KÍT ĐỊNH TÍNH FASCIOLA TRONG
HUYẾT THANH NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT ELISA
Chỉ sử dụng cho chẩn đoán
FC-96 : 96 test
Mục đích sử dụng
Bộ thử nghiệm này dùng để phát hiện kháng thể IgG kháng với Fasciola có trong huyết
thanh bệnh nhân bằng kỹ thuật miễn dịch hấp phụ men (ELISA).
Giới thiệu
Fasciola là một loại sán lá, là nguyên nhân gây ra bệnh sán lá gan. Người nhiễm bệnh sán
lá khi ăn cải xong không được nấu chín và một vài thực vật dưới nước khác có ấu trùng
sán lá. Một khi ấu trùng vào cơ thể, ấu trùng thoát khỏi nang đi vào ruột non và di chuyển
đến xoang màng bụng thông qua thành ruột. Ấu trùng xuyên qua màng Glisson vào gan
và ở tại nhu mô gan khoảng trên 9 tuần. Cuối cùng, ấu trùng đi vào ống mật, trưởng thành
và đẻ trứng.
Trong cơ thể, một khi ấu trùng đi vào nhu mô gan thì ở đó có sự phá hủy. Sự tăng sản của
ống mật xảy ra giống với ấu trùng sản xuất độc tố. Khi trưởng thành, sán có thể là nguyên
nhân của dị ứng, tắc nghẽn, xáo trộn quá trình trao đổi chất. Sán trưởng thành có thể tìm
thấy khắp nơi trong cơ thể ngoài gan, ví dụ như túi mật. Sán có thể trở lại nhu mô gan và
hình thành abcess. Vài bệnh nhân có triệu chứng trong vài tuần đầu, tuy nhiên không có
hiện diện của trứng trong phân cho đến khi sán trưởng thành, mất khoảng 8 tuần. Triệu
chứng bao gồm sốt, biếng ăn, giảm cân, thiếu máu, tiêu chảy và nôn. Vài bệnh nhân
không trãi qua bất kỳ triệu chứng nào. Nếu một bệnh nhân dương tính với huyết thanh
chẩn đoán Fasciola, kháng thể sẽ còn trong máu vài năm và sẽ phản ứng chéo với
Schistosoma.
Nắm được chu kỳ vòng đời Fasciola là chìa khóa ngăn chặn tính lan rộng của nhiễm. Sán
trưởng thành trong ký chủ, trường hợp người này, có trứng của Fasciola bên trong cơ thể.
Trứng này theo phân ra ngoài môi trường xung quanh. Trứng sẽ đi vào ốc sên. Từ đó, ấu
trùng hình thành nang và dính vào những thực vật sống dưới nước. Bằng cách nhấn mạnh
việc ăn những thực vật sống dưới nước không được nấu chín trong vùng dịch tễ có bệnh,
sự lan rộng của nhiễm bệnh có thể giảm xuống. Những báo cáo gần đây ước lượng
khoảng 2.4 triệu người bị nhiễm trên toàn thế giới.
Nguyên tắc
Tất cả các giếng đều được phủ kháng nguyên Fasciola. Trong suốt quá trình ủ với huyết
thanh bệnh nhân được pha loãng, kháng thể phản ứng với kháng nguyên được bao phủ
đó. Sau khi rửa để di chuyển những phần khác còn lại của mẫu, enzyme kết hợp (Enzyme
Conjugate) được thêm vào. Nếu kháng thể kết hợp được vào kháng nguyên, thì sau đó
enzyme kết hợp sẽ liên kết với kháng thể này. Sau một chuỗi các quá trình rửa, chất hiện
màu (chromogen – Tetramethylbenzidine hoặc TMB) sẽ được cộng vào. Nếu có mặt của
1
Enzyme Conjugate, peroxidase sẽ xúc tác phản ứng và cho hiện màu từ không màu đến
màu xanh da trời. Cuối cùng thêm vào dung dịch ngừng phản ứng (Stop Solution) và màu
xanh da trời chuyển đến màu vàng sáng. Sau đó, phản ứng có thể đọc bằng mắt hoặc
bằng máy đọc ELISA.
Thành phần bộ kít
Tên thành phần
Thanh thử nghiệm
Mô tả
Ký hiệu
Những giếng gắn kháng MT PLATE
nguyên Fasciola (loại 96
giếng)
Enzyme kết hợp
Một chai chứa 11ml chứa CONJ
protein A kết hợp với
peroxidase
Control dương
Một chai chứa 1ml huyết CONTROL +
thanh thỏ dương tính đã pha
loãng
Control âm
Một chai chứa 1ml huyết CONTROL thanh người âm tính đã pha
loãng
Chất hiện màu
Một chai chứa 11ml TMB
SUBS TMB
Nước rửa (Nồng độ 20X)
Một chai chứa 25ml
WASH BUF
Buffer pha loãng huyết Một hoặc hai chai chứa SPECM DIL
thanh
30ml buffer
Dung dịch ngừng phản ứng Một chai chứa 11ml của SOLN
0.73M phosphoric acid
Lưu ý sử dụng
Không sử dụng dung dịch nếu đã bị kết tủa hoặc lắng cặn. Nước rửa có thể thấy tinh thể
khi lưu giữ dưới 2-80C. Tinh thể sẽ biến mất sau khi pha loãng để thực hiện thử nghiệm.
Không sử dụng huyết thanh có nhiễm vi khuẩn hoặc mỡ cao. Mẫu máu có mỡ cao nên
được lọc trước khi sử dụng.
Xử lý tất cả những mẫu huyết thanh nếu có khả năng có mầm bệnh. Control âm tính đã
được thử nghiệm cho kết quả âm tính với kháng nguyên bề mặt của HBV và kháng thể
HIV. Sản phẩm này nên được sử dụng dưới điều kiện an toàn thích hợp.
Không được cộng azid vào mẫu hoặc bất ký thành phần nào của sản phẩm.
Điều kiện lưu giữ
Các thành phần phản ứng, thanh thử nghiệm được giữ 2-80C.
Chai nước có rửa nắp vặn giữ ở nhiệt độ phòng.
Chuẩn bị
2
Nước rửa: mở nắp và cộng vào chai đã có sẵn 475ml nước cất. Nước rửa đã pha loãng
này chuyển vào chai có nắp vặn với chóp mở hẹp.
Chú ý: Rửa gồm việc làm đầy mỗi giếng bằng nước rửa, lắc, hút ra và làm đầy lại.
Tránh tạo bọt trong giếng trong quá trình rửa.
Lấy và chuẩn bị huyết thanh
Mẫu huyết thanh nên được lấy trong điều kiện vô khuẩn. Máu tủa xuống bên dưới và tiết
ra huyết thanh. Tránh làm máu bị tán huyết. Mẫu huyết thanh nên được giữ 2-80C nếu nó
được phân tích trong một vài ngày tới. Mẫu huyết thanh có thể giữ từ 3-6 tháng bằng
cách giữ ở -200C hoặc thấp hơn.
Không được làm nóng cũng như lặp lại quá trình làm lạnh mẫu huyết thanh.
Mẫu thử nghiệm: thực hiện pha loãng 1:100, sử dụng buffer dùng cho pha loãng (ví dụ:
5μl huyết thanh và 495μl buffer dùng cho pha loãng).
Tiến hành
Vật liệu cung cấp: Thanh thử nghiệm.
Vật liệu cần thiết nhưng không cung cấp
Pipette
Chai có nắp để đựng nước rửa
Ống đong có vạch
Tube cho pha loãng huyết thanh
Giấy thấm
Vật liệu cần thiết
Máy đọc plate ELISA với bước sóng 450nm và 650nm đến 620nm (kết quả có thể đọc
bằng mắt)
Tiến hành
1. Bẻ thanh thử nghiệm (strip) để lấy số giếng (wells) cần thiết (2 giếng cho control)
và đặt vào lỗ giữ wells trên plate.
2. Cộng 100μl (hoặc 2 giọt) của control âm vào giếng 1, 100μl control dương vào
giếng 2 và 100μl huyết thanh bệnh nhân đã được pha loãng (1:64) vào các giếng
còn lại
Chú ý: Control dương và control âm cung cấp trong bộ kít đã được pha loãng.
3. Ủ ở nhiệt độ phòng (15-250C) trong 10 phút.
4. Lắc plate nhẹ và rửa 3 lần với nước rửa đã được pha loãng.
5. Cộng 2 giọt Enzym Conjugate vào mỗi giếng.
6. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
7. Lắc plate nhẹ và rửa 3 lần với nước rửa đã được pha loãng. Úp ngược plate vào
giấy thấm để di chuyển tất cả nước cỏn lại bên trong giếng ra ngoài giấy thấm.
8. Cộng 2 giọt Chromogen vào mỗi giếng.
3
9. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
10. Cộng 2 giọt Stop Solution và lắc nhẹ strip.
Đọc kết quả
Đọc bằng mắt: Nhìn vào mỗi giếng và so sánh với nền trắng (ví dụ: tờ giấy trắng) và ghi
nhận phản ứng là sạch, hoặc +, ++, hoặc +++).
Máy đọc ELISA: Cài đặt bước sóng máy đọc là 450nm/650nm-620nm.
Giới hạn của bộ kít thử nghiệm
Kết quả huyết thanh học sử dụng cho mục đích chẩn đoán nhưng không phải là phương
pháp chẩn đoán duy nhất.
Kiểm tra chất lượng
Thử nghiệm control cho phép đánh giá sự ổn định của bộ kít. Bộ kít không được sử dụng
nếu bất kỳ control nào rơi ra khỏi ngưỡng quy định.
Giá trị ngưỡng chấp nhận cho control là:
Control âm: 0.0 đến 0.09 OD
Control dương: 0.5 hoặc trên 0.5 OD
Xử lý sự cố
Control âm có màu hơi quá, hơi đậm
Điều chỉnh: rửa thêm, di chuyển hết nước rửa từ các giếng ra giấy thấm, không để các
giếng bị khô.
Diễn giải kết quả-Máy đọc ELISA
Đọc tất cả các giếng tại 450nnm/650nm-620nm
Dương tính: Hấp thu bằng hoặc trên 0.1 OD
Âm tính: Hấp thu nhỏ hơn 0.1 OD
Một kết quả đọc OD âm tính cho biết rằng bệnh nhân không có mức kháng thể để phát
hiện. Điều này có thể do miễn dịch của bệnh nhân yếu.
Diễn giải kết quả-Bằng mắt
So sánh kết quả với control. Một mẫu nên diễn giải như một kết quả dương tính nếu mức
độ màu sắc hiện lên rõ ràng.
Kết quả mong đợi
Tỷ lệ cho kết quả dương tính có thể thay đổi giữa các vùng dân cư và địa lý. Nếu có thể,
mỗi phòng thí nghiệm nên thành lập một khoảng chấp nhận cho dân số bệnh nhân.
Dữ liệu thực hiện
4
SCIMEDX
+
-
Phương pháp tham khảo*
+
12
0
0
50
Đồng ý dương tính: 100% (12/12)
Đồng ý âm tính: 100% (50/50)
*: Phương pháp tham khảo: sử dụng kít ELISA thương mại khác.
Không tìm thấy trao đổi chéo với thử nghiệm Trypanosoma cruzi dương tính.
Công ty Việt Ân cam kết bản dịch trên đúng với bản gốc, nếu sai chúng tôi xin chịu trách nhiệm.
CÔNG TY VIỆT ÂN
5