Ontwikkelingsbiologie - Hoofdstuk 9 : Vogels
Hoofdstuk 9 : Vorming van het vertebrate lichaamsplan en
lichaamsassen - vogels
I. Vroege klievingen in het vogelei
De klievingen van een vogelembryo zijn discoïdaal (slechts een deel van het ei vormt het
embryo) en meroblastisch (de klievingen gaan niet doorheen het volledige ei) en resulteren
in de vorming van de blastodisc, een dunne laag (2-3 mm) van dooiervrij cytoplasma (Figuur
9.1). Het blastoderm is initieel enkellagig en continu. Equatoriale en vertikale klievingen
genereren 5 tot 6 cellagen, het circulaire blastoderm. Tussen het blastoderm en de dooier
ontstaat de subgerminale holte (blastoderm pompt vocht uit albumine naar subgerminale
ruimte).
De diepe cellen van de blastoderm ondergaan “shedding” en ze sterven af. De 1-cel dikke
laag die achterblijft is de area pellucida. Deze vormt grotendeels het eigenlijke embryo. De
marginale cellen van de blastoderm vormen de area opaca. Tussen de area opaca en area
pelucida is een dunne cellaag : de marginale zone.
De eerste klievingen gebeuren tijdens passage door het oviduct. Hierbij wordt het ei
omgeven door albumine, membranen en eischaal; na leggen van het ei gaan de klievingen
verder.
Figuur 9.1. Levenscyclus van de kip en de discoïdale meroblastische klieving bekeken van de
animale en laterale zijde (zie tekst)
II. Gastrulatie
Vóór de eigenlijke gastrulatie treedt de delaminatie op van individuele cellen in de
subgerminale ruimte die de polyinvaginatie eilandjes (primaire hypoblast) vormen (Figuur
9.2). Tegelijkertijd gaan cellen migreren vanuit de achterste marginale zone (Sikkel van
Koller) en vormen daar de secundaire hypoblast.
1
Ontwikkelingsbiologie - Hoofdstuk 9 : Vogels
Figuur 9.2. Vorming van de 2-lagige blastoderm van een kippenembryo. (A,B) Primaire
hypoblastcellen delamineren individueel en vormen eilandjes onder de epiblast. (C) De secundaire
hypoblastcellen migreren ondertussen vanuit de posterieure rand (de Sikkel van Koller en de
posterieure marginale cellen daarachter), onder de epiblast (ep) en inkorporeren de polyinvaginatieeilandjes. (D,E) Terwijl de hypoblast anterieur beweegt, gaan de cellen van de epiblast ter hoogte
van de SvK de primitieve streep vormen (met vooraan de Knoop van Hensen) waar doorheen cellen
gaan migreren tijdens de gastrulatie.
Uiteindelijk ontstaat een tweelagig blastoderm: epiblast en hypoblast (komen samen t.h.v.
area opaca) met tussenin een ‘blastocoel’. De epiblast vormt het eigenlijke embryo
(bestaande uit de 3 kiembladen + extra embryonale membraan). De hypoblast vormt de
dooierzak en de dooiersteel (verbinding van de endodermale verteringsbuis met de dooier).
De gastrulatie vangt aan met de vorming van de primitieve streep (of oerstreep) juist vóór
de Sikkel van Koller (SvK) door de invaginatie en convergentie van endodermale precursoren
vanuit de epiblast. Ondertussen beweegt ook de secundaire hypoblast naar voren. De
primitieve streep strekt uit over 60-75% van area pellucida en definieert de A-P as (Figuur
9.2).
2
Ontwikkelingsbiologie - Hoofdstuk 9 : Vogels
In de oerstreep vormt zich een primitieve groef (analoog aan blastoporus bij amfibieën) met
aan het vooreinde de oerknop of de knoop van Hensen (KvH = analoog aan dorsale lip van
de blastoporus)
Cellen gaan vervolgen migreren door de KvH naar het blastocoel. De eerste cellen die
migreren vormen de voorlopers van het faryngeaal endoderm en de voordarm. Deze
verdringen de hypoblast naar de periferie waar deze de germinale sikkel vormt (hierin
bevinden zich de voorlopers van de geslachtscellen). De volgende cellen die doorheen de
knoop van Hensen migreren vormen het hoofdmesenchym en het prechordale plaat
mesoderm. Deze duwen de epiblast op tot de vorming van het hoofdproces. De laatste
cellen die door de knop migeren vormen het chordamesoderm (notochord) (Figuur 9.3).
Ondertussen gaan ook cellen migreren via het lateraal deel van de oerstreep. Deze cellen
splitsen op in twee lagen. De diepe laag associeert met de middenlijn van de hypoblast en
duwt deze weg. De diep-migrerende laag vormt de endodermale organen en extraembryonale membranen (dooierzak, allantoiszak). De tweede ondiepe laag van mesenchym
spreidt zich uit tussen het endoderm en de epiblast en vormt het lateraal mesoderm en
eveneens extra-embryonale membranen (amnionzak, chorionzak) (Figuur 9.4).
Een tweede fase van de gastrulatie begint met de regressie van de oerstreep waarbij de KvH
beweegt naar een meer posterieure positie (Figuur 9.3). In zijn zog worden de notochord en
de somieten uitgelegd. Bij de volledige regressie van de KvH (vormt finaal de anale regio) zijn
alle drie de kiemlagen gevormd en gepositioneerd.
3
Ontwikkelingsbiologie - Hoofdstuk 9 : Vogels
Figuur 9.3 Celbewegingen van de
primitieve streep in een kippenembryo.
(A-C) Dorsaal zicht van de vorming en
elongatie van de primitieve streep. Het
blastoderm is getoond 3-4 uur (A), 7-8 uur
(B) en 15-16 uur (C) na de bevruchting. (DF) Vorming van de notochord en de
mesodermale somieten terwijl de
primitieve streep regresseert in embryo’s
19-22 uur (D), 23-24 uur (E) na
bevruchting en in het 4-somiet stadium
(F). Bestemmingskaarten van de epiblast
zijn getoond voor 2 stadia : het definitieve
primitieve streep stadium (C) en
gedurende neurulatie (F). In (F) is het
endoderm reeds geïngresseerd onder de
epiblast en convergente extensie is
zichtbaar in de middenlijn.
4
Ontwikkelingsbiologie - Hoofdstuk 9 : Vogels
Figuur 9.4. Migratie van endodermale en mesodermale cellen doorheen de primitieve streep.
De eerste cellen die migreren vanuit de epiblast vormen endoderm en insereren eerst in de
hypoblast. De hypoblast zal dan uitsorteren en komen te liggen onder de laag van endoderm. De
mesodermale cellen migreren ondertussen tussen de epiblast en het endoderm. De foto’s rechts
tonen tracks van GFP gelabelde cellen in verschillende posities van de primitieve streep.
Boven de notochord vindt de neurulatie plaats. Het vogelembryo vertoont een duidelijke A-P
gradiënt in ontwikkelingsgraad; het anterieure deel v/h embryo is duidelijk meer ontwikkeld
dan het posterieure deel (Figuur 9.5)
Figuur 9.5. Anterieure-posterieure gradiënt in
de ontwikkeling tijdens de neurulatie van een
kippenembryo.
Epibolie van het ectoderm
Terwijl de toekomstige mesodermale en endodermale cellen naar binnen migreren gaan de
ectodermale precursoren prolifereren en via epibolie over de dooier uitspreiden en deze
volledig omringen. De cellen t.h.v. de area opaca adhereren en migreren hierbij via filopodia
op de vitelline envelop (via binding van fibronectine) en trekken als het ware de
ectodermale cellen mee.
5
Ontwikkelingsbiologie - Hoofdstuk 9 : Vogels
Factoren die rol spelen bij ingressie door oerstreep (Figuur 9.4)
HNK-1: sulfaatvorm van glucuronzuur
HNK-1 positieve cellen ingresseren en worden aangetrokken door de achterste marginale
zone (waarschijnlijk wordt in deze zone een chemoattractant gesecreteerd). Deze cellen
secreteren bovendien proteasen die de basale lamina oplossen. Hierdoor ontstaat de
primitieve groef in de bovenliggende epiblast waarna de ingressie van HNK-1-negatieve
epiblastcellen plaatsgrijpt. HNK-1 is noodzakelijk voor de vorming van endo- en mesoderm
(zoals aangetoond via neutraliserende antilichamen)
Fibronectine-rijke basale membraan van epiblast
Hyaluronzuur
Wordt gesecreteerd door de ectodermale cellen in het blastocoel waar het zorgt voor de
coating van de mesenchymale cellen en verhindert hun onderlinge associatie.
Scatter factor
Deze gesecreteerde factor zorgt voor de convertie van epitheel naar mesenchymale cellen.
Dit gebeurt o.a. door de functionele onderdrukking van E-cadherine door fosforylatie van βcatenine.
III. Vorming van de embryonale assen
Het blastoderm vormt een barrière tussen het basische en negatief geladen albumine (pH
9.5) en de zure en positief geladen subgerminale ruimte (pH 6.5). Hierdoor wordt een
potentiaalverschil (25 mV) gecreëerd wat leidt tot de vastlegging van de dorsale – ventrale
as.
De conversie van een radiale naar bilaterale structuur (m.a.w. vastlegging v.d. AP as) wordt
bepaald door de zwaartekracht. Het roterende afdalen van het ei zorgt namelijk voor een
asymmetrische positionering van de blastodisc door de zwaardere dooiermassa (Figuur 9.6).
De bovenste blastodisc zijde (geassocieerd met het lichtere dooiermateriaal) vormt het
posterieure (caudale) deel van het embryo.
Figuur 9.6.
Specificatie van de
anterieureposterieure as door
de zwaartekracht
(zie tekst)
6
Ontwikkelingsbiologie - Hoofdstuk 9 : Vogels
Vanuit de posterieure marginale zone (PMZ) vormt eerst de secundaire hypoblast en
vervolgens de primitieve streep (oerstreep). De PMZ induceert een oerstreep indien
getransplanteerd naar voorste marginale zone (en verhindert de vorming van andere
oerstrepen) .
De PMZ is de equivalent van het Nieuwkoop Centrum bij amfibieën (Figuur 9.7) :
- induceert oerstreep en de Knoop van Hensen.
- ter hoogte van de PMZ vindt men een overlap tussen TGF-β expressie en de
aanwezigheid van nucleair ß-catenine.
- net zoals bij amfibieën vindt men in de PMZ secretie van Vg1.
- de cellen van de PMZ zullen zelf geen deel uitmaken van de Knoop van Hensen en de
axiale structuren.
Figuur 9.7. Vorming van het Nieuwkoop centrum in Xenopus en de kip. (A) Vorming van het
Nieuwkoop centrum in Xenopus. De zwaartekracht, samen met de plaats van penetratie van de
spermatozoïde bepalen de activatie van β-catenine in de dorsale regio. De vegetale cellen
secreteren Vg1. De overlappende regio vormt het Nieuwkoop centrum. (B) In de kip wordt βcatenine teruggevonden in de buitenste cellen van de blastodisc. De Vg1-producerende cellen
bevinden zich in de toekomstige posterieure cellen van het blastoderm. De overlappende regio
vormt het Nieuwkoop centrum.
Het voorste deel van de PMZ vormt de Sikkel van Koller (SvK). De epiblast en de middenlaag
van deze SvK vormen de Knoop van Hensen (Figuur 9.8).
De KvH is het equivalent van de dorsale blastoporuslip (Spemann’s Organisator) :
- hier begint de gastrulatie
- de cellen vormen chordamesoderm en kunnen een nieuwe embryonale as vormen
na transplantatie
- de middenlaag van de SvK expresseert goosecoid
7
Ontwikkelingsbiologie - Hoofdstuk 9 : Vogels
Figuur 9.8. Vorming van de Knoop van Hensen vanuit de Sikkel van Koller. (A) Diagram van het
posterieure deel van een vroeg embryo met aanduiding van de cellen die werden gemerkt met
fluorescente kleurstof in de foto’s. (B) Net vóór de gastrulatie worden de cellen in het anterieure
deel van de SvK (de epiblast en de middenlaag) gelabeld met een groene kleur. De cellen in het
posterieure deel van de SvK worden gemerkt met een rode kleurstof. Terwijl de cellen migreren
vormen de anterieure cellen de KvH en zijn notochord derivaten. De posterieure cellen vormen de
posterieure regio van de primitieve streep.
Genexpressie in de “organizator” kan worden gecatalogeerd onder 2 sets (Fig. 9.9):
- een 1ste set van genen geëxpresseerd in het posterieure deel van de SvK die de
Nieuwkoop-equivalent vormen van het kippenembryo. Deze genen, o.a. Noggin en Vg1
vindt men dan terug over de gehele lengte van de primitieve groef (Vg1 speelt trouwens
een essentiële rol bij de vorming van de primitieve streep – kan een 2de as vormen indien
ectopisch geëxpresseerd in anterieure marginale zone).
- Een 2de set van genen, o.a. Chordin en Sonic Hedgehog wordt enkel geëxpresseerd in het
anterieure deel van de primitieve groef en finaal beperkt tot de knoop van Hensen.
Figuur 9.9. Genexpressie in de primitieve streep. (A) Schema van de algemene
genexpressiepatronen in verschillende ontwikkelingsstadia met aanduiding van het Nieuwkoopequivalent (blauw) en de Sikkel van Koller en afgeleiden (rood). Vorming van de Knoop van Hensen
vanuit de Sikkel van Koller. (B) Expressie van Vg1 tijdens de vorming van de primitieve streep en (C)
expressie va chordin.
8
Ontwikkelingsbiologie - Hoofdstuk 9 : Vogels
IV. Neurulatie bij de kip
Het dorsaal mesoderm induceert de vorming van de neurale buis. De cellen van de Knoop
van Hensen secreteren net als de Spemann organisator Chordin en Noggin. Deze blokkeren
BMPs en induceren samen met Nodal de dorsalisatie van het ectoderm en het mesoderm.
Bij de kip is inhibitie van BMP signalisatie niet voldoende voor neurulatie. In tegenstelling tot
amfibieën blokkeert behandeling met BMP niet de neurale inductie en de overexpressie van
chordin in niet-neuraal epiblast induceert geen neurulatie. De FGFs lijken betrokken bij de
generatie van neuronale celtypes in de epiblast. FGFs worden geproduceerd in de KvH en
pareltjes met FGF induceren de neurale delen van de romp en de achterhersenen. De
vorming van de voorhersenen wordt vermoedelijk gemedieerd door factoren afgescheiden
door anterieur visceraal endoderm.
V. Anterieure-Posterieure patroonvorming
De hypoblast en het definitieve endoderm zijn noodzakelijk voor het vastleggen van de
anterieure identiteit in het embryo (deze specificatie is gescheiden van de neurale inductie).
Terwijl de KvH neurulatie induceert gaat de onderliggende endodermale laag Cerberus en
andere hoofd-inducers induceren aan zijn anterieure uiteinde. Net zoals bij Xenopus gaat het
anterieure endoderm dus betrokken zijn bij de specificatie van het hoofd. Caudalisatie van
de neurale plaat gebeurt via een gradiënt van RA (secretie posterieur – afbraak anterieur)
9
Ontwikkelingsbiologie - Hoofdstuk 9 : Vogels
VI. Links-rechts as vorming bij de kip
Net zoals bij amfibieën wordt de vorming van de L-R as gereguleerd door de gesecreteerde
factor Nodal en de TF Pitx2 die beiden specifiek links tot expressie komen. Het mechanisme
van Nodal activering verschilt echter in vergelijking met andere klassen van vertebraten
(Figuur 9.10)
RECHTS
Als de oerstreep de maximale lengte bereikt heeft treedt rechts de expressie op van activine
(en activine receptor) (zie ook Figuur 9.11) en BMP4. Dit zorgt ervoor dat rechts de expressie
van Shh stilvalt. Tegelijkertijd wordt door BMP4 rechts ook FGF8 geïnduceerd. De rechtse
expressie van FGF8 induceert Snail (cSnR), een transcriptionele repressor die de TF Pitx2
inhibeert.
Figuur 9.10. De pathway voor links-rechts asymmetrie in de kip (zie tekst)
LINKS
Aan de linkerkant van het embryo zal Shh de expressie van Cerberus induceren. Cerberus
(ook wel Caronte genoemd) is een paracriene factor die in samenwerking met BMPs links in
het laterale plaat mesoderm Nodal expressie kan induceren. Nodal induceert dan Pitx2 en
represseert Snail.
Onder invloed van Retinoïnezuur treedt in de middenlijn expressie van Lefty-1 op. Lefty-1
verhindert hier dat Cerberus signaliseert naar het rechter deel van het embryo.
Pitx2 is cruciaal in de generatie van asymmetrie van de embryonale structuren (Figuur 9.12).
Ectopische expressie van Nodal of Pitx2 rechts induceert een random L-R asymmetrie
(“Rieger syndroom” bij de mens)
10
Ontwikkelingsbiologie - Hoofdstuk 9 : Vogels
Figuur 9.11. (B,C) Dorsaal en detailzicht van de expressie van Activine receptor II mRNA. (D,E)
Expressie van Shh vanuit een dorsaal overzichtsperspectief en in detail in de KvH.
Figuur 9.12. Transmissie van een “links” signaal van de KvH naar het laterale plaat mesoderm
resulteert in de linkse expressie van cerberus, nodal en pitx2. (A) In situ hybrisatie voor cerberus
mRNA vanuit een ventraal perspectief (vandaar signaal aan de rechter kant. (B) In situ hybridisatie
voor de nodal messenger vanuit een dorsaal perspectief. (C) Linkse expressie van het pitx2 mRNA in
een later stadium en vanuit een ventraal perspectief. Het signaal is o.a. aanwezig aan de linker zijde
van de vormende harttubus. Meer anterieur is er ook symmetrische expressie.
Behandeling van embryo’s met Follistatine blokkeert de activering van de activine-receptor
wat eveneens resulteert in een random L-R asymmetrie.
Onder invloed van ectopische expressie van activine links of Shh rechts wordt Nodal egaal
L+R geëxpresseerd (Figuur 9.13).
11
Ontwikkelingsbiologie - Hoofdstuk 9 : Vogels
Figuur 9.13. Ectopische expressie van Sonic Hedgehog leidt tot de symmetrische expressie van
nodal mRNA (en randomisatie van de looping van het hart). Expressie van Nodal in een wild-type
embryo (A) en in een embryo waarbij een Shh-bevattende pellet werd geïmplanteerd in de rechter
flank van de KvH (B).
VII. De vroege ontwikkeling bij vertebraten: de kip (conclusies)
• Vissen, reptielen en vogels ondergaan discoïdale meroblastische klieving leidend tot de
vorming van blastoderm.
• In kippenembryo’s vormt de vroege klieving een area opaca en een area pellucida.
Daartussen ligt de marginale zone. Gastrulatie begint aan de posterieure marginale zone
waar zowel de secundaire hypoblast als de oerstreep starten.
• De oerstreep is afgeleid van de voorste epiblast cellen en de centrale cellen van de
achterste marginale zone. Terwijl de oerstreep zich rostraal uitbreidt, wordt de Knoop van
Hensen gevormd. De cellen die door de Knoop van Hensen migreren vormen hoofd
mesenchym, de prechordale plaat en het chordamesoderm.
• De prechordale plaat induceert de vorming van voorhersenen; chordamesoderm
induceert vorming van middenhersenen, achterhersenen en ruggemerg. De eerste cellen
die lateraal langs de oergoef migreren worden endoderm, die de hypoblast verdringen.
Vervolgens migreren de mesodermale cellen. Ondertussen omtrekt het oppervlakte
ectoderm de volledige dooier door epibolie.
• In vogels is de zwaartekracht kritisch in het vastleggen van de A-P as. De L-R as wordt
gevormd door de expressie van Nodal aan de linkerzijde van het embryo waar het Pitx2
expressie induceert in de linkerdelen van de ontwikkelende organen.
12