Enzimologie speciala Biotehnologii industrial, an III 2022-2023 Inhibitia enzimatica- Determinarea activitatii enzimatice a LDH in prezenta oxalatului de potasiu. Inhibiţia activităţii enzimatice reprezintă micşorarea vitezei de reacţie ca urmare a prezenţei unui inhibitor – substanţă ce provoacă o scădere a activităţii enzimatice. Procesul de inhibiţie poate fi reversibil sau ireversibil. Inhibiţia reversibilă este caracterizată prin capacitatea de revenire la reacţie a unei enzime, după înlăturarea inhibitorului. În inhibiţia reversibilă se poate stabili un echilibru între enzimă şi inhibitor, definit ca o constantă de echilibru, care este o măsură a afinităţii enzimei pentru acel inhibitor. Eficienţa unui inhibitor este exprimată prin constanta de inhibiţie (Ki). ki [E] x [I] E+I EI de unde: Ki = k-i [EI] unde: E = enzima; I = inhibitorul; EI = complexul enzimă-inhibitor. Eficienţa unui inhibitor se poate exprima prin I50 şi respectiv prin pI50. Prin I50 se înţelege concentraţia inhibitorului care determină reducerea cu 50% a activităţii enzimatice. Logaritmul cu semn schimbat a lui I50 se numeşte pI50. Inhibiţia ireversibilă este caracterizată prin incapacitatea de revenire la reacţie a enzimei, după înlăturarea inhibitorului. În inhibiţia ireversibilă, gradul de inhibiţie este dependent de timp, activitatea enzimei neputând fi recuperată odată ce s-a instalat inhibiţia. Capacitatea inhibitorului este exprimată printr-o constantă de viteză, care determină fracţiunea enzimei inhibată într-o anumită perioadă de timp şi pentru o anumită concentraţie de inhibitor. De cele mai multe ori, inhibitorul ireversibil se leagă printr-o legătură covalentă de enzimă, formând un compus stabil şi inactiv ce nu mai poate fi îndepărtat uşor prin simpla dializă sau gel-filtrarea preparatului enzimatic. Principiul lucrarii: Se masoara viteza reactiei enzimatice la diferite concentratii de cofactor mentinandu-se constanta concentratia piruvatului, temperatura, concentratia enzimei, pH-ul, in prezenta si absenta inhibitorului (oxalatul de K, 0.5 mM). Enzimologie speciala Biotehnologii industrial, an III 2022-2023 Aparatură necesară: - spectrofotometru UV-VIS Reactivi necesari: Soluţii stoc: - tampon fosfat disodic, pH=7.5, 100 mM; NADH+H+, 10 mM???; piruvat, 10 mM; LDH (4.5 mg/ml) activitate 443 U/mg H20 1. Dozarea NADH Tehnica de lucru: - se etalonează transmisia 0 şi 100% faţă de apă distilată; - se alege lungimea de undă de 340 nm; - se prepară soluţiile de lucru pentru dozarea NADH prin diluarea concentraţiilor stoc. Soluţiile de lucru pentru dozarea NADH au următoarele concentraţii finale în cuva de reacţie: - H2O - tampon fosfat disodic, pH=7.5, 50 mM; - NADH (~1mM) - piruvat, 1 mM start 5µl LDH (nediluata) -se calculează volumul fiecărui reactant, astfel încât volumul total de reacţie să fie de 2000 μl - se introduc în cuvă volumele corespunzătoare din fiecare reactant cu excepţia LDH - se declanşează reacţia prin introducerea LDH în cuva de reacţie; - se urmăreşte modificarea absorbanta NADH la 340 nm, în urma formării de NAD+ timp de 1 minut - se notează cu A1, respectiv A2, valorile de absorbanta A1= A2= [NADH]= 2. Determinarea KM si vmax a LDH pentru NADH in absenta si prezenta oxalatului de K Tehnica de lucru: - se etalonează transmisia 0 şi 100% faţă de apă distilată; - se alege lungimea de undă de 340 nm; Enzimologie speciala Biotehnologii industrial, an III - 2022-2023 se prepară soluţiile de lucru pentru determinarea activităţii enzimatice a LDH prin diluarea concentraţiilor stoc. Soluţiile de lucru au următoarele concentraţii finale în cuva de reacţie: - tampon fosfat disodic, pH=7.5, 50 mM; - NADH (variabil) - piruvat, 1 mM - H2O Se pipeteaza solutiile in 5 eprubete, in duplicat dupa cum urmeaza: Nr. [S] eprubetelor (mM) 1 0.0050 2 0.0080 3 0.0100 4 0.0200 5 0.0400 1/ [S] Volumul de S (µl) H2O (µl) A ΔA/min v (U/mg) 103/v - se calculează volumul fiecărui reactant, astfel încât volumul total de reacţie să fie de 2000 μl - se introduc în cuvă volumele corespunzătoare din fiecare reactant cu excepţia LDH - se declanşează reacţia prin introducerea a 10 µl LDH (diluata 1000x) în cuva de reacţie; - se urmăreşte modificarea absorbantei timp de 1 minut; - se notează cu A1, respectiv A2, valorile de absorbanta care indică consumul de NADH timp de 1 minut, ca urmare a actvităţii LDH (pentru fiecare concentratie de substrat) -se determină activitatea enzimatică a LDH serice în unităţi de activitate enzimatică/ minut (U/mg) Experimentul se repeta in prezenta oxalatului de K- inhibitor al LDH Mod de calcul: - se determină ΔA/min care reprezintă consumul de NADH datorat activităţii LDH serice: Enzimologie speciala Biotehnologii industrial, an III 2022-2023 ΔA/min x Vt [U/mg] = εmM x d x Vp unde: U/ml = activitatea enzimatică a LDH serice - Vt= volumul total din cuva de reacţie exprimat în ml; - ε mM = coeficientul de extinctie milimolară a NADH+H+ la 340 nm; - d = lăţimea cuvei (1 cm); - se determina necunoscutele din tabel - se reprezinta grafic 1/ [S] fata de 1/v in prezenta si absenta oxalatului de K - se calculeaza Km si vmax in prezenta si absenta oxalatului de K - se determina tipul de inhibitie pe baza graficului si a valorilor constantelor michaeliene in prezenta si absenta inhibitorului.