Bakterilerin metabolizması ve üretilmesi Bakterilerin üremesi Bakteriler, uygun koşullarda her 10-30 dakika içinde bölünerek sayılarını iki misli artırabilirler. Tek bir bakteri, 10-12 saat sonra sayıca milyonlara ulaşabilir. Bakteri üremesi Kromozom Plazma membranı Hücre duvarı Kromozom dublikasyonu Hücre büyümesi devamı Iki hücreye bölünme Kültür Mo yapay olarak üretilerek çoğaltılmaları Besiyeri Mo organizma dışında (in vitro ortam) üretildikleri ortamlar Koloni Katı besiyerinde üreyen tek bir mo’nın üreyerek oluşturduğu gözle görülebilir mo toplulukları Koloniler Bakteri kolonilerinin özelliği Bakteri kolonilerinin • büyüklüğü • biçimi • yapısı • rengi (pigment) • kokusu • hemolitik aktivitesi bakteri türlerinin ayırt ettirici özelliklerindendir. Bakteriyel üreme dönemi Logaritmik bakteri sayısı Logaritmik üreme dönemi Duraklama dönemi Bekleme dönemi Ortama adaptasyon SAAT Logaritmik azalma dönemi Bakteriyel üremenin dönemleri 1. 2. 3. 4. Lag - bekleme dönemi Logaritmik üreme dönemi Durgunluk dönemi Ölüm ya da azalma dönemi Bakterilerin üreme için gereksinimleri 1. Ortamlarda kimyasal maddeler gerekli karbon-C, azot-N, su, mineraller (S, P, Ca, Mg, Na, vb.), etkene göre özel maddeler (kuru ağırlıklarının %95’i) 2. Oksijen gereksinimi Zorunlu aerop (ancak O2 varlığında ürer ) Fakültatif anaerop (O2 yokluğunda/varlığında üreyebilir) Aerotoleran (O2 varlığını tolere edebilir) Mikroaerofilik (düşük O2 düzeyi gereksinir) Zorunlu anaerop (O2 varlığında yaşayamaz) 3. Isı - mezofil (25o - 40oC) 4. pH -genellikle nötral pH (6.5-7.5) karbon kaynakları karbonhidratlardır Besiyeri Üreme ortamlarında bulunması gerekenler 1. Karbon (C) 2. Azot (N) 3. Mineraller (S, P, Ca, Mg, Na, vb.) 4. Su (H20) 5. Ek bazı faktörler 6. Besiyerinin sterilizasyonu Oksijen (O2) ile ilişkilerine göre BAKTERİLER Aerop O2 varlığında üreyebilen bakteriler Anaerop O2 siz ortamda üreyebilen, O2 temas ettiklerinde üreme yetenekleri olmayan bakteriler Fakültatif anaerop Üreme ortamında O2 bulunup bulunmamasından etkilenmeyenler Mikroaerofil Düşük yoğunlukta O2 bulunan ortamda üreme özelliği olan bakteriler Tüpte sıvı besiyeri O2 O2 Hava % 21 O2 O2 O2 Bakterilerin Oksijen gereksinimi Zorunlu Aerop Fakültatif Anaerop Zorunlu Anaerop Aerotoleran anaerop Mikroaerofil pH Çoğu bakteri en iyi nötral pH’da (6.5-7.5) ürer sadece bazı organizmalar asit ortamda (< pH 4) da üreyebilmekte Acid-loving bacteria. Acidiphilium sp MO üretilmesi Kültür yöntemleri KÜLTÜR: Mikroorganizmaların • canlı ya da cansız besleyici ortamlarda üretilmesi, • uygun ısı ve atmosfer koşullarında çoğaltılması işlemidir. Kültür ortamları Canlı ortamlar Virüsler ve bazı bakteriler – – – Deney hayvanları Embriyonlu yumurta Hücre kültürleri Cansız ortamlar Bakteri ve mantarlar Besiyerleri • Birçok bakteri ve maya mantarı cansız ortamlarda (besiyerlerinde) 24-48 saat içinde üreyebilir. • Bazı bakteriler ve küf mantarları daha zengin besiyerlerinde ya da daha uzun sürelerde üreyebilir (Brucella, Mikobakteriler). • Virüsler ve bazı bakteriler (Chlamydia, Rickettsia) zorunlu hücre içi paraziti olduklarından sadece canlı ortamlarda üretilebilir. Cansız ortamlar Besiyerleri Besiyerleri • Bakterilerin üremeleri için gerekli enerji kaynakları değişik oranlarda, çeşitli maddeler halinde besiyerlerinin yapısında yer alır. • Et ekstraktı(et özeti), maya özeti, malt özeti (arpa), beyin ve kalp özetleri değişen oranlarda çeşitli besiyerlerinde kullanılır. • Na, K, Cl gibi çeşitli elektrolitler Besiyerleri • Mikrobiyal metabolizma sonucu oluşan PH değişiklikleri çeşitli belirleyiciler ile görünür hale gelir. • Kan besiyerini zenginleştirmek ve m.o’nın hemolitik aktivitesini belirlemek için eklenir. • Besiyerine m.o’nın gereksinim duyduğu, buna karşın diğerleri için inhibitör olan maddeler eklenir. • Biyokimyasal testler için üre, aminoasitler eklenir. Besiyerleri Agar Deniz yosunlarından elde edilen bir galaktoz polimeridir. 85°C → erir 40 °C → donar Sıvı halinde koyulduğu petri plaklarında bu ısıda donar. Besiyeri çeşitleri Fiziksel özelliklerine göre 1. Sıvı besiyeri Üreme tortu, zar oluşumu, bulanıklık veya renk değişimi şeklinde gözlenir 2. Yarı katı besiyeri Agar yoğunluğu % 0.05-0.5 Mikroaerofillerin üretilmesi Hareket 3. Katı besiyeri %2-3 agar Tüp-Petri Besiyeri çeşitleri Kimyasal özelliklerine göre Temel (basit) besiyerleri Genel üretim besiyerleridir. Sıklıkla buyyon veya (buyyon+agar ) jeloz kullanılır. Et suyu, pepton, tuz vb Zenginleştirilmiş besiyeri Kan, serum, glikoz vs. bol besleyici maddeler içerir. Seçici besiyerleri Üremesi istenmeyen mo baskılar. Ayırt edici besiyerleri Ayıraç ile belirli metabolik aktivitesi olan mo ayırabilir. İndikatör dediğimiz ayıraçlar içerirler Özgül besiyeri Belirli bir çeşit mo üretilmesinde kullanılır. 1. Temel (basit) besiyerleri Et suyu, pepton, tuz gibi maddelerden hazırlanır. Ör: buyyon Buyyon + Agar basit besiyeri- Jeloz besiyeri 2. Zenginleştirilmiş besiyerleri Temel + kan, serum, glikoz, yumurta Bazı bakteriler temel by’de üremeyip bunlarda ürerler Kanlı agar, Çikolata agar 3. Özel besiyerleri Güçlükle üreyen bazı mo için. Komplekstirler. 4. Seçici (selektif) besiyerleri Üretilmesi istenen bakteriyi baskılamadan diğer bakterilerin (ör: flora bakterileri) üremesini engelleyen özel besiyerleri. Mo’ların üremesini antibiyotikle engellerler. eosin metilen blue (EMB), selenit F, GN Agar 5. Ayırt edici besiyerleri Çeşitli indikatörler7 kimyasal maddelerle üreyen kolonilerin renklerine göre mo’ların tanımlanabildiği besiyerler. Ör: Endo Agar, Mac Conkey Agar 6. Özgül besiyerleri Yalnızca tek veya sınırlı sayıda mo üretilmesi için kullanılan by. Ör: Mycobacterium tuberculosis için Löwenstein Jensen by 7. Ayıraçlı besiyerleri Çeşitli indikatörler (bromtimol mavisi, fenol kırmızısı vb) ve kimyasal maddeler (Karnonhidrat, sitrat, üre vb) ile mo’ların biyokimyasal özelliklerinin belirlendiği besiyerleri Ör: TSİ agar Sıcaklık gereksinimi • Psikrofil bakteriler (0o – 20oC) • Mezofil bakteriler (25o - 40oC) • Termofil bakteriler (50o - 60o; >80o C) Bakterilerin cansız ortamlarda üretilmesi ve tanımlanmaları • Bakterilerin organizma dışında (in vitro ortamlarda) üretildikleri cansız ortamlara - besiyeri • Besiyerinde üretilmiş olan mo tümüne - kültür adı • Katı besiyerinde üreyen tek bir bakterinin üreyerek oluşturduğu gözle görülebilir mikrop topluluğu- koloni Kültür hastalık örneği ↓ katı besiyerine ekim ↓ her bir bakteri kültür sonucunda ↓ koloni (bakteri topluluğu) Bakteri tanısı (sayı/tipi) – İdantifikayon , tanımlama Kültür Anaerop kültür Anaerop ortam için özel kapaklı kavanoz Tanımlama (idantifikasyon) • Hastalık örnekleri uygun besiyerlerine ekildikten ve uygun koşullarda bekletildikten bir süre sonra hastalık etkeni olan bakteriler gözle görünür hale gelirler. • Hastalık örneklerinden yapılan kültürlerde üreyen mikroorganizmalar, bazı özelliklerine bakılarak tanımlanırlar. Bakterilerin identifikasyonu - Morfolojik özellikler . Koloni özellikleri (R, S,M koloni) . Bakterinin şekli (kok, çomak, spiral) . Boyutu (küme, zincir, diplokok) . Boyanma özellikleri (Gram olumlu, olumsuz) - Üreme gereksinimleri (Aerop, anaerop, mikroaerofil) - Biyokimyasal özellikleri - Enzimler - Antijenler Bakterilerin identifikasyonu Bakterinin şekli (kok, çomak, spiral) Bakterilerin identifikasyonu Bakterinin boyanma özellikleri Bakterilerin identifikasyonu Biyokimyasal özellikleri Katalaz enzimi → Katalaz testi Staphylococcus – Streptococcus Pozitif Negatif Bakterilerin identifikasyonu Biyokimyasal özellikleri Hemolizin enzimi Streptococcus türleri HEMOLİZ TÜRLERİ (nonhemolitik) (nonhemolitik) Bakterilerin identifikasyonu Vitamin gereksinimleri X ve V faktör Haemophilus spp. tür düzeyinde tanımlama X ve V büyüme faktörü gereksimlerine göre X- Hemin V- nikotinamid-adenin-dinükleotit (NAD) H. influenzae - hem X factor hem V büyüme faktörüne gereksinim duyar Haemophilus influenzae Bakterilerin identifikasyonu Biyokimyasal testler Şeker fermantasyonu H2S üretimi sitrat kullanımı Bakterilerin identifikasyonu Biyokimyasal testler TSI (Triple Sugar Iron) Test Bakterilerin identifikasyonu Biyokimyasal testler SIM (Sulfide Indole Motility) Test 1= K. pneumoniae 2= E. coli 3= P. vulgaris 4= E. aerogenes Hızlı identifikasyon sistemleri Saatler içinde sonuç Son yıllarda MALDI-TOF MS teknolojisi Bakterilerin rutin tanısında kullanıma girmiş ve bir devrim niteliğindedir • Mo protein yapılarının kütle spektrometresinde iyonizasyonu ile elde edilen spektraların grafiksel görüntülerine göre mo cins ve türlerinin tanımlanması • Katı besiyerlerinde üretilmiş bakteriler, dakikalar içinde cins ve tür düzeyinde doğru olarak tanımlanabilmektedir