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title: 25-27-28 Ago 2023; Appunti di biologia molecolare, parte 3
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25/08/2023 18:14:29
# Unità di trascrizione e le tre fasi di trascrizione
Unità di trascrizione = tratto di DNA che va dal promotore al terminatore espresso come singola molecola di DNA.
RNA polimerasi (ha forma di C) si lega sul DNA riconoscendo delle sequenze specifiche, chiamate promotore; lo si trova all'inizio del gene e contiene il nucleotide da cui parte la sintesi del RNA (detto TSS o sito +1), questa prosegue fino ad incontrare il terminatore.
Oltre al sito d'inizio (+1), prima dello stesso, troviamo nucleotidi indicati con numero negativo: di alta importanza sono -10 e -35, che sono due sequenze conservate nel promotore (queste sono dette sequenze upstream).
Quelle dopo il sito d'inizio sono con numeri positivi (downstream); quelle più vicine al +1, prossimali, quelle lontane, distali.
### RNA polimerasi trascrive solo uno dei due filamenti della doppia elica del DNA
Perché RNA polimerasi trascriva la molecola di DNA, ha bisogno di uno stampo ed utilizza uno solo dei due filamenti della doppia elica di DNA, perché sia accessibile è necessaria la creazione di una bolla di trascrizione, ossia che una regione del DNA venga a denaturarsi.
Nella bolla si possono identificare il DNA codificante (non usato come stampo) e DNA stampo (usato dalla polimerasi), la direzione di sintesi rimane sempre 5'-3' usando l'estremità 3'-OH libero per aggiungere il nuovo nucleotide con la sua base complementare a quella del DNA stampo.
RNA è complementare a quello stampo ed uguale a quello (salvo cambio T-U) al codificante.
La bolla si muove sempre assieme all'enzima, tant'è che la doppia elica si denatura e richiude man mano che la bolla avanza lungo il filamento di DNA.
RNA appena trascritto rimane solo per poco e poi si stacca.
La polimerasi si lega al promotore con un orientamento prefissato, così dallo stesso promotore si trascrive sempre lo stesso filamento di DNA.
In pratica ogni gene ha un orientamento specifico per la DNA polimerasi.
__Lo stampo di DNA per la sintesi di RNA__
Il codone d'inizio è ATG; il gene, il promotore e le sequenze di regolazione del DNA si scrivono come appaiono sul filamento codificante.
__Accoppiamento trascrizione/traduzione nei procarioti__
I procarioti fanno sia trascrizione che traduzione contemporaneamente; questo perché viene trascritto e rimane associato per un brevissimo periodo di tempo, diventanto perciò libero per venir tradotto dai ribosomi in proteine.
Negli eucarioti questo non avviene, perché bisogna prima maturare mRNA (coda poli-A, Cap 5' e rimozione introni).
### __Le fasi della trascrizione in procarioti ed eucarioti__
1. Inizio (ha vari sottostep)
2. ALlungamento
3. Fine __Inizio__
a. Per prima cosa il promotore deve essere riconosciuto dalla polimerasi, legandovisi, creando il #complesso chiuso#
b. Una volta che la RNA pol. è stabilmente legata al promotore si attuano diverse modifiche conformazionali dentro la polimerasi,che permettono l'apertura della bolla di trascrizione (lunga circa 13bp), detta anche #ComplessoAperto.
La bolla coinvolge la parte finale del promotore, incluso il sito d'inizio della trascrizione e delle sequenze a valle del sito d'inizio, detta #melting del promotore.
c. RNA polimerasi inizia a sintetizzare RNA senza distaccarsi e inizia a tentare di sintetizzare un RNA abbastanza lungo, che ibrida il DNA stampo e deve essere stabile, detto #InizioAbortivo: ossia prima di partire con la catena principale crea segmenti di 10bp, abbastanza stabile per creare questo ibridio stabile DNA-RNA, a cui segue poi la sintesi.
Questo serve perché la RNA polimerasi non usa #primer.
__Allungamento__
DNA si apre nella direzione di sintesi e si richiude alle sue spalle in modo da mantenere la bolla di lunghezza costante.
#RNAPol. ha diverse funzioni:
a. Sintetizza RNA.
b. Separa due filamenti di DNA a valle e li riavvolge a monte dell'enzima.
c. Stacca la catena di RNA dallo stampo di DNA.
d. Funziona da correttore di bozze.
L'apertura della doppia elica per creare la bolla di trascrizione viene a generare a valle del RNA-polimerasi dei superavvolgimenti positivi, dovranno intervenire le topoisomerasi per risolverli e rimuoverli.
__Terminazione__
#RNAPol. rilascia RNA neosintetizzato, si dissocia dal DNA e nei batteri esistono sequenze specifiche dette terminatori, che consentono la dissociazione della polimerasi.
__Subunità delle RNA polimerasi__
I batteri hanno una sola RNA polimerasi, RNAP core; mentre le eucariote ne hanno 3, RNAP 1, RNAP 2 e RNAP 3.
Ogni polimerasi è specifica per la sintesi di determinati RNA:
a. #RNApol 1 sintetizza degli RNAs.
b. #RNApol 2 sintetizza mRNA, microRNA e alcuni DNA non codificanti.
c. #RNApol 3 sintetizza tRNA, rRNA 5s e snRNA.
Sono state identificate altre due RNA polimerasi, che usano sempre il DNA come stampo, che sonno #RNAPol 4 e 5, che si trovano solo nelle piante, dove trascrivono solo DNA interferenti che silenziano geni bersaglio.
La #RNAPol batterica ha componente enzimatica detta RNAP core, costituita da una serie di subunità:
a. Due subunità beta.
b. Due subunità alfa.
c. Due subunità omega.
Negli eucarioti ci sono molte subunità in più.
### __Architettura delle RNA polimerasi__
La struttura ricorda una chela di granchio; le pinze sono delle subunità beta e beta'; il sito attivo si trova alla base delle due pinze, in una regione detta #SolcoCentraleAttivo.
Meccanismo della sintesi di DNA
La serie di polimerizzazione è analoga a quella della DNA polimerasi.
La #RNAPol. sinteizza in 5'-3', anche in questo caso l'estremità #3OH libero del RNA nascente va colpire il fosfato alfa del nuovo ribonucleotide, entrato nel sito enzimatico e appaiato con la sua base complementare allo stampo di DNA.
La reazione rilascia pirofosfato e addiziona il ribonucleotide alla catena di RNA.
Il sito attiva presenta due ioni magnesio (che stanbilizzano pure i fosfati beta e gamma), in grado di ridurre l'affinità dell'idrogeno per l'ossigeno in posizione 3', in modo da creare un ossigeno carico negativamente, che colpisce il fosfato alfa con rilascio di pirofosfato.
### __Canali della RNA polimerasi__
Ha diversi canali, che consentono il passaggio del DNA, RNA e ribonucleotidi verso e dal #SolcoCentraleAttivo, a questo livello ci sono diversi canali:
a. Primo canale che permette ingresso del DNA, che va denaturato e trascritto.
b. Canale che permette ingresso dei ribonucleotidi.
c. Un canale da cui esce RNA neosintetizzato
RNA viene sintetizzato in direzione 5'-3', alla 3' viene addizionato il ribonucleotide, complemenatare alla base dello stampo.
All'interno della #RNAPol. si forma una bolla di denaturazione, dove i due filamenti sono separati e a monte vi è il canale d'ingresso, a valle il canale di uscita del DNA, che è di nuovo riappaiato.
Durante l'allungamento, la bolla è sempre mantenuta a dimensione costante.
# La trascrizione nei procarioti e la sua regolazione:
Il core enzimatico è RNA P core, associato ad un #FattoreSigma, quest'ultimo crea proprio l'oloenzima, ovvero dove viene mantenuta questa attività polimerasica.
Il #FattoreSigma assicura alla RNA polimerasi batterica di legarsi con notevole affinità al promotore; agisce come fattore di trascrizione a tutti gli effetti, nei procarioti se ne ha 1 soltanto.
Quando sigma è legato si riduce la capacità globale della polimerasi di legare il DNA, mentre aumenta l'affinità nei confronti del promotore.
#FattoreSigma ha dei domini rivolti verso l'esterno che servono per riconoscere e legare il promotore, gli altri sono nella regione interna, fra le due parti della pinza e occupano parzialmente il canale ove si posiziona il DNA (garantendo la bassa affinità per RNA polimerasi).
In #Ecoli il fattore preponderante è sigma70; altri sono il fattore sigma32 (shock termico), sigma54 (carenza di azoto), sigma28 (sistema del flagello).
Per #sigma70 le sequenze conservate a -35 e -10 sono rispettivamente __TTGACA__ e __TATAAT__ .
Un promotore che presenta una sequenza a -35 e -10 nel suo promotore, identica o quasi alle sequenze consenso è un promotore molto forte, viceversa, il contrario. I #GeniCostitutivi sono geni che la cellula vuole esprimere ad alti livelli continuamente, detti __"Housekeeping"__, come __actina__, o geni legati al __metabolismo del glucosio__ (aldolasi o chinasi ad esempio).
I #GeniNonCostitutivi sono quelli inducibili, regolati da fattori esterni, come un attacco virale o infezione/infiammazione.
Gli elementi a -35 e -10 sono riconosciuti dal fattore sigma associato alla RNA polimerasi, ma siccome questa ha un'estremità, ossia la #CodaCTerminale della subunità alfa, che interagisce con UP il quale rende ancora più stabile l'interazione della #RNAPol. con il promotore (ecco perché è detto forte); la #CodaCTerminale ha un ponte flessibile, interagendo più facilmente con questo elemento, creando ulteriore interazione tra enzima e DNA.
Il fattore interagisce con il promotore e lo fa mediante delle regioni specifiche; il #FattoreSigma contiene 4 regioni principali o domini, indicati con numeri __1,2,3,4__ a partire dall'estremità N-terminale fino all'estremità C-terminale.
Di questi, il dominio 2 interagisce con la sequenza specifica a -10, mentre il 4 interagisce con la -35; il promotore esteso coinvolge 2,3.
Tra la regione 3 e 4 si ha un __linker__ che collega queste due regioni.
Considerando #sigma70 e promotore classico, il dominio 2 interagisce con -10 e la 4 con la regione -35; quest'ultima interagisce con una struttura __elica-giro-elica__; fornendo l'energia di legame necessaria per assicurare la polimerasi sul promotore.
Il dominio 2 interagisce con struttura __alfa elica__; questa interazione ha un ruolo importante nella transizione da complesso chiuso ad aperto.
L'interazione tra questa regione e la sequenza consenso è fondamentale per consentire la denaturazione locale, che coinvolge la sequenza consenso a -10 del DNA.
### ricapitolando:
1. La regione -35 fornisce l'energia necessaria per assicurare l'energia di legame della polimerasi sul promotore.
2. Sulla regione -10 inizia la separazione del DNA, durante la transizione dal complesso chiuso ad aperto e l'interazione con la regione 2 permettendo di stabilizzare il DNA aperto.
Durante il cambio conformazionale da chiuso ad aperto, la #RNAPol subisce cambiamenti strutturali:
1. Le pinze beta e beta' si chiudono a valle del sito d'inizio della trascrizione, come se tenessero fermo il DNA, su cui la #RNAPol è legata.
2. La regione amminoterminale del #FattoreSigma si sposta dal #SolcoAttivoCentrale ad una posizione esterna, consentendo libero accesso al filamento stampo nel sito attivo e dare l'avvio alla sintesi del RNA.
## Meccanismo di azione della trascrizione
La #RNAPol rimane durante la fase d'inizio trascrizione rimane ferma sul promotore, nonostante ciò, riesce a sintetizzare RNA di masssimo 10 pb che consente di abbandonare il promotore ed iniziare la fase di allungamento (inizio abortivo).
Il modello più accettato per questo fenomeno è quello detto di #accartocciamento (detto anche di scrunching); in questo processo #RNAPol rimane legata al promotore e ferma, richiama al suo interno un tratto di DNA.
Una volta assorbito, il DNA si va ad organizzare sotto forma di protuberanza; #RNAPol sintetizza poi questo primo tratto; il processo è detto di #accartocciamento, perché è come se RNA pol fosse una mano che trascina il DNA a singolo filamento dentro di sé, accartocciandolo a formare una bolla.
Sintetizzati i 10 pb, il #FattoreSigma ancora legato alla polimerasi, viene espulso, o meglio soltanto la sua parte __linker 3/4__, posizionata nel canale di uscita della RNA, il quale viene liberato.
# Allungamento
Come già detto la bolla di trascrizione rimane costante nelle sue dimensioni (ossia una dimensione di 12-14pb), mentre l'ibrido che si sta creando tra DNA stampo e RNA neostintetizzato è attorno agli 8-9 nucleotidi.
1. Punto di partenza, si ha bolla e RNA appaiato creando ibrido con 9pb.
2. #RNAPol trasloca in avanti di uno, mentre trasloca si porta dietro la bolla di trascrizione, quando trasloca in avanti, una coppia di basi in avanti si dissocia e un'altra dietro all'enzima si appaia (così lascia costante la bolla); RNA traslocato ha una base dissociata che porta verso il canale di uscita, tant'è che l'ibrido tra DNA e RNA non è più di 9 ma 8, questo avviene perché si ha una nuova base sullo stampo che deve essere letta per aggiungere il nucleotide.
3. RNA pol è traslocata in avanti di 1, ecco perché l'ibrido è tra 8-9, in base al momento in cui l'enzima trasloca di uno; questo processo è ripetuto per l'intero stampo.
## Autocorrezione da parte della RNA polimerasi
<u>funzionalità di correttore di bozze</u>
1. **Autocorrezione cinetica o editing pirofosforolitico:** in caso di ultima base aggiunta in 3'OH non corretta, perché la base del ribonucleotide non è complementare a quella dello stampo e quindi in questo meccanismo #RNAPol entra in stallo dopo aver incorporato la base errata, catalizzando una reazione inversa di rimozione del ribonucleotide; il pirofosfato rilasciato va a colpire il legame fosfodiesterico, rompendolo ed in questo modo stacca la base errata e a quel punto #RNAPol può riprendere la sintesi.
2. **Autocorrezione nucleolitica o editing idrolitico:** RNAPol , dopo essersi accorta di aver appaiato erroneamente alcuni nucleotidi, torna indietro (in ritardo) fino alla base errata e con la sua attività nucleasica va a rompere il legame fosfodiesterico, usando acqua e i nucleotidi vengono eliminati; tutta la sequenza contenente la base errata, a questo punto #RNAPol può ripartire e continuare la sua sintesi di RNA.
RNA pol fa 1 errore ogni 10^4-5 nucleotidi.
# Terminazione
Nei procarioti la terminazione si attiva quando la polimerasi legge un codone detto #terminatore.
I terminatori sono sequenze sul DNA che una volta trascritte da una RNA polimerasi consente la fine della trascrizione, con rilascio dell'enzima dal DNA ed il rilascio di RNA appena sintetizzato.
**Esistono 2 tipi di #terminatore:**
1. <u>#TerminatoreRHO-dipendente</u>, terminatore che non necessita di questa proteina RHO.
Quando il terminatore viene a contatto con #RNAPol, il trascritto ha una struttura ad ansa (forcina); osservando la struttura si nota che questo terminatore presenta due sequenze ripetutute ed invertite, seguite da una sequenza __poliA__ e __poliT__, e termina con una coda #poliU.
<u>Come funziona la terminazione?</u>
Quando RNA trascrive il terminatore si forma la struttura a forcina, rendendo instabile il RNA.
RNA è tenuta assieme dall'ultimo tratto #poliU; il tratto #poliAU, rispetto ad uno GC, è instabile in quanto ha solo 2 coppie di legami a idrogeno per ogni coppia AU.
Questo assicura la dissociazione di RNA dallo stampo.
2. <u>#TerminatoreRHO-dipendente</u>, questo terminatore ha una prima regione, che viene chiamata sequenza RUT, che se trascritta produce una sequenza ricca in C.
La sequenza RUT può essere seguita, con distanza più o meno grande, da due brevi sequenze ripetute e invertite, le quali a loro volta daranno su RNA una struttura a forcina, che si viene a creare nella parte 3'.
I terminatori prevedono il reclutamento di un fattore che riconosce la sequenza RUT e questo fattore è RHO.
Quando si vede la sequenza **CCGCC**, è indicativo del fatto che #RNAPol ha trascritto la sequenza RUT, riconosciuta dall'esamero RHO (elicasi con attività ATPasica); come motore molecolare riconosce la sequenza e con attività ATPasica scorre lungo RNA, seguendo il movimento della polimerasi.
Quando la polimerasi giunge al #terminatore, ovvero le sequenze brevi ripetute ed invertite, RNA assume la struttura a forcina, #RNAPol così rallenta e la forcina destabilizza sia RNA che stessa polimerasi, entrando in stallo.
Viene poi raggiunta da RHO che ne provoca il distacco (tramite azione elicasica pone fine alla tascrizione). # Regolazione della trascrizione nei procarioti
Le cellule procariotiche sono sensibili a segnali esogeni (come molecole nel terreno di coltura che entrando nella cellula assumono ruolo di regolatori positivi, o negativi, della trascrizione); le proteine che regolano positivamente sono dette #attivatori, esplicando quindi una maggiore trascrizione del gene.
Le proteine che regolano negativamente sono dette #repressori, e inibiscono la trascrizione.
Entrambi agiscono a livello della **fase iniziale della trascrizione**.
In assenza di attivatori o repressori la #RNAPol. si lega al promotore in maniera debole ed esprime basalmente il gene; è detto **livello di espressione costitutiva basale**.
<u>Come funzionano questi modulatori?</u>
I #repressori si legano ad una regione chiamata #operatore (sequenza specifica di DNA), adiacente o inglobato nel promotore di avvio della trascrizione; quando il repressore vi si legam impedisce l'accesso della #RNAPol. e l'effetto è quello di assenza di trascrizione.
Gli #attivatori hanno 2 siti di legame; 1 interagisce con la polimerasi legata al promotore e 1 lega il DNA in una sequenza adiacente al #promotore ma che non coincide con lo stesso, creando quello che viene detto **legame cooperativo** e grazie a questo si stimola il passaggio da #ComplessoChiuso a #ComplessoAperto.
I geni sono poi organizzati in operoni.
<u>Che cos'è un operone?</u>
#Operone è formato da promotore, operatore e #GeniStrutturali; questi ultimi, tutti vicini l'uno all'altro, vengono trascritti assieme in un'unica molecola di mRNA da cui derivano una serie di proteine.
Questa singola molecola di mRNA viene detta #RNAPolicistrionico.
Gli operatori hanno numero variabile di geni (1-12), e sono prerogativa dei procarioti, dal momento che i geni eucarioti non sono organizzati in operoni ma trascritti singolarmente: da ogni gene deriva un mRNA singolo e perciò viene chiamato #RNAMonocistrionico.
<u>Struttura operone</u>
Contiene i **geni strutturali** tutti adiacenti, trascritti e tradotti poi in proteine a loro volta strutturali; queste sono funzionalmente correlate, in quanto sono coinvolte tutte nella stessa via metabolica.
I #GeniStrutturali sono sotto controllo di un promotore che contiene promotore, operatore e repressore (ad esempio).
I #repressori stessi possono essere trascritto da un gene regolatore, che quindi codifica per la proteina regolatrice, gene che comunque non fa parte dell'operone, dal momento che si può trovare anche in un punto lontano del codice genetico.
I #repressori possono essere attivati o inibiti ad opera di una serie di metaboliti.
**Esempio di regolazione dell'inizio della trascrizione nei procarioti**
<u>Geni coinvolti nel metabolismo del lattosio in E. coli</u>
Contiene nello specifico 3 #GeniStrutturali:
1. **LacZ**, che codifica per la Beta-galattosidasi.
2. **LacY**, che codifica per la permeasi del lattosio.
3. **LacA**, che codifica per la tiogalattoside transacetilasi.
Questi geni sono inoltre sotto il controllo del promotore che contiene parzialmente sovrapposta la sequenza dell'operatore; adiacente si trova il sito del legame #attivatori, chiamati in E. coli **CAP** (proteina attivatore catabolita) o **CRP** (proteina recettore del cAMP).
**<u>Ruolo dei 3 enzimi</u>**
Il lattosio entra nella cellula tramite permeasi; entrato viene scisso dalla galattosidasi in glucosio e galattosio; in ultimis la tiogalattoside transacetilasi trasferisce gruppi acetilici ai Beta-galattosidi.
## Controllo negativo operone LAC
LAC viene attivato in presenza di lattosio e assenza di glucosio; in queste condizioni ho LacY,Z,A e siti di controllo con promotore e operatore e repressore.
Se sono in presenza di glucosio e assenza di lattosio il #GeneRegolatore **Lac I**, viene trascritto per produrre il repressore LAC, che si legerà all'operatore bloccando la trascrizione dei geni strutturali inibendo la trascrizione del LAC.
Nel caso contrario, presente lattosio ma assente glucosio, il repressore LAC deve essere inibito; interviene quindi un induttore chiamato **allolattosio**, il quale va a legarsi al repressore modificandolo conformazionalmente, impedendogli di legare la sua sequenza bersaglio sul DNA.
La conversione del lattosio in **allolattosio** è catalizzata dalla galattosidasi, che non potrebbe esistere dal momento che l'inibitore è legato al operone.
**<u>Come funziona dunque?</u>**
Semplicemente la #RNAPol. riesce ad attura una espressione basale del gene, legandosi (ogni tanto) al sito promotore invece del repressore LAC; anche in asssenza di lattosio quindi, ci sono bassi livelli di questo enzima per poter catalizzare la conversione.
### Forma del repressore LAC
Lega il DNA attraverso 2 monomeri (dimero) che constano entrambi di **coda N-terminale** , in sequenze appartententi all'operatore LAC; ogni sequenza è costituita da 2 sequenze palidrome, ogni sequenza è detta emisito, riconosciuto poi da una delle due teste N-terminali, con motivo **elica-giro-elica**; un dominio centrale che serve per regolare la sua funzione visto che contiene il sito di legame per l'allolattosio e poi un dominio C-terminale che serve per **l'oligomerizzazione**.
Il dominio **N-terminale** è costituito da 2 alfa eliche, dove 1 si posiziona sul solco maggiore per legarsi al DNA e viene chiamata #ElicaR, l'altra si posiziona più all'esterno per interagire con lo zucchero fosfato del DNA e stabilizzando l'interazione.
L'allolattosio fa si che le due teste si allontanino dai siti di legame dell'operatore, facendo si che la #RNAPol. possa legarsi e fare il suo lavoro.
I #repressori LAC si legano come tetramero e non come dimero, ad un operone chiamato **O1**, riconosciuto dal repressore LAC, lo stesso che si sovrappone parzialmente al promotore LAC, l'operatore interagisce con le teste di 2 dimeri (dal momento che si lega come tetramero), legandosi ad altri due operatori possibili **O2** e **O3** (operatori ausiliari), che si trovano a 410pb di distanza da O1 (O2) e 83pb a monte (O3).
### Controllo positivo operone LAC
Sotto controllo positivo degli #attivatori CAP, detto anche CRP (recettore del cAMP).
Da questo gene CAP lontano rispetto all'operone si ottiene mRNA da cui viene ricavato l'attivatore CAP; se in presenza di glucosio, CAP non è in grado di riconoscere il sito che si trova a monte del promotore dell'operone e di conseguenza la sua azione di attivatore non viene esplicata.
In presenza di lattosio, serve che l'attivatore venga attivato e perciò viene prodotta una molecola segnale (cAMP), la quale funge da induttore, legandosi alla proteina CAP, che cambia conformazione e si lega al sito adiacente al promotore, promuovendo la trascrizione dell'operone LAC.
Perché l'attivatore CAP sia attivo e funzionale deve legare la cAMP.
Il cAMP è prodotto da una adenilato ciclasi che converte ATP in cAMP, ovvero adenosina monofosfato 3' 5' ciclico.
Livelli molto bassi di glucosio attivano adenilato ciclasi aumentando quelli di cAMP, alti livelli di questa molecola segnalano assenza di glucosio e la necessità di attivare una via metabolica alternativa; inoltre, il cAMP è anche induttore positivo del CAP che si lega sul DNA e interagisce con #RNAPol.
**Riassumendo:**
<u>Attivazione della trascrizione dell'operone richiede 2 elementi fondamentali:</u>
1. La presenza del lattosio, o meglio, del metabolita allolattosio che lega il repressore LAC, impenendogli il legame con operone.
2. L'assenza di glucosio nel mezzo di coltura, il che determina alti livelli di induttore cAMP che lega l'attivatore CAP attivandolo così da legare il suo sito di legame sul DNA e #RNAPol.
<u>Inibizione della trascrizione:</u>
1. L'assenza di lattosio e perciò dell'induttore allolattosio permette al repressore LAC di legare l'operatore.
2. La presenza di glucosio che determina bassi livelli dell'induttore cAMP, lasciando solo l'attivatore CAP che non lega così il suo sito di legame sul DNA né #RNAPol.
## Attenuazione della trascrizione dell'operone Trp
Molti meccanismi di regolazione avvengono all'inizio della trascrizione; un'altro tipo agisce sulla fase di terminazione, esso è noto come **meccanismo di attenuazione**.
Il meccanismo di attenuazione non è specifico per l'operone Trp, perciò non regola soltanto questo operone, ma anche altri operoni che codificano per enzimi coinvolti nella sintesi di aa (ossia che codificano per #ProteineStrutturali).
Il fenomeno dell'attenuazione va a interrompere la sintesi prematura del mRNA policistrionico dell'operone Trp in risposta alla presenza di triptofano intracellulare a bassi, ma sufficienti livelli, per le attività metaboliche cellulari, e quindi l'espressione di tutti gli enzimi coinvolti nella sintesi dello stesso aminoacido, perché già presente nella cellula.
<u>Spiegazione:</u>
La sequenza leader o Trpl, presente in forma di mRNA e si trova a monte dei geni strutturali dell'operone Trp, la sequenza leader consta di 161 nucleotidi e contiene una breve sequenza codificante di aa, dove sono presenti due **codoni** adiacenti che codificano per il triptofano.
La sequenza contiene 4 regioni, che comprendono parzialmente l'ORF, infatti, i codoni adiacenti si trovano nella regione 1.
La regione **3** può appaiarsi con la **4** e la **2**:
1. Quando si appaia con la 2, la struttura a forcina che creano non ha effetti sulla trascrizione.
2. Quando si appaia con la regione 4, la struttura a forcina blocca la trascrizione, perché dopo la regione 4 ce n'è una **PoliU** (che è la descrizione della #TerminatoreRHO-dipendente).
La sequenza leader, trascritta e riconosciuta dai ribosomi, i quali si occupano della traduzione di mRNA, che attraverso l'azione di tRNA carichi con aa specifico, riconoscono il codone mRNA e portano l'aa specifico.
**<u>Se il Trp è presente nella cellula</u>**, questo può essere associato al tRNA corrispondente, il quale riconosce i codoni adiacenti Trp.
Succede quindi che in presenza di concentrazioni sufficienti di Trp (e di rispettivi tRNA), i ribosomi legano ORF che comprende i due codoni adiacenti e iniziano a tradurre la sequenza, reclutando tRNA carichi di Trp che vanno a legare i due codoni.
I ribosomi scorrendo trovano le sequenze adiacenti che si sovrappongono parzialmente alla **regione 1**, costituita da 13 codoni, ottenendo alla fine un peptide di 13 aa con **2 Trp adiacenti**.
Nel fare questo, i ribosomi impediscono alla **regione 3** di appaiarsi con la **2**, ma di andare alla regione **4**, creando un terminatore intrinseco.
Così facendo si crea un mRNA tronco, senza #GeniStrutturali trascritti, perciò mRNA è detto **attenuato** e degradato.
**<u>Se le concentrazioni di Trp sono basse</u>**, il ribosoma arriva a tradurre ORF con i codoni adiacenti al Trp, ma essendo in carenza, i tRNA carichi non ci sono e quindi, i ribosomi, quando si trovano su i codoni adiacenti, entrano in stallo, bloccando la traduzione.
Lo stallo consente alla **regione 3** di appaiarsi con la **regione 2**, che però non funziona da terminatore e quindi #RNAPol. può continuare a fare il suo lavoro, trascrivendo anche i geni strutturali, che permetteranno di tradurre l'intero operone.