抗菌性物質の適正使用と
乳生産効率の改善に向けた
牛乳房炎における免疫応答の監視と調節
Monitor and modulate immune responses in bovine mastitis to
improve antibiotic stewardship and efficiency in milk production
帯広畜産大学大学院 畜産学研究科
畜産科学専攻 博士後期課程
黄哲璿
Huang Che Hsuan
2
序論
乳房炎とは
• 病原体の感染による乳腺の炎症反応
• 症状：発熱、乳房の腫脹、異常乳、体細胞増加
• 対策：搾乳衛生、抗菌性物質治療
乳房の腫脹
異常乳
序論
3
乳房炎原因菌の分類
細胞壁の染色性
陽性菌
陰性菌
ブドウ球菌
レンサ球菌
大腸菌群
伝播パターン
伝染性
環境性
黄色ブドウ球菌 (SA)
無乳性レンサ球菌
マイコプラズマ
環境性ブドウ球菌 (CNS）
環境性レンサ球菌
大腸菌群
病原性
Major原因菌
Minor原因菌
SA
レンサ球菌
大腸菌群
CNS
コリネバクテリウム
序論
4
乳房炎による損失(年間)
報告
総損失
乳量損失
治療費・
廃棄乳
淘汰
1999 Yalcinら
19,500
14,700
2,100
2,700
2005 Østergaardら
21,600
16,000
5,600
-
2008 Huijpsら
20,700
14,800
2,200
3,300
2010 Nielsenら
15,800
9,700
5,900
0
2016 Van Soestら
17,800
10,200
3,900
3,000
＊単位：円/牛
序論
5
乳房炎のコントロール
5-points plan (全米乳房炎協議会, 1960s)：
• 搾乳前後の消毒
• 乾乳期治療 (抗菌性物質の乳房注入)
• 臨床型乳房炎の治療 (抗菌性物質の乳房注入)
• 慢性感染牛の淘汰
• 搾乳設備の定期点検
➜ 伝染性原因菌検出、バルク乳体細胞数↓
抗菌性物質用量↑
序論
6
One Health
環境に残留
環境
耐性菌発生
耐性菌発生
人間健康
人間に使う
抗菌性物質
動物健康
耐性菌発生
Wiki: https://en.wikipedia.org/wiki/One_Health
動物に使う
抗菌性物質
序論
乳房炎対策における
抗菌性物質の適正使用
• 盲目的乾乳期治療
➜ 感染リスク高い牛が対象の
選択的乾乳期治療（SDCT）
• 臨床型乳房炎に対する盲目的治療
➜ Culture-based selective therapy
• 抗菌性物質が主体の治療法
➜ 免疫応答を調節する免疫療法
例：大腸菌ワクチン、牛顆粒球コロニー刺激因子
7
序論
8
乳房炎における免疫応答
細胞性免疫
IL10
SCC ↑
IL1β
TNFα
マクロファージ
好中球
IFNγ
IL12
抗原提示
＊SCC: 乳中体細胞数；Igs: 免疫グロブリン
キラーT
(CD8+)
IL10
ヘルパーT
(CD4+)
IL4
液性免疫
IL6
Igs ↑
B細胞
序論
9
免疫応答による乳房炎の監視
乳中
CMT変法 (CMT)
体細胞数 (SCC)
好中球↑
種別体細胞数 (DSCC)
血中
乳腺感染
好中球↓
グロブリン↑
白血球数 (WBC)
アルブミン/グロブリン比
(A/G比)
序論
本研究の目的と計画
目的：
免疫応答の監視と調節により、牛乳房炎における
抗菌性物質の使用管理と乳生産の効率を改善する
研究計画：
1. 選択的乾乳期治療の有用性を確立
2. CMT変法結果と体細胞組成との関連性を調査
3. 乳生産と体細胞組成との関連性を調査
4. 乳房炎重症度、原因菌による特異的な免疫応答を調査
5. 免疫調節による新たな乳房炎対策の検討
10
総合考察
11
乳房炎対策の改善策
乾乳期治療
研究①
SDCTの
有用性の検討
乳腺感染
研究②
CMT変法
による摘発
臨床型乳房炎
研究④
原因菌、
重症度別特異的
な免疫応答
研究③
乳腺感染が生産性 生産性、治療策
に与える影響
に与える影響
研究⑤ キトサンによる免疫応答の調節
→ 乳房炎再発と乾乳期乳腺感染の防止
生産性向上と抗菌性物質の使用低減
第
1 章:
選択的乾乳期治療における乳腺感染
の予防効果に影響するリスク因子
Effect and Limitation of Selective Dry Cow Therapy
背景
13
分娩後乳房炎の要因と対策
各泌乳期の乳腺感染リスク(1981 Natzke)
乾乳期乳腺感染予防 ➜ Dry Cow Therapy (DCT)
背景
14
乾乳期治療の変遷
Blanket dry cow therapy (BDCT)
↓
乳汁培養検査
体細胞数
CMT変法
Selective dry cow therapy (SDCT)
材料方法
15
日本におけるSDCTの実施
目的：1. 日本におけるSDCTの実施の適合性判定
2. SDCTの効果に影響するリスク因子の認定
試験農場：本学畜産フィールド科学センター
試験時間：2020年3月から2021年1月
供試動物：ホルスタイン種経産牛44頭
実験方法：乳汁培養検査、乳房炎歴とCMT変法に基づく
SDCTの実施及び乳腺感染リスク因子の調査
調査項目：乾乳期乳腺感染、牛群衛生、乳頭シール付着状況
材料方法
16
試験の流れと試験区の作成
乾乳前乳腺感染、CMT変法と乳房炎歴の調査
高リスク牛
低リスク牛
抗菌性物質使用
抗菌性物質非使用
乳頭シール貼付
感染
分房
感染使用区
非感染
分房
健常使用区
非使用区
分娩予定日14日前乳汁培養検査
17
結果
分娩前乳汁培養検査結果
抗菌性物質
低減
病原菌
感染
使用区
健常
使用区
非使用区
合計
分房数
(%)
58
(35.0%)
52
(31.3%)
56
(33.7%)
166
(100%)
分娩前
感染率
40.8%
19.2%
28.6%
29.6%
オッズ=1.67 (P=0.27)
SDCTの効果に
影響するリスク因子
結果
同居牛群の衛生スコア
(乳房後面)
乳頭シール付着日数
健常使用区
非使用区
健常使用区
非使用区
P = 0.46
P = 0.014
P = 0.67
P = 0.011
綺麗 汚い
非感染 感染
非感染 感染
分娩前の感染状況
長い 短い
非感染 感染
非感染 感染
分娩前の感染状況
18
考察
乳頭シールの使用と
SDCTの乳腺感染防止効果
報告
2020 Roweら
2019 Kaberaら
2018 Vanhoudtら
2021 Niemiら
2018 Vasquezら
2014 Scherpenzeelら
効果
○
○
○
△
△
×
乳頭保護
内部性
内部性
内部性
3.5割は内部性
外部性
なし
19
結論
20
日本におけるSDCTの実施
日本は内部性乳頭シールの使用が未承認
• 衛生管理が良く、乳腺感染率が低い牧場
→ 乳頭シールの保護効果を確認し、SDCT実施
SDCTの効果を影響する他の要因
• 乳腺感染の認定に使う試験の感度
第
2 章:
乳中体細胞組成の変化が
CMT変法の結果に与える影響
Differential Somatic Cell Count Affects the CMT
背景
22
CMT変法とは
界面活性剤が体細胞を破壊し、細胞内容物を凝集
➜ 体細胞数を推定
少
体細胞
多
背景
23
各感染期における体細胞の変化
種別体細胞数(DSCC ;％)＝リンパ球＋多形核白血球(PMN)
→ マクロファージ(%) = 100 – DSCC (%)
回復期・
慢性感染期
感染初期
健康
DSCC ↓
DSCC ↑
SCC ↑
好中球動員
SCC ↓
組織損傷
体細胞組成の変化がCMT変法に影響を与える？
材料方法
DSCCがCMT変法
に与える影響の調査
調査方法：
乳房炎発生当日、3、5、7、14、21日後に、発生分房に
CMT変法を行い(-~3+に評価)、SCCとDSCCを測定
試験農場：本学畜産フィールド科学センター
試験期間：2021年6月～2022年2月
供試動物：泌乳牛41頭（乳房炎58例）
統計分析：
SCCをリニアスコア(SCS)に、MAC (=100-DSCC)を
その対数に変換し、累積ロジット混合モデルで分析
𝑙𝑜𝑔𝑖𝑡(𝑃(𝑌𝑖 ≤ 𝑗)) = 𝜃𝑗 － 𝛽1 𝑆𝐶𝑆𝑖 － 𝛽2 𝑙𝑜𝑔 (𝑀𝐴𝐶𝑖) － day𝑘 － 𝛾𝑚
24
結果
25
分析結果と結果による予測
結果の概要
結果による予測
変数
SCS
MAC*
の対数
オッズ比
(95% CI)
3.66
(2.89, 4.64)
4.35
(1.91, 9.91)
P値
2.71E-44
5.08E-4
マクロファージ (％)
リニアスコア5
*マクロファージの割合
リニアスコア(SCS)
CMT反応
-
±
+
2+
3+
26
観察例(臨床型乳房炎の回復)
マクロファージ (％)
考察
CMT変法
乳房炎経過日数
－
±
＋
2＋
3＋
リニアスコア
例922B：体細胞数が低下するが、CMT変法結果が悪化
→ 回復している分房に抗菌性物質を使用
27
考察
マクロファージ (％)
観察例(潜在性乳房炎)
CMT変法
781C
－
±
＋
753D
2＋
3＋
リニアスコア
例781C: 慢性化したためマクロファージの割合が高い
→ CMT変法は慢性化した潜在性乳房炎の摘発に応用
結論
28
CMT変法の限界や可能性
• CMT変法と乳房炎の回復は一致していない可能性
• CMT変法で治療延長の判断を下すのは短絡的
• CMT変法を高MAC慢性乳房炎の摘発に応用可能
慢性乳房炎を摘発する必要性
(2011 Pinzón SánchezとRuegg)
1. 再発しやすい
2. 治療しても治しにくい
3. 生産性に深刻な影響を与える(第三章)
第
3 章:
体細胞数と種別体細胞数が
乳生産に与える作用
Estimate Mastitis Impact using Total and Differential SCC
背景
30
体細胞数と組織損傷の不一致
健康
回復期・
慢性感染期
感染初期
DSCC ↓
DSCC ↑
SCC ↓
SCC ↑
好中球動員
組織損傷
SCC ：感染初期 ＞ 回復・慢性期
組織損傷：感染初期 ＜ 回復・慢性期
乳量の変化は？
材料方法
SCSとDSCCの相互作用が
乳生産に与える影響
調査方法：
乳検記録でSCS、DSCCと乳量の関係を分析
調査期間：2021年1月～2022年3月
調査牛群：十勝管内月278農場
調査動物：泌乳牛9万6075頭 (延べ46万0580か月の記録)
分析対象：以下全ての条件に合致したデータ
1.
2.
3.
泌乳日数6 ~ 305日のデータ
SCS 2~10.2のデータ(DSCCの測定範囲)
以上の記録を5か月以上持っている牛
→ 216農場 9945頭 延べ6万5766か月の記録
31
32
材料方法
一般化加法モデル
体細胞、泌乳日数、季節と乳量の非線形関係を調査
𝒇𝒋
𝜷𝒋
乳量
𝑔 𝐸 𝑦𝑖
リンク
関数(log)
SCS、DSCCの相互作用
= 𝑔 𝜇𝑖 = 𝛽0 + 𝛽𝑝𝑎𝑟𝑖𝑡𝑦 + 𝑓1,𝑝𝑎𝑟𝑖𝑡𝑦
𝑓2,𝑝𝑎𝑟𝑖𝑡𝑦
𝑖
𝐷𝐼𝑀𝑖 + 𝑓3,𝑝𝑎𝑟𝑖𝑡𝑦
𝑖
泌乳日数と季節の作用
確率分布：Tweedie分布
𝑖
SCS𝑖 , D𝑆𝐶𝐶𝑖 +
𝐷𝑜𝑌𝑖 + 𝛾ℎ𝑒𝑟𝑑 + 𝛾𝑐𝑜𝑤
牛群と牛の変量作用
33
結果
乳量の変化
SCS、DSCCと乳量の関係（産次別）
2産
3産以上
DSCC（％）
1産
乳量(kg/d)
リニアスコア (SCS)
SCSが高くてもDSCCが高い → 乳房炎初期 → 乳量正常
SCSが高くてDSCCが低い →慢性化した乳房炎→ 乳量激減
考察
34
DSCC、SCSの変化による
乳損失の推定(95%CI)
リニアスコア
産次 DSCC
1
2
3+
85
75
65
55
40
85
75
65
55
40
85
75
65
55
40
2
4
6
8
10
5.3% (±1.8%)
2.8% (±1.1%)
-2.5% (±1.2%)
-12.2% (±1.6%)
-23.8% (±3.2%)
2.5% (±0.8%)
-3.5% (±1.0%)
-12.9% (±1.2%)
-27.5% (±2.1%)
-43.0% (±3.6%)
0.0%
-9.0% (±1.1%)
-22.0% (±1.6%)
-40.1% (±3.3%)
-57.4% (±5.0%)
-2.0% (±0.5%)
-13.8% (±1.2%)
-29.7% (±1.9%)
-50.3% (±4.1%)
NA
-3.9% (±1.3%)
-19.4% (±1.6%)
-39.0% (±2.5%)
NA
NA
2.6% (±1.6%)
1.5% (±0.9%)
-2.7% (±1.1%)
-12.2% (±1.3%)
-24.1% (±2.5%)
1.1% (±0.7%)
-4.5% (±0.8%)
-12.5% (±1.0%)
-24.3% (±1.5%)
-37.1% (±2.6%)
0.0%
-9.9% (±0.9%)
-21.2% (±1.2%)
-34.7% (±2.3%)
-47.9% (±4.0%)
-0.7% (±0.5%)
-14.7% (±1.0%)
-28.7% (±1.4%)
-43.5% (±3.0%)
-56.9% (±5.0%)
-0.9% (±1.0%)
-20.4% (±1.1%)
-38.0% (±1.8%)
NA
NA
4.6% (±1.3%)
2.1% (±0.7%)
-2.8% (±0.8%)
-11.6% (±0.8%)
-22.2% (±1.5%)
2.1% (±0.5%)
-4.3% (±0.6%)
-12.9% (±0.8%)
-25.2% (±0.9%)
-38.2% (±1.5%)
0.0%
-9.7% (±0.7%)
-21.4% (±0.9%)
-36.3% (±1.4%)
-50.9% (±2.3%)
-1.5% (±0.4%)
-13.9% (±0.8%)
-28.2% (±1.0%)
-45.3% (±1.8%)
-60.8% (±2.9%)
-2.2% (±0.8%)
-17.8% (±0.9%)
-35.5% (±1.5%)
-55.5% (±3.0%)
NA
總結
35
SCSとDSCCが乳量への影響
• SCSが高くDSCCが高い(乳房炎初期)
→ 健康と同様
• SCSが高くDSCCが低い(慢性乳房炎)
→ 20キロ以上激減
• 一般化加法モデルは乳損失の推定に役に立てる
• app:
https://che-hsuan.shinyapps.io/Milk_composition_Jp_ver/
• 展望：SCSとDSCCの変化を引き起こす要因を特定
結果
36
泌乳日数、季節の効果
乳量
泌乳日数の効果
峰
季節の効果
谷
結果
37
泌乳日数、季節の効果
乳脂肪産量
峰
谷
乳蛋白産量
峰
谷
38
結果
気温の影響？
乳蛋白産量
谷
十勝平均気温
峰
結果
39
気温が乳蛋白産量に与える影響
𝑔 𝐸 PY𝑖
𝑓2,𝑝𝑎𝑟𝑖𝑡𝑦
= 𝑔 𝜇𝑖 = 𝛽0 + 𝛽𝑝𝑎𝑟𝑖𝑡𝑦 + 𝑓1,𝑝𝑎𝑟𝑖𝑡𝑦
𝑖
𝑖
SCS𝑖 , D𝑆𝐶𝐶𝑖 +
𝐷𝐼𝑀𝑖 + 𝑓3 𝐷𝑜𝑌𝑖 + 𝒇𝟒 𝑻𝒆𝒎𝒑𝒊 + 𝛾ℎ𝑒𝑟𝑑 + 𝛾𝑐𝑜𝑤
閾値 ≈ 16℃
*牛5000頭のデータ
第
4 章:
牛乳房炎における重症度と
原因菌による特異的な免疫応答
Severity & Pathogen Dependent Immune Responses in Mastitis
41
白血球数(106/mL)
原因菌に対する
特異的な免疫応答 （2004 Bannermanら)
IL8 (pg/mL)
TNFa (pg/mL)
体温(℃)
背景
接種後時間（時）
接種後時間（時）
乳房炎重症度による
特異的な免疫応答
背景
*
*
*
*
*
IL1β(U/mL)
*
TNFα (U/mL)
大腸菌乳房炎
42
（2001 大塚ら)
材料方法
原因菌、重症度による
特異的な免疫応答の調査
調査方法：
乳房炎の原因菌、重症度を特定し、発生当日、3、
5、7、14、21日後に各免疫指標を測定
試験農場：本学畜産フィールド科学センター
試験期間：2021年6月～2022年2月
供試動物：ホルスタイン種泌乳牛38頭 乳房炎49症例
調査項目：
乳房炎原因菌、重症度
血液A/G比、白血球数
乳中体細胞数
軽度
中度
重度
重症度の区分
異常乳
乳房腫脹
全身症状(発熱など)
(2011 Pinzón-SánchezとRuegg)
43
材料方法
44
原因菌の同定
有意な
発育がない
No significant
Growth (NG)
ウベリスレンサ
球菌同定キット
Other
Streptococcus (OS)
API 20 Strep®
Streptococcus
uberis (SU)
Streptococcus
dysgalactiae (SD)
45
材料方法
分析方法
目的：乳房炎原因菌、重症度による免疫応答の経時
的変化を調査する
•
リニアスコア、白血球数、AG比：
原因菌 重症度 経過日数 原因菌と経過日数
𝑌𝑖𝑗𝑘𝑙𝑚 = 𝛽0 + 𝛽1 𝑃𝑎𝑡ℎ𝑘 + 𝛽2 𝑆𝑒𝑣𝑚 + 𝛽3 𝑇𝑖𝑚𝑒𝑙 + 𝛽4 𝑃𝑎𝑡ℎ𝑘 × 𝑇𝑖𝑚𝑒𝑙 +
𝛽5 𝑆𝑒𝑣𝑚 × 𝑇𝑖𝑚𝑒𝑙 + 𝛽6 𝐷𝐼𝑀𝑖 + 𝛽7 𝐷𝐼𝑀𝑖2 + 𝛽8 𝑃𝑎𝑟𝑖𝑡𝑦𝑖𝑗 + 𝛾𝑗
重症度と経過日数
結果
46
リニアスコアの変化
原因菌別
重症度別
P =0.023
重症度
リニアスコア
原因菌
P =0.05
乳房炎発生日数
軽度
中度
重度
47
白血球数の変化(原因菌別)
WBC(100 cells/mL)± 95％CI
結果
乳房炎発生日数
考察
原因菌に対する
特異的な免疫応答
白血球数の変化：GNR＞Strep.＞SA、CNS
2004 Bannermanら:
- 大腸菌: LPSで炎症性サイトカインが上昇 →
白血球が乳房に移行、血中白血球低下
- SA:サイトカインの上昇が不顕著
48
49
結果
A/G比(重症度別)
＊各時間点の平均は発生日の平均と比較し、Dunnett法でP値を調整
A/G比± 95％CI
軽度
中度
比較
乳房炎発生日数
重度
考察
重症度による
特異的な免疫応答
A/G比：重度乳房炎における低下が激しい
- 炎症によるグロブリンの産生
- 乳腺損傷によるアルブミンが乳中に滲出
- 生産性との関係:
乾乳前A/G比が低い牛、次乳期乳量は低い
(2021 Cattaneoら)
50
結論
乳房炎原因菌と重症度を
特定する重要性
免疫応答は乳房炎の原因菌と重症度により異なり、
治療の方針もそれに応じて変えるべき
例：大腸菌 → 急性炎症反応 → 敗血症の恐れ →
急性期の対症治療
SA → 弱い炎症反応 → 潜在的継続感染 →
治療後治癒の判定
免疫応答の調節により、抗菌性物質の管理と乳生産
の効率を改善 → キトサンに着目
51
第
5 章:
キトサンの免疫調節機能による
新たな乳房炎対策の検討
Modulate Immune Responses in Mastitis by Chitosan
53
背景
先行研究
乳房炎発生の翌日から、低分子キトサン10g、3日間経口投与
CHI (n=15)
(ng/L)
34
190
28
150
110
22
70
16
30
10
IL12
9.0ab
ab
b 13.5
x xy
x y
a
7.5
12.0
6.0
x
xy x 10.5
yz
4.5
Group:
Group: ns
ns
CRP
46
270
40
230
CON (n=15)
(ng/L)
245
270
210
230
ab
y 190
175
105
110
70
1 2 3.0
3 4 5 6 7
30
35
0.0
IL4
x xy
b ab ab
yz z
a
140
150
z
1.5
CHI (n=15)
xy x x
yz
Group:ns
ns
Group:
Globulin
(g/dL)
5.0
ab
z
Globulin
=15)
4.5
b
b
4.0
3.5
3.0
z 2.5
1 2 3 4 5 6 7
a
2.0
Group: ns
1 2 3 4 5 6 7
乳房炎経過日数
Mean±SD; a,b: キトサン群内P<0.05; x-z: 対照群内P<0.05
1 2 3 4 5 6 7
(Pan, 2021)
背景
13
キトサンの効果
細胞性免疫
IL12
キラーT
(CD8+)
ヘルパーT
(CD4+)
液性免疫
IL4
Igs ↑
B細胞
キトサンによる
新たな乳房炎対策
背景
SDCTに伴う
乳腺感染増加
55
臨床型乳房炎
の再発
抗菌性物質以外の乳房炎対策が必要
試験A
乾乳期乳腺
感染の予防
キトサンの
免疫賦活効果
試験B
臨床型乳房炎
再発の防止
5ーA :
キトサンによる
乾乳期乳腺感染の予防
Prevent Dry Period IMI by Chitosan
A.材料方法
キトサンの乾乳期
乳腺感染の予防効果の調査
試験農場：本学畜産フィールド科学センター
試験期間：2021年6月から2022年6月
供試動物：ホルスタイン種経産牛21頭
(対象10頭、投与11頭)
投与条件：乾乳前の乳汁培養検査で全分房陰性
投与試料：
投与群：50-200kDa キトサン10g＋米ぬか30g
対照群：米ぬか30ｇ
57
58
A.材料方法
試験の流れ
採血
3日間投与
D-4
D-2
乾乳日
(D0)
乳汁培養検査
1wk
2wk
4wk
分娩予定
2週間前
分
娩
調査項目
フィールド調査：衛生スコア(乳房後面)、ティトナー付着日数
臨床効果：乾乳期乳腺感染の発生
免疫動態：血中IL4, IL6, IL10, IL12, IFNγ濃度とA/G比
A.材料方法
59
分析方法
目的：衛生スコアとティトナー付着日数の影響
を配慮しつつ、投与の効果を調べる
• 乾乳期乳腺感染の変化(式1)：
𝑙𝑜𝑔𝑖𝑡ሺ𝐼𝑛𝑓𝑖𝑗𝑘𝑙 ቁ = 𝛽0 + 𝛽1 𝐺𝑟𝑜𝑢𝑝𝑘 + 𝛽2 𝐻𝑦𝑔𝑖𝑒𝑛𝑒𝑙 + 𝛽3 𝑆𝑒𝑎𝑙𝑎𝑛𝑡𝑖 + 𝛾𝑗 ,
• A/G比、サイトカイン濃度(式2)：
𝑌𝑖𝑗𝑘 = 𝛽0 + 𝛽1 𝐺𝑟𝑜𝑢𝑝𝑘 + 𝛽2 𝑇𝑖𝑚𝑒𝑖 + 𝛽3 𝐺𝑟𝑜𝑢𝑝𝑘 × 𝑇𝑖𝑚𝑒𝑖 + 𝛾𝑗 ,
乳腺感染率を影響する要因
Estimate
-2.81
-0.38
0.04
0.69
感染率
感染率
(Intercept)
投与
ティトナー
衛生スコア
投与状況
SE
1.40
0.53
0.07
0.40
P value
0.48
0.59
0.09
感染率
A.結果
60
ティトナー
付着日数
衛生スコア
(予測±95％CI)
A.結果
61
血中サイトカイン濃度とAG比
(平均±95％CI)
分娩前
乾乳前
分娩前
乾乳前
分娩前
乾乳前
分娩前
乾乳前
A/G比
乾乳前
分娩前
5ーB :
キトサンによる
臨床型乳房炎再発の予防
Prevent Clinical Mastitis Recurrence by Chitosan
B.材料方法
キトサンの乳房炎再発の
予防効果の調査
試験農場： 本学畜産フィールド科学センター
試験期間： 2021年6月～2022年2月
供試動物：ホルスタイン種泌乳牛38頭 乳房炎49症例
（投与:22症例、対照:27症例）
投与条件：
同じ原因菌の乳房炎が発生した乳牛2頭を
1頭投与群、1頭対照群にペアリング
投与試料：
投与群：50-200kDaキトサン10ｇ＋米ぬか30ｇ
対照群：米ぬか30ｇ
63
64
B.材料方法
乳
房 D0
炎
後
日
数
試験の流れと調査項目
乳房炎再発の監視
5日間投与
D3
D5
D7
D14
D21
乳汁と血液の採取
調査項目：
臨床効果：細菌学的治癒率、再発までの時間
血液：A/G比、白血球数
乳汁：TNFα, IL1b, IL4, IL6, IL10, IL12, IFNγ,体細胞数
B.材料方法
65
分析方法
目的：乳房炎原因菌、重症度の影響を考慮しつつ、
投与の効果を調査
•
細菌学的な治癒率：
𝑙𝑜𝑔𝑖𝑡 𝐶𝑢𝑟𝑒𝑖𝑗𝑘 = 𝛽0 + 𝛽1 𝐺𝑟𝑜𝑢𝑝𝑗 + 𝛽2 𝑃𝑎𝑡ℎ𝑜𝑔𝑒𝑛𝑘 ,
•
体細胞数、白血球数、AG比、サイトカイン：
𝑌𝑖𝑗𝑘𝑙𝑚𝑛 = 𝛽0 + 𝛽1 𝑃𝑎𝑡ℎ𝑜𝑔𝑒𝑛𝑘 + 𝛽2 𝑆𝑒𝑣𝑒𝑟𝑖𝑡𝑦𝑙 + 𝛽3 𝐺𝑟𝑜𝑢𝑝𝑚 + 𝛽4 𝑇𝑖𝑚𝑒𝑛 +
𝛽5 𝑃𝑎𝑡ℎ𝑜𝑔𝑒𝑛𝑘 × 𝑇𝑖𝑚𝑒𝑛 + 𝛽6 𝑆𝑒𝑣𝑒𝑟𝑖𝑡𝑦𝑙 × 𝑇𝑖𝑚𝑒𝑛 + 𝛽7 𝐺𝑟𝑜𝑢𝑝𝑚 × 𝑇𝑖𝑚𝑒𝑛 + 𝛾𝑗 ,
•
再発までの時間：
ℎ 𝑡 = ℎ0 𝑡 × exp 𝛽1 𝐺𝑟𝑜𝑢𝑝𝑗 + 𝛽2 𝑃𝑎𝑡ℎ𝑜𝑔𝑒𝑛𝑘 ,
66
B.結果
治癒率を影響する要因
P値
0.57
Major原因菌
12.43
0.01
治癒率
投与
OR
1.77
対照
投与
対照
投与
B.結果
67
再発に対する生存分析
生存(再発しない)率
投与
CNS
対照
CNS
投与
Major
対照
Major
投与
OR = 0.91 (CI :0.26-3.21) P = 0.88
主要原因菌 OR = 0.33 (CI: 0.09-1.18) P = 0.09
乳房炎発生後日数
B.結果
68
SCS、DSCC、白血球数、AG比
WBC (100cells/mL)
(平均±95％CI)
乳房炎発生後日数
B.結果
69
乳中サイトカインの変化
(平均±95％CI)
乳房炎発生後日数
考察
70
効果が見られなかった原因
投与量、投与時間：
投与時間
投与量
効果
実験A
3日
10 g/d
無
実験B
5日
10 g/d
無
2021 Zheng ら
56日
0.5 - 2g/kg (採食量)
IL-1, NF-κB↓
分子量(本試験50-200 kDa) ：
30 kDa以上は水溶性が低く生体利用率が低い(2005 KimとRajapakse)
結論
71
キトサンの免疫調節機能
• キトサンの免疫調節機能は見られなかった
• 投与量、投与時間、分子量が原因 ?
総合考察
General discussion
本研究の結果による
乳房炎対策の提案
総合考察
臨床型乳房炎
研究④
原因菌、
重症度別治療
乾乳期治療
研究①
乳頭保護、
衛生の改善
SDCT
実施
研究②
延長治療
回避
抗菌性物質
使用低減
73
潜在性慢性感染
研究②
CMT変法、
DSCCで摘発
再発、重症
の防止
研究③
感染牛の淘汰、
早期乾乳
生産性
向上
74
総合考察
将来展望
乳量(kg/d)
DSCC（％）
3産以上
早期
治療
淘汰
リニアスコア (SCS)
75
結論
本研究で明らかになった知見に基づき
乳房炎対策を立てることは、
抗菌性物質の管理および
乳生産の向上に役立てると考える
76
投稿(予定)論文および学会発表
投稿(予定)論文
Huang, C. H., I. Fujiwara, and N. Kusaba. 2022. Effect of selective dry cow therapy on
dry period intramammary infection dynamics and their association with management
factors in Japan. Anim. Sci. J. 93. https://doi.org/10.1111/asj.13718.
Huang, C. H. and N. Kusaba. 2022. Association between differential somatic cell count
and California Mastitis Test results in Holstein cattle. JDS Communication 3:441 - 445.
https://doi.org/10.3168/jdsc.2022-0249.
Huang, C. H., K. Furukawa, and N. Kusaba. Estimating the nonlinear interaction
between somatic cell score and differential somatic cell count on milk production by
parity using generalized additive models. Manuscript (submitted to Journal of Dairy
Science, under major revision).
Huang, C. H., M. Kayano, and N. Kusaba. Pathogen and severity-dependent immune
responses in bovine mastitis: highlight the dynamics of differential somatic cell count.
Manuscript.
学会発表
黃哲璿、藤原郁歩、草場信之、乳牛に対する選択的乾乳期治療における乳腺感染
の消長と感染予防効果に影響するリスク因子、十勝獣医師会、帯広、2022年6月
黃哲璿、草場信之、牛乳房炎における乳中体細胞組成の変化がCMT変法の結果
に与える影響、第165回日本獣医学会学術集会、麻布、2022年9月
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謝辞
主指導の草場先生、
副指導の宮本先生、川島先生および茅野先生
ご指導、誠にありがとうございました
研究室の学生さん、
FSCの職員さん、うしぶ。の皆さん
ご協力に感謝申し上げます
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