МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего образования
«КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
(ФГБОУ ВО «КубГУ»)
Факультет физико-технический
Кафедра радиофизики и нанотехнологий
КУРСОВОЙ ПРОЕКТ
СПОСОБЫ ИММОБИЛИЗАЦИИ ДНК НА ПОДЛОЖКАХ ИЗ
РАЗЛИЧНЫХ МАТЕРИАЛОВ
Работу выполнил _______________________ Новиков Николай Анатольевич
Курс 2
Направление подготовки 11.03.04 Электроника и Наноэлектроника
Направленность (профиль) Нанотехнологии в электронике
Научный руководитель
канд. хим. наук, доцент _____________________________ Е. Е. Текуцкая
Нормоконтролёр __________________________________ Соколов М.Е
Краснодар
2022
РЕФЕРАТ
Курсовой проект 20 с., 7 рис., 1 табл., 13 источн.
ИММОБИЛИЗАЦИЯ ДНК. ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ, КРЕМНИЙ,
ПОЛИСТИРОЛЬНЫЕ ПЛАНШЕТЫ, БИОПОЛИМЕРЫ
Объектом изучения данного курсового проекта является
иммобилизация ДНК или олигонуклеотидов, осуществляемая для создания
ДНК-биочипов, используемых в электроника и медицине.
Целью работы является исследование методов фиксации ДНК на
различных подложках с целью нахождения наиболее эффективного метода.
В результате выполнения курсового проекта были изучены методы
иммобилизации ДНК на подложках из кремния, слюды и на поверхности
полистирольных планшет.
2
СОДЕРЖАНИЕ
Введение ................................................................................................................... 4
1
Фиксация ДНК на поверхности кремния ....................................................... 5
1.1
Светоиндуцированная нековалентная фиксация .................................... 5
1.1.1 Методика эксперимента .......................................................................... 6
1.1.2 Результаты эксперимента........................................................................ 7
1.2. Фиксация ДНК с помощью серосодержащего производного
фенантролина...................................................................................................... 10
2 Иммобилизация ДНК на поверхности полистирольных планшет ................ 12
2.1 Методы закрепления .................................................................................... 12
2.2 Результаты .................................................................................................... 12
3
Иммобилизация ДНК на поверхности слюды ............................................. 15
3.1. Иммобилизация с помощью ионов металлов .......................................... 15
3.2. Иммобилизация с помощью модификации 3аминопропилтриэтоксиксиланом ..................................................................... 17
Заключение ............................................................................................................ 18
Список использованных источников .................................................................. 19
3
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время вызывает большой интерес возможное создание
различных наноструктур с использованием биологических полимеров. Такие
наноструктуры могут быть использованы во многих сферах науки, в том
числе наноэлектронике, медицине и др. В качестве главного компонента
наноструктур может выступать молекула ДНК благодаря своим уникальным
физическим и химическим свойствам (высокая плотность заряда, большая
жесткость, комплементарность цепочек). ДНК-чипы могут быть
использованы для создания биодатчиков [1], ячеек памяти [2], систем анализа
полиморфизма генов метаболизма [3], (Технология и прим ДНК биочипов)
для определения патогенных микроорганизмов и вирусов, для обнаружения
генно-модифицированных организмов (ГМО) [4]. Именно поэтому очень
важно найти оптимальные методы иммобилизации молекул ДНК на
подложках. Чем эффективнее будет фиксация молекул, тем выше будет
точность анализа, скорость работы чипов.
Помимо методов фиксации на конечный результат влияет и материал
подложки, на которой фиксируется ДНК или олигонуклеотид.
Целью данной работы является рассмотрение некоторых методов фиксации
ДНК на различных подложках. В большинстве случаев проверка результатов
осуществляется с помощью атомно-силовой микроскопии, так как она
позволяет исследовать топографию поверхности подложки путем ее
непосредственной визуализации [5].
4
1 Фиксация ДНК на поверхности кремния
1.1 Светоиндуцированная нековалентная фиксация
Фиксация молекулы ДНК в данном методе обусловлена в большей степени
электростатическими взаимодействиями. Благодаря высокой проводимости
полупроводниковые материалы имеют малые времена релаксации
поверхностных зарядов, что заметно влияет на вероятность фиксации
полиионов. Под действием освещения из собственной области поглощения
генерируются неравновесные заряды на поверхности проводника, что, в
последствии, положительно влияет на вероятность фиксации. Процесс
перезарядки поверхностных состояний полупроводникового кристалла под
действием света изображен на рисунке 1.1
Рисунок 1.1 - Зонные диаграммы приповерхностной области кремния p-типа
проводимости в темноте (a) и при освещении светом в собственной области спектра (б)
при hν> (Ec – Ev).
Ec — дно зоны проводимости, Ev — потолок валентной зоны, Ea — положение уровня
мелкой акцепторной примеси, EF — положение уровня Ферми в нейтральной области
полупроводника, Fn — уровень нейтральности поверхностных состояний, EFs —
положение квазиуровня Ферми на поверхности при освещении, W — толщина области
5
пространственного заряда, di — толщина окисного слоя, L — диффузионная длина
неравновесных электронов
На рисунке 1.1, а изображена зонная диаграмма приповерхностной области
p-типа проводимости при условии термодинамического равновесия. Указаны
положения уровня Ферми Ef и мелкой акцепторной примеси Ea. Отмечен
уровень нейтральности поверхностных центров Fn, соответствующий
нулевому суммарному заряду поверхностных состояний, при условии, что
уровни выше Fn пусты, а ниже – заполнены. Нейтральность такой системы
исходит из равенства положительного заряда, захваченного на
поверхностные состояния и состояния на границе раздела полупроводник—
окисел, и отрицательного некомпенсированного заряда мелкой акцепторной
примеси в обедненной области W.
Освещение поверхности светом с энергией квантов превышающей ширину
запрещенной зоны приводит к генерации неравновесных зарядов (электронов
и дырок) в объеме полупроводника. Зонная диаграмма для такого случая
показана на рисунке 1.1, б. Дырки под воздействием электрического поля
отталкиваются от поверхности и не используются для перезарядки
поверхностных состояний. Электроны захватываются на поверхностные
уровни, создавая избыточный отрицательный заряд. Для наилучшей
эффективности генерации неравновесных носителей источник излучения
должен испускать волну длиной соответствующей глубине поглощения света
в образце в пределах диффузионной длины неосновных носителей заряда L.
Противоположный результат будет наблюдаться при использовании кремния
с противоположными основными носителями (n-типа).
1.1.1 Методика эксперимента
В ходе приготовления образцов использовали ДНК тимуса теленка (Sigma), с
молекулярной массой 𝑀 = 8 ∗ 106 Да, определенной по значению
характеристической вязкости в 0,15 М NaCl. ДНК растворяли в
бидистилированной воде, а после досаливали до 0,005 M NaCl. В некоторых
6
опытах для фиксации ДНК в ее раствор вводили 𝑀𝑔𝐶𝑙2 с конечной
концентрацией в растворе 𝐶𝑀𝑔𝐶𝑙2 = 5 ∗ 10−4 М. Концентрация ДНК в
конечном растворе составила 𝐶𝐷𝑁𝐴 = 2,5 ∗ 10−4 %
В качестве образца кремния использовались монокристаллы кремния p- и nтипа с ориентацией (100). Все образцы кремния до эксперимента
предварительно протравливали в смеси 𝐻2 𝑂 и 𝐻𝐹 в соотношении 10:1 в
течении 2 мин при комнатной температуре. Для образования на поверхности
кремния естественного окисла образцы держали на воздухе 1,5 ч. Для
образования на поверхности кремния искусственного окисла протравленные
образцы помещали в раствор смеси H2O2 и H2SO4 в соотношении 1:1 при
температуре 50 ℃ на 20 с. После этого образцы промывали
дистиллированной водой. На образцы наносили каплю раствора ДНК
объемом ~10 мкл. В качестве источника освещения использовали светодиод с
длиной волны λ=630 и 890 нм. Светодиод располагали на расстоянии 5 мм
над поверхностью капли.
1.1.2 Результаты эксперимента.
На рисунке 1.2, а. изображена необработанная поверхность кремния p-типа.
Используемая в работе поверхность не имеет видимых дефектов. После
обработки никаких различимых эффектов так же не было обнаружено
(рисунок 1.2 б, в).
7
Рисунок 1.2 - Поверхность кремния p-типа до обработки (а), после травления (б) и с
искусственным окислом (в).
Эксперимент показал, что на поверхности кремния с искусственным окислом
не наблюдается фиксация ДНК как при добавлении ионов магния, так и при
их отсутствии (рисунок 1.3. в, а). Не происходит фиксации молекул ДНК и в
образце с естественным окислом, но без добавления 𝑀𝑔𝐶𝑙2 (б). В
присутствии ионов магния ДНК надежно закрепляется на поверхности
кремния p-типа при освещении (г). Повторенный множество раз
эксперимент показал, что для иммобилизации ДНК на поверхности кремния
p-типа может быть совершена только при соблюдении следующих условий:
необходимо наличие очень тонкого слоя окисла (тунельно-прозрачный слой)
и присутствие ионов магния в растворе. Таким образом, можно полагать, что
поверхность монокристаллического кремния p-типа действительно обладает
отрицательным поверхностным зарядом при освещении. Положительные
ионы магния играют связывающую роль между отрицательно заряженной
поверхностью кремния и одноименно заряженной молекулой ДНК[6].
8
Рисунок 1.3 – АСМ изображения поверхности кремния p-типа. (а) – образец с
искусственным окислом, раствор ДНК не содержит 𝑀𝑔𝐶𝑙2. (б) – Образец с естественным
окислом, раствор ДНК не содержит 𝑀𝑔𝐶𝑙2. (в) – образец с искусственным окислом,
раствор ДНК содержит 𝑀𝑔𝐶𝑙2 . (г) - Образец с естественным окислом, раствор ДНК
содержит 𝑀𝑔𝐶𝑙2 . Каждый образец освещали светом.
Аналогичный эксперимент, однако без освещения показал, что ДНК не
фиксируется при любых условиях (искусственный и естественный окисл,
наличие/отсутствие 𝑀𝑔𝐶𝑙2 ). Малейшее попадание света приводит к
мгновенной фиксации ДНК на монокристалл.
Таким образом, был обнаружен способ иммобилизации ДНК на кристалле
кремния p-типа при освещении его светом из собственной области
поглощения.
9
1.2. Фиксация ДНК с помощью серосодержащего производного
фенантролина
Основным отличием от других методов является дополнительное
выдерживание образцов в растворе PhenSH. После этого подложки
высушиваются в потоке воздуха. Процесс иммобилизации ДНК проводился в
течении часа для каждой подложки, а затем образцы промывались водой.
Результаты эксперимента представлены на рисунке 1.2.1. Молекулы ДНК на
АСМ-изображении плохо различимы из-за большой неровности поверхности.
Однако, молекулы ориентированы на подложке, что свидетельствует о
связывании молекул ДНК с поверхностью подложки. Биополимеры не
слипаются на подложке.
Рисунок 1.2.1 – АСМ-изображение подложек из кремния различных типов.(а, б) –
кремний n-типа, (в, г) –кремний p-типа. Подложки выдерживались в течении 72 часов в
10
растворе PhenSH, а затем, после промывки водой, выдерживались в растворе ДНК с
последующей промывкой водой.
Наибольшую эффективность метода можно получить если обрабатывать
подложки из кремния дополнительно ионами магния. В таком случае,
совместное воздействие ионов магния и PhenSH приводит к более сильному
связыванию молекул биополимеров с поверхностью подложки [7]. Результат
эксперимента с добавлением в раствор ДНК ионов магния изображен на
рисунке 1.2.2.
Рисунок 1.2.2 – АСМ-изображение подложек из кремния. Исходный образец (слева)
выдерживался в растворе ДНК с добавлением хлорида магния. Образец справа
предварительно обрабатывался в течении 15 минут в растворе PhenSH. Оба образца после
выдержки промыли водой.
11
2 Иммобилизация ДНК на поверхности полистирольных
планшет
2.1 Методы закрепления
Для закрепления ДНК на поверхности полистирольных планшет ПО
«Ленмедполимер» и Nunc A/S ДНК плазмиды pSK-CAT гидролизовали
рестриктазой Dra1. Полученную смесь метили 32𝑃 по 5’- концам с помощью
Т4-полинуклеотидкиназы. Водные растворы, содержавшие разные
количества фрагментов ДНК, выдерживали 3 мин при +100℃, после чего
помещали в лунки полистирольных планшет (Лунки содержали в себе по 90
мкл буфера PBS-MgCl2 ). После 12 ч инкубации при комнатной температуре,
раствор из лунок удаляли. Иммобилизация ДНК производилось одним из
следующих способов. Способ «А» - Планшеты выдерживали при
атмосферном давлении и температуре +65℃ в течении 10-60 минут. Способ
«B» - планшеты выдерживали три температуре +65℃ в вакууме на
протяжении 10-120 минут. Не зафиксированный материал смывали буфером
1 x SSC с 1 мМ EDТА при +65℃ на протяжении 15 минут и дважды при
комнатной температуре. Количество зафиксированной ДНК определяли с
помощью оценки радиоактивности (Радиоактивность в лунках измеряли с
помощью толуолового сцинтиллятора Packard). Иммобилизация 1 нг ДНК на
полистирольных планшетах Nunc A/S соответствовала 2300±300 имп/мин, а
на планшетах ПО «Ленмедполимер» - 3300±200 имп/мин.
2.2 Результаты
Из данных, указанных в таблице 1 видно, что наибольшее количество
иммобилизированных ДНК на планшетах ПО «Ленмедполимер» достигается
после 10 минут закрепления, как способом «А» так и способом «B».
12
Таблица 2.1 – Фиксация ДНК-рестриктов плазмиды pSK-CAT на
поверхности полистирольных планшет в растворе PBS-𝑀𝑔𝐶𝑙2 в зависимости
от времени закрепления
Планшеты
Количество Способ
внесенной
Время
закрепления закрепления зафиксированной
ДНК, нг
Nunc A/S
50
50
ПО
50
ДНК, нг
А
B
А
«Ленмедполимер»
50
Количество
B
0
0,40±0,04 (6)
10
0,57±0,17 (3)
20
0,59±0,07 (2)
30
0,30±0,02 (3)
60
0,52±0,09 (3)
0
0,40±0,04 (6)
10
0,30±0,09 (3)
20
0,49±0,19 (2)
30
0,34±0,06 (3)
60
0,39±0,06 (3)
120
0,50±0,20 (2)
0
1,40±0,20 (6)
10
2,20±0,40 (3)
20
1,86±0,17 (2)
30
1,77±0,01 (3)
60
1,88±0,16 (3)
0
1,40±0,20 (6)
10
2,22±0,05(3)
20
2,11±0,02(2)
30
2,00±0,20(3)
60
1,88±0,09(3)
120
2,00±0,03(2)
На примере планшет Nunc A/S можно убедится в том, что иммобилизация
фрагментов ДНК на подложке способом «А» достигает максимального
значения через 10 минут закрепления и не изменяется в течении часа. При
фиксации молекул способом «B» было обнаружено, что количество
13
зафиксированной ДНК на подложке достигло максимума за 20 минут. При
увеличении времени закрепления результат ухудшался.
Таким образом, можно заключить что: 1) Для достижения максимальной
величины фиксации ДНК не требуется много времени, достаточно 10-20
минут. 2) Величина максимальной иммобилизации не зависит от способа
закрепления на данных полистирольных планшетах. 3) Эффективность
закрепления ДНК выше на планшетах ПО «Ленмедполимер» в 4 раза по
сравнению с планшетами Nunc A/S[8].
14
3 Иммобилизация ДНК на поверхности слюды
3.1. Иммобилизация с помощью ионов металлов
В большинстве случаев фиксация ДНК на поверхность слюды идет в
присутствии в растворе ионов Mg2+ [9]. Пример такого закрепления
изображен на рисунке 3.1.1.
Рисунок 3.1.1 – АСМ изображение ДНК зафиксированной на поверхности
слюды с помощью ионов Mg2+
Так же были проведены эксперименты по возможной иммобилизации
молекул ДНК на слюде в присутствии ионов Ba2+, Ni2+, Co2+, которые
оказались успешными [10].
Было установлено, что различные ионы по-разному связывают молекулу
ДНК с поверхностью слюды. В ходе экспериментов в работе [10] было
установлено, что чем больше ионный радиус металла, тем хуже он фиксирует
ДНК (Исключением, однако, является Mg2+). На рисунке 3.1.2 показаны АСМ
– изображения ДНК, зафиксированной с помощью различных растворов
металлов.
15
Рисунок 3.1.2 – АСМ – изображения ДНК, зафиксированных на поверхности
слюды в присутствии различных ионов металлов.
Помимо ионного радиуса атома на степень иммобилизации молекул ДНК на
поверхности слюды так же влияют и сами ионы металлов,
взаимодействующие с молекулой ДНК, изменяя её конформацию [11].
16
3.2. Иммобилизация с помощью модификации 3аминопропилтриэтоксиксиланом
Из-за частого взаимодействия ионов металла с молекулами ДНК,
приводящего к изменению конформации последней, был разработан метод
иммобилизации ДНК, при котором поверхность слюды модифицируется 3аминопропилтриэтоксиксиланом (APTES) [12]
Достоинствами данного метода является возможность проводить измерения в
очень щелочных средах (pH до 10). Самым важным преимуществом данного
способа является сохранение суперспиральной структуры ДНК, что было
невозможно при использовании металлов [13].
Однако, данный способ обладает и минусами, среди которых возможная
полимеризация 3-аминопропилтриэтоксиксилана, что приводит к
загрязнению подложки, и, как следствие, ошибкам при анализе
экспериментов.
17
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Основные результаты курсового проекта состоят в следующем:
1 Были изучены способы иммобилизации ДНК на подложках из
кремния. Большую роль в фиксации молекул на кристалле кремния играют
основные носители зарядов в материале. Для кремния n-типа эффективным
методом иммобилизации ДНК является светоиндуцированная нековалентная
фиксация. Так же, связующим компонентом фиксации могут служить
производные фенантролина.
2 Была исследована фиксация ДНК в лунках полистирольных планшет
разных фирм. Результаты экспериментов свидетельствуют о том, что
эффективная фиксация молекул происходит при небольшом количестве
времени,
что
может
сильно
экономить
время
при
промышленном
производстве ДНК-биочипов.
3 Для иммобилизации ДНК на поверхности слюды могут быть
использованы растворы многих металлов. Большую роль в связывании
молекул с поверхностью слюды играет ионный радиус металлов. Для
уменьшения воздействия ионов металлов на молекулу ДНК может быть
использован 3-аминопропилтриэтоксиксилан.
18
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
1. de Abreu F.C., de Paula F.S., Ferreira D.C.M. et al. // Sensors. – 2008. – 8. –
P. 1519 – 1538
2. Song W., Sun T., Song Y. et al. // Talanta. – 2005. – 67. – P. 543 – 547.
3. Создание биочипа для анализа полиморфизма в генах системы
биотрансформации / А.С. Глотов [и др.] // Молекулярная биология.
2005. № 39 (3). С. 403–412.
4. Шляпников, Ю.М. Разработка методов иммобилизации и детекции
фрагментов ДНК на микрочипах: специальность 2.00.10
«биоорганическая химия»: автореферат диссертации на соискание
учёной степени кандидата химических наук / Шляпников Юрий
Михайлович; Московский государственный университет имени М.В.
Ломоносова. – Москва, 2010. – 23 с.
5. Т. И. Шарипов, Р. Ф. Талипов. Оценка количественных параметров
иммобилизации олигонуклеотидов на поверхности слюды // Вестник
Башкирского Университета. – 2010. – Т. 15, №4. – С. 1112-1114.
6. И. Л. Волков, Н.В. Базлов, А.С. Бондаренко. Светоиндуцированная
нековалентная фиксация ДНК и синтетических полиионов на
поверхности монокристаллов кремния // Журнал структурной химии. –
2009. – Т. 50, №5. – С. 999-1006.
7. Соколов П.А. Разработка способов фиксации ДНК на различных
поверхностях и исследование свойств сформированных структур :
специальность 2.00.06 «высокомолекулярные соединения»:
диссертация на соискание ученой степени кандидата физикоматематических наук / Соколов Петр Александрович; СанктПетербургский государственный университет. – Санкт-Петербург,
2014. – 171 с.
8. Беклемишев А.Б., Пичко Н.П. Способ иммобилизации фрагментов ДНК
на полистирольных планшетах. Бесприборная регистрация
19
радиоактивного и хемилюминесцентного излучения в
микробиологических планшетах // Бюллетень Сибирского отделения
Российской Академии Медицинских наук. – 2008. – Т.28, №2. – С.1219.
9. J. Vesenkaa,M. Gutholda,C.L. Tanga,D. Kellerb,E. Delainec,C. Bustamante
Substrate preparation for reliable imaging of DNA molecules with the
scanning force microscope // Ultramicroscopy, 1992, 42–44, 2, 1243–1249.
10.Helen G. Hansma and Daniel E. Laney DNA Binding to Mica Correlates
with Cationic Radius: Assay by Atomic Force Microscopy // Biophysical
Journal, 1996, 70, 1933-1939.
11. Jianping Zheng, Zhuang Li, Aiguo Wu, Hualan Zhou AFM studies of DNA
structures on mica in the presence of alkaline earth metal ions // Biophysical
Chemistry, 2003, 104, 37–43.
12. Shin-ichi TANAKA, Masateru TANIGUCHI and Tomoji K AWAI
Selective Adsorption of DNA onto SiO2 Surface in SiO2 /SiH Pattern //
Japanese Journal of Applied Physics, 2004, 43, 10, 7346–7349.
13.Yuri L. Lyubchenkoa, Luda S. Shlyakhtenkoa and Toshio Ando Imaging of
nucleic acids with atomic force microscopy // Methods. Author manuscript;
available in PMC 2012 June 1
20