UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Degradación de compuestos aromáticos y alicíclicos en la bacteria Azoarcus sp. CIB, y sus aplicaciones biotecnológicas TESIS DOCTORAL DAVID SANZ MATA Madrid, 2020 UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Degradación de compuestos aromáticos y alicíclicos en la bacteria Azoarcus sp. CIB, y sus aplicaciones biotecnológicas Firmado por SANZ MATA, DAVID (FIRMA) el día Memoria presentada por David Sanz Mata, Licenciado en Biología, para optar al grado de Doctor en Biociencias Moleculares por la Universidad Autónoma de Madrid Director: Firmado por DIAZ FERNANDEZ EDUARDO - DNI 00808442S el día Eduardo Díaz Fernández Tutor: HIDALGO HUERTAS AURELIO 30591892Y Firmado digitalmente por HIDALGO HUERTAS AURELIO - 30591892Y Nombre de reconocimiento (DN): c=ES, serialNumber=IDCES-30591892Y, givenName=AURELIO, sn=HIDALGO HUERTAS, cn=HIDALGO HUERTAS AURELIO - 30591892Y Fecha: 2020.04.27 14:21:50 +01'00' Aurelio Hidalgo Huertas CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS MARGARITA SALAS - CSIC Madrid, 2020 ZAFRA GOMEZ FRANCISCO 24170820M Firmado digitalmente por ZAFRA GOMEZ FRANCISCO - 24170820M Nombre de reconocimiento (DN): c=ES, serialNumber=IDCES-24170820M, givenName=FRANCISCO, sn=ZAFRA GOMEZ, cn=ZAFRA GOMEZ FRANCISCO - 24170820M Fecha: 2020.04.27 18:03:25 +02'00' El trabajo presentado en esta memoria ha sido realizado en el Departamento de Biotecnología Microbiana y de Plantas del Centro de Investigaciones Biológicas Margarita Salas (CIB), perteneciente al Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), bajo la dirección del Doctor Eduardo Díaz Fernández. David Sanz Mata ha disfrutado de una beca del Programa de Becas de Doctorado “Formación de Profesorado Universitario (FPU)”, convocatoria 2014, otorgada por el Ministerio de Educación, Cultura y Deporte (actualmente Ministerio de Universidades). A todos los que siempre confiaron en mi “La mayoría de la gente dice que el intelecto es lo que hace a un gran científico. Están equivocados: es el carácter” Albert Einstein Índice Índice Índice Abreviaturas 23 Resumen 29 Abstract 33 Introducción: 37 1. Relevancia de los compuestos aromáticos en la naturaleza 37 2. Catabolismo bacteriano de los compuestos aromáticos 38 2.1. Catabolismo aeróbico 39 2.1.1. Rutas aeróbicas clásicas 39 2.1.2. Rutas aeróbicas híbridas 40 2.2. Catabolismo anaeróbico 42 2.2.1. Rutas periféricas 44 2.2.2. Rutas centrales 45 2.2.2.1. Ruta alta del benzoil-CoA 46 i) Reducción del anillo aromático (desaromatización) 46 ii) β-oxidación modificada 47 2.2.2.2. Ruta baja del benzoil-CoA 47 2.3. Transporte de los compuestos aromáticos 49 2.3.1. Transportadores monocomponente 49 2.3.2. Transportadores multicomponente 50 2.3.3. Transportadores de membrana externa 51 3. Metabolismo de compuestos alicíclicos: degradación del ciclohexano carboxilato (CHC) 51 4. Metabolismo del o-ftalato 53 4.1. Catabolismo aeróbico del o-ftalato (PA) 53 4.2. Catabolismo anaeróbico del PA 54 Objetivos 59 Materiales y métodos: 63 1. Cepas bacterianas y plásmidos 63 2. Medios y condiciones de cultivo 68 2.1. Medios ricos 68 2.2. Medio mínimo 68 11 Índice 2.3. Obtención de condiciones anaeróbicas en los medios de cultivo 69 2.4. Condiciones de cultivo 69 2.5. Conservación de las cepas bacterianas 69 3. Técnicas de manipulación de DNA y RNA 70 3.1. Extracción y purificación de DNA 70 3.2. Reacción de amplificación en cadena con DNA polimerasa termorresistente (PCR) 70 3.3. Ensamblaje de DNA mediante la técnica “Gibson Assembly” 82 3.4. Producción de DNA sintético 82 3.5. Secuenciación automática de DNA 83 3.6. Extracción y purificación de RNA 83 3.7. Ensayos de retrotranscripción (RT-PCR) y PCR cuantitativa 83 3.8. Electroforesis en geles de agarosa 84 4. Procedimientos de transferencia genética 4.1. Transformación de células de E. coli, A. baylyi ADP1 y P. putida KT2440 84 84 mediante choque térmico o electroporación 4.2. Transferencia de plásmidos a Azoarcus sp. CIB, A. communis, B. xenovorans, C. 85 necator y C. pinatubonensis mediante conjugación biparental 5. Construcción de cepas mutantes de deleción en Azoarcus sp. CIB por doble 85 recombinación homóloga 6. Técnicas de manipulación de proteínas. 87 6.1. Electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) 87 6.2. Sobreproducción y purificación de proteínas desde los vectores de expresión 87 pET28 7. Ensayos de actividad enzimática 7.1. Ensayos de actividad β-galactosidasa 8. Ensayos de unión de proteína a DNA 88 88 88 8.1. Marcaje de sondas radiactivas 88 8.2. Ensayos de retardo en gel 89 9. Ensayos de transporte de o-ftalato radiactivo 89 10. Cromatografía líquida de alta presión (HPLC) 90 11. Microscopía electrónica de transmisión (TEM) 90 12. Análisis mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) de la 91 composición y cantidad de PHB intracelular 13. Recursos informáticos 91 Resultados: 95 12 Índice 1. Capítulo 1: Caracterización de la ruta periférica de la degradación anaeróbica del o- 95 ftalato 1.1. Diseño de una cassette recombinante portadora de los genes catabólicos de la ruta 95 periférica de o-ftalato 1.2. Identificación de un transportador activo de o-ftalato. 97 1.3. Diseño de una cassette funcional portadora de la ruta periférica de o-ftalato 99 1.4. Caracterización del transportador (PhtTab) de o-ftalato 101 1.5. La ruta periférica pht del o-ftalato es funcional también en condiciones aeróbicas 102 1.6. Requerimientos de la célula huésped para el metabolismo aeróbico del o-ftalato vía 104 ruta periférica pht 1.7. Aplicaciones biotecnológicas de la cassette pht 2. Capítulo 2: Estudio y caracterización de la ruta bad de Azoarcus sp. CIB 106 108 2.1. La ruta bad no sustituye a la ruta bzd para la degradación anaeróbica del benzoato 109 2.2. Caracterización del cluster bad 112 2.3. Análisis in silico de la distribución del cluster bad en bacterias 113 2.4. Estudio de la regulación del cluster bad 115 2.4.1. Análisis transcripcional y regulación específica de los genes bad 115 2.4.2. Caracterización del inductor de los genes bad 118 2.4.3. Caracterización in vitro de la interacción de BadR con el promotor PaliB 119 2.5. Diseño de una cassette bad para el metabolismo del CHC 3. Capítulo 3: Identificación y estudio de la ruta baja del metabolismo del benzoato, CHC y 121 124 pimelato en Azoarcus sp. CIB 3.1. Identificación de dos clusters implicados en la β-oxidación de ácidos grasos 124 dicarboxílicos en la cepa Azoarcus sp. CIB 3.2. Estudio del cluster aab 127 3.3. Estudio del cluster pim 130 3.4. Diseño y construcción de cassettes híbridas para la degradación de CHC y 133 pimelato Discusión: 139 1. Estudio de la ruta periférica de la degradación de o-ftalato (PA) vía benzoil-CoA 139 1.1. Identificación del primer transportador tipo TAXI-TRAP implicado en el 139 transporte del PA 1.2. La ruta pht permite el catabolismo aeróbico del PA en bacterias con una ruta box 141 funcional 1.3. La cassette pht como herramienta biotecnológica para la revalorización del PA 2. Caracterización de la ruta bad en la cepa Azoarcus sp. CIB 143 144 13 Índice 3. Estudio de la ruta baja de β-oxidación del pimelil-CoA en la cepa Azoarcus sp. CIB: el 147 catabolón del pimelil-CoA 3.1. Estudio del cluster aab que codifica la ruta baja de degradación de benzoato y 148 CHC 3.2. Estudio del cluster pim que codifica la ruta de degradación de pimelato 149 3.3. Diseño de cassettes catabólicas para la degradación de CHC y pimelato 151 Conclusiones 155 Conclusions 159 Bibliografía 163 14 Índice Lista de figuras 1. Esquema de las rutas del catabolismo aeróbico del benzoato 41 2. Esquema del catabolismo anaeróbico del benzoato en diversas bacterias 45 3. Ruta baja del benzoil-CoA 48 4. Esquema del catabolismo del ciclohexano carboxilato en diversas bacterias 52 5. Catabolismo del o-ftalato en organismos aerobios y anaerobios 55 6. Esquema de la técnica Gibson Assembly 82 7. Estrategia seguida para la construcción de los mutantes mediante deleción en Azoarcus sp. 86 CIB 8. Organización del cluster génico implicado en la ruta periférica de degradación del o-ftalato 95 en la bacteria Aromatoleum aromaticum EbN1 9. Esquema de la clonación de los genes phtDa, phtDb, phtSa y phtSb en el vector de 96 expresión pIZ1016 10. Crecimiento de la cepa Azoarcus sp. CIB (pIZPHT) 97 11. Organización del cluster pht en la bacteria Azoarcus sp. PA01 98 12. Ensayos de transporte de [14C]-o-ftalato en A. evansii 99 13. Esquema de la construcción del plásmido pIZPHTRAP 100 14. Crecimiento de la cepa Azoarcus sp. CIB (pIZPHTRAP) 100 15. Ensayos de transporte de [14C]-o-ftalato en Azoarcus sp. CIB (pIZPHT) y Azoarcus sp. 101 CIB (pIZPHTRAP) 16. Crecimiento aeróbico de la cepa Azoarcus sp. CIB (pIZPHTRAP) en o-ftalato 102 17. Esquema de la construcción del plásmido pIZPHTRAPΔPDC 103 18. Crecimiento de la cepa Azoarcus sp. CIB (pIZPHTRAPΔPDC) 104 19. Organización de los clusters génicos responsables de la degradación de benzoato en C. 105 necator H16 vía catecol (ruta ben/cat) o vía benzoil-CoA (ruta box) 20. Crecimiento en o-ftalato y expresión de la ruta box en C. necator H16 (pIZPHTRAP) 106 21. Producción de PHB en C. necator H16 (pIZPHTRAP) 107 15 Índice 22. Degradación del CHC en Azoarcus sp. CIB 109 23. Crecimiento de las cepas Azoarcus sp. CIB y Azoarcus sp. CIBΔbzdW en medio MC a 110 30ºC utilizando benzoato como única fuente de carbono en condiciones anaeróbicas 24. Análisis de la expresión de la ruta bad en Azoarcus sp. CIBΔbzdW 111 25. Crecimiento de las cepas Azoarcus sp. CIBT y Azoarcus sp. CIBTΔbzdW en medio MC 111 a 30ºC utilizando benzoato como única fuente de carbono en condiciones anaeróbicas 26. Crecimiento de las cepas Azoarcus sp. CIB y Azoarcus sp. CIBΔbadHI en medio MC a 112 30ºC utilizando CHC como única fuente de carbono, en condiciones aeróbicas (A) o anaeróbicas (B) 27. Análisis de la expresión de la ruta bad en Azoarcus sp. CIB 113 28. Organización génica de los clusters bad en proteobacterias 114 29. Análisis co-transcripcional de los genes bad en Azoarcus sp. CIB 116 30. Localización de las secuencias de unión de BadR en el cluster bad de Azoarcus sp. CIB 116 31. Expresión de la fusión traduccional PaliB::lacZ en E. coli 117 32. Actividad de BadR sobre la expresión de la fusión traduccional PaliB::lacZ 117 33. Expresión de la fusión traduccional PaliB::lacZ en células de E. coli que contienen los 118 genes badR y aliA 34 Actividad del promotor PaliB en presencia de diferentes inductores 119 35: Clonación, hiperproducción y purificación del regulador BadR 120 36. Ensayos in vitro de la interacción de la proteína BadR con el promotor PaliB 121 37. Esquema de la cassette bad 122 38. Esquema bioquímico propuesto para la transformación del CHC en biotina 123 39. Crecimiento de las cepas E. coli ΔbioH y E. coli ΔbioH (pIZBad) 124 40. Degradación del pimelil-CoA en Azoarcus sp. CIB 125 41. Análisis de la expresión del cluster de β-oxidación I y II en Azoarcus sp. CIB 127 42. Análisis de la expresión del cluster aab y del cluster bad en Azoarcus sp. CIB 127 43. Crecimiento de la cepa Azoarcus sp. CIBΔAzCIB_1938 128 16 Índice 44. Construcción del plásmido pIZBadβ1 y degradación de CHC en huéspedes heterólogos 129 45. Organización y expresión de los genes pim en Azoarcus sp. CIB 131 46. Construcción de los plásmidos pIZPim1, pIZPim2 y pIZPim3 y degradación de pimelato 132 en huéspedes heterólogos 47. Esquema de la estrategia seguida para la clonación de los genes AzCIB_2917 y 134 AzCIB_2911 en el plásmido pIZBadβ1 48. Esquema de la estrategia seguida para la subclonación de la cassette Pim1 y la cassette 135 Pim2 en el plásmido pIZBad 49. Degradación de pimelato y CHC en huéspedes heterólogos 136 50. Árbol filogenético de la proteína de unión a sustrato (SBP) de diferentes transportadores 141 primarios (tipo ABC) y secundarios (tipo TRAP-, TAXI-TRAP, TTT-) de compuestos aromáticos 17 Índice Lista de tablas 1. Cepas bacterianas utilizadas en este trabajo 63 2. Plásmidos empleados en este trabajo 65 3. Oligonucleótidos utilizados 71 19 Abreviaturas Abreviaturas Abreviaturas A Adenina AAHS Aromatic acid:H+ Symporter Family ABC ATP-binding cassette transporters A600 Densidad óptica medida a 600 nm aa Aminoácido ADP Adenosina difosfato ATP Adenosina 5’-trifosfato b Base BCR Benzoil-CoA reductasa BSA Seroalbúmina bovina BTEX Benceno, tolueno, etilbenceno y xilenos Bz Benzoato C Citosina cDNA DNA complementario Ci Curio CHC Ciclohexano carboxilato CHDC Ciclohexano dicarboxilato CoA Coenzima A CNEMC Chinese National Environmental Monitoring Center Ct Carboxilo-terminal Da Dalton DAMP Dimetilalilmonofosfato dATP Desoxiadenosina 5’-trifosfato DCCD N,N’-diciclohexilcarbodiimida dCTP Desoxicitidina 5’-trifosfato dGTP Desoxiguanosina 5’-trifosfato DMSO Dimetilsulfóxido DNA Ácido desoxirribonucleico DNP 2,4, Dinitrofenol dNTP Desoxinucleótido trifosfato DTT Ditiotreitol dTTP Desoxitimidina 5’-trifosfato EDTA Ácido etilendiaminotetracético EPA Environmental Protection Agency Etf Electron transfer flavoprotein FAD Dinucleótido de flavina y adenina FADH Dinucleótido de flavina y adenina reducido 23 Abreviaturas FMN Flavinadenosinmononucleótido G Guanina Gmr Resistencia a gentamicina GTP Guanosina 5’-trifosfato h Hora His6 Secuencia de aminoácidos compuesta por 6 histidinas HTH Motivo hélice-giro-hélice IPA Isoftalato IPTG Kan Isopropil-β-D-tiogalatopiranósido R Resistencia a kanamicina kb kilobase kDa kilodalton Km Constante de Michaelis-Menten lacI Q Gen que codifica el represor LacI del operón lac LB Medio Lysogeny Broth m/v Relación masa/volumen M63 Medio mínimo M63 MC Medio mínimo MC MHS Metabolite:H+ Symporter Family min Minuto ml Mililitro mM Milimolar mob Región para la movilización NAD Nicotinamida-adenina-dinucleótido NADH+H+ Nicotinamida-adenina-dinucleótido reducido NADP Fosfato de nicotinamida-adenina-dinucleótido + 24 + NADPH H Fosfato de nicotinamida-adenina-dinucleótido reducido NCBI National Center for Biotechnology Information nm Nanómetro nt Nucleótido Nt Amino-terminal ori Origen de replicación PA o-ftalato PAEs Phthalic Acid Esters PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida pb Pares de bases PCBs Polychlorinated Biphenyls PCR Reacción en cadena de la polimerasa PDC o-ftaloil-CoA una descarboxilasa Abreviaturas PDB Protein Data Bank PHA Polihidroxialcanoato PHB Polihidroxibutirato Pim Pimelato prFMN Flavinadenosinmononucleótido prenilado PT7 Promotor T7 Ptac Promotor tac PVC Cloruro de polivinilo RBS Secuencia de unión al ribosoma RNA Ácido ribonucleico mRNA RNA mensajero RNAP RNA polimerasa RNAt RNA de transferencia r.p.m. Revoluciones por minuto RT-PCR Reacción de retrotranscripción acoplada a PCR σ Factor sigma de la RNA polimerasa SBP Substrate Binding Protein SDS Dodecilsulfato sódico Sm Estreptomicina SPT o-ftalato succinil-CoA transferasa T Timina TAE Tampón Tris-Acetato-EDTA TAXI TRAP associated extracytoplasmic immunogenic TBDRs TonB-dependent receptors TBE Tampón Tris-Borato-EDTA TE Tampón Tris-EDTA TMDs Transmembrane Domains TPA Tereftalato TRAP Tripartite ATP-independent Periplasmic Tris Tri(hidroximetil)aminometano TTT Tripartite Tricarboxylate Transporters U Unidad de actividad enzimática UTP Uridina trifosfato UV Ultravioleta v/v Relación volumen-volumen X-gal 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido 25 Resumen Resumen La β-proteobacteria Azoarcus sp. CIB es un organismo modelo para el estudio de la degradación anaeróbica/aeróbica de compuestos aromáticos. En esta tesis doctoral se ha profundizado en el conocimiento de dichas rutas metabólicas, ampliando la capacidad degradadora de la cepa CIB a nuevos compuestos contaminantes (o-ftalato) y estudiando el metabolismo de compuestos alicíclicos, como el ciclohexano carboxilato (CHC), cuya degradación converge con la de los compuestos aromáticos a nivel de la ruta baja de β-oxidación de ácidos dicarboxílicos alifáticos (catabolón del (hidroxi)pimelil-CoA). El primer objetivo ha consistido en el desarrollo de una cassette pht (a partir de los genes de Aromatoleum aromaticum EbN1) que incluye tanto los genes catabólicos necesarios para el metabolismo anaeróbico periférico del o-ftalato hasta benzoil-CoA, como los genes phtTaTb, que codifican el primer transportador tipo TAXI-TRAP que se describe para el transporte de o-ftalato y que son esenciales para el crecimiento anaeróbico de la cepa CIB recombinante en o-ftalato. Inesperadamente, la ruta pht también se ha demostrado funcional en presencia de oxígeno, y se ha confirmado la consiguiente mineralización del benzoilCoA generado a través de la ruta aeróbica híbrida box. La expresión de la cassette pht en la bacteria Cupriavidus necator H16 ha permitido el desarrollo de un biocatalizador capaz de revalorizar o-ftalato hacia la producción de polihidroxibutirato (PHB), lo que supone un abordaje pionero para el reciclado de sustancias plastificantes que son también contaminantes emergentes. En el segundo objetivo se han caracterizado los genes bad implicados en el metabolismo aeróbico/anaeróbico del CHC en Azoarcus sp. CIB. A diferencia de lo descrito en bacterias fotótrofas o en anaerobios estrictos degradadores de compuestos aromáticos, la ruta bad de bacterias desnitrificantes, como la cepa CIB, no converge con la ruta central anaeróbica del benzoil-CoA (ruta bzd). Se ha caracterizado la regulación específica del cluster bad de Azoarcus sp. CIB, que está mediada por el represor transcripcional BadR y la molécula inductora CHC-CoA. La presencia de clusters bad con una organización génica similar en diversas proteobacterias sugiere una regulación transcripcional conservada en todos ellos y revela que la capacidad para metabolizar CHC está más extendida de lo que inicialmente se había sospechado. El desarrollo de una cassette bad y su expresión en Escherichia coli para la producción de pimelil-CoA (un precursor de biotina) a partir de CHC es un ejemplo del valor biotecnológico de los estudios realizados. En el tercer objetivo de la tesis se han identificado los genes aab implicados en la ruta baja de βoxidación del (hidroxi)pimelil-CoA derivado de la ruta central anaeróbica del benzoil-CoA (ruta bzd) y de la ruta del CHC en Azoarcus sp. CIB. Un segundo cluster de β-oxidación similar al anterior (genes pim) es el encargado de la degradación de pimelato en la cepa CIB. Aunque los clusters aab y pim se inducen específicamente en presencia de sus diferentes sustratos, la inactivación de uno de ellos se compensa con la inducción del otro. La caracterización del catabolón del (hidroxi)pimelil-CoA para el metabolismo de compuestos aromáticos (anaeróbico), alicíclicos (CHC) y alifáticos (pimelato) ha permitido la construcción de diferentes cassettes metabólicas que, combinadas con los genes bad, permiten expandir la degradación del CHC y pimelato a huéspedes heterólogos, e.g. Pseudomonas putida, y pueden ser de gran interés biotecnológico para la síntesis de nuevos biopolímeros. 29 Abstract Abstract The β-proteobacteria Azoarcus sp. CIB is a model organism for the study of the anaerobic/aerobic degradation of aromatic compounds. In this doctoral thesis, the knowledge on these metabolic pathways has been expanded, broadening the degrading capacity of the CIB strain over new contaminant compounds (PA) and studying the metabolism of alicyclic compounds, such as cyclohexane carboxylate (CHC), whose degradation converge with that of aromatic compounds at the level of the lower pathway of aliphatic dicarboxylic acids β-oxidation (the (hydroxy)pimeloyl-CoA catabolon). The development of a pht cassette (from the Aromatoleum aromaticum EbN1 genes) was the first objective of this work. This cassette includes both the catabolic genes needed for the peripheral anaerobic metabolism of PA to benzoyl-CoA, and the genes phtTaTb that encode for the first TAXI-TRAP transporter described for the transport of PA and that are essential for the anaerobic growth of the recombinant CIB strain in PA. Unexpectedly, the pht pathway has been demonstrated to be functional in the presence of oxygen, and it has been confirmed the subsequent mineralization of the benzoyl-CoA generated through the box hybrid aerobic pathway. The expression of the pht cassette in the bacteria Cupriavidus necator H16 has allowed us to develop a biocatalyst able to valorize PA for polyhydroxybutyrate (PHB) production. This represents a pioneer approach for the recycling of plasticizing substances that are also emerging contaminants. The characterization of the bad genes involved in the aerobic/anaerobic metabolism of CHC in Azoarcus sp. CIB was the second objective of this thesis. Unlike what was described for phototroph bacteria or strict anaerobic degraders of aromatic compounds, the bad pathway of denitrificant bacteria, such as the CIB strain, does not converge with the central anaerobic pathway of benzoyl-CoA (bzd pathway). The specific regulation of the Azoarcus sp. CIB bad cluster, mediated by the BadR transcriptional repressor and the CHCCoA inductor molecule, has been characterized. The presence of bad clusters with a similar genetic organization in diverse proteobacteria suggests a conserved transcriptional regulation and reveals that the capacity to metabolize CHC is more widespread than what it was initially thought. The development of a bad cassette and its expression in E. coli to produce pimeloyl-CoA (a biotin precursor) from CHC is an example of the biotechnological value of these discoveries. The third objective of this work was to identify the aab genes, involved in the lower pathway for the β-oxidation of (hydroxy)pimeloyl-CoA, which is derived from the anaerobic central pathway of benzoyl-CoA (bzd pathway) and the bad pathway in Azoarcus sp. CIB. A second β-oxidation cluster (pim genes), that is similar to the previous one, is responsible for the degradation of pimelate in the CIB strain. Although the aab and pim clusters are specifically induced in the presence of their diverse substrates, the inactivation of one of them is compensated with the induction of the other. The characterization of the catabolon of (hydroxy)pimeloyl-CoA for the metabolism of aromatic (anaerobic conditions), alicyclic (CHC) and aliphatic (pimelate) compounds has allowed us to construct diverse metabolic cassettes that, in combination with the bad genes, allow to widespread CHC and pimelate degradation to heterologous hosts, such as Pseudomonas putida, and that can be of great biotechnological interest for the synthesis of new biopolymers. 33 Introducción Introducción Introducción 1. Relevancia de los compuestos aromáticos en la naturaleza Se denominan compuestos aromáticos a todas aquellas moléculas químicas que poseen estructuras cíclicas, planas y completamente conjugadas, es decir que presentan sus enlaces covalentes dobles alternados con enlaces simples de forma que existe influencia mutua entre ellos lo que permite generar una región llamada de "deslocalización electrónica". Los compuestos aromáticos presentan, por tanto, los electrones π deslocalizados, en concreto (4n+2) siguiendo la regla de Hückel, donde n es un número entero positivo (Vollhardt y Schore, 1994). La "deslocalización electrónica" o energía de resonancia de la nube π, es lo que se denomina "aromaticidad", siendo esta propiedad la responsable de la elevada estabilidad termodinámica característica de este tipo de moléculas. Los compuestos aromáticos, incluyendo las estructuras homocíclicas (derivadas del benceno y por tanto que contienen únicamente átomos de carbono e hidrógeno) y heterocíclicas (que incluyen N-; S-; Oheterociclos), son el segundo grupo más abundante de compuestos orgánicos presentes en la naturaleza, tan solo por detrás de los carbohidratos, y derivan principalmente del polímero denominado lignina. Este polímero polifenólico es uno de los componentes fundamentales de la pared celular de las plantas y constituye el 25% de la biomasa de la Tierra (Katahira et al., 2018; Granja-Travez et al., 2020; Kumar y Chandra, 2020). Otras fuentes naturales de compuestos aromáticos son los flavonoides, taninos, y quinonas (derivados del metabolismo secundario de las plantas), los aminoácidos aromáticos, y los hidrocarburos aromáticos presentes en los combustibles fósiles (Gibson y Harwood, 2002). Por otra parte, los compuestos aromáticos tienen una gran relevancia en la industria moderna ya que se utilizan para producir disolventes, pesticidas o polímeros artificiales como plásticos o fibras sintéticas (Swoboda-Colberg, 1995). A una buena parte de estos compuestos se les denomina "xenobióticos", puesto que tienen un origen antropogénico y su estructura o sustituyentes no se encuentran de forma habitual en la naturaleza (Pieper y Reineke, 2000). Muchos compuestos aromáticos son tóxicos y, debido a la estabilidad termodinámica del anillo bencénico, permanecen en el medio ambiente durante mucho tiempo constituyendo un serio problema de contaminación ambiental (McLeod y Eltis, 2008). Dentro de los compuestos especialmente contaminantes se encuentra el grupo denominado BTEX, constituido por benceno, tolueno, etilbenceno y xilenos, y los hidrocarburos policíclicos aromáticos, entre los que se incluyen el naftaleno, fenantreno o antraceno, que están constituidos por uno o varios anillos de benceno fusionados. Estos compuestos se producen en grandes cantidades, y un tratamiento negligente de los mismos puede conducir a la contaminación de acuíferos y sedimentos (B. Lin et al., 2002; Alegbeleye et al., 2017; Seaton y Neidle, 2018). El caso de los compuestos xenobióticos representa un problema adicional puesto que, además de que están siendo liberados al medio ambiente en altas cantidades, el hecho de que su estructura sea novedosa en la naturaleza hace que todavía no hayan aparecido mecanismos biológicos que permitan su completa degradación, siendo además algunos de estos compuestos particularmente tóxicos, como por ejemplo, los derivados polihalogenados de las dioxinas y los bifenilos (PCBs), los compuestos nitroaromáticos, los derivados fenólicos halogenados (Häggblom, et al., 2000; Abraham et al., 2002), y los ésteres de ftalato (Benjamin et al., 2015; Gao y Wen, 2016). A nivel celular, 37 Introducción el carácter tóxico de los compuestos aromáticos se debe a los daños que producen en la membrana celular, en los ácidos nucleicos y en ciertas proteínas citoplasmáticas, pudiendo ocasionar la muerte celular (de Smet et al., 1978; Sikkema et al., 1995; Casida y Durkin, 2017; Floriano et al., 2019). A nivel sistémico, en los organismos pluricelulares, ciertos compuestos aromáticos pueden provocar desde leves daños dermatológicos hasta graves afecciones del sistema nervioso central y sistema endocrino, favorecer el desarrollo de distintos tipos de cáncer, o malformaciones durante del desarrollo embrionario (Chee-Sanford et al., 1996; Incardona et al., 2004; Annamalai y Namasivayam, 2015). Como se ha indicado anteriormente, los compuestos aromáticos son muy abundantes en la naturaleza y por tanto su reciclaje es indispensable para poder cerrar el ciclo del carbono y para el mantenimiento de la biosfera (Dagley, 1978; Harwood y Parales, 1996; Rabus et al., 2016). En este punto, los microorganismos, incluyendo bacterias, arqueas y hongos, juegan un papel esencial, puesto que no solo han sido capaces de adaptarse a la toxicidad de este tipo de compuestos, sino que además han desarrollado distintas estrategias metabólicas para poder utilizarlos como única fuente de carbono y energía (mineralización) (Harayama y Timmis, 1992; Gibson y Harwood, 2002; Vaillancourt et al., 2004; Díaz, 2004; Fuchs, 2008; Rabus et al., 2016; Durante-Rodríguez et al., 2018). Además, y debido a la promiscuidad que presentan algunas de las enzimas implicadas en el metabolismo de los compuestos aromáticos, ciertas bacterias son capaces de degradar, al menos parcialmente, distintos compuestos xenobióticos que presentan similitud estructural con compuestos aromáticos naturales (Díaz, 2004; McLeod y Eltis, 2008; Carmona et al., 2009; Rabus et al., 2016; Durante-Rodríguez et al., 2018). Por tanto, la utilización de microorganismos para reducir o eliminar contaminantes, también denominada "biorremediación" (Ramos et al., 1994), parece la estrategia ecológica óptima para hacer frente a este problema medioambiental. Una eficaz biorremediación precisa, no obstante, de un mayor conocimiento de las capacidades catabólicas de los microorganismos para diseñar racionalmente nuevas cepas genéticamente modificadas capaces de metabolizar más eficientemente distintos tipos de compuestos aromáticos, incluidos los más tóxicos o recalcitrantes, e incluso mineralizar completamente los compuestos xenobióticos (de Lorenzo, 2001; Rabus et al., 2016; Martínez-García y de Lorenzo, 2019). Por otro lado, las modernas técnicas de biología de sistemas y biología sintética permiten el diseño de auténticas “biorefinerías”, es decir, la utilización de los microorganismos, especialmente las bacterias, para la síntesis de productos de interés industrial, incluyendo ciertos compuestos aromáticos, a partir de fuentes de carbono renovables o de contaminantes (Thompson et al., 2018; Eltis y Singh, 2018; Cao et al., 2019; Huccetogullari et al., 2019; Martínez-García y de Lorenzo, 2019). 2. Catabolismo bacteriano de los compuestos aromáticos El catabolismo de los compuestos aromáticos comprende dos etapas secuenciales: 1) modificación de la densidad electrónica del anillo aromático (activación), y 2) ruptura del anillo aromático. Las estrategias que emplean los microrganismos para realizar estas dos etapas dependen de la presencia o ausencia de oxígeno en el proceso, distinguiéndose, por tanto, el catabolismo aeróbico y el anaeróbico, los cuales presentan una serie de características diferenciales que se detallarán más adelante. En ambos casos las bacterias han desarrollado 38 Introducción una gran variedad de “rutas periféricas”, que son las encargadas de activar los diferentes sustratos y transformarlos en una serie de intermediarios centrales que serán desaromatizados y metabolizados posteriormente a través de las llamadas “rutas centrales” (Heider y Fuchs, 1997; Harwood et al., 1998; Heider et al., 1998; Pieper et al., 2004). La convergencia de la gran diversidad de “rutas periféricas” en unas pocas “rutas centrales”, es lo que se ha denominado “embudo catabólico” (Harayama y Timmis, 1989; Carmona et al., 2009; Sudarsan et al., 2016; Thompson et al., 2018; Durante-Rodríguez et al., 2018; Perez et al., 2019). 2.1. Catabolismo aeróbico 2.1.1. Rutas aeróbicas clásicas En el caso del metabolismo aeróbico de los compuestos aromáticos, el oxígeno es esencial puesto que no solo actúa como aceptor final de electrones en la cadena respiratoria, sino que, además, es necesario como cosustrato de las enzimas (oxigenasas) que catalizan tanto la activación como la ruptura del anillo aromático (Parales y Resnick, 2006; Vaillancourt et al., 2006). La estrategia clásica para la mineralización aeróbica de los compuestos aromáticos consiste en la desestabilización del anillo aromático mediante la incorporación de grupos hidroxilo y la formación de derivados mono-, di- o tri- hidroxilados. Estas rutas periféricas están catalizadas por oxigenasas que pueden ser monooxigenasas o dioxigenasas (Fig. 1) en función de que introduzcan uno o dos grupos hidroxilo, respectivamente (Gibson y Parales, 2000; Seaton y Neidle, 2018); pero en ambos casos requieren oxígeno molecular como co-sustrato, NAD(P)H como poder reductor y cofactores metálicos como el hierro (el más frecuente) (Fetzner, 2000; Seaton y Neidle, 2018). Las enzimas de las rutas periféricas tienen una mayor o menor especificidad por sus sustratos y su síntesis está frecuentemente inducida en presencia de éstos (Heider y Fuchs, 1997). Las diversas “rutas periféricas” generan un número limitado de intermediarios centrales, e.g. catecol, protocatecuato, homoprotocatecuato, gentisato, homogentisato, hidroxiquinol e hidroquinona, que son susceptibles de sufrir una apertura del anillo aromático desestabilizado a través de una serie de “rutas centrales”, generando un compuesto intermediario no aromático. Este proceso de ruptura del anillo aromático está catalizado por dioxigenasas de ruptura, que son metaloenzimas capaces de romper un enlace C-C mediante la adición de dos átomos de oxígeno molecular a los intermediarios centrales hidroxilados (Harayama et al., 1989; Harayama y Timmis, 1992; van der Meer et al., 1992; Harwood y Parales, 1996; Seaton y Neidle, 2018). Mientras que las intradiol dioxigenasas son dependientes de Fe3+ y catalizan la denominada “ruptura ortho”, que ocurre entre los dos grupos hidroxilo de sustratos catecólicos, las extradiol dioxigenasas son dependientes de Fe2+, y catalizan la “ruptura meta” adyacente a uno de los grupos hidroxilo, actuando tanto sobre sustratos catecólicos, e.g. catecol (Fig. 1), protocatecuato, homoprotocatecuato, como sobre aquellos que no presentan dos grupos hidroxilo contiguos, tales como, el gentisato el homogentisato y la hidroquinona (Vaillancourt et al., 2004). Se han descrito también dioxigenasas de ruptura capaces de catalizar la apertura de compuestos monohidroxilados, como el 2aminofenol (Takenaka et al., 1997), el salicilato (2-hidroxibenzoato) (Hintner et al., 2001) y el 1-hidroxi-2naftoato (Iwabuchi y Harayama, 1998), y trihidroxilados como el hidroxiquinol (Armengaud et al., 1999) y el ácido gálico (Nogales et al., 2005). La posterior degradación del compuesto alifático generado tiene lugar a 39 Introducción través de rutas bien caracterizadas como por ejemplo la ruta ortho del β-cetoadipato (Fig. 1) (Gescher et al., 2006), o las rutas de degradación meta, e.g. metil-catecol, homogentisato, gentisato, etc. (Fig. 1) (Vaillancourt et al., 2004). 2.1.2. Rutas aeróbicas híbridas Dentro del metabolismo aeróbico de los compuestos aromáticos se han descrito una serie de rutas enzimáticas denominadas “híbridas” puesto que combinan características tanto del catabolismo aeróbico como del anaeróbico. En la primera etapa, los compuestos aromáticos son transformados a sus respectivos derivados de coenzima A (CoA) mediante una tioesterificación catalizada por aril-CoA ligasas que requieren para su actividad CoA, Mg2+ y ATP (Boll y Fuchs, 1995). El proceso de tioesterificación es una característica típica de las rutas anaeróbicas de degradación de compuestos aromáticos (como se detallará en el apartado 2.2), ya que la unión de la molécula de CoA facilita la desestabilización del anillo aumentando su densidad electrónica (Heider y Fuchs, 1997). En la siguiente etapa se produce la apertura del anillo aromático, y por tanto la pérdida del carácter aromático del derivado de CoA, mediante sucesivas reacciones de oxidación, u oxidación/reducción, en las que se requiere la presencia de oxígeno como cosustrato, lo que es característico de las rutas aeróbicas. Dentro de las rutas híbridas, una de las más estudiadas es la denominada “ruta box” para el metabolismo del benzoato (Fig. 1) (Zaar et al., 2004; Gescher et al., 2005, 2006). Después de la activación del benzoato a benzoil-CoA (ruta periférica), catalizada por la benzoato CoA ligasa (Gescher et al., 2002), la monooxigenasa (epoxidasa) BoxAB adiciona oxígeno molecular en los carbonos 2 y 3 produciendo el correspondiente epoxibenzoil-CoA (Zaar et al., 2004). La posterior apertura del anillo alicíclico del epoxibenzoil-CoA está catalizada por una 2,3-epoxibenzoil-CoA hidrolasa (BoxC), perteneciente a la familia de las enoil-CoA hidratasas/isomerasas (Gescher et al., 2005). Finalmente, el producto alifático originado (3,4dihidroadipil-CoA semialdehído) se metaboliza a través de una serie de reacciones similares a las de la βoxidación de ácidos grasos (todavía no muy bien caracterizadas, y que incluyen la formación de una posible lactona), generando muy probablemente β-cetoadipil-CoA, que es un intermediario de la ruta aeróbica clásica del β-cetoadipato (Gescher et al., 2006). Finalmente, el β-cetoadipil-CoA se transforma en acetil-CoA y succinil-CoA mediante una reacción catalizada por una β-cetoadipil-CoA tiolasa (BoxE) (Fuchs et al., 2011). 40 Introducción Figura 1. Esquema de las rutas del catabolismo aeróbico del benzoato. En sombrado azul se muestra la ruta híbrida box para el metabolismo del benzoato vía benzoil-CoA. En sombreado amarillo se representa la ruta ben-cat para el metabolismo del benzoato a catecol (ruta ben), y la posterior degradación de éste a través de la ruta cat (ruta ortho con ruptura de anillo tipo intradiol catalizada por la enzima catecol 1,2-dioxigenasa) (flecha roja). En sombreado verde se muestra la reacción donde convergen las rutas box y ben/cat. Las enzimas y los intermediarios metabólicos están señalados en cada paso. Se representa además la ruta meta para la degradación del catecol a través de una ruptura de anillo tipo extradiol, catalizada por la enzima catecol-2,3-dioxigenasa (flecha morada). 41 Introducción La ruta box se ha estudiado extensivamente en Azoarcus evansii (actualmente reclasificada como Aromatoleum evansii (Rabus et al., 2019) pero también se ha descrito en otras bacterias tales como Azoarcus sp. CIB (Valderrama et al., 2012), Thauera aromatica (Schühle et al., 2001), Bacillus stearothermophilus (Zaar et al., 2001), Burkholderia xenovorans LB400 (Denef et al., 2006), Comamonas testosteroni (Chen et al., 2014; Suvorova y Gelfand, 2019). También se han descrito otras rutas aeróbicas híbridas tales como la de la degradación del ácido fenilacético en bacterias (Luengo et al., 2001; Bartolomé-Martín et al., 2004, Arias et al., 2008) el 2-aminobenzoato en A. evansii (Schühle et al., 2001); las rutas de degradación de compuestos aromáticos heterocíclicos, como el ácido isonicotínico en Mycobacterium sp. INA1 (Kretzer et al., 1993), y las de degradación de los ácidos 2-furano y 2-tiofeno carboxilato en algunas bacterias (Cripps, 1973; Koenig y Andreesen, 1990). La presencia de estas rutas híbridas puede suponer una ventaja evolutiva para aquellos microorganismos anaerobios facultativos que vivan en ambientes en los que la concentración de oxígeno sufra importantes fluctuaciones, puesto que el derivado de CoA generado puede ser intermediario central tanto para las rutas aeróbicas como para las anaeróbicas. De esta forma, estos microorganismos se garantizan el aprovechamiento de la fuente de carbono independientemente de la presencia o ausencia de oxígeno, lo que puede suponer una ventaja adaptativa con respecto a otros competidores que únicamente posean la ruta aeróbica clásica (Niemetz et al., 1995). 2.2. Catabolismo anaeróbico Se define como ecosistema anóxico aquel en el que el aporte de oxígeno sea inferior al consumo de esta molécula en el medio. Como ejemplos, se pueden destacar: los suelos con difícil drenaje, aguas residuales con alta actividad microbiana, el tracto intestinal de los animales, hábitats acuáticos estáticos, acuíferos subterráneos y sedimentos marinos (Widdel y Rabus, 2001; Lovley, 2003). Muchos de estos ecosistemas están contaminados por compuestos aromáticos, por lo que los microorganismos anaeróbicos capaces de degradarlos constituyen un pilar fundamental de los ciclos biogeoquímicos (Evans y Fuchs 1988; Lovley 2001, 2003; Widdel y Rabus 2001; Gibson y Harwood, 2002; Heider, 2007; Rabus et al., 2016). En estas condiciones, la estrategia para conseguir la desaromatización del anillo aromático difiere sustancialmente a la de las condiciones aeróbicas y se fundamenta en una serie de reacciones de reducción (Gibson y Harwood, 2002; Fuchs, 2008) utilizando como aceptor final de electrones distintos compuestos inorgánicos como el NO3- (que es reducido a NO2¯ o a N2) (Spormann y Widdel 2000), el Fe3+ (que es reducido a Fe2+) (Coates et al., 2001) o el SO42- (que es reducido a SO32- o a SO2-) (Morasch et al., 2004; Peters et al., 2004), u otros menos comunes como el Mn4+, el ClO4-, el Cr4+, el V4+, el óxido de trimetilamina, e incluso algunos compuestos orgánicos como el dimetil sulfóxido (DMSO), el fumarato, etc. (Coates et al., 2002; Gibson y Harwood, 2002; Lovley, 2003; Chakraborty y Coates, 2004; Carmona et al., 2009; Rabus et al., 2016; Durante-Rodríguez et al., 2018). Además, se han descrito microorganismos capaces de fermentar los compuestos aromáticos aunque el rendimiento energético es tan bajo que generalmente los compuestos aromáticos no se mineralizan completamente sino que se transforman en ácidos orgánicos alifáticos de cadena corta, que serán 42 Introducción posteriormente metabolizados por microorganismos metanógenos o reductores de azufre, estableciéndose así una asociación sintrófica entre ellos y los microorganismos fermentadores de compuestos aromáticos (Evans y Fuchs, 1988; M. S. Elshahed et al., 2001). Tradicionalmente, el catabolismo anaeróbico de los compuestos aromáticos ha sido menos estudiado que el catabolismo aeróbico, debido a la dificultad que representa el aislamiento de nuevas cepas anaeróbicas, el crecimiento de cultivos anaeróbicos puros, así como la manipulación genética de estas bacterias. Es por ello por lo que todavía existen muchos interrogantes acerca del metabolismo de los compuestos aromáticos en condiciones anaeróbicas. Sin embargo, durante las últimas décadas se han realizado importantes descubrimientos tanto a nivel bioquímico, mediante la caracterización de las enzimas implicadas en el proceso; como a nivel genético, a través de la identificación de los clusters génicos que codifican estas enzimas, así como del estudio de los mecanismos reguladores que determinan la expresión de estos genes (Carmona et al., 2009; Rabus et al., 2014; Nešvera et al., 2015). En ausencia de oxígeno el anillo aromático presenta una reactividad extremadamente baja, por lo que su metabolismo en condiciones anaeróbicas precisa de unas reacciones poco convencionales. El estudio de estas reacciones metabólicas representa una oportunidad excepcional de adquirir nuevos conocimientos no solo a nivel de ciencia básica (estudios bioquímicos o evolutivos) sino desde el punto de vista biotecnológico debido a las potenciales aplicaciones industriales que se pueden obtener (Fuchs 2008). Existe una serie de microorganismos en los que se ha estudiado más en detalle el metabolismo anaeróbico de los compuestos aromáticos: ▪ α-proteobacterias: Magnetospirillum spp. (Shinoda et al., 2005) y Rhodopseudomonas palustris (Egland et al., 2001; Harwood et al., 1998). ▪ β-proteobacterias: Aromatoleum aromaticum (Rabus, 2005) Azoarcus spp. (Anders et al., 1995; Hirsch et al., 1998; Barragán et al., 2004) y Thauera spp. (Leuthner y Heider, 2000; Philipp y Schink, 2000; Song et al., 2000). ▪ δ-proteobacterias: anaerobias estrictas reductoras de hierro como Geobacter spp. (Coates et al., 2001), reductoras de azufre como Desulfococcus multivorans (Peters et al., 2004), Desulfobacterium, Desulfobacula, Desulfotignum (Durante-Rodríguez et al., 2018); y las fermentadoras Syntrophus aciditrophicus SB (McInerney et al., 2007) y Syntrophorhabdus spp. (Durante-Rodríguez et al., 2018). ▪ -proteobacterias: Sedimenticola spp. y Dechloromarinus spp. (Durante-Rodríguez et al., 2018). ▪ Gram positivos: Desulfitobacterium, Pelotomaculum, y Desulfotomaculum, pertenecientes a la clase Clostridia (Durante-Rodríguez et al., 2018). ▪ Arqueas: como la reductora de hierro Ferroglobus placidus (Tor y Lovley, 2001). De entre las bacterias anaerobias facultativas destacan T. aromatica, Aromatoleum aromaticum, o distintas cepas de Azoarcus y Magnetospirillum como modelos de estudio para la degradación anaeróbica de compuestos aromáticos utilizando nitrato como aceptor final de electrones; así como la bacteria fotótrofa R. palustris. Dentro de los anaerobios estrictos, los organismos modelo son: Geobacter metallireducens y 43 Introducción Ferroglobus placidus, que utilizan hierro como aceptor de electrones; y Syntrophus aciditrophicus, en condiciones de fermentación (Durante-Rodríguez et al., 2018). 2.2.1. Rutas periféricas En el metabolismo anaeróbico las rutas periféricas catalizan la desestabilización del anillo de diversos compuestos aromáticos y su transformación, eliminando en el caso de que sea necesario distintos grupos funcionales, en uno de los 9 intermediarios centrales descritos hasta la fecha: resorcinol (1,3dihidroxibenceno), 6-hidroxinicotinato, pirogalol/floroglucinol (1,3,5-trihidroxibenceno), hidroxihidroquinona (1,2,4-trihidroxibenceno), 2-aminobenzoil-CoA, 3-hidroxibenzoil-CoA, 3-metilbenzoilCoA, 4-metilbenzoil-CoA, y el benzoil-CoA (este último es el mayoritario y mejor estudiado) (Heider y Fuchs, 1997; Harwood et al., 1998; Alhapel et al., 2006; Gibson y Harwood, 2002; Fuchs, 2008; Carmona et al., 2009; Rabus et al., 2016; Durante-Rodríguez et al., 2018). Como se indicó anteriormente, la molécula de CoA ejerce un papel desestabilizador del anillo aromático, al igual que ocurre con los grupos hidroxilo en el metabolismo aeróbico (Heider y Fuchs, 1997). La activación o incorporación de CoA al compuesto aromático ocurre a través de una reacción de tioesterificación catalizada por las enzimas denominadas aril-CoA ligasas, que utilizan Mg2+ como cofactor, así como dos sustratos, CoA y ATP (este último se hidroliza a AMP + 2Pi). Se han identificado y estudiado diversas CoA ligasas implicadas en el catabolismo anaeróbico de compuestos aromáticos en distintos microorganismos, de entre las que cabe destacar las benzoato-CoA ligasas de R. palustris, T. aromatica, Azoarcus sp. CIB (Fig. 2) (Egland et al., 1995; Schühle et al., 2003; Barragán et al., 2004), las 4hidroxibenzoato-CoA ligasas de R. palustris y T. aromatica (Biegert et al., 1993; Gibson et al., 1994), o la 3metilbenzoato-CoA ligasa de Azoarcus sp. CIB (Juárez et al., 2013). En algunas bacterias, como en algunos reductores de hierro pertenecientes a la familia Geobacteraceae (Oberender et al., 2012), en reductores de azufre o en microorganismos fermentadores (Kuever et al., 2014), la activación del compuesto aromático al correspondiente aril-CoA derivado tiene lugar a través de CoA transferasas que incorporan CoA a partir de acetil-CoA/succinil-CoA (Leuthner y Heider, 2000; Martín-Moldes et al., 2016; Blázquez et al., 2018). Cabe destacar que un mismo microorganismo puede codificar diferentes aril-CoA ligasas capaces de reconocer el mismo sustrato aromático, como es el caso de R. palustris en cuyo genoma se encuentran los genes badA, hbaA y aliA que codifican una benzoato-CoA ligasa, una 4-hidroxibenzoato-CoA ligasa y una ciclohexanocarboxilato-CoA ligasa, respectivamente, todas ellas capaces de catalizar la activación del benzoato a benzoil-CoA (Egland et al., 1995). Por el contrario, existen microorganismos como T. aromatica o Magnetospirillum spp. que han evolucionado una única benzoato-CoA ligasa tanto para la ruta aeróbica hibrida box como para la ruta anaeróbica bzd (Carmona et al., 2009; Durante-Rodríguez et al., 2018). 44 Introducción Figura 2. Esquema del catabolismo anaeróbico del benzoato en diversas bacterias. Las diferentes etapas de la degradación se encuentran sombreadas en diferentes colores: (I) Ruta periférica o de activación del benzoato a benzoilCoA por medio de la benzoato-CoA ligasa (sombreado rojo); (II) Ruta central del benzoil-CoA (sombreado amarillo) donde tiene lugar la reducción del anillo aromático por medio de la benzoil-CoA reductasa (sombrado azul oscuro) y la β-oxidación modificada (sombreado verde) mediante hidratación (flechas verde oscuro), deshidrogenación (flechas azul claro) e hidrólisis (flechas naranjas) del compuesto alicíclico; (III) Ruta baja del benzoil-CoA (sombreado gris) que genera 3 moléculas de acetil-CoA y una de CO2. Se indican también las enzimas implicadas en cada una de las etapas señaladas en R. palustris (Bad), Thauera/Magnetospirillum (Bcr), Azoarcus (Bzd), Geobacter/Syntrophus/ Desulfitobacterium (Bam). Los metabolitos representados en la figura se indican a continuación: (1) benzoato; (2) benzoil-CoA; (3) ciclohex1,5-dieno-1-carbonil-CoA (dienoil-CoA); (4) ciclohex-1-eno-1-carbonil-CoA (monoenoil-CoA); (5) 6-hidroxiciclohex1-eno-1-carbonil-CoA; (6) 2-hidroxiciclohexano-1-carbonil-CoA; (7) 6-cetociclohex-1-eno-1-carbonil-CoA; (8) 2cetociclohexano-1-carbonil-CoA; (9) 3-hidroxipimelil-CoA; (10) pimelil-CoA. 2.2.2. Rutas centrales El intermediario central más común en la degradación anaeróbica de compuestos monoaromáticos es el benzoil-CoA, puesto que en él convergen las diferentes rutas periféricas de una gran variedad de compuestos aromáticos tales como el etilbenceno, bencilalcohol, p-cresol, tolueno, fenol, fenilacetato, fenilpropionato, fenilalanina, vanilina, anilina, benzoato, y sus derivados hidroxilados o aminados, así como moléculas aromáticas halogenadas (Egland et al., 1997; Heider y Fuchs, 1997; Breese et al., 1998; Harwood et al., 1998; Schink et al., 2000; Barragán et al., 2004; Samanta y Harwood, 2005; Shinoda et al., 2005; Wischgoll et al., 2005; McInerney et al., 2007; Rabus et al., 2016; Durante-Rodríguez et al., 2018). Las rutas de degradación del 3-hidroxibenzoil-CoA, 2-aminobenzoil-CoA, 3-metilbenzoil-CoA y 4-metilbenzoil-CoA han sido mucho menos estudiadas (Lochmeyer et al., 1992; Heider et al., 1998; Philipp y Schink, 2000; Schink et al., 2000; Laempe et al., 2001; Boll, 2005b; Darley et al., 2007; Wöhlbrand et al., 2008; Lahme et al., 2012; Juárez et al., 2013). Algunas rutas periféricas generan intermediarios aromáticos tales como el floroglucinol, resorcinol, 6hidroxinicotinato e hidroxihidroquinona, que no requieren la activación mediada por CoA debido a la menor aromaticidad de su anillo. En estos casos, el anillo aromático es susceptible de ser reducido, sin gasto de ATP, 45 Introducción mediante la acción de enzimas que utilizan directamente NAD(P)H, en el caso del floroglucinol y la hidroxiquinona (Haddock y Ferry, 1989; Schink et al., 2000; Pacheco-Sánchez et al., 2019) o ferredoxinas, en el caso del resorcinol (Kluge et al., 1990; Darley et al., 2007; Molina-Fuentes et al., 2015; Pacheco-Sánchez et al., 2017) y 6-hidroxinicotinato (Alhapel et al., 2006). La ruta central del benzoil-CoA se estructura en dos módulos catabólicos: i) la ruta alta, que comprende la transformación del benzoil-CoA hasta un compuesto alifático de 7 carbonos (pimelil-CoA o 3hidroxipimelil-CoA), y ii) la ruta baja, que engloba la conversión de este compuesto alifático C7-dicarboxilCoA en acetil-CoA y glutaril-CoA a través de una serie de reacciones similares a las de la β-oxidación de ácidos dicarboxílicos (Carmona y Díaz, 2005; Blázquez et al., 2008; Carmona et al., 2009; Rabus et al., 2016; Durante-Rodríguez et al., 2018). 2.2.2.1. Ruta alta del benzoil-CoA La ruta alta del benzoil-CoA se estructura en dos módulos metabólicos principales: i) la reducción del anillo aromático del benzoil-CoA, y ii) la β-oxidación modificada del compuesto alicíclico generado (Fig. 2). i. Reducción del anillo aromático (desaromatización) Esta es la etapa clave de la degradación anaeróbica puesto que supone la pérdida del carácter aromático del compuesto intermediario. Esta reacción está catalizada por la benzoil-CoA reductasa (BCR), siendo esta enzima la única de toda la ruta que es sensible a la presencia de oxígeno (Boll y Fuchs, 1995). El benzoil-CoA se reduce mediante un mecanismo semejante a la reacción de Birch, en la que ocurre una transferencia secuencial de electrones y protones a potenciales rédox extremadamente bajos (Boll et al., 2002; Boll, 2005a, 2005b; Meckenstock et al., 2016). Esta reducción está facilitada la por presencia del grupo tioéster, lo cual explica por qué las rutas anaeróbicas suelen implicar tioésteres de CoA (Fuchs 2008; Meckenstock et al., 2016). En el caso de BCRs de bacterias anaerobias facultativas, tales como las de T. aromatica (Boll y Fuchs, 1995), R. palustris (Gibson y Gibson, 1992), Azoarcus spp. (Barragán et al., 2004; Ebenau-Jehle et al., 2003), se trata de heterotetrámeros que requieren la hidrólisis de dos moléculas de ATP para vencer la barrera energética de reducción del anillo y se clasifican como BCRs clase I (Boll, 2005b). Por el contrario, las BCRs de bacterias anaerobias estrictas, tales como las de G. metallireducens, Desulfococcus multivorans y S. aciditrophicus (Kung et al., 2009; Löffler et al., 2011), se clasifican como BCRs clase II y son complejos enzimáticos que realizan la reducción del anillo aromático independientemente de ATP y utilizando mecanismos de bifurcación de electrones (Boll et al., 2016; Meckenstock et al., 2016). Por otra parte, las BCRs clase I se clasifican en dos grupos en función del producto alicíclico que generan: i) BCRs tipo Thauera: el benzoil-CoA se reduce a ciclohex-1,5-dieno-1-carbonil-CoA (dienoil-CoA) como ocurre en T. aromatica, Azoarcus spp., Magnetospirillum spp., Desulfococcus multivorans, G. metallireducens y S. aciditrophicus (Fig. 2); ii) BCRs tipo Rhodopseudomonas: se produce una reducción extra que implica dos electrones adicionales y que da lugar a ciclohex-1-eno-1-carbonil-CoA (enoil-CoA) como ocurre en R. palustris (Egland et al., 1997; Boll 2005a, 2005b; Carmona y Díaz, 2005; Boll et al., 2016). 46 Introducción ii. β-oxidación modificada El producto alicíclico, mono- o dienoil-CoA, generado por la acción de las BCRs, se metaboliza posteriormente mediante una serie de reacciones similares a las de la β-oxidación de ácidos grasos (Fig. 2). Primero, el compuesto alicíclico sufre la incorporación de una molécula de agua al doble enlace catalizada por una acil-CoA hidratasa, a continuación, se produce una deshidrogenación mediada por una hidroxiacil-CoA deshidrogenasa y, finalmente, el compuesto alicíclico se hidroliza por medio de una oxoacil-CoA hidrolasa, generando un compuesto alifático C7-dicarboxil-CoA. Dependiendo de la naturaleza del producto de la reducción del benzoil-CoA, se han identificado dos vías alternativas (Fig. 2): i) β-oxidación tipo Thauera: es la más frecuente, emplea como sustrato el dienoil-CoA cíclico y genera 3-hidroxipimelil-CoA (Harwood et al., 1998; Laempe et al., 1998; Laempe, et al., 1999); ii) β-oxidación tipo Rhodopseudomonas: descrita únicamente en R. palustris, cataliza la transformación del enoil-CoA cíclico producto de la BCR dando lugar a pimelil-CoA (Harwood et al., 1998; Pelletier y Harwood, 1998, 2000). El análisis comparativo de las enzimas implicadas en las dos variantes de la β-oxidación revela diferencias significativas tanto a nivel de secuencia primaria como a nivel de especificidad de sustrato (Carmona et al., 2009; Durante-Rodríguez et al., 2018). Los genes implicados en la ruta alta del metabolismo anaeróbico del benzoato, incluyendo la benzoatoCoA ligasa, se suelen agrupar en un único cluster, como por ejemplo el cluster bad de R. palustris, el cluster bcr de T. aromatica y Magnetospirillum, el cluster bzd de Azoarcus spp. y Syntrophus aciditrophicus o el cluster bam de G. metallireducens (Gibson y Harwood, 2002; Carmona et al., 2009; Durante-Rodríguez et al., 2018). La mayoría de estos clusters suelen contener también genes reguladores transcripcionales específicos y genes que codifican presuntos transportadores para la entrada del benzoato al interior celular (Carmona et al., 2009; Durante-Rodríguez et al., 2018). Los reguladores transcripcionales específicos mejor estudiados hasta la fecha son las proteínas BadR y BzdR que controlan las rutas anaeróbicas para la degradación de benzoato en R. palustris y Azoarcus sp. CIB, respectivamente (Egland y Harwood, 1999; Barragán et al., 2005; Hirakawa et al., 2015; Durante-Rodríguez et al., 2019). 2.2.2.2. Ruta baja del benzoil-CoA A través de la ruta baja el compuesto alifático C7-dicarboxil-CoA se transforma en acetil-CoA y glutaril-CoA, que es finalmente oxidado a dos moléculas de acetil-CoA y CO2 (Gallus y Schink, 1994; Harrison y Harwood, 2005) (Fig. 3). El pimelil-CoA que se genera en la ruta alta de Rhodopseudomonas se convierte en 3-hidroxipimelil-CoA, por lo que su degradación converge con la de la ruta tipo Thauera (Fig. 3) (Harrison y Harwood, 2005). Las bacterias presentan diversos genes codificantes de enzimas que podrían participar en el catabolismo de estos intermediarios dicarboxil-CoA, que pueden provenir no solo del catabolismo anaeróbico de ácidos aromáticos, sino también del metabolismo de compuestos alicíclicos, como el ciclohexano carboxilato (Fig. 2), o del catabolismo de determinados compuestos alifáticos como los ácidos dicarboxílicos, e.g. pimelato (Fig. 3). 47 Introducción Figura 3. Ruta baja del benzoil-CoA. A través de la ruta central, el benzoil-CoA se transforma en pimelil-CoA (R. palustris) o 3-hidroxipimelil-CoA (en otras bacterias), dos intermediarios de la ruta de degradación del ácido graso dicarboxílico pimelato. El compuesto C7-dicarboxil-CoA se degrada a través de la serie de reacciones que se muestran hasta dar lugar a tres moléculas de acetil-CoA y una de CO2. La ruta baja consiste en una β-oxidación de ácidos grasos dicarboxílicos de cadena larga (flechas verdes), una etapa enzimática catalizada por la glutaril-CoA deshidrogenasa (flecha roja) y una β-oxidación de ácidos grasos de cadena corta (flechas azules). Las actividades de las enzimas Pim se detallan a continuación: PimA (acil-CoA ligasa); PimCD (acil-CoA deshidrogenasa); PimF (enoil-CoA hidratasa); PimE (hidroxiacil-CoA deshidrogensasa); PimB (β-cetotiolasa). En R. palustris se han caracterizado varios clusters de genes pimFABCDE que se inducen específicamente cuando las células crecen anaeróbicamente en benzoato (o pimelato). Los genes pim codifican todas las enzimas necesarias para llevar a cabo la β-oxidación de los ácidos dicarboxílicos de cadena impar hasta glutaril-CoA (Larimer et al., 2004; Harrison y Harwood, 2005; VerBerkmoes et al., 2006). En el genoma de otras bacterias anaerobias degradadoras de compuestos aromáticos, tales como A. aromaticum sp. EbN1 (Rabus, 2005), Azoarcus sp. CIB (Martín-Moldes et al., 2015) y G. metallireducens (Butler et al., 2007), se han identificado in silico diversos clusters génicos que codifican posibles rutas de β-oxidación de ácidos dicarboxílicos, pero ninguno de ellos se ha confirmado y caracterizado experimentalmente. La oxidación y descarboxilación del glutaril-CoA a crotonil-CoA está catalizada en la mayoría de las bacterias por una glutaril-CoA deshidrogenasa bifuncional codificada por el gen gcdH (Fig. 3) (Blázquez et al., 2008; Wischgoll et al., 2009). Sin embargo, en las bacterias fermentadoras o en las reductoras de sulfato, el glutaril-CoA es oxidado por una glutaril-CoA deshidrogenasa dependiente de NAD+ (Wischgoll et al., 2009, 2010) y el glutaconil-CoA generado es descarboxilado gracias a una glutaconil-CoA descarboxilasa 48 Introducción multicomponente anclada a la membrana que sintetiza ATP (Dimroth y Schink, 1998). La transformación del crotonil-CoA en acetil-CoA forma parte del catabolismo de ácidos grasos de cadena corta, e implica las actividades de una crotonil-CoA hidratasa (3-hidroxibutiril-CoA deshidratasa), una 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa y una acetoacetil-CoA tiolasa (Fig. 3) (Gallus y Schink, 1994; Auburger y Winter, 1996; Elshahed et al., 2001; Elshahed y McInerney, 2001). Los genes codificantes de dichas enzimas se han identificado mediante análisis in silico en el genoma de algunos biodegradadores anaeróbicos (Harrison y Harwood, 2005; Martín-Moldes et al., 2015; Rabus, 2005). 2.3. Transporte de los compuestos aromáticos Aunque el carácter hidrofóbico de muchos compuestos aromáticos les permite atravesar la membrana citoplásmica de las bacterias por difusión pasiva, es frecuente la existencia de transportadores específicos que facilitan la entrada de estos compuestos al interior de la célula. Por otro lado, el transporte de ciertos compuestos aromáticos polares, e.g. ácidos aromáticos, puede llegar a ser esencial para la degradación de estas moléculas, y está en muchos casos relacionado con la quimiotaxis positiva hacia dichas fuentes de carbono (Martín-Moldes et al., 2016). Los genes que codifican los transportadores suelen encontrarse asociados a los genes catabólicos y reguladores formando parte del mismo cluster génico. Si bien se han estudiado y caracterizado varios transportadores de compuestos aromáticos en las rutas de degradación aeróbica (Kamimura et al., 2017), y existen algunos estudios in vitro con proteínas transportadoras de compuestos aromáticos en la bacteria anaerobia R. palustris (Michalska et al., 2012; Salmon et al., 2013; Tan et al., 2013), hasta la fecha no se ha demostrado in vivo la necesidad de un transporte activo para la degradación anaeróbica de los compuestos aromáticos. De hecho, se ha sugerido que la activación de los compuestos aromáticos a sus correspondientes derivados CoA en el metabolismo anaeróbico podría ser un mecanismo que facilitase su acumulación en el citoplasma favoreciendo así su transporte por difusión pasiva (Fuchs, 2008; Carmona et al., 2009). Los transportadores de compuestos aromáticos que se han estudiado con mayor detalle se corresponden con los implicados en el transporte de ácidos aromáticos y otros monómeros que derivan de la lignina (Kamimura et al., 2017). Estos sistemas de transporte activo pueden ser monocomponente o multicomponente, y pueden requerir ATP (transportadores primarios) o la fuerza protón-motriz (transportadores secundarios) como fuente de energía. 2.3.1. Transportadores monocomponente Los transportadores MFS (Major Facilitator Superfamily) son los transportadores secundarios de membrana interna mejor estudiados (Pao et al., 1998). Son proteínas de entre 400-600 aminoácidos que poseen 12-14 α-hélices que les permiten integrarse en la membrana plasmática (Reddy et al., 2012). Pueden catalizar diferentes tipos de transporte como el uniporte de un solo sustrato, el simporte sustrato:catión (Na +, H+, entre otros) o el antiporte sustrato:sustrato o sustrato:catión (Yan, 2015), y han sido clasificados en 83 familias distintas (Västermark et al., 2014). En concreto, la mayor parte de los transportadores MFS de compuestos 49 Introducción aromáticos pertenecen a la familia 15 y catalizan el transporte tipo simporte acido aromático:H+ (AAHS), e.g. PcaK (p-hidroxibenzoato y protocatecuato), MhbT (3-hidroxibenzoato), BenK (benzoato), GenK (gentisato), VanK (vanilato), GalT (galato) (Nichols y Harwood, 1997; D’Argenio et al., 1999; Merkens et al., 2005; Nogales et al., 2011; Seaton y Neidle, 2018), o PmdK para el transporte de protocatecuato en Comamonas sp. E6 (Kamimura et al., 2010). Sin embargo, el transportador CouT de R. jostii RHA1, para la adquisición al interior celular de sustratos aromáticos como el ferulato, el p-coumarato y el dihidroferulato, pertenece a la Familia 6 de transportadores MFS que catalizan el simporte metabolito:H+ (MHS) (Otani et al., 2014). Existen también algunos ejemplos de transportadores de compuestos aromáticos monocomponente que no pertenecen a la superfamilia MFS. Es el caso de la proteína GacP perteneciente a la superfamilia de transportadores de iones (IT, ion transporter) y que interviene en el transporte de galato en Lactobacillus plantarum WCFS1 (Reverón et al., 2017). 2.3.2. Transportadores multicomponente Son aquellos que están constituídos por una proteína de unión al sustrato (SBP, Substrate Binding Protein) que interacciona con un componente integral de membrana. Los más extendidos y mejor estudiados son los transportadores ABC (ATP-binding cassette transporters) que se encuentran en arqueas, procariotas y eucariotas y requieren energía en forma de ATP para realizar su función (transportadores primarios) (Fath y Kolter, 1993). Generalmente están constituidos por dos proteínas transmembrana, dos proteínas con dominios de unión a nucleótidos que forman la subunidad ATPasa citoplasmática y que se encuentran interaccionando con las proteínas transmembrana (TMDs) (Wilkens, 2015), y la subunidad SBP de reconocimiento del sustrato que se encuentra en el periplasma en el caso de las bacterias Gram-negativas o unida a la proteína transmembrana en el caso de las bacterias Gram-positivas (Berntsson et al., 2010). Como ejemplos de transportadores ABC de sustratos aromáticos cabe destacar el transportador PatDCAB (o-ftalato) (Hara, et al., 2010), PcaMNVW (protocatecuato) (Maclean et al., 2011), o el transportador CouPSTU (p-cumarato, cinamato, cafeato y ferulato) (Salmon et al., 2013). Además, se han identificado 12 presuntas SBP mediante ensayos bioquímicos in vitro capaces de reconocer diferentes compuestos aromáticos derivados de la lignina en diversas cepas R. palustris (CGA009, HaA2, BisB5) S. meliloti 1021 y B. diazoefficiens USDA 110 (Michalska et al., 2012; Tan et al., 2013). Los transportadores tipo TRAP (tripartite ATP-independent periplasmic) están constituidos por una SBP y dos TMDs que tienen entre 4 y 12 hélices α, que les permite integrarse en la membrana y formar el canal. Como en el caso de los transportadores MFS, no requieren ATP para llevar a cabo su función, sino que dependen de la fuerza protón motriz (H+ o Na+). Este tipo de transportadores secundarios se encuentran ampliamente distribuidos en procariotas, sin embargo, no están presentes en eucariotas (Mulligan et al., 2011; Rosa et al., 2018). Hasta la fecha se han descrito únicamente tres transportadores TRAP involucrados en la incorporación de compuestos aromáticos: FcbT1-3 en Comamonas sp. DJ-12, para el transporte del 4clorobenzoato (Chae et al., 2000; Chae y Zylstra, 2006); TarPQM en R. palustris CGA009, para el transporte de p-cumarato, cinamato, cafeato y ferulato (Salmon et al., 2013); y TphC-TpiAB en Comamonas sp. Strain E6, para el transporte del tereftalato (Hosaka et al., 2013). 50 Introducción 2.3.3. Transportadores de membrana externa En el caso de las bacterias Gram-negativas, los compuestos aromáticos deben ser capaces de atravesar la membrana externa. Esto puede ocurrir mediante sistemas de transporte pasivo: i) porinas inespecíficas, e.g. OmpW para el transporte de naftaleno y otros compuestos aromáticos policíclicos (Neher y Lueking, 2009); ii) canales específicos de sustrato, e.g. miembros de la subfamilia OpdK para el transporte de vanilato, ftalato, fenilacetato y galato, en diversas cepas de Pseudomonas (Tamber et al., 2006; Biswas et al., 2008; Nogales et al., 2011). También se han descrito sistemas de transporte activo a través de receptores dependientes de TonB (TBDRs, TonB-dependent receptors) (Nikaido, 2003). Los TBDRs son transportadores activos de membrana externa que utilizan la fuerza protón motriz transmitida desde el complejo TonB-ExbB-ExbD localizado en la membrana interna (Noinaj et al., 2010). Los genes que codifican TBDRs aumentan su expresión en diversos microorganismos cuando éstos utilizan algún compuesto aromático como fuente de carbono (Tamber, et al., 2006; Hartmann y Armengaud, 2014; Simon et al., 2014; Yun et al., 2014), y recientemente se ha caracterizado el primer TBDR implicado en el transporte de un dímero aromático derivado de la lignina en Sphingobium sp. SYK-6 (Fujita et al., 2019). 3. Metabolismo de compuestos alicíclicos: degradación de ciclohexano carboxilato (CHC) La degradación de ciertos compuestos alicíclicos está íntimamente relacionada con la de los compuestos aromáticos, ya que implica la aromatización de estos sustratos o su incorporación como intermediarios (no aromáticos) en alguna de las etapas de las rutas de degradación de compuestos aromáticos. El ciclohexano carboxilato (CHC) es un modelo de compuesto alicíclico que está ampliamente difundido en el medio ambiente puesto que se produce de forma natural en plantas a través de la vía del shikimato como grupo funcional para formar parte de diversos productos secundarios (Floss et al., 1992) o se encuentra formando parte de diversos policétidos sintetizados por microorganismos pertenecientes al género Streptomyces (Cropp et al., 2000). Por otro lado, el CHC se utiliza en la industria química para la producción de medicamentos o pesticidas (Wang et al., 2016), pero también está siendo liberado al medio ambiente en altas concentraciones debido a las aguas residuales que se vierten desde las plantas productoras de compuestos petroquímicos, que utilizan fenol o acetona como sustratos para la producción de estos compuestos, o durante el refinado del petróleo crudo que provoca la liberación de ácidos nafténicos (algunos de los cuales se pueden transformar finalmente en CHC) (Brient et al., 2000; Holowenko et al., 2001). Las altas concentraciones de CHC en la naturaleza constituyen un serio problema dada la toxicidad del CHC y los efectos negativos que tiene sobre animales, plantas o microorganismos (Rogers et al., 2002). La biodegradación microbiana de CHC es una estrategia ecológica de interés para tratar de eliminar este compuesto de los lugares contaminados. Se han descrito dos estrategias para la degradación microbiana del CHC: catabolismo aeróbico y catabolismo anaeróbico. 51 Introducción En presencia de oxígeno la ruta de degradación del CHC genera 4-hidroxibenzoato y está catalizada por monooxigenasas y oxidasas (desaturasas) que aromatizan el compuesto alicíclico. Esta ruta se ha descrito en bacterias pertenecientes a los géneros Alcaligenes, Arthrobacter, y en Corynebacterium cyclohexanicum (Kaneda, 1974; Smith y Callely, 1975; Blakley, 1978; Taylor y Trudgill, 1978). Estas bacterias convierten el 4-hidroxibenzoato en protocatecuato como intermedio central que se degrada posteriormente a través de la ruta del β-cetoadipato (Fig. 4). Figura 4. Esquema del catabolismo del ciclohexano carboxilato en diversas bacterias. En sombreado verde se representa la ruta de degradación aeróbica a través de dioxigenasas que transforman el compuesto alicíclico en el intermediario central aromático protocatecuato, en las bacterias Alcaligenes, Arthrobacter y C. cyclohexanicum. En sombreado rojo se representa la ruta de degradación, tanto aeróbica como anaeróbica, en la bacteria fotosintética R. palustris y que converge a nivel del intermediario alicíclico monoenoil-CoA (compuesto 4 de la figura 2) en la ruta bad también implicada en la degradación anaeróbica del benzoato (Fig. 2). En sombreado azul se representa la ruta de degradación anaeróbica que converge a nivel del intermediario alicíclico dienoil-CoA (compuesto 3 de la figura 2) en la ruta bam implicada en la degradación anaeróbica del benzoato en organismos anaerobios estrictos de los géneros Geobacter, Syntrophus y Desulfococcus (Fig. 2). Se han descrito dos rutas catabólicas diferentes para la degradación anaeróbica de CHC, pero en ambos casos las rutas convergen con la ruta anaeróbica central del benzoil-CoA. En la α-proteobacteria fotosintética anaerobia facultativa R. palustris (Küver et al., 1995) el CHC se convierte en ciclohex-1-eno-1-carbonil-CoA (enoil-CoA; primer intermediario no aromático de la ruta bad para la degradación anaeróbica de benzoato) a través de su activación a CHC-CoA, catalizado por una CoA ligasa específica (AliA) (Samanta y Harwood 2005), y una posterior oxidación adicional, catalizada por la acil-CoA deshidrogenasa AliB (Hirakawa et al., 2015) (Fig. 4). En la δ-proteobacteria anaerobia estricta G. metallireducens (reductor de hierro) el metabolismo anaeróbico del CHC implica tres etapas enzimáticas mediadas por: (1) succinil-CoA:CHC-CoA transferasa que activa el CHC a CHC-CoA; (2) CHC-CoA deshidrogenasa que cataliza la 1,2-deshidrogenación de CHC- 52 Introducción CoA a CHeneCoA; (3) ciclohexa-1,5-dieno-1-carboxil-CoA deshidrogenasa que cataliza una 1,4deshidrogenación generando ciclohexa-1,5-dieno-1-carboxil-CoA (dienoil-CoA; primer intermediario no aromático de la ruta central del benzoil-CoA) (Fig. 4) (Kung et al., 2014). Si bien la ruta de degradación anaeróbica del CHC en otras bacterias anaerobias estrictas, e.g. cepas de Desulfococcus (reductores de sulfato) y Syntrophus (fermentadores), parece ser similar a la descrita en G. metallireducens (Kung et al., 2014), la degradación anaeróbica del CHC en bacterias anaerobias facultativas capaces de utilizar nitrato como aceptor final de electrones (desnitrificantes) no se ha estudiado hasta la fecha y podría requerir una ruta diferente a la ruta central del benzoil-CoA. 4. Metabolismo del o-ftalato Se denominan ftalatos (de inglés Phthalic Acid Esters, PAEs) a los compuestos aromáticos derivados del ácido o-ftálico (ácido 1,2-benceno dicarboxílico), al cual se unen radicales alquílicos o aromáticos mediante enlaces éster con uno o ambos grupos carboxilo. Los ftalatos se añaden habitualmente a los plásticos como moduladores de las propiedades de estos materiales, por ejemplo para conferir flexibilidad, elasticidad o plasticidad (Giam, 1984; Nilsson, 1994; Boll et al., 2019). Se utilizan en la fabricación de productos de cloruro de polivinilo (PVC), materiales de construcción, juguetes, ropa, cosméticos, perfumes, aditivos para pinturas, envases de alimentos y aparatos médicos (Vats et al., 2013; Benjamin et al., 2015; Boll et al., 2019). Por lo general, los ftalatos se unen de manera no covalente a los polímeros plásticos, lo que facilita su difusión al medio ambiente y son, por ello, uno de los contaminantes orgánicos emergentes más frecuentes (Nilsson, 1994; Gao y Wen, 2016). Los ftalatos y sus derivados metabólicos son potencialmente dañinos para los humanos y la vida silvestre debido a sus efectos hepatotóxicos, teratogénicos, carcinogénicos y además, están clasificados como disruptores endocrinos, pudiendo causar infertilidad (Fushiwaki et al., 2003; Latini et al., 2006; Lambrot et al., 2009; Annamalai y Namasivayam, 2015). Debido a estos efectos nocivos, se ha prohibido su uso por distintas agencias como la EPA (Environmental Protection Agency) en Estados Unidos o el CNEMC (Chinese National Environmental Monitoring Center) en China (Net et al., 2015). El o-ftalato o ácido ftálico (PA) deriva fundamentalmente de la biodegradación de los PAEs a través de reacciones de desesterificación o desalquilación, β-oxidación o transesterificación (Liang et al., 2008). Sin embargo, el o-ftalato también se ha identificado como un intermediario central en la degradación bacteriana de hidrocarburos aromáticos policíclicos como el fenantreno (Kiyohara y Nagao, 1978), el fluoreno (Grifoll, et al., 1994) y el fluoranteno (Sepic et al., 1998). 4.1. Catabolismo aeróbico del o-ftalato (PA) El metabolismo del o-ftalato en condiciones aeróbicas se conoce desde la década de los 70-80, y consiste en la transformación de este sustrato aromático en el intermediario central protocatecuato a través de 3 etapas enzimáticas: 1) dioxigenación, 2) deshidrogenación y 3) descarboxilación, catalizadas por dioxigenasas de dos componentes (reductasa y oxigenasa), cis-(di)hidrodiol-deshidrogenasas y dihidroxiftalato decarboxilasas, respectivamente (Fig. 5) (Boll et al., 2019). Se han descrito dos tipos de 53 Introducción dioxigenasas de dos componentes que transforman el o-ftalato en 4,5-dihidro-cis-4,5-dihidroxiftalato (Keyser et al., 1976; Nomura et al., 1992), o en 3,4-dihidro-cis-3,4-dihidroxiftalato (Eaton y Ribbons, 1982). Estos intermediarios son los sustratos de las cis-diol-deshidrogenasas para producir 4,5-dihidroxi-ftalato, como en Burkholderia cepacia DBO1 (Chang y Zylstra, 1998), Pseudomonas fluorescens PHK (Pujar y Ribbons, 1985), y Comamonas testosteroni (Nakazawa y Hayashi, 1977); o 3,4-dihidroxi-ftalato, como en Mycobacterium vanbaalenii PYR-1 (Stingley et al., 2004), Arthrobacter keyseri 12B (Eaton, 2001), Terrabacter sp. strain DBF63 (Habe et al., 2003), o Rhodococcus jostii RHA1 (Patrauchan et al., 2005). Ambos intermediarios tienen grupos hidroxilo en posición “ortho” o “para” a uno de los dos grupos carboxilo, lo cual es esencial para su posterior descarboxilación, generando en ambos casos protocatecuato. El protocatecuato se metaboliza posteriormente a través de rutas ortho o meta (Fig. 5) (Eaton y Ribbons, 1982; Seaton y Neidle, 2018). Recientemente se ha descrito una ruta aeróbica nueva en la cepa Pseudomonas sp. PTH10 en la que el PA se convierte en 2,3-dihidroxibenzoato por una ftalato 2,3-dioxigenasa, y éste es posteriormente metabolizado por una 3,4-dioxigenasa que rompe el anillo aromático en posición meta (Fig. 5) (Kasai et al., 2019). 4.2. Catabolismo anaeróbico del PA Los primeros estudios sobre la degradación anaeróbica de PA proponían una ruta periférica consistente en dos pasos enzimáticos catalizados por una reductasa y una descarboxilasa con la formación de benzoato (Taylor y Ribbons, 1983). Posteriormente, se propuso la formación de ftaloil-CoA como intermediario inicial seguido de la descarboxilación a benzoil-CoA (Nozawa y Maruyama, 1988). Sin embargo, solo recientemente (y durante el transcurso de esta tesis doctoral) se han conseguido caracterizar las enzimas involucradas en la ruta periférica anaeróbica del PA hasta benzoil-CoA mediante estudios de proteogenómica diferencial y ensayos enzimáticos in vitro en varios microorganismos desnitrificantes estrechamente relacionados filogenéticamente: Azoarcus sp. PA01 (Junghare et al., 2016), Thauera chlorobenzoica 3CB-1, Aromatoleum aromaticum EbN1 y A. evansii KB740 (Ebenau-Jehle et al., 2017) (Fig. 5). El PA se activa primero a o-ftaloilCoA, mediante una succinil-CoA:PA transferasa (SPT) dependiente de succinil-CoA (perteneciente a la familia de las CoA transferasas tipo III (Heider, 2001; Mergelsberg, et al., 2018). Posteriormente, el o-ftaloilCoA se descarboxila a benzoil-CoA por la acción de una o-ftaloil-CoA descarboxilasa (PDC) perteneciente a la familia de enzimas UbiD (des)carboxilasas (Mergelsberg et al., 2017). Las enzimas UbiD, que están involucradas también en la síntesis de ubiquinonas (Cox et al., 1969) o en la descarboxilación de cinamato a estireno (Payne et al., 2015), requieren un cofactor flavinadenosinmononucleótido prenilado (prFMN) que se genera a partir del FMN por la acción de una proteína UbiX que utiliza el dimetilalilmonofosfato (DAMP) como cosustrato (F. Lin et al., 2015; White et al., 2015). La enzima PDC forma un hexámero que utiliza prFMN, K+ y Fe2+ como cofactores; en presencia de oxígeno el Fe2+ se oxida Fe3+ lo que evita la interacción de PDC con el prFMN y conduce a la inactivación de la enzima (Mergelsberg et al., 2017). Los genes pht que codifican las enzimas SPT, PDC y la proteína UbiX, se organizan en un cluster que está conservado en los distintos organismos desnitrificantes estudiados hasta la fecha (Fig. 5) (Ebenau-Jehle et al., 2017; Junghare et 54 Introducción al., 2016). Asociados a los genes pht catabólicos se han identificado dos genes adicionales que presuntamente codificarían un sistema de transporte activo del PA al interior de la bacteria (Fig. 5), pero cuya demostración experimental todavía está pendiente (comunicación personal de M. Boll). Figura 5. Catabolismo del o-ftalato en organismos aerobios y anaerobios. En verde se representa la ruta metabólica de degradación del o-ftalato en condiciones anaeróbicas. La succinil-CoA:ftalato-CoA transferasa (SPT) cataliza la transformación del o-ftalato en o-ftalaoil-CoA, el cual es posteriormente metabolizado a benzoil-CoA por una ftalato descarboxilasa (PDC) que necesita un cofactor prenilado prFMN. Se representan además las vías clásicas del metabolismo aeróbico del o-ftalato a través de la ftalato 4,5-dioxigenasa (naranja) o ftalato 3,4-dioxigenasa (azul), que en ambos casos conducen al intermediario central protocatecuato, el cual se puede metabolizar a través de rutas ortho o meta. También se encuentra representada la ruta metabólica recientemente descrita en Pseudomonas sp. PHT10 que transforma el oftalato en 2,3-dihidroxibenzoato mediante una ftalato 2,3-dioxigenasa (rojo). 55 Introducción En organismos anaerobios estrictos, como es el caso de Pelotomaculum isopthalicum, que es capaz de metabolizar PA a través de una asociación sintrófica con organismos metanogénicos (Qiu et al., 2006), o Desulfosarcina cetónica, que lo mineraliza utilizando sulfato como aceptor final de electrones (Geiger et al., 2019), la ruta periférica es similar a la descrita en bacterias desnitrificantes si bien la activación del PA a oftaloil-CoA esta catalizada por una CoA ligasa dependiente de ATP en lugar de la SPT caracterizada en microorganismos desnitrificantes (Geiger et al., 2019). 56 Objetivos Objetivos Objetivos Como se ha indicado en la Introducción, Azoarcus sp. CIB es una β-proteobacteria anaerobia facultativa capaz de degradar compuestos aromáticos, entre los que se incluyen los hidrocarburos tóxicos tolueno y m-xileno, utilizando nitrato como aceptor final de electrones (anaerobiosis) o en presencia de oxígeno (aerobiosis), lo que lo convierte en un organismo muy interesante para estudiar la bioquímica y regulación de los mecanismos de degradación aeróbicos y anaeróbicos en una misma célula. Además, Azoarcus sp. CIB muestra resistencia a distintos metales y metaloides y se ha descrito que puede presentar un estilo de vida endófito cuando interacciona con el arroz (Fernández et al., 2014). La posibilidad de poder manipular genéticamente la cepa CIB y el hecho de disponer de un modelo metabólico a escala genómica de ésta (iLA1020) nos ha permitido poder utilizarla como chasis para distintos bioprocesos anaeróbicos tales como la producción de bioplásticos (PHB) (Zamarro et al., 2017), nanopartículas metálicas (Fernández-Llamosas et al., 2016), o enzimas anaeróbicas (Jacoby et al., 2018). En esta tesis, Azoarcus sp. CIB se ha utilizado para seguir investigando distintos aspectos desconocidos hasta la fecha de la degradación anaeróbica/aeróbica de ciertos compuestos aromáticos y alicíclicos contaminantes, e.g. PA y CHC, así como alguna de sus posibles aplicaciones biotecnológicas. En concreto, los objetivos específicos de este trabajo han sido: 1. Caracterización de la ruta periférica de la degradación del o-ftalato. 2. Estudio y caracterización de la ruta bad de Azoarcus sp. CIB. 3. Identificación y estudio de la ruta baja del metabolismo del benzoato, CHC y pimelato en Azoarcus sp. CIB. 59 Materiales y métodos Materiales y métodos Materiales y métodos 1. Cepas bacterianas y plásmidos La Tabla 1 muestra las diferentes cepas bacterianas empleadas en este trabajo, junto con sus genotipos y características más relevantes. Los plásmidos utilizados en este trabajo se describen en la Tabla 2, donde se muestra el nombre de cada plásmido y sus características más relevantes. Tabla 1. Cepas bacterianas utilizadas en este trabajo. Cepa Genotipo/Fenotipo Referencia E. coli DH10β F´, mcrA, Δ(mrr hsdRMS-mcrBC), Φ80lacZΔM15, Life Technologies ΔlacX74, deoR, recA1, araD139, Δ(ara-leu)7697, galU, galK, rpsL (SmR), endA1, nupG S17-1λpir BL21 (DE3) MC4100 Tpr Smr recA thi hsdRM+ RP42׃׃.Tc׃׃Mu׃׃Kan Tn7 λpir de Lorenzo y fago lisogénico. Timmis, 1994 F-, ompT, hsdSB(rB- mB- ), gal, dcm, λDE3 Green et al., 2012 araD139 Δ(argF-lac)U169 rpsL 150 (Smr) relA1 Casadaban 1976 flbB5301 deoC1 ptsF25 rbsR ΔbioH F+, fadR601, atoC512(Const) Spratt et al., 1981; Jenkins et al., 1987 Azoarcus sp. CIB Azoarcus sp. CIB Cepa silvestre. Barragan et al., et al., 2004 Azoarcus pIZPHT Azoarcus pIZPHTRAP Azoarcus pIZPHTRAPΔphtΔβ Azoarcus ΔbzdW Azoarcus sp. CIBT Cepa CIB conteniendo el plásmido pIZPHT. Este trabajo Cepa CIB conteniendo el plásmido pIZPHTRAP. Este trabajo Cepa CIB conteniendo el plásmido Azoarcus Este trabajo pIZPHTRAPΔphtΔβ. Cepa CIB mutante de deleción en el gen bzdW. Este trabajo Cepa CIB que carece del elemento genético móvil Zamarro ICEXTD (isla metabólica que contiene las rutas de 2016 degradación anaeróbica de tolueno, m-xileno y 3metilbenzoato). Azoarcus CIBTΔbzdW Azoarcus ΔbadHI Cepa CIBT mutante de deleción en el gen bzdW. Cepa CIB mutante de deleción en los genes badH y Este trabajo Este trabajo badI. 63 Materiales y métodos Cepa Genotipo/Fenotipo Referencia Azoarcus ΔAzCIB_1938 Cepa CIB mutante de deleción en el gen AzCIB_1938. Este trabajo Cepa silvestre. Anders et al., 1995 Cepa silvestre (LMG22127). Reinhold Aromamtoleum evansii Aromamtoleum evansii KB 740 Azoarcus communis Azoarcus communis SWub3 A. communis pIZBadβ1 et al., 1993 A. communis conteniendo el plasmido pIZBadβ1. Este trabajo Cepa silvestre. Juni y Janik, 1969 A. baylyi ADP1 conteniendo el plásmido pIZBadβ1. Este trabajo Cepa silvestre. Denef et al., 2004 B. xenovorans conteniendo el plásmido pIZBadβ1. Este trabajo Cepa silvestre. Pohlmann et al., Acinetobacter baylyi Acinetobacter baylyi ADP1 A. baylyi ADP1 pIZBadβ1 Burkholderia xenovorans Burkholderia xenovorans LB400 B. xenovorans pIZBadβ1 Cupriavidus necator Cupriavidus necator H16 2006 C. necator pIZPHTRAP Cupriavidus conteniendo el plásmido pIZPHTRAP. Este trabajo Cepa silvestre. Don y Pemberton, Cupriavidus pinatubonensis Cupriavidus pinatubonensis JMP134 C. pinatubonensis 1981 Cupriavidus conteniendo el plásmido pIZPHTRAP. Este trabajo Cepa silvestre. Franklin pIZPHTRAP Pseudomonas putida P. putida KT2440 1981 P. putida pIZPHTRAP P. putida pIZBadβ1 64 P. putida conteniendo el plásmido pIZPHTRAP. P. putida conteniendo el plásmido pIZBadβ1. Este trabajo Este trabajo et al., Materiales y métodos Cepa P. putida pIZBadβ1AzCIB_2917 Genotipo/Fenotipo P. putida conteniendo Referencia el plásmido Este trabajo pIZBadβ1AzCIB_2917. P. putida pIZPim 1 P. putida conteniendo el plásmido pIZPim1. Este trabajo P. putida pIZPim 2 P. putida conteniendo el plásmido pIZPim2. Este trabajo P. putida pIZPim 3 P. putida conteniendo el plásmido pIZPim3. Este trabajo P. putida pIZBadβ1AzCIB_2917 P. putida pIZBadβ1AzCIB_2917-11 P. putida conteniendo el plásmido Este trabajo el plásmido Este trabajo pIZBadβ1AzCIB_2917. P. putida conteniendo pIZBadβ1AzCIB_2917-2911. P. putida pIZBadPim1 P. putida conteniendo el plásmido pIZBadPim1. Este trabajo P. putida pIZBadPim2 P. putida conteniendo el plásmido pIZBadPim2. Este trabajo Tabla 2. Plásmidos empleados en este trabajo. Plásmido Descripción Referencia pIZ1016 pIZ1016 GmR, derivado del vector de clonación y expresión de Moreno-Ruiz et al., amplio espectro de huésped pBBR1MCS-5, con el 2003 promotor Ptac y el gen lacIQ de pMM40. pIZPHT GmR, derivado de pIZ1016 que contiene los genes Este trabajo catabólicos de la ruta periférica para la degradación anaeróbica del o-ftalato (phtSa, phtSb, phtDa y phtDb) de Aromatoleum aromaticum EbN1 bajo el control del promotor Ptac. pIZPHTRAP GmR, derivado de pIZ1016, que contiene los genes Este trabajo catabólicos y de transporte de la ruta periférica del oftalato (phtTa y phtTb) de Aromatoleum aromaticum EbN1 bajo el control del promotor Ptac. pIZPHTRAPΔPDC GmR, derivado de pIZPHTRAP, con el gen que Este trabajo codifica la o-ftaloil-CoA descarboxilasa delecionado. 65 Materiales y métodos Plásmido Descripción pIZ2 GmR, derivado de pIZ1016 con un MCS optimizado. Referencia Laboratorio Eduardo Díaz pIZBadR GmR, derivado de pIZ2, que contiene el gen badR de Este trabajo Azoarcus sp. CIB bajo el control del promotor Ptac. pIZBadRAliA GmR, derivado de pIZ2, que contiene los genes badR Este trabajo y aliA de Azoarcus sp. CIB bajo el control del promotor Ptac. pIZBad GmR, derivado de pIZ2, que contiene el cluster bad Este trabajo sintético bajo el control del promotor Ptac. pIZBadβ1 GmR, derivado de pIZBad, que contiene el cluster bad Este trabajo sintético y el cluster de β-oxidación I (aab) de Azoarcus sp. CIB bajo el control del promotor Ptac. pIZBadβ1AzCIB_2917 GmR, derivado de pIZBad, que contiene el cluster bad Este trabajo sintético, el cluster de β-oxidación I (aab) y la CoA transferasa del pimelato (AzCIB_2917) de Azoarcus sp. CIB bajo el control del promotor Ptac. pIZBadβ1AzCIB_2917-11 GmR, derivado de pIZBad, que contiene el cluster bad Este trabajo sintético, el cluster de β-oxidación I (aab), la CoA transferasa (AzCIB_2917) y el transportador MFS del pimelato (AzCIB_2911) de Azoarcus sp. CIB bajo el control del promotor Ptac. pIZPim1 GmR, derivado de pIZ2, que contiene el cluster de β- Este trabajo oxidación II (incluye los genes pim catabólicos, el transportador MFS y las ETFs implicadas en el metabolismo del pimelato) de Azoarcus sp. CIB bajo el control del promotor Ptac. pIZPim2 GmR, derivado de pIZ2, que contiene el cluster de β- Este trabajo oxidación II (incluye los genes pim catabólicos y el transportador MFS del pimelato) de Azoarcus sp. CIB bajo el control del promotor Ptac. pIZPim3 GmR, derivado de pIZ2, que contiene el cluster de β- Este trabajo oxidación II (incluye exclusivamente los genes pim catabólicos) de Azoarcus sp. CIB bajo el control del promotor Ptac. 66 Materiales y métodos Plásmido pIZBadPim1 Descripción Referencia GmR, derivado de pIZBad, que contiene el cluster bad Este trabajo sintético, el cluster de β-oxidación II (incluye los genes pim catabólicos, el transportador MFS y las ETFs implicadas en el metabolismo del pimelato) de Azoarcus sp. CIB bajo el control del promotor Ptac. pIZBadPim2 GmR, derivado de pIZBad, que contiene el cluster bad Este trabajo sintético, el cluster de β-oxidación II (incluye los genes pim catabólicos y el transportador MFS del pimelato) de Azoarcus sp. CIB bajo el control del promotor Ptac. pSEVA pSEVA225T KanR, oriRK2, ‘lacZ, vector para la búsqueda de (Silva-Rocha et al., promotores con el gen testigo lacZ. pSEVA225TPaliB 2013) KanR, derivado de pSEVA225T, que contiene una Este trabajo fusión traduccional del promotor PaliB con el gen lacZ. pET pET-28a KanR, vector de clonación e hiperexpresión orif1, Novagen oriColE1, promotor T7, operador lac, N-terminal His6. pET-28BadR KanR, derivado de pET-28a que expresa la proteína Este trabajo BadR con una fusión de 6 histidinas en su extremo amino terminal. pK18mobsacB pK18mobsacB KanR, oriColE1, Mob+, lacZα. Vector suicida con el Schäfer et al., 1994 marcador de selección sacB para la construcción de mutantes de deleción por doble recombinación homóloga en dos eventos de recombinación independientes. pK18mobsacBΔbzdW KanR, pK18mobsacB conteniendo un fragmento Este trabajo quimérico de 1.7-kb XbaI/HindIII con las regiones flanqueantes al gen bzdW. pK18mobsacBΔbadHI KanR, pK18mobsacB conteniendo un fragmento Este trabajo quimérico de 1.6-kb XbaI/HindIII con las regiones flanqueantes a los genes badH y badI. 67 Materiales y métodos Plásmido Descripción Referencia pK18mobsacBΔAzCIB_1938 KanR, pK18mobsacB conteniendo un fragmento Este trabajo quimérico de 1.4-kb XbaI/HindIII con las regiones flanqueantes al gen AzCIB_1938. 2. Medios y condiciones de cultivo Todas las soluciones y medios de cultivo utilizados en este trabajo se esterilizaron por calor húmedo en autoclave a 121°C y 1 atmósfera de presión, o mediante filtración utilizando filtros estériles Millipore de 0,2 μm de tamaño de poro. Para el crecimiento de las diferentes bacterias se utilizó dos tipos de medios de cultivo, medio rico y medio mínimo, cuya composición se detalla a continuación. 2.1. Medios ricos Para las bacterias A. baylyi, E. coli y P. putida, el medio rico empleado fue Lysogeny Broth (LB) (Sambrook y Rusell, 2001), que se complementó con agar al 1,5% (m/v) para los cultivos en medio sólido. Para las bacterias Azoarcus sp. CIB, A. communis, A. evansii, B. xenovorans y C. necator el medio rico utilizado fue Nutrient Broth (NB) (Difco, 234000) que contiene 3 g de extracto de carne de ternera y 5 g de peptona por litro, con pH 6,8. Cuando fue necesario, se complementaron con antibióticos a las concentraciones que se indican: kanamicina (Kan) 50 μg/ml, gentamicina (Gm) 10 μg/ml y estreptomicina (Sm) 10 μg/ml. Los antibióticos se prepararon en soluciones 1000 veces concentradas en agua. Estas soluciones se esterilizaron por filtración y se almacenaron a -20°C hasta su utilización. 2.2. Medio mínimo El medio mínimo empleado en este trabajo para cultivar las cepas de Azoarcus sp. CIB, A. communis, A. evansii, A. baylyi, B. xenovorans, C. necator, C. pinatubonensis y P. putida está basado en el medio basal MA (pH 7,5), cuya composición, para un litro, se detalla a continuación: 0,33 g KH2PO4; 1,2 g Na2HPO4; 0,11 g NH4Cl; 0,1 g MgSO4⋅7H2O; 0,04 g CaCl2. Este medio basal fue suplementado con una solución de elementos traza (pH 6,5), cuya composición (1000x para 1 l de H2O destilada) se detalla a continuación: 1,5 g ácido nitrilotriacético (NTA); 3,0 g MgSO4⋅7H2O; 0,5 g MnSO4⋅2H2O; 1,0 g NaCl; 0,1 g FeSO4⋅7H2O; 0,18 g CoSO4⋅7H2O; 0,3 g NaSeO3⋅5H2O; 0,18 g ZnSO4⋅7H2O; 0,01 g CuSO4⋅5H2O; 0,02 g KAl(SO4)2⋅12H2O; 0,01 g H3BO3; 0,01 g Na2MoO⋅2H2O; 0,025 g NiCl2⋅6H2O. También se suplementó el medio MA con una solución de vitaminas cuya composición (1000x para 1 l de H2O destilada) es la siguiente: 20 mg biotina; 10 mg piridoxina-HCl; 50 mg riboflavina; 50 mg D-pantotenato cálcico; 50 mg ácido paminobenzoico; 20 mg ácido fólico; 50 mg tiamina-HCl⋅2H2O; 50 mg ácido nicotínico y 50 mg vitamina B12. Para el crecimiento anaeróbico de Azoarcus sp. CIB se añadió 10 mM KNO3 como aceptor final de electrones al medio MC (medio basal complementado con vitaminas y elementos traza). Además, para asegurar 68 Materiales y métodos el ambiente reductor, se añadió al medio MC una solución de sulfuro ferroso a una concentración final de 0,044 mg/ml. Para Azoarcus sp. CIB las concentraciones finales de antibióticos utilizadas fueron kanamicina (Kan) 30 μg/ml y gentamicina (Gm) 7 μg/ml. Para los cultivos sólidos se añadió agar purificado (Neogen MC006) al 2% (m/v). 2.3. Obtención de condiciones anaeróbicas en los medios de cultivo Para obtener condiciones de anaerobiosis, el medio de cultivo, así como las soluciones de elementos traza, nitrato potásico, sulfuro ferroso y todos los compuestos que fueron utilizados como fuente de carbono, se dispensaron en frascos de vidrio, los cuales se taparon con tapones de goma y se sellaron con arandelas de aluminio. A través del tapón de goma se inyectó una aguja conectada a un depósito de nitrógeno (Air Liquide), permitiendo pasar un flujo de este gas al medio líquido durante varios minutos con el objeto de eliminar el oxígeno. Finalmente, todos los frascos fueron autoclavados. Para obtener una solución anaeróbica y estéril de vitaminas (las cuales son sensibles al calor) se realizó la misma operación descrita anteriormente, pero con frascos de vidrio vacíos en los que, después de ser esterilizados por autoclave, se inyectó la solución de vitaminas mediante una jeringa conectada a un filtro estéril Millipore (de 0,2 μm de diámetro de poro). Una vez preparadas estas soluciones, fueron añadidas al medio basal MA para obtener así el medio MC complementado con las correspondientes fuentes de carbono. Tanto la filtración de las soluciones de vitaminas como la inoculación de los medios de cultivo con las distintas cepas bacterianas se realizó en una cámara de anaerobiosis (Forma Scientific). 2.4. Condiciones de cultivo Para los cultivos aeróbicos, las cepas de E. coli se cultivaron a 37°C, y Azoarcus sp. CIB, A. evansii, A. communis, A. baylyi, B. xenovorans, C. necator y P. putida se cultivaron a 30°C, con una agitación de 200 r.p.m.. Los cultivos anaeróbicos de Azoarcus sp. CIB, A. evansii y A. communis se incubaron a 30°C sin agitación utilizando 10 mM KNO3 como aceptor final de electrones. Las fuentes de carbono no aromáticas, como por ejemplo sales de ácidos orgánicos (piruvato, succinato, glutarato, etc) fueron añadidas a los medios de cultivo en una relación 0,2% (m/v), salvo que se indique lo contrario. Cuando se utilizó una fuente de carbono aromática como el benzoato o el o-ftalato, ésta se añadió al medio MC a una concentración de 3 mM. En el caso especial del ciclohexano carboxilato y el pimelato, fuentes de carbono no aromáticas, se añadieron a los medios de cultivo a una concentración de 3mM. El crecimiento de los cultivos fue monitorizado midiendo la absorbancia a 600 nm (A600) empleando un espectrofotómetro Shimadzu UV-260. La morfología celular se analizó con un microscopio de contraste de fase Nikon OPTIPHOT-2. La desnitrificación en cultivos anaeróbicos fue monitorizada midiendo los niveles de NO3- y NO2- con el Test Nitrates (Merck). El consumo de o-ftalato en el medio de cultivo fue monitorizado mediante HPLC, tal y como se detalla en el apartado 10 de Materiales y métodos. 2.5. Conservación de las cepas bacterianas 69 Materiales y métodos Durante cortos períodos de tiempo (inferiores a un mes) E. coli se conservó a 4°C en placas de medio LB. Los cultivos anaeróbicos de Azoarcus sp. CIB se conservaron adecuadamente durante un periodo aproximado de un mes a 4°C en viales de vidrio. Para su conservación a largo plazo, las bacterias se congelaron en el medio de cultivo correspondiente con glicerol al 15% (v/v) y se mantuvieron a -80°C. 3. Técnicas de manipulación de DNA y RNA La manipulación del DNA, así como la mayor parte de las técnicas de biología molecular utilizadas en este trabajo, se realizó esencialmente tal y como se describen en Molecular cloning: a laboratory manual, 4th ed (Green et al., 2012). Las endonucleasas de restricción fueron suministradas por New England Biolabs. La DNA ligasa T4 y los kits de ligación Quick Ligation™ Kit e Instant Sticky-end Ligase Master Mix fueron suministrados por New England Biolabs. La DNA polimerasa I fue suministrada por Biotools, las polimerasas de alta fidelidad Phusion® y GXL® por New England Biolabs y Takara respectivamente. Todas las enzimas se emplearon atendiendo a las especificaciones de las diferentes casas comerciales. Los fragmentos de DNA se purificaron mediante los productos IllustraTM PCR DNA and Gel Band Purification kit (GE Healthcare) o QIAquick PCR Purification Kit y QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). 3.1. Extracción y purificación de DNA La purificación de DNA plasmídico se realizó mediante el uso de High Pure Plasmid Purification Kit (Roche). El DNA cromosómico se extrajo de rutina empleando el procedimiento descrito en Current protocols in molecular biology (Ausubel, 2007). Para la extracción del DNA cromosómico más puro y concentrado se utilizó el kit PureLink™ Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen™). La concentración y pureza del DNA obtenido se analizó espectrofotométricamente evaluando la ratio A260/A280, (Nanophotometer Pearl, IMPLEN), y mediante la visualización en geles de agarosa. 3.2. Reacción de amplificación en cadena con DNA polimerasa termorresistente (PCR) La amplificación del DNA se realizó en un equipo Mastercycler Gradient (Eppendorf) o Veriti™ 96Well Thermal Cycler (Applied Biosystems™) y las enzimas que se emplearon fueron la DNA polimerasa I termorresistente Taq y las polimerasas de alta fidelidad Phusion® y GXL®. Las mezclas de reacción contenían 1,5 mM MgCl2, 0,5 μM oligonucleótidos y 0,25 mM dNTPs. Los distintos oligonucleótidos empleados en las reacciones de PCR se indican en la Tabla 3, en la que se detalla la secuencia de nucleótidos y la finalidad del producto de PCR. Todos los oligonucleótidos fueron adquiridos a Sigma-Aldrich. Las condiciones estándar de PCR para cada polimerasa fueron las siguientes: 1. Taq: generalmente utilizada para PCRs de comprobación a partir de colonia de E. coli o de DNA genómico de Azoarcus sp. CIB. Un primer ciclo de 95°C 5-10 min (dependiendo del molde de DNA), seguido de 35 ciclos de 95°C 1 min, 60°C 1 min (o la temperatura adecuada, optimizada por gradiente según los oligonucleótidos utilizados), 72°C 1 min por cada 1.000 pb según el fragmento a amplificar, y un ciclo final de 72°C 10 min. El volumen final de reacción son 25 µl. 70 Materiales y métodos 2. Phusion®: utilizada puntualmente para el proceso de síntesis de DNA para la construcción de plásmidos, o para PCRs de comprobación a partir de colonia de E. coli o de DNA genómico de Azoarcus sp. CIB cuando era necesario amplificar más de 3 kb o el contenido en GC del fragmento de DNA era superior al 63%, empleando para ello un buffer adecuado. Un primer ciclo de 95°C 1-5 min (dependiendo del molde de DNA), seguido de 35 ciclos de 98°C 15 s, 58°C 30 s (o la temperatura adecuada, optimizada por gradiente según los oligonucleótidos utilizados), 72°C 30 s por cada 1.000 pb según el fragmento a amplificar, y un ciclo final de 72°C 5 min. El volumen final de reacción son 25 µl en el caso de una PCR de comprobación o de 50 µl si es una PCR para la obtención de un fragmento de DNA utilizado para la construcción de un plásmido. 3. GXL®: utilizada de rutina para el proceso de síntesis de DNA para la construcción de plásmidos. Un primer ciclo de 98°C 1 min, seguido de 30 ciclos de 98°C 15 s, 58°C 30 s (o la temperatura adecuada, optimizada por gradiente según los oligonucleótidos utilizados), 68°C 1 min por cada 1.000 pb según el fragmento a amplificar, y un ciclo final de 68°C 5 min. El volumen final de reacción son 50 µl. Tabla 3. Oligonucleótidos utilizados. Las regiones subrayadas pertenecen a la diana de restricción que se indica al final de la secuencia. Secuencia (5'→3') Nombre Utilización (Diana restricción) EbN1 113 FW EbN1 102 RV CCAAGCTTTGACCTAAGGAGG Clonación de TAAATAATGAAAAGACTGATA EB_RS21715 de “A. aromaticum” (4.692 pb de GTGGGGAT (HindIII) DNA) en el plásmido pIZ1016 doblemente CCACTAGTTCACTGGAACGCT digerido CCTTCGATCTG (SpeI) secuencia Shine-Dalgarno (doble subrayado), para con los genes HindIII/SpeI EB_RS21730- incluyendo una generar el plásmido pIZPHT. 97 FW Gibson 95 RV Gibson GAGTATGCGGAATATCAGATC Clonación de los genes EB_RS21705- GAAGGAGCGTTCCAGTGAAC EB_RS21695 de “A. aromaticum” (3.864 pb de AATTGACTAGTATGTTACGAA DNA) mediante Gibson Assembly para introducir ACATCGTTTGT (MfeI, SpeI) nuevas dianas de restricción (MfeI, SpeI, SbfI y GGCGAATTGGAGCTCCACCGC XbaI) en el plásmido pIZPHT digerido con SpeI, GGTGGCGGCCGCTCTAGAACC para generar el plásmido pIZPHTRAP. TGCAGGACTAGTTCACTCCCC TCGCAGCCAGCG (XbaI, SbfI, SpeI) 71 Materiales y métodos Secuencia (5'→3') Nombre Utilización (Diana restricción) badR Fw XbaI CCCCCTCTAGATGACCTAAGG Clonación del gen badR (509 pb) de Azoarcus sp. AGGTAAATAATGAAAGACCTT CIB en el plásmido pIZ2 doblemente digerido con TCCGCTGCC (XbaI) XbaI/HindIII incluyendo una secuencia Shine- badR Rv AvrII CCCCCAAGCTTCCTAGGCTAA Dalgarno (doble subrayado), para generar el HindIII plásmido pIZBadR. AGCCTGGCCATGTTTCGC (HindIII) aliA Fw CCCCCCAAGCTTTGACCTAAG Clonación del gen aliA (1.672 pb) de Azoarcus sp. GAGGTAAATAATGAATTTCGA CIB en el plásmido pIZBadR doblemente digerido CCCGGTGCTG (HindIII) con HindIII/SacI incluyendo una secuencia Shine- AAAAAAGAGCTCTCACTTGTC Dalgarno (doble subrayado), para generar el GTTGCCGAAGGAC (SacI) plásmido pIZBadRAliA. TCGTTCAGGTGATGCAGGGC Secuenciación cluster bad sintético en el plásmido HindIII aliA Rv SacI Bad Sec 1 pIZBad. Bad Sec 2 ATCGACGTGCATTTCCAGCG Secuenciación cluster bad sintético en del plásmido pIZBad. Bad Sec 3 TTGAGAAGTCTGGCGTCTCGG Secuenciación cluster bad sintético en el plásmido pIZBad. Bad Sec 4 CTTCGGCAACGACAAGTGACC Secuenciación cluster bad sintético en el plásmido pIZBad. AzCIB_1942 CCCCCACTAGTTGACCTAAGG Clonación del gen AzCIB_1942 (1.198 pb) de Fw SpeI AGGTAAATAATGATCCGCGAC Azoarcus sp. CIB en el plásmido pIZBad CAGGAGAC (SpeI) doblemente digerido con SpeI/HindIII incluyendo AzCIB_1942 AAAAACCTGCAGGTCATTCGC una secuencia Shine-Dalgarno (doble subrayado), Rv SbfI CTGCAGCCCGG (SbfI) para generar el plásmido pIZBadβ1. AzCIB_1939 GGGGGCCTGCAGGTGACCTAA Clonación de los genes AzCIB_1939- AzCIB_1937 Fw SbfI GGAGGTAAATAATGGATGCA (3.580 pb) de Azoarcus sp. CIB en el plásmido GTAGTCGTCGAACG (SbfI) pIZBad doblemente digerido con SpeI/HindIII AzCIB_1937 CCCCCCAAGCTTCAATTGTCT incluyendo una secuencia Shine-Dalgarno (doble Rv HindIII AGATTCAGCCCGGAATGCGCT subrayado) y dos dianas nuevas de restricción XbaI CG (HindIII) y MfeI, para generar el plásmido pIZBadβ1. 72 Materiales y métodos Secuencia (5'→3') Nombre Utilización (Diana restricción) AzCIB_2917 CCCCCCCTCTAGATGACCTAA Clonación del gen AzCIB_2917 (1.268 pb) de Fw XbaI GGAGGTAAATAATGTCAGGA Azoarcus sp. CIB en el plásmido pIZBadβ1 GCACTTTCACATATTCGCG doblemente digerido con XbaI/HindIII incluyendo (XbaI) una secuencia Shine-Dalgarno (doble subrayado), AzCIB_2917 CCCCCCAAGCTTTCAGATCAC para generar el plásmido pIZBadβ1AzCIB_2917. Rv HindIII GGCATTCGCCTTCAG (HindIII) AzCIB_2917 CCCCCCCTCTAGATGACCTAA Clonación de los genes AzCIB_2917 (1.268 pb) y Fw XbaI GGAGGTAAATAATGTCAGGA AzCIB_2911 (1.269 pb) de Azoarcus sp. CIB a GCACTTTCACATATTCGCG través de la diana SbfI en el plásmido pIZBadβ1 (XbaI) doblemente digerido con XbaI/HindIII incluyendo Pim M1 Rv AAAAAACCTGCAGGTCAGATC dos secuencias Shine-Dalgarno (doble subrayado) SbfI ACGGCATTCGCCTTCAG (SbfI) delante de cada gen, para generar el plásmido AzCIB_2910 AAAAAAACCTGCAGGTGACCT pIZBadβ1AzCIB_2917-11. Fw SbfI AAGGAGGTAAATAATGGAAA TGACGGCCAACGGGCAG (SbfI) Pim M3 Rv CCCCCCCAAGCTTTCACTTCT HindIII GCGGGTCGTAGAGTTTTTCCT (HindIII) Pim M1 Fw GGGGGGGACTAGTTGACCTAA Clonación de los genes AzCIB_2914-AzCIB_2917 SpeI GGAGGTAAATAATGAACGAA (4.799 pb) de Azoarcus sp. CIB en el plásmido GTCCTTCTCGCGGGAC (SpeI) pIZ1016 doblemente digerido con SpeI/HindIII Pim M1 Rv AAAAAACCTGCAGGTCAGATC incluyendo una secuencia Shine-Dalgarno (doble SbfI subrayado), para generar los plásmidos pIZPim1, ACGGCATTCGCCTTCAG (SbfI) pIZPim2 o pIZPim3. Pim M2 Fw GGGGGGCCTGCAGGTGACCTA Clonación de los genes AzCIB_2912-AzCIB_2909 SbfI AGGAGGTAAATAATGATTCGC (4.252 pb) de Azoarcus sp. CIB en el plásmido GACCAGGAAACCCTTAACG pIZ1016 doblemente digerido con SpeI/HindIII (SbfI) incluyendo una secuencia Shine-Dalgarno Pim M2 Rv AAAAAAAAGCTTTCAGATTTG (subrayada dos veces), para generar el plásmido HindIII pIZPim1. CGCGGCCAGCTCCG (HindIII) 73 Materiales y métodos Secuencia (5'→3') Nombre Utilización (Diana restricción) Pim M2 Fw GGGGGGCCTGCAGGTGACCTA Clonación de los genes AzCIB_2912-AzCIB_2911 SbfI AGGAGGTAAATAATGATTCGC (2.522 pb) de Azoarcus sp. CIB en el plásmido GACCAGGAAACCCTTAACG pIZ1016 doblemente digerido con SpeI/HindIII (SbfI) incluyendo una secuencia Shine-Dalgarno (doble Pim M3 Rv CCCCCCCAAGCTTTCACTTCT HindIII subrayado), para generar el plásmido pIZPim2. GCGGGTCGTAGAGTTTTTCCT (HindIII) Pim M2 Fw GGGGGGCCTGCAGGTGACCTA Clonación del gen AzCIB_2912 (1.155 pb) de SbfI AGGAGGTAAATAATGATTCGC Azoarcus sp. CIB en el plásmido pIZ1016 GACCAGGAAACCCTTAACG doblemente digerido con SpeI/HindIII incluyendo (SbfI) una secuencia Shine-Dalgarno (doble subrayado), Pim M4 Rv AAAAAAAAGCTTTCAGTTCGC HindIII para generar el plásmido pIZPim3. GGCGTCGCGGATCATGTTG (HindIII) PaliB Fw CCCCCAAGCTTCTTGCGGTGT HindIII PaliB CGACGAGCGCTTGC (HindIII) Rv AAAAAGGATCCTCGCAACGG Clonación del promotor del gen aliB (262 pb) de Azoarcus sp. CIB en el plásmido pSEVA225T doblemente digerido con HindIII/BamHI, para BamHI CGGGTATGCGTGGC (BamHI) generar el plásmido pSEVA225TPaliB. BadR Fw NdeI GGGGGGCATATGAAAGACCTT Clonación del gen badR (477 pb) de Azoarcus sp. TCCGCTGCC (NdeI) CIB en el plásmido pET28a doblemente digerido badR Rv AvrII CCCCCAAGCTTCCTAGGCTAA con NdeI/HindIII, para generar el plásmido HindIII pET28BadR. AGCCTGGCCATGTTTCGC (HindIII) ΔbzdW Fw 1 CCTCTAGACGACATCTCCGAA Clonación de las regiones flanqueantes del gen XbaI GTGCTGCT (XbaI) bzdW: ΔbzdW 1 (788 pb) y ΔbzdW 2 (967 pb), a ΔbzdW Rv 1 CCGGATCCGAATTGCGCTTTA través de la diana intermedia BamHI en el BamHI CTCATGGTGTCTCC (BamHI) plásmido pK18mobsacB doblemente digerido con ΔbzdW Fw 2 CCGGATCCGTGTGGAAGAACA XbaI/HindIII, BamHI CCTGATTTAGACGGTC (BamHI) pK18mobsacBΔbzdW. Plásmido necesario para la ΔbzdW Rv 2 CCAAGCTTCCCGGTTTGCTGC obtención de las cepas mutantes Azoarcus ΔbzdW HindIII CAGTGAC (HindIII) y Azoarcus CIBTΔbzdW. BzdW- Fw CGTGGAGACGGATCGCAAGG Comprobación de la mutación de deleción del gen BzdW- Rv AGGCCATCAGCTTCGAGAGC bzdW. 74 para generar el plásmido Materiales y métodos Secuencia (5'→3') Nombre Utilización (Diana restricción) ΔbadHI Fw 1 CCAATCTAGAGCGAGCGACTA Clonación de las regiones flanqueantes de los XbaI genes badH y badI: ΔbadHI 1 (719 pb) y ΔbadHI CGACTTCGG (XbaI) ΔbadHI Rv 1 CCAAGGATCCCGCAAGCACCA 2 (939 pb), a través de la diana intermedia BamHI BamHI en GAAGTAAGCC (BamHI) el plásmido pK18mobsacB doblemente ΔbadHI Fw 2 CCAAGGATCCGCCTTCAAGAC digerido con XbaI/HindIII, para generar el BamHI plásmido CTCTCATTTTGC (BamHI) pK18mobsacBΔbadHI. Plásmido ΔbadHI Rv 2 GGCCAAGCTTCTTGTCGAGCA necesario para la obtención de la cepa mutante HindIII CCTTCATCGCGG (HindIII) Azoarcus ΔbadHI. BadHI- Fw AAGAAGATCGGCGAATTCCA Comprobación de la mutación de deleción de los GGGCG genes badH y badI. BadHI- Rv GCAGCACATTTCCGAAGCGAA GAGC ΔAzCIB_1938 AGGGGTCTAGACAGCGAAGC Clonación de las regiones flanqueantes del gen Fw 1 XbaI GGTCCGAATCC (XbaI) AzCIB_1938: ΔAzCIB_1938 CCCCCCATATGCTGACGCCCG ΔAzCIB_1938 2 (809 pb), a través de la diana Rv 1 NdeI ACAACTGAC (NdeI) intermedia NdeI en el plásmido pK18mobsacB ΔAzCIB_1938 GGGGGCATATGACGCATTGCA doblemente digerido con XbaI/HindIII, para Fw 2 NdeI TCGAACATCTC (NdeI) generar el plásmido pK18mobsacBΔAzCIB_1938. ΔAzCIB_1938 GGGGGAAGCTTCGAGATGGA Plásmido necesario para la obtención de la cepa Rv 2 HindIII TGCAGTAGTCGTCG (HindIII) mutante Azoarcus ΔAzCIB_1938. AzCIB_1938- TCCGATCACGGCGTTGTCCAT Comprobación de la mutación de deleción del gen Fw CACC AzCIB_1938. AzCIB_1938- TCTTCCATTTCCCCACCTCCAC Rv GCG ΔAzCIB_1938 (612 pb) y BoxB CIB RT AACTCGACCAACTACGACGTG Amplificación de un fragmento interno (90 pb) del Fw gen boxB de Azoarcus sp. CIB, utilizado en BoxB CIB RT GTCGTGCATCTTGACGTAGC ensayos de RT-PCR. Rv BoxD CIB RT AAGGCCCTTACCTACGAGGA Amplificación de un fragmento interno (82 pb) del Fw gen boxD de Azoarcus sp. CIB, utilizado en BoxD CIB RT CGAAATATTCTGCACGTTTGG ensayos de RT-PCR. Rv 75 Materiales y métodos Secuencia (5'→3') Nombre Utilización (Diana restricción) boxB1 H16 RT CGCACAGCTTCGATGTCTAC Amplificación de un fragmento interno (81 pb) del Fw gen boxB1 de C. necator H16, utilizado en ensayos boxB1 H16 RT GCATCTTGACGTGGTCGAA de RT-PCR. Rv benA H16 RT GCCTCGACCTGGATACCTT Amplificación de un fragmento interno (101 pb) Fw del gen benA de C. necator H16, utilizado en benA H16 RT CATCTCGAGTTCGAACAGCTC ensayos de RT-PCR. Rv boxB2 H16 RT GGCAGCCCAACTACCTGA Amplificación de un fragmento interno (75 pb) del Fw gen boxB2 de C. necator H16, utilizado en ensayos boxB22 H16 TGCGCAGATAAATGTCATGG de RT-PCR. RT Rv HK H16 RT CTGGATCCGCTCAAGTACG Amplificación de un fragmento interno (72 pb) del Fw gen housekeeping dnaE, codificante de la HK H16 RT GAAGTCGGGCATCGAGAC subunidad α de la DNA polimerasa III de C. Rv necator H16, utilizado en ensayos de RT-PCR. recA H16 RT AGATCGGCGTGATGTTCG Amplificación de un fragmento interno (70 pb) del Fw gen recA H16 RT ACCGAGGCGTAGAACTTGAG recombinasa de DNA de C. necator H16, utilizado Rv en ensayos de RT-PCR. HK CIB RT GGACGCAGTCTTTTGCGTGGT Amplificación de un fragmento interno (220 pb) Fw del gen housekeeping dnaE, codificante de la AAC housekeeping recA, codificante de la HK CIB RT GTGCGTCAAAGTCGCTGCTGT subunidad α de la DNA polimerasa III de Azoarcus Rv sp. CIB, utilizado en ensayos de RT-PCR. CG recA CIB RT CGAAATCGAAGGTGAGATGG Amplificación de un fragmento interno (87 pb) del Fw gen recA CIB RT ATGTTGGCGGTGAGCTTG recombinasa de DNA de Azoarcus sp. CIB, Rv utilizado en ensayos de RT-PCR. housekeeping recA, codificante de la bzdN RT Fw GCATGTTCTGCCCGTTCT Amplificación de un fragmento interno (69 pb) del bzdN RT Rv CTTCCGCGTAGTCGAAGC gen bzdN de Azoarcus sp. CIB, utilizado en ensayos de RT-PCR. 76 Materiales y métodos Nombre Secuencia (5'→3') Utilización (Diana restricción) bzdW RT Fw TTCAACGTCCTCGACATCC Amplificación de un fragmento interno (84 pb) del bzdW RT Rv CAGCAGCTTCACGCTGTTAT gen bzdW de Azoarcus sp. CIB, utilizado en ensayos de RT-PCR. bzdX RT Fw AGTGCGAGCTGTGCAAGAC Amplificación de un fragmento interno (75 pb) del bzdX RT Rv AGATGCCCATCGAATTGC gen bzdX de Azoarcus sp. CIB, utilizado en ensayos de RT-PCR. bzdY RT Fw AGCGCCTTCGGTGATCTT Amplificación de un fragmento interno (99 pb) del bzdY RT Rv GTCGGGTTGTTCAGGATGAT gen bzdY de Azoarcus sp. CIB, utilizado en ensayos de RT-PCR. mbdY F1 GCAAGGAAGCAGGGCGCG Amplificación de un fragmento de 324 pb mbdW R2 CGCGCCGAAGCTGAAGTGC comprendido entre los genes mbdY y mbdW de Azoarcus sp. CIB, utilizado en ensayos de RT-PCR (Juárez et al., 2013). mbdO RT Fw CCGAGAGTGGTTCGACAGTT Amplificación de un fragmento interno (75 pb) del mbdO RT Rv TTCCCGGCGATAAAACAGTA gen mbdO de Azoarcus sp. CIB, utilizado en ensayos de RT-PCR. aliA RT Fw TTCCGCAAGTTCGACCAC Amplificación de un fragmento interno (77 pb) del aliA RT Rv ACGACGACGACCTGCTTC gen aliA de Azoarcus sp. CIB, utilizado en ensayos de RT-PCR. badK RT Fw ATGGACCTGTGCCTGACC Amplificación de un fragmento interno (135 pb) badK RT Rv CGAGAACTCGGCGATCTT del gen badK de Azoarcus sp. CIB, utilizado en ensayos de RT-PCR. aliB RT Fw AAGTGATCCGCGAAATGG Amplificación de un fragmento interno (120 pb) aliB RT Rv CGCCATACGAGATCTGCTC del gen aliB de Azoarcus sp. CIB, utilizado en ensayos de RT-PCR. badH RT Fw AGCCGTTGTAGCGGAAATC Amplificación de un fragmento interno (64 pb) del badH RT Rv CGTCAGATCGACCGCATAG gen badH de Azoarcus sp. CIB, utilizado en ensayos de RT-PCR. badI RT Fw GCGACCGTTACGATCAACCG Amplificación de un fragmento interno (104 pb) badI RT Rv ATGCTGCGGTCGTAATCCG del gen badI de Azoarcus sp. CIB, utilizado en ensayos de RT-PCR. 77 Materiales y métodos Nombre Secuencia (5'→3') Utilización (Diana restricción) AzCIB_1942 TGTTCGGGCTGTCGATTC RT Fw AzCIB_1942 Amplificación de un fragmento interno (88 pb) del gen AzCIB_1942 de Azoarcus sp. CIB, utilizado en GTGCGACCGATCTCGAAG ensayos de RT-PCR. CGCTCGACTGGCTGATCT Amplificación de un fragmento interno (74 pb) del RT Rv AzCIB_1941 RT Fw AzCIB_1941 gen AzCIB_1941 de Azoarcus sp. CIB, utilizado en GATCGTGCCCGTATCGAC ensayos de RT-PCR. GCATTGCTGCACGATCAAG Amplificación de un fragmento interno (82 pb) del RT Rv AzCIB_1940 RT Fw AzCIB_1940 gen AzCIB_1940 de Azoarcus sp. CIB, utilizado en GGTGTTCTCTCCGATCACG ensayos de RT-PCR. TCTACGCAGGGGAGATCCT Amplificación de un fragmento interno (112 pb) RT Rv AzCIB_1937 RT Fw AzCIB_1937 del gen AzCIB_1937 de Azoarcus sp. CIB, GCCAGCGACTCGTAGGTC utilizado en ensayos de RT-PCR. GCTGCATTGCTGCTTATCG Amplificación de un fragmento interno (81 pb) del RT Rv AzCIB_2918 RT Fw AzCIB_2918 gen AzCIB_2918 de Azoarcus sp. CIB, utilizado en CCGTGCAATGAACAACTGAG ensayos de RT-PCR. GCGATGGCGATCTCTACATT Amplificación de un fragmento interno (109 pb) RT Rv AzCIB_2916 RT Fw AzCIB_2916 del gen AzCIB_2916 de Azoarcus sp. CIB, GAGTCGAACACCTTGAAGTCG utilizado en ensayos de RT-PCR. GTGCATCCCCGAGGAATA Amplificación de un fragmento interno (70 pb) del RT Rv AzCIB_2912 RT Fw AzCIB_2912 gen AzCIB_2912 de Azoarcus sp. CIB, utilizado en GATCTCGAACGCGACCAG ensayos de RT-PCR. CCTGACGAACGTCGAAGC Amplificación de un fragmento interno (141 pb) RT Rv AzCIB_2911 RT Fw AzCIB_2911 RT Rv 78 del gen AzCIB_2911 de Azoarcus sp. CIB, CCGACCGAAAAGACGATG utilizado en ensayos de RT-PCR. Materiales y métodos Nombre Secuencia (5'→3') Utilización (Diana restricción) AzCIB_2910 TCGAGTGTGGTGAACTGAGC RT Fw AzCIB_2910 Amplificación de un fragmento interno (88 pb) del gen AzCIB_2910 de Azoarcus sp. CIB, utilizado en GTCGGCTGTTCCTTGTCG ensayos de RT-PCR. TTATTGCAGAACACGACAACG Amplificación de un fragmento interno (106 pb) RT Rv AzCIB_2909 RT Fw AzCIB_2909 del gen AzCIB_2910 de Azoarcus sp. CIB, ATCAGCACGTGGACCTCAGT utilizado en ensayos de RT-PCR. GCACGCTGACTTTCGAGGACC Amplificación de un fragmento de 300 pb RT Rv aliA-badK CRT Fw aliA-badK comprendido entre los genes aliA y badK de TGGCCGATCCCGGTCATCAC para el análisis cotranscripcional. CRT Rv aliB-badH TGATGGGTCTGCAGATCGGCG CRT Fw aliB-badH GCAGATTGCGGAACCGATGCC Azoarcus sp. CIB, utilizado en ensayos de RT-PCR para el análisis cotranscripcional. GAAGCTCCGTACCGCCTTC CRT Fw badI RT Rv Amplificación de un fragmento de 721 pb comprendido entre los genes aliA y badK de CRT Rv badH-badI Azoarcus sp. CIB, utilizado en ensayos de RT-PCR Amplificación de un fragmento de 337 pb comprendido entre los genes badH y badI de ATGCTGCGGTCGTAATCCG Azoarcus sp. CIB, utilizado en ensayos de RT-PCR para el análisis cotranscripcional. badI- CTCTACTACGAGACGGCCGAG Amplificación de un fragmento de 325 pb AzCIB_1942 comprendido entre los genes badI y AzCIB_1942 CRT Fw de Azoarcus sp. CIB, utilizado en ensayos de RT- badI- GCACGAAGCGCGAAATCGTG PCR para el análisis cotranscripcional. TTCGGAAATGTGCTGCCGCG Amplificación de un fragmento de 328 pb AzCIB_1942 CRT Rv AzCIB_194241 CRT Fw AzCIB_194241 CRT Rv comprendido entre los genes AzCIB_1942 y CGATCCGCAGCACATCCTCG AzCIB_1941 de Azoarcus sp. CIB, utilizado en ensayos de RT-PCR para el análisis cotranscripcional. 79 Materiales y métodos Secuencia (5'→3') Nombre Utilización (Diana restricción) AzCIB_1941- GCCCTTGTCGGAATTCGTTGT Amplificación de un fragmento de 1108 pb 39 CRT Fw C comprendido entre los genes AzCIB_1941 y AzCIB_1941- ATGCGCACCTGCTGGTTC AzCIB_1939 de Azoarcus sp. CIB, utilizado en ensayos 39 CRT Rv de RT-PCR para el análisis cotranscripcional. AzCIB_1939- CCCAGATCAAGGAAGTGCTGC 38 CRT Fw Amplificación de un fragmento de 356 pb comprendido entre los genes AzCIB_1941 y AzCIB_1939- CATCTTGCCCTTCTCGGCG AzCIB_1939 de Azoarcus sp. CIB, utilizado en ensayos 38 CRT Rv de RT-PCR para el análisis cotranscripcional. AzCIB_1938- CTCGACGATCCTCGCGATCC 37 CRT Fw Amplificación de un fragmento de 354 pb comprendido entre los genes AzCIB_1941 y AzCIB_1938- TGCGACGTTGCGCGAATCC AzCIB_1939 de Azoarcus sp. CIB, utilizado en ensayos 37 CRT Rv de RT-PCR para el análisis cotranscripcional. PaliB Fw GGGGGGGAATTCCGCTGCTCC Extremo 5’ para amplificar un fragmento de 100 EMSA WT TCCTGTGTAGGTTGAGCGCAT pb que incluye la región promotora del gen aliB EcoRI TCTAGGGAGCATCGAACTTAT (PaliB), utilizado para los ensayos de retardo en gel. CTGT (EcoRI) PaliB Rv TGAACCCAGTTTTGGCCGGTT Extremo 3’ para amplificar un fragmento de 100 AAAAAAAGAAATAGCAATGT pb que incluye PaliB con el sitio consenso de unión ATTGACAGATAAGTTCGATGC a BadR (negrita y subrayado), utilizado para los TCCC ensayos de retardo en gel. EMSA WT Rv TGAACCCAGTTTTGGCCGGTT Extremo 3’ para amplificar un fragmento de 100 EMSA AAAAAAAGAAATAGCAATAT pb que incluye PaliB con el sitio de unión a BadR CAATATTG TGACAGATAAGTTCGATGCTC modificado (negrita y subrayado), utilizado para CC los ensayos de retardo en gel. PaliB Rv TGAACCCAGTTTTGGCCGGTT Extremo 3’ para amplificar un fragmento de 100 EMSA AAAAAAAGAAATAGCAATGT pb que incluye PaliB con el sitio de unión a BadR GAATACAT ATTCACAGATAAGTTCGATGC modificado (negrita y subrayado), utilizado para TG TCCC los ensayos de retardo en gel. PaliB Rv TGAACCCAGTTTTGGCCGGTT Extremo 3’ para amplificar un fragmento de 100 EMSA AAAAAAAGAAATAGCAACCC pb que incluye PaliB con el sitio de unión a BadR CAAGGGGT CTTGACAGATAAGTTCGATGC modificado (negrita y subrayado), utilizado para TG TCCC los ensayos de retardo en gel. PaliB 80 Materiales y métodos Secuencia (5'→3') Nombre Utilización (Diana restricción) Rv TGAACCCAGTTTTGGCCGGTT Extremo 3’ para amplificar un fragmento de 100 EMSA AAAAAAAGAAATAGCATTAT pb que incluye PaliB con el sitio de unión a BadR CAATATAA ATTGACAGATAAGTTCGATGC modificado (negrita y subrayado), utilizado para TG TCCC los ensayos de retardo en gel. PaliB Rv TGAACCCAGTTTTGGCCGGTT Extremo 3’ para amplificar un fragmento de 100 EMSA AAAAAAAGAAATAGCAATGT pb que incluye PaliB con el sitio de unión a BadR CAATACAC GTATTGACAGATAAGTTCGAT modificado (negrita y subrayado), utilizado para ATTG GCTCCC los ensayos de retardo en gel. PaliB Rv TGAACCCAGTTTTGGCCGGTT Extremo 3’ para amplificar un fragmento de 100 EMSA AAAAAAAGAAATAGCTTTGT pb que incluye PaliB con el sitio de unión a BadR CAATACAA ATTGACAGATAAGTTCGATGC modificado (negrita y subrayado), utilizado para AG TCCC los ensayos de retardo en gel. PaliB Rv TGAACCCAGTTTTGGCCGGTT Extremo 3’ para amplificar un fragmento de 100 EMSA AAAAAAAGAAATAGCAATGT pb que incluye PaliB con el sitio de unión a BadR CAATACAC GTGTATTGACAGATAAGTTC modificado (negrita y subrayado), utilizado para ACATTG GATGCTCCC los ensayos de retardo en gel. F24 CGCCAGGGTTTTCCCAGTCAC Secuenciación de los fragmentos de DNA GAC clonados en plásmidos que portan el gen lacZa PaliB (pIZ1016). R24 AGCGGATAACAATTTCACACA Secuenciación de los fragmentos DNA clonados GGA en plásmidos que portan el promotor Plac o derivados. T7 TAATACGACTCACTATAGGG Secuenciación de los fragmentos de DNA clonados en plásmidos que contienen el promotor T7 (pET). TT7 GCTAGTTATTGCTCAGCGG Secuenciación de los fragmentos de DNA clonados en plásmidos que contienen el terminador transcripcional TT7 (pET). 16S1 AAGGAGGTGATCCAGCC Secuenciación del 16S rDNA para comprobar la identidad de las cepas bacterianas. 16S2 GAGASTTTGATCHTGGCTCAG Secuenciación del 16S rDNA para comprobar la identidad de las cepas bacterianas. 1387 Rv GGGCGGWGTGTACAAGGC Secuenciación del 16S rDNA para comprobar la identidad de las cepas bacterianas. 81 Materiales y métodos Nombre Secuencia (5'→3') Utilización (Diana restricción) 63 Fw CAGGCCTAACACATGCAAGTC Secuenciación del 16S rDNA para comprobar la identidad de las cepas bacterianas. 3.3. Ensamblaje de DNA mediante la técnica “Gibson Assembly” La técnica Gibson Assembly (Gibson et al., 2009; Gibson, et al., 2010) emplea tres actividades enzimáticas en una única reacción: 1) Actividad exonucleasa 5': degrada una de las hebras del DNA a partir de los extremos 5' dejando unos largos extremos de DNA monocatenarios y exponiendo esa secuencia para que ocurra un anillamiento con la secuencia complementaria que se encuentra en otro fragmento de DNA. 2) Actividad polimerasa: rellena los espacios en las regiones complementarias anilladas. 3) Actividad DNA ligasa: sella covalentemente los fragmentos de DNA en las regiones complementarias anilladas y rellenadas para generar fragmentos de DNA de doble cadena híbridos. Figura 6. Esquema de la técnica Gibson Assembly. Se representa como los fragmentos A y B generados mediante PCR para tener extremos solapantes con el vector y entre si (representados con los mismos colores) se insertan en el plásmido de destino mediante esta técnica, gracias a las actividades 5’ exonucleasa, DNA polimerasa y DNA ligasa. La reacción se llevó a cabo en un equipo ThermoMixer™ modelo F2.0 (Eppendorf) durante 1 hora a 50°C utilizando el kit Gibson Assembly Master Mix (New England Biolabs). 3.4. Producción de DNA sintético 82 Materiales y métodos La cassette bad sintética fue generada por la empresa GeneScript® en la plataforma GenPlus. El plásmido pIZBad también fue generado por GeneScript® gracias a su servicio de clonaje en vectores personalizados. 3.5. Secuenciación automática de DNA La secuenciación de DNA se llevó a cabo utilizando un secuenciador automático modelo ABI Prism 37 automated DNA sequencer (Applied Biosystems Inc), en el Servicio de Secuenciación Automática de DNA gestionado por la empresa Secugen S. L. en el Centro de Investigaciones Biológicas Margarita Salas. Para la reacción de secuenciación se utilizó el Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems), y la DNA polimerasa AmpliTaq FS, siguiendo las recomendaciones de los proveedores. Las reacciones se llevaron a cabo con un termociclador Gene Amp PCR System 2400 (Perkin-Elmer). 3.6. Extracción y purificación de RNA La purificación del RNA se realizó partiendo de las células bacterianas resuspendidas en una solución de lisozima 50 mg/ml (Sigma) en tampón TE (Tris-HCl 10mM pH 8,0, EDTA 1 mM). A continuación, el RNA total del cultivo se aisló mediante el High Pure RNA Isolation kit (Roche), siguiendo las recomendaciones del fabricante. Para la eliminación del DNA contaminante se empleó el DNAse and Removal treatment kit (Ambion), siguiendo las especificaciones del fabricante. La concentración y pureza del RNA obtenido se analizó mediante un análisis espectrofotométrico a A260 y de la ratio A260/A280, respectivamente, manteniéndose este último siempre entre 1,8 y 2 (Nanophotometer Pearl, IMPLEN), y mediante su visualización en geles de agarosa. 3.7. Ensayos de retrotranscripción (RT-PCR) y PCR cuantitativa Una vez extraído el RNA para comprobar que no tuviera DNA contaminante, se realizó una PCR usando la DNA polimerasa I Taq (Biotools), como se indica en el apartado 3.2, utilizando 1 µl de RNA como molde y utilizando los oligonucleótidos para la amplificación de los genes housekeeping dnaE o recA, indicados en la tabla 3. La ausencia de banda de amplificación significa que el RNA no está contaminado con DNA (puesto que en esta PCR se busca obtener un resultado negativo es necesario incluir un control positivo añadiendo 1 µl de DNA genómico para comprobar que la reacción se ha llevado a cabo correctamente). En el caso de observar amplificación es necesario repetir el tratamiento con DNAse and Removal treatment kit (Ambion), y realizar de nuevo la PCR de comprobación. Una vez purificado el RNA y eliminado el DNA contaminante, se realizó una reacción de retrotranscripción mediada por la transcriptasa reversa del Transcriptor First Strand cDNA Synthesis kit (Roche). Cada reacción de retrotranscripción (20 μl) contenía 1 μg de RNA, 10 U de transcriptasa reversa, 20 U de inhibidor de RNasas, dNTPs 1 mM y 60 μM random hexamer primer del kit. Los hexámeros se emplearon como cebadores para poder utilizar las mismas alícuotas de cDNA como molde para reacciones de PCR en las que se emplean diversos pares de oligonucleótidos. El protocolo estándar para la síntesis de cDNA consistió 83 Materiales y métodos en una incubación de 10 min a 25°C, seguido de un ciclo de 30 min a 55°C y una última incubación de 5 min a 85°C, utilizando un equipo Mastercycler Gradient (Eppendorf). Posteriormente se empleó 1 μl del cDNA obtenido como molde para la PCR posterior. El cDNA se amplificó utilizando los oligonucleótidos requeridos en cada caso a una concentración final de 0,5 μM, y 1 U de la DNA polimerasa I Taq (Biotools). El volumen total de la reacción de PCR fue de 50 μl y se realizaron 25 ciclos de amplificación siguiendo el programa descrito en el apartado 3.2. Cuando se llevó a cabo experimentos de PCR a tiempo real, se utilizó un termociclador LightCycler®480 II Real-Time PCR Instrument (Roche). El volumen de cada reacción fue de 20 μl, que contenían 1 μl de cDNA de la mezcla de la reacción de la retrotranscripción, 0,25 μM de la pareja de oligonucleótidos correspondiente y 10 μl de SYBR Green Master Mix (Roche). Los genes dnaE y recA, que codifican para la subunidad α de la DNA polimerasa III y la recombinasa RecA, respectivamente, cuya expresión se ha demostrado constitutiva a lo largo del ciclo celular, fueron utilizados como control interno en las reacciones de PCR a tiempo real, empleando la pareja de oligonucleótidos HK H16 RT Fw / HK H16 RT Rv (Tabla 3). Los resultados se mostraron como cuantificaciones relativas utilizando el método ΔΔCt (Livak y Schmittgen, 2001). Las amplificaciones por PCR se llevaron a cabo de la siguiente forma: 1 ciclo inicial de desnaturalización (95°C, 4 min), seguido de 55 ciclos de amplificación (desnaturalización, 95°C, 10 s; hibridación, 60°C, 10 s; elongación y medida de la señal, 72°C, 10 s). Para la cuantificación relativa de los valores de fluorescencia obtenidos, se realizó una curva de calibrado con las mismas parejas de oligonucleótidos y con diluciones seriadas de DNA genómico de C. necator H16. 3.8. Electroforesis en geles de agarosa Para visualizar los fragmentos de DNA y la integridad del RNA total se utilizaron geles del 0,7% o 1,5% (m/v) de agarosa en tampón TAE (40 mM Tris-HCl; 20 mM ácido acético; 2 mM EDTA, pH 8), utilizando el mismo tampón como electrolito. A las muestras se les añadió ¼ de su volumen de tampón de carga (30% Ficoll 400 (m/v); 0,2% azul de bromofenol (m/v); 0,2% xileno cianol (m/v) y 40 mM EDTA pH 8,0). La electroforesis se realizó a 100 V durante 15-20 min y, una vez finalizada, los geles se tiñeron con Gel Red Nucleid Acid Gel Stain (Biotium), visualizándose los fragmentos de ácidos nucleicos con radiación ultravioleta en un transiluminador. Como marcador de tamaño de DNA se utilizaron Quick-LoadTM 100bp DNA Ladder o Quick-LoadTM 1kp DNA Ladder (New England BioLabs). 4. Procedimientos de transferencia genética 4.1. Transformación de células de E. coli, A. baylyi ADP1 y P. putida KT2440 mediante choque térmico o electroporación Las células de E. coli se transformaron utilizando dos procedimientos distintos: choque térmico y electroporación. Las células de A. baylyi ADP1 y P. putida KT2440 se transformaron exclusivamente por 84 Materiales y métodos electroporación. La transformación por choque térmico requiere la preparación previa de células competentes con RbCl (Green et al., 2012) o utilizando el kit Mix & Go! E.coli Transformation Kit (Zymo Research®). La transformación por electroporación (Wirth et al., 1989) se llevó a cabo en un equipo Gene Pulser/Pulse Controller (Bio-Rad), según las recomendaciones del fabricante, utilizando las siguientes condiciones: 2,5 kV, 25 μF, 200 Ω. 4.2. Transferencia de plásmidos a Azoarcus sp. CIB, A. communis, B. xenovorans, C. necator y C. pinatubonensis mediante conjugación biparental Los plásmidos se movilizaron a Azoarcus sp. CIB, A. communis, B. xenovorans, C. necator y C. pinatubonensis por conjugación biparental utilizando la cepa E. coli S17-1λpir como donador, siguiendo el protocolo establecido por de Lorenzo y Timmis (1994) con algunas modificaciones. Para su realización, se utilizó una cantidad de células de la cepa donadora correspondiente a una A600 de 5 provenientes de un cultivo en LB con Kan y Sm; y de la cepa receptora, Azoarcus sp. CIB, A. communis, B. xenovorans, C. necator y C. pinatubonensis cultivadas en medio mínimo MC con piruvato 0,2% (m/v), succinato 0,2% (m/v) o benzoato 3mM. Se empleó una cantidad de células correspondiente a una A600 de 35. Los exconjugantes fueron seleccionados aeróbicamente en placas de medio mínimo MC con 10 mM ácido glutárico (0,2%), 3 mM CHC o 3 mM benzoato (contra-selección de la cepa donadora) y el correspondiente antibiótico cuyo gen de resistencia se encuentra en el plásmido. Este protocolo de conjugación se empleó tanto para la transferencia de plásmidos replicativos como de plásmidos suicidas. 5. Construcción de cepas mutantes de deleción en Azoarcus sp. CIB por doble recombinación homóloga Para la construcción de los mutantes de deleción de Azoarcus sp. CIB (Azoarcus ΔbzdW, Azoarcus CIBTΔbzdW, Azoarcus ΔbadHI, Azoarcus ΔAzCIB_1938) se clonaron en el vector pK18mobsacB (Tabla 2) dos fragmentos de DNA flanqueantes a las regiones que se quiere delecionar (Fig. 6). Para generar los mutantes Azoarcus ΔbzdW y Azoarcus CIBTΔbzdW se clonó una región de DNA localizada en posición 5’ al gen bzdW (fragmento ΔbzdW 1 de 788 pb), utilizando la pareja de oligonucleótidos ΔbzdW Fw/Rv 1(XbaI/BamHI) (Tabla 3) y otra región localizada en posición 3’ al gen bzdW (fragmento ΔbzdW 2 de 967 pb), utilizando la pareja de oligonucleótidos ΔbzdW Fw/Rv 2 (BamHI/HindIII) (Tabla 3), dando lugar al plásmido pK18mobsacBΔbzdW (Tabla 2). Para generar el mutante Azoarcus ΔbadHI se clonó una región de DNA localizada en posición 5’ al gen badH (fragmento ΔbadHI 1 de 719 pb), utilizando la pareja de oligonucleótidos ΔbadHI Fw/Rv 1(XbaI/BamHI) (Tabla 3) y otra región en posición 3’ al gen badI (fragmento ΔbadHI 2 de 939 pb), utilizando la pareja de oligonucleótidos ΔbadHI Fw/Rv 2 (BamHI/HindIII) (Tabla 3), dando lugar al plásmido pK18mobsacBΔbadHI (Tabla 2). Para generar el mutante Azoarcus ΔAzCIB_1938 se clonó una región de DNA localizada en posición 5’ al gen AzCIB_1938 (fragmento ΔAzCIB_1938 1 de 612 pb), 85 Materiales y métodos utilizando la pareja de oligonucleótidos ΔAzCIB_1938 Fw/Rv 1(NdeI/HindIII) (Tabla 3) y otra región en posición 3’ al gen AzCIB_1938 (fragmento ΔAzCIB_1938 2 de 809 pb), utilizando la pareja de oligonucleótidos Figura 7. Estrategia seguida para la construcción de los mutantes mediante deleción en Azoarcus sp. CIB. En la parte superior de la figura se representa el cromosoma de Azoarcus sp. CIB. Se toma como ejemplo para mutar el gen bzdW (verde). En morado y en azul se representan las regiones localizadas en posición 5’ y 3’, respectivamente, al gen bzdW. Tras amplificar por PCR los productos de dichas regiones con las parejas de oligonucleótidos ΔbzdW Fw/Rv 1 y ΔbzdW Fw/Rv 2, son clonados en un vector suicida. Tras dos sucesos de recombinación homóloga, se seleccionan los exconjugantes resistentes a sacarosa y sensibles al antibiótico correspondiente del plásmido, y son analizadas por PCR para confirmar la cepa mutante Azoarcus ΔbzdW que porta la deleción del gen bzdW en su cromosoma. ΔAzCIB_1938 Fw/Rv 2 (XbaI/NdeI) (Tabla 3), dando lugar al plásmido pK18mobsacBΔAzCIB_1938 (Tabla 2). Las construcciones resultantes pK18mobsacBΔbzdW, pK18mobsacBΔbadHI y pK18mobsacBΔAzCIB_1938 fueron transferidas de la cepa donadora E. coli S17-1 λpir (Tabla 1) a la cepa receptora Azoarcus sp. CIB (y también a Azoarcus sp. CIBT en el caso de pK18mobsacBΔbzdW), mediante conjugación biparental, tal y como se indica en el apartado 4.2. de esta sección. Los exconjugantes fueron seleccionados aeróbicamente en placas de medio mínimo MC con kanamicina (30 μg/ml) y ácido glutárico 10 86 Materiales y métodos mM (0,2%) (en el caso de pK18mobsacBΔbadHI y pK18mobsacBΔAzCIB_1938), o 3 mM CHC (en el caso de pK18mobsacBΔbzdW) como fuente de carbono para la contra-selección de la cepa donadora. Las colonias obtenidas sufrieron una recombinación simple que integra los plásmidos suicidas dentro del cromosoma. Posteriormente fueron crecidas en medio líquido MA con 10 mM ácido glutárico o 3mM CHC sin antibiótico durante 3 pases sucesivos y manteniendo el cultivo en fase estacionaria durante 24h-48h en cada pase para favorecer el segundo evento de recombinación espontáneo. Durante el cuarto pase, y recogiendo el cultivo en fase exponencial, las cepas fueron inoculadas en placas de MA con 10 mM ácido glutárico o 3mM CHC y 5% sacarosa (m/v) para seleccionar aquéllas que habían perdido el plásmido suicida integrado en el genoma. Al menos 20 candidatos de estos nuevos exconjugantes se crecieron en MA con 10 mM ácido glutárico o 3mM CHC y 5% sacarosa (m/v) fueron analizados por PCR con las parejas de oligonucleótidos BzdW - Fw/Rv, BadHI- Fw/Rv o AzCIB_1938- Fw/Rv para confirmar si durante la segunda recombinación había sucedido la deleción del gen correspondiente o la reversión al gen silvestre. Aquellos candidatos en los que se confirmó la deleción se crecieron en MA con 10 mM ácido glutárico o 3mM CHC, 5% sacarosa (m/v) y kanamicina (30 μg/ml) para confirmar su resistencia a sacarosa y su sensibilidad al antibiótico para corroborar la pérdida del plásmido suicida y que éste no hubiese recombinado en otra región del genoma causando efectos polares. 6. Técnicas de manipulación de proteínas 6.1. Electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) Las electroforesis analíticas de proteínas se realizaron en todos los casos en condiciones desnaturalizantes en presencia de dodecilsulfato sódico (SDS). La técnica utilizada fue la descrita por Laemmli (1970) utilizando geles de poliacrilamida a diferentes concentraciones (7.5-12.5%). Las muestras se hirvieron a 100 °C durante 10 min en presencia del tampón de ruptura (62,5 mM Tris-HCl pH 6,8, 2% SDS, 5% βmercaptoetanol, 10% glicerol y 0,005% azul de bromofenol). Las electroforesis se realizaron a temperatura ambiente y a 150 V (corriente constante), utilizando un electrolito que contenía 25 mM Tris-HCl pH 8,8, 192 mM glicina y 0,1% SDS. Las proteínas de los geles se tiñeron con azul brillante de Coomassie R-250 (Swank y Munkres, 1971). Las proteínas empleadas como marcadores de masa molecular (miosina, 200 kDa; βgalactosidasa E. coli, 116.3 kDa; fosforilasa B, 97.4 kDa; BSA, 66.2 kDa; ovoalbúmina, 45 kDa; anhidrasa carbónica, 31 kDa; inhibidor de tripsina, 21.5 kDa; lisozima, 14.4 kDa y aprotinina, 6.5 kDa) se adquirieron a Bio-Rad. 6.2. Sobreproducción y purificación de proteínas desde los vectores de expresión pET28 La cepa E. coli BL21 (DE3) pET28BadR se empleó para la sobreproducción de la proteína His6-BadR. Todos los cultivos se realizaron en medio LB + Kan incubados en agitación a 37°C. A partir de un preinóculo overnight se inocularon 100 ml de medio a una A600 inicial de 0,05 y se incubó a 37°C. Una vez el cultivo alcanzó una A600 de 0,5 se adicionó 0,5 mM IPTG y la temperatura de incubación se redujo a 30°C. El cultivo se incubó 4 horas y posteriormente las células se recogieron por centrifugación y se conservaron a -20°C. 87 Materiales y métodos Las células se resuspendieron en 10 ml de tampón de trabajo (50 mM NaH2PO4, 50 mM Na2HPO4, 300 mM NaCl, imidazol (diferentes concentraciones entre 50 mM-2 M), pH 7,8) y a continuación se dividieron en alícuotas de 2 ml. Las células se rompieron por sonicación (5 rondas de pulsos cada 0.5 segundos a lo largo de 30 segundos al 70% amplitud; Bandelin Sonoplus). El extracto obtenido se centrifugó a 4°C y 20.000 g durante 20 minutos y se recogió el sobrenadante (extracto crudo). La purificación de la proteína His 6-BadR se realizó empleando una columna de afinidad que contenía níquel (Ni-NTA, Qiagen). Una vez equilibrada la columna con el tampón de trabajo, se hizo pasar el extracto celular a través de la misma y se lavó con 2 volúmenes del mismo tampón. Finalmente, las proteínas fueron eluídas con el tampón de trabajo, con un gradiente ascendiente de concentración de imidazol que partía de 50 mM y llegaba a 2 M. Se recogieron fracciones de 1 ml, y la concentración de proteína se estimó mediante espectrofotometría a 280 nm, teniendo en cuenta el coeficiente de extinción molar teórico de la proteína (84840 M-1 cm-1). Las alícuotas que presentaban una mayor absorbancia a 280 nm (500 mM, 1 M y 2 M de imidazol) se analizaron mediante SDS-PAGE. Las fracciones que contenían His6-BadR se dializaron a 4°C en el tampón de análisis (50 mM NaH2PO4, 50 mM Na2HPO4, 300 mM NaCl, 10% glicerol, pH 7,8). Posteriormente, las proteínas fueron repartidas en alícuotas y almacenadas a – 20°C durante al menos 3 meses sin observar pérdida de su actividad. 7. Ensayos de actividad enzimática 7.1. Ensayos de actividad β-galactosidasa Para los ensayos de actividad β-galactosidasa se emplearon células de E. coli portadoras de la fusión traduccional PaliB::lacZ en el plásmido pSEVA225TPaliB (Tabla 2). Las células se cultivaron a 37°C en medio LB con 1 mM IPTG y, cuando se indica, ciclohexano carboxilato (CHC), hasta alcanzar la densidad óptica deseada en cada caso (mitad de la fase exponencial de crecimiento, A600 0,6-0,8). La actividad βgalactosidasa se analizó permeabilizando las células, y las unidades de actividad enzimática (Unidades Miller) se determinaron según el método descrito por Miller (1972). 8. Ensayos de unión de proteína a DNA 8.1. Marcaje de sondas radiactivas Las sondas se amplificaron mediante PCR empleando la DNA polimerasa Taq (Biotools) y las parejas de oligonucleótidos específicos PaliB Fw EMSA WT EcoRI y el oligonucleótido Rv correspondiente para generar las diferentes sondas con el sitio de unión a BadR modificado (Tabla 3). En todos los casos la longitud de las sondas fue de 100 pb e incluía un sitio de restricción EcoRI en su extremo. ▪ Sonda PaliB WT: sonda generada con el oligonucleótido PaliB Rv EMSA WT que incluye el sitio consenso de unión a BadR (CAATN2ATTG). ▪ Sonda PaliB CAATATTG: sonda generada con el oligonucleótido PaliB Rv EMSA CAATATTG WT que incluye el sitio de unión a BadR modificado (CAAT-ATTG). ▪ Sonda PaliB GAATACATTG: sonda generada con el oligonucleótido PaliB Rv EMSA GAATACATTG que incluye el sitio de unión a BadR modificado (GAATN2ATTG). 88 Materiales y métodos ▪ Sonda PaliB CAAGGGGTTG: sonda generada con el oligonucleótido PaliB Rv EMSA CAAGGGGTTG que incluye el sitio de unión a BadR modificado (CAAGGGGTTG). ▪ Sonda PaliB CAATATAATG: sonda generada con el oligonucleótido PaliB Rv EMSA CAATATAATG que incluye el sitio de unión a BadR modificado (CAATN2AATG). ▪ Sonda PaliB CAATACACATTG: sonda generada con el oligo PaliB Rv EMSA CAATACACATTG que incluye el sitio de unión a BadR modificado (CAATN4ATTG). ▪ Sonda PaliB CAATACAAAG: sonda generada con el oligonucleótido PaliB Rv EMSA CAATACAAAG que incluye el sitio de unión a BadR modificado (CAATN2AAAG). ▪ Sonda PaliB CAATACACACATTG: sonda generada con el oligonucleótido PaliB Rv EMSA CAATACACACATTG que incluye el sitio de unión a BadR modificado (CAATN6ATTG). Los fragmentos de PCR se purificaron mediante el kit QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) y se digirieron con la enzima de restricción EcoRI. Los productos obtenidos se marcaron en el extremo digerido mediante incorporación de [α-32P] dATP (6000 Ci/mmol, 20mCi/ml; Perkin-Elmer) con el fragmento Klenow de la DNA polimerasa I de E. coli (5 U/μl, Promega). Los fragmentos marcados se purificaron mediante el kit QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen). 8.2. Ensayos de retardo en gel Para los ensayos de retardo en gel se utilizaron las sondas radiactivas obtenidas tal y como se detalla en el apartado anterior. Las mezclas de reacción contenían la proteína purificada His6-BadR a diversas concentraciones (1-8 pM), así como la sonda correspondiente marcada radiactivamente a una concentración de 0.5 nM en un volumen final de reacción de 9 μl. El tampón utilizado contenía 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 10% glicerol, 50 mM KCl, 2 mM β-mercaptoetanol, 250 μg/ml seroalbúmina bovina (BSA) y DNA inespecífico de esperma de salmón a una concentración de 50 μg/ml. El resultado de la reacción se analizó por PAGE al 5% en tampón TBE 0.5x (45 mM Tris-borato, 1 mM EDTA). El gel se secó sobre papel Whatman 3MM y los productos de la reacción se detectaron por autorradiografía con películas Hyperfilm MP (Amersham Biosciences) con pantallas amplificadoras (Cronex Lightning Plus DuPont). 9. Ensayos de transporte de o-ftalato radiactivo Los ensayos de transporte se realizaron con las cepas A. evansii y Azoarcus sp. CIB conteniendo los plásmidos pIZPHTRAP o pIZPHT (control negativo). En el caso de A. evansii, a partir de un cultivo crecido en medio MC con benzoato en condiciones anaeróbicas, se inocularon células a una A600 inicial de 0,1 en 20 ml de medio MC con 3 mM benzoato (control) o con 3 mM PA, y los cultivos se incubaron durante 24h. En el caso de las cepas de Azoarcus sp. CIB conteniendo los plásmidos pIZPHTRAP o pIZPHT, las células se crecieron anaeróbicamente en medio MC con 3 mM benzoato y Gm (7 μg/ml), y se inocularon a una A600 inicial de 0,1 en 20 ml de medio NB con IPTG (isopropiltiogalactopiranósido) 1mM para inducir la expresión de los genes pht durante 16h hasta que los cultivos alcanzaron el comienzo de la fase estacionaria de crecimiento (A600 1,8-2,0). En todos los casos las células se recogieron por centrifugación a 4°C y se lavaron 89 Materiales y métodos dos veces con solución salina. Finalmente, las células se resuspendieron en 2 mL de solución salina a una A600 de 4. Los ensayos de transporte se realizaron en un volumen final de 100 μl, conteniendo 10 μl de 14C-oftalato (50 μCi/mmol; American Radiolabeled Chemicals) (concentración final entre 5 y 25 µM), 40 μl de solución salina, 50 μl de células resuspendidas en solución salina a una A600 de 2. El ensayo de transporte comienza cuando se añaden las células, y se realiza en un termobloque a 30°C y 300 r.p.m. Cuando se realizaron ensayos de competición con ftalatos no marcados radiactivamente, se utilizó 10 μl de 14 C-PA (concentración final 25 µM), 10 μl de o-ftalato, isoftalato o tereftalato fríos (no marcados radiactivamente) a una concentración final de 250 µM, 30 μl de solución salina, y 50 μl de células resuspendidas en solución salina a una A600 de 2. Para los ensayos en presencia de inhibidores, se utilizaron 10 μl de 14 C-PA (concentración final 25 µM), 10 μl de N,N’-diciclohexilcarbodiimida 10 mM (DCCD, Sigma) o 2,4dinitrofenol 10 mM (DNP, Sigma), 30 μl de solución salina, 50 μl de células resuspendidas en solución salina a una A600 de 2. En este caso, las células se incuban a 30°C y 300 r.p.m. en un termobloque durante 10 min, y el ensayo de transporte comienza cuando se añade el 14C-PA. Para finalizar el ensayo de transporte, se añadió 1 ml de solución salina a 4°C, y se procedió inmediatamente a la filtración de las células mediante un sistema de filtración múltiple Millipore con filtros de un tamaño de poro de 0,22 µm. Las células retenidas en el filtro se lavaron secuencialmente con 5 ml de solución salina. Los filtros se dejaron secar y posteriormente se pasaron a tubos eppendorf de 2 ml con líquido de centelleo para medir la radiactividad en un contador de centelleo líquido (LKB Wallac). 10. Cromatografía líquida de alta presión (HPLC) La detección y cuantificación de la desaparición del benzoato y o-ftalato utilizados como fuente de carbono en los medios de cultivo se realizó mediante HPLC-DAD usando un equipo de cromatografía líquida de alta presión (Agilent Series 1260 Infinity II, Agilent, CA, USA) equipado con inyector automático acoplado en serie a un detector DAD que permitió monitorizar la elución a A225. La separación de los metabolitos se realizó con una columna de fase reversa C18 (MediterraneaTM sea 18 (TEKNOKROMA) (15 cm x 0,46 5μm)), a temperatura ambiente con un flujo de 1 mL min-1 e inyectando 25 µl de muestra. La fase móvil fue: agua ácida con 1% de ácido trifluoroacético (TFA) (A) y acetonitrilo (B). El método de elución fue el siguiente: Al inicio 100% de fase A; después de 5 min se incrementó de forma linear el porcentaje de la fase B hasta llegar al 100% en 20 min; finalmente, se modificó la mezcla hasta llegar a la original (100% de A) en 2 min y posteriormente se equilibró la columna durante 5 min con esa misma fase. Los datos se procesaron con el software proporcionado por la propia casa comercial (OpenLab CDS, Agilent, CA, USA). 11. Microscopía electrónica de transmisión (TEM) Para observar la producción de PHB en el interior celular, los cultivos bacterianos se recogieron en una fase de la curva de crecimiento adecuada mediante centrifugación a 3.800 r.p.m. 20 min a 4°C, se lavaron dos veces en solución salina y se fijaron en glutaraldehído al 5% (m/v). Posteriormente, las células se 90 Materiales y métodos suspendieron en OsO4 al 2,5% (m/v) durante 1 h, se deshidrataron gradualmente en soluciones de etanol (30%, 50%, 70%, 90% y 100% (v/v)); 30 min cada una) y óxido de propileno (1h), y se embebieron en resina Epon 812. Se cortaron secciones ultrafinas con un microtomo usando un cuchillo de diamante Diatome. Las secciones se recogieron en rejillas de cobre de malla 400 recubiertas con una capa de carbono y se observaron utilizando un microscopio electrónico de transmisión Jeol JEM-1230 en el servicio de Microscopía Electrónica del CIB. 12. Análisis mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) de la composición y cantidad de PHB intracelular Para determinar el contenido de PHB de Azoarcus sp. CIB (pIZPHTRAP) y C. necator (pIZPHTRAP), las células se cultivaron a 30°C en medio MC con 3 mM benzoato o 3 mM PA en condiciones anaeróbicas o aeróbicas, respectivamente, hasta que alcanzaron la fase estacionaria de crecimiento. La producción de PHB se cuantificó por GC-MS del poliéster hidrolizado mediante metanolisis y se mostró como el porcentaje de monómero de PHB con respecto al peso seco total de la célula (CDW). El procedimiento de metanolisis se realizó resuspendiendo 3 mg de células liofilizadas en 0,5 ml de cloroformo y 2 ml de metanol que contenía ácido sulfúrico al 15% y 0,5 mg ml-1 de ácido 3-metilbenzoico (patrón interno), y posterior incubación a 80°C durante 4 h. Tras enfriar la muestra, se añadió 1 ml de agua desmineralizada y 1 ml de cloroformo, y la fase orgánica que contiene los ésteres metílicos de los monómeros resultantes se analizó mediante GC-MS (de Eugenio et al., 2009). Se utilizó para el análisis un cromatógrafo de gases Agilent 7890A con un detector MS 5975C (EI, 70 eV) y un inyector split-splitless. Una alícuota (1 µl) de la fase orgánica se inyectó en el cromatógrafo de gas a una relación de división de 1:20. La separación de los compuestos se logró usando un sistema HP-5 MS columna capilar (5% fenil-95% de siloxano de metilo, de 30 m x 0,25 mm de espesor de película). Se utilizó helio como gas portador a una velocidad de flujo de 1 ml min-1. La temperatura del inyector y la línea de transferencia se fijaron en 275°C y 300°C, respectivamente. El programa de temperatura del horno fue: temperatura inicial 80°C durante 2 min, luego desde 80°C hasta 150°C a una velocidad de 5°C min-1 y se mantuvo durante 1 min. Los espectros de masas se registraron en modo de barrido completo (m/z 40 hasta 550). El éster metílico del ácido 3-hidroxibutírico se resolvió usando el modo de seguimiento de iones seleccionados (SIM). 13. Recursos informáticos El análisis de las secuencias nucleotídicas se realizó con los siguientes programas y servidores: Chromas 2.01 (Technelysium Pty Ltd.) para el análisis de cromatogramas procedentes de reacciones rutinarias de secuenciación, el análisis de secuencias, diseño de experimentos de ingeniería genética y diseño y análisis de oligonucleótidos; SnapGene software (GSL Biotech); la aplicación QPCRProbefinder (https://qpcr.probefinder.com/organism.jsp) para el diseño y análisis de oligonucleótidos de qRT-PCR y RTPCR; y OligoAnalyzer Tool (Integrated DNA Technologies) para el diseño y análisis de oligonucleótidos previa a su solicitud a la casa comercial para comprobar que no formasen estructuras secundarias o dimerizasen 91 Materiales y métodos consigo mismos o con su pareja y evitar los consiguientes problemas en el paso de amplificación de DNA por PCR. Las secuencias de nucleótidos y las secuencias deducidas de aminoácidos se compararon con las existentes en las bases de datos mediante el uso de los algoritmos BlastN y BlastP, respectivamente (Altschul et al., 1990). El servidor seleccionado para ejecutar estos algoritmos fue el del National Center for Biotechnology Information (NCBI; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/BLAST.cgi). La comparación de parejas de secuencias proteicas se realizó con el programa Blast2sequences a través del servidor del NCBI, mientras que para los alineamientos múltiples de secuencias se empleó el programa ClustalOmega desde el servidor EMBL-EBI (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). Como genoma de referencia de Azoarcus sp. CIB se empleó la secuencia depositada en la base de datos del NCBI (número de acceso en GenBank CP011072). Para el análisis de genes se utilizó la base de datos KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) (Kanehisa y Goto, 2000). Los estudios filogenéticos se realizaron mediante la herramienta Phylogeny (http://www.phylogeny.fr/), empleando el algoritmo MUSCLE para el alineamiento múltiple de secuencias y Gblocks para el curado de dichos alineamientos. Los filogramas se construyeron empleando un procedimiento bootstrap (100 replicados) y un modelo de sustitución WAG (Dereeper et al., 2008). 92 Resultados Resultados Resultados 1. Capítulo 1: Caracterización de la ruta periférica de la degradación anaeróbica del o-ftalato 1.1. Diseño de una cassette recombinante portadora de los genes catabólicos de la ruta periférica de o-ftalato Como se ha comentado en la Introducción, al inicio de esta tesis doctoral no se conocían los genes implicados en la degradación anaeróbica del o-ftalato. Gracias a nuestra colaboración con el grupo de Prof. Matthias Boll (Universidad Friburgo, Alemania) y a sus estudios bioquímicos y proteómicos sobre la degradación anaeróbica del o-ftalato en bacterias desnitrificantes (Thauera chlorobenzoica 3CB-1, Aromatoleum evansii y Aromatoleum aromaticum EbN1), pudimos conocer (previo a su publicación) que la ruta periférica implicada en el metabolismo anaeróbico del o-ftalato incluía dos etapas enzimáticas: la activación del compuesto aromático a o-ftaloil-CoA, y la subsiguiente descarboxilación de éste para generar benzoil-CoA, que es metabolizado posteriormente a través de la ruta central bzd (Fig. 2) (Ebenau-Jehle et al., 2017). En la bacteria A. aromaticum EbN1 se determinó que los genes de la ruta periférica se encontraban localizados entre las posiciones 62.049-71.015 pb en el megaplásmido p2A en una región rica en transposasas (Fig. 8). Este cluster génico consta de 7 marcos abiertos de lectura (ORFs) que codifican: una descarboxilasa de la familia UbiD (gen phtDa), una FMN preniltransferasa hipotética perteneciente a la familia UbiX (phtDb), dos subunidades de una hipotética CoA transferasa tipo III (genes phtSa y phtSb), y un hipotético sistema de transporte (phtTa y phtTb) que se encuentra separado de los genes anteriores por una presunta transposasa (Fig. 8). Figura 8. Organización del cluster génico implicado en la ruta periférica de degradación del o-ftalato en la bacteria Aromatoleum aromaticum EbN1. La región representada es la secuencia comprendida entre las bases 62.049-71.015 pb del megaplásmido p2A de esta cepa (GenBank: CR555308.1). Los genes pht han sido representados con flechas de diversos colores: azul oscuro, gen que codifica la FMN preniltransferasa (phtDb); azul claro, gen que codifica la o-ftaloilCoA una descarboxilasa PDC (phtDa); naranja y amarillo, genes que codifican las dos subunidades de la o-ftalato succinil-CoA transferasa (SPT) tipo III (phtSa y phtSb); rojo, genes que codifican un supuesto transportador de o-ftalato. En gris se representa el gen que codifica una hipotética transposasa. Para confirmar que las 4 proteínas mencionadas anteriormente (PhtSa, PhtSb, PhtDa y PhtDb), las cuales se inducen específicamente cuando la cepa EbN1 se cultiva anaeróbicamente en o-ftalato como única fuente de carbono (Ebenau-Jehle et al., 2017), son las encargadas de la ruta periférica que convierte el o-ftalato en benzoil-CoA, se procedió a la clonación de los genes pht correspondientes como una cassette de DNA 95 Resultados recombinante. Dicha cassette se clonó en el plásmido de amplio espectro de huésped pIZ1016 (Tabla 2), que permite la expresión génica gracias al promotor Ptac, controlado por la proteína LacIQ e inducible en presencia de isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG), generando el plásmido pIZPHT (Fig. 9). Figura 9. Esquema de la clonación de los genes phtDa, phtDb, phtSa y phtSb en el vector de expresión pIZ1016. Se utilizaron los oligonucleótidos EbN1 113 Fw/EbN1 102 Rv para amplificar mediante PCR los genes pht (4,6 kb) del plásmido p2A de A. aromaticum EbN1. Posteriormente, el fragmento amplificado se digirió con las enzimas de restricción HindIII y SpeI y se introdujo en el plásmido pIZ1016 (previamente digerido con las mismas enzimas) mediante ligación, para así obtener el plásmido pIZPHT. Las abreviaturas indicadas en el esquema son: Gm R (gen que confiere resistencia a la gentamicina), oripBBR1 (origen de replicación del plásmido pBBR1), mob (región para la movilización), lacIQ (gen que codifica el represor LacI del operón lac) y Ptac (promotor Ptac). El plásmido pIZPHT se introdujo mediante conjugación (Materiales y métodos 4.2.) en la cepa Azoarcus sp. CIB, que, como se ha comentado con anterioridad, carece de la capacidad de metabolizar el oftalato, pero sí es capaz de degradar benzoil-CoA anaeróbicamente a través de la ruta bzd (Barragán et al., 2004). Sin embargo, la cepa resultante Azoarcus sp. CIB (pIZPHT) no fue capaz de crecer usando o-ftalato como única fuente de carbono en condiciones anaeróbicas (utilizando nitrato 10 mM como aceptor final de electrones), en comparación con el crecimiento observado en benzoato (control positivo) (Fig. 10). Este resultado sugería que los genes catabólicos phtDa, phtDb, phtSa y phtSb no son suficientes para permitir la conversión anaeróbica del o-ftalato en benzoil-CoA. 96 Resultados Figura 10. Crecimiento de la cepa Azoarcus sp. CIB (pIZPHT). La cepa se cultivó en medio MC a 30ºC utilizando benzoato (3mM, círculos rojos) u o-ftalato (3mM, triángulos negros), como únicas fuentes de carbono, en condiciones anaeróbicas. El crecimiento se monitorizó midiendo el incremento de absorbancia a 600 nm (A600). Las barras muestran la desviación estándar de los resultados de tres experimentos independientes. 1.2. Identificación de un transportador activo de o-ftalato Puesto que el plásmido pIZPHT portador de los genes catabólicos pht no confería la capacidad para degradar o-ftalato a la cepa CIB, se planteó la hipótesis de que quizás existiesen una serie de genes auxiliares adicionales involucrados en el metabolismo de este compuesto aromático. Curiosamente, próximos a los genes catabólicos de la degradación del o-ftalato, y separados de éstos por un gen que codifica una transposasa, se localizan los genes phtTa y phtTb que podrían codificar un transportador de este compuesto al interior celular (Fig. 8). Además, no muy alejados de los genes catabólicos pht, se localizan otros genes que podrían codificar un trasportador de tipo ABC (GenBank: CR555308.1). Por otro lado, y como se indicó en la Introducción, ya se habían descrito dos transportadores tipo ABC involucrados en el transporte de o-ftalato durante la degradación aeróbica de este compuesto en R. jostii RHA1 (PatDCAB) (Hara et al., 2010) y B. multivorans (OphFGH) (Chang et al., 2009). La publicación de un trabajo por el grupo del Prof. Bernhard Schink (Universidad Konstanz , Alemania) sobre el aislamiento y secuenciación de la cepa Azoarcus sp. PA01, capaz de degradar el o-ftalato en condiciones anaeróbicas (Junghare et al., 2015), permitió disponer del segundo genoma completo de un organismo degradador de o-ftalato. La disponibilidad del genoma de Azoarcus sp. PA01 permitió identificar los genes pht y compararlos con los de A. aromaticum EbN1. En la cepa PA01, los genes pht se encuentran localizados en el genoma, ya que la cepa carece de plásmidos, en la región 206.830214.955 pb, también flanqueada por transposasas. El cluster pht de la cepa PA01 presenta una organización similar al de la cepa EbN1, y codifica las dos subunidades correspondientes a la succinil-CoA (o-ftalato-CoA transferasa (SPT) (genes phtSa y phtSb), que presentan un 96% y 94% de identidad con respecto a las de EbN1; la PDC descarboxilasa UbiD y la proteína UbiX (genes phtDa y phtDb, con 99% y 98% de identidad con respecto a las de EbN1, respectivamente), y dos genes adicionales, que podrían codificar las dos subunidades 97 Resultados de un presunto transportador (genes phtTa y phtTb) con 99% y 98% de identidad con respecto a los de la cepa EbN1) (Fig. 11). Figura 11. Organización del cluster pht en la bacteria Azoarcus sp. PA01. La región representada corresponde con la secuencia comprendida entre las bases 206.830-214.955 pb del genoma de esta cepa (GenBank: NZ_LARU01000001.1). Los genes pht han sido representados con flechas de diversos colores: azul oscuro, gen que codifica la FMN preniltransferasa (phtDb); azul claro, gen que codifica la o-ftaloil-CoA una descarboxilasa PDC (phtDa); naranja y amarillo, genes que codifican las dos subunidades de la o-ftalato succinil-CoA transferasa (SPT) tipo III (phtSa y phtSb); rojo, genes que codifican un supuesto transportador de o-ftalato. Dado que los diferentes análisis in silico del cluster pht sugerían la existencia de un transporte activo de o-ftalato al interior de la bacteria, se decidió confirmar experimentalmente la existencia de dicho transporte. Puesto que en el laboratorio no disponíamos de la cepa EbN1 pero sí de la bacteria A. evansii, la cual también utiliza o-ftalato como única fuente de carbono en condiciones anaeróbicas (Ebenau-Jehle et al., 2017). Se cultivó anaeróbicamente esta cepa hasta fase exponencial (A600 de 0,3) usando como fuente de carbono benzoato (control) u o-ftalato, y se realizaron ensayos de transporte de o-ftalato marcado radiactivamente, tal y como se detalla en el apartado 9 de Materiales y métodos. En la figura 12A se observa la acumulación dentro de las células del sustrato marcado radiactivamente a medida que transcurre el tiempo del ensayo cuando se utilizan células cultivadas en o-ftalato, pero no cuando las células utilizadas proceden de cultivos crecidos en benzoato. Para confirmar que la entrada del o-ftalato estaba mediada por un sistema de transporte activo y discriminar si se trata de un transportador primario (tipo ABC) que requiere ATP o uno secundario que requiere fuerza protón motriz, se realizaron los ensayos de transporte preincubando las células con inhibidores energéticos tales como la N,N’-diciclohexilcarbodiimida (DCCD), inhibidor de la ATP sintasa, o el 2,4dinitrofenol (DNP), ionóforo que desestabiliza la cadena de transporte de electrones e impide la generación de la fuerza protón motriz. Tal y como se muestra en la figura 12B, la incubación con DCCD no impide que las células de A. evansii sigan incorporando el sustrato marcado radiactivamente, sin embargo, la incubación con DNP inhibe completamente el transporte de 14C-o-ftalato. 98 Resultados Figura 12. Ensayos de transporte de [14C]-o-ftalato en A. evansii. A. Medida de la acumulación de [14C]-o-ftalato [10μM] por A. evansii cultivado anaeróbicamente en medio MC con benzoato 3 mM como única fuente de carbono y energía (barras blancas) o con o-ftalato 3 mM (barras negras). Los ensayos de transporte se realizaron a tiempo 0, 1, 5 y 10 minutos, como se detalla en el apartado 9 de Materiales y métodos. B. Transporte de [14C]-o-ftalato en A. evansii (cultivado en MC + o-ftalato 3 mM) a tiempo 0 y 5 minutos. Las células han sido previamente incubadas (10 min) con 1mM 2,4-dinitrofenol (DNP) (barras grises); 1 mM N,N’-diciclohexilcarbodiimida (DCCD) (barras rayadas), o en ausencia de inhibidores (control) (barras negras). Se muestran los valores promedio de tres experimentos independientes, junto con la desviación estándar correspondiente. Estos resultados nos permiten concluir que en la cepa A. evansii cultivada anaeróbicamente en o-ftalato se induce un transporte activo de esta molécula, cuyo mecanismo de acción es independiente de ATP pero que depende de la fuerza protón motriz. 1.3. Diseño de una cassette funcional que codifica la ruta periférica de o-ftalato Teniendo en cuenta los resultados presentados anteriormente, el transporte activo de o-ftalato (dependiente de la fuerza protón-motriz) al interior celular es un requisito indispensable para la degradación de éste. Puesto que tanto en el cluster pht de la cepa EbN1 como en el de la cepa PA01 se encuentran conservados los genes que codifican un presunto transportador (Fig. 8), se decidió clonar los genes phtTa, que codifica la subunidad que formaría el canal transmembrana, y phtTb, que codifica la presunta proteína periplásmica de unión a sustrato, en el plásmido pIZPHT, generándose el plásmido resultante pIZPHTRAP (Fig. 13). 99 Resultados Figura 13. Esquema de la construcción del plásmido pIZPHTRAP. Se utilizaron los oligosnucleótidos 97 Fw GIBSON/95 Rv GIBSON para amplificar los genes phtTa y phtTb (3.864 pb) del plásmido p2A de A. aromaticum EbN1. El fragmento se introdujo en el plásmido pIZPHT (previamente linearizado con la enzima de restricción SpeI) mediante la técnica de “Gibson Assembly” para obtener el plásmido pIZPHTRAP. Las abreviaturas indicadas en el esquema son: GmR (gen que confiere resistencia a la gentamicina), ori (origen de replicación), mob (región para la movilización), lacIQ (gen que codifica el represor LacI del operón lac) y Ptac (promotor tac). Cuando se introdujo el plásmido pIZPHTRAP en Azoarcus sp. CIB, la cepa recombinante Azoarcus sp. CIB (pIZPHTRAP) fue capaz de crecer en condiciones anaeróbicas utilizando o-ftalato como única fuente de carbono (Fig. 14). Este resultado, que contrasta con la ausencia de crecimiento de la cepa Azoarcus sp. CIB (pIZPHT), demuestra la funcionalidad de la nueva cassette recombinante (cassette pht), y sugiere que los genes phtTaTb codifican el transportador de o-ftalato al interior celular, el cual es indispensable para la degradación del o-ftalato en bacterias desnitrificantes. Figura 14. Crecimiento de la cepa Azoarcus sp. CIB (pIZPHTRAP). La cepa se cultivó en medio MC en condiciones anaeróbicas utilizando o-ftalato (3 mM) como única fuente de carbono, cuyo consumo se midió mediante HPLC (triángulos azules), tal y como se detalla en el apartado 10 de Materiales y métodos. Se valoró el incremento de absorbancia a 600 nm (A600) (círculos negros). Las barras muestran la desviación estándar de los resultados de tres experimentos independientes. 100 Resultados 1.4. Caracterización del transportador (PhtTab) de o-ftalato Para confirmar que los genes phtTaTb codifican un transportador de o-ftalato, se comparó la cinética del transporte en células de Azoarcus sp. CIB (pIZPHT) y Azoarcus sp. CIB (pIZPHTRAP) utilizando concentraciones crecientes de 14C-o-ftalato en un rango de 5 a 25 µM (Fig. 15A). Mientras que no se observó transporte significativo de 14C-o-ftalato con la cepa Azoarcus sp. CIB (pIZPHT), sí se observó transporte con la cepa Azoarcus sp. CIB (pIZPHTRAP), siendo la velocidad máxima y la KM de 156 ± 14 pmol/min/mg proteína y 15µM, respectivamente. Por lo tanto, estos resultados indicaban que los genes phtTaTb, ausentes en pIZPHT pero presentes en la cassette pht, codifican un transportador de o-ftalato. Para confirmar que PhtTaTb constituye un sistema de transporte activo, se realizaron los experimentos de transporte preincubando las células con los inhibidores DNP y DCCD. Tal y como se muestra en la figura 15B, la adición de DCCD no supuso un cambio en la eficiencia de transporte del 14C-o-ftalato, sin embargo, la presencia de DNP sí inhibió completamente el transporte. Estos resultados son coherentes con los obtenidos en A. evansii (Fig.12), y revelan que el transportador PhtTaTb requiere la fuerza protón motriz para el transporte de o-ftalato, un comportamiento típico de transportadores tipo TRAP. Figura 15. Ensayos de transporte de [14C]-o-ftalato en Azoarcus sp. CIB (pIZPHT) y Azoarcus sp. CIB (pIZPHTRAP). A. Transporte de [14C]-o-ftalato tras 5 min de incubación con células de Azoarcus pIZPHT (barras blancas) y Azoarcus pIZPHTRAP (barras negras), utilizando un rango de concentración de 5-25 μM de sustrato radiactivo. B. Transporte de [14C]-o-ftalato 25 μM en células de Azoarcus sp. CIB (pIZPHTRAP). Se muestran ensayos de transporte realizados con células preincubadas durante 10 min en presencia de 1mM 2,4-dinitrofenol (DNP), 1 mM N,N’diciclohexilcarbodiimida (DCCD) o en ausencia de inhibidores (Control). También se muestran ensayos de transporte en ausencia de inhibidores a los que se añadió 250 μM de o-ftalato no radioactivo (PA), 250 μM de isoftalato no radioactivo (IPA) o 250 μM de tereftalato no radiactivo (TPA). En todos los casos, se muestran los valores promedio de tres experimentos independientes, junto con la desviación estándar correspondiente. Finalmente, para estudiar la especificidad de sustrato del transportador PhtTaTb se realizaron experimentos de transporte de 14C-o-ftalato (25 µM) en presencia de una concentración 10 veces superior de sustrato no marcado radioactivamente o de los otros dos isómeros del ftalato, isoftalato y tereftalato. En estos ensayos de competición, la presencia de una elevada concentración de un compuesto que es sustrato del 101 Resultados transportador debería reducir la eficiencia del transporte de una baja concentración de o-ftalato marcado radiactivamente. Como cabría esperar, la presencia de o-ftalato no marcado impide el transporte de 14C-oftalato (Fig. 15B, columna PA). En el caso de los isómeros isoftalato y tereftalato, se observa una disminución en torno al 50% de la capacidad de transporte de 14C-o-ftalato (Fig. 15B, columnas IPA y TPA), lo que indica que el transportador es capaz de reconocer estos isómeros, aunque con menor eficiencia que el o-ftalato. 1.5. La ruta periférica pht del o-ftalato es funcional también en condiciones aeróbicas Aunque se había descrito que en T. chlorobenzoica 3CB-1 la segunda etapa enzimática de la ruta periférica del o-ftalato, la catalizada por la PDC descarboxilasa, se inhibe en ensayos in vitro en presencia de oxígeno (Ebenau-Jehle et al., 2017; Mergelsberg et al., 2017), ensayos realizados con extractos celulares de Azoarcus sp. PA01 revelaron que las enzimas SPT y PDC descarboxilasa eran funcionales en condiciones aeróbicas (Junghare et al., 2016). Curiosamente, está descrito que Azoarcus sp. PA01 es incapaz de crecer en o-ftalato aeróbicamente (Junghare et al., 2016), pero esto podría ser debido no tanto a que la ruta periférica no sea activa en aerobiosis sino más bien a que la cepa carece de la ruta box para la degradación aeróbica del benzoil-CoA generado en la ruta pht. Para tratar de confirmar si la ruta pht es funcional in vivo también en condiciones aeróbicas, se ensayó la cassette pht en una cepa capaz de metabolizar benzoil-CoA en presencia de oxígeno a través de la ruta aeróbica híbrida box (Valderrama et al., 2012). Tal y como se muestra en la figura 16A, la cepa Azoarcus sp. CIB (pIZPHTRAP) fue capaz de crecer en condiciones aeróbicas utilizando o-ftalato como única fuente de carbono y energía, si bien el consumo del sustrato aromático (en torno a 0,5 mM) fue inferior al detectado en condiciones anaeróbicas (Fig. 14). En la figura 16B se observa que en presencia de o-ftalato la cepa Azoarcus sp. CIB (pIZPHTRAP) está induciendo el gen boxB, lo que sugiere que está metabolizando el benzoil-CoA generado en la ruta periférica a través de la ruta aeróbica híbrida box. 102 Resultados Figura 16 (página anterior). Crecimiento aeróbico de la cepa Azoarcus sp. CIB (pIZPHTRAP) en o-ftalato. A. La cepa se cultivó en medio MC a 30ºC en condiciones anaeróbicas utilizando o-ftalato (3 mM) como única fuente de carbono. El crecimiento se valoró midiendo el incremento de absorbancia a 600 nm (A600) (círculos negros). El consumo de o-ftalato se monitorizó mediante HPLC (triángulos azules), tal y como se detalla en el apartado 10 de Materiales y métodos. Las barras muestran la desviación estándar de los resultados de tres experimentos independientes. B. Expresión del gen boxB de la cepa Azoarcus sp. CIB (pIZPHTRAP) creciendo en medio MC en condiciones aeróbicas en presencia de benzoato 3 mM (control positivo (calle 1), piruvato (0,2% p/v) (calle 2) u o-ftalato 3 mM (calle 3). Las células se recogieron en mitad de la fase exponencial de crecimiento y la extracción del RNA y los ensayos de RT-PCR se realizaron como se detalla en los apartados 3.7 y 3.8 de Materiales y métodos. Calle M, patrones de DNA (Quick-LoadTM 100bp DNA Ladder): a la izquierda del gel se indican los tamaños de las bandas de patrones (en pb). Estos resultados sugerían que la ruta periférica pht es funcional in vivo tanto en condiciones anaeróbicas como en condiciones aeróbicas. No obstante, y aunque un análisis bioinformático del genoma de la cepa CIB no reveló la existencia de ninguna enzima con similitud significativa a la PDC descarboxilasa; no se podía descartar la posibilidad de que la PDC descarboxilasa de la cepa EbN1 (que comparte una identidad de aminoácidos del 93,7% con la de T. chlorobenzoica 3CB-1), clonada en la cassette pht y expresada en Azoarcus sp. CIB (pIZPHTRAP), realmente no fuese funcional en condiciones aeróbicas y que alguna enzima endógena de la cepa CIB pudiese suplir inespecíficamente la actividad PDC descarboxilasa necesaria para la generación del benzoil-CoA. Para descartar esta hipótesis, se procedió a delecionar un fragmento interno (595 pb) del gen phtDa que codifica la PDC descarboxilasa en la cassette pht (Fig. 9). El plásmido resultante, pIZPHTRAPΔPDC, se transformó en Azoarcus sp. CIB, dando lugar a la cepa Azoarcus sp. CIB (pIZPHTRAPΔPDC). Figura 17. Esquema de la construcción del plásmido pIZPHTRAPΔPDC. El plásmido pIZPHTRAP se digirió con las enzimas de restricción SphI y SnaB1 (liberándose un fragmento de 595 pb) y se recircularizó mediante tratamiento con la enzima Klenow, que rellena los extremos cohesivos generados, y posterior ligación obteniéndose el plásmido pIZPHTRAPΔPDC. En la figura 18 se puede observar que la cepa Azoarcus sp. CIB (pIZPHTRAPΔPDC) no es capaz de crecer utilizando o-ftalato como única fuente de carbono, ni en condiciones aeróbicas (Fig. 18A) ni en condiciones anaeróbicas (Fig. 18B). De este resultado se puede concluir que la PDC descarboxilasa presente en la cassette pht es indispensable para el metabolismo del o-ftalato en Azoarcus sp. CIB (pIZPHTRAP) tanto 103 Resultados en condiciones aeróbicas como anaeróbicas, demostrando que la ruta periférica pht es ciertamente activa cuando las bacterias se incuban en presencia de oxígeno. Figura 18. Crecimiento de la cepa Azoarcus sp. CIB (pIZPHTRAPΔPDC). La cepa se cultivó en medio MC a 30ºC utilizando benzoato (3mM, círculos verdes) u o-ftalato (3mM, triángulos negros), como únicas fuentes de carbono, en condiciones aeróbicas (A) o anaeróbicas (B). El crecimiento se monitorizó midiendo el incremento de absorbancia a 600 nm (A600). Las barras muestran la desviación estándar de los resultados de tres experimentos independientes. 1.6. Requerimientos de la célula huésped para el metabolismo aeróbico del o-ftalato vía ruta periférica pht En el apartado anterior se demostró que la cepa Azoarcus sp. CIB (pIZPHTRAP) es capaz de metabolizar o-ftalato aeróbicamente. La ruta periférica pht convierte el o-ftalato en benzoil-CoA, que después será metabolizado a través de la ruta aeróbica híbrida box, la cual se induce en presencia de este derivado de CoA (Valderrama et al., 2012). No obstante, se planteó la hipótesis de que el benzoil-CoA pudiese ser transformado en benzoato gracias a la actividad, inespecífica o específica, de alguna enzima tioesterasa o CoAtransferasa presente en la célula huésped, de forma que bacterias que presentan un metabolismo clásico del benzoato vía ruta ben (oxida el benzoato a catecol)-cat (degrada catecol a intermediarios del metabolismo central) (Fig. 1) (Harwood y Parales, 1996), pudiesen ser capaces también de metabolizar el o-ftalato aeróbicamente mediante la ruta periférica pht. Para explorar esta posibilidad y establecer cuáles son los requisitos metabólicos de la bacteria huésped que le permitan degradar o-ftalato a través de la ruta pht en presencia de oxígeno, se transfirió el plásmido pIZPHTRAP a diferentes bacterias que presentaban diferentes combinaciones de rutas de degradación aeróbica del benzoato, incluyendo tanto el cluster box, que codifica la ruta aeróbica hibrida, como el ben/cat, que codifica la ruta aeróbica clásica. Así, se generaron cepas recombinantes a partir de las bacterias P. putida KT2440, que contiene únicamente el cluster ben/cat (Nelson et al., 2002), Cupriavidus pinatubonensis JMP134, que contiene un cluster ben/cat y un cluster box que carece del gen boxD y, por tanto, no es funcional (Lykidis et al., 2010; Donoso et al., 2011; Pérez-Pantoja et al., 2008, 104 Resultados 2015), y Cupriavidus necator H16, que contiene un cluster ben/cat (en el cromosoma 1) y dos clusters box (cluster box1 en cromosoma 1 y cluster box2 en cromosoma 2) (Fig. 19) (Pohlmann et al., 2006). Figura 19. Organización de los clusters génicos responsables de la degradación de benzoato en C. necator H16 vía catecol (ruta ben/cat) o vía benzoil-CoA (ruta box). A. Esquema del cluster box1 localizado en el cromosoma 1 de C. necator H16 (NC_008313.1) en la región 1.523.605-1.536.880 pb, y que incluye los genes H16_A1408- H16_A1418 (genes que codifican las enzimas catabólicas en azul, genes que codifican un supuesto transportador ABC en verde). B. Esquema del cluster box2 que se encuentra en el cromosoma 2 de esta bacteria (NC_008314.1) en la región 2.159.4812.170.364 pb e incluye los genes H16_B1912-H16_B1919 (genes que codifican las enzimas catabólicas en morado, genes que codifican un supuesto transportador MFS en azul). C. Esquema del cluster ben/cat que se encuentra en el cromosoma 1 de esta bacteria (NC_008313.1) en la región 2.130.339-2.138.599 pb e incluye los genes H16_A1960-H16_A1968 (genes que codifican las enzimas catabólicas en naranja). En negro se representan los genes que codifican las proteínas reguladoras. En gris se representa un gen que codifica una proteína de función desconocida. Las cepas C. pinatubonensis JMP134 (pIZPHTRAP) y P. putida KT2440 (pIZPHTRAP) no fueron capaces de crecer en o-ftalato; sin embargo, la cepa C. necator H16 (pIZPHTRAP) sí fue capaz de crecer en condiciones aeróbicas en este sustrato aromático como única fuente de carbono y energía (Fig. 20A). Este resultado demostraba por primera vez la funcionalidad de la ruta pht en bacterias desnitrificantes no 105 Resultados pertenecientes al grupo Azoarcus/Aromatoleum/Thauera, y sugería la necesidad de una ruta box funcional en la célula huésped. Figura 20. Crecimiento en o-ftalato y expresión de la ruta box en C. necator H16 (pIZPHTRAP). A. Crecimiento de las cepas C. necator H16 (triángulos negros) y C. necator H16 (pIZPHTRAP) (círculos negros) en medio MC a 30ºC en condiciones aeróbicas utilizando o-ftalato (3 mM) como única fuente de carbono, cuyo consumo se midió mediante HPLC (círculos morados), tal y como se detalla en el apartado 10 de Materiales y métodos. Se valoró el incremento de absorbancia a 600 nm (A600). Las barras muestran la desviación estándar de los resultados de tres experimentos independientes. B. Expresión de los genes benA (naranja), boxB1 (azul), boxB2 (morado) y recA (gris, control) de la cepa C. necator H16 (pIZPHTRAP) creciendo en medio MC con piruvato (0,2% p/v) u o-ftalato (3 mM) como única fuente de carbono. Las células se recogieron en mitad de la fase exponencial de crecimiento y la extracción del RNA y los ensayos de qRT-PCR se realizaron como se detalla en los apartados 3.7 y 3.8 de Materiales y métodos. Se utilizó el gen recA, cuya expresión no cambia significativamente en las dos condiciones ensayadas, como estándar interno. Las barras muestran la desviación estándar de los resultados de tres experimentos independientes. Para confirmar la implicación de la ruta box en el metabolismo del o-ftalato a través de la ruta pht en la cepa recombinante C. necator H16 (pIZPHTRAP), se monitorizó mediante qRT-PCR la expresión de los genes benA, boxB1 y boxB2 a partir del RNA extraído de dicha cepa creciendo en o-ftalato o en piruvato (condición control). Tal y como se muestra en la figura 20B, los genes boxB1 y boxB2 presentan una clara inducción en o-ftalato respecto a su expresión en piruvato (entre 40 y 400 veces superior), mientras que el gen benA muestra una expresión basal tanto en piruvato como en o-ftalato. Este resultado permite concluir que C. necator H16 (pIZPHTRAP) metaboliza el o-ftalato en condiciones aeróbicas mediante la expresión heteróloga de los genes pht y la expresión endógena de los genes box presentes en su genoma, siendo la primera vez que se demuestra la expresión de la ruta box en un microorganismo perteneciente al género Cupriavidus. 1.7. Aplicaciones biotecnológicas de la cassette pht Dado que el o-ftalato derivado de los ésteres presentes en los plásticos está atrayendo mucho interés como fuente de carbono abundante procedente de los desechos plásticos (Annamalai y Namasivayam, 2015; Benjamin et al., 2015) su revalorización hacia la producción de sustancias de interés industrial, tales como los polihidroxialcanoatos (PHAs), es una estrategia prometedora que hasta la fecha no se ha abordado. Los PHAs son poliésteres naturales que pueden ser utilizados como plásticos biodegradables (Anderson y Dawes, 1990), y sus características biocompatibles los convierten además en un material adecuado para ciertas aplicaciones médicas (Brigham y Sinskey, 2012; Dwivedi et al., 2020). El polihidroxibutirato (PHB) se describió por 106 Resultados primera vez en 1925 (López-Cortés et al., 2008) como un tipo común de PHA que contiene únicamente 3hidroxibutirato en su estructura, y constituye el biopolímero más frecuente y abundante dentro de los PHAs (Raza et al., 2019). Figura 21. Producción de PHB en C. necator H16 (pIZPHTRAP). A y B. Imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de la cepa C. necator H16 (pIZPHTRAP) en medio MC a 30ºC en condiciones aeróbicas utilizando o-ftalato 3 mM como única fuente de carbono. Las muestras se prepararon siguiendo el protocolo detallado en el apartado 11 de Materiales y métodos. C. Cromatograma obtenido por GC del contenido de PHB intracelular: C4, muestra el pico correspondiente al metil-butirato que se genera tras la metanolisis; 3-MBz, muestra el pico correspondiente al patrón interno de 3-metilbenzoato. C. necator H16 es la bacteria modelo por excelencia para la producción aeróbica de PHB (Pohlmann et al., 2006; Reinecke y Steinbüchel, 2009), pudiendo acumular hasta el 80% de su peso seco en forma de este polímero en presencia de fuentes de carbono fácilmente asimilables y en condiciones de limitación de nitrógeno (Reinecke y Steinbüchel, 2009). Además, se ha descrito también la acumulación de PHB cuando la cepa H16 utiliza ciertos compuestos aromáticos (Tomizawa et al., 2014; Kumar et al., 2019). Puesto que se ha demostrado anteriormente que la ruta pht es funcional en C. necator H16, se analizó si la cepa C. necator H16 (pIZPHTRAP) era capaz de acumular gránulos de PHB cuando metabolizaba o-ftalato. Tal y como se muestra en la figura 21, se observaron efectivamente gránulos de PHB en el interior de las células de la cepa recombinante. La composición y el contenido del PHB de las células liofilizadas se determinaron mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS) del poliéster metanolizado como se describió previamente en el apartado 12 de Materiales y métodos. El perfil cromatográfico obtenido por GC- 107 Resultados MS de los productos liberados por la metanolisis mostró un único pico correspondiente al monómero de 3hidroxibutirato (Fig. 21C). El PHB acumulado representaba aproximadamente el 8-9% del peso seco total de la célula. Una acumulación similar de PHB (14%) se pudo observar cuando la cepa se cultivó en benzoato. Está descrito que Azoarcus sp. CIB es capaz de producir PHB creciendo anaeróbicamente en hidrocarburos aromáticos como única fuente de carbono y energía (Zamarro et al., 2017). Por tanto, se decidió verificar si la cepa Azoarcus sp. CIB (pIZPHTRAP) creciendo anaeróbicamente en o-ftalato era capaz de producir gránulos de PHB. Al igual que ocurrió con la cepa H16 recombinante en condiciones aeróbicas, Azoarcus sp. CIB (pIZPHTRAP) cultivado anaeróbicamente en o-ftalato fue capaz de acumular PHB si bien éste solo alcanzó un 1,5% del peso seco total de la célula. Todos estos resultados tomados en su conjunto revelan que la cassette recombinante pht puede ser utilizada para la transformación del o-ftalato en PHB tanto en condiciones anaeróbicas, como se demuestra con la cepa Azoarcus sp. CIB (pIZPHTRAP), como aeróbicas, como es el caso de la cepa C. necator H16 (pIZPHTRAP). 2. Capítulo 2: Estudio y caracterización de la ruta bad de Azoarcus sp. CIB Como se ha comentado en la Introducción, y hasta la realización de esta tesis, las etapas iniciales del catabolismo anaeróbico del benzoato, modelo de compuesto aromático, y del ciclohexano carboxilato (CHC), modelo de compuesto alicíclico, se habían descrito como rutas convergentes de una ruta central común de βoxidación del compuesto alicíclico insaturado resultante, y que está codificada por los genes bad en la bacteria fotótrofa anaerobia facultativa R. palustris (Harwood et al., 1998; Pelletier y Harwood, 1998, 2000; Hirakawa et al., 2015) y por los genes bam en organismos anaerobios estrictos tales como G. metallireducens (Kung et al., 2009, 2014) (Fig. 4). Sin embargo, en el genoma de Azoarcus sp. CIB (posiciones 2.171.368- 2.177.524 pb) se había descrito la existencia de un cluster de genes cuyos productos muestran una identidad de secuencia aminoacídica en torno al 56% con respecto a los productos codificados por los genes del cluster bad de R. palustris (Fig. 22A) (Martín-Moldes et al., 2015). El cluster bad de Azoarcus incluye a los genes que codifican la presunta CoA ligasa AliA (AzCIB_1947), que activa el CHC a CHC-CoA, la acil-CoA deshidrogenasa AliB (AzCIB_1946), que transforma el CHC-CoA en ciclohex-1-eno-1-carbonil-CoA el cual es posteriormente metabolizado por la enoil-CoA hidratasa BadK (AzCIB_1948), la 2-hidroxiciclohexanocarboxil-CoA deshidrogenasa BadH (AzCIB_1944) y la 2-cetociclohexanocarboxil-CoA hidrolasa BadI (AzCIB_1943), generando finalmente pimelil-CoA (Fig. 22B). Esta observación hacía sospechar que en bacterias desnitrificantes anaerobias facultativas la degradación anaeróbica del benzoato y del CHC podría seguir un esquema metabólico diferente al descrito hasta la fecha y requerir rutas centrales independientes, i.e. la ruta bzd previamente caracterizada para la degradación del benzoato (Barragán et al., 2004) y una nueva ruta bad para la degradación del CHC. No obstante, no se podía descartar a priori que los genes bad de la cepa CIB pudiesen constituir además una ruta alternativa para la degradación anaeróbica del benzoato cuando la ruta principal bzd estuviese bloqueada en alguna de sus etapas de β-oxidación. Para confirmar esta hipótesis, se procedió a estudiar el papel de los genes bad en Azoarcus sp. CIB. 108 Resultados Figura 22. Degradación del CHC en Azoarcus sp. CIB. A. Organización del cluster de genes presuntamente implicados en la ruta de degradación del CHC en Azoarcus sp. CIB. La región representada se localiza entre las bases 2.171.3682.177.524 pb del genoma de Azoarcus sp. CIB (NZ_CP011072.1). Los genes han sido representados con flechas de diversos colores: en verde, el gen que codifica la enoil-CoA hidratasa (badK); en rojo, el gen que codifica la ciclohexanocarboxilato-CoA ligasa (aliA); en rosa, el gen que codifica la ciclohexanocarboxil-CoA deshidrogenasa (aliB); en negro, el gen regulador (badR); en azul, el gen que codifica la hidroxiacil-CoA deshidrogenasa dependiente de NAD+ (badH); y en naranja, el gen que codifica la oxoacil-CoA hidrolasa (badI). B. Esquema bioquímico de la ruta bad descrita en R. palustris. Las proteínas que catalizan las reacciones, así como otras moléculas necesarias para la catálisis, junto con los intermediarios que se generan se indican en cada paso. 2.1. La ruta bad no sustituye a la ruta bzd para la degradación anaeróbica del benzoato Trabajos previos habían demostrado que mutaciones en el cluster bzd de Azoarcus sp. CIB impiden el crecimiento anaeróbico en benzoato de las cepas mutantes (Barragán et al., 2004), lo cual sugiere que no hay rutas alternativas a la ruta bzd para el metabolismo anaeróbico del benzoato en esta bacteria. Sin embargo, todas las mutaciones realizadas mediante disrupción génica por inserción tenían efectos polares sobre el último gen del operón bzd que codifica la primera de las actividades enzimáticas necesarias para el catabolismo del benzoato, es decir, la activación de éste a benzoil-CoA por la benzoato CoA ligasa (BzdA). Por ello, se procedió a construir un mutante de deleción (sin efectos polares) en uno de los genes del operón bzd que permitiese la activación y reducción anaeróbica del benzoato con la consiguiente acumulación del producto alicíclico resultante que posteriormente pudiese ser metabolizado por una ruta central de β-oxidación distinta a la ruta bzd. Así, se diseñó una estrategia de deleción del gen bzdW y construcción de la cepa mutante Azoarcus sp. CIBΔbzdW siguiendo el protocolo detallado en la sección 5 de Materiales y métodos. La ausencia de la enzima BzdW en la cepa mutante cultivada en presencia de benzoato en condiciones anaeróbicas permitiría la acumulación del intermediario ciclohex-1,5-dieno-1-carbonil-CoA (Fig. 2), que podría ser sustrato de alguna 109 Resultados otra hidratasa de la célula capaz de actuar sobre un sustrato similar, e.g. la enzima BadK que presuntamente actúa sobre el ciclohex-1-eno-1-carbonil-CoA. Tal y como se muestra en la figura 23, la cepa Azoarcus sp. CIBΔbzdW fue capaz de crecer en benzoato como única fuente de carbono en condiciones desnitrificantes, aunque mostró una fase de latencia de unas 24h antes de iniciar su crecimiento. Este resultado contrasta con los experimentos previos realizados con los mutantes de inserción en el cluster bzd los cuales eran incapaces de metabolizar benzoato (Barragán et al., 2004), y sugiere que el genoma de Azoarcus sp. CIB codifica otra ruta metabólica capaz de suplir a la ruta de β-oxidación bzd o, al menos, otra actividad hidratasa capaz de suplir a BzdW. Figura 23. Crecimiento de las cepas Azoarcus sp. CIB (círculos negros) y Azoarcus sp. CIBΔbzdW (círculos morados) en medio MC a 30ºC utilizando benzoato (3mM) como única fuente de carbono en condiciones anaeróbicas. Se valoró el incremento de absorbancia a 600 nm (A600). Las barras muestran la desviación estándar de los resultados de tres experimentos independientes. Para confirmar si los genes bad estaban supliendo la función de los genes bzd en la β-oxidación del intermediario ciclohex-1,5-dieno-1-carbonil-CoA cuando la cepa Azoarcus sp. CIBΔbzdW estaba metabolizando benzoato en condiciones anaeróbicas, se analizó la expresión de los genes badK, badH y badI mediante RT-PCR. Tal y como se muestra en la figura 24, no se observó expresión de ninguno de los genes bad en la cepa mutante. Este resultado sugiere que la ruta bad (o la supuesta hidratasa BadK) no está implicada en el metabolismo del ciclohex-1,5-dieno-1-carbonil-CoA en Azoarcus sp. CIBΔbzdW. Para tratar de averiguar qué enzima estaba supliendo a BzdW en la cepa mutante Azoarcus sp. CIBΔbzdW, se realizó un análisis bioinformático buscando posibles parálogos. Se observó que la enzima MbdW presentaba la mayor identidad en la secuencia de aminoácidos (41,7%) con BzdW, siendo superior a la identidad de secuencia que presentaba BadK (37,7%). La enzima MbdW forma parte de la ruta mbd para la degradación anaeróbica del 3-metilbenzoato en Azoarcus sp. CIB, y se ha postulado como la hidratasa que actúa sobre el metil-ciclohex-1,5-dieno-1-carbonil-CoA (Juárez et al., 2013). Mediante técnicas de RT-PCR se confirmó la expresión del gen mbdW en la cepa Azoarcus sp. CIBΔbzdW cultivada anaeróbicamente en benzoato (Fig. 24), lo que sugiere que MbdW es capaz de suplir la actividad de BzdW en el catabolismo 110 Resultados anaeróbico del benzoato. Para confirmar la implicación de los genes mbd en el catabolismo anaeróbico del benzoato, se construyó un mutante de deleción del gen bzdW en Azoarcus sp. CIBT, una cepa derivada de Azoarcus sp. CIB que carece del elemento integrativo-conjugativo ICEXTD el cual contiene los genes mbd, entre otros (Zamarro et al., 2016). Figura 24. Análisis de la expresión de la ruta bad en Azoarcus sp. CIBΔbzdW. Expresión de los genes badH, aliB, aliA, badK y mbdW de la cepa Azoarcus sp. CIBΔbzdW creciendo en medio MC con benzoato (3 mM) como única fuente de carbono. Las células se recogieron en mitad de la fase exponencial de crecimiento y la extracción del RNA y los ensayos de qRT-PCR se realizaron como se detalla en los apartados 3.7 y 3.8 de Materiales y métodos. La construcción de la cepa mutante Azoarcus CIBTΔbzdW se detalla en la sección 5 de Materiales y métodos. Tal y como se observa en la figura 25, la cepa mutante Azoarcus CIBTΔbzdW no fue capaz de crecer en benzoato en ausencia de oxígeno. Este resultado indica que en ausencia de la enzima MbdW, no existe ninguna otra enzima codificada en el genoma de Azoarcus sp. CIB capaz de suplir la función de BzdW. Figura 25. Crecimiento de las cepas Azoarcus sp. CIBT (círculos grises) y Azoarcus sp. CIBTΔbzdW (círculos morados) en medio MC a 30ºC utilizando benzoato (3mM) como única fuente de carbono en condiciones anaeróbicas. Se valoró el incremento de absorbancia a 600 nm (A600). Las barras muestran la desviación estándar de los resultados de tres experimentos independientes. En resumen, los resultados presentados más arriba revelan que la cepa CIB posee una importante robustez metabólica en lo que se refiere al metabolismo anaeróbico del benzoato, puesto que el bloqueo de su 111 Resultados ruta principal de degradación anaeróbica (ruta bzd) no impide el crecimiento en esta fuente de carbono utilizando para ello actividades enzimáticas de otras rutas centrales de degradación de compuestos aromáticos tales como la ruta mbd. Por otro lado, los resultados presentados confirman que la ruta bad no está implicada en la degradación anaeróbica del benzoato en la cepa CIB, lo que constituye una diferencia significativa con lo descrito hasta la fecha en otras bacterias anaerobias facultativas tales como la bacteria fotótrofa R. palustris. 2.2. Caracterización del cluster bad Una vez confirmado que los genes bad de Azoarcus sp. CIB no suplen a los genes bzd para la degradación anaeróbica del benzoato, se decidió comprobar si el cluster bad está realmente implicado en la degradación del CHC. Para ello, inicialmente, se comprobó experimentalmente que Azoarcus sp. CIB era capaz de crecer en CHC tanto en presencia de oxígeno como en condiciones desnitrificantes (Fig. 26). Posteriormente, se analizó la expresión de los genes bad en ambas condiciones cuando las células se encontraban en la fase exponencial de crecimiento. Tal y como se muestra en la figura 27, todos los genes catabólicos (badI, badH, aliB, aliA y badK) se encuentran inducidos cuando Azoarcus sp. CIB está metabolizando CHC, lo que contrasta con su ausencia de expresión cuando la bacteria se cultiva en benzoato, tanto en condiciones aeróbicas como anaeróbicas. Por lo tanto, los estudios de expresión génica del cluster bad están de acuerdo con su participación en la degradación aeróbica/anaeróbica de CHC. Figura 26. Crecimiento de las cepas Azoarcus sp. CIB (cuadrados negros) y Azoarcus sp. CIBΔbadHI (triángulos naranjas) en medio MC a 30ºC utilizando CHC (3mM) como única fuente de carbono, en condiciones aeróbicas (A) o anaeróbicas (B). Se valoró el incremento de absorbancia a 600 nm (A600). Las barras muestran la desviación estándar de los resultados de tres experimentos independientes. Para confirmar que las enzimas implicadas en el metabolismo del CHC están codificadas por los genes bad, se construyó un mutante de deleción de los genes badH y badI, tal y como se detalla en el apartado 5 de Materiales y métodos. En la figura 26 se muestra que la cepa mutante resultante, Azoarcus sp. CIBΔbadHI, 112 Resultados es incapaz de crecer utilizando CHC como única fuente de carbono y energía, tanto en condiciones aeróbicas (Fig. 26A) como anaeróbicas (Fig. 26B). Este resultado valida la hipótesis de que los genes bad están realmente involucrados en el metabolismo del CHC, y revela que la ruta bad es la única implicada en el metabolismo del CHC en Azoarcus sp. CIB. Figura 27. Análisis de la expresión de la ruta bad en Azoarcus sp. CIB. Expresión de los genes badI, badH, aliB, aliA, badK de la cepa Azoarcus sp. CIB creciendo en medio MC con benzoato (3 mM, carriles Bz) o ciclohexanocarboxilato (3mM, carriles CHC) como única fuente de carbono tanto en condiciones aeróbicas (A) como anaeróbicas (B). Las células se recogieron en mitad de la fase exponencial de crecimiento y la extracción del RNA y los ensayos de qRT-PCR se realizaron como se detalla en los apartados 3.7 y 3.8 de Materiales y métodos. 2.3. Análisis in silico de la distribución del cluster bad en bacterias Se decidió analizar la presencia del cluster bad en los genomas de otras bacterias para determinar la distribución de la ruta bad como estrategia común para la degradación del CHC. En la figura 28 se representan algunos de los clusters bad encontrados en diferentes α, β y γproteobacterias. Los clusters bad dentro del género Azoarcus/Aromatoleum presentan una disposición de los genes idéntica a la descrita para el cluster de Azoarcus sp. CIB. Esta organización también se encuentra en la cepa Thauera phenolivorans, la única Thauera descrita hasta la fecha que contiene un cluster bad. Sin embargo, otras β-proteobacterias, e.g. Cupriavidus necator H16, Acidovorax carolinensis NA3, Alicycliphilus 113 Resultados Figura 28. Organización génica de los clusters bad en proteobacterias. Los genes han sido representados con flechas de diversos colores: en verde, el gen que codifica la enoil-CoA hidratasa (badK); en rojo, el gen que codifica la ciclohexanocarboxilato-CoA ligasa (aliA); en rosa, el gen que codifica la ciclohexanocarboxil-CoA deshidrogenasa (aliB); en negro, el gen regulador perteneciente a la familia MarR (badR); en azul, el gen que codifica la hidroxiacil-CoA deshidrogenasa dependiente de NAD+ (badH); en naranja, el gen que codifica la oxoacil-CoA hidrolasa (badI); y en azul oscuro, el gen que codifica la acil-CoA deshidrogenasa implicada en el metabolismo de ácidos dicarboxílicos (dcaA). La estrella amarilla indica la posible caja de unión de BadR (CAAN 4TTG). Dos rayas verticales separan los genes no adyacentes en el genoma. denitrificans BC, Burkholderia cenocepacia DDS 22E-1, Comamonas serinivorans, Leptothrix cholodnii, Polaromonas naphthalenivorans, Ralstonia pickettii DTP0602, Variovorax boronicumulans, entre otras, 114 Resultados presentan un cluster bad constituido por los genes aliA, aliB, badI y badH orientados en el mismo sentido, probablemente constituyendo un único operón de genes catabólicos, mientras que el supuesto regulador, badR, está orientado en sentido contrario; y un ortólogo del gen badK se localiza siempre fuera del cluster bad en otra región del genoma. Dentro de las α-proteobacterias el cluster bad solo se encuentra presente, además de en R. palustris, en la bacteria Pelagibaca abyssi, en concreto en el plásmido pPABY2. En ambos casos, la distribución de los genes en el cluster es similar a la descrita en C. necator H16. Sin embargo, en el caso de R. palustris, el gen badK se encuentra detrás del gen aliA, formando un operón de genes catabólicos orientado en sentido divergente al regulador badR; mientras que en el caso de P. abyssi el gen badK se encuentra separado del resto de genes catabólicos y aguas abajo del regulador badR (Fig. 28). En el caso de las γ-proteobacterias el cluster bad se encuentra presente en dos cepas del género Pseudomonas, P. silesiensis y Pseudomonas sp. TCU-HL1, y en dos cepas del género Marinobacter, M. adhaerens y M. salinus. En todas ellas los genes aliA, badH, badI, aliB y badR se encuentran formando probablemente un operón. Este operón está orientado de forma divergente al gen badK, en el caso de las cepas pertenecientes al género Pseudomonas, mientras que en las cepas pertenecientes al género Marinobacter el gen badK se encuentra localizado en una región distinta del genoma (Fig. 28). En resumen, todos estos análisis sugieren que la capacidad de degradar CHC a través de la ruta bad es más común de lo que se había supuesto en un principio. La regulación transcripcional de todos los clusters bad descritos parece estar conservada y mediada por la proteína BadR, un represor de la familia MarR (ver apartado 2.4). Curiosamente, en todos los clusters bad identificados se encuentra una secuencia consenso similar a la de unión de BadR (CAANNNNTTG) en la región intergénica de los dos operones divergentes, lo que sugiere un mecanismo de regulación similar en todos ellos. 2.4. Estudio de la regulación del cluster bad 2.4.1. Análisis transcripcional y regulación específica de los genes bad Para estudiar la organización transcripcional del cluster bad de Azoarcus sp. CIB, se realizaron experimentos de RT-PCR de las correspondientes regiones intergénicas (Fig. 29). Tal y como se muestra en la figura 29, los genes aliA y badK forman una unidad transcripcional. Por otro lado, los genes aliB, badH y badI forman parte de un operón divergente al operón aliAbadK. Curiosamente, el gen badR, que codifica un presunto regulador transcripcional, se localiza dentro del operón aliBbadHbadI y se transcribe en orientación divergente a éste. 115 Resultados Figura 29. Análisis co-transcripcional de los genes bad en Azoarcus sp. CIB. Co-expresión de los genes aliA-badK; badH-bad y aliB-badH de la cepa Azoarcus sp. CIB creciendo en medio MC con benzoato (3 mM, carriles Bz) o ciclohexano carboxilato (3mM, carriles CHC) como única fuente de carbono en condiciones anaeróbicas. Las células se recogieron en mitad de la fase exponencial de crecimiento y la extracción del RNA y los ensayos de qRT-PCR se realizaron como se detalla en los apartados 3.7 y 3.8 de Materiales y métodos. En el cluster bad de R. palustris el gen badR codifica un represor transcripcional de la familia MarR (Egland y Harwood, 1999). La proteína BadR se une a la región operadora (CAATNNATTG) que se localiza entre los genes divergentes badR y badH, concretamente entre las cajas -35 y -10 del gen badR (Hirakawa et al., 2015). En el caso del cluster bad de Azoarcus sp. CIB, se detectan 2 cajas operadoras de unión de BadR (CAATNNATTG) entre los genes aliA y aliB, solapando con las presuntas cajas -35 de los promotores PaliA y PaliB, respectivamente (Fig. 30). Figura 30. Localización de las secuencias de unión de BadR en el cluster bad de Azoarcus sp. CIB. La región representada corresponde con la secuencia intergénica de 434 pb entre los codones de inicio (ATG) de los genes aliB y aliA. Las flechas grises y azules representan las cajas -10 y -35, respectivamente, de los promotores PaliB y PaliA. En morado están indicadas las secuencias de unión de BadR solapando en parte con las cajas -35 (subrayadas en azul). Para estudiar la regulación específica de los genes bad de la cepa CIB se construyó una fusión traduccional del promotor del gen aliB (PaliB) con el gen reportero lacZ (PaliB::lacZ), generando el plásmido pSEVA225TPaliB (Fig. 31A, Tabla 2). Utilizando la cepa E. coli DH10B (pSEVA225TPaliB) se realizaron ensayos β-galactosidasa, confirmándose una significativa actividad del promotor PaliB (Fig. 31B), y sugiriendo que dicha actividad se encuentra regulada de forma negativa en la cepa CIB. Figura 31 (siguiente página). Expresión de la fusión traduccional PaliB::lacZ en E. coli. A. Esquema de la clonación del promotor PaliB (incluyendo los 51 primeros nucleótidos del gen aliB) en el vector de búsqueda de promotores pSEVA225T (Tabla 2). El plásmido resultante pSEVA225TPaliB permite expresar la proteína quimérica resultante de la fusión traduccional del gen aliB con el gen reportero lacZ bajo el control del promotor PaliB. B. Medida de la actividad β-galactosidasa (Unidades Miller, U.M.) en células de E. coli DH10B que contienen los plásmidos pSEVA225T (barra negra) o pSEVA225TPaliB (barra roja). Las células fueron cultivadas en medio LB y la actividad enzimática ensayada como se describe en el apartado 7.1 de Materiales y métodos. Las barras muestran la desviación estándar de los resultados de tres experimentos independientes. 116 Resultados Para comprobar si el gen badR codifica el regulador específico que controla la actividad del promotor PaliB se clonó dicho gen bajo el control de la pareja reguladora LacI/Ptac en el plásmido pIZ2, generando el plásmido pIZBadR (Fig. 32A, Tabla 2), que permite inducir la expresión del gen regulador en presencia de IPTG. Tal y como se muestra en la figura 32B, la presencia del regulador BadR inhibe significativamente la actividad del promotor PaliB. Estos resultados revelan que BadR actúa como un represor transcripcional de los genes bad. Figura 32. Actividad de BadR sobre la expresión de la fusión traduccional PaliB::lacZ. A. Esquema de la clonación del gen badR (AzCIB_1945) en el vector de amplio rango de huésped pIZ2 (Tabla 2). El plásmido resultante pIZBadR permite expresar el regulador bajo el control de la pareja reguladora LacIQ/Ptac. B. Medida de la actividad β-galactosidasa (Unidades Miller, U.M.) en células de E. coli DH10B que contienen los plásmidos pSEVA225TPaliB y pIZ2 (barra verde) o pIZBadR (barra negra). Las células fueron cultivadas en medio LB con 1mM de IPTG, y la actividad enzimática ensayada como se describe en el apartado 7.1 de Materiales y métodos. Las barras muestran la desviación estándar de los resultados de tres experimentos independientes. 117 Resultados 2.4.2. Caracterización del inductor de los genes bad Para identificar la molécula inductora de los genes bad se probó inicialmente la adición del sustrato de la ruta (CHC) al medio de cultivo utilizado para crecer la cepa E. coli DH10B (pSEVA225TPaliB/pIZBadR). En estas condiciones no se observó actividad del promotor PaliB, lo que sugería que la molécula inductora no era el sustrato inicial de la ruta sino alguno de los intermediarios CoA generados en dicha ruta. Para confirmar esta hipótesis, se clonó el gen aliA (codifica la presunta CHC-CoA ligasa) en el plásmido pIZBadRAliA (Fig. 33A, Tabla 2). La cepa E. coli DH10B (pSEVA225TPaliB, pIZBadRAliA) cultivada en presencia de CHC (3mM) permite la actividad del promotor PaliB, ya que genera unos elevados niveles de actividad βgalactosidasa (Fig. 33B). Estos resultados sugieren que el gen aliA codifica la enzima CoA ligasa que activa el CHC a su derivado CoA (CHC-CoA) el cual funciona como efector del represor BadR y permite la desrepresión del promotor PaliB y la consiguiente inducción de los genes bad. Una vez determinado que el CHC-CoA era el inductor del sistema, se determinó el rango de concentraciones de CHC capaces de generar una respuesta del promotor PaliB. Para ello, se realizaron ensayos β-galactosidasa con la cepa E. coli DH10B (pSEVA225TPaliB, pIZBadRAliA) añadiendo distintas concentraciones de CHC al medio de cultivo. En la figura 34B se puede observar que la concentración mínima de CHC necesaria para inducir la activación del promotor PaliB es 0,1 µM, siendo 1 µM la concentración de CHC a la que se obtiene la máxima inducción. Figura 33. Expresión de la fusión traduccional PaliB::lacZ en células de E. coli que contienen los genes badR y aliA. A. Esquema de la clonación del gen aliA en el vector de amplio rango de huésped pIZBadR. El plásmido resultante, pIZBadRAliA, permite expresar el gen regulador badR y el gen aliA, que codifica la CHC-CoA ligasa, bajo el control de la pareja reguladora LacIQ/Ptac. B. Medida de la actividad β-galactosidasa (Unidades Miller, U.M.) en células de E. coli DH10B que contienen los plásmidos pSEVA225TPaliB y pIZBadR (barra negra) o pIZBadRAliA (barra naranja). Las células fueron cultivadas en medio LB con 1mM de IPTG y 3mM de CHC, y la actividad enzimática ensayada como se describe en el apartado 7.1 de Materiales y métodos. Las barras muestran la desviación estándar de los resultados de tres experimentos independientes. 118 Resultados Para determinar el perfil de efectores del sistema regulador AliA/BadR, se ensayó la activación del promotor PaliB en la cepa E. coli DH10B (pSEVA225TPaliB, pIZBadRAliA) cultivada en presencia de distintos análogos estructurales del CHC tales como el ciclohexano 1,2-dicarboxilato (CHDC), el pimelato (ácido dicarboxílico alifático) y el benzoato (análogo aromático). Solo el benzoato permitió una cierta desrepresión que fue entre 4 y 5 veces inferior a la detectada en presencia de CHC, lo que indica que el sistema AliA/BadR es relativamente específico para el CHC (Fig. 34A). Figura 34. Actividad del promotor PaliB en presencia de diferentes inductores. A. Medida de la actividad βgalactosidasa (Unidades Miller, U.M.) en células de E. coli DH10B que contienen los plásmidos pSEVA225TPaliB y pIZBadRAliA. Las células fueron cultivadas en medio LB con 1mM de IPTG y 3mM de CHC (CHC, barra naranja), benzoato (Bz, barra verde), ciclohexano dicarboxilato (CHDC, barra azul), pimelato (Pim, barra roja) o sin adicionar ningún compuesto (control, barra gris). B. Medida de la actividad β-galactosidasa (Unidades Miller, U.M.) en células de E. coli DH10B que contienen los plásmidos pSEVA225TPaliB y pIZBadRAliA. Las células fueron cultivadas en medio LB con 1mM de IPTG y diferentes concentraciones de CHC (0,05 µM- 1µM). La actividad enzimática se ensayó como se describe en el apartado 7.1 de Materiales y métodos. Las barras muestran la desviación estándar de los resultados de tres experimentos independientes. 2.4.3. Caracterización in vitro de la interacción de BadR con el promotor PaliB Una vez determinado que el represor BadR era capaz de modular in vivo la actividad del promotor PaliB en respuesta al inductor CHC-CoA, se decidió estudiar la interacción de este regulador con el promotor PaliB mediante ensayos in vitro. Para ello, se clonó el gen badR en el plásmido de sobreexpresión pET28BadR (Fig. 35A). La inducción de la expresión del gen badR en la cepa E. coli BL21 conteniendo el plásmido pET28BadR permitió la obtención de la proteína His6-BadR, la cual fue parcialmente purificada mediante cromatografía de afinidad tal y como se detalla en el apartado 6.2 de Materiales y métodos (Fig. 35B). Una vez purificadas ambas proteínas, se analizó su capacidad de interaccionar con el promotor PaliB mediante ensayos de retardo en gel. Para ello, se diseñó una sonda de DNA marcada radiactivamente con 32P que incluye la región promotora PaliB (ver apartado 8.1 de Materiales y métodos). 119 Resultados Figura 35. Clonación, hiperproducción y purificación del regulador BadR. A. Esquema de la clonación del gen badR en el vector de expresión pET28a. Las abreviaturas indicadas son: PT7 (promotor del gen 10 del bacteriófago T7), KanR (gen que confiere resistencia a la kanamicina), ori pBR322, lacIQ (gen que codifica el represor LacIQ). B. Gel SDS-PAGE (12.5%) en el que se analizó la proteína parcialmente purificada mediante el método descrito en la sección 6.2 de Materiales y métodos a partir de extractos de E. coli BL21 (DE3) que contiene el plásmido pET28BadR. Carril S: sobrenadante del extracto lisado. Carriles L1 y L2: lavados correspondientes a la fracción del sobrenadante que no se adhiere a la membrana de Zn. Carriles 50, 250, 500, 750 1M y 2M hacen referencia a los sucesivos lavados añadiendo entre 50mM y 2M de imidazol para despegar la proteína de la resina de Zn. Tal y como se observa en la figura 36 (panel A), la proteína His6-BadR fue capaz de unirse a la sonda PaliB de forma específica, lo que confirmaba la interacción del regulador con el promotor diana. Además, este resultado indica que el hecho de tener una cola de histidinas en el N-terminal no le impide al regulador BadR interaccionar con el ADN. Para confirmar la caja operadora de BadR, se construyeron sondas del promotor PaliB con diferentes sustituciones de nucleótidos en la presunta región operadora CAATN2ATTG (ver apartado 8.1 de Materiales y métodos). Si se produce una modificación en el primer (Fig. 36B, carriles 1-5) o segundo nucleótido del palíndromo (Fig. 36D, carriles 1-5), el regulador BadR ya no es capaz de unirse al ADN. Sin embargo, mutaciones en el tercer (Fig. 36C, carriles 1-5) o cuarto nucleótido (Fig. 36B, carriles 6-10) no afectan a su capacidad para reconocer su región operadora. En lo que respecta a la distancia entre las secuencias palindrómicas, se observa que si se eliminan los dos nucleótidos que separan estas secuencias, BadR no interacciona con el ADN (Fig. 36A, carriles 6-10), al igual que si la distancia aumenta hasta 6 nucleótidos (Fig. 36D, carriles 6-10). Por otra parte, si la distancia entre ambas cajas es de 4 nucleótidos (Fig. 36C, carriles 6-10), el regulador reconoce esta región operadora con la misma eficiencia con la que reconoce la región nativa. 120 Resultados Figura 36. Ensayos in vitro de la interacción de la proteína BadR con el promotor PaliB. Ensayos de retardo en gel en los que se emplearon concentraciones crecientes de la proteína His6-BadR purificada (0 pmol, carriles 1 y 6; 1 pmol, carriles 2 y 7; 2 pmol, carriles 3 y 8; 4 pmol, carriles 4 y 9; 8 pmol, carriles 5 y 10) y distintas sondas del promotor PaliB. A. Sonda PaliB con el sitio de unión a BadR consenso CAATACATTG (carriles 1-5) o modificado CAAT-ATTG (carriles 6-10). B. Sonda PaliB con el sitio de unión a BadR modificado a GAATACATTG (carriles 1-5) o a CAATGGGGATTG (carriles 6-10). C. Sonda PaliB con el sitio de unión a BadR modificado a CAATATAATG (carriles 1-5) o a CAATACACATTG (carriles 6-10). D. Sonda PaliB con el sitio de unión a BadR modificado a CAATACAAAG (carriles 1-5) o a CAATACACACATTG (carriles 6-10). Teniendo en cuenta estos datos en conjunto, se puede concluir que la interacción de BadR con su región operadora depende en su mayor parte de los dos primeros nucleótidos de las regiones palindrómicas (los cuales deben estar altamente conservados) y la distancia de separación entre ambas regiones palindrómicas no puede ser inferior a 2 nucleótidos ni exceder los 4. 2.5. Diseño de una cassette bad para el metabolismo del CHC Como se ha indicado anteriormente, la ruta propuesta para la degradación de CHC en Azoarcus sp. CIB implica la activación inicial de este compuesto a CHC-CoA por la actividad de AliA, y su posterior βoxidación hasta pimelil-CoA mediada por las actividades de AliB, BadK, BadH y BadI (Fig. 22B). Para confirmar que los genes catabólicos bad eran los únicos necesarios y suficientes para la conversión de CHC 121 Resultados en pimelil-CoA, se diseñó una cassette de DNA que expresase dichos genes formando un único operón bajo el control heterólogo de la pareja reguladora Ptac/LacIQ. Para ello, se construyó el plásmido promiscuo pIZBad (Fig. 37, Tabla 2). Figura 37. Esquema de la cassette bad. Diseño de la cassette bad modificando el orden de los genes bad con respecto al cluster bad de Azoarcus sp CIB y cuya secuencia ha sido optimizada para eliminar ciertas dianas de restricción. El plásmido resultante pIZBad permite la expresión heteróloga de los genes bad bajo el control de la pareja reguladora Ptac/LacIQ. Para comprobar la funcionalidad de la cassette bad se utilizó una estrategia previamente descrita (Bernstein et al., 2008), y que consiste en emplear como huésped la cepa E. coli ΔbioH, la cual tiene afectada la ruta de síntesis de pimelil-ACP, un precursor de la biotina, por lo que es incapaz de crecer en medios mínimos sin la presencia de esta vitamina. Dado que el pimelil-CoA puede ser utilizado como sustrato de la enzima BioF para la síntesis de biotina, el crecimiento de E. coli ΔbioH en medios carentes de biotina se puede utilizar como método de selección para identificar la formación de pimelil-CoA en la célula (Fig. 38). 122 Resultados Figura 38. Esquema bioquímico propuesto para la transformación del CHC en biotina. Las proteínas que catalizan las reacciones, así como otras moléculas necesarias para la catálisis, junto con los intermediarios que se generan, se indican en cada paso. Las proteínas en color gris se corresponden con las enzimas de E. coli que participan en la síntesis de biotina. Tal y como se muestra en la figura 39, la cepa E. coli ΔbioH (pIZBad) fue incapaz de crecer en un medio mínimo sin biotina, pero la adición de CHC permitió el crecimiento de la cepa. Por el contrario, la cepa control E. coli ΔbioH no fue capaz de crecer en este medio sin vitamina ni siquiera tras la adición de CHC. Este resultado confirma que la cassette bad es funcional y permite la transformación de CHC en pimelil-CoA. Por otro lado, la cassette bad constituye una herramienta biotecnológica de gran interés para expandir la capacidad de degradar CHC a organismos que carecen de dicha habilidad (ver apartado 3.2 de Resultados). 123 Resultados Figura 39. Crecimiento de las cepas E. coli ΔbioH y E. coli ΔbioH (pIZBad). Las cepas E. coli ΔbioH (cuadrados negros) y E. coli ΔbioH (pIZBad) (círculos morados) se cultivaron en medio MC a 30ºC utilizando glucosa (0,2%) como fuente de carbono, CHC (3mM) e IPTG (1mM) como inductor, en condiciones anaeróbicas. El crecimiento se monitorizó midiendo el incremento de absorbancia a 600 nm (A600). Las barras muestran la desviación estándar de los resultados de tres experimentos independientes. 3. Capítulo 3: Identificación y estudio de la ruta baja del metabolismo del benzoato, CHC y pimelato en Azoarcus sp. CIB 3.1. Identificación de dos clusters implicados en la β-oxidación de ácidos grasos dicarboxílicos en la cepa Azoarcus sp. CIB Como se ha descrito en la Introducción, la ruta central de la degradación anaeróbica del benzoato produce 3-hidroxipimelil-CoA. Por otro lado, el catabolismo del CHC, tanto aeróbico como anaeróbico, produce pimelil-CoA. Ambos derivados de CoA son metabolizados hasta glutaril-CoA y acetil-CoA a través de una ruta baja de β-oxidación que se ha identificado en R. palustris y está codificada por varios clusters de genes pimFABCDE que se localizan en distintas regiones del genoma (Larimer et al., 2004; Harrison y Harwood, 2005; VerBerkmoes et al., 2006). Cuando se analizó la presencia de ortólogos de los genes pim en el genoma de Azoarcus sp. CIB, se identificaron dos clusters génicos que podrían codificar las enzimas implicadas en la ruta baja del metabolismo de compuestos aromáticos (benzoato) y alicíclicos (CHC), así como en la degradación de ácidos grasos dicarboxílicos de número impar de átomos de carbono (e.g. pimelato). El cluster de β-oxidación I está formado por los genes AzCIB_1937-AzCIB_1942, y se localiza adyacente al cluster bad, mientras que el cluster de β-oxidación II está formado por los genes AzCIB_2912-AzCIB_2917 (Fig. 40A). Las funciones predichas para cada uno de los genes se indican en la figura 40B. Los genes AzCIB_1942/AzCIB_2912 (79,3% identidad) codifican la presunta acil-CoA deshidrogenasa que transforma el pimelil-CoA en trans-Δ-2-pimelil-CoA (2,3-dideshidropimelil-CoA); los genes AzCIB_1939/AzCIB_2914 (74,5% identidad) codifican la enoil-CoA hidratasa que transforma el trans-Δ-2-pimelil-CoA en 3hidroxipimelil-CoA; los genes AzCIB_1938/AzCIB_2915 (66,5% identidad) codifican la 3-hidroxiacil-CoA 124 Resultados 125 Resultados Figura 40 (página anterior). Degradación del pimelil-CoA en Azoarcus sp. CIB. A. Organización génica de los posibles clusters de genes implicados en la ruta de degradación (β-oxidación) del pimelil-CoA en Azoarcus sp. CIB. Las regiones representadas corresponden con las secuencias comprendidas entre las bases 2.164,808-2.171,187 (cluster de βoxidación I, flechas azul oscuro) y 3.265,574-3.272,591 (cluster de β-oxidación II, flechas rojas) del genoma de Azoarcus sp. CIB (NZ_CP011072.1). En gris, genes de función desconocida; y en negro, el gen que codifica una proteína reguladora perteneciente a la familia IclR. B. Esquema bioquímico propuesto para el metabolismo del 3-hidroxipimelil-CoA que puede provenir del metabolismo de ácidos dicarboxílicos como el pimelato, la ruta de degradación del CHC (ruta bad, flechas naranjas) o la ruta de degradación anaeróbica del benzoato (ruta bzd, flechas moradas). Las proteínas que catalizan las reacciones y los genes que las codifican, así como otras moléculas necesarias para la catálisis, junto con los intermediarios que se generan, se indican en cada paso. deshidrogenasa involucrada en la transformación del 3-hidroxipimelil-CoA en 3-cetopimelil-CoA; los genes AzCIB_1937/AzCIB_2916 (77% identidad) codifican la β-cetotiolasa (acetil-CoA aciltransferasa) que cataliza la conversión del 3-cetopimelil-CoA en glutaril-CoA y acetil-CoA. En el cluster de β-oxidación I existen dos genes adicionales, AzCIB_1940 y AzCIB_1941, de función desconocida y cuyos productos muestran similitud con la proteína PaaY involucrada en la degradación del ácido fenilacético y con una hipotética nitroreductasa, respectivamente. Por otra parte, el cluster de β-oxidación II contiene además: i) el gen AzCIB_2917, que codifica una presunta CoA transferasa encargada de la activación del pimelato a pimelil-CoA; ii) el gen AzCIB_2913, que codifica un posible regulador transcripcional perteneciente a la familia IclR; y iii) los genes "accesorios" (AzCIB_2909-2911 y AzCIB_2918), que también podrían estar implicados en el metabolismo del pimelato (ver más adelante). Para tratar de discernir si alguno de los clusters de β-oxidación comentados anteriormente estaban realmente involucrados en el metabolismo del benzoato, CHC y/o pimelato, se estudió su expresión. Para ello, se realizaron experimentos de RT-PCR para comprobar la inducción de los genes AzCIB_1937 (marcador del cluster I) y AzCIB_2912 (marcador del cluster II) cuando Azoarcus sp. CIB se cultiva en condiciones anaeróbicas utilizando benzoato, CHC o pimelato como fuente de carbono. Tal y como se muestra en la figura 41A, el gen AzCIB_1937 se encuentra inducido en presencia de CHC y benzoato, pero no cuando la cepa CIB está creciendo en pimelato como fuente de carbono. Por el contrario, el gen AzCIB_2912 solo se encuentra inducido en presencia de pimelato pero no cuando Azoarcus sp. CIB está creciendo en benzoato o CHC como fuentes de carbono (Fig. 41B). Este resultado sugiere que en Azoarcus sp. CIB el cluster de β-oxidación I (a partir de ahora denominado cluster aab por "aromatic and alicyclic beta-oxidation") codifica la ruta baja del metabolismo de compuestos aromáticos (anaeróbico) y alicíclicos (aeróbico/anaeróbico), mientras que el cluster de β-oxidación II (a partir de ahora denominado cluster pim por "pimelate degradation") es el encargado del metabolismo aeróbico/anaeróbico de ácidos dicarboxílicos alifáticos de cadena impar, como es el caso del pimelato. Figura 41 (siguiente página). Análisis de la expresión del cluster de β-oxidación I y II en Azoarcus sp. CIB. Expresión de los genes AzCIB_1937 (β-oxidación I) (A) y AzCIB_2912 (β-oxidación I) (B) de la cepa Azoarcus sp. CIB creciendo en medio MC con benzoato (3 mM, carriles Bz), ciclohexano carboxilato (3mM, carriles CHC) o pimelato (3 mM, carriles Pim) como única fuente de carbono en condiciones anaeróbicas. Las células se recogieron en mitad de la fase exponencial de crecimiento y la extracción del RNA y los ensayos de qRT-PCR se realizaron como se detalla en los apartados 3.7 y 3.8 de Materiales y métodos. 126 Resultados 3.2. Estudio del cluster aab Para conocer la organización transcripcional del cluster aab, se realizó un estudio de la posible cotranscripción de los genes AzCIB_1937-AzCIB_1939, y de la expresión del gen AzCIB_1942 cuando Azoarcus sp. CIB se cultiva anaeróbicamente en benzoato. Tal y como se observa en la figura 42, los tres genes AzCIB_1937-AzCIB_1939 forman un único operón que se está expresando en presencia de benzoato. Por el contrario, el gen AzCIB_1942 no se expresa en benzoato y solo se induce su expresión cuando la cepa CIB se cultiva en CHC (Fig. 42A). Este resultado está de acuerdo con la función predicha para AzCIB_1942, que sería necesaria para el metabolismo del pimelil-CoA generado en la degradación del CHC, pero no para el metabolismo del 3-hidroxipimelil-CoA generado en la degradación anaeróbica del benzoato. Dado que el gen AzCIB_1942 se encuentra localizado en posición 3´ al gen badI (AzCIB_1943) y codifica la actividad enzimática que actúa sobre el producto de la enzima BadI, se analizó si estos genes pudieran estar cotranscribiéndose cuando Azoarcus sp. CIB se cultiva en CHC. Tal y como se muestra en la figura 42B, AzCIB_1942 y AzCIB_1943 se co-transcriben en presencia de CHC. Este resultado revela que el operón catabólico formado por los genes aliB, badH, badI, contiene un cuarto gen (AzCIB_1942) que, por tanto, forma parte también del cluster bad. Figura 42. Análisis de la expresión del cluster aab y del cluster bad en Azoarcus sp. CIB. A. Co-transcripción de los genes AzCIB_1939-AzCIB_1937 de la cepa Azoarcus sp. CIB creciendo en medio MC con benzoato (3 mM, carriles Bz) o pimelato (3 mM, carriles Pim) como única fuente de carbono en condiciones anaeróbicas. B. Expresión del gen AzCIB_1942 de la cepa Azoarcus sp. CIB creciendo en medio MC con benzoato (3 mM, carril Bz), ciclohexano carboxilato (3mM, carril CHC) o pimelato (3 mM, carril Pim) como única fuente de carbono en condiciones anaeróbicas. C. Co-transcripción de los genes badI (AzCIB_1943)-AzCIB_1942 de la cepa Azoarcus sp. CIB creciendo en medio MC con benzoato (3 mM, carril Bz) o ciclohexano carboxilato (3mM, carril CHC) como única fuente de carbono en condiciones anaeróbicas. Las células se recogieron en mitad de la fase exponencial de crecimiento y la extracción del RNA y los ensayos de qRT-PCR se realizaron como se detalla en los apartados 3.7 y 3.8 de Materiales y métodos. 127 Resultados Para confirmar que el cluster aab está involucrado en el metabolismo del benzoato y CHC se construyó un mutante de la cepa CIB en el gen AzCIB_1938, tal y como se detalla en el apartado 5 de Materiales y métodos. La cepa Azoarcus sp. CIBΔAzCIB_1938 mostró un crecimiento anaeróbico más lento en CHC y en benzoato que el de la cepa silvestre (Fig. 43B y C), si bien el crecimiento aeróbico en CHC fue similar en ambas cepas (Fig. 43A). Estos resultados sugieren que el cluster aab es el principal responsable de la ruta baja de degradación anaeróbica del benzoato, así como de la degradación aeróbica/anaeróbica de CHC. Además, tal y como se observa en la figura 43D, el cluster aab puede ser sustituido por el cluster pim en la cepa Azoarcus sp. CIBΔAzCIB_1938, puesto que el gen AzCIB_2912 (indicador del cluster pim) está inducido en la cepa mutante pero no en la silvestre. Es decir, que esta cepa es capaz de sobreponerse a su propia regulación e inducir el cluster pim en ausencia de pimelato, aunque en condiciones aeróbicas en presencia de CHC es capaz de adaptarse muy rápido dado que tiene una tasa de crecimiento similar a la de la cepa silvestre, mientras que en condiciones anaeróbicas tanto en CHC y benzoato requiere más tiempo para poder inducir el cluster pim. Figura 43. Crecimiento de la cepa Azoarcus sp. CIBΔAzCIB_1938. La cepa se cultivó en medio MC a 30ºC utilizando CHC (3mM, triángulos verdes) en condiciones aeróbicas (A) o anaeróbicas (B) o benzoato en condiciones anaeróbicas (3mM, triángulos azules) (C), como únicas fuentes de carbono, comparando su crecimiento en todas las condiciones con la cepa silvestre Azoarcus sp. CIB (cuadrados negros). Se valoró el incremento de absorbancia a 600 nm (A600). Las barras muestran la desviación estándar de los resultados de tres experimentos independientes. D. Expresión del gen AzCIB_2912 en las cepas Azoarcus sp. CIB (carriles CIB) y Azoarcus sp. CIBΔAzCIB_1938 creciendo en CHC aeróbico y anaeróbico o benzoato anaeróbico. Las células se recogieron en mitad de la fase exponencial de crecimiento y la extracción del RNA y los ensayos de qRT-PCR se realizaron como se detalla en los apartados 3.7 y 3.8 de Materiales y métodos. 128 Resultados Figura 44. Construcción del plásmido pIZBadβ1 y degradación de CHC en huéspedes heterólogos. A. Esquema de la estrategia seguida para la clonación del cluster aab en el plásmido pIZBad. Se utilizaron los oligonucleótidos AzCIB_1942 Fw SpeI/AzCIB_1942 Rv SbfI (Tabla 3) para amplificar por PCR el gen AzCIB_1942 (1.198 pb), y los oligos AzCIB_1939 Fw SbfI/AzCIB_1937 Rv HindIII (Tabla 3) para amplificar por PCR los genes AzCIB_1937-1939 (3.584 pb); Los fragmentos se digirieron con las enzimas de restricción SpeI/SbfI y SbfI/HindIII, respectivamente, y se introdujeron en el plásmido pIZBad (previamente digerido con las enzimas SpeI/HindIII) mediante ligación para obtener el plásmido pIZCBadβ1 B. Crecimiento de las cepas P. putida KT 2440 (triángulos negros), A. baylyi (círculos rosas), A. communis (cuadrados azules) y B. xenovorans (triángulos verdes) en medio MC a 30ºC utilizando CHC (3mM) en condiciones aeróbicas como única fuente de carbono. Se valoró el incremento de absorbancia a 600 nm (A600). Las barras muestran la desviación estándar de los resultados de tres experimentos independientes. 129 Resultados Para confirmar que el cluster aab codifica todas las actividades enzimáticas necesarias y suficientes para la conversión del pimelil-CoA en glutaril-CoA, se diseñó una cassette recombinante aab que contiene en el mismo operón los genes AzCIB_1937-AzCIB_1939, así como el gen AzCIB_1942, con una secuencia ShineDalgarno sintética en su extremo 5´para asegurar su traducción, y se clonó bajo el control del promotor Ptac en el plásmido pIZBad portador de la cassette chc (Fig. 44A). El plásmido resultante, pIZBadβ1, se introdujo en diversas bacterias que degradan glutarato (vía glutaril-CoA) pero que no eran capaces de degradar CHC de forma natural, e.g. P. putida KT2440, A. baylyi ADP1, B. xenovorans y A. communis. Tal y como se observa en la figura 44B, todas las cepas recombinantes portadoras del plásmido pIZBadβ1 fueron capaces de utilizar CHC como única fuente de carbono y energía en condiciones aeróbicas. Este resultado demuestra que el plásmido pIZCBadβ1 contiene todos los genes necesarios para la transformación del CHC en glutaril-CoA y, por lo tanto, que el cluster aab es responsable de la conversión del pimelil-CoA (generado en la ruta bad) en glutaril-CoA. Por otra parte, el resultado obtenido indica que los genes AzCIB_1941-AzCIB_1940, que están ausentes en la cassette aab, no son estrictamente necesarios para el metabolismo del CHC. 3.3. Estudio del cluster pim El cluster pim de Azoarcus sp. CIB contiene, entre otros, los genes catabólicos (y el presunto gen regulador) que se inducen específicamente cuando las células se cultivan en pimelato organizados en dos presuntos operones divergentes, AzCIB_2914-AzCIB_2917 y AzCIB_2912-AzCIB_2913 (Fig. 45A). Además de los genes mencionados anteriormente, el cluster pim también incluye una serie de genes "accesorios" que podrían estar implicados en el metabolismo del pimelato (Fig. 46 A). Así, en posición 3´ del gen AzCIB_2912 se localizan los genes AzCIB_2911, que codifica un transportador de membrana de la familia MFS posiblemente implicado en la entrada de pimelato al interior celular, y AzCIB_2909 y AzCIB_2910, que codifican las subunidades α y β de una presunta flavoproteína transferente de electrones (EtfAB, electron transfer flavoprotein) desde el FADH generado por la acil-CoA deshidrogenasa (AzCIB_2912) hasta las quinonas de la cadena de transporte de electrones. Por otro lado, en posición 3' del gen AzCIB_2917 se localiza otro gen (AzCIB_2918) que podría codificar otro transportador MFS implicado en el transporte de pimelato. Para tratar de averiguar si estos genes “accesorios” realmente estaban implicados en el metabolismo del pimelato, inicialmente se estudió su inducción mediante RT-PCR cuando Azoarcus sp. CIB se cultiva, tanto en condiciones aeróbicas como anaeróbicas, en pimelato como única fuente de carbono y energía. Tal y como se observa en la figura 45B, los genes AzCIB_2909 y AzCIB_2910, así como el gen AzCIB_2911, se encuentran inducidos en presencia de pimelato, sin embargo, el gen AzCIB_2918 mostró una escasa inducción en este compuesto alifático. Este resultado sugiere que en el metabolismo del pimelato intervienen, además de las enzimas directamente implicadas en la ruta metabólica, un sistema Etf flavoproteína (AzCIB_2909 y AzCIB_2910) y un sistema de transporte específico (AzCIB_2911) para incorporar el sustrato del medio. 130 Resultados Figura 45. Organización y expresión de los genes pim en Azoarcus sp. CIB. A. Las regiones representadas corresponden con las secuencias comprendidas entre las bases 3.262.510-3.273.956 del genoma de Azoarcus sp. CIB. Las flechas en rojo corresponden con los genes que codifican para las enzimas implicadas en el metabolismo del pimelato; las flechas grises corresponden con los genes que codifican las subunidades α y β de una presunta flavoproteína transferente de electrones; las flechas blancas corresponden con los genes que codifican proteínas transmembrana pertenecientes a la familia MFS (major facilitator superfamily), y la flecha negra corresponde con el gen que codifica para una proteína reguladora perteneciente a la familia IclR. B. Expresión de los genes AzCIB_2909, AzCIB_2910, AzCIB_2911, AzCIB_2915 y AzCIB_2918 de la cepa Azoarcus sp. CIB creciendo en medio MC con benzoato (3 mM, carriles Bz) o pimelato (3 mM, carriles Pim) como única fuente de carbono en condiciones anaeróbicas. Las células se recogieron en mitad de la fase exponencial de crecimiento y la extracción del RNA y los ensayos de qRT-PCR se realizaron como se detalla en los apartados 3.7 y 3.8 de Materiales y métodos. Para profundizar en el estudio del papel de los genes accesorios del cluster pim en el metabolismo del pimelato, se decidió diseñar una serie de cassettes recombinantes portadoras de los genes pim catabólicos (AzCIB_2914-AzCIB_2917 y AzCIB_2912) y distintas combinaciones de genes accesorios: i) cassette Pim1 (cassette completa que incluye los genes AzCIB_2911; AzCIB_2909 y AzCIB_2910); ii) cassette Pim2 (incluye solo el gen AzCIB_2911); y iii) cassette Pim3 (no incluye ninguno de los genes accesorios) (Fig. 46A). Estas cassettes se clonaron en el plásmido pIZ2, de forma que su expresión estuviese regulada por la pareja reguladora Ptac/LacIQ, generando los plásmidos pIZPim1, pIZPim2 y pIZPim3 (Fig. 46A, Tabla 2). Estos plásmidos se transfirieron posteriormente a la bacteria P. putida KT2440, la cual es capaz de degradar glutarato/glutaril-CoA, pero no pimelato. 131 Resultados 132 Resultados Figura 46 (página anterior). Construcción de los plásmidos pIZPim1, pIZPim2 y pIZPim3 y degradación de pimelato en huéspedes heterólogos. A. Esquema de la estrategia seguida para la construcción de las cassettes Pim1, Pim2 y Pim3. Se utilizaron los oligonucleótidos PimM1 Fw SbfI /PimM1 Rv SpeI (Tabla 3) para amplificar por PCR los genes AzCIB_2914-2917 (4.808 pb), y los oligonucleótidos PimM2 SbfI/ PimM2/PimM3/PimM4 Rv HindIII (Tabla 3) para amplificar por PCR los genes AzCIB_2909-2912 (4.264 pb), AzCIB_2911-2912 (2.534 pb) y AzCIB_2912 (1.200 pb). Los fragmentos se digirieron con las enzimas de restricción SbfI/SpeI y SbfI/HindIII respectivamente y se introdujeron en el plásmido pIZ1016 (previamente digerido con las enzimas SpeI/HindIII) mediante ligación para obtener los plásmidos pIZPim1, pIZPim2 y pIZPim3. B. Crecimiento de las cepas P. putida KT 2440 pIZPim1 (círculos rojos), P. putida KT 2440 pIZPim2 (cuadrados naranjas) y P. putida KT 2440 pIZPim1 (triángulos negros) en medio MC a 30ºC utilizando pimelato (3mM) como única fuente de carbono en condiciones aeróbicas. Se valoró el incremento de absorbancia a 600 nm (A600). Las barras muestran la desviación estándar de los resultados de tres experimentos independientes. Tal y como se muestra en la figura 46B, mientras que P. putida KT2440 (pIZPim3) fue incapaz de utilizar pimelato como única fuente de carbono y energía, la cepa P. putida KT2440 (pIZPim2) sí mostró crecimiento en pimelato. Este resultado confirma que el gen AzCIB_2911 es esencial para el catabolismo del pimelato y sugiere que el transporte de este ácido dicarboxílico al citoplasma bacteriano está mediado por un transportador de membrana de la superfamilia MFS. Cuando se comparó el crecimiento de P. putida KT2440 conteniendo la cassette Pim2 con el de la misma cepa conteniendo la cassette completa Pim1 se pudo apreciar que ésta última presentaba una tasa de crecimiento en pimelato muy superior a la primera (Fig. 46B), lo cual sugiere que la presunta Etf codificada por los genes AzCIB_2909 y AzCIB_2910 (presentes solo en la cassette Pim1) facilita la degradación de pimelato al participar en la regeneración del FAD utilizado como cofactor por la pimelil-CoA deshidrogenasa (AzCIB_2912) (Fig. 46B). En resumen, los resultados presentados más arriba confirman el papel del cluster pim en la degradación del pimelato, y revelan por primera vez que el transporte de este sustrato al interior bacteriano está mediado por una proteína de membrana de la superfamilia MFS que es esencial para un catabolismo eficaz. 3.4. Diseño y construcción de cassettes híbridas para la degradación de CHC y pimelato Como se ha comentado anteriormente en el apartado 3.2, la cepa Azoarcus sp. CIBΔAzCIB_1938 fue capaz de crecer anaeróbicamente en benzoato, así como en CHC tanto en condiciones aeróbicas como anaeróbicas concluyendo que el cluster pim es capaz de sustituir al cluster aab. Entonces, se planteó la hipótesis de que el cluster aab pudiese ser sustituido por el cluster pim, por lo que se procedió a comprobarla mediante el diseño de una cassette que incorporase los genes necesarios para degradar el pimelato pero utilizando los genes que codifican los pasos enzimáticos del cluster aab en lugar del cluster pim. Por otro lado, sería interesante poder combinar en una única cassette de DNA la capacidad para degradar CHC y pimelato, de forma que se pudiesen transferir simultáneamente ambas habilidades a organismos incapaces de realizar estos procesos. Con estos objetivos, se procedió a construir cassettes recombinantes que incluyesen todos los genes necesarios para la degradación de CHC y pimelato hasta glutaril-CoA. Dado que el plásmido pIZBadβ1 confiere la capacidad de degradar CHC y el plásmido pIZPim1 confiere la capacidad de metabolizar pimelato, se utilizaron ambos para diseñar una nueva generación de 133 Resultados cassettes híbridas portadoras de los genes: i) bad-aab-AzCIB_2917 (plásmido pIZBad1-2917), ii) bad-aabAzCIB_2917/2911 (plásmido pIZBad1-2917-11) (Fig. 47) y iii) bad-pim (plásmido pIZBadPim1) (Fig. 48). Figura 47. Esquema de la estrategia seguida para la clonación de los genes AzCIB_2917 y AzCIB_2911 en el plásmido pIZBadβ1. Se utilizaron los oligonucleótidos AzCIB_2917 Fw XbaI/ AzCIB_2917 Rv HindIII o PimM1 Fw SbfI (Tabla 3) para amplificar por PCR el gen AzCIB_2917 (1.207 pb), y los oligonucleótidos AzCIB_2910 Fw SbfI/ PimM3 Rv HindIII para amplificar por PCR el gen AzCIB_2911 (1.316 pb). Los fragmentos se digirieron con las enzimas de restricción XbaI/HindIII y XbaI/SbfI y SbfI/HindIII, respectivamente, y se introdujeron en el plásmido pIZBadβ1 (previamente digerido con las enzimas XbaI/HindIII) mediante ligación para obtener los plásmidos pIZBadβ1AzCIB_2917 y pIZBadβ1AzCIB_2917-11 respectivamente. 134 Resultados Además, se siguió la misma estrategia para generar el plásmido pIZCBadPim2 (Fig. 48B, Tabla 2) para determinar si la flavoproteína transferente de electrones del cluster pim también influye en la eficiencia de degradación del CHC. Figura 48. Esquema de la estrategia seguida para la subclonación de la cassette Pim1 (9.033 pb) y la cassette Pim2 (7.303 pb) en el plásmido pIZBad. Se digirieron los plásmidos pIZPim1 y pIZPim2 con las enzimas SpeI/HindIII. Los fragmentos resultantes se purificaron y se introdujeron en el plásmido pIZBad (previamente digerido con las enzimas XbaI/HindIII) mediante ligación para obtener los plásmidos pIZBadPim1 y pIZBadPim2. 135 Resultados Los plásmidos resultantes se transfirieron a la cepa P. putida KT 2440 y se analizó la capacidad de las cepas recombinantes para metabolizar CHC y pimelato. Tal y como se observa en la figura 49A, todas las cepas recombinantes fueron capaces de crecer en CHC, si bien la cassette con el cluster pim (pIZBadPim1 y pIZBadPim2) generó un menor crecimiento que las cassettes basadas en el cluster aab. En cualquier caso, este resultado confirma que la expresión de los genes pim permite el metabolismo del pimelil-CoA generado en la degradación del CHC, si bien la eficiencia de las enzimas Pim pudiera ser más baja que la de las enzimas Aab. Por otro lado, en la figura 49B se muestra que las cepas que contienen los plásmidos pIZBadPim1 o pIZBadβ12917/11 son capaces de utilizar pimelato como única fuente de carbono y energía, lo que indica de nuevo que las enzimas Aab y Pim son intercambiables para el metabolismo del pimelil-CoA. Cabe destacar que la cepa P. putida KT2440 (pIZCBadβ1-2917) no fue capaz de metabolizar pimelato a pesar de expresar la CoA transferasa que activa éste a pimelil-CoA, lo que vuelve a confirmar el papel esencial del gen AzCIB_2911 para el transporte del pimelato al interior celular. Figura 49. Degradación de pimelato y CHC en huéspedes heterólogos. Las cepas P. putida KT2440 (pIZCBadβ12917-11) (cuadrados negros), P. putida KT2440 (pIZCBadβ1-2917) (cuadrados rojos), P. putida KT2440 (pIZBadPim1) (círculos verdes) y P. putida KT2440 (pIZBadPim1) (círculos azules) se cultivaron en medio MC a 30ºC utilizando CHC (3 mM) (A) o pimelato (3 mM) (B) como únicas fuentes de carbono en condiciones aeróbicas. El crecimiento se monitorizó midiendo el incremento de absorbancia a 600 nm (A600). Las barras muestran la desviación estándar de los resultados de tres experimentos independientes. 136 Discusión Discusión Discusión 1. Estudio de la ruta periférica de la degradación de o-ftalato (PA) vía benzoilCoA Al comienzo de la presente tesis doctoral se desconocían los genes implicados en la ruta periférica de degradación anaeróbica del PA vía benzoil-CoA, por lo que uno de los objetivos iniciales de este trabajo fue la identificación de los mismos para diseñar una cassette de DNA recombinante que, como herramienta biotecnológica, permitiese el metabolismo anaeróbico del PA en bacterias. Simultáneamente al desarrollo de esta tesis doctoral se identificaron los genes catabólicos implicados en la degradación anaeróbica de PA, i.e., los genes phtSaSb (codifican la enzima SPT) y phtDaDb (codifican la enzima PDC y la FMN preniltransferasa asociada), en diversas bacterias pertenecientes a los géneros Aromatoleum, Azoarcus y Thauera (Junghare et al., 2016; Ebenau-Jehle et al., 2017; Mergelsberg et al., 2017; Mergelsberg et al., 2018). Sin embargo, como se demuestra en el apartado 1.1 de Resultados, la expresión exclusiva de estos 4 genes catabólicos no confería la capacidad de metabolizar este sustrato aromático a un huésped heterólogo (Azoarcus sp. CIB) incapaz de utilizar PA (Fig. 10), por lo que se concluyó que el metabolismo del PA hasta benzoil-CoA debería implicar una serie de genes auxiliares adicionales a los genes catabólicos. 1.1. Identificación del primer transportador tipo TAXI-TRAP implicado en el transporte del PA La comparación de los distintos clusters pht que codifican la ruta periférica de PA, tanto en bacterias anaerobias facultativas (β-proteobacterias desnitrificantes), e.g., cepas de los géneros Azoarcus/ Aromatoleum/Thauera, como en bacterias anaerobias estrictas (δ-proteobacterias reductoras de sulfato), e.g., Desulfobacula toluolica (Geiger et al., 2019; Boll et al., 2019), revela que al lado de los correspondientes genes catabólicos se localizan dos genes adicionales, denominados en esta tesis phtTa and phtTb (Fig. 8), que presuntamente codifican un sistema de transporte activo tipo TRAP para la incorporación de PA al interior celular. Además, no muy alejados de los genes catabólicos pht, en algunos genomas, como el de A. aromaticum EbN1, se localizan otros genes que podrían codificar un trasportador de tipo ABC (GenBank: CR555308.1). La más que probable necesidad de un transporte activo del PA muy probablemente se deba a la naturaleza polar de esta molécula aromática con dos grupos carboxilos que dificultan la difusión de este compuesto a través de la membrana. En este sentido, ya se ha descrito la necesidad de un transporte activo de PA para su metabolismo aeróbico en bacterias tales como diferentes cepas de Burkholderia, e.g., los transportadores monocomponente OphD and MopB de la superfamilia MFS, y el transportador OphFGH de tipo ABC (Saint y Romas, 1996; Chang et al., 2009); y Rhodococcus, e.g., el transportador PatDABC de tipo ABC (Hara et al., 2010). Para confirmar experimentalmente la necesidad de un transporte activo del PA durante su degradación anaeróbica por bacterias desnitrificantes se realizaron ensayos de transporte de evansii. Dichos ensayos revelaron una clara inducción del transporte de 14 C-PA con células de A. 14 C-PA cuando las células se 139 Discusión cultivaban anaeróbicamente en PA pero no cuando procedían de cultivos crecidos en presencia de benzoato (Fig. 12). Además, la inhibición del transporte cuando se empleaba un inhibidor específico de la fuerza protónmotriz, e.g., DNP, y no cuando se utilizaba un inhibidor específico de la ATPasa, e.g. DCCD (Fig. 12), permitía concluir que se trataba de un transporte activo e independiente de ATP. Estos resultados indicaban que el transportador de PA en la ruta anaeróbica era un transportador secundario dependiente de la fuerza protónmotriz, lo cual estaba de acuerdo con la función asignada a los productos génicos PhtTa-PhtTb. La clonación de los genes phtTaTb en el plásmido pIZPHT (contiene los genes catabólicos phtSaSb-phtDaDb) generó la cassette pht (plásmido pIZPHTRAP) la cual confirió crecimiento anaeróbico en PA a Azoarcus sp. CIB (Fig. 14), y confirmó el papel esencial de los genes phtTaTb en el metabolismo anaeróbico del PA en bacterias desnitrificantes. La demostración experimental de que los genes phtTaTb codifican un transportador activo de PA dependiente de la fuerza protón-motriz se obtuvo confirmando la ausencia de transporte de 14C-PA en Azoarcus sp. CIB portador del plásmido pIZPHT (carente de los genes phtT), y la existencia de dicho transporte en células de Azoarcus sp. CIB (pIZPHTRAP) cuando los ensayos se realizaban en ausencia de DNP (Fig. 15B). Además, el transportador fue capaz de reconocer los isómeros isoftalato y tereftalato, aunque con menor eficiencia que el PA (Fig. 15B). Todos estos resultados permiten concluir que PhtTaTb constituye el primer transportador de PA que se caracteriza en el metabolismo anaeróbico de este aromático. En este sentido, se había discutido en la literatura que la activación inicial de los ácidos aromáticos a sus correspondientes ésteres de CoA por la actividad de la aril-CoA ligasas podría ser un mecanismo que facilitase la entrada y acumulación de dichos compuestos en el citoplasma celular (Fuchs, 2008; Carmona et al., 2009), lo cual podría hacer dispensables a los sistemas clásicos de transporte en el metabolismo anaeróbico de los compuestos aromáticos. Por lo tanto, el trabajo presentado en esta tesis demuestra por primera vez la necesidad de sistemas de transporte activo también para el metabolismo anaeróbico de los compuestos aromáticos. Los genes phtTa y phtTb codifican la proteína integral de membrana citoplásmica y la proteína periplásmica de unión a sustrato (SBP) del transportador, respectivamente. El análisis detallado de la comparación de la estructura primaria de PhtTb (326 aa) con la de otras proteínas similares presentes en las bases de datos revela una muy alta identidad (96%) con PhtTb (PA01_RS0095) de Azoarcus sp. PA01 (Junghare et al., 2016) y una relativamente alta identidad con sus ortólogos PhtTb de A. toluclasticus (82%) y T. clorobenzoica (81%) (Ebenau-Jehle et al., 2017) (Fig. 46). Fuera del grupo de las β-proteobacterias, también se observa una significativa identidad de secuencia (en torno al 45-50%) con presuntas SBPs de miembros de los géneros Halomonas y Marinobacterium (γ-proteobacterias), y Tistlia y Zhengella (α-proteobacteria), las cuales están codificadas en clusters génicos muy probablemente implicados en el metabolismo aeróbico del PA vía protocatecuato. Con una identidad del 28% se encuentra la SBP (OpaL) del presunto transportador identificado en el clúster de degradación aeróbica del PA vía 2,3-dihidroxibenzoato en la cepa Pseudomonas sp. strain PTH10 (Kasai et al., 2019) (Fig. 5). Todas estas SBP de reconocimiento de PA se agrupan filogenéticamente fuera del grupo de las SBPs de la familia TRAP y dentro de la familia TAXI-TRAP, cuyo prototipo es la SBP TTHA115 (TT1099) de Thermus thermophilus HB8 (26,7% identidad con PhtTb) que se ha predicho implicada en el transporte de L-glutamato o L-glutamina (Takahashi et al., 2004). Los transportadores de la familia TAXI-TRAP, muy frecuentes en arqueas, se caracterizan por presentar SBPs 140 Discusión diferentes a las de los transportadores TRAP, y una única proteína integral de membrana correspondiente a la fusión de la subunidad grande (DctM) y pequeña (DctQ) de las proteínas de membrana de los transportadores TRAP (Mulligan et al., 2011; Rosa et al., 2018). De acuerdo con estas características generales de los TAXITRAP, la proteína PhtTa (657 aa) contiene 15 presuntos dominios transmembrana, 10 de los cuales se localizan en el extremo N-terminal y serían equivalentes a la subunidad DctM, 4 se localizan en el extremo C-terminal y serían equivalentes a la subunidad DctQ, y el dominio adicional estaría implicado en la fusión de las regiones N- y C-terminal. Dado que hasta la fecha no se había demostrado la función biológica de ningún transportador de la familia TAXI-TRAP, el trabajo presentado en esta tesis permite concluir que PhtTaTb es el primer TAXITRAP que se describe de función conocida. Finalmente, merece la pena destacar que el transportador PhtTaTb caracterizado en esta tesis incrementa aún más la ya conocida diversidad de mecanismos de transporte de los ftalatos al citoplasma bacteriano, sumándose a los transportadores monocomponente de la superfamilia MFS, e.g. OphD y MopB (Saint y Romas, 1996; Chang et al., 2009), y a los transportadores multicomponente dependientes de SBP tales como los de las familias ABC (e.g., OphFGH, PatDABC) (Chang et al., 2009) y TTT (TpiABTphC, TpiABIphC) (Hosaka et al., 2013) (Fig. 50). Figura 50. Árbol filogenético de la proteína de unión a sustrato (SBP) de diferentes transportadores primarios (tipo ABC) y secundarios (tipo TRAP-, TAXI-TRAP, TTT-) de compuestos aromáticos. El alineamiento múltiple de las diferentes proteínas y el árbol filogenético resultante se realizó como se detalla en el apartado 13 de Materiales y métodos. La barra representa 0,1 sustituciones por aminoácido. Se indican los nombres de las proteínas, los códigos GenBank y el nombre del microorganismo que alberga la proteína correspondiente. El sustrato de cada sistema transportador también se indica entre paréntesis. El prototipo SBP de los transportadores TRAP, TTT y TAXI-TRAP se muestra en negrita. Entre los transportadores TAXI-TRAP (en azul), la proteína PhtTb de A. aromaticum EbN1 estudiada en este trabajo se indica con una flecha. En sombreado naranja se muestran las proteínas similares a PhtTb codificadas en los clusters pht; En sombreado amarillo se muestran las proteínas PhtTb codificadas en los clusters presuntamente implicados en la degradación aeróbica de PA vía protocatecuato. 1.2. La ruta pht permite el catabolismo aeróbico del PA en bacterias con una ruta box funcional 141 Discusión Durante el desarrollo de la presente tesis doctoral se planteó la hipótesis de que la ruta pht no fuese estrictamente anaeróbica puesto que los experimentos realizados en Azoarcus sp. PA01 indicaban que las enzimas SPT y PDC decarboxilasa mantenían su actividad en presencia de oxígeno (Junghare et al., 2016); sin embargo, esta bacteria no era capaz de metabolizar el PA aeróbicamente puesto que carecía de las enzimas necesarias para degradar el benzoail-CoA (ruta box) generado por la ruta periférica pht. En este sentido la cepa Azoarcus sp. CIB (pIZPHTRAP) representaba una oportunidad única para comprobar si la ruta pht era funcional en condiciones aeróbicas puesto que estaba descrito que es capaz de metabolizar el benzoato en presencia de oxígeno vía benzoil-CoA a través de la ruta box (Valderrama et al., 2012). En el Resultado 1.5 se demostró que la cepa Azoarcus sp. CIB (pIZPHTRAP) era capaz de crecer en PA como única fuente de carbono en condiciones aeróbicas, además la inducción de los genes box en estas condiciones confirmaba que el metabolismo aeróbico del PA se producía vía benzoil-CoA a través de la ruta box (Fig. 16B). Puesto que este resultado contradecía el hecho de que la PDC descarboxilasa purificada de T. chlorobenzoica 3CB-1 se inhibía en presencia de oxígeno (Mergelsberg et al., 2017); se decidió eliminar la PDC de la cassette pht generando la cepa Azoarcus sp. CIB (pIZPHTRAPΔPDC). En la figura 18 se demuestra que esta cepa fue incapaz de crecer en presencia de PA tanto en condiciones aeróbicas como anaeróbicas descartando así la hipótesis de que en el genoma de Azoarcus sp. CIB pudiese haber otra enzima capaz de suplir la función de la PDC de A. aromaticum EbN1 de la cassette pht, siendo esta por tanto la enzima responsable de descarboxilar el o-ftaloil-CoA a benzoil-CoA tanto en ausencia como en presencia de oxígeno. Una posible explicación para comprender estos resultados es que la PDC descarboxilasa sea en efecto sensible al oxígeno, pero en el interior celular puede estar protegida de alguna forma, envuelta en membranas citoplasmáticas o rodeada de enzimas que utilicen el oxígeno como cofactor, de manera que la concentración de oxígeno a la que está expuesta sea inferior a aquella que le causa la perdida de sus capacidades enzimáticas, circunstancia que no ocurre al purificarla, lo cual provoca su inactivación. En cualquier caso, los resultados aquí presentados revelan una nueva función para la ruta pht como una ruta periférica alternativa para la degradación aeróbica de PA. Las rutas aeróbicas clásicas se basan en dioxigenasas de hidroxilación en anillo que requieren altas tensiones de oxígeno que pueden convertirse rápidamente en limitantes en muchos ecosistemas naturales o cuando las bacterias crecen en las superficies formando biopelículas (Boll et al., 2019). Además de su papel en la degradación anaeróbica de PA, la ruta pht podría constituir una adquisición evolutiva para la degradación de este compuesto aromático por bacterias que viven en entornos en los que se enfrentan limitaciones de oxígeno, y que dependen de benzoil-CoA en lugar de intermediarios centrales catecólicos para el catabolismo aeróbico de compuestos aromáticos. Por último, se ha demostrado la funcionalidad de la cassette pht en bacterias desnitrificantes fuera de los géneros Azoarcus/Aromatoleum/Thauera, puesto que la cepa C. necator H16 (pIZPHTRAP) fue capaz de metabolizar el PA en condiciones aeróbicas (Resultado 1.6). El hecho de que las cepas C. pinatubonensis JMP134 (pIZPHTRAP) y P. putida KT2440 (pIZPHTRAP) fuesen incapaces de degradar el PA descartaba la hipótesis de que hubiese alguna enzima tiolesterasa o CoA-transferasa presente en estas bacterias que las permitiese transformar el benzoil-CoA, generado en la ruta pht, en benzoato, el cual sería posteriormente metabolizado por la ruta clásica ben/cat. Hasta la fecha solo se ha caracterizado una única benzoil-CoA 142 Discusión tioesterasa perteneciente a la bacteria A. evansii (Ismail, 2008), y tanto C. necator H16, C. pinatubonensis JMP134 como P. putida KT2440 carecen de proteínas similares a esta. Como se comentó anteriormente, P. putida KT2440 carece de los genes box (Nelson et al., 2002), mientras que C. pinatubonensis JMP134 a pesar de tener un cluster box (Lykidis et al., 2010), se ha demostrado que no codifica para una ruta box funcional puesto que no permite el crecimiento en benzoato al mutante en la ruta ben/cat JMP134ΔbenA (Donoso et al., 2011), probablemente porque es un cluster incompleto al carecer del gen boxD. Estos resultados en conjunto sugerían a su vez que la cepa C. necator H16 (pIZPHTRAP) probablemente metabolizase el PA a través de una ruta box funcional como en el caso de Azoarcus sp. CIB, y no a través de la ruta ben/cat; hecho que se demostró al observar la inducción de los genes box mediante experimentos de qRT-PCR (Fig. 19B) cuando esta cepa se cultivaba en presencia de PA, siendo por tanto ésta la primera vez que se demuestra la expresión de la ruta box funcional en un microorganismo perteneciente al género Cupriavidus. Mientras que la ruta clásica ben/cat de degradación del benzoato se ha estudiado ampliamente en una amplia variedad de bacterias, la ruta híbrida aeróbica (ruta box) se ha caracterizado más recientemente (Gescher et al., 2002, 2005, 2006). Aunque los estudios realizados in silico sugieren que los genes box se encuentran diseminados entre las α, β y algunas δ proteobacterias (Valderrama et al., 2012; Suvorova y Gelfand, 2019), solo existen unos casos descritos en los que demuestren una ruta box activa en ciertas cepas de Azoarcus (Gescher et al., 2002; Valderrama et al., 2012), Comamonas (Chen et al., 2014), Burkholderia (Denef et al., 2006) o Thauera (Schühle et al., 2001). Los resultados aquí presentados con las cepas de Cupriavidus revelan que el cassette pht es una herramienta genética interesante puesto que puede ser utilizada para detectar rutas box funcionales en bacterias. Por otra parte, estos resultados pueden aportar información adicional para tratar de descifrar el papel fisiológico de los genes box presentes en microorganismos aeróbicos que están a su vez dotados de las rutas clásicas de degradación de benzoato (genes ben-cat). En general, se cree que en estos microorganismos las rutas box están preferentemente activas cuando las células metabolizan benzoato en condiciones de tensión de oxígeno reducidas (transición a la fase estacionaria) o cuando la ruta principal ben está mutada (Denef et al., 2004, 2006). Los resultados obtenidos en la presente tesis doctoral podrían indicar que las rutas box pueden formar parte de un mecanismo de adaptación cuando las células se enfrentan a la presencia de benzoil-CoA generado por el metabolismo endógeno de ciertos sustratos y/o por la adquisición de rutas periféricas heterólogas, por ejemplo, los genes pht, que también conducen a la formación de este derivado de CoA. En este sentido, la ubicación natural de los genes pht en plásmidos o en regiones cromosómicas flanqueadas por transposasas y repeticiones invertidas (Ebenau-Jehle et al., 2017; Boll et al., 2019;), podría facilitar su transferencia horizontal y la propagación de la capacidad de degradación del PA entre las bacterias receptoras que albergan una ruta box funcional. 1.3. La cassette pht como herramienta biotecnológica para la revalorización del PA Los polihidroxialcanoatos (PHAs) son poliésteres naturales que pueden ser utilizados como bioplásticos biodegradables (Anderson y Dawes, 1990), y dadas sus características biocompatibles los convierte en un material adecuado para ciertas aplicaciones médicas (Brigham y Sinskey, 2012). 143 Discusión C. necator H16 es un modelo de producción de polihidroxibutirato (PHB) (Pohlmann et al., 2006; Reinecke y Steinbüchel, 2009), que es el biopolímero de PHA más común, pudiendo acumular entre el 80% y 90% de su peso seco en forma de este polímero en función de la fuente de carbono y en condiciones de limitación de nitrógeno. Esta bacteria es capaz de producir PHB a partir de distintos sustratos como azucares simples o triacilgliceroles (Jiang et al., 2016), los cuales a su vez pueden provenir de residuos industriales. La conversión de aceites vegetales (Budde et al., 2011) o grasas animales (Riedel et al., 2015) en bioplásticos es una estrategia para disminuir la contaminación, mejorar la eficiencia de la industria revalorizando estos residuos y contribuyendo a generar una economía circular más respetuosa con el medio ambiente. Esta estrategia de revalorización se ha intentado aplicar con otro tipo de sustratos más complejos de degradar, como son los hidrocarburos aromáticos o polímeros plásticos (Jiang et al., 2016) o los derivados aromáticos provenientes de la lignina (Tomizawa et al., 2014). Sin embargo, hay pocos ejemplos de bacterias que puedan utilizar este tipo de sustratos aromáticos para la producción de PHAs: C. necator es capaz de utilizar el 3-hidroxibenzoato y el 4-hidroxibenzoato produciendo un 63-65% de su peso seco en PHB; ciertas bacterias pertenecientes al género Pseudomonas que pueden acumular PHAs a partir de hidrocarburos aromáticos (Tobin y O’Connor, 2005; Ni et al., 2010) o del tereftalato derivado de la pirolisis del tereftalato (Kenny et al., 2008), produciendo entre 14-26% de su peso seco en PHAs de diversa composición; y por último fuera del género Pseudomonas, Rhodococcus aetherivorans IAR1 capaz de producir poli (3-hidroxibutiratoco-3-hidroxivalerato) (PHBV) a partir de tolueno llegando a acumular hasta un 30% de su peso seco de este compuesto (Hori et al., 2009), y A. aromaticum que es capaz de metabolizar el etilbenceno y el tolueno, acumulando en el proceso entre un 5-10% de su peso seco en PHB (Trautwein et al., 2008). Como se ha descrito anteriormente la cepa C. necator pIZPHTRAP fue capaz de metabolizar el PA en condiciones aeróbicas, además el metabolismo de este sustrato aromático le permitió a esta bacteria acumular en su interior reservas de polihidroxibutirato (PHB), hasta un 8,2% de su peso seco (Resultado 1.8). Hasta la fecha no se ha descrito ninguna bacteria capaz de producir PHB a partir de PA, por lo que la cepa recombinante C. necator pIZPHTRAP representa una oportunidad de revalorizar los residuos procedentes de la industria plástica (esteres de ftalato), mediante la producción de bioplásticos a partir de ellos. 2. Caracterización de la ruta bad en la cepa Azoarcus sp. CIB El metabolismo anaeróbico del CHC se ha estudiado en detalle en dos microorganismos, R. palustris (Hirakawa et al., 2015) y G. metallireducens (Kung et al., 2014), y en ambos casos las rutas de degradación convergen con la ruta central de degradación anaeróbica del benzoato (Harwood et al., 1998; Pelletier y Harwood, 1998, 2000; Kung et al., 2009, 2014). Previo al desarrollo de esta tesis doctoral se habían identificado, dada la similitud de secuencia que presentan con los genes bad de R. palustris, los genes que codifican las enzimas que podrían estar involucradas en el metabolismo del CHC en la cepa Azoarcus sp. CIB (Martín-Moldes et al., 2015). De esta forma, en Azoarcus sp. CIB el metabolismo anaeróbico del CHC ocurriría a través de la ruta bad mientras que el metabolismo anaeróbico del benzoato tiene lugar a través de la ruta bzd previamente caracterizada (Barragán et al., 2004). Los experimentos genéticos presentados en esta 144 Discusión tesis, i.e., estudios de inducción de los genes bzd y bad, y la construcción del mutante Azoarcus sp. CIBΔbadHI incapaz de utilizar CHC como fuente de carbono, confirman que el metabolismo anaeróbico del benzoato y CHC en Azoarcus sp. CIB tiene lugar a través de dos rutas independientes, i.e., la ruta bzd y la ruta bad, respectivamente, que no son sustitutorias en el caso de bloqueo de alguna de ellas. Azoarcus sp. CIB, representa, por lo tanto, un nuevo paradigma de bacteria en la que la degradación anaeróbica del sustrato alicíclico (CHC) y aromático (benzoato) ocurre a través de dos rutas metabólicas independientes. Sin embargo, la inactivación del producto del gen bzdW en la cepa Azoarcus sp. CIBΔbzdW sí puede ser complementada con la actividad del producto del gen mbdW (Fig. 24), lo que sugiere que la co-existencia de la ruta bzd para el metabolismo del benzoato (Barragán et al., 2004) y la ruta mbd para el metabolismo del 3-metilbenzoato (Juárez et al., 2013) constituye un mecanismo de robustez metabólica para la cepa CIB, que puede conservar una degradación eficiente de benzoato a pesar de tener bloqueada alguna de las etapas enzimáticas de la ruta bzd específica para dicha degradación. Los resultados de crecimiento celular (Fig. 26) y expresión génica (Fig. 27) presentados en esta tesis demuestran que la ruta bad de Azoarcus sp. CIB es funcional tanto en condiciones aeróbicas como anaeróbicas, lo que está de acuerdo con las observaciones previas realizadas en R. palustris (Hirakawa et al., 2015). La ruta bad constituye, por lo tanto, una estrategia aeróbica/anaeróbica de degradación de CHC. La ruta conocida de degradación aeróbica del CHC genera 4-hidroxibenzoato y está catalizada por una monooxigenasa y una oxidasa (Kaneda, 1974; Smith y Callely, 1975; Blakley, 1978; Taylor y Trudgill, 1978). La ruta bad constituye, por lo tanto, una nueva estrategia de degradación aeróbica de CHC que no implica las rutas aeróbicas clásicas que generan 4-hidroxibenzoato/protocatecuato, los cuales son finalmente degradados a través de la ruta central del beta-cetoadipato. Estas observaciones están de acuerdo con los análisis in silico realizados en esta tesis que revelan la presencia de clusters bad en genomas de bacterias que no son anaerobias, e indican que la capacidad de degradar CHC a través de la ruta bad es más común de lo que se había supuesto en un principio. Los estudios realizados en esta tesis sobre la regulación del cluster bad de Azoarcus sp. CIB revelaron la existencia de tres unidades transcripcionales, i.e., los dos operones catabólicos divergentes aliAbadK y aliBbadHbadI, y el gen regulador badR (Fig. 29). El gen badR codifica un regulador transcripcional de la familia MarR que muestra 49% identidad de secuencia con el regulador ortólogo del cluster bad de R. palustris (BadRRp) (Egland y Harwood, 1999; Hirakawa et al., 2015). Al igual que BadRRp, el regulador BadR de la cepa CIB es un represor transcripcional que reconoce la caja operadora CAATN2ATTG presente en los promotores catabólicos regulados. Sin embargo, mientras que la caja operadora de BadRRp se localiza entre las cajas -35 y -10 del gen badR y solapando con el sitio de inicio de la transcripción (+1) del gen badI (Hirakawa et al., 2015), en Azoarcus sp. CIB existen dos cajas operadoras en la región intergénica entre los genes divergentes aliA y aliB, en ambos casos solapando parcialmente con las respectivas cajas -35 de los correspondientes promotores. La posición de la caja operadora BadR en el promotor PaliB está de acuerdo con el papel represor observado para esta proteína sobre la actividad de dicho promotor (Fig. 30). Los experimentos de retardo en gel (Fig. 36) demostraron que la especificidad de BadR se debe fundamentalmente a los dos primeros nucleótidos de las regiones palindrómicas así como la distancia de separación entre dichas regiones, la cual no puede ser inferior a 2 nucleótidos ni exceder los 4. 145 Discusión Estudios genéticos in vivo utilizando la fusión PaliB::lacZ han revelado que el regulador BadR no reconoce al CHC como molécula efectora capaz de inducir la actividad del promotor catabólico. La desrepresión de BadR sobre PaliB solo se observó cuando las células, creciendo en presencia de CHC, expresaban la presunta CoA ligasa (AliA) capaz de activar CHC a CHC-CoA (Fig. 33), indicando que el primer intermediario de la ruta actúa como inductor de la expresión de los genes catabólicos. Este resultado contrasta con el descrito en R. palustris, en donde experimentos de retardo en gel demostraron que el inductor del cluster bad es el último intermediario de la ruta, i.e., 2-cetociclohexano-1-carboxil–CoA (Hirakawa et al., 2015), si bien no se ensayaron otros posibles intermediarios tales como el CHC-CoA. Por tanto, los resultados presentados en esta tesis permiten concluir que el CHC-CoA es un inductor de los genes bad, aunque no se pueda descartar que otros derivados CoA intermediarios de la ruta puedan ser reconocidos por BadR y funcionar también como inductores. En este sentido, cabe mencionar que la CoA ligasa AliA de la cepa CIB también parece reconocer y activar el benzoato a benzoil-CoA, al igual que se observó con la enzima ortóloga AliA de R. palustris (Samanta y Harwood, 2005), el cual es capaz de activar al promotor PaliB aunque con significativa menor eficiencia que el CHC-CoA (Fig. 33A). No obstante, el ligero efecto inductor del benzoilCoA sobre la actividad de PaliB observado en E. coli no parece tener un reflejo biológico en Azoacus sp. CIB ya que los genes bad no se ven inducidos cuando la cepa CIB se cultiva en benzoato y, por tanto, genera benzoil-CoA (Fig. 27). La construcción de una cassette bad recombinante portadora de los genes catabólicos aliABbadHIK bajo el control heterólogo de la pareja reguladora LacIQ/Ptac, y su expresión en la cepa E. coli ΔbioH confirmó que dichos genes son necesarios y suficientes para la conversión de CHC en pimelil-CoA (Fig. 39). Una cassette sintética similar basada en los genes bad de R. palustris y su aplicación para la biosíntesis de biotina en E. coli ya se había descrito anteriormente (Bernstein et al., 2008). Sin embargo, la cassette bad construida en esta tesis se ha clonado y expresado en un plásmido derivado de pIZ1016 y, por tanto, capaz de replicar en un elevado número de bacterias gram-negativas, lo que permite su utilización no solo en E. coli sino en otras bacterias de interés industrial y/o medioambiental, ampliando así su utilidad como una herramienta genética de interés para distintas aplicaciones biotecnológicas. Así, la cassette bad (plásmido pIZBad) se ha utilizado para expandir la capacidad de mineralizar CHC a bacterias incapaces de degradar este contaminante (ver más adelante). La posibilidad de transferir la cassette bad a bacterias altamente productoras de biotina, como Pseudomonas mutabilis ATCC31014 (la cual se ha modificado genéticamente para convertirse en el organismo más eficiente en la producción de biotina, llegando a los 271.88 mg/L (Xiao et al., 2019), podría incrementar aún más los niveles de producción de esta vitamina a partir del pimelil-CoA generado al suministrar CHC a los cultivos. La biotina, también conocida como vitamina B7 o vitamina H, es un cofactor esencial y universal para una gran variedad de reacciones de carboxilación tanto en arqueas, bacterias como plantas, hongos y animales (Beckett, 2007; Tong, 2013). Tiene una gran relevancia desde el punto de vista industrial puesto que se usa como componente en la industria cosmética, farmacéutica, alimentaria y ganadera, produciéndose a nivel mundial entre 10 y 30 toneladas con un valor de varios cientos de millones de dolares (Shaw et al., 1999; Streit y Entcheva, 2003). Actualmente, la mayor parte de la biotina comercial se sintetiza a través de un proceso químico que incluye varias etapas derivado del proceso originalmente desarrollado por Goldberg y Sternbach 146 Discusión (1949. Synthesis of Biotin, US2489235), lo que supone un alto coste energético y la producción de enormes cantidades de residuos químicos. Debido a las desventajas que plantea esta forma de producción industrial de biotina, sobre todo desde el punto de vista medioambiental, se han intentado desarrollar nuevas estrategias de síntesis de este cofactor utilizando un enfoque biotecnológico mediante el uso de distintos microorganismos genéticamente modificados sobreproductores de biotina, entre los que se incluyen: E. coli, Bacillus subtilis, Bacillus sphaericus, Serratia marcescens, Kurthia sp., o Agrobacterium/Rhizobium (Streit y Entcheva, 2003). La validación experimental de la utilidad del plásmido pIZBad para incrementar la producción de biotina a partir del pimelil-CoA generado al suministrar CHC a organismos de interés industrial será objeto de trabajo futuro. 3. Estudio de la ruta baja de β-oxidación del pimelil-CoA en la cepa Azoarcus sp. CIB: el catabolón del pimelil-CoA El pimelil-CoA es un compuesto intermediario central en el que convergen distintas rutas metabólicas (catabolón del pimelil-CoA) tales como las implicadas en: i) la ω-oxidación de ciertos ácidos grasos (Kusunose et al., 1964), ii) la oxidación de algunos alcanos (Kester y Foster, 1963) y cicloalcanos, e.g. tetralina (LópezSánchez et al., 2010), iii) la degradación del ciclohexanocarboxilato (Blakley, 1978); iv) la degradación anaeróbica de compuestos monoaromáticos, como el benzoato y otros compuestos aromáticos que generan benzoil-CoA en su degradación (Harwood y Gibson, 1997) o poliaromáticos como el naftaleno (Weyrauch et al., 2017); v) la degradación de ciertos ácidos grasos dicarboxílicos de número impar de átomos de carbono como el pimelato (u otros de más de 7 C), que se encuentra de forma natural en el medio ambiente derivados de materia vegetal como la suberina (Bernards y Razem, 2001) o formando parte de los aceites de las semillas de las plantas (Harrison y Harwood, 2005). La capacidad de algunas bacterias, como Pseudomonas fluorescens, para degradar ácidos dicarboxílicos mediante una serie de enzimas inducibles que generan derivados de CoA se conoce desde finales de la década de los 60 (Hoet y Stanier, 1970). Sin embargo, no fue hasta mediados de la década de los 90 cuando se propuso una ruta de β-oxidación para el metabolismo del pimelato hasta glutaril-CoA (Gallus y Schink, 1994; Harrison y Harwood, 2005). Hasta la fecha esta ruta no ha podido ser corroborada experimentalmente en bacterias, tan solo se ha caracterizado la pimelil-CoA ligasa para la activación del pimelico (Gallus y Schink, 1994). Una de las principales razones que explican el escaso conocimiento que existe sobre las rutas de β-oxidación de pimelato en bacterias es la redundancia génica encontrada en la mayor parte de los genomas disponibles. Así, por ejemplo, en R. palustris se han identificado hasta 160 genes que podrían estar involucrados en la β-oxidación de ácidos grasos y ácidos dicarboxílicos, y se han descrito varios clusters de genes pim todos ellos presuntamente implicados en la degradación de pimelato (Harrison y Harwood, 2005). En esta tesis se ha profundizado en la identificación y estudio de los determinantes genéticos del catabolón del pimelil-CoA en bacterias. Como se ha indicado en la Introducción, al comienzo de la presente Tesis doctoral se conocía que la cepa Azoarcus sp. CIB era capaz de metabolizar el pimelato (Martín-Moldes et al., 2015) y el CHC (Blázquez et al., 2008) tanto aeróbica como anaeróbicamente, y que además era capaz 147 Discusión de utilizar el benzoato y otros compuestos aromáticos que generan benzoil-CoA (e.g. tolueno, fenilacetato, Tyr, p-hidroxibenzoato, etc.), en condiciones anaeróbicas (Barragán et al., 2004). Sin embargo, se desconocían los genes implicados en el metabolismo del pimelil-CoA, o 3-hidroxipimelil-CoA, que se generaba al metabolizar todos estos sustratos alifáticos, alicíclicos y aromáticos hasta glutaril-CoA (ruta baja). Para tratar de identificar estos genes, se procedió inicialmente a analizar en detalle el genoma de la cepa CIB (buscando ortólogos de los genes pim de R. palustris) y se detectaron dos posibles clusters génicos (aab y pim) que podrían codificar las enzimas encargadas de la β-oxidación del pimelil-CoA, generando 3-hidroxipimelil-CoA como intermediario y produciendo glutaril-CoA como metabolito final. 3.1. Estudio del cluster aab que codifica la ruta baja de degradación de benzoato y CHC El cluster aab (cluster de β-oxidación I) se induce específicamente cuando Azoarcus sp. CIB se cultiva anaeróbicamente en benzoato o cuando se cultiva en CHC (tanto en presencia como en ausencia de oxígeno) (Fig. 41 y 42), y confiere crecimiento en CHC cuando se combina con la ruta bad y se expresa en bacterias incapaces de metabolizar este sustrato alicíclico, e.g. P. putida (Fig. 44). Todos estos resultados permiten concluir que el cluster aab codifica las enzimas implicadas en la ruta baja del metabolismo anaeróbico del benzoato y del metabolismo (aeróbico/anaeróbico) del CHC en Azoarcus sp. CIB. Además, el hecho de que el mutante AzCIB_1938 fuese capaz de utilizar benzoato y CHC se corresponde con lo observado previamente en otras bacterias como R. palustris en las que la inactivación de un cluster de β-oxidación se compensaba con la expresión de otros clusters de β-oxidación alternativos (Harrison y Harwood, 2005). La relación funcional entre el cluster bad y el cluster aab tiene un claro reflejo en la localización genómica adyacente de ambos agrupamientos génicos. En la literatura se han descrito otros casos en el que los genes de la ruta central del metabolismo de un compuesto aromático o alicíclico forman un cluster con los genes de la ruta baja. Así por ejemplo, es el caso del cluster thn cuyos genes codifican las enzimas implicadas en la degradación de la tetralina (1,2,3,4-tetrahidronaftaleno) en Sphingomonas macrogolitabida TFA, incluyendo aquellas para la degradación del pimelato generado como intermediario en el metabolismo de este compuesto formado por un anillo aromático y otro alicíclico (López-Sánchez et al., 2010). En el cluster mbd del propio Azoarcus sp. CIB, también se encuentran localizados los genes presuntamente implicados en la ruta baja para la degradación del ácido dicarboxílico (metil-hidroxipimelil-CoA) que se genera en la ruta central del 3-metilbenzoil-CoA incluyendo una supuesta (metil)-glutaril-CoA deshidrogenasa (Juárez et al., 2013). Una agrupación genómica bad-aab similar a la descrita en Azoarcus sp. CIB también se observa en los genomas de otras bacterias de los géneros Aromatoleum, Azoarcus y Thauera. En el caso concreto de T. phenolivorans, entre los genes que separan a los ortólogos de AzCIB_1942 y AzCIB_1937-AzCIB_1939, se localiza el gen gcdH, lo que refleja un nivel superior de agrupamiento génico que incluye también a los determinantes genéticos encargados del metabolismo del glutaril-CoA generado en la ruta baja. Sin embargo, en otras bacterias portadoras del cluster bad, éste no se encuentra asociado físicamente a un cluster aab. La ruta central del CHC (ruta bad) genera pimelil-CoA, por lo que atendiendo a la ruta de β-oxidación propuesta (Gallus y Schink, 1994), sería necesario la inducción de los cuatro genes del cluster aab, i.e., 148 Discusión AzCIB_1942 y AzCIB_1939-AzCIB_1937, para la conversión de dicho pimelil-CoA en glutaril-CoA. Sin embargo, el metabolismo anaeróbico del benzoato genera directamente 3-hidroxipimelil-CoA, para cuya degradación solo serían necesarias las enzimas codificadas por los genes AzCIB_1938 y AzCIB_1937 (Fig. 42). Cuando se analiza la expresión de los genes aab en la cepa CIB cultivada en benzoato o en CHC, se observa que en CHC están inducidos los 4 genes catabólicos, mientras que en benzoato el gen AzCIB_1942 no se expresa, lo que está de acuerdo con la función predicha para cada uno de estos genes y con la necesidad de expresar el gen AzCIB_1942 solo en presencia de CHC (Fig. 42).La expresión del gen AzCIB_1939 en benzoato, un sustrato cuya degradación no necesita a priori el producto génico AzCIB_1939, se explicaría porque forma parte de una unidad transcripcional junto con los genes AzCIB_1938 y AzCIB_1937 (Fig. 42), los cuales sí son necesarios para la degradación del 3-hidroxipimelil-CoA generado por la ruta central bzd. Un estudio más detallado de la expresión del gen AzCIB_1942 reveló que éste realmente forma parte del cluster bad ya que se co-transcribe con los genes aliB, badH y badI los cuales solo se expresan en presencia de CHC (Fig. 42). Por tanto, el cluster aab estaría formado básicamente por los genes AzCIB_1937-AzCIB_1939, los cuales forman una unidad transcripcional inducible en presencia de CHC y de benzoato (en condiciones anaeróbicas). Actualmente se desconoce el mecanismo de regulación de estos tres genes, aunque se sabe que son inducibles puesto que no se están expresando en presencia de pimelato. Aunque el gen regulador más cercano es badR, es poco probable que este represor de la familia MarR esté regulando la expresión génica del operón aab ya que: I) la región promotora del gen AzCIB_1939 carece de una caja operadora BadR, II) estos genes se encuentran inducidos en benzoato anaeróbico y en esas condiciones no se genera el inductor (CHCCoA) de BadR. Por otro lado, es poco probable que el inductor del operón aab sea uno de los intermediarios de la ruta, como el 3-hidroxipimelil-CoA, puesto que en ese caso este cluster también estaría inducido en presencia de pimelato, ya que su ruta de β-oxidación genera los mismos intermediarios que la ruta aab. Dado que ortólogos de los genes aab se encuentran en genomas de bacterias que no son capaces de degradar anaeróbicamente benzoato (carecen del cluster bzd), y que el cluster aab se localiza adyacente al cluster bad en bacterias que poseen un cluster bzd, e.g. A. aromaticum EbN1, Azoarcus sp. DN11, Azoarcus sp. KH32C,T. phenolivorans, etc.; se podría concluir que el cluster aab ha evolucionado para la degradación de CHC pero que también ha sido reclutado por la ruta bzd en organismos que degradan anaeróbicamente compuestos aromáticos por la ruta del benzoil-CoA. No obstante, también se ha detectado órtologos de los genes AzCIB_1937-AzCIB_1939 en bacterias que no son capaces de degradar ni benzoato, ni CHC ni pimelato, como es el caso de A. communis. Esta observación sugiere que las bacterias han ido adquiriendo clusters de genes implicados en procesos de β-oxidación de ácidos dicarboxílicos, y sus derivados, generados en el metabolismo de compuestos naturales o en el reciclado de los lípidos de membrana, y que en algunas bacterias, como es el caso de Azoarcus sp. CIB, han ido evolucionando y especializándose (al menos en lo que se refiere al control de su expresión génica) para la degradación de intermediarios generados en el catabolismo de ácidos aromáticos y alicíclicos (e.g. cluster aab) o de ácidos dicarboxílicos alifáticos (e.g. cluster pim). 3.2. Estudio del cluster pim que codifica la ruta de degradación de pimelato 149 Discusión El cluster pim (clúster de β-oxidación II) se induce específicamente cuando Azoarcus sp. CIB se cultiva anaeróbicamente en pimelato (tanto en presencia como en ausencia de oxígeno) (Fig. 45), y confiere crecimiento en este compuesto alifático cuando se expresa en bacterias incapaces de metabolizarlo, e.g. P. putida (Fig. 46B). Estos resultados permiten concluir que el cluster pim codifica las enzimas implicadas en la ruta baja del metabolismo (aeróbico/anaeróbico) del pimelato en Azoarcus sp. CIB. A diferencia del cluster aab, en el que solo se localizan los genes que codifican las actividades enzimáticas encargadas de la transformación del pimelil-CoA a glutaril-CoA, en el clúster pim se encuentran además los genes que codifican un transportador de pimelato de tipo MFS (AzCIB_2911), una pimelato CoA transferasa (AzCIB_2917) que activará el pimelato a pimelil-CoA, un sistema Etf flavoproteína (AzCIB_2909 y AzCIB_2910), y un regulador transcripcional perteneciente a la familia IclR (AzCIB_2913) que supuestamente controlará la expresión de los genes pim. Por lo tanto, el cluster pim de la cepa CIB se asemeja más a los otros clusters de metabolismo de ácidos dicarboxílicos descritos en la literatura. El cluster dca de Acinetobacter baylyi ADP1 (Parke et al., 2001) y los ortólogos en B. abortus y P. aeruginosa PAO1 (Herrou et al., 2018) presentan también estos tres genes, mientras que los clusters pim de R. palustris y Bradyrhizobium japonicum presentan un gen que codifica una CoA ligasa (pimA), un sistema de transporte tipo ABC que podría estar involucrado en el transporte de los ácidos dicarboxílicos, y mantienen el gen regulador tipo IclR (Harrison y Harwood, 2005). Puesto que el primer paso de la β-oxidación del pimelato es su transformación a pimelil-CoA, parece lógico que la enzima que cataliza ese proceso (una acil-CoA transferasa o una acil-CoA ligasa) esté codificada dentro del cluster (Parke et al., 2001; Harrison y Harwood, 2005; Herrou et al., 2018). Hasta la fecha, la enzima que activa el pimelato mejor caracterizada es la CoA ligasa PimA de R. palustris, la cual presenta un amplio rango de sustratos puesto que es capaz de activar tanto ácidos grasos como ácidos dicarboxílicos, curiosamente el pimelato es uno de los sustratos sobre los que tiene una menor actividad (Harrison y Harwood, 2005). En el cluster thn de la degradación de tetralina en S. macrogolitabida se encuentra el gen thnH, el cual codifica una CoA transferasa que activa el pimelato (generado en el catabolismo de la tetralina) a pimelil-CoA (LópezSánchez et al., 2010). Además, el trabajo presentado sugiere que la expresión de un sistema Etf que acople la regeneración del cofactor FAD necesario para la actividad de las acil-CoA deshidrogenasas es una nueva estrategia a tener en cuenta para mejorar el rendimiento de ciertas rutas metabólicas en las que participan dichas enzimas. Como se ha comentado anteriormente la presencia de un gen regulador que codifica una proteína de la familia IclR parece ser una constante en los clusters de degradación de ácidos dicarboxílicos, incluido el cluster pim de Azoarcus sp. CIB, siendo el represor BaaR de B. abortus el único caracterizado hasta el momento (Herrou et al., 2018). La caja operadora de BaaR está formada por dos secuencias palindrómicas (IBS1 e IBS2) ricas en A y T localizadas en la región intergénica entre dos operones divergentes, el del propio gen baaR y el del gen bab2_0216. En el caso de Azoarcus sp. CIB, el cluster pim también parece estar formado por 2 operones divergentes y en la región intergénica entre ambos, que incluye la propia región promotora del gen AzCIB_2913, también existen regiones ricas en A/T. En esta tesis se demuestra que los genes pim de Azoarcus sp. CIB son inducibles puesto que se expresan en presencia de pimelato, mientras que en presencia de benzoato o CHC permanecen silentes. Dado que las rutas de β-oxidación codificadas por los clusters aab y 150 Discusión pim comparten los mismos intermediarios, parecería lógico asumir que el sustrato inicial, i.e., pimelato, es el inductor del cluster pim. Sin embargo, atendiendo a lo descrito para el represor BaaR, el cual presenta una identidad del 51% con la proteína codificada por el gen AzCIB_2913, los ácidos adípico, ε-aminocaproico, tetradecanoico y la ε-caprolactona son capaces de desreprimir el sistema in vivo, pero estas moléculas no interaccionan directamente con el represor en ensayos de retardo en gel (Herrou et al., 2018). Por lo tanto, no es evidente que el pimelato sea capaz de interaccionar directamente con el regulador IclR de Azoarcus. sp CIB y serán necesarios estudios futuros para dilucidar el mecanismo de regulación del cluster pim de Azoarcus sp. CIB. El hecho de que la cepa Azoarcus ΔAzCIB_1938 fuese capaz de metabolizar el CHC y el benzoato mediante la inducción de los genes pim (Fig. 39D), indica que el cluster pim puede complementar al cluster aab cuando se produce un bloqueo en esta ruta de β-oxidación, sugiriendo cambios adaptativos en la regulación del cluster pim. Este resultado concuerda con lo descrito previamente en la literatura puesto que mutaciones en los genes dca en Acinetobacter baylyi ADP1 (Parke et al., 2001), en los genes pim en R. palustris (Harrison y Harwood, 2005) o en los genes thn implicados en la ruta baja del metabolismo de la tetralina en S. macrogolitabida (López-Sánchez et al., 2010), no impiden que estos microorganismos mantengan la capacidad de metabolizar ácidos dicarboxílicos. En conclusión, estos resultados demuestran la gran robustez metabólica que presentan las bacterias, incluida Azoarcus sp. CIB, en el metabolismo oxidativo de este tipo de ácidos dicarboxílicos. Por último, como se ha descrito anteriormente, la presencia de genes que codifican presuntos transportadores tipo MFS es habitual en otros clusters implicados en el metabolismo de ácidos dicarboxílicos, e.g. genes dcaK, mucK, y bab2_0213 en A. baylyi ADP1 (Parke et al., 2001; Herrou et al., 2018) P. aeruginosa PAO1 (Herrou et al., 2018) y B. abortus (Herrou et al., 2018), respectivamente. Sin embargo, tan solo en este último caso se ha demostrado experimentalmente que la proteína Bab2_0213 es un transportador MFS implicado en el transporte del ácido adípico, pero no es capaz de incorporar el ε-aminocaproico, el tetradecanoico o la ε-caprolactona. En esta tesis se demuestra que el gen AzCIB_2911 es esencial para el crecimiento en pimelato (Fig. 46), lo que sugiere fuertemente que codifica un transportador tipo MFS implicado en la incorporación de pimelato al interior celular, siendo el primer transportador de pimelato descrito hasta la fecha en la literatura. El hecho de que este transportador sea imprescindible para el metabolismo eficiente de este acido dicarboxílico no es de extrañar, puesto que ya se había demostrado que el pimelato, al igual que ocurre con otros ácidos dicarboxílicos, no es capaz de atravesar la membrana interna bacteriana, aunque la bacteria Bacillus sphaericus es capaz de incorporarlo únicamente por difusión pasiva pero de manera muy poco eficiente (Ploux et al., 1992). 3.3. Diseño de cassettes catabólicas para la degradación de CHC y pimelato. El estudio de los clusters de β-oxidación de ácidos dicarboxílicos y sus derivados de Azoarcus sp. CIB ha permitido el desarrollo de cassettes de DNA recombinantes que constituyen herramientas genéticas de 151 Discusión interés biotecnológico para expandir la capacidad de metabolizar CHC y pimelato a bacterias incapaces de degradar estos compuestos de forma natural. La combinación de los genes bad junto con el cluster aab permitió el desarrollo de la primera herramienta molecular descrita en la literatura, el plásmido pIZBadβ1, que incluía todos los genes necesarios para la transformación del CHC en glutaril-CoA, permitiendo el crecimiento en este sustrato alicíclico a bacterias que de forma natural no pueden utilizarlo como única fuente de carbono y energía, tales como P. putida KT2440, A. baylyi ADP1, B. xenovorans y A. communis (Fig. 44B). De igual forma, el estudio del cluster pim de Azoarcus sp. CIB facilitó el desarrollo de las primeras cassettes recombinantes, plásmidos pIZPim1 y pIZPim2, que permiten el metabolismo del pimelato a bacterias que de forma natural no pueden utilizar este sustrato dicarboxílico como única fuente de carbono y energía, como es el caso de P. putida KT2440 (Fig. 46). Además, el trabajo presentado sugiere que la expresión de un sistema Etf que acople la regeneración del cofactor FAD necesario para la actividad de las acil-CoA deshidrogenasas es una nueva estrategia a tener en cuenta para mejorar el rendimiento de aquellas rutas metabólicas en las que participan dichas enzimas. Dado que la degradación de CHC y de pimelato convergen en pimelil-CoA pero requieren etapas iniciales independientes, i.e., ruta bad para el CHC y CoA transferasa (AzCIB_2917)/transportador MFS (AzCIB_2911) para el pimelato, se diseñaron cassettes recombinantes híbridas capaces de metabolizar ambos sustratos. Para ello se combinaron los genes bad-aab-AzCIB_2917/2911 (plásmido pIZBad1-2917/11) (Fig. 47) y los genes bad-pim (plásmidos pIZBadPim1 y pIZBadPim2) (Fig. 48). Las cepas recombinantes constituyen los primeros biocatalizadores derivados de P. putida capaces de utilizar tanto CHC como pimelato como únicas fuentes de carbono y energía (Fig. 49), ampliando así el rango de sustratos que este microorganismo de interés industrial puede metabolizar y convertir en productos de valor añadido, tales como mcl-PHAs, cuando se cultive en las condiciones de fermentación adecuadas (limitación de nitrógeno, etc.). La construcción de las cassettes híbridas también ha permitido confirmar que los productos génicos aab y pim son intercambiables y catalizan reacciones similares cuando se expresan de forma heteróloga, lo que no ocurre de forma natural en Azoarcus sp. CIB en donde la regulación endógena impide la expresión simultánea de ambos clusters. Las cassettes recombinantes generadas en este trabajo son también de gran interés biotecnológico para el desarrollo de bioprocesos que conviertan compuestos contaminantes, como el CHC, en pimelil-CoA (cassette bad) y glutaril-CoA (cassettes bad-aab o bad-pim1), cuando se expresen en huéspedes adecuados capaces de acumularlos y secretarlos al medio en forma de ácidos pimélico y glutárico, respectivamente. Ambos ácidos son de interés biotecnológico para la síntesis de polímeros como el nailon (Turk et al., 2016). 152 Conclusiones Conclusiones Conclusiones 1. Los genes phtTb y phtTa codifican el primer transportador de o-ftalato tipo TAXI-TRAP descrito en la literatura, el cual es necesario para una biodegradación eficiente de este sustrato aromático a través de la ruta periférica pht. Por primera vez se demuestra la importancia del transporte en el metabolismo anaeróbico de compuestos aromáticos. 2. La ruta pht es también funcional en condiciones aeróbicas y requiere su acoplamiento a la ruta híbrida box para la completa mineralización del benzoil-CoA generado. La cassette pht ha permitido demostrar la funcionalidad de la ruta box en organismos modelo tales como Cupriavidus necator H16, permitiendo expandir las capacidades degradadoras de éstos frente al o-fatalo. 3. La cassette pht es una herramienta biotecnológica de gran relevancia puesto que permite revalorizar el oftalato derivado de los plásticos mediante su transformación en PHB, tal y como se demuestra en la cepa recombinante C. necator H16 (pIZPHTRAP). 4. La existencia de más de una ruta central para la degradación anaeróbica de compuestos aromáticos le confiere a Azoarcus sp. CIB una gran robustez metabólica. Así, la inactivación del gen bzdW en la ruta central del benzoil-CoA se suple con la expresión del gen mbdW, implicado en la degradación anaeróbica del 3-metilbenzoato. 5. Los genes bad codifican las enzimas necesarias para el metabolismo del compuesto alicíclico ciclohexano carboxilato tanto en condiciones aeróbicas como anaeróbicas en la cepa Azoarcus sp. CIB. A diferencia de lo descrito hasta la fecha en organismos fotótrofos o en anaerobios estrictos degradadores de compuestos aromáticos, la degradación de ciclohexano carboxilato en bacterias desnitrificantes no converge con la ruta central del benzoil-CoA (ruta bzd), y ninguna de estas rutas complementa funcionalmente la inactivación de la otra. 6. El cluster bad se organiza en dos operones catabólicos divergentes (aliAbadK y aliBbadHI) regulados por el represor transcripcional BadR (proteína de la familia MarR), que se une a la secuencia operadora “CAATNNATTG” presente en la región intergénica de los operones catabólicos. La presencia del primer intermediario de la ruta, CHC-CoA, provoca la liberación de BadR de su promotor diana y la consiguiente inducción de los genes bad. Un análisis mutacional de la caja operadora revela que los dos primeros nucleótidos del palíndromo, así como una distancia adecuada entre las dos mitades de éste, son esenciales para la interacción con BadR. 7. Los genes bad están presentes en distintos grupos de proteobacterias lo que sugiere que la capacidad para degradar ciclohexano carboxilato vía CHC-CoA está más extendida de lo que inicialmente se sospechaba. 155 Conclusiones Además, los clusters bad poseen una organización genética similar con la conservación del gen regulador badR y la caja operadora consenso “CAANNNANTG” situada en la región intergénica entre los operones divergentes, lo que sugiere una regulación transcripcional similar a la descrita en Rhodopseudomonas palustris y Azoarcus sp. CIB. 8. Azoarcus sp. CIB presenta dos clusters génicos para la degradación de ácidos dicarboxílicos alifáticos. El cluster aab codifica las enzimas necesarias para la β-oxidación del pimelil-CoA proveniente de la ruta bad o del 3-hidroxipimelil-CoA proveniente de la ruta central anaeróbica bzd. Por el contrario, el cluster pim codifica las enzimas implicadas en la b-oxidación de ácidos dicarboxílicos, e.g. pimelato, provenientes del medio extracelular. Aunque los genes aab y pim solo se inducen cuando la cepa CIB se cultiva en presencia de ciclohexano carboxilato/benzoato o pimelato, respectivamente, la inactivación de uno de ellos conlleva la aparición de células que expresan el cluster complementario. 9. Estudios genéticos revelan que el cluster pim codifica, además: i) el primer transportador tipo MFS (AzCIB_2911) que se describe para el transporte del pimelato, siendo esencial para el metabolismo de este ácido graso; y ii) un presunto sistema ETF (AzCIB_2909 y AzCIB_2910) que facilita el metabolismo de este sustrato alifático. 10. La construcción de cassettes recombinantes con los genes bad, para la producción de biotina en E. coli, o su combinación con los genes aab y los genes pim que codifican el transportador y la CoA transferasa que activa pimelato a pimelil-CoA, para la degradación de ciclohexano carboxilato y pimelato en P. putida, revela el potencial biotecnológico de los estudios realizados y abre las puertas al diseño de nuevas cassettes que permitan el desarrollo de biocatalizadores a la carta para la producción de nuevos bioplásticos y/o monómeros para la síntesis de biopolímeros con nuevas propiedades. 156 Conclusions Conclusions Conclusions 1. The phtTb and phtTa genes encode for the first TAXI-TRAP PA transporter described in literature. This transporter is necessary for the efficient biodegradation of this aromatic substrate through the peripheral pht pathway. It has been demonstrated for the first time the importance of transport in the anaerobic metabolism of aromatic compounds. 2. The pht pathway is also functional under aerobic conditions and requires its coupling to the hybrid box pathway for the complete mineralization of the generated benzoyl-CoA. The cassette pht has enabled us to demonstrate the functionality of the box pathway in model organisms such as Cupriavidus necator H16, allowing to widespread their degrading capacities over PA. 3. The pht cassette is a highly relevant biotechnological tool since it allows to valorize the PA derived from plastics through its transformation to PHB, as it is shown with the recombinant strain C. necator H16 (pIZPHTRAP). 4. The availability of more than one central pathway for the anaerobic degradation of aromatic compounds confers Azoarcus sp. CIB a great metabolic robustness. Thus, the inactivation of the bzdW gene in the central pathway of benzoyl-CoA is supplemented with the expression of the mbdW gene, that is involved in the anaerobic degradation of 3-methylbenzoate. 5. The bad genes encode the enzymes needed for the metabolism of the alicyclic compound CHC both under aerobic and anaerobic conditions by the Azoarcus sp. CIB strain. Unlike what it was described to date for phototroph organisms or strict anaerobic degraders of aromatic compounds, the degradation of CHC in denitrificant bacteria does not converge with the central pathway of benzoyl-CoA (bzd pathway), and none of these pathways functionally complements the inactivation of the other. 6. The bad cluster is organized in two divergent catabolic operons (aliAbadK and aliBbadHI), that are regulated by the transcriptional repressor BadR (a protein that belongs to the MarR family), that binds to the operator sequence “CAATNNATT”, which is present in the intergenic region of the catabolic operons. The presence of the first intermediate of the pathway, CHC-CoA, causes the release of BadR from its target promoter and the subsequent induction of the bad genes. A mutational analysis of the operator box reveals that the first two nucleotides of the palindrome, together with an adequate distance between the two halfs of it, are essential for the interaction with BadR. 7. The bad genes are present in diverse groups of proteobacteria. This suggests that the capacity to degrade CHC via CHC-CoA is more widespread than what is was initially thought. In addition, the bad clusters have a similar genetic organization, involving the conservation of the badR regulatory gene and the 159 Conclusions consensus operator box “CAANNNANTG”, that is located in the intergenic region between the divergent operons. This suggests a similar transcriptional regulation to that described for R. palustris and Azoarcus sp. CIB. 8. Azoarcus sp. CIB has two gene clusters for the degradation of aliphatic dicarboxylic acids. The aab cluster encodes the enzymes needed for the the b-oxidation of the pimeloyl-CoA from the bad pathway or the 3hydroxipimeloyl-CoA from the bzd anaerobic central pathway. Conversely, the pim cluster encodes the enzymes involved in the b-oxidation of dicarboxylic acids, e.g. pimelate, from the extracellular medium. Although the aab and pim genes are only induced when the CIB strain is grown in the presence of cyclohexane carboxylate/benzoate or pimelate, respectively, the inactivation of one of them causes the emergence of cells that express the complementary cluster. 9. Genetic studies reveal that the pim cluster encode, in addition: i) the first MFS transporter (AzCIB_2911) described for the transport of pimelate, that is essential for the metabolism of this fatty acid; and ii) a presumed ETF system (AzCIB_2909 and AzCIB_2910) that facilitates the metabolism of this aliphatic substrate. 10. The construction of recombinant cassettes bearing the bad genes, for the production of biotin in E. coli; or its combination with the aab and pim genes that encode the transporter and the CoA transferase that activates pimelate to pimeloyl-CoA, for the degradation of cyclohexane carboxylate and pimelate in P. putida, reveals the biotechnological potential of these studies and pave the way to design new cassettes that allow to develop customized biocatalysts for the production of new bioplastics and/or monomers for the synthesis of biopolymers with new properties. 160 Bibliografía Bibliografía Bibliografía Abraham, W.R., Nogales, B., Golyshin, P.N., Pieper, D.H., Timmis, K.N., 2002. Polychlorinated biphenyldegrading microbial communities in soils and sediments. Curr. Opin. Microbiol. 5, 246–253. Alegbeleye, O.O., Opeolu, B.O., Jackson, V.A., 2017. Polycyclic Aromatic Hydrocarbons: A Critical Review of Environmental Occurrence and Bioremediation. 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