에 발표한 논문인 것으로 알려져 있다. 1786년 이탈리아의 갈바니(Galvani)는 개구리의 해 부실험 중 개구리의 다리가 금속과 접촉할 때 경련을 일으키는 것을 발견하고, 개구리의 몸 안에서 발생한 전기가 근육을 통해 흘러간다는 ‘동물전기’의 존 재를 주장하였다. 그러나 이러한 동물 전기설에 의문을 품은 볼타는, 그것이 서 로 다른 금속 사이에서 일어나는 현상으로서 다만 동물의 체액이 전해질 역할 을 한 것을 확신하였다. 이후 그는 1800년에 동전모양의 두 금속판 사이에 알칼 리용액으로 적신 천조각을 끼운 것을 여러 쌍 겹쳐 쌓은 후, 양 끝에 전선을 연 - 76 - 화학공학기초실험 2 결하여 전류를 발행시킬 수 있는 ‘볼타의 전퇴(Volta’s pile)’를 발표하게 되 었다. 이것이 오늘날 우리가 사용하고 있는 전지의 최초의 형태이다 (그림1 왼 쪽). 그림 1. 볼타전퇴. 이와 더불어 1932년 바그다드 인근의 고대 유적지에서 전지로 추정되는 2000 년 전의 항아리가 발견되었다.(그림 1 오른쪽). 이 항아리는 약 15cm 높이의 전 토 토기로서, 그 안에 구리 실린더가 들어있고, 구리와 철로 된 막대가 실린더 안에 고정되어 있으며, 막대들은 산성물질에 의해 부식되어 있었다. 일부 학자 들은 이것이 최초의 전지라고 주장을 하고 있으나 전지로 이용되었는지는 확실 치 않다. 전지는 일정 수명기간 동안만 한 차례 사용이 가능한 일차전지(primary battery)와 재충전을 통해 장시간 반복 사용이 가능한 이차전지(secondary or rechargeable battery)로 나눌 수 있는데, 볼타전지 이후 다양한 전지들이 개발 되고 상용화되어왔다. 최초로 상용화된 일차전지는 1865년 프랑스의 르클랑셰(Le Clanché)가 고안한 망간전지이다. 망간전지는 아연 음극과 이산화망간 양극 및 염화암모늄염 (NH4Cl)과 염화아연(ZnCl2)염을 혼합하여 적용한 산성의 수계 전해질(aqueous electrolyte)을 사용하는데, 기전력이 1.5V로서 다양한 소형 전자제품에 사용되었 다. 이후 망간전지의 산성 전해질을 수산화칼륨염(KOH)울 적용한 알칼리 전해질 로 대체하여 기전력을 망간전지와 동일하게 유지함과 동시에 전지의 용량과 출 - 77 - 전기화학 력특성을 향상시켜, 사용기간 및 성능을 획기적으로 개선한 알칼리전지를 상용 하였다. 또한 공기/아연전지(1.4V),산화은전지(1.5V) 등의 다양한 일차전지들의 개발이 이루어졌고, 1970년 대에 이르러 리튬금속을 음극으로 적용한 3V급 리튬 일차전지의 상용화가 이루어지면서 일차전지의 성능은 매우 큰 진전을 이루게 된다. 최초의 이차전지는 1859년 프랑스 플랑떼(Planté)에 의해 고안된 납축전지이 다. 납축전지는 과산화납을 양극으로, 납을 음극으로 그리고 묽은 황산을 전해 액으로 사용하였는데, 셀 당 기전력은 2V이며 현재는 주로 자동차용 축전지에 적용되고 있다. 이후 Ni/Cd(1.2V) 전지가 1948년에 상용화되어, 기존의 일차전지 가 주로 적용되던 소형 전자기기 분야를 본격적으로 대체하기에 이르게 된다. 그러나 Ni/Cd 전지는 카드뮴의 환경유해성으로 인해 최근에는 점차 사용이 제한 되고 있다. 1990년대 초에 들어서면서 Ni/Cd 전지에 비해 보다 환경친화적이고 성능이 향 상된 Ni-MH(1.2V) 전지가 사용화되었고, 곧이어 작동전압이 3배 높은 3V급의 리 튬이차전지의 등장으로 에너지 밀도가 크게 향상되어 전지의 소형화, 경량화가 가능하여 핸드폰, 노트북 PC, 캠코더 등의 휴대용 시장은 리튬 이차전지가 주도 하게 되었다. 전지기술의 발전 전지기술은 1800년 볼타전지의 발견 이후, 200년 남짓한 전지의 개발역사를 통 해 두 번의 획기적인 진보가 있었다. 그 하나는 일차전지에서 이차전지로의 발 전이고, 다른 하나는 3V급으로의 작동전압의 상승이다. 특히 리튬이차전지는 경 량이면서도 3.7V 이상의 높은 평균방전전압을 유지함으로써, 현재 알려진 전지 들 중 가장 높은 에너지 밀도를 나타내어 전지기술의 혁신을 주도하는 대표적 인 전지가 되었다. 이차전지기술의 발달에 따른 에너지밀도의 변화를 살펴 보면, 최초의 이차전지 인 납축전지의 경우 중량당 에너지 밀도가 30 Wh/kg, 부피당 에너지 밀도는 100Wh/L를 넘지 못하였으나, 리튬 이차전지는 연평균 10%씩 에너지 밀도가 꾸 준히 증가하여, 현재 원통형을 기준으로 한 중량당 에너지 밀도는 200Wh/kg, 부 피당 에너지 밀도는 600Wh/L에 이르고 있다 (그림 2). 이는 현재 리튬이차전지 - 78 - 화학공학기초실험 2 의 에너지밀도 수준이 중량을 기준으로 볼 때, 납축전지에 비해 약 다섯 배, Ni-MH에 비해 세 배 정도 향상된 것임을 알 수 있다. 그림 2. 전지기술의 발전에 따른 에너지밀도의 변화. 이차전지의 일종인 Ni-MH 전지의 경우에도 낮은 작동전압과 에너지밀도의 한 계는 있지만 높은 안전성을 방탕으로 하이브리드 전기자동차(hybrid electric vehicle, HEV)에 탑재되어 큰 각광을 받고 있다. 그러나 최근 플러그인 하이브리 드 전기자동차(plug-in hybrid electric vehicle, PHEV) 및 전기자동차(electric vehicle, EV) 기술이 관심을 끌면서 성능의 한계를 드러내는 Ni-MH 전기보다는 고에너지 및 고출력특성을 동시에 갖는 리튬이차전지가 더 큰 주목을 받고 있 다. 특히, 전기자동차용 이차전지는 충전시간이 짧고 경량이면서도 성능이 우수 하여야 하므로, 향후 리튬이차전지를 중심으로 기술개발 경쟁이 치열할 것으로 예상되며, 현재를 극복할 수 있는 획기적이고도 지속적인 기술 진보가 기대된 다. 리튬이차전지의 개요 전지가 이차전지로서의 성질을 나타내기 위해서는 양극과 음극이 충전 (charge)과 방전(discharge)을 반복적으로 수행할 수 있는 구조를 가지고 있어야 한다. 이를 위해서는 전극 내에서의 이온의 삽입 및 탈 리가 용이하고 이들 과 정이 진행되는 동안 전극의 구조가 안정하게 유지되어야 하며 전해질은 이온의 전달을 용이하게 하여야 한다. 그림 3에 대표적인 리튬이차전지의 구성에 대한 - 79 - 전기화학 개략도를 나타내었다. 그림 3. 리튬이차전지의 Li 이온의 삽입/탈리 과정. 전지에서 전극 내로 삽입되는 이온은 집전체를 통해 전극으로 들어온 전자와 전하중성(charge neutrality)을 이루어 전극 내에 전기에너지를 저장하는 매개체 가 가 된다. 또한 이온은 전해질 영역에서 빠른 속도로 전극 쪽으로 이동함으로 써 전극 내에서의 반응속도를 크게 할 수 있다. 즉 전지의 전체의 반응속도에 크게 영향을 미치는 것은 전해질 및 전극 영역에서의 이온이 이동속도이다. 또 한 저장할 수 있는 전기에너지의 양을 경정하는 것은 전하중성을 이루기 위해 전극에 삽입된 이온의 양이다. 결국, 전극의 소재와 이온의 종류가 실제 저장할 수 있는 전지에너지의 양을 결정하는 주요 요소가 되는데, 이온의 종류로서 리 튬이온(Li+)을 사용한 전지를 리튬 이차전지(lithium secondary batteries)라고 한 다. 리튬은 자연계에 알려진 금속 중 가장 가볍고 표준환원전위가 가장 낮아 3V 이상의 높은 기전력을 얻을 수 있으며 전극소재로 적용 시 중량 및 체적당 에 너지 밀도가 높다. 리튬이차전지는 작동 전압이 물분해 전압보다 높기 때문에 수용액 대신 유기용매를 전해질로 사용해야 하며, 전극으로서는 일반작으로 Li+ 의 삽입과 탈 리가 용이한 격자구조를 갖는 물질들을 사용한다. 현재 리튬 이온을 이용한 이차전지(lithium ion based secondary batteries) 혹 은 리튬이차전지는 고출력, 고에너지 특성으로 인해 스마트 폰(smart phone), 넷 북(net book) 등의 휴대용 모바일 전원 뿐 아니라 하이브리드 자동차(hybrid - 80 - 화학공학기초실험 2 vehicle)등의 주된 에너지원으로 활용되고 있다. 향후 EV(electric vehicle) 및 전 력 저장(energy storage system, ESS)등의 용도로 각광받을 것으로 예상되는 리 튬이차전지는 4 V대의 높은 전압, -20도에서 50도 이상의 넓은 활용 온도, 1 kW/kg 이상의 높은 출력 밀도, 100 Wh/kg 이상의 높은 에너지 밀도로 인해 그 활용 범위가 더더욱 넓어질 것으로 예상된다.1 그림 1에서 이러한 리튬이차전지 의 적용 제품에 대한 개괄도를 나타내었다. 이러한 리튬이차전지는 양극과 음극에서 일어나는 산화･환원반응을 통해 지 속적인 에너지의 저장과 사용이 가능한 전지이다. 다른 전지에 비해 에너지 밀 도와 출력이 우수하며 에너지 전환 효율이 뛰어나다는 장점을 가지고 있다. 그림 4. 리튬 이차전지의 적용제품 및 동향 리튬이차전지는 충･방전이 일어날때 양극과 음극 물질 사이에서 전해질을 따 라 이동하는 리튬 이온이 도선을 통해 이동하는 전자와 전기적인 전하중성을 이루며 전기 또는 화학에너지를 저장한다. 리튬이차전지는 네 가지 기본소재인 양극, 음극, 전해질, 분리막으로 구성되며 통상적으로 양극에는 전이금속 산화물을 사용하고 음극에는 층간 삽입이 가능 한 탄소계 재료를 사용하고 있다. 리튬이차전지는 일반적으로 전이금속산화물 (transition metal oxide)을 양극소재로, 탄소를 음극소재로 사용하며, 전해질로 액체전해질을 사용할 경우 이를 리튬이온전지(lithium-ion batteries, LIB)라 하고 고분자 전해질을 사용하면 리튬이온폴리머전지(lithium-ion polymer - 81 - batteries, 전기화학 LIPB)라 부른다. 상용화된 리튬이차전지는 그림 5에 나타난 바와 같이 전지의 형태 및 구성 요 소의 소재에 따라 여러 가지로 분류될 수 있다. 전지 형태의 경우, 노트북 PC에 주로 적용되고 있는 원통형(cylindrical) 전지와 휴대형 단말기에 적용되고 있는 각형(prismatic) 전지, 원형 단전지 형태인 코인형(coin) 전지, 그리고 알루미늄/플 라스틱 복합 외장재를 적용한 파우치형(pouch) 전지가 그 대표적인 예이다. 그림 5. 리튬이차전지의 형태에 따른 분류. 전지의 구성요소에 따른 소재 특성은 대개 다음과 같다. 양극의 경우 리튬이 격자 구조의 일부분을 이루고 있다가 탈리 시에 이온의 형태로 빠져 나오기 때 문에 구조적으로 인정한 전이금속계 산화물소재를 주로 사용하고 있으며, 음극 으로는 양극에서 빠져 나온 리튬이온을 안정하게 저장하고 큰 기전력을 제공할 수 있도록 그 표준환원전위가 리튬과 크게 차이가 나지 않는 물질을 사용한다. 전해질의 경우 작동전압 범위 내에서 전기화학적 안정성을 유지하고 열 및 화 학적 안정성이 높은 리튬염과 유기용매를 사용한다. 이 외에 양극과 음극의 전 기적 접촉에 의한 단락을 방지하기 위한 분리막 으로서 고온에서 용융될 수 있 는 고분자 또는 세라믹 물질을 사용한다. 리튬이차전지의 미래 지금까지의 리튬이차전지는 소형 전자기기 및 휴대형 IT 기기들을 중심으로 발 전되어 왔다. 이를 바탕으로 리튬이차전지는 향후 ‘녹색 에너지’, ‘무선충 전’, ‘자가발전’, ‘리사이클’, ‘휴대에서 착용으로’, ‘플렉시블’ 등을 핵 - 82 - 화학공학기초실험 2 심 주제로 하는 새로운 응용분야를 개척할 것으로 예상된다. 따라서 이들의 기능 과 용도를 면밀히 고려하여 미래에 요구되는 전지를 미리 예측하고 기술개발을 준비하는 것이 매우 중요하다. 미래의 리튬이차전지 분야 중 특히 중대형 전지가 큰 기대를 모으고 있다. 일부 상용화를 시작한 HEV 외에 PHEV 및 EV 전지, 로봇용 전지, 또는 태양열, 풍력, 조력 등의 대체 에너지 개발로 생산된 전기를 저장할 수 전력저장용 고성능 리튬 이차전지는 매우 중요한 에너지 저장시스템으로서 스마트 그리드기술의 핵심요소 로 인식되고 있다. 마이크로 에너지용의 초소형 전지와 플렉시블 전지도 크게 기대되는 미래형 리 튬이차전지의 하나이다. RFID/USN, MEMS/NEMS형 소자, 인제 삽입/내장형 의료기 기에 적용될 수 있는 초소형 전지, 착복형 PC나 플렉시블 디스플레이와 같이 구 부릴 수 있는 전자기기에 사용 가능한 플렉시블 전지의 경우, 전지의 구조 제어 및 제조 공정 등이 기존의 방법과는 크게 달라질 것으로 예상된다. 이 외에 완전 고체형(all-solid-state) 리튬이차전지의 개발에 대해서도 큰 기대를 하고 있다. 최근 리튬이차전지의 잦은 폭발사고에 따른 대량 리콜 사태를 겪으면 서, 기존의 액체전해질이 갖는 안전성 문제를 획기적으로 해결할 수 있는 고분자 형 전해질이나 무기계 또는 유·무기 복합계 전해질의 개발과 이에 적합한 전극 소재 및 공저의 개발도 매우 중요한 과제가 되고 있다. - 83 - 전기화학 2. 전지화학의 기본 전기화학이란 금속 또는 반도체 등의 전자전도체(electron conductor)와 전해질 과 같은 이온전도체(ionic conductor)와의 계면에서 일어나는 산화·환원 반응에 의한 전자전달을 다루는 학문이다. 전기화학을 바탕으로 한 기술영역에는 일반적 으로 전지, 반도체, 부식, 전기분해, 도금 등이 포함된다. 본 교재에서는 화학에너 지를 전기에너지로 변환시키는 일차전지, 이차전지, 연료전지 등과 연관된 분야를 특정적으로 전지화학이라고 명명하였으며, 특히 본 장에서는 이차전지를 중심으로 한 전지화학에 대하여 기술하고자 한다. 전지의 구성 전기화학 셀 및 전지 전기화학 셀은 화학에너지를 전기에너지로 변환하거나 그 반대로 전지에너지를 화학에너지로 변환하는 소자의 가장 작은 단위 구조를 말한다. 전기화학 셀은 그 자체로 전지라 부르기도 하지만, 보다 일반적으로는 여러 개의 전지화학 셀이 모 여 있는 시스템을 전지라라고 한다. 전기화학 셀은 기본적으로 두 개의 서로 다른 전극과 전해질로 구성되어 있다. 이들 두 전극은 서로 다른 전위(electric potential)를 가지고 있기 때문에 전해질을 매개로 하여 연결되었을 때 전위차가 발생하게 되며, 이를 기전력이라고도 한다. 이때 전위라 함은 전지장 내에서 단위 전하가 받는 위치에너지로서 일반적으로 볼트(V)로 표시되며, 기전력은 전기회로에서 전기를 흐르게 하는 원동력이 된다. 기전력에 의해서 각 전극에서는 산화·환원반응이 일어나고, 발생된 전자는 외부 회로를 통하여 이동한다. 이때 전해질에서는 전하중성을 유지하기 위하여 이온들 이 두 전극 사이를 이동하여 셀이 전기화학적 평형에 도달할 때까지 전극에서 산 화·환원반응이 지속된다. 2-1-2 전지의 구성과 전극의 정의 앞서 설명한 바와 같이 전지(또는 전지화학셀)는 산화·환원반응을 통하여 화학 에너지를 전기에너지로 또는 전지에너지를 화학에너지로 변환시키는 장치로서 크 게 보면 그림 6에 나타낸 바와 같이 양극(cathode), 음극(anode) 및 전해질 - 84 - 화학공학기초실험 2 (electrolyte)로 구성되며, 추가적으로 두 전극 간의 전기적 단락을 방지하기 위한 분리막을 포함한다. 그림 6. 전지의 모식도(방전). 전극에서 전기화학적 산화·환원반응이 일어날 때 전해질을 통하여 이온이 산화 전극과 환원전극 사이를 이동하며, 동시에 도선을 통해 두 전극 사이에서 전자의 이동이 일어난다. 이 때 전자는 두 개의 전극을 연결하는 외부도선을 따라 이동하 므로 전제적으로 폐회로(closed circuit)를 구성하게 된다. 음극에서는 전지의 방전(discharge) 동안 전극물질의 전기화학적 산화반응 (oxidation, A → A+ + e-)이 일어나며, 이 전극을 산화전극(anode)이라 부른다. 이 때 방전이란 전지가 갖고 있는 화학에너지를 전기에너지로 변화시키는 과정을 의 미한다. 양극에서는 전기의 방전 동안 외부회로를 통해 음극으로부터 전달된 전자 에 의해 전극 물질의 환원반응(reduction, B+ + e- → B)이 일어나며, 이 전극을 환원전극(cathode)이라 부른다. 전해질은 두 전극 사이에서 이론을 전달하는 이온 전도체(ionic conductor)로서, 전자에 대한 전도성은 없으며 단지 이온전도성만을 나타낸다. 전지에서 일차전지는 전극에서의 산화·환원반응이 비가역적인 반면, 이차전지는 산화·환원반응이 가역적이며 반복적 사용이 가능하다. 이때 가역적이라 함은 같 은 전극 내에서 산화·환원 반응이 반복적으로 일어나는 것을 말한다. 따라서 이 차전지는 일차전지와 달리 충전하여 여러 번 사용할 수 있는 장점이 있다. 이차전 지의 경우 전극에서는 산화뿐만 아니라 환원 반응도 일어날 수 있으므로 방전 시 산화전극의 역할을 하던 전극은 충전 시 환원전극으로 전환된다. 따라서 전극의 - 85 - 전기화학 정의는 방전 동안의 산화전극을 음극, 환원전극을 양극이라 하고 충전 동안에도 그 정의는 변하지 않는다. 이는 이차전지 전극의 정의가 전기에너지로 변환되는 방전 과정을 기준으로 하기 때문이다. 완전 셀(full cell)과 반쪽 셀(half cell) 전지의 전기화학적 특성을 분석하기 위하여 전기화학 셀을 자주 이용하게 되는 데 이때 전기화학 셀은 완전 셀 혹은 반쪽 셀을 사용한다. 완전 셀은 실질적으로 사용될 양극과 음극이 동시에 전기화학 반응에 참여하는 환전한 전지의 형태를 가지고 있어 이를 이용하여 전지의 특성 및 성능 등을 직접적으로 측정할 수 있 는 장점이 있다. 그러나 완전 셀의 경우에는 기준전극을 추가적으로 사용함으로써 기준전극에 대한 양극과 음극의 전위를 각각 측정함으로써 전극의 전위차를 구할 수 있다. 이에 반해, 반쪽 셀을 사용할 경우에는 환원전극 혹은 산화전극 중 한쪽 전극만을 작업 전극으로 하고, 상대전극을 기준전극으로 사용하기 때문에 작업 전 극에서만 일어나는 현상을 측정하고 분석하기가 용이하여 각 전극소재들의 기본 성질을 규명하는데 유리하다. 이와 같이, 완전 셀 또는 반 쪽셀의 이용은 측정자 의 목적에 따라 선택될 수 있다. 전기화학 반응과 전위 방전 시 전지에서의 전기화학적 반응은 전지가 생산해 낼 수 있는 전기적 에너 지와 상관관계를 가진다. 주어진 전극에서 다음 반응으로 진행되는 전기화학반응 을 생각해보자. pA + qB = rC + sD (1) 여기서 p, q, r 및 s는 A,B,C 및 D 화학종에 대한 각각의 양론계수(stoichiometric coefficient)를 의미한다. 위 반응식에 관한 Gibbs 자유에너지 변화를 활동도 a에 관한 식으로 표현할 수 있으며, 식 (2)와 같다. ln (2) 전지가 평형상태에서 얻을 수 있는 일(Wrev)은 최대의 일(Wmax)에 해당하며 - 86 - 화학공학기초실험 2 이는 전기화학 반응 진행 동안의 Gibbs 자유에너지의 변화, △G로 나타낼 수 있 으며 다음 식과 같이 표시된다. max (3) max (4) 한편, 전기적 에너지는 전지 내를 흐르는 전하 Q(charge, 단위: coulomb, C) 및 전위차(E)와 다음과 같은 관계가 있다. (5) max 이때 Q는 전지 내 전자의 개수와 전자의 전하량(e)의 곱으로 나타낼 수 있다. 전 자 개수 ne는 전자의 몰 수와 아보가드로수(NA, 6.023×1023)의 곱에 해당하며, Q 를 전자의 몰수(n)와 전자의 전하량으로 나타내면 다음 식과 같다. Q = nee (6) Q = nNAe (7) 또한, 전하의 Q는 다음과 같이 나타낼 수도 있다. (8) 여기서 F는 Faraday 상수로서, 전자 1몰에 해당하는 전하량(96,485 C/mol)이다. 따라서 전지의 두 전극이 서로 다른 전위를 갖는다면 그 전위차로 인해 n몰의 전 자가 이동할 때 전지의 행하는 전기적 일은 다음 식으로 표시된다. max (9) ≡ (10) 이 식은 전지에서 일어나는 전기화학반응에 의한 평형상태에서의 Gibbs 자유에 - 87 - 전기화학 너지 변화와 전지로부터 얻을 수 있는 기전력과의 관계를 보여준다. 전기화학반응에 참가하는 반응물과 생성물들이 모두 표준상태인 경우에 전지의 전위는 표준 전위(standard potential), E°로 나타낸다. (11) 식 (2)와 식 (11)로부터 다음과 같이 Nernst식이 얻어지고, 전위차는 전기화학 반 응에 참여하는 성분들의 농도에 의해 영향을 받는다. (12) 전지의 전압과 전류 • 전압 전압이란 전기 회로에 있는 두 지점 간 전위의 차이를 의미한다. 이는 전기를 흐르게 하는 원동력(driving force)으로서 기전력(electromotive force)이라고도 하 며 단위는 볼트(V)를 사용한다. 실제 전지전압은 구동하는 조건, 예를 들면 온도 나 압력 등에 의하여 영향을 받으므로 기준이 되는 전지 상태의 설정이 필요하다. 이에 따라 전극의 경우 표준상태(1기압, 25℃, 1몰의 수소 농도 기준)이며 평형상 태 하에서의 전위를 표준전극전위(standard electrode potential)로 정하여 각 전극 들의 전위의 기준으로 삼고 있다. 실제 두 전극 사이의 전위 차이는 아래와 같이 식으로 나타낼 수 있다. Erxn = Eright – Eleft (11) 여기서 Erxn은 전지에서의 반응에 의해 형성되는 전위차 그리고 Eright 및 Eleft 는 각각의 전극에 대한 전위를 의미한다. 단, 자발적 산화·환원반응을 가지는 galvanic cell인 경우의 Erxn는 양의 전압 값을 가여야 하는 반면, 전기화학 반응 이 비자발적인 경우의 Erxn는 음의 전압 값을 가지는 electrolytic cell에 해당하게 된다. - 88 - 화학공학기초실험 2 그림 7. 전지의 개방회로 전압 프로파일 전지는 전류가 거의 흐르지 않을 경우 즉, 평형 상태인 경우에만 전지 내 반응의 △G와 같은 크기의 전지적 에너지를 공급할 수 있다. 그러나, 실질적으로 방전반 응 시의 전지에서는 전류가 흐르는 상태로서 이는 열역학적 기준에서 반응이 비 평형상태 하에서 진행된다고 볼 수 있다. 이러한 방전 광정에서의 전압은 개방회 로전압(open circuit voltage, OCV)보다 항상 작은 값을 나타내기 때문에 열역학적 으로 가능한 최대 에너지를 이용할 수가 없게 된다. 개방회로 전압이란 외부 부하 혹은 외부 회로가 접속되어 있지 않은 어떤 장치의 두 단자 사이에서의 전지적인 전위차이다. 여기서 개방회로전압 보다 실제 전압이 낮아지는 이유는 전지의 내부 저항(ohmic 분극) 및 전극/전해질 계면에서의 전하 이동과 연관된 분극 (polarization) 현상과 관련지어 설명할 수 있다. 반면, 전지 내 반응을 역방향으로 진행시키는 충전 과정에서의 전압은 개방회로 전압보다 높은데, 그 이유는 내부저 항 및 활성화 분극에 따른 과전압의 형상과, 이온전도가 전자전도보다 낮으며, 전 극 재료에 불순물이 포함될 수 있고, 전극재료 표면과 내부에서의 리튬 이온 확산 속도의 차이로 전극의 부위별 리튬이온 농도 차이가 유발되어 분극 현상을 일으 키기 때문이다. 그림 7은 실질적인 충·방전 방응에서 주기적 전류펄스(current pulse)에 따른 전 압 전이를 보여주고 있다. 이들 충·방전 곡선의 전압은 표준산태에서 매우 느린 - 89 - 전기화학 속도로 전류를 흘려주면서 측정한 것으로써 동시에 주기적으로 전류를 인가하지 않고 평형상태에 접근하였을 때의 개방회로 전압을 측정한 것이다. 이와 같이, 전 류펄스에 따른 전압전이를 통하여 실질적인 충·방전반응 하에서의 각각의 전압 과 개방회로 전압 간의 차이를 분극현상과 연관지어 해석할 수 있다. • 전류 전류는 단위시간당의 전하의 이동량을 뜻하므로 전극에서의 전기화학 반응속도 와 밀접한 관계를 가진다. 전극반응의 속도는 전해질에서 전극으로의 물질전달, 전극 활물질 표면에서의 전자전달 반응 등에 의해 결정된다. 전극에서 가역반응을 나타내는 반응물 O 및 생성물 R에 관한 전기화학 반응식은 식 (14)로 나타낼 수 있는데, 전류 반응속도 간의 상호관계는 식 (15) 및 (16)에 나타난 바와 같은 Nernst 식으로 주어진다. O + ne (14) (15) (16) 여기서 νf 및 νb 는 전극에서의 정반응 및 역반응의 반응속도를 의미하며 kf 및 kb 는 각 반응의 속도상수를 나타낸다. 또한 Co 및 CR는 산화성분 및 환원성 분의 농도로서 Co(x, t)는 시간 t 및 전극표면으로부터의 거리 에서의 산화성분 농도를 뜻하며 ic 및 ia는 각각 환원 및 산화에 관한 전류를 나타낸다. 그리고 n, F, A는 반응에 기여하는 전자의 몰수, Faraday 상수, 전극의 표면적에 해당된다. 전극에서의 순수(net) 반응속도는 정반응과 역반응의 반응속도의 차이로서 다음 과 같은 식으로 표시할 수 있다. - 90 - (17) 화학공학기초실험 2 즉, 전극에서 생성되는 전류는 순수 반응속도에 의해 영향을 받는다. 만약 전극 에서의 반응이 평형상태에 이르게 되면 정반응 속도 및 역반응 속도가 동일하게 됨으로써 순수 반응속도 νnet는 0이 되어 전류의 생성이 중지된다. • 분극 분극(polarization)이라 함은 전극전위 값이 평형상태에서 과하거나 부족하게 되는 현상을 의미한다. 전지에서 반응이 진행될 때는 각 전지구성 요소에서 일어나는 전하 이동과정이 같은 속도로 일어나지 않으므로 어는 특정 과정의 전하 이동과 정이 상대적으로 늦어지는 경우 이것이 전지의 전제 반응에 대한 속도제한과정 (rate limiting process)이 된다. 따라서 전지의 양 단자 사이에 전류가 흐르게 되 면, 양 단자 사이에서 측정되는 전압 E는 항상 평형전압(Eeq, equilibrium)보다 크 거나(충전시) 작게(방전시) 나타난다. 이때 양 단자 사이에서 측정되는 전압과 평 형전압의 차이를 과전압(overpotential)이라 하며, 실제 분극의 정도를 측정하는 방 법이 된다. 즉, 측정전압(E), 평형전압(Eeq) 및 과전압(n) 간의 관계는 다음 식으로 나타낼 수 있다. 그림 8. 충.방전 시간 증가에 따른 분극 곡선 (18) 여기서 분극은 그림 8에 나타낸 바와 같이 크게 세 가지로 분류되는데, iR 강하로 표현되는 ohmic 분극과 주로 전극 특성과 관련된 활성화 분극(activation polarization) 및 농도 분극(concentration polarization)으로 구분한다. 여기서 iR 강하는 전극 반응과 관련된 저항이 아니라 전해액 내의 특성이다. 특 - 91 - 전기화학 히, iR 강하는 전류밀도에 비례해서 증가함으로, 내부저항을 최소화해야만 고전류 밀도 구동시 작동전압이 크게 떨어지는 것을 막을 수 있다. 반면, 활성화 분극은 전극의 특성과 밀접한 관련이 있는 것으로, 이는 활물질 종 류에 따른 원천적인 (inherent) 요소로서, 온도 등에 의해서 크게 영향을 받는다. 반면, 활물질 표면에서의 반응물질의 농도 구배(concentration gradient)에 의한 것 을 농도 분극으로 구분한다. 그러나, 실제 전지에서는 이러한 요소들이 혼재되어 나타나기 때문에 명확히 구분하는 것이 쉽지 않다. 전지의 특성 • 용량(capacity) 전지 용량이란 주어진 방전 조건하에서 전지를 완전히 방전시켰을 때 얻을 수 있는 전하량으로서 전류와 시간의 곱으로 나타낸다. 전지의 이론 용량(CT, theoretical capacity)은 전지의 활물질의 양에 의해 결정되며, 다음 식으로 계산한 다. (19) 여기에서, F는 Faraday 상수를 나타내며, 는 전지가 완전히 방전되는 동안 반 응으로부터 생성되는 전지의 몰수를 나타낸다. 실제 용량 (Cp, practical capacity) 은 반응물이 방전반응에 100% 참여하지 못하기 때문에 이론 용량보다 작은 값을 나타나며 충·방전 속도가 증가함에 따라 iR강하 때문에 더욱 감소한다. 일반적으로 전지의 충·방전 속도를 표시할 때 C rate를 자주 사용한다. 전지 용 량과 충 방전 전류 사이에는 다음과 같은 관계가 주어진다. (20) 여기에서 h는 전지의 용량을 완전히 방전(또는 충전)하는데 걸리는 시간(hour), 는 충·방전 전류(A), 그리고 Cp는 전지의 용량(Ah)이다. 이때 값의 역수를 C rate로 정의한다. 다시 말하면 C 값이 클수록 충전 또는 방전을 시키는데 소요되 는 시간이 짧아지는 것을 의미하게 된다. 전지나 전극의 용량을 나타낼 때에는 전극의 단위 무게당 용량(gravimetric - 92 - 화학공학기초실험 2 specific capacity, Ah/kg)이나, 단위 부피당 용량(volumetric specific capacity, Ah/L, mAh/cm3)을 사용하여 서로 비교하기가 용이해진다. • 에너지 밀도 에너지밀도는 전지나 전극의 성능을 결정하는 매우 중요한 인자로서 단위 무게 나 부피로부터 얻어질 수 있는 에너지를 나타낸다. 전지 반응에서 1 몰의 반응물 로부터 얻을 수 있는 에너지의 최대 값은 다음 식으로 주어진다. (21) 여기에서, E는 전지의 기전력, 는 1 몰의 전지 반응에 대한 이론적 에너지(단 위: Wh, 1Wh = 3600 J)를 나타낸다. 또한, 1 몰의 반응물로부터 얻을 수 있는 실제의 에너지( )는 다음과 같으며, 전 지를 방전시키는 방법에 따라 다르게 나타난다. (22) 전지의 방전 속도, 즉 단위 시간당 방전 전류가 증가함에 따라 전지의 전압은 점차 평형 전압으로부터 벗어나게 된다. 용량의 경우와 마찬가지로 에너지 밀도도 단위 무게를 기준으로 할 경우 Wh/kg, mWh/g, 단위 부티 경우에는 Wh/L, mWh/cm3 등으로 표시할 수 있다. • 출력(power) 전지의 출력은 단위사간 당 생산할 수 있는 에너지를 뜻한다. 즉 출력(P)은 전 류(i)와 전지 전압(E)의 곱으로 나타낼 수 있다. (23) × 전지의 출력은 주어진 전압에서 얼마나 큰 전류를 흘려줄 수 있는가에 대한 척 도가 되기도 한다. 일반적으로 전류가 증가할 때 전지로부터 얻을 수 있는 출력은 - 93 - 전기화학 초기에는 증가하다가 최고값에 도달한 후 감소하는 경향을 보이는데, 이는 분극 현상과 관련된 것으로서 전류가 특정 값 이상으로 증가하면 전지 전압이 감소하 기 때문이며 주어진 전압 범위에서 얻을 수 있는 용량도 감소하게 된다. 이러한 분극 현상은 반응물질인 리튬이온의 확산속도 및 전지 내부 저항과 관련되기 때 문에 전지의 출력 특성을 향상시키기 위해서는 이온의 확산속도 및 전기 전도도 특성을 향상시키는 것이 필요하다. 출력도 용량이나 에너지의 경우와 마찬가지로 단위 무게나 부피를 기준으로 하는 출력 밀도(power density)로 나타낼 수 있다. • 충·방전 수명(cycle life) 일반적으로 충·방전 수명이란 일정 용량 이상의 성능을 구현할 수 있는 전지의 충·방전 횟수를 지칭하며 오앤 충·방전 싸이클 후에도 전지의 용량이 크게 감 소하지 않고 그대로 유지되는 것이 필요하다. 리튬이차전지의 수명은 반복되는 충·방전 과정에서의 양극 및 음극 활물질의 구조 안정성에 크게 좌우된다. 비가 역 용량은 방전 과정 동안 이미 충전된 전하량 중에서 방전되지 못한 전하량을 나타내는 것으로서 일반적으로 초기 충·방전 싸이클 이후에 큰 값을 보이며 이 는 주로 전극와 전해질 계면에 형성되는 새로운 층(layer)에 의해 야기된다. N회 충·방전 싸이클 진행 후 용량 유지율은 CN/C1(%)으로 주어지며, 상대적인 용량 감소는 (C1-CN)/C1 으로 나타낸다. 여기서 CN 및 C1은 N회 및 1회 충·방 전 후의 용량을 각각 일컫는다. 일반적으로 충·방전 수명은 방전 깊이(depth of discharge)에 의해 영향을 받으며, 이는 전지의 종류에 따라 딸라지며 일반적으로 리튬전지에서는 얕은 방전(low depth of discharge)상태에서 충전이 반복될 때, 즉 용량을 완전히 소모하기 전에 방전을 끝내고 다시 충전시킬 때 더 긴 충·방전 수명을 나타낸다. • 방전 곡선(discharge curves) 전지의 방전 곡선은 충·방전이 반복적으로 계속됨에 다라 방전특성이 변하게 되는데 방전 조건, 측정하고자 하는 전기적 성질의 종류나 측정 변수 등에 따라 매우 다양한 형태로 나타난다. 일반적인 방전 조건으로는 일정 전류, 일정 출력 일정 외부저항 등이 있다. 측정하고자 하는 전기적 성질에는 전지전압, 전류, 출 력 등이 있고 측정 변수에는 방전시간, 용량, 리튬이온 점유율 등이 있다. 위의 - 94 - 화학공학기초실험 2 경우만 고려해도 1개의 전지로부터 다양한 방전 곡선의 형태는 전지의 구성 요소 에 따라 다양하며, 전형적인 방전 곡선의 형태를 그림 8에 나타내었다. 그림 9. LiFePO4의 방전곡선 형태. 그림 9는 전지를 일정한 전류로 방전할 때의 전지전압의 변화를 용량의 함수로 도시한 것이다. 일정한 전류 인가 조건에서는 용량은 전류의 인가 시간에 비례하 므로 그림 9는 전류의 인가시간에 따른 전압의 변화를 의미한다. 또, 전지 전압은 부하(load)가 연결되지 않았을 때는 개방회로 전압을 나타내며, 부하가 연결되어 작동할 때는 작동전압을 나타낸다. 방전이 종료되는 시점의 전지 전압을 종지전압 이라 한다. 그림 9에서 곡선 I은 방전이 진행되는 동안 전지내의 반응이 전지전압에 거의 영 향을 미치지 않은 경우이고, 곡선 Ⅱ는 방전이 진행되는 동안 전지내의 반응 메커 니즘이 변화되어 2개의 평탄 영역을 나타내는 경우이다. 곡선 Ⅲ은 방전이 진행되 는 동안 반응물질과 생성물질의 조성 및 전지의 내부저항 등이 계속 변화하는 경 우이다. - 95 - 전기화학 리튬이차전지의 경우, 충·방전 후의 전지전압의 변화는 아래의 Armand식으로 해석된다. (24) ln 식 (24)에서 는 리튬이온 점유율, 는 intercalation된 리튬이온 사이의 상호작용 이 전지전압에 미치는 영향을 나타낸다. 이때 용량 변화에 따른 전지 전압의 기울 기 변화는 전극에서의 리튬이온 확산 속도, 상전이, 결정구조 변화 및 용해 등의 직접적인 요인과 양극 활물질의 입자 크기 및 온도, 전해질 특성, 분리막의 기공 등 추가적인 요인에 의하여 결정된다. 이러한 요인들에 따라 Armand식의 y와 k 값이 변화될 수 있다. 전지가 방전 과정에서 전류 밀도가 매우 낮을 경우에는 작동 전지의 전압은 이 론적 평형 전압에 근접하여 방전 용량 또한 이론 용량에 가까운 값을 나타낸다. 그러나 그림 10에서 보는 바와 같이 ①에서 ④로의 방향, 즉 방전전류가 증가함에 따라 iR 강하 및 분극에 따른 과전압이 증가하여 방전이 진행되는 동안 전지전압 이 감소하고, 방전 곡선의 경사도가 증가하여 주어진 종지전압까지 방전하는 경우 에는 결과적으로 전지 용량이 감소한다. 이러한 방전 전압의 특성은 온도에 따라 서도 크게 변한다. 그림 10. 전지전압에 대한 전류밀도 영향 - 96 - 화학공학기초실험 2 그림 11. 전지용량에 대한 온도영향. 그림 11에 보는 바와 같이 전지가 낮은 온도에서 방전될 경우에는 전지내의 반 응에 참여하는 성분들의 화학적 활동도(chemical activity)가 감소하여 전지의 내부 저항이 증가하며, 이로 인해 전지 전압의 급격한 강하와 함께 용량의 감소를 초래 하게 된다. 온도가 증가하면 내부 저항이 감소하고 방전 전압 영역이 증가하여 용 량의 증가를 가져오게 된다. 그러나 온도가 너무 높으면 화학적 활동도가 증가하 여 방전(self-discharge)을 포한함 원하지 않은 종류의 부가적인 화학적 반응을 일 으킬 수 있다. - 97 - 전기화학 3. 리튬 이차전지용 주요 소재 리튬이차 전지는 양극, 음극, 전해질, 분리막 그리고 집전체와 케이스로 이루어 져 있다. 1) 양극활물질 양극을 이루는 양극활물질은 리튬이온이차전지의 원가에서 가장 큰 비중인 약 30%를 차지한다. 또한 전지의 용량, 구동전압 등의 특성에 가장 큰 영향을 미치는 물질이다. 현재 상용화되어 사용되고 있는 대표적인 양극활물질로 LiCoO2, LiNi1/3Co1/3Mn1/3O2, LiNi0.5Co0.3Mn0.2O2, LiMn2O4, LiFePO4가 있으며, 이들의 특징을 표 1.에 정리하였다. 표 1. 양극활물질의 특성 LiCoO2 Li(Ni1/3Co1/3Mn1/3)O2 LiMn2O4 LiFePO4 구조 층상 층상 스피넬 올리빈 이론 용량 274mAh/g 285mAh/g 148mAh/g 170mAh/g 가용 용량 145mAh/g 170mAh/g 120mAh/g 150mAh/g 3.7V 3.6V 4.1V 3.4V 가용전압 (Li/Li+vs.) 장 점 단 점 • 높은 전기전도도 • 합성이 쉬움 • 가격 고가, 독성 • 열적 불안정 • 높은 용량 • 가격 저렴 • 열적 안정성 • 합성이 어려움 • 가격이 저렴 • 독성이 없음 • 열적안정성 • 가격 저렴 • 독성이 없음 • 망간 용출 • 낮은 전기전도도 • 적은 방전 용량 • 낮은 에너지밀도 LiCoO2는 매우 우수한 양극 활물질로 LIB가 Ni-MH를 대신하여 이차전지의 왕 자가 되는데 크게 공헌하였다. 그러나 구성 원소의 하나인 코발트는 희토류로 매 장량이 적을 뿐만 아니라 생산지가 일부 국가에 편재되어 있어 수요가 늘어남에 따라서 공급면에서 불안정할 것이라는 인식이 있었으며, 실제로 2000년대 중반부 터 가격이 폭등하였다. 따라서 코발트를 사용하지 않거나 적게 사용한 양극활물질 개발이 활발히 진행되었으며, 그 중에서 LiCoO2와 같은 층상구조를 가지는 것의 하나로 LiNi1/3Co1/3Mn1/3O2가 개발되었다. - 98 - 화학공학기초실험 2 2) 음극활물질 리튬 이온전지가 개발되기 전에는 리튬 금속을 음극으로 사용한 리튬이차전지가 개발되었었다. 리튬 금속의 부피당 이론용량은 2062mAh/cc로 매우 높아, 부피당 이론용량이 855mAh/cc인 탄소를 음극활물질로 사용하는 LIB보다 고용량의 전지를 만들 수 있는 장점이 있다. 그러나 리튬이차전지는 충방전을 할 때마다 새로운 리 튬 금속이 음극 표면에 불균일하게 석출하여 수지상(dendrite)를 형성하고, 새로이 석출된 리튬은 전해질을 또 다시 분해시키고 불균일한 표면피막을 형성하기 때문 에 싸이클 특성이 급격히 감소할 뿐만 아니라 성장한 수지상이 분리막을 뚫고 내 부 단락을 일으키는 등의 문제가 발생하기 때문에 거의 사용되지 않고 있다. 리튬 금속이 가지는 문제점은 흑연이 리튬 이온을 반복적으로 삽입/탈리할 수 있다는 것을 알아내면서 해결되었다. 특히 리튬이 삽입된 탄소는 리튬 금속과 거 의 같은 전기화학 반응 전위를 가지기 때문에 전지 전압 손실이 거의 없으며, 또 한 탄소는 리튬이 삽입/탈리할 때 부피변화가 작기 때문에 여러 번 충방전을 반 복하여도 결정구조의 변화가 적어 싸이클 수명이 우수한 전지를 만들 수 있게 하 였다. 3) 전해질 전해질은 리튬이온이 두 개의 전극을 왕복하는 통로로, 리튬염과 용매로 되어 있다. 전극 반응은 리튬이온과 전자가 항상 동시에 움직인다. 그러므로 전극재료 와 전해질재료의 계면에서 전극 내의 전자와 리튬이온이 만나거나 헤어져야 반응 이 일어난다. 전자의 이동은 물리적 현상으로 반응 없이 매우 빠르게 일어남으로 대부분의 경우 전극반응의 속도를 결정하는 것은 리튬이온의 이동속도이다. 전해 질은 리튬이온의 이동뿐만 아니라 전지의 수명과 안전성에도 매우 중요한 역할을 하고 있으며, 높은 이온전도성, 전기화학적 안정성, 화학적 안정성, 열적 안정성, 환경친화성 등의 특성이 요구된다. 현재 대부분의 리튬이온이차전지에서는 LiPF6 를 리튬염으로 사용하고 용매로는 리튬염의 용해도와 온도에 따른 전해액의 점도 및 안전성을 고려하여 EC(ethyl carbonate), DMC(dimethyl carbonate), DEC(diethyl carbonate), EMC(ethylmethyl carbonate)등을 특정 비율로 혼합하여 사용하고 있다. - 99 - 전기화학 4) 분리막 리튬이온이차전지용 분리막은 양극과 음극이 접촉하여 전자가 직접 전달되는 단 락 현상이 일어나는 것을 방지하고 리튬이온은 원활하게 이동할 수 있게 하는 역 할을 한다. 또한 분리막은 전지의 단락에 의한 이상전류, 급격한 내압 및 온도 상 승, 발화 등을 방지하는 역할이 추가적으로 요구되고 있다. 현재 두께 25㎛내외의 미세 기공을 가진 다공성 PE(poly ethylene)과 PC(poly carbonate)계 수지가 주로 사용되고 있다. 5) 바인더 활물질 분말과 도전제 분말을 결착시켜 집전체인 금속 집전체에 고정시키는 역 할을 수행한다. 바인더는 기본적으로 절연체이며 전극의 구조를 유지시켜 준다. 일반적으로 고분자 소재를 사용하며, Polyvinylidene difluoride (PVDF)가 가장 보 편적인 바인더이다. - 상용전지: 대부분 PVDF를 사용한다. • 바인더의 요구특성 - 전해질에 용해되지 않으면서 결착력을 유지해야 한다. - 합제 슬러리의 코팅 공정성(적절한 점도 및 분산성)이 좋아야 한다. - 내열성이 높아야 한다. - 내산화성이 높아야 한다. • 바인더 개발 방향 - 고 용량화 및 고 출력화를 위해 바인더 사용량을 감소시키는 방향 (고결착력 바인더, 분자량이 높은 바인더 등을 적용) - 바인더의 결착력 및 안정성을 높여 전지의 장수명화 - 음극에서 효율개선을 위해 음극 활물질의 표면을 잘 감싸면서도 안정한 바인더 의 개발 - 부피팽창이 큰 전극재료의 수명을 향상시키기 위한 고결착력, 고탄성 바인더의 개발 - 100 - 화학공학기초실험 2 ① PVDF 바인더 PVDF는 카보네이트류, 에스테르류, 락톤류 등의 유기용매에는 거의 용해되지 않 고, DMAc(dimethylacetate)나 NMP에 잘 용해된다. PVDF의 물리화학적 특성은 아래와 같다. - 유리전이온도(Tg):-35oC - 녹는점(Tm):175oC - 결정화 온도(Tc):142oC PVDF는 아래와 같은 다른 고분자와 공중합체를 만들어 사용하기도 한다. - HFP (hexafluoropropylene) - CTFE (chlorotrifluoroethylene) Kureha KF1100은 분자량은 280,000 g/mol 이고, 가장 많이 사용되고 있다. Kureha KF1300은 KF1100 다음으로 널리 사용되고 있고, 특성은 KF1100과 유사하다. 분자 량은 350,000 g/mol 이다. 고분자 결정성은 공중합체 고분자 구조에 따라 달라진 다. PVDF-HFP 공중합체의 경우, 고분자 사슬의 적층(packing)이 어려워지면서 결 정성이 떨어진다. PVDF에 functional group을 도입하여 결착력 향상을 향상시키기 도 한다. 작용기가 도입된 KF9000 계열 바인더는 음극의 부피변화 억제를 위해 많이 사용된다. ② SBR 바인더 SBR 바인더는 PVDF 등과 같이 불소함유 바인더를 사용할 때 발생할 수 있는 문 제점을제거할 수 있으며, 또한 극판과의 접착력도 불소함유 바인더보다 우수하다. 따라서, SBR 바인더를 사용하면 환경 및 설비상의 단점을 극복할 수 있다. 또한 바인더 함량을 낮출 수 있어서 합제 내 활물질의 함량을 증가시켜 전지의 용량을 증대시킬 수 있다. - 101 - 전기화학 수계 바인더인 SBR (styrene-butadiene rubber)의 경우 물에 suspension으로 미립 자가 분산된 형태로 슬러리 제조 시에 점도가 매우 낮아서 믹싱과 코팅의 진행이 이루어지지 않으므로 증점제인 CMC (carboxy methyl cellulose)를 함께 사용한다. SBR 바인더는 물이 용매인 반면에, PVDF 바인더는 NMP를 용매로 사용한다. 따 라서, SBR 바인더를 사용하게 되면 극판 내 물의 함량을 최대한 낮추는 것이 관 건이 된다. PVDF 바인더를 기본적으로 SBR 바인더보다 더 많은 양을 사용해야 하기 때문에 나노 활물질에는 적합하지 않다. ６）도전제 합제 전극 내에 전자전도 채널을 형성함으로써 전기 전도도를 향상시키는 목적 으로 소량 첨가하는 미세 탄소 분말을 도전제 (conducting agent)라 한다. 도전제 로 주로 탄소계 물질이 사용되어 왔다. 표 2는 몇 가지 도전제의 특성을 비교 정 리한 것이다. 현재 가장 널리 사용되고 있는 도전제는 탄소블랙 류이다. 표 2. - 102 - 화학공학기초실험 2 1-8. 집전체 합제 슬러리는 금속 호일에 도포하여 극판을 제조하게 되는데 이때 사용되는 금 속 호일을 집전체라고 한다. 집전체는 박막 극판을 제조하는데 중요한 구성요소이 며, 활물질에서 전기화학 반응이 일어나도록 전자를 외부에서 전달하거나 또는 활 물질에서 전자를 받아 외부로 흘려 보내는 통로 역할을 한다. 리튬이차전지에서는 양극에는 Al, 음극에는 Cu 집전체를 사용한다. 집전체의 두 께는 통상 10~20㎛ 정도이다. 권취 공정을 통해 합제가 코팅이 되기 때문에 집전 체의 장력이 어느 정도 있어야 하므로 집전체의 두께를 너무 얇게 할 수는 없다. 알루미늄 집전체를 양극에 사용하는 이유는 다음과 같다. - 알루미늄의 전기화학적 안정성이 양극활물질의 전극반응 전위영역 에서 높기 때문이다. - 가격이 싸기 때문이다. 구리 집전체를 음극에 사용하는 이유는 다음과 같다. - 탄소전극의 작동 범위에서 전기화학적으로 비활성인 금속은 니켈과 구리 등이 다. 니켈의 경우 가격이 비싸기 때문에 가격적으로 유리한 구리가 실제 사용된다. 7) 합제전극 전지의 전극에서 진행하는 전기화학 반응은 전자 전도체와 이온 전도체가 접촉 하는 계면에서 진행한다. 이 반응을 빠르게 하기 위해서는 반응 속도를 크게 하는 것이 바람직하다. 금속의 석출·용해 반응은 그 반응 속도가 크지만, 다른 전극의 - 103 - 전기화학 경우에는 반응 자체의 속도가 느린 경우가 많다. 이와 같은 경우에는 다공성 전극 과 같은 구조로 제조하여 접촉계면을 증대시킨다. 즉, 입경이 작은 분말을 활물질 로 이용하여 이것을 집전체 위에 도포하여 다공성 전극의 형태로 하여 전극 표면 적을 비약적으로 증대시킨다. 이때 접촉 저항을 포함하여 전자 전도성이 낮은 활 물질의 경우에는 저항이 커지고, 충방전할 때에 전위 분포가 생겨 분말 활물질의 이용률이 낮아진다. 이것을 피하기 위하여 탄소재료 등을 도전제로서 첨가한다. 또한 분말을 안정되게 도포하기 위하여 안정한 고분자를 결착제(바인더)로서 이용 한다. 활물질과 도전제 분말과 결착제를 유기용매로 섞어서 반죽한 것을 전극 합 제라 한다. 이 합제를 금속박과 금속 메쉬 등의 집전체 위에 도포하여 합제 전극 을 제조한다. 4. 리튬이자전지의 전기화학 특성 분석 리튬이차전지의 용량, 작동 전압을 측정 및 평가하기 위해서는 여러가지 방법이 사용될 수 있는데 가장 많이 사용하는 방법은 전류를 일정하게 흘려주어 전압의 변화를 측정하는 정전류 충방전법(galvanostatic charge-discharge)과 순환전압 주 사법(cyclic voltammetry, CV) 등이 있다. 1) 순환 전압-전류법(CV)에 의한 리튬 이온전지의 산화-환원 측정 순환 전압-전류법(Cyclic Voltammetry: CV)은 전기 화학적으로 활성이 있는 화 학종의 산화-환원 거동을 연구하는 데 가장 널리 사용되는 전기 분석법의 하나로, 측정이 용이하고 간단하며 응용 법위가 넓다는 장점을 인해 여러 분야에서 이용 되고 있다. 순환 전압-전류법에서는 젓지 않는 용액에 들어 있는 작업 전극 (Working Electrode: WE)에 칼로멜 전극 또는 은-염화 은 전극과 같은 기준 전극 (Reference Electrode: RE)을 이용하여 그림 1과 같은 삼각파 모양의 전압을 가하 고, 이 때 흐르는 전류를 측정함으로써 그림 2와 같은 순환 전압-전류 곡선(Cyclic Voltammogram)을 얻게 된다. 순환 전압-전류법은 전지를 특정 전압 영역에 대해 단위 시간당 일정 전압으 로 주사하여, 지정된 전압 영역에서 한계까지 도달할 경우 주사 방향을 반대반향 으로 바꿔서 주사하여 전압의 변화에 따라 전류를 측정하는 전기화학 분석방법이 다. 이러한 결과 그림 2와 같이 순환하는 파형의 그래프를 얻을 수 있다. - 104 - 화학공학기초실험 2 이러한 CV법은 정전류 충방전과는 다르게 전압을 조절하여 그에 따른 전류를 측정하는 방법이므로 측정 시간이 짧다는 장점을 가지나, 반응속도의 조절이 어려 우므로 전지 반응의 관찰에는 적합하지 않은 단점을 지닌다. 같은 조건으로 지정하여 수 회의 사이클을 반복하면 전지의 내부에서 산화･환 원반응의 전압, 전기량, 가역성, 지속성 등에 대한 정보를 얻을 수 있다. 또한 주 사 속도를 변화시켜 속도에 따른 산화･환원 특성을 확인하여 속도에 따른 결과를 얻을 수 있다. 그림 3은 mesoporous carbon-Si 복합재를 0.5~2.3 V 전압 범위에서 0.2 mV/s로 주사한 결과이며 첫 번째 사이클과 5번째 사이클 결과를 비교한 결과 이다. 그림 1. 순환 전압-전류 곡선에 이용되는 파형. 그림 2. 셀에 대한 순환 전압-전류 곡선. 그림 2에서 Epc와 Epa는 각각 환원 봉우리 전압 및 산화 봉우리 전압이며, ipc와 ipa는 각각 환원 봉우리 전류와 산화 봉우리 전류이다. 가역 반응의 경우 25℃에서 봉우리 전위 차이(ΔEp)는 식 1과 같다. ∆ (1) 환원 전류의 크기는 화학종의 농도 및 주사 속도에 영향을 받으며, 환원 봉우리 의 전류( )는 시료의 농도( )와 주사 속도( )의 제곱근에 비례한다. 25℃에서 는 식 3과 같이 나타낸다. - 105 - 전기화학 × 화합물 몰당 이동한 전자의 수 전극 표면적 시료의 농도 확산 계수 주사 속도 (2) 전압을 변화시키면서 그에 따라 발생하는 전류를 측정하는데 이를 통해 전압전류도를 작성하여 전해 전위로 분석 물질을 정성하고 그때의 전류 값으로 농도 를 정량 할수 있습니다. CV 커브는 총 4개의 구간으로 이뤄져있다. ① 양극 전류의 증가 ② 양극 전류의 감소 - 106 - 화학공학기초실험 2 ③ 음극 전류의 증가 ④ 음극 전류의 감소 그림 3. 여러 사이클에서 순환 전압-전류 곡선 각각의 4개 구간은 1 사이클인 CV로 표현되며, 따라서 여러 싸이클을 비교할 - 107 - 전기화학 수 있고 다른 변수를 바꿔가면서 전압전류를 비교할 수 있다. 이때 y축인 전류의 피크가 생기는 이유는 과전압 증가와 동시에 반응 양의 증가로 인해 전류가 크게 되는 효과와 시간이 지남에 따라 전극 주위의 반응 양 감소로 전류가 작게 되는 효과에 의해 생겨난다. 즉 전위(전압)을 anode 쪽으로 주사하면, 과전압 증대에 따 라 산화속도는 증가하면서 전류가 커지게되고 전류의 증가는 표면에 있어서 R의 감소를 가져다주어 결국 전류가 0이 된다. 이후 전류는 확산 지배 영역이 된다. 2) 정전류 시험법 정전류 시험법은 일정 전류(galvanostatic)를 인가하여 시간에 따른 전압의 변화 를 측정하여 특성을 확인하는 방법이다. 이때 변화하는 전압의 범위를 제어하여 연속적인 충･방전 실험을 통해 측정이 가능하다. 그림 1에서는 충전상태의 리튬이차전지를 정전류를 이용한 방전을 통해 측정되 는 전압 및 용량을 그림으로 나타내었다. 이 그림에서 보듯이 방전방향의 전류를 일정하게 흘려주는 경우 전지의 전압이 감소하고 전압 감소가 특정의 전압 (cut-off voltage) 이하일 경우 방전을 중단하게 되며 이 시간 동안 방전된 양으로 부터 용량(capacity)를 측정하게 된다. 통상적으로 방전전압의 경우 3 V정도까지만 측정하여 과방전(over-discharge) 에 의한 전극 물질의 손상을 막게 된다. 또한 충전의 경우에는 전지의 전압이 올 라가게 되며 전해질 분해 및 전극 물질 안정성을 위하여 4.3 V이하의 전압을 주 로 이용하게 된다. 그림 1. 리튬이차전지에서 양극과 음극의 전위차 설명. - 108 - 화학공학기초실험 2 그림 2. 전지에서의 정전류 방전을 통한 전압 및 용량의 측정. 통상적으로 리튬이차전지의 전극 물질의 경우 반쪽 전지(half-cell) 을 제작하여 각각 전극 물질의 특성을 평가하게 되는데 음극(혹은 양극)과 리튬메탈과의 반쪽 전지를 통해 정전류 충방전을 수행하여 용량 및 전압등을 평가하게 된다. 그림 3 은 흑연계 음극재료를 0~2.5 V로 전압의 범위를 설정하여 실험한 결과로 연속적 인 싸이클을 진행하는 동안 일정한 모양의 가역적인 결과를 확인할 수 있다. 이러 한 결과를 통해 각 사이클 별 충전 용량과 방전 용량 그리고 효율을 측정할 수 있다. 그림 3. 정전류 시험법을 적용한 측정한 흑연(graphite) 음극의 충,방전 곡선 그림 4. 정전류/정전압 실험법. - 109 - 전기화학 PART Ⅱ/Ⅲ. 2차 전지의 충·방전 실험 준비물 시약 FeCl2·4H2O, FeCl3·6H2O, NaOH, N-Methylpyrrolidone, Lithium hexafluorophosphate solution (in ethylene carbonate and ethyl methyl carbonate, 1.0 M LiPF6 in EC/EMC=50/50 (v/v), battery grade (Aldrich) Green Alternative), Super-P, Poly(acrylic acid) 30% in H2O 기구 및 장비 충·방전기(Channel Battery Analyzer/0.02-10mA, upto 5V, model : BST8-MA), 임피던스 측정기 산화철 나노입자 제조 실험 방법 1) 0.003mol(0.594g)의 FeCl2·4H2O (198.81g/mol), 0.006mol(1.622g)의 FeCl3·6H2O (270.30g/mol)과 증류수 20ml를 250ml비커에 넣고 유리막대로 교반한다. 2) 이 혼합물에 열을 가하여 80℃에서 5분간 유지시키며 천천히 교반한다. 3) 위 용액에 2N-NaOH 수용액(8g/100ml) 12.5ml를 뷰렛으로 10~20분간 천천히 첨가한다. 처음에는 갈색 침전물이 생기다가, 검은색 침전물이 형성된다. FeCl2 + 2FeCl3 + 8NaOH -> Fe3O4 +8NaCl +4H2O 4) 이때 교반을 멈추고 천천히 식히며 침전물을 가라앉히도록 한다. 침전물의 손실을 최소화하기 위해 충분한 시간을 들여 맑은 물 층이 조심스럽게 제거되 도록 한다. 자석을 사용하면 침전물을 빠르게 가라앉힐 수 있다. 5) pH가 7에 가깝게 DI water로 세척 후 침전물을 여과시킨다. 마지막은 에탄올 로 세척한다. 6) 진공건조기에서 80℃에서 2-12시간 건조한다. - 110 - 화학공학기초실험 2 극판제조 실험 방법 1) 아게이트 막자사발에 80℃이상에서 건조된 산화철 나노입자 0.2g과 도전제 (Super-P) 0.025g을 5분 이상 잘 혼합한다. (산화철 나노입자 : 바인더 : 도전제 =8:1:1, 무게비) 2) 위 혼합물에 PAA [poly(acrylic acid)] 17.5%짜리 0.143g(고형분 0.025g)과 증류 수 0.25g을 1ml 주사기를 사용하여 넣는다. 최종 고형분 함량 : 40.45% 3) 유리판을 isopropyl alcohol(IPA)을 이용하여 잘 닦는다. 그 위에 구리 호일 (80mm*80mm)을 올린 후 IPA로 호일을 잘 닦는다. 4) 호일 위에 테이프를 붙이고, 슬러리를 주사기 이용하여 테이프 사이에 흘려 준다. 자를 이용하여 잘 도포한다. 5) 만들어진 극판은 증류수 제거를 위해 80℃에서 한 시간 건조 후, 120℃에서 24시간동안 진공건조한다. 코인셀 조립 실험 방법 참고영상 : https://www.youtube.com/watch?v=OV4iGUrdysg https://www.youtube.com/watch?v=pm1yzlwaWAU https://www.youtube.com/watch?v=40DEWHrb-EU - 111 - 전기화학 전지의 성능평가 1) 충·방전 1) 위의 그림과 같이 충·방전 장치에 연결한다. 2) 본체의 11번과 15번 전원을 켠다. 3) 모니터의 TC5.3프로그램을 실행시킨다. 4) 집게 등을 이용하여 전지를 연결한다. 음극 (빨간색 선), 양극 (검은색 선) 5) 11번 8개, 15번 8개 프로그램 중 전지를 연결한 프로그램에“Startup”을 실행 시킨다. 6) Step Set => CC 충전, CV 충전, CC 방전 전류량 조절하고 OK - 112 - 화학공학기초실험 2 7) OK를 누른 후, 화면에서 전압/전류/용량 확인가능함. 8) 실험이 실시되고 있는 마우스 오른쪽 버튼 클릭하여 “Open data”누르면, 현 재 측정데이터를 볼 수 있음. 9) 데이터 저장시 분석프로그램 메뉴창에서 File-Save As 누른 후, 파일명을 저장 - 113 - 전기화학 한다. 10) 충·방전속도 (C-rate)의 변화에 따른 충·방전 용량 실험 C-rate coincell 1 (5회) 2 (3회) 3 (2회) CC charge Voltage Current (V) 3.0 3.0 3.0 CV charge Voltage Current (mA) 0.2 0.4 0.6 (V) 3.0 3.0 3.0 (mA) 0.1 0.2 0.3 CC discharge Voltage Current (V) 0.5 0.5 0.5 (mA) 0.2 0.4 0.6 * Fe3O4 이론용량 (926mA/g) (참고논문 : 액중 전기선 폭발법을 이용한 Fe3O4/Fe/ 그래핀 나노복합체 분말의 제조 및 전기화학적 특성) * 1C : 926mA/h=926mA/3600s=0.257mv/s - 114 - 화학공학기초실험 2 실험시 주의사항 1. 전해액이 산화성이 높으므로 주의하여 다룬다. 2. 충·방전기가 켜져 있을 때, 손으로 만지지 않는다. 3. 전극은 수분에 취약하므로 데시케이터에 보관한다. - 115 - 전기화학 전지의 성능평가 2) 임피던스 측정 1) 기기 설치 (전원연결, PC와 기기는 아래 그림과 같이 usb케이블로 연결) 2) EIS(Electrochemical Impedance Spectroscopy)법에 의한 저항 측정 2-1) 코인셀을 키트에 올려놓고, 위 그림과 같이 전선을 연결한다. - 116 - 화학공학기초실험 2 2-2) SM 프로그램 실행=>Experiment(E)=>Techniques(T)선택 2-3) EIS package(EIS)=>Static frequency scanning=>Potentiostatic EIS 아래와 같은 창이 열리면, OPEN (EIS예제 파일 선택)=> Apply to CH => 실험파 일명 저장=> 스타트버튼 클릭 - 117 - 전기화학 2-4) EIS 분석 view EIS graph 버튼 선택=>Open data file 버튼 선택=>측정한 파일 선택=> Run ZMAN 버튼 선택 - 118 - 화학공학기초실험 2 - 119 - 전기화학 2-5) Add item 클릭=> 분석 :상위메뉴의 Analysis-Circular Fit 선택 - 120 - 화학공학기초실험 2 2-6) Nyquist 메뉴선택 => Rs 값 기록 2-7) 데이터 엑셀로 저장하는 법 : 표에 커서를 놓고 마우스오른쪽 버튼을 눌러 Export To Excell 선택하고 데이 터 저장한다. - 121 - 전기화학 전지의 성능평가 3) 순환전압주사법 1) 기기 설치 (전원연결, PC와 기기는 아래 그림과 같이 usb케이블로 연결)/EIS와 동일 장치임. 2) 순환전압주사법 - CV측정 2-1) 코인셀을 키트에 올려놓고, 위 그림과 같이 전선을 연결한다. - 122 - 화학공학기초실험 2 2-2) SM 프로그램 실행=>Experiment(E)=>Techniques(T)선택 2-3) Basic techniques=>Dynamic=>Cyclic colrammetry 아래와 같은 창이 열리면, OPEN (20181002-0.1mv.cv 예제 파일 선택)=> Apply to CH => 실험파일명 저장=> 스타트버튼 클릭 실험조건 : 3V~0.01V, 0.1mv/s, segment count 3 - 123 - 전기화학 2-4) CV 분석 view DC graph 버튼 선택=>Open data file 버튼 선택=>측정한 파일선택 =>Export to excel버튼 선택 - 124 - 화학공학기초실험 2 - 125 - 전기화학 - 126 - 화학공학기초실험 2 실험 보고서 전기화학 Ⅱ/Ⅲ - 충·방전 용량 학부 전공 학번 실험 조 : 실험 일자 : 담당 교수 : 담당 조교 : 1. 제작한 코인셀의 충·방전곡선을 각각 그리시오. 2. 사이클에 따른 충·방전 곡선을 각각 그리시오. - 127 - 성명 전기화학 3. 사이클에 따른 쿨롱 효율을 각각 그리시오. 4. 충·방전 속도에 따른 용량을 각각 나타내시오. 5. EIS 분석 : C-rate변화에 따른 충·방전 실험 전·후 의 Rs값을 분석하시오. 분석방법 충·방전 10회 측정 전 측정 후 C-rate 변화 측정 전 Rs - 128 - 측정 후 화학공학기초실험 2 고찰할 내용 (1) 합성된 산화철 나노입자의 제조확인을 위한 방법을 기술하시오. (2) 코인셀의 충·방전 용량변화에 영향을 미치는 요인을 기술하시오. (3) 충·방전실험 전, 후의 Rs값 변화에 대해 기술하시오. 참고 문헌 1. Iron oxide Nanoparticles, M. M. Raman, et al., 2011 2. Chem. Educ.,, P. Berer, et al., 76, 943, 1999 3. Colloids and Surfaces B: Biointerface, G. G. C. Arizaga., et al., 98, 63, 2012. 4. 무기화학실험, 노동윤, 2015. Keyword 음극 물질 - 129 -