Opzetten en optimaliseren van een qPCR
voor het kwantificeren van Salmonella
Geschreven door:
Sang Nguyen sang.nguyen@student.fontys.nl 4312279
Elle de Lepper e.delepper@student.fontys.nl 4275381
Datum experiment:
05-10-2021, 07-10-2021 & 12-10-2021
Ingeleverd op:
16-05-2022
Cursus:
Biomoleculaire Technieken
Docenten:
Malika Azhimi
Sandra van Och
Sander Kurvers
Door het inleveren van dit werkstuk verklaar ik dat het werkstuk eigen werk is en dat het vrij is van plagiaat.
Inhoudsopgave
1.
Inleiding ........................................................................................................................................... 1
2.
Materiaal en meetmethode ............................................................................................................ 2
2.1 DNA isolatie voor specificiteit controle ......................................................................................... 2
2.2 Isolatie van DNA met isolatiekit .................................................................................................... 2
2.3 qPCR programma........................................................................................................................... 2
3.
Resultaten........................................................................................................................................ 3
3.1 Opzetten qPCR voor de detectie en kwantificering van Salmonella ............................................. 3
3.2 Primer optimalisatie ...................................................................................................................... 5
4.
Discussie .......................................................................................................................................... 8
5.
Conclusie ......................................................................................................................................... 9
6.
Literatuur ....................................................................................................................................... 10
ii
1. Inleiding
Tijdens dit experiment wordt een kwantitatieve Real-Time PCR (qPCR) uitgevoerd die specifiek is voor
het hilA gen. Hierbij is het doel om de concentratie Salmonella DNA in een monster te bepalen.
Nadat de qPCR is afgerond wordt de qPCR geoptimaliseerd door naar de primerconcentratie te
kijken, zodat er betere resultaten verkregen worden. Er wordt een validatiemonster waarvan de
concentratie Salmonella DNA bekend is meegenomen om de qPCR mee te valideren. Verder wordt er
een negatieve controle van E. coli meegenomen, aangezien de qPCR specifiek is voor Salmonella zal
het resultaat met E. coli DNA negatief zijn. Er wordt ook een validatie monster meegenomen, hierbij
is de concentratie Salmonella DNA bekend, om de test te kunnen valideren. Als laatst wordt er ook
nog een watercontrole meegenomen, hierbij hoort er niks gemeten te worden, als dat wel zo is heeft
er contaminatie plaats gevonden.
Een quantative polymerase chain reaction (qPCR) is een amplificatietechniek die gebruikt kan
worden voor kwantificatie van DNA. Hierbij wordt er gebruik gemaakt van fluorescentie, een
voorbeeld hiervan is SYBR Green[1]. SYBR Green bindt tussen dubbelstrengs DNA en stuurt een
fluorescent signaal. Hiermee kan er bepaald worden dat er product gevormd is, maar niet specifiek
welk product. Doormiddel van probes is het mogelijk om te bepalen welk stuk DNA geamplificeerd is.
Gelabelde probes binden aan een specifiek stuk DNA en geven een signaal af als het DNA is omgezet.
Aan het einde van de qPCR, na 30-40 cycli, kunnen de samples verder geanalyseerd worden. Er kan
bijvoorbeeld een smeltcurve gemaakt worden. Doormiddel van een smeltcurve kan er achterhaald
worden of er aspecifieke producten gevormd zijn[2]. De PCR producten worden langzaam verhit,
hierdoor zal het DNA van dubbelstrengs naar enkelstrengs gaan, waardoor SYBR Green geen
fluorescent signaal meer afgeeft. Het fluorescente signaal wordt uitgezet tegen de temperatuur,
hieruit ontstaat de smeltcurve.
Als een qPCR uitgevoerd is kan hiervan de efficiëntie berekend worden. De efficiëntie (E) staat voor
de hoeveelheid template die wordt gekopieerd in één cyclus[3]. Het streven is een efficiëntie van
100%, wat wil zeggen dat tijdens elke cyclus van de qPCR de hoeveelheid van het monster DNA
verdubbelt. Bij de qPCR worden de drempelwaardes (Ct-waardes) van de verdunningen van de
monsters gemeten. Er wordt een grafiek gemaakt, waarbij de Ct-waardes op de y-as worden gezet
tegen de logaritmes van de concentraties op de x-as. Bij een efficiëntie van 100%, zal het
richtingscoëfficiënt gelijk zijn aan 3,33. Met het richtingscoëfficiënt kan de efficiëntie berekend
worden, hiervoor worden formule 1 en 2 gebruikt.
𝐸 = 10−1/𝑅𝐶
(1)
𝐸% = (𝐸 − 1) × 100
(2)
1
2. Materiaal en meetmethode
2.1 DNA isolatie voor specificiteit controle
Er werden 2 cupjes genomen, in beide cupjes werden er 50 50 µl nuclease vrij water ingedaan.
Daarna werd een bacterie kolonie gestipt aan de LB agar-plaat. Dit werd in 1 cupje gedaan.
Vervolgens werd een bacterie kolonie gestipt aan de voedingsbodem met E.coli. Dit werd in een
andere cupje gedaan. Beide cupjes werden voor 10 minuten gekookt en daarna afgekoeld op ijs.
Vervolgens werden beide cupjes gecentrifugeerd. Het supernatant van beide cupjes werd
overgebracht in 2 nieuwe cupjes.
2.2 Isolatie van DNA met isolatiekit
Er werd 3 mL van BHI-overnachtkweek gecentrifugeerd. Daarna werd er 100 µl TE buffer toegevoegd
aan het cupje. Vervolgens werd er 10 µl lysozyme aan dit cupje toegevoegd. Daarna werd er op 37
graden geïncubeerd. Na incubatie werd er 100 µl TL buffer en 20 µl Proteinase K solution aan dit
cupje toegevoegd. Vervolgens werd er weer geïncubeerd bij 55 graden Celsius voor 60 minuten. Na
incubatie werd er 5 5 µl RNase A toegevoegd. Vervolgens werd er gecentrifugeerd. Het supernatant
werd middels schudden overgebracht naar een nieuwe 1,5 mL microcentrifuge buis. Hierbij werd er
220 µl BL buffer toegevoegd. Vervolgens werd dit geïncubeerd op 65 graden Celsius. Na incubatie
werd er 220 µl 100% ethanol toegevoegd. Nadien werd er een HiBind DNA Mini Column toegevoegd
aan de 2 mL buis. De gehele sample werd aan deze HiBind DNA Mini Column toegevoegd. Naderhand
werd er gecentrifugeerd bij 10.000 rpm voor 1 minuut. Het filtraat werd mettertijd verwijderd en
overgebracht in een nieuwe 2 mL buis. Hierbij werd een nieuwe HiBind DNA mini column
toegevoegd. Ook werd hierbij 500 µl HBC buffer toegevoegd. Dit werd vervolgens gecentrifugeerd op
10.000 rpm voor 1 minuut. Het filtraat werd verwijderd. Aan de buis werd 700 µl DNA Wash buffer
toegevoegd. Hierna werd er weer gecentrifugeerd. Na centrifugatie werd het filtraat verwijderd en
opnieuw 700 µl Wash buffer toegevoegd. De lege HiBind DNA Mini Column werd op maximale
snelheid voor 2 minuten gecentrifugeerd. De kolom werd overgebracht naar een 1,5 mL cupje.
Hierbij werd 50 µl elutiebuffer (65%) toegevoegd. De elutiebuffer werd druppelsgewijs toegevoegd.
Dit werd nadien gecentrifugeerd. De eluaat werd opnieuw in de kolom toegevoegd en opnieuw
gecentrifgueerd. Na isolatie werd de concentratie gemeten middels de nanodrop.
2.3 qPCR programma
De cupjes werden in het real time PCR-apparaat gezet en met het onderstaande programma:
1. 5 minuten 94°C  2. 1 min 94 °C  3. 1 min 65 °C  fluerescentie meting  4. 1 min 72 °C.
Stap 2 t/m 4 werden 34x herhaald.  5. 20 minuten 72 °C
2
3. Resultaten
3.1 Opzetten qPCR voor de detectie en kwantificering van Salmonella
Tijdens het experiment is de concentratie van Salmonella DNA in de 100 oplossing bepaald middels
een nanophotometer. De resultaten die daaruit zijn gekomen zijn zichtbaar in figuur 1.
Figuur 1 Nanodrop resultaten
In figuur 1 is in grote witte cijfers de concentratie van DNA af te lezen, deze is 44,050 ng/µl.
Daaronder zijn de ratio’s A260/280 en A260/230 te zien, deze hebben te maken met de zuiverheid.
De ratio A260/280 is 1,847 en de ratio A260/230 is 1,622.
Er is in het experiment een qPCR uitgevoerd voor de detectie en kwantificering van Salmonella, in
figuur 2 is de amplificatiecurve die hieruit is gekomen weergegeven. Hierbij is er ook een smeltcurve
gemaakt deze is weergegeven in figuur 3. Naast deze figuren is er in tabel 5 een legenda zichtbaar,
waarin weergegeven staat waar de gekleurde lijnen in figuur 2 en 3 voor staan.
Kleur Cupje Inhoud
1
E.coli (neg.
Controle)
2
Salmonella (pos.
Controle)
3
Monster 100
4
Monster 10-1
5
Monster 10-2
6
Monster 10-3
7
Validatiemonster
8
Watercontrole
Figuur 2 Amplicatiecurve qPCR
3
Figuur 3 Smeltpunt qPCR
Doormiddel van figuur 2 en 3 zijn de Ct-waarden en de smeltpunten bepaald. Deze waarden zijn
weergegeven in tabel 6.
Tabel 6: Inhoud bijbehorende ct-waardes en smeltpunt
Cupje
1
2
3
4
5
6
7
8
Inhoud
E.coli
Salmonella
100
101
102
103
Validatiemonster
Watercontrole
Ct-waarde
n.v.t.
16,45
11,84
15,79
19,41
23,22
16,67
32,47
Smeltpunt
n.v.t.
n.v.t.
82.20
82.80
83.00
83.00
83.00
n.v.t.
Van alle cupjes zijn de concentraties DNA bepaald, deze zijn zichtbaar in tabel 7.
Tabel 7: Bijbehorende concentraties van elke cupje
Inhoud
E. coli
Salmonella
Monster 100
Monster 10-1
Monster 10-2
Monster 10-3
Validatiemonster
Watercontrole
Ctwaarde
n.v.t.
16,45
11,84
15,79
19,41
23,22
16,67
32,47
Concentratie
(pg/µl)
n.v.t.
44,05
4,405
0,4405
0,04405
-
LN(concentratie)
3,785325
1,48274
-0,819845
-3,12243
-
Er is een grafiek geplot met de Ct-waarden en de bijbehorende concentraties van de
verdunningsreeks. De grafiek die hieruit is geplot is zichtbaar in figuur 4.
4
Figuur 4 Ct-waardes en bijbehorende concentraties
De procentuele efficiëntie is bepaald doormiddel van de volgende formule:
%𝐸𝑓𝑓𝑖𝑐𝑖ë𝑛𝑡𝑖𝑒 = (𝐸 − 1) ∗ 100%
Hierbij is de gemiddelde Ct-waarde gebruikt, deze is 4,07. Hiermee kan de efficiëntie berekend
1
1
worden doormiddel van de volgende formule: 10𝐶𝑡−𝑤𝑎𝑎𝑟𝑑𝑒 . De formule invullen geeft: 104,07 = 1,76.
De efficiëntie is dus 1,76.
Hiermee kan de procentuele efficiëntie berekend worden. De formule invullen geeft: %𝐸 =
(1,76 − 1) ∗ 100% = 76,03%. De procentuele efficiëntie is dus 76,03%.
De concentratie van het validatiemonster is bepaald en berekend met behulp van Excel. Hieruit is
een concentratie van 2,40 pg/µl gekomen.
3.2 Primer optimalisatie
Er is in het experiment een qPCR uitgevoerd voor de detectie en kwantificering van Salmonella, nadat
deze uitgevoerd was is er naar de primerconcentratie gekeken. Er zijn verschillende
primerconcentraties gebruikt om te kijken wat dit met de efficiëntie doet. Hierbij is er een qPCR
amplificatiecurve gemaakt en deze is weergegeven in figuur 5. Hierbij is er ook een smeltcurve
gemaakt deze is weergegeven in figuur 6. Naast deze figuren is er in tabel 8 een legenda zichtbaar,
waarin weergegeven staat waar de gekleurde lijnen in figuur 5 en 6 voor staan.
5
In de onderstaande grafiek is de qPCR amplicatiecurve weergegeven:
Figuur 5: qPCR amplificatiecurve van primer optimalisatie
In tabel 8 is de inhoud per cupje weergegeven:
Tabel 1: Legenda figuur 5 en 6
Kleur
Cupje Inhoud
1
Monster 10-1 met primer
concentratie 100 nM
2
Monster 10-1 met primer
concentratie 500 nM
3
Monster 10-1 met primer
concentratie 750 nM
4
Monster 10-3 met primer
concentratie 100 nM
5
Monster 10-3 met primer
concentratie 500 nM
6
Monster 10-3 met primer
concentratie 750 nM
7
Watercontrole (primer
concentratie 500 nM)
8
Ethanolcontrole (primer
concentratie 500 nM)
6
In figuur 6 is de smeltcurve van de qPCR weergegeven:
Figuur 6: Smeltcurve van primer optimalisatie
Doormiddel van figuur 5 en 7 zijn de Ct-waarden en de smeltpunten bepaald van de monsters met de
verschillende primer concentraties. Deze waarden zijn weergegeven in tabel 9.
Tabel 2: Ct-waarden en smeltpunten primer optimalisatie
Cupje
Ct-waarde
Smeltpunt
1
19.41
82.00
2
17.11
82.00
3
16.16
82.50
4
30.07
81.50
5
n.v.t.
n.v.t.
6
26.18
82.00
7
n.v.t.
n.v.t.
8
n.v.t.
n.v.t.
7
4. Discussie
In figuur 2 is er zichtbaar dat er bij de watercontrole op het einde een kromme curve is. Dit wil
zeggen dat er dus wel DNA in de watercontrole zat en dat er dus contaminatie heeft plaatsgevonden,
een mogelijke wijze waarop dit is gebeurd is door aerosolen. Ook bij E. coli de negatieve controle is
er op het einde een kleine curve aanwezig, wat wil zeggen dat er Salmonella DNA aanwezig was. Dit
is vermoedelijk gekomen door aerosolen. Bij de positieve controle Salmonella is te zien dat de lijn
vroeg af vlakt. Dat deze lijn vroeg afvlakt komt door een handelingsfout. Er is 46 µl van de reactiemix
toegevoegd, hierdoor is er een verkeerde concentratie aan Salmonella en aan primers aanwezig.
Doordat de controles afwijken, mogen de resultaten als niet als betrouwbaar beschouwd worden.
Doormiddel van de nanophotometer is de concentratie van Salmonella DNA in de 100 oplossing
bepaald en daarnaast zijn de ratio’s A260/280 en A260/230 bepaald. Er is bepaald dat de
concentratie DNA 44,05 ng/µl is. Verder is er voor ratio A260/280 bepaald dat deze 1,847 is en voor
ratio A260/230 is bepaald dat deze 1,622 is. De A260/280 ratio van 1,847 geeft aan dat er puur DNA
van Salmonella aanwezig was. Als de A260/230 ratio lager is dan 1,8 wil dat zeggen dat er mogelijk
contaminatie heeft plaatsgevonden met producten die bij een golflengte van 230 nm absorberen. Er
is een ratio van 1,622 bepaald, wat wil zeggen dat er dus contaminatie heeft plaatsgevonden.\
De uiteindelijke Ct-waardes liggen hoger dan 3,32, dit wil zeggen dat de qPCR geen hoge efficiëntie
had. Een mogelijke oorzaak hiervoor is dat er geen optimale primer voor deze omstandigheden is
gebruikt. was. Verder is het mogelijk dat de reactieomstandigheden ook niet optimaal waren of dat
de concentratie reagentia in de PCR niet optimaal was. De hogere Ct-waardes geven aan dat de
aanwezigheid van het doelmonster minder was.
In figuur 5 is zichtbaar dat de lijn van cupje 2 niet omhoogkomt, wat wil zeggen dat er geen DNA
aanwezig was. Dit komt hoogstwaarschijnlijk doordat er een pipetteerfout is gemaakt en het monster
10-3 niet in het cupje is gepipetteerd.
Ook is in figuur 2 zichtbaar dat de lijnen van de monsters met een lage primer concentratie eerder
afvlakken. Dit wil zeggen dat de monsters met een hogere primer concentratie dus later afvlakken en
dus de effectiviteit hoger is bij een hogere primerconcentratie. De Ct-waardes lagen lager bij de
hogere concentratie, dit resulteert in een hogere aanwezigheid van het monster product en
efficiëntie.
8
5. Conclusie
Het doel van dit experiment was het opzetten van een qPCR die specifiek is voor het hilA gen die
Salmonella detecteert. Nadat de qPCR afgerond was, werd er naar de primerconcentratie gekeken
om de qPCR te optimaliseren. Doormiddel van dit experiment is er een concentratie Salmonella DNA
in het monster bepaald van 44,05 ng/µl. Verder is er uit de resultaten een Ct-waarde van hoger dan
3,32 gekomen, wat als gevolg een lagere efficiëntie heeft. De uiteindelijke Ct-waardes waren
gemiddeld 4,07, dit had een efficiëntie van 76,03%. De efficiëntie is dus lager dan de efficiëntie rond
de 100% die was verwacht. Daarnaast kan er geconcludeerd worden dat de Ct-waardes lager zijn bij
een hogere primerconcentratie, waardoor de efficiëntie hoger is.
9
6. Literatuur
[1]
I. M. Mackay, K. E. Arden, and A. Nitsche, “Real-time PCR in virology,” Nucleic Acids Res., vol.
30, no. 6, p. 1292, Mar. 2002, doi: 10.1093/NAR/30.6.1292.
[2]
“Interpreting melt curves: An indicator, not a diagnosis.”
[3]
D. Svec, A. Tichopad, V. Novosadova, M. W. Pfaffl, and M. Kubista, “How good is a PCR
efficiency estimate: Recommendations for precise and robust qPCR efficiency assessments,”
Biomol. Detect. Quantif., vol. 3, p. 9, Mar. 2015, doi: 10.1016/J.BDQ.2015.01.005.
10