13. DNA 테크놀로지
2018학년도 6번
(1) 유전자 가위
- 생물체 내에서 발견되는 제한효소와 달리, 인위적으로 18~40개의 염기서열을 특이적으
로 인식해 DNA 가닥을 절단하도록 만든 인공 제한효소
(2) 유전자 가위의 발전
① ZFN(Zinc finger nuclease)
- 세 개의 염기서열을 특이적으로 인식하는 아연 집게 도메인(Zinc finger domain)들을
조합해 이은 뒤, FokI restriction endonuclease 도메인을 연결함
② TALEN(Transcription activator-like effector nuclease)
-
식물에
감염하는
Xanthomonas에서
발견된
TALE(Transcription
activator-like
effector) 단백질 내의 TALE DNA-결합 도메인을 얻음
- 염기서열을 한 개씩 특이적으로 인식하는 TALE DNA-결합 도메인들을 조합해 이은 뒤,
FokI resstriction endonuclease 도메인을 연결함
③ RGEN(CRISPR/Cas-derived RNA guided endonulcease)
- 세균과 고세균에 광범위하게 존재하는 타입 II CRISPR/Cas 시스템을 활용
→ 세균에 외래 DNA가 침범할 때마다 외래 DNA의 일부를 세균의 염색체 내 특정 지점에
차곡차곡 삽입함
→ 외래 DNA들이 삽입되어 이어진 부분을 CRISPR (Clusters of regularly interspaced
palindromic repeat) 라고 함
→ CRISPR 부위의 서열을 전사해서 만들어진 CRISPR RNA가 Cas9(CRISPR-associated
protein 9) 과 결합하면, 외래 DNA가 재차 침입했을 때 CRISPR RNA와 상보적으
로 결합해 외래 DNA를 절단함
- 인위적으로 sgRNA(single guide RNA)을 합성해 Cas9과 결합시키면 특정 DNA 서열을
절단하는데 사용할 수 있음
2019 박선우의 MD 단원별 기출분석
(3) 절단된 DNA의 수선
- 유전자 가위가 도입된 세포 내에서 DNA가 절단되면, 첨가한 타겟팅 벡터와 상동 재조
합 되거나, 비상동 말단연결 과정 중 일부 서열의 소실, 삽입, 대체 등이 일어남
2006학년도 26번
<벡터의 연결반응 효율 향상법>
(i) pBR322
• pBR322 벡터에는 AmpR, TetR
두 개의 항생제 내성 유전자가 존재
R
- Tet 내의 제한효소 자리를 잘라 삽입을 원하는 절편과 섞어 연결 반응을 시킴
- 벡터들을 대장균에 형질전환한 후, 암피실린 첨가 배지에서 키움
-> 자가 연결된 벡터와 절편이 삽입된 벡터를 지닌 대장균들이 모두 성장
- 암피실린 첨가 배지에서 자란 대장균들을 복제판 배양법으로 테트라사이클린 첨가 배지
에 옮겨 키움
-> 자가 연결된 벡터를 지닌 대장균만 성장 가능
-> 암피실린 첨가 배지에서 자라고, 테트라사이클린 첨가 배지에서 자라지 못한 콜로니를
획득
2019 박선우의 MD 단원별 기출분석
(ii) pBluescript
• 절편을 삽입할 수 있는 MCS가 LacZ 유전자 내에 존재
- MCS를 제한효소로 잘라 삽입을 원하는 절편과 섞어 연결 반응을 시킴
- 벡터들을 대장균에 형질전환한 후, 암피실린과 X-gal 첨가 배지에서 키움
-> 자가 연결된 벡터와 절편이 삽입된 벡터를 지닌 대장균들이 모두 성장
┏ 자가 연결된 벡터를 지닌 콜로니는 X-gal을 분해해 파란색 콜로니를 생성
┗ 절편이 삽입된 벡터를 지닌 콜로니는 LacZ 유전자가 파괴되어 X-gal을
분해하지 못하므로 흰색 콜로니를 생성
(iii) 알칼리성 포스파테이스 (Alkaline phosphatase) 법
• 벡터를 제한효소로 자른 후 알칼리성 포스파테이스를 처리해 말단의 인산기를 제거
• 삽입하려는 절편과 섞어 연결 반응을 시킴
- 리가아제는 인산과 하이드록시기 사이를 연결하기 때문에 벡터의 자가 결합은 안됨
• 절편이 삽입된 벡터를 형질전환하면 인산이 떨어진 부분을 대장균의 수선 효소들이 고쳐
줌
2019 박선우의 MD 단원별 기출분석
2012학년도 11번
<종양 생성의 과정>
• 상처난 쌍떡잎식물에서 방출된 아세토시린곤 (Acetosyringone)의 신호를 받은 아그로박
테리움이 식물세포에 부착
• vir 신호 전달계가 활성화 되어 박테리아가 가진 Ti 플라스미드 내의 T-DNA 부분이 복
제됨
• 복제된 절편이 식물 세포의 세포질로 유입된 후 핵까지 수송됨
• T-DNA는 자신을 감싸고 있던 단백질들이 떨어진 후 식물 염색체에 무작위로 삽입됨
┏ tmr 좌위 : 시토키닌 합성 유전자들 발현
-> 호르몬들이 식물세포의 분열을 촉진해 종양 유도
┗ tms 좌위 : 옥신 합성 유전자들 발현
- 오파인 생합성 유전자 : 오파인을 합성, 분비해 아그로박테리움의 양분으로 이용됨
2019 박선우의 MD 단원별 기출분석
2009학년도 35번
<식물의 형질전환>
• Ti 플라스미드 내 T-DNA의 LB(Left border), RB(Right border) 서열 사이에 NeoR
항생제 내성 유전 자와 형질전환 하려는 특정 유전자를 삽입
• 조작한 플라스미드를 아그로박테리움에 도입한 후 상처난 잎에 뿌려 감염시킴
┏ 쌍떡잎식물은 바로 감염됨
┗ 외떡잎식물은 아세토시린곤을 뿌려서 감염율을 높임
• 감염된 식물세포를 G418이 들어있는 배지에서 키워 선별
• 탈분화, 비조직화된 세포 덩어리인 캘러스로 자람
• 캘러스에 옥신, 시토키닌을 적당한 비율로 처리해서 형질전환 된 식물로 배양
2019 박선우의 MD 단원별 기출분석
등의
2005학년도 8번
<미니 프렙 (Mini-prep)>
• 대장균 내에서 증폭시킨 플라스미드들을 회수하는 방법
(i) 원심분리 해서 박테리아를 수확
(ii) 용액 I (50 mM 포도당, 10 mM EDTA, 25 mM Tris-HCl(pH8.0) 첨가 후 현탁
(리소자임을 넣기도 함)
(iii) 용액 II(0.2N NaOH, 1.0% SDS) 첨가 후 혼합
(iv) 용액 III(3M 아세트산칼륨 (pH 4.8) 첨가 후 혼합
(v) 원심분리 후 위층을 얻음
▶ 포도당
- 세포가
급격히
터져서
DNA가
부서지지 않도록 삼투압을 맞춰 세포 형태를 유지
▶ EDTA
┏ 2가 양이온 제거
┗ 세포벽을 불안정하게 만듦
▶ NaOH
- 단백질, DNA를 변성
▶ SDS
- 세포막 파괴
▶ 아세트산 칼륨 (Potassium acetate)
- 용액 중화
┏ 박테리아 DNA는 외가닥으로 분리된 후 염기들이 소수성 결합으로 뭉쳐 침전되지만,
플라스미드 DNA는 다시 이중가닥을 형성할 수 있음
┗ 용해도가 낮은 KDS (Potassium dodecyl sulfate)를 형성해 침전시킴
(vi) 이소프로판올을 첨가한 후 혼합
(vii) 원심분리 후 아래층을 얻음
(viii) 침전물을 70 % 에탄올로 세척
(ix) 침전물을 적당한 부피의 완충용액 (TE 완충액)에 녹임
2019 박선우의 MD 단원별 기출분석
2009학년도 22번
<분광 광도계를 이용한 분석>
(i)정량 분석
• 순수한 물질에 대해 파장별로 흡광도를 측정하면, 물질의 농도가 증가할수록 각 파장
마다 흡광도가 비례해서 증가하기 때문에 일정한 흡광 파형이 나타남
- 농도에 따른 흡광 변화가 가장 큰 정점을 잡아 흡광도를 측정해 물질의 농도를 측정
(ii) 정성 분석
• 분리한 DNA 샘플의 순도를 확인하는 실험
- 순수한 물질에 대해 두 파장의 흡광도 비율을 계산하면 항상 일정한 값이 나타남
-> 시료에 다른 물질이 섞여 있으면 비율이 바뀌기 때문에 물질의 순도를 알 수 있음
2019 박선우의 MD 단원별 기출분석
2011학년도 6번
<녹아웃 마우스>
2019 박선우의 MD 단원별 기출분석
2018학년도 23번
2019 박선우의 MD 단원별 기출분석