Lezione 7/11/2019 Il microscopio (micron piccolo e skopein guardare) è uno strumento che consente di risolvere e ingrandire oggetti di piccole dimensioni per permetterne l'osservazione. MICROSCOPI OTTICI Consentono di risolvere e ingrandire oggetti di piccole dimensioni, la cui analisi si realizza nell'ambito dello spettro elettromagnetico della luce. Tutti i microscopi hanno struttura simile: condensatore, un sistema di lenti più o meno complesso e degli obiettivi. Tra le lenti degli obiettivi e quelle degli oculari possono essere inseriti dei diaframmi, dei prismi che hanno il compito di concentrare la luce in una direzione piuttosto che in un’altra, in periferia piuttosto che al centro). Utilizzano come sorgente per l’osservazione del preparato la luce e permettono di vedere un’immagine in 2D. Oggi in realtà non è più così perché molti strumenti nuovi hanno montate apparecchiature multifocus che permette di mettere a fuoco una determinata struttura con una determinata forma facendo scansioni a diverse altezze (tante foto) e ricostruisce le immagini ottenendo un’immagine completa e tridimensionale. Un esempio di microscopio con una tale capacità è lo STEREOMICROSCOPIO 1 Lezione 7/11/2019 ● STEREOMICROSCOPIO ↳ funziona come una grossa lente d’ingrandimento grazie alla quale riusciamo a vedere gli oggetti tridimensionalmente (visione 3D) e permette di vedere anche i dettagli. È trinoculare, ovvero presenta due oculari e un oculare fotografico per poter fare delle foto. Viene utilizzato per fare il prelievo di campioni o fare delle dissezioni di animali). Si può osservare tutto tranne le colture cellulari per cui è necessario uno strumento differente, ovvero l’INVERTOSCOPIO in cui la parte ottica (obiettivi e oculari) si trova sotto mentre il condensatore si trova sopra (Nel caso degli altri microscopi, le due componenti sono al contrario). Quando la luce colpisce lateralmente le cellule, questa crea un contrasto tale per cui posso riuscire a vedere le cellule vive (senza che siano colorate in alcun modo) e riesce a mettere in evidenza la forma di queste. La zona del nucleo è più spessa, quindi viene attraversato di meno dalla luce. STRUTTURE A CONFRONTO MICROSCOPIO NORMALE STEREOMICROSCOPIO Il condensatore rappresenta la sorgente da cui parte la luce. Il fascio di luce attraversa tre lenti: le due lenti degli obiettivi e la lente degli oculari. La prima delle lenti degli obiettivi fornisce un’immagine ingrandita ma rovesciata. Il fascio luminoso poi va a colpire l’altra lente che riproduce un’immagine ancora più ingrandita ma nel verso giusto (quindi restituisce l’immagine corretta). All’interno dell’obiettivo c’è una sola lente. Infatti non vi è un vero e proprio revolver con tutti gli obiettivi ma c'è una struttura circolare su cui sono montate le singole lenti per cui girando questa sorta di revolver sposto le lenti fino a 4x, 10x e non vado oltre il 40x. 2 Lezione 7/11/2019 Piccolo crostaceo osservato attraverso lo STEREOMICROSCOPIO. Questo esemplare ha dimensioni di circa 2mm (quindi è visibile ad occhio nudo) ma attraverso una osservazione allo STEREOMICROSCOPIO è possibile visualizzare i dettagli dell’animale. In questi caso l’immagine è ingrandita di circa 100 volte. 3 Lezione 7/11/2019 ● MICROSCOPIO FOTONICO IN CAMPO CHIARO Utilizza come fonte di energia la luce (luce bianca λ= 400-700 nm) e permette di visualizzare preparati a fresco (vetrini che si guarda sul momento e poi si eliminano) e preparati stabili (vetrini trattati che possono essere conservati per decenni). La luce è concentrata in un unico faccio per cui si illumina tutto il campione. Presenta diverse strutture: ❖ Tavolino traslatore : scorre lungo due assi grazie a una vite laterale ed è il luogo dove si poggia il vetrino per l’osservazione ❖ Vite macrometrica e micrometrica : sono delle viti che permettermi di mettere a fuoco il vetrino da osservare. Quella micrometrica serve per piccoli aggiustamenti, mentre quella macrometrica serve per aggiustamenti più ampi. ❖ Un CONDENSATORE con lente biconvessa che fa convogliare i raggi luminosi in un punto centrale (fuoco). Il fascio entra nell'obiettivo e illumina la lente riuscendo così ad ottenere un’immagine 4 Lezione 7/11/2019 ❖ OCULARI con lente con capacità 10x 0 12,5x ❖ Revolver : struttura costruita da obiettivi per ingrandire ulteriormente l’immagine ( es. 4x, 10x, 20x, 40x, 100x) ❖ OBIETTIVI con due lenti ❖ DIAFRAMMI che si allargano o si stringono per convogliare ulteriormente il fascio di luce e migliorare la qualità dell’immagine e anche il contrasto. 5 Lezione 7/11/2019 LIMITE INFERIORE DI VISIBILITÀ (ε) → distanza minima alla quale due determinati punti possono essere distinti da noi come punti separati. Se questa distanza si riduce vedrò i due punti come un unico punto. Quindi: - Se i due punti sono posti ad una distanza superiore o uguale a ε , i due punti si osserveranno come distinti. - Se i due punti sono posti ad una distanza inferiore a ε, i due cerchietti luminosi saranno più o meno sovrapposti; il nostro occhio non è in grado di distinguere i due punti che saranno pertanto osservati come se fossero un unico punto. α è l’angolo di convergenza della luce Il parametro opposto al limite inferiore di visibilità è il potere risolutivo (D). Esso è determinato dalla capacità di ingrandire le immagini. Il potere risolutivo è la capacità di poter distinguere due punti vicini. L’occhio umano ha un potere risolutivo fino ad un massimo di 0,2 mm (millimetri), ovvero è in grado di arrivare a distinguere due punti ad una distanza massima di 2 mm (se la distanza è inferiore, l’occhio umano vedrà un solo punto). Questo microscopio, invece, ha un potere risolutivo fino a 0,2 µm (micrometri, 1 µm = 10-6 m) grazie all’interposizione di lenti tra il mio occhio e l’oggetto da osservare. 6 Lezione 7/11/2019 Se la distanza fra due punti è maggiore o uguale al potere risolutivo dello strumento che stiamo utilizzando riesco a vedere due punti separati. Il potere risolutivo dello strumento di osservazione determina il livello di dettaglio contenuto nell’immagine. L’ingrandimento non determina un aumento di risoluzione delle immagini. Infatti aumentano le dimensioni ma non migliora la qualità. A causa dei fenomeni di diffrazione della luce, un punto al microscopio ottico non è visibile come tale ma come un cerchietto luminoso il cui diametro è uguale ad ε. OBIETTIVI A SECCO → sono gli obiettivi dall’1x al 60x. Hanno una lunghezza direttamente proporzionale al potere di ingrandimento per cui utilizzando obiettivi più potenti la lente frontale si avvicina al vetrino coprioggetto; ne consegue che una maggior quantità di raggi luminosi entrano nell’obiettivo facendo aumentare l’ampiezza dell’angolo α (tendente a 90°) e quindi senα aumenta tendendo ad 1. Ne consegue un aumento della AN e una 7 Lezione 7/11/2019 diminuzione di ε = limite inferiore di visibilità. Ogni mezzo ha il suo INDICE DI RIFRAZIONE, che è la capacità di deviare i raggi luminosi secondo un angolo più o meno pronunciato. L'indice di rifrazione dipende dalla densità del mezzo e dalle sue caratteristiche chimico-fisiche. L'INDICE DI RIFRAZIONE si identifica con la lettera "n". OBIETTIVI A OLIO → sul preparato viene messo un olio per immersione con indice di rifrazione uguale a quello del vetro che consente di aumentare l’apertura numerica rispetto a quella che si ha all’aria e quindi aumentare il potere di risoluzione. I raggi luminosi che non erano penetrati nell’obiettivo vengono convogliati nell’obiettivo. È il caso dell’obiettivo 100x che si avvicina così tanto al campione da non permettere la visione dell’immagine. L’olio quindi serve per aumentare la capacità di visualizzazione e così si può vedere l’immagine in modo nitido. Abbiamo capito quindi che più la capacità di ingrandimento dell’obiettivo è elevata più le dimensioni dell'obiettivo sono grandi perché la distanza fra le due lenti che stanno all’interno deve essere tale da permettere di convogliare il fascio luminoso e fare invertire l'immagine. In questa immagine visibile grazie ad un microscopio fotonico in campo chiaro possiamo trovare delle strutture particolari, gli spermatodesmi, in cui gli spermatozoi non si trovano da soli ma sono raggruppati. 8 Lezione 7/11/2019 ● MICROSCOPIO FOTONICO IN CAMPO SCURO Presenta una base scura e la luce viene deviata in modo da colpire il campione lateralmente, ottenendo così un’immagine da parte dei raggi riflessi. La ghiera viene girata in modo che la parte centrale viene oscurata e i raggi vengono deviati verso l’esterno. Quindi quella che ottengo è un’immagine nera nella quale si evidenziano con la luce i bordi dell’oggetto che stiamo andando ad osservare. È un metodo molto usato per guardare le cellule e per la fluorescenza. Troviamo nuovamente l’immagine degli spermatodesmi ma questa volta in campo scuro, un cui la luce riflessa “accarezza” la loro struttura. 9 Lezione 7/11/2019 ● MICROSCOPIO A CONTRASTO DI FASE Ho le stesse componenti strutturali ma la differenza con i precedenti microscopi sta nel fatto che prima del condensatore vi è un piccolo DIAFRAMMA DI FASE che fa sì che parte dei raggi luminosi vengono trasmessi in modo diretto e altri vengano rifratti. Questo mi permette di avere un’immagine quasi tridimensionale. Grazie al diaframma si può decidere la quantità di luce che può colpire il campione e quindi quanti raggi diffrare: più allargo il diaframma più luce do; più stringo il diaframma, meno raggi rifratti passano e più aumenta la profondità di campo, ovvero ottengo un’immagine che assomiglia a una tridimensionale. 10 Lezione 7/11/2019 ● MICROSCOPIO A CONTRASTO INTERFERENZIALE In questo microscopio sono presenti diversi prismi che danno un’immagine molto nitida e quasi tridimensionale. 11 Lezione 7/11/2019 ● MICROSCOPIO A LUCE POLARIZZATA Viene utilizzata luce polarizzata, cioè luce che vibra in un piano unico. Il microscopio presenta due dispositivi di polarizzazione: ● Polarizzatore, montato sotto al condensatore ● Analizzatore, posto tra obiettivo e oculare Sono due prismi che cambiano la direzione della luce e permette la visualizzazione di diverse zone. Entrambi permettono il passaggio soltanto di luce polarizzata in un solo piano. E’ possibile stabilire nella struttura che si esamina la presenza di zone isotrope e di zone anisotrope o birifrangenti. ● Si definiscono ANISOTROPI gli oggetti in cui l’indice di rifrazione e l’assorbimento della luce variano a seconda della direzione di provenienza della luce stessa; sono costituiti da molecole disposte in maniera ordinata (disomogenea). ES. bande di actina e tropomiosina ● Si definiscono ISOTROPI gli oggetti in cui l’indice di rifrazione e l’assorbimento della luce sono gli stessi per tutti gli assi di provenienza della luce; sono costituiti da molecole disposte in maniera disordinata (omogenea). ES. bande di miosina 12 Lezione 7/11/2019 ● MICROSCOPIO A FLUORESCENZA Il preparato viene illuminato con luce ultravioletta ad una determinata lunghezza d’onda e i suoi componenti vengono esaminati in base alla fluorescenza emessa. La sorgente luminosa è una lampada a vapori di mercurio che emette radiazioni ultraviolette (invisibili). Poiché il mercurio è pericoloso per la salute, oggi ormai si utilizzano i microscopi a laser. Come funziona? La lampada a fluorescenza emette lungo tutte le lunghezze d’onda. Se ad esempio la fluorescenza è con il verde, il filtro che si utilizza è quello che cattura tutte le lunghezze d’onda tranne quella del verde. Il filtro di sbarramento fa sì che tutte le lunghezze d’onda del verde passano, mentre tutte le altre vadano fuori. ESEMPIO 2 Se voglio avere una fluorescenza rossa, metto il filtro rosso e il filtro di sbarramento che faccia convogliare le diverse lunghezze d’onda del rosso ma scarti tutte le altre. Prima questi passaggi erano fatti manualmente, mentre oggi è tutto automatico. La fluorescenza è quella proprietà per cui particolari sostanze (molecole), dette FLUORESCENTI, colpite da luce ultravioletta (radiazione eccitante con lunghezza d’onda compresa tra 250 e 400 nm) vengono eccitate, cioè sono capaci di emanare in risposta un fascio di luce (luce di fluorescenza) dello spettro del visibile (qualsiasi lunghezza d’onda compresa tra 400 e 700 nm) (può essere gialla, blu, rossa, ecc.) e quindi maggiore o uguale a quella della luce di eccitazione. Per il rosso si usa la rodamina, per il verde la falloidina. Il blu viene usato per colorare i nuclei delle cellule perché sono presenti delle molecole intercalanti del DNA che una volta che si legano ad esso emettono fluorescenza blu. 13 Lezione 7/11/2019 Le sostanze possono essere dotate di: - Fluorescenza primaria (o naturale) : quando la fluorescenza viene emessa naturalmente (es. vitamina A, riboflavina, porfirine, clorofille, etc.). Alcuni organismi (es. lucciole e alcuni organismi acquatici) sono in grado di produrre molecole fluorescenti, altri invece riescono ad emettere molecole fluorescenti vivendo in simbiosi con batteri fluorescenti. - Fluorescenza secondaria (o artificiale) : quando la fluorescenza viene indotta artificialmente trattando il preparato con particolari sostanze fluorescenti dette FLUOROCROMI (es. acridina orange, Hoechst, fluoresceina, rodamina, giallo lucifero, etc.). La fluorescenza è un sistema antigene-anticorpo ovvero si ha in seguito a un legame specifico. Ad esempio se volessi trovare in una cellula la presenza dell’actina dovrei inserire nella cellula l’anticorpo, ovvero quella molecola che si legherà in modo specifico (in sostanza si tratta di un anti-actina). Una volta che abbiamo l'anticorpo si possono fare due cose: - O si lega l’anticorpo con il fluorocromo così che, una volta avvenuto il legame specifico, il legame stesso scatena la fluorescenza e io posso visualizzare la quantità di actina. (FLUORESCENZA DIRETTA) - Faccio sì che l'anticorpo si leghi all'antigene specifico e, una volta avvenuto il legame, il fluorocromo si leghi al complesso antigene-anticorpo. (FLUORESCENZA INDIRETTA) 14 Lezione 7/11/2019 La specificità della fluorescenza dipende dalla specificità del legame tra fluorocromo e sostanze tissutali Le immagini appaiono colorate su fondo scuro, mentre il colore della luce di fluorescenza dipende dal filtro di eccitazione e dal fluorocromo. La fluorescenza decade più o meno rapidamente (quenching) poiché le molecole eccitate per tornare allo stato fondamentale trasferiscono l’energia assorbita a molecole circostanti sotto forma di agitazione termica; poiché la luce accentua tale fenomeno, i preparati vengono allestiti in penombra, conservati e osservati al buio. Ogni molecola fluorescente ha un proprio: 1. Spettro di eccitazione: gamma di frequenze per cui essa si eccita; 2. Spettro di emissione Entrambi con un picco massimo. 15 Lezione 7/11/2019 ● MICROSCOPIO CONFOCALE 16 Lezione 7/11/2019 MICROSCOPI ELETTRONICI A differenza dei microscopi ottici, utilizzano come sorgente luminosa i fasci di elettroni. Per far sì che gli elettroni non si disperdano, tutti i microscopi elettronici funzionano sottovuoto. Distinguiamo due tipi di microscopi elettronici: a scansione e a trasmissione. Con quello a scansione arriviamo a un potere risolutivo intorno ai 5 nm (considerando che normalmente una buona scansione arriva 200.000 ingrandimenti). Con quello a trasmissione abbiamo un potere risolutivo di massimo 0,2-0,4 nm. ● MICROSCOPIO A TRASMISSIONE All’interno di un cannone sotto ALTO VUOTO un fascio di elettroni generato eccitando un filamento di tungsteno (si trova sospeso in alto) che viene accelerato (tensione di 50 KV) da un anodo raggiungendo una lunghezza d’onda = 0.005 nm e quindi un potere risolutivo D= 0.2 nm. Questi elettroni (detti ELETTRONI PRIMARI) emessi dal filamento e accelerati dall’anodo sono concentrati da una lente elettromagnetica (condensatore) sul retino dove si trova il campione. In realtà questi non sono gli elettroni che daranno l’immagine, ma sono gli elettroni secondari. Si ha una diffusione anelastica → L’interazione degli elettroni primari con gli atomi del preparato, provoca, in seguito al trasferimento di energia, l’espulsione degli elettroni di valenza che vengono denominati ELETTRONI SECONDARI (SE). Questi hanno le seguenti caratteristiche: ● Bassa energia (inferiore a 50 kV); ● Possibilità di emersione superficiale, per cui consentono di 17 Lezione 7/11/2019 acquisire informazioni di tipo morfologico dagli strati superficiali profondi non più di 10 nm. Troviamo anche la presenza di altro tipo di elettroni, gli ELETTRONI RETRODIFFUSI (o backscattered) (sono elettroni diffusi con un angolo di 90°), i quali si generano con la diffusione elastica in seguito all'incidenza degli elettroni primari sui nuclei dell'atomo bombardato. Sono elettroni ad alta energia (superiore a 50kV) e forniscono informazioni di tipo compositivo e morfologico delle zone comprese tra la superficie e la profondità di 10 μm. Le lenti obiettivo ed intermedia ingrandiscono l’oggetto, la cui immagine, ulteriormente ingrandita da una lente proiettiva, viene proiettata sullo schermo fluorescente, osservata attraverso una finestra per l’osservazione o impressionata su lastra fotografica. Oggi, invece, i microscopi vengono collegati al computer e grazie ad dei software è possibile analizzare il campione nel dettaglio e fare diverse foto tramite il programma stesso (Es. Microscopio elettronico a scansione della prof) Un'altra differenza rispetto agli anni precedenti sono le dimensioni, che oggi sono ridotte a una scatola di dimensioni molto ridotte. Prima erano molto grandi (addirittura quanto una scrivania) ed erano ancorati al pavimento per evitare le vibrazioni e gli spostamenti. 18 Lezione 7/11/2019 19 Lezione 7/11/2019 ● MICROSCOPIO A SCANSIONE 20 Lezione 7/11/2019 I microscopi elettronici di nuova generazione riescono a funzionare anche a basso vuoto, riducendo il numero di elettroni utilizzati e deviati più lateralmente. Questo fa sì che il campione possa essere osservato senza essere metallizzato. Questo è importante per studiare strutture delicate o esemplari unici. 21 Lezione 7/11/2019 22 Lezione 7/11/2019 23
