Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI
1
All images in this document is removed due to copyright restriction
HISTOTEKNIK DASAR
Ahmad Aulia Jusuf
Bagian Histologi
Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia
2009
PENDAHULUAN
Histoteknik adalah metoda atau cara/proses untuk membuat sajian histologi dari spesimen
tertentu melalui suatu rangkaian proses hingga menjadi sajian yang siap untuk diamati atau
dianalisa. Sajian histologi yang baik dapat digunakan untuk
1. Bahan pengajaran dan praktikum mahasiswa, guna mempelajari bentuk dan struktur
jaringan tubuh tertentu yang normal.
2. Riset, guna mempelajari perubahan jaringan dan organ tubuh hewan percobaan yang
mendapat perlakuan tertentu atau mempelajari pertumbuhan dan perkembangan jaringan
atau organ tubuh tertentu.
3. Membantu menegakkan diagnosa penyakit yang diderita oleh seorang pasien
Untuk mencapai ketiga tujuan tersebut sajian histologi yang dibuat harus dapat memberikan
gambaran tentang bentuk dan besar serta susunan sel; inti sel dan sitoplasma; badan inklusi
(glikogen, tetesan lemak, pigmen dsbnya); susunan serat jaringan ikat; otot dan lain sebagainya
sesuai dengan gambaran jaringan tubuh tersebut dalam kondisi hidup.
Sajian yang baik dapat membantu mahasiswa memahami struktur histologi jaringan tubuh
sesuai dengan kondisi yang sebenarnya pada waktu hidup.
Sajian yang baik juga akan memberikan hasil yang benar-benar shahih (valid/akurat) yang
sangat dibutuhkan oleh para peneliti untuk menjawab permasalahan yang timbul. Di samping itu
sajian yang baik juga diperlukan oleh klinikus untuk menunjang diagnosa penyakit yang diderita
oleh pasien.
SUMBER JARINGAN ATAU ORGAN
1. Manusia
Jaringan yang berasal dari manusia tentulah yang paling ideal karena struktur histologi
yang harus dipelajari oleh mahasiswa adalah struktur histologi manusia. Jaringan tubuh
ini dapat di ambil dari cadaver (jenazah) dengan syarat jaringan atau organ tersebut di
Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009
Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI
2
ambil kurang dari 3 jam setelah kematian, sebab bila lebih lama sudah terjadi
pembusukan atau autolisis. Sayangnya syarat tersebut pada masa kini hampir mustahil
dapat dipenuhi. Cara lain adalah mengambil jaringan atau organ tersebut dari kamar
operasi.
2. Hewan
Jaringan atau organ yang diambil dari hewan merupakan alternatif. Beberapa hewan yang
sering dipakai adalah
a. Kera, paling menyerupai jaringan tubuh manusia karena sama-sama tergolong
mahluk primata
b. Kambing, terutama untuk melihat serat Purkinje di jantung
c. Babi untuk melihat lobulus klasik hepar dan arteri Hulsen pada limpa.
d. Kucing dan anjing
e. Tikus putih (mice) dan rat
f.
Kelinci
Jaringan dapat diambil dari hewan yang difiksasi dalam keadaan hidup (fiksasi supra/
intravital) atau hewan yang telah mati (fiksasi emersi/rendam).
Histoteknik ini dapat dilakukan oleh staf pengajar, peneliti atau teknisi laboratorium.
Setiap staf pengajar bagian biomedik harus menguasai teknik pembuatan sajian histologi dengan
baik, karena setiap staf pengajar bagian biomedik dituntut untuk dapat melakukan riset yang
sering kali melibatkan teknik pembuatan sediaan histologi. Setiap peneliti sebaiknya membuat
sajian histologi sendiri, karena dengan melakukannya sendiri setiap peneliti dapat mengetahui
kesulitan-kesulitan yang terjadi sekaligus cara untuk mengatasinya. Disamping peneliti juga dapat
mengamati hal-hal yang terjadi pada jaringan selama proses pembuatan sajian.
Pembuatan sajian histologi yang bersifat massal dan banyak biasanya dilakukan oleh
teknisi laboratorium tetapi harus dikontrol oleh staf pengajar sehingga kualitas sajian histologi
yang dihasilkan akan dapat senantiasa dikontrol.
Setelah jaringan atau organ tubuh yang akan dibuat sajian histologi diisolasi dari
sumbernya, jaringan tubuh tersebut kemudian diproses hingga menjadi sajian histologi.
Rangkaian proses pembuatan sajian histologi (Gb-1) terdiri atas
1. Fiksasi (Fixation)
2. Dehidrasi (Dehydration)
3. Pembeningan (Clearing)
4. Pembenaman (Impregnasi/Embedding)
5. Pengecoran (Blocking)
Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009
Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI
3
6. Pemotongan jaringan (Sectioning)
7. Pewarnaan (Staining)
8. Perekatan (Mounting)
9. Pelabelan (Labelling)
Uraian selanjutnya akan membahas tahapan pembuatan sajian histologi ini secara lebih rinci.
Gambar-1 Rangkaian Proses dalam Histoteknik
ISOLASI (PENGAMBILAN ) JARINGAN TUBUH
A. Persiapan
Sebelum jaringan tubuh diambil beberapa pesiapan perlu dilakukan yang terdiri atas
1. Persiapan alat dan bahan/cairan
Perangkat peralatan yang harus dipersiapkan untuk melakukan isolasi atau
pengambilan jaringan tubuh terdiri atas peralatan bedah minor (gunting, pinset,
scalpel, klem, pemegang jaringan, kassa, dll), meja operasi, lampu, peralatan
anestesi (disposible syringe, sungkup/masker anestesi) dan obat anestesi (eter,
ketalar, phenobarbital dll) serta perangkat pengawetan jaringan (fiksasi jaringan)
seperti wadah untuk fiksasi emersi, cairan fiksasi (Formol salin, Muller, Bouin,
Zenker dll), peristaltik pump/syringe pump untuk fiksasi supravital dan lain-lain
2. Persiapan sampel
Untuk jaringan yang diambil dari kadaver atau manusia, jaringan segera diambil
dan dimasukkan kedalam caian fiksasi. Untuk sampel yang diambil dari hewan,
maka hewan perlu dipersiapkan terlebih dahulu. Hewan yang dipilih haruslah
sehat, galurnya harus baik dan jelas, mempunyai status gizi yang baik dan
dipelihara sesuai dengan syarat-syarat pemeliharaan hewan coba. Hewan yang
digunakan dipilih sesuai dengan tujuan penelitian dan pengajaran. Kera
merupakan hewan yang mempunyai struktur tubuh yang mirip dengan manusia.
Untuk mempelajari serat purkinje pada jantung dengan lebih jelas dapat
digunakan jantung kambing, untuk mempelajari lobulus hati klasik degan lebih
Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009
Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI
4
baik digunakan hati babi, untuk mempelajari arteri Hulsen pada limpa lebih baik
digunakan limpa yang berasal dari babi dan sebagainya.
B. Pelaksanaan
Untuk jaringan yang berasal dari kadaver dan dari jaringan operasi, jaringan yang
telah diambil langsung dimasukkan kedalam wadah yang berisi cairan fiksasi. Sedangkan
untuk jaringan yang berasal dari hewan tahapan pengambilan jaringan adalah sebagai
berikut
1. Pembiusan
Untuk membius hewan yang akan diambil jaringan tubuhnya dapat dilakukan
dengan 2 cara yaitu
a. Pembiusan inhalasi dengan menggunakan eter dan sungkup muka
b. Pembiusan dengan menyuntikkan zat anestesi seperti chloralhydrate,
ketalar, phenobarbital, dan sebagainya.
c. Campuran yaitu pembiusan inhalasi yang diikuti dengan pembiusan lewat
suntikan
2. Pembedahan dan isolasi jaringan tubuh
Setelah hewan terbius sempurna, proses selanjutnya adalah melakukan operasi
dan pengambilan jaringan tubuh yang diinginkan. Jaringan tubuh lalu dipotongpotong didalam cairan fisiologis (NaCl 0.9%) untuk mendapatkan ukuran yang
lebih kecil. Hal ini perlu dilakukan agar cairan fiksasi dapat masuk kedalam
jaringan dengan mudah dan baik. Potongan jaringan kemudian dimasukkan
kedalam wadah-wadah kecil yang telah diberikan label/keterangan. Wadah berisi
cairan fiksasi dan jaringan kemudian disimpan ditempat yang sesuai hingga saat
pemerosesan jaringan selanjutnya.
3. Fiksasi supravital/intra vital
Khusus untuk jaringan tubuh yang difiksasi secara supravital atau intravital,
segera setelah hewan terbius sempurna, hewan dibaringkan di atas meja operasi
dan diikat agar posisinya stabil. Setelah itu dinding perut dibuka dengan sayatan
pada garis tengah dilanjutkan ke samping kiri dan kanan pada sisi atas dan bawah.
Diafragma lalu dibuka. Tulang iga dipotong pada costosterno junction. Tulang
Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009
Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI
5
sternum lalu ditarik ke atas dan difiksasi. Setelah tulang sternum diangkat ke atas
akan terlihat jantung. Aurikula atrium kanan dan ventrikel kiri lalu diidentifikasi.
Perikardium lalu dibuka. Dinding aurikula atrium kanan digunting dan darah
dibiarkan mengalir. Setelah darah mengalir keluar, jarum yang disambung ke
slang infus ditusukkan kedalam ventrikel kiri. Peristaltik pump lalu dinyalakan
dan cairan infus akan mengalir masuk kedalam ventrikel kiri menggantikan darah
yang hilang lewat atrium kanan. Cairan infus yang pertama mengalir adalah
cairan NaCl 0.9% untuk membilas darah dari jaringan tubuh sehingga jaringan
tubuh yang akan diambil bebas dari kontaminasi darah. Selanjutnya akan
mengalir cairan fiksasi yang akan memfiksasi seluruh jaringan tubuh. Cairan
fiksasi dibiarkan mengalir hingga seluruh jaringan terfiksasi sempurna yang
ditandai oleh adanya leher dan ekor yang kaku. Selama cairan fiksasi mengalir
akan terlihat kedutan pada seluruh otot. Setelah seluruh jaringan terfiksasi
sempurna, sisa bekuan darah dibersihkan dari tubuh hewan dengan mencuci
dengan air kran. Jaringan tubuh yang diinginkan kemudian diisolasi, dipotongpotong dan dimasukkan kedalam wadah yang berisi cairan fiksasi yang sama
dengan cairan fiksasi yang diinfuskan. Wadah yang berisi cairan fiksasi dan
jaringan kemudian dilabel dan disimpan hingga saat proses pengolahan jaringan
selanjutnya.
FIKSASI (FIXATION)
Dasar dari pembuatan sajian histologi yang baik adalah melakukan fiksasi yang benar.
Kesalahan yang dilakukan pada tahap fiksasi tidak akan pernah dapat diperbaiki lagi pada
tahapan selanjutnya. Jadi hasil akhir sajian histologi yang baik sangat tergantung pada cara
melakukan fiksasi dengan baik.
Tujuan dari fiksasi adalah untuk
1. Mengawetkan jaringan.
Fiksasi bertujuan untuk mempertahankan susunan jaringan agar mendekati kondisi
seperti sewaktu hidup.
2. Mengeraskan jaringan
Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009
Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI
6
Fiksasi bertujuan untuk mengeraskan jaringan terutama jaringan lunak agar memudahkan
pembuatan irisan tipis.
Efek fiksasi terhadap jaringan yang diproses adalah
1. Menghambat proses pembusukan dan autolisis
Fiksasi akan menghambat terjadinya pembusukan yang disebabkan oleh kuman-kuman
pembusuk yang berasal dari luar tubuh. Waktu pembusukan untuk setiap jaringan atau
organ berbeda-beda tergantung kepada konsistensi dan kandungan unsur-unsur penyusun
jaringan tersebut. Jaringan usus dan otak sangat rentan terhadap proses pembusukan
dibandingkan jaringan tubuh lainnya. Pembusukan seringkali disertai oleh pembentukan
gas yang berbau.
Autolisis adalah proses perusakan jaringan tubuh yang disebabkan oleh ensim-ensim
proteolitik yang terdapat pada jaringan tersebut. Proses proteolitik ini akan lebih cepat
terjadi pada suhu tropik (24-36C). Proses proteolitik lebih mudah terjadi di Jakarta
dibandingkan dengan negeri-negeri dingin.
Untuk menghindari proses pembusukan dan autolisis, jaringan harus segera dimasukkan
kedalam cairan fiksasi segera setelah kematian atau segera setelah diambil dari tubuh.
Bila keadaan ini tidak memungkinkan jaringan dapat disimpan sementara di dalam
ruangan dengan temperatur yang sangat dingin (Freezer).
2. Pengawetan
Sel-sel dan jaringan diawetkan mendekati kondisinya seperti sewaktu hidup.
3. Pengerasan
Efek pengerasan akan mempermudah penangan jaringan lunak, misalnya otak
4. Pemadatan koloid
Fiksasi akan mengubah konsistensi sel yang setengah cair (Sol) menjadi lebih padat (Gel)
5. Differensiasi optik
Fiksasi akan mengubah indeks refraksi berbagai unsur sel dan jaringan sehingga unsurunsur yang belum diwarnai dapat dilihat dengan lebih mudah dibandingkan dengan
jaringan yang belum difiksasi.
6. Pengaruh terhadap pewarnaan
Sebagian besar cairan fiksasi yang ada mempengaruhi reaksi histokimia karena mengikat
bagian reaktif jaringan.
Hal-hal yang harus diperhatikan dalam pembuatan jaringan histologis adalah:
Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009
Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI
7
1. Tebal irisan jaringan 3-5mm sehingga cairan fiksasi dapat dengan cepat medmfiksasi
seluruh jaringan. Bila irisannya terlalu tebal maka permukaan luarnya saja yang difiksasi
dengan cukup baik, sedangkan bagian tengah jaringan sudah keburu membusuk sebelum
cairan fiksasi sempat merembes ke sana.
2. Volume cairan fiksasi sekurang-kurangnya harus 15-20x volume jaringan yang akan
difiksasi.
Besarnya volume jaringan menentukan volume fiksasi yang diperlukan
sedangkan tebal jaringan menentukan kecepatan fiksasi. Panjang dan lebar jaringan
umumnya ditentukan oleh jenis mikrotom yang akan digunakan.
3.
Jenis cairan fiksasi yang akan digunakan bergantung kepada unsur jaringan yang akan
didemonstrasikan dan kepada jenis pewarnaan yang akan digunakan. Untuk keperluan
praktis cairan fiksasi dapat dibedakan menjadi 3 kelompok yaitu
A. Micro-anatomical fixation
Fiksasi ini digunakan apabila struktur histologis jaringan hendak dipertahankan
dengan hubungan yang benar antara lapisan jaringan dan kelompok sel. Cairan
fiksasi
yang tergolong kelompok ini
adalah cairan formalin atau
modifikasinya, cairan acetic alkohol formalin, cairan Heidenhain Susa, cairan
Zenker, cairan Bouin
B. Cytological fixatives
Fiksasi ini digunakan apabila struktur intraselular atau badan inklusi hendak
dipertahankan dan di ekspresikan. Untuk mencapai tujuan ini sering di capai
dengan mengurbankan penetrasi cairan yang merata, kemudahan pemotongan
dengan mikrotom dan hilangnya struktur sel lainnya. Fiksasi ini dapat dibagi
menjadi 2 kelompok yaitu fiksasi inti (nuklear) dan fiksasi sitoplasma. Cairan
fiksasi yang tergolong dalam kelompok ini adalah fiksasi inti (larutan Carnov)
dan fiksasi sitoplasma (larutan Muller, formol saline, formol calcium, Zenker
formol).
C. Histochemical fixatives
Fiksasi ini digunakan apabila jaringan hendak diwarnai dengan pewarnaan
histokimia
sedapatnya
Cairan fiksasi yang digunakan tidak boleh mengubah atau
mengubah
seminim
mungkin
unsur-unsur
yang
akan
didemonstrasikan. Fiksasi histokimia yang baik harus memenuhi syarat-syarat
sebagai berikut:
1. Mengawetkan unsur yang akan didemonstrasikan
Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009
Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI
2. Mengikat
8
atau
mengawetkan
unsur
jaringan
khusus,
tanpa
mempengaruhi gugus reaktif yang digunakan pada visualisasi.
3. Tidak mempengaruhi reagen yang digunakan pada proses visualisasi,
misalnya fiksatif glutaraldehida memfiksasi protein jaringan sedemikian
rupa dengan suatu coating terdiri atas gugus aldehida reaktif sehingga
menghasilkan reaksi PAS atau Schiff positif.
A. LARUTAN FORMALIN
Larutan formalin merupakan cairan fiksasi yang paling umum digunakan. Laurtan formalin yang
digunakan adalah formalin 10%. Formula yang digunakan adalah
Formalin (40% Formaldehida) ........................................................ 10 ml
Air .................................................................................................. 90 ml
Formaldehida 40% adalah gas yang larut dalam air dengan volume 40% dari total berat
larutan. Larutan jenuh ini secara komersial diperdagangkan sebagai Formalin atau 40%
Formaldehida. Telah disepakati bahwa yang dimaksud dengan formaldehida 40% =
larutan jenuh gas formaldehida.
Formalin terutama terdapat dalam bentuk polimer dari formaldehida. Bentuk ini tak dapat
digunakan untuk fiksasi. Yang dapat digunakan adalah bentuk monomernya. Untuk
menghasilkan formalin dalam bentuk monomer diperlukan waktu, kecuali bila pH larutan netral
atau sedikit alkalis, karena kecepatan depolarisasi tergantung pada pH. Jadi jangan sekali-kali
menggunakan formalin 10% yang baru dibuat karena jaringannya keburu membusuk sebelum
terfiksasi dengan baik. Selain itu formalin bersifat asam karena mengandung asam formiat akibat
oksidasi formaldehida. Oleh sebab itu larutan formalin 10% harus dibuat netral atau sedikit
alkalis dengan menggunakan larutan buffer phosphate dengan pH 7.2 sebagai pelarut, atau
dengan menambahkan kalsium asetat. Yang paling mudah dan murah adalah Formol Saline
dengan formulanya
Formalin (formaldehida 40%) .............................................................. 100ml
Sodium klorida (NaCl)
..............................................................
Air kran
............................................................
9gram
900ml
Larutan formalin 10% dengan phosphate buffer yang sering digunakan adalah
1. Formol Calcium (Lillie 1965)
Formalin (40% formaldehida) ....................................................... 10 ml
Kalsium asetat ................................................................................. 2 gr
Akuades ................................................................................... ad 100 ml
Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009
Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI
9
2. Formol Calcium (Baker, 1944)
Formalin ............................................................................................. 10 ml
Calcium chlorida .................................................................................. 2 gr
Akuades ....................................... ................................................ad 100 ml
3. Buffer formalin
Formalin ............................................................................................
10 ml
Acid sodium phosphate monohydrate ............................................... 0.40 gr
Anhydrous disodium phosphate ........................................................ 0.65 gr
Akuades ...........................................................................................ad 100 ml
4. Buffered formalin sukrosa (Holt dan Hicks, 1961)
Formalin ............................................................................................. 10 ml
Sukrosa ................................................................................................ 7.5 gr
M/15 Phosphate buffer (pH 7.4) .......................................................ad 100 ml
Cairan fiksatif formalin akan mengawetkan struktur halus (fine structure) dengan sangat baik,
phospholipid dan beberapa ensim. Cairan ini sangat dianjurkan untuk dipakai pada penelitian
gabungan secara sitokimia dan mikroskop elektron. Untuk mendapatkan hasil yang terbaik
jaringan harus di dinginkan sampai 4 derajat Celsius dalam refrigerator.
Kelebihan larutan fiksatif formalin adalah
a. merupakan cairan fiksatif umum
b. pH mendekati netral
c. Pigmen formalin (acid formaldehyde haematin) tidak terbentuk karena pembentukannya baru
terjadi bila ada interaksi antara larutan formalin pada pH asam dengan hemoglobin atau
produknya (sering dijumpai pada organ yang mengandung banyak darah seperti hepar, lien,
sumsum tulang dan sebagainya). Bila pigmen ini terbentuk dapat dihilangkan dengan
perlakuan pikrat-alkohol atau larutan alkohol 1% dalam sodium hidroksida (NaOH)
d. Potongan jaringan dapat ditinggalkan di dalam cairan formol salin untuk jangka waktu lama
(dapat sampai 1 tahun) tanpa ada perubahan yang berarti
e. Bla diperlukan jaringan yang direndam dalam cairan fiksatif
ini dapat di ambil dan
dimasukkan ke dalam cairan fiksatif lainnya bila diperlukan
Kekurangan larutan fiksatif formalin adalah
Jaringan yang difiksasi dengan cara rendam memerlukan waktu sedikitnya 24 jam baru
dapat diproses.
Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009
Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI
10
B. LARUTAN MULLER
Cairan fiksasi ini merupakan fiksatif sitologi yang dapat digunakan untuk memfiksasi inti
dan sitoplasma sel. Potassium dikromat yang terdapat di dalam larutan Muller akan
memfiksasi protein tanpa mempresipitasikannya. Diduga hal ini terjadi karena ion krom
membentuk kompleks-kompleks dengan air yang mengikat bagian reaktif rantai protein di
dekatnya. Kalium dikromat terutama mengikat gugus karboksil dan hidroksil protein sehingga
fiksatif yang mengandung ion krom tidak dapat di pakai untuk histokimia. Kalium dikromat dapat
digunakan untuk reaksi kromaffin.
Setelah fiksasi dengan larutan Muller jaringan harus dicuci dulu di dalam air kran mengalir
selama 24 jam sebelum dilakukan proses dehidrasi, karena memindahkan jaringan secara
langsung ke dalam alkohol akan menghasilkan oksida yang tak dapat larut dan tak dapat
disingkirkan lagi dari jaringan.
Kelebihan dari larutan Muller adalah
1. Mempunyai daya penetrasi yang cepat dan baik. Jaringan biasanya akan terfiksasi
baik dalam waktu 24 jam.
2. Memfiksasi inti dan sitoplasma sel dengan baik
Kekurangan dari larutan Muller adalah
1. Jaringan yang difiksasi dengan larutan Muller harus segera dilakukan proses
dehidrasi
setelah 24 jam. Bila jaringan direndam terlalu lama (>24 jam) dapat
menyebabkan kerapuhan pada jaringan sehingga tidak mungkin untuk dipotong
dengan mikrotom secara baik.
2. Tidak dapat dipakai untuk pewarnaan dengan metoda histokimia
3. Harus dicuci dulu dengan air kran mengalir sebelum dilakukan dilakukan proses
dehidrasi, karena dehidrasi langsung dengan menggunakan alkohol dapat
menghasilkan oksida yang tak dapat larut dan tak dapat disingkirkan dari jaringan.
Formula larutan Muller adalah sebagai berikut
Potassium dikromat .................................................................. 12.5 gram
Sodium sulfate ............................................................................
5 gram
Akuades ..................................................................................ad 500 ml
Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009
Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI
11
C. LARUTAN BOUIN
Larutan fiksatif ini mengandung larutan asam pikrat jenuh. Asam pikrat merupakan zat
berbentuk serbuk bewarna kuning seperti kunyit dan mudah meledak dalam keadaan kering,
sehingga harus disimpan dalam keadaan lembab. Asam pikrat jenuh dibuat dengan cara
melarutkan serbuk asam pikrat dalam air hingga jenuh (terdapat endapan serbuk pikrat di dasar
larutan.
Asam pikrat mempresipitasikan protein dengan cara membentuk ikatan pikrat-protein.
Asam pikrat menyebabkan sel darah merah menjadi rusak, seringkali menghilangkan Fe+3,
terutama bila berada dalam jumlah sedikit dan dapat melindungi RNA dari proses perusakan oleh
ensim ribonuklease.
Kelebihan dari larutan Bouin adalah
1. Mempunyai daya penetrasi yang cepat dan merata, tetapi dapat menyebabkan
terjadinya sedikit pengerutan. Untuk mengatasi hal ini ke dalam larutan Bouin
biasanya di tambahkan asam asetat glasial sesaat sebelum dipakai. Waktu fiksasi
cepat yaitu 24 jam, tetapi potongan kecil dengan ketebalan kurang dari 2-3 mm dapat
selesai di fiksasi dalam 2-3 jam.
Asam asetat glasial sendiri mempunyai kemampuan untuk fiksasi meskipun rendah.
Asam asetat glasial biasanya digunakan bersama-sama dengan larutan fiksatif lain
dan berfungsi untuk meniadakan pengerutan yang disebabkan oleh larutan lainnya.
Nukleoprotein dipresipitasi oleh asam asetat dan sering ditambahkan pada zat wara
hematoksilin agar inti tampak jelas dan tajam.
2. Memberikan warna cemerlang bila diwarnai dengan metoda trichrome.
3. Sangat baik untuk memperlihatkan inti sel seperti pada sel benih di testis dan ovum.
Kekurangan dari larutan Bouin adalah
1. Jaringan yang difiksasi dengan larutan Bouin harus segera dilakukan proses dehidrasi
setelah 24 jam. Bila jaringan direndam terlalu lama (>24 jam) dapat menyebabkan
kerapuhan pada jaringan sehingga tidak mungkin untuk dipotong dengan mikrotom
secara baik.
2. Warna kuning pada jaringan akibat kelebihan pikrat. Untuk menghilangkan warna
kuning, jaringan harus dicelup dalam alkohol atau dengan mencucinya dalam air kran
semalam. Oleh karena terbentuk beberapa ikatan pikrat yang larut dalam air, jaringan
harus segera dipindahkan ke dalam alkohol
Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009
Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI
12
Formula larutan fiksatif Bouin adalah
Larutan asam pikrat jenuh ......................................................................... 12.5 gram
Formalin 10% (40% formaldehida) ............................................................ 100 ml
Bila akan digunakan baru tambahkan “ asam asetat glasial” .....................
5 ml
D. LARUTAN ZENKER FORMOL (CAIRAN HELLY)
Larutan
fiksatif
Zenker
mengandung Merkuri
klorida yang berfungsi
untuk
mempresipitasi protein. Merkuri klorida akan mengikat gugus asam protein dan gugus asam
fosfat nukleoprotein, dan juga bereaksi secara khusus dengan gugus thiol (SH).
Kelebihan dari larutan fiksatif Zenker adalah
1. Daya fiksasinya cepat dan kuat, tetapi kecepatan penetrasinya berkurang setelah
meresap sejauh beberapa milimeter pertama dan potongan jaringan yang melebihi
ketebalan 5 mm pada umumnya cenderung untuk menjadi keras (rapuh), overfixed di
bagian perifer dan lunak serta undefixed di bagian tengah. Untuk mengatasi hal
tersebut larutan fiksatif ini biasanya dikombinasi dengan asam asetat, formalin,
potassium dikromat dan sebagainya. Waktu fiksasi umunya 6-24 jam
2. Fiksatif ini sangat baik untuk fiksasi sumsum tulang dan limpa serta organ lain yang
banyak mengandung darah seperti jantung dan otot
3. Warna sitoplasma jaringan yang difiksasi dengan larutan fiksatif ini akan lebih
cemerlang.
Kekurangan dari larutan fiksatif Zenker adalah
1. Pemaparan jaringan di dalam larutan fiksatif ini yang melebihi waktu yang
ditentukan akan mengakibatkan jaringan menjadi rapuh (keras), overfixed dibagian
perifer dan underfixed ditengahnya. Jaringan seperti ini tidak dapat dipotong dengan
mikrotom.
Karenanya
larutan
ini
jarang
digunakan
tersendiri,
umumnya
dikombinasikan dengan asam asetat, formalin, potassium bikromat dan sebagainya.
Formula larutan Zenker sebagai berikut
Merkuri klorida .......................................................................................... 5 gram
Potassium dikromat .................................................................................... 2.5 gram
Sodium sulfat ............................................................................................. 1 gram
Akuadest .................................................................................................. ad 100 ml
Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009
Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI
13
Tambahkan formalin segera sebelum pemakaian ...................................... 5 ml
E. LARUTAN ETHYL ALKOHOL
Fiksasi ini biasanya digunakan untuk sajian hapus dan tidak digunakan untuk fiksasi
jaringan, sebab larutan fiksatif ini mempunyai daya penetrasi yang lambat ke dalam jaringan dan
cenderung untuk mengeraskan jaringan bila jaringan direndam terlalu lama di dalam larutan
fiksasi ini. Larutan ini memfiksasi jaringan dengan cara mendenaturasi protein dan
mempresipitasi glikogen. Apabila fiksatif ini dicampur dengan reagen lainnya seperti larutan
Carnoy, fiksasi berlangsung cepat.
D. LARUTAN ASAM ASETAT-ALKOHOL-FORMALIN (TELLYESNICZKY)
Fiksasi ini digunakan untuk mendemonstrasikan glikogen. Larutan ini akan mencegah
karbohidrat menjadi larut sebelum unsur protein selesai difiksasi. Karena formalin dan alkohol
merupakan zat dengan penetrasi cepat, larutan ini merupakan fiksatif yang kerjanya cepat.
Jaringan dengan ketebalan 5 mm selesai difiksasi dalam 4 jam.
Asam asetat , umumnya disebut asam asetat glasial karena padat pada suhu di bawah 17
derajat Celsius. Asam asetat tidak pernah digunakan sendirian karena efek pembengkakan pada
serat kolagen, tetapi ia digunakan untuk meniadakan pengerutan yang disebabkan oleh reagen
lainnya. Nukleoprotein (dalam inti sel) dipresipitasikan oleh acetic acid dan karenanya sering
ditambahkan pada zat warna hematoksilin agar inti tampak lebih jelas dan tajam, mitokondria dan
aparatus Golgi dihancurkannya atau menjadi rusak
Formula larutan fiksatif ini adalah
Formalin .................................................................................................... 5 ml
Asam asetat glasial .................................................................................... 5 ml
Alkohol 70% .............................................................................................. 90 ml
E. LARUTAN HEIDENHEIN’S SUSA
Larutan ini merupakan larutan fiksatif karbohidrat yang sangat baik. Larutan fiksatif ini
mempunyai daya penetrasi yang cepat dan merata serta memberikan hasil pulasan yang sangat
cemerlang dengan rincian sitologi yang sangat baik. Jaringan dengan ketebalan kurang dari 8mm
selesai difiksasi setelah 12-24 jam. Bila jaringan difiksasi lebih dari 24 jam, jaringan akan
menjadi keras dan rapuh
Formula larutan fiksatif ini adalah
Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009
Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI
14
Merkuri klorida ........................................................................................... 4.5 gr
Sodium klorida ............................................................................................. 0.5 gr
Trichloracetic acid ........................................................................................ 2 gr
Acetic acid ................................................................................................... 4 ml
Formalin ....................................................................................................... 20 ml
Akuadest ...................................................................................................... 100 ml
F. LARUTAN CARNOY
Larutan ini merupakan larutan fiksatif inti yang mempunyai daya penetrasi yang cepat.
Di samping itu larutan fiksatif ini juga akan mengawetkan substansia Nissl dan glikogen.
Keuntungan dari larutan Carnoy adalah sangat cepat . Fiksasi ini sering digunakan
apabila suatu diagnostik perlu ditegakkan dengan cepat, misalnya pada bagian bedah untuk
diagnostik sel kanker. Fiksasi umumnya selesai setelah 1-2jam,sedangkan potongan kecil selesai
difiksasi dalam 15 menit.
Kekurangan fiksasi ini adalah efek pengerutan yang kuat dan menghancurkan sebagian
besar unsur sitoplasma lainnya. Efek pengerutan dapat dikurangi dengan melakukan fiksasi pada
suhu nol derajat Celsius selama 18 jam
Formula larutan fiksatif Carnoy adalah
Alcohol absolut ......................................................................................... 60 ml
Chloroform ................................................................................................ 30 ml
Glacial acetic acid ..................................................................................... 10 ml
TEHNIK LENDRUM
Tehnik Lendrum digunakan untuk melunakkan jaringan kulit setelah difiksasi. Hal ini
terjadi karena kulit merupakan jaringan yang keras. Setelah potongan kulit dikeluarkan dari
larutan fiksatif, kulit dicuci sebentar dengan air kran mengalir atau dengan alkohol 90%,
kemudian direndam dalam larutan phenol 4% dalam akwades selama 1-3 hari. Dengan perlakuan
khusus ini diharapkan kulit menjadi mudah diiris dengan pisau mikrotom tajam tanpa merobek .
Sebelum memotong pisau mikrotom sebaiknya direndam dalam es sehingga memudahkan
pemotongan. Setelah dibuat blok, blok preparat sebaiknya disimpan dalam air es.
Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009
Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI
15
DEHIDRASI
Dehidrasi merupakan langkah ke dua dalam pemerosesan jaringan. Proses ini (Gb-2)
bertujuan untuk mengeluarkan seluruh cairan yang terdapat dalam jaringan yang telah difiksasi
sehingga jaringan nantinya dapat diisi dengan parafin atau zat lainnya yang dipakai untuk
membuat blok preparat. Hal ini perlu dilakukan karena air tidak dapat bercampur dengan cairan
parafin atau zat lainnya yang dipakai untuk membuat blok preparat.
Gambar-2 Proses Dehidrasi
Ada beberapa macam cairan yang dapat dipakai untuk proses dehidrasi yaitu
1. Alkohol
2. sukrosa 20%
3. metil alkohol atau spiritus
Setelah jaringan selesai difiksasi jaringan dipindahkan ke dalam alkohol dan diproses
sebagai berikut
1. alkohol 70% ................................................................................................... 1 hari
2. alkohol 70% .................................................................................................... 1 hari
3. alkohol 70% .................................................................................................... 1 hari
4. alkohol 95% ................................................................................................... 1 hari
5. alkohol 95% ................................................................................................... 1 hari
6. alkohol 95% ................................................................................................... 1 hari
7. alkohol 100% ................................................................................................. 1 hari
8. alkohol 100% ................................................................................................. 1 hari
9. alkohol 100% .................................................................................................. 1 hari
Di samping cara di atas cara lain yang juga sering di pakai adalah dehidrasi bertahap dengan
menggunakan alkohol dengan konsentrasi yang makin meningkat secara lebih perlahan yaitu
1.
alkohol 70% ................................................................................................... 1 hari
2. alkohol 80% .................................................................................................... 1 hari
3. alkohol 90% ...................................................................................................... 1 hari
4. alkohol 95% ...................................................................................................... 1 hari
5. alkohol 95% ....................................................................................................... 1 hari
6. alkohol 100% ...................................................................................................... 1 hari
Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009
Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI
16
7. alkohol 100% ..................................................................................................... 1 hari
Alkohol yang sudah dipakai dapat dimurnikan denga cara memasukkan cuprisulfat (CuSO4)
kedalamnya. Cuprisulfat yang bewarna putih (tak mengandung air) akan berubah menjadi biru
(mengandung air). Ganti cuprisulfat beberapa kali hingga warnanya tetap putih walaupun telah
disimpan beberapa hari. Cuprisulfat yang telah bewarna biru karena mengandung air dapat di
hilangkan airnya dengan cara memanaskan.
Metil alkohol dapat digunakan menggantikan alkohol absolut. Metil alkohol ini terlebih
dahulu diberi cuprisulfat hingga warnanya tetap putih, setelah itu siap untuk digunakan. Bila
menggunakan spiritus harus ditest dulu dengan alkohol absolut murni sebagai kontrol.
Untuk jaringan yang akan dipotong menggunakan cryostat dan blok preparat dibuat
menggunakan tissue tech jaringan di dehidrasi menggunakan sukrosa 20% selama 2 hari. Cairan
pekat sukrosa 20% ini dibuat dengan cara sebagai beikut
Sukrosa (gula pasir) ...................................................... 20 gram
Air suling .....................................................................ad 100 ml
PEMBENINGAN (CLEARING)
Pembeningan adalah suatu tahap untuk mengeluarkan alkohol dari jaringan dan
menggantinya dengan suatu larutan yang dapat berikatan dengan parafin. Jaringan tidak dapat
langsung dimasukkan ke dalam parafin karena alkohol dan parafin tidak bisa saling melarutkan.
Proses mengeluarkan alkohol dari jaringan ini sangat krusial karena bila di dalam jaringan masih
tertinggal sedikit alkohol maka parafin tidak bisa masuk kedalam jaringan sehingga jaringan
menjadi “ matang diluar, mentah di dalam” dan akan menyebabkan jaringan menjadi sulit untuk
dipotong dengan mikrotom.
Bahan atau reagen pembening yang paling sering dipakai adalah sebagai berikut
1. chloroform
2. benzene/benzol
3. xylene/xylol
4. cedar wood oil
5. benzil benzoat
6. methyl benzoat
Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009
Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI
17
Chloroform
Chloroform merupakan clearing agent yang paling sering dipakai, karena sifatnya
yang “toleran” artinya jaringan tidak menjadi keras dan rapuh. Sifat ini tak dipunyai oleh
benzene dan xylene. Jaringan biasanya dibeningkan dalam waktu semalam
Kekurangan chloroform adalah titik akhirnya yaitu saat jaringan telah menjadi bening
dan transparan yang tak dapat terlihat dengan jelas oleh mata. Untuk mengatasi hal ini
jaringan sebaiknya direndam dalam chloroform untuk jangka waktu yang lebih panjang
dari yang sebenarnya, sehingga seluruh alkohol diyakini telah keluar dari jaringan dan
jaringan telah sempurna diresapi oleh chloroform. Kekurangan lainnya adalah chloroform
harganya ebih mahal dari xylene dan benzene tetapi lebih murah dari cedarwood oil
Benzene/Benzol dan Xylene
Benzene dan xylene merupakan clearing agent yang cukup cepat. Masa kerja
benzene lebih sedikit lambat dari xylene, tetapi tidak membuat jaringan menjadi serapuh
bila menggunakan xylene. Potongan kecil dapat dibuat menjadi bening dalam waktu ½ 1 jam, sedangkan yang lebih tebal (5mm) telah menjadi bening dalam waktu 2-4 jam.
Benzene saat ini sudah jarang dipakai karena sifat karsinogeniknya.
Bila xylene atau xylol yang dipakai sebagai zat pembening, metodanya adalah
sebagai berikut:
1. Setelah jaringan dikeluarkan dari cairan dehidrasi (alkohol) jaringan dimasukkan
kedalam xylol I selama 1 jam.
2. Perhatikan jaringan akan menjadi bening
3. untuk menyakinkan bahwa seluruih cairan alkohol telah keluar, jaringan
kemudian dipindahkanke cairan xylol II. Lama inkubasi dalam xylol tergantung
pada besarnya jaringan, tetapi biasanya berkisar antara ½ - 1 jam.
4. Jaringan kemudian direndam dalam parafin cair di dalam oven selama kira-kira ½
jam. Setelah itu jaringan siap untuk dimasukkan kedalam blok parafin.
Benzyl benzoat
Benzyl benzoat merupakan clearing agent yang lambat penetrasinya sehingga
Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009
Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI
18
dibutuhkan waktu inkubasi yang lebih lama Metoda pembeningan adalah sebagai berikut
1. Benzyl benzoat I
Jaringan dikeluarkan dari cairan dehidrasi dan direndam dalam benzyl benzoat
selama semalam (24 jam) sampai seluruh jaringan tenggelam. Benzyl benzoat
mempunyai penetrasi yang lambat sehingga tidak perlu kuatir jaringan menjadi
terlalu keras dan rapuh.. Setelah inkubasi selama semalam, jaringan akan tampak
menjadi bening dan transparan.
2. Benzyl benzoat II
Jaringan lalu dipindahkan ke dalam benzyl benzoat II selama kira-kira 2-3 jam.
3. Benzol parafin
Jaringan lalu dipindahkan ke dalam campuran benzol dan parafin cair dengan
perbandingan yang sama, misalnya benzol/benzene sebanyak 25 ml di campur
dengan parafin cair sebanyak 25 ml juga. Jaringan direndam dalam benzol parafin
selama ½-1 jam.
4. Parafin cair
Jaringan kemudian dimasukkan ke dalam parafin cair selam kira-kira ½ jam.
Setelah itu jaringan siap untuk dimasukkan kedalam blok parafin.
5. Bisa juga setelah dari benzyl benzoat II jaringan direndam dalam xylol/xylene
selama ½-1jam, baru kemudian dimasukkan kedalam parafin cair di oven selama
½ jam.
Cedarwood oil
Cedarwood oil merupakan zat pembening termahal dari semua clearing agent tetapi
merupakan clearing agent terbaik, karena sifatnya yang tidak mengeraskan jaringan,
sehingga nantinya jaringan sangat mudah untuk diiris tipis dengan mikrotom. Jaringan
dapat direndam dalam clearing agent ini untuk waktu yang lama bahkan hingga berbulanbulan tanpa menjadi keras dan rusak. Pembeningan oleh cedarwood oil ini sangat baik
tidak hanya untuk jaringan yang halus tetapi juga untuk jaringan yang keras seperti kulit
dan jaringan ikat padat.
Methyl benzoate
Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009
Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI
19
Methyl benzoat merupakan clearing agent yang mempunyai dayapenetrasi lebih
cepat dari benzyl benzoat. Kekurangan dari zat clearing ini adalah mudah menjadi
rapuh/keras
sehingga
menyulitkan
pengirisan
dengan
mikrotom.
Prosedur
pembeningannya adalah sebagai berikut
1. Methyl benzoat I
Setelah dikeluarkan dari cairan dehidrasi jaringan dimasukkan kedalam larutan
methylbenzoat sampai tenggelam, dengan waktu kira-kira 2-3 jam.
2. Methylbenzoat II
Jaringan kemudian dimasukkan ke dalam methyl benzoat II selama 1-2 jam,
tergantung pada besar dan jumlah jaringan.
3. Benzol-Parafin
Jaringan kemudian dipindahkan dan direndam dalam cairan benzol-parafin dan
direndam selama 1/2 hingga 1 jam. Cairan benzol–parafin dibuat dengan
mencampurkan larutan benzol dengan parafin dengan perbandingan yang sama.
4. Jaringan kemudian dipindahkan kedalam cairan parafin selama beberapa menit
PEMBENAMAN (EMBEDDING/IMPREGNASI)
Pembenaman (impregnasi) adalah proses untuk mengeluarkan cairan pembening
(clearing agent) dari jaringan dan diganti dengan parafin. Pada tahap ini jaringan harus
benar-benar bebas dari cairan pembening karena sisa cairan pembening dapat mengkristal
dan sewaktu dipotong dengan mikrotom akan menyebabkan jaringan menjadi mudah
robek.
Zat pembenam (impregnasi agent) yang dipakai adalah
1. Pafin caira panas yang mempunyai temperatur lebur (Melting temperature) kirakira 56-59 C
2. Parafin histotek khusus (Tissue mat) dengan suhu 56C
3. Paraplast yaitu campuran parafin murni dengan beberapa polimer plastik.
Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009
Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI
20
Gambar-3 Pembenaman (Embedding/ Impregnasi)
Keuntungan memakai parafin dengan titik lebur rendah adalah jaringan tidak mudah
menjadi rapuh/garing. Parafin dengan titik lebur rendah biasanya dipakai untuk jaringan
embrional
Keuntungan memakai paraplast adalah sifat parafinnya lebih elastis sehingga tidak
mudah sobek ketika dipotong dengan mikrotom dan dapat dipotong lebih mudah.
Proses pembenaman sebagai berikut
1. jaringan dbenamkan ke dalam parafin/paraplast I selama 2 jam
2. jaringan kemudian dipindahkan kedalam parafin/paraplast II selama 1 jam
3. akhirnya jaringan dimasukkan kedalam parafin/paraplast III selama 2 jam.
4. setelah pembenaman proses dapat dilanjutkan dengan pengecoran/bloking
PENGECORAN (BLOCKING)
Pengecoran (Blocking) adalah proses pembuatan blok preparat agar dapat
dipotong dengan mikrotom.
Untuk membuat blok preparat dapat digunakan 2 macam cara
1. Cara lama yaitu dengan menggunakan potongan besi berbentuk L (Leuckhart)
2 buah potongan besi disusun diatas lembaran logam hingga rapat dan
membentuk ruang seperti kubus. Tuangkan sedikit parafin cair di bagian pinggir
tempat pertemuan potongan besi agar tak bocor. Jaringan kemudian dimasukkan
ke dalam ruangan kubus. Selanjutnya parafin dituangkan kedalam ruangan kubus
tersebut. Hal yang harus dicegah adalah jangan sampai gelembung udara mengisi
kedalam blok parafin tersebut.
2. Cara baru yaitu dengan menggunakan cetakan dari plastik dan piringan logam
Dengan cara ini histoplate dari plastik diletakkan di atas piringan logam (seperti
cetakan membuat es batu). Tuangkan sedikit cairan parafin ke dalam cetakan
tersebut. Secepatnya masukkan jaringan dengan menggunakan pinset yang telah
dipanaskan (agar parafin tak beku) dan diatur posisinya di dalam cetakan. Parafin
cair kemudian dituangkan kembali hingga menutupi seluruh cetakan tersebut.
Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009
Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI
21
Selama tindakan ini cetakan (histoplate dari plastik) dan piringan logam harus
diletakkan diatas hot plate.
PEMOTONGAN (MOUNTING)
Pemotongan (mounting) adalah proses pemotongan blok preparat dengan
menggunakan mikrotom.
Sebelum melakukan pemotongan serangakaian persiapan yang harus dilakukan
adalah
1. Persiapan pisau mikrotom
Pisau mikrotom harus diasah sebelum dipakai agar jaringan dapat dipotong
dengan baik dan tidak koyak sehingga didapatkan jaringan yang baik. Pisau
mikrotom kemudian diletakan pada tempatnya di mikrotom dengan sudut tertentu.
Rekatkan blok parafin pada holder dengan menggunakan spatula atau scalpel.
Letakkan tempat duduk blok parafin beserta blok preparat pada tempatnya pada
mikrotom.
2. Persiapan Kaca Objek
Kaca objek yang akan direkatkan preparat harus telah dicoated (disalut) dengan
zat perekat seperti albumin (putih telur), gelatin atau tespa
3. Persiapan Waterbath atau wadah berisi air hangat dengan temperatur 37-400C
4. Persiapan sengkelit atau kuas
Tehnik pemotongan parafin yang mengandung preparat adalah sebagai berikut
1. Rekatkan blok parafin yang mengandung preparat pada tempat duduknya di
mikrotom. Tempat duduk blok parafin beserta blok parafinnya kemudian
diletakkan pada pemegangnya (holder) pada mikrotom dan dikunci dengan kuat.
Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009
Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI
22
2. Letak pisau mikrotom pada tempatnya dan atur sudut kemiringannya. Biasanya
sudut kemiringan berkisar 20-30 derajat.
3. Atur ketebalan potongan yang diinginkan, biasanya dipakai ketebalan antara 5-7
mikrometer
4. gerakkan blok preparat ke arah pisau sedekat mungkin dan potonglah blok
preparat secara teratur dan ritmis. Buang pita-pita parafin yang awal tanpa
jaringan hingga kita mendapatkan potongan yang mengandung preparat jaringan
5. Pita parafin yang mengandung jaringan lalu dipindahkan secara hati-hati
menggunakan sengkelit atau kuas kedalam waterbath yang temperaturnya diatur
37-40C dan biarkan beberapa saat hingga poita parafin tersebut mengembang.
6. Setelah pita parafin terkembang dengan baik, tempelkan pita parafin tersebut pada
kaca objek yang telah dicoated dengan cara memasukkan kaca objek itu kedalam
waterbath dan menggerakkannya ke arah pita parafin. Dengan menggunakan
sengkelit atau kuas pita parafin ditempelkan pada kaca objek. Setelah melekat
kaca objek digerakkan keluar dari waterbath dengan hati-hati agar pita parafin
tidak melipat.
7. Letakkan kaca objek yang berisi pita parafin di atas hotplate dengan temperatur
40-45C, biarkan selama beberapa jam. Cara lainnya adalah dengan melewatkan
kaca objek di atas api sehingga pita parafin melekat erat di atas kaca objek.
8. Setelah air kering dan pita parafin telah melekat dengan kuat, simpan kaca objek
berisi potongan parafin dan jaringan sampai saatnya untuk diwarnai.
PEWARNAAN (STAINING)
Pewarnaan adalah proses pemberian warna pada jaringan yang telah dipotong
sehingga unsur jaringan menjadi kontras dan dapat dikenali / diamati dengan mikroskop.
Proses timbulnya warna terkait dengan terjadinya ikatan antara molekul tertentu yang
Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009
Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI
23
terdapat pada daerah dan struktur jaringan yang tertentu. Sinar dengan panjang
gelombang tertentu yang terdapat dalam sinar yang berasal dari cahaya matahari atau
lampu mikroskop yang dipaparkan pada sajian yang telah diwarnai akan diabsorpsi
(diserap) atau diteruskan. Zat warna yan terikat pada jaringan akan menyerap sinar
dengan panjang gelombang tertentu sehingga jaringan tersebut akan tampak berwarna.
Sebelum melakukan pewarnaan serangkaian persiapan yang harus dilakukan
adalah sebagai berikut
1. Peralatan gelas harus dibersihkan dulu dan dibilas dengan akuades
2. Timbang zat warna dengan cermat dan tepat
3. Larutkan zat warna dalam pelarut yang benar dengan memperhatikan urutan
pencampurannya, misalnya hematoksilin selalu harus dilarutkan dalam alkohol
dulu sebelum ditambahkan bahan lain.
4. Aduk zat warna dengan baik agar seluruh partikel zat warna terlarut dengan baik
5. Tuangkan larutan zat warna ke dalam wadah yang sesuai untuk proses pewarnaan
dengan menyaringnya menggunakan kertas saring
6. Siapkan juga larutan-larutan lain yang diperlukan untuk proses pewarnaan dan
tuangkan dalam wadah yang sesuai
7. Atur urutan larutan-larutan tersebut sesuai dengan prosedur proses pewarnaan
8. Zat warna beralkohol harus ditutup rapat untuk mencegah penguapan alkohol
yang akan menyebabkan presipitasi (pengendapan) zat warna
Pelarut yang umum dipakai dalam proses pewarnaan adalah air dengan derajat
keasaman yang netral (pH 7). Disamping itu juga dapat digunakan cairan pelarut lainnya
seperti etilalkohol (etanol) dengan derajat konsentrasi yang bervariasi. Bila tidak ada
keterangan dalam proses pelarutan yang menggunakan alkohol berarti konsnetrasi
alkohol yang digunakan adalah alkohol absolut dengan konsentrasi 99.9%.
Pulasan Hematoksilin-Eosin
Pulasan (pewarna) yang sering digunakan secara rutin adalah pewarnaan yang dapat
digunakan untuk memulas inti dan sitoplasma serta jaringan penyambungnya yaitu
pulasan hematoksilin-eosin (HE). Pada pulasan HE digunakan 2 macam zat warna yaitu
Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009
Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI
24
hematoksilin yang berfungsi untuk memulas nti sel dan memberikan warna biru
(basofilik) serta eosin yang merupakan counterstaining hematoksilin, digunakan untuk
memulas sitoplasma sel dan jaringan penyambung dan memberikan warna merah muda
dengan nuansa yang berbeda.
Hematoksilin merupakan zat warna alami yang pertama kali dipakai tahun 1863.
Hematoksilin akan mengikat inti sel secara lemah, kecuali bila ditambahkan senyawaan
lainnya seperti alumunium, besi, krom dan tembaga. Senyawaan hematoksilin yang
dipakai adalah bentuk oksidasinya yaitu hematein. Proses oksidasi senyawaan
hematoksilin ini dikenal sebagai Ripening dan dapat dipercepat prosesnya dengan
menambahkan senyawaan yang bertindak sebagai oksidator seperti merkuri oksida,
hidrogen peroksida, potassium permanganat dan sodium iodat.
Selama proses oksidasi berlangsung kemampuan hematoksilin utuk mewarnai inti sel
akan terus berlangsung dan akan berkurang bila proses oksidasi telah selesai. Untuk
memperpanjang proses ini larutan hematoksilin dapat disimpan dalam wadah tertutup dan
disimpan dalam ruangan gelap. Dalam kondisi terpapar oleh cahaya sebaiknya larutan
diganti sekurangnya seminggu sekali. Jenis hematoksilin yangsering dipakai adalah
mayer, delafied, Erlich, Bullard dan Bohmer, sedangkan counterstaining yang dipakai
adalah eosin, safranin, dan phloxine.
Beberapa larutan hematoksilin yang digunakan adalah
1. Hematoksilin Erlich
Hematoksilin Erlich adalah hematoksilin yang paling tahan lama, mudah
berdifferensiasi dan warnanya relatif tahan lama. Hematoksilin ini baru bisa digunakan
setelah 1-2 bulan dibuat. Waktu inkubasinya adalah 30 menit dan counterstainingnya
adalah 0.5 -1% larutan eosin dalam air. Formulanya adalah sebagai berikut
o Hematoksilin …………………….. 6 gram
o Alkohol absolut …………………. 300ml
o Akwades ………………………….. 300ml
o Glycerol ……………………………. 300 ml
o Glacial acetic acid ………………. 30 ml
o Potassium alum …………………. berlebihan
Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009
Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI
25
Cara pembuatannya adalah sebagai berikut
1. Hematoksilin dilarutkan dalam alkohol
2. Sambil digerus dalam mortar secara perlahan-lahan tambahkan bahan lainnya
secara berurutan sambil digerus
3. Akhirnya tambahkan kristal potassium alum (Aluminium potassium sulfate)
sambil menggoyang-goyang botol hingga terdapat endapan kristal alum di dasar
botol.
4. Botol berisi larutan hematoksilin Ehrlich kemudian ditutup secara longgar dengan
gumpalan kapas dan disimpan ditempat terang selama 1-2 bulan sehingga
hematoksilinnya teroksidasi menjadi haematin. Proses ini dikenal sebagai
pematangan
2. Hematoksilin Delafield
Larutan zat warna ini tahan bertahun-tahun dalam penyimpanan, bisa digunakan 3
hari setlah pembuatan, counterstaining dengan menggunakan 0.5-1% larutan eosin dalam
air, waktu inkubasi 15-20 menit. Formula larutan pewarna ini adalah
o Hematoksilin kristal …………………... 6 gr
o Alkohol absolut …………………………. 50 ml
o Ammonium alum ………………………. 55 gr
o Akwades ………………………………….. 600ml
o Glycerol …………………………………… 150ml
Cara pembuiatan larutan hematoksilin Delafield adalah sebagai berikut
1. Larutkan kristal hematoksilin dengan alkohol absolut
2. Larutkan ammonium alum dengan akwades hingga jenuh (saturated)
3. Campurkan kedua larutan tersebut dan diamkan selama 3-5 hari
4. Saring dan tambahkan glycerol
5. Biarkan selama 3 hari dalam botol terpapar cahaya
6. Setelah 3 hari simpan dalam botol tertutup dan lindungi dari cahaya
Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009
Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI
26
3. Hematoksilin Mayer
Larutan hematoksilin Mayer merupakan larutan yang dapat disimpan dalam
waktu lama (berbulan-bulan), counterstaining dengan 0.5-1% larutan eosin dan waktu
inkubasinya 10-15 menit. Formulanya adalah
o Hematoksilin kristal ……………………….. 1gr
o Aquades ……………………………………….. 1000ml
o Sodium iodate ……………………………….. 0.2 gr
o Ammonium/potassium alum ……………. 50gr
o Citric acid ……………………………………… 1gr
o Chloral hydrate ……………………………… 50gr
Cara pembuatannya adalah sebagai berikut
1. Larutkan ammonium/potassium alum di dalam aquades
2. Tambahkan hematoksilin dan campurkan secara baik
3. Kemudian tambahkan sodium iodate, citric acid dan chloralhydrate
4. Campur dan aduk hingga seluruhnya tercampur dengan baik
5. Biarkan semalam dan saring dengan kertas saring besoknya
4. Hematoksilin Harris
Larutan pewarna yang dapat dipakai segera setelah selesai dibuat, counterstaining
dengan 0.5-1% larutan eosin dan waktu inkubasinya adalah 15-20 menit. Formulanya
adalah sebagai berikut
Kristal hematoksilin …………………………… 5.0 gr
Alkohol 100% ………………………………….. 50 ml
Ammonium/potassium alum ……………….. 100 gr
Distilled water …………………………………… 1000 ml
Merkuri oksida …………………………………… 2.5 gr
Cara pembuatannya adalah sebagai berikut
1. Larutkan hematoksilin di dalam alkohol
2. Larutkan ammonium/potassium alum di dalam distilled water dan panaskan
3. Hentikan pemanasan dan campur kedua larutan tersebut
Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009
Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI
27
4. Panaskan dengan cepat sambil di aduk
5. Hentikan pemanasan dan campurkan merkuri oksida kedalamnya perlahan-lahan
6. Panaskan kembali hingga larutan bewarna purple gelap
7. Hentikan pemanasan dan tempatkan wadah berisi larutan tersebut di dalam wadah
berisi air dingin hingga laurtan hematoksilin menjadi dingin
8. Larutan siap untuk digunakan segera setelah dinginkan
9. Tambahkan 2-4ml asam asetat glasial per 100ml Larutan untuk meningkankan
ketajaman warna inti
10. Saring sebelum digunakan
Larutan Counterstaining
Beberapa pulasan yang dipakai sebagai counterstaining larutan hematoksilin adalah
eosin, safranin dan phloxine.
1. Larutan Eosin
Larutan eosin yang digunakan terdiri atas larutan stok (Stock solution) dan larutan
kerja (working solution). Adapun kedua larutan ini adalah sebagai berikut
1% Stock Alkohol-Eosin
Eosin Y, water soluble ………………………. 1.0 gr
Distilled water ………………………………….. 20 ml
Larutkan dan tambahkan
Alkohol 95% …………………………………….. 80 ml
Working Eosin Solution
Eosin stock solution …………………………… 1 bagian
Alkohol 80% …………………………………….. 3 bagian
Dibuat sesaat sebelum digunakan dan tambahkan asam asetat
glasial 0.5ml untuk setiap 100 ml larutan dan aduk dengan baik
2. Larutan Phloxine
Laurtan phloxine terdiri atas larutan stock eosin, stock phloxine, working solution
dan larutan Safran. Larutan-larutan tersebut adalah sebagai berikut
Stock Eosin
Eosin Y water soluble …………………………… 1 gram
Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009
Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI
28
Distilled water ……………………………………… 100ml
Stock Phloxine
Phloxine B …………………………………………….. 1.5 gr
Distilled water ………………………………………... 100ml
Working Solution
Stock Eosin …………………………………………….. 100ml
Stock Phloxine …………………………………………. 10ml
Alkohol 95% ……………………………………………. 780ml
Asam asetat glasial ………………………………….. 4ml
2% Alkohol Safran
Safran du Gatinais ……………………………………. 2 gram
Alkohol 100% ………………………………………….. 100ml
Pulasan rutin yang banyak dipakai adalah
I. Pulasan Mayer hematoksilin-eosin
Pulasan ini banyak dipakai dengan beberapa pertimbangan
1. Differensiasi warna sangat jelas
2. Mewarnai inti sel dengan baik dan jelas dengan background yang tidak
bewarna
3. Hasil konsisten
4. Prosedurnya sederhana
5. Dapat mewarnai preparat yang difiksasi dengan fiksasi apapun juga
Prosedur yang dipakai adalah sebagai berikut
a. Deparafinisasi dengan xylol (2x2 min)
b. Hidrasi dengan serial Alkohol 100% (2x2 min) – 95% (2min) – 90% (2 min) –
80% (2 min) - 70% (2min) – Distilled water (3min)
c. Inkubasi dalam larutan hematoksilin Mayers selama 15 min
d. Cuci dalam air mengalir selama 15-20menit
e. Observasi di bawah mikroskop, bila masih terlalu biru cuci lagi di air
mengalir selama beberapa menit. Bila sudah cukup warnanya lanjutkan ke
langkah selanjutnya
Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009
Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI
29
f. Counterstaining dalam larutan Eosin working solution selama 15 detik hingga
2 menit tergantung pada umur eosin dan kedalaman warna yang diinginkan
g. Dehidrasi dalam serial alkohol dengan gradasi meningkat perlahan mulai 70%
hingga 100% masing-masing 2 menit.
h. Jernihkan dan dealkoholisasi dalam xylol 2x2min
i. Tutup dengan balsem kanada
Hasil/ Interpretasi adalah
 Inti sel bewarna biru
 Sitoplasma bewarna kemerahan dengan adanya beberapa variasi warna pada
komponen tertentu
II. Pewarnaan Hematoksilin Harris-Eosin
Protokol pulasan hematoksilin Harris –eosin adalah sebagai berikut
a. Deparafinisasi dalam xylol
b. Hidrasi dalam larutan alkohol dengan gradasi yang menurun dari 100%-95%90%-80%-70%
c. Inkubasi dalam larutan hematoksilin Harris selama 15 min
d. Bilas dalam air mengalir dalam waktu yang singkat
e. Celup dalam campuran asam-alkohol secara cepat 3-10 celup cek differensiasi
warna di bawah mikroskop
f. Bilas dalam air mengalir secara singkat
g. Celup sebanyak 3-5 kali dalam larutan ammonium atau lithium karbonat hingga
potongan bewarna biru cerah
h. Cuci dalam air mengalir selama 10-20 menit Bila pencucian tidak maksimal
jaringan sulit terwarna oleh Eosin
i. Inkubasi dalam eosin selama 15 detik hingga 2 menit
j. Dehidrasi dalam alkohol dengan konsentrasi yang meningkat secara perlahan,
masing-masing selama 2 menit
k. inkubasi dalam xylol 2x2menit
l. Tutup dengan kaca penutup
Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009
Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI
Hasil/Interpretasi hasil pulasan
 Inti sel bewarna biru
 Sitoplasma bewarna kemerahan dengan adanya beberapa variasi warna
pada komponen tertentu
III. Pewarnaan Hematoksilin Mayer-Phloxyne-Safran
Prosedur pewarnaan adalah sebagai berikut
a. Deparafinisasi dalam xylol
b. Hidrasi dalam larutan alkohol dengan gradasi yang menurun dari 100%-95%90%-80%-70%
c. Inkubasi dalam larutan asam pikrat jenuh selama 5 menit
d. Cuci dalam air mengalir hingga seluruh asam pikrat hilang
e. Inkubasi dalam larutan hematoksilin Mayer selama 15 menit
f. Basuh dengan air mengalir selama 20 menit
g. Warnai dalam larutan 1.5% larutan Phyloxine B selama 2 menit
h. Basuh dengan air selama 5 menit
i. Cuci dengan alkohol absolut 3 kali
j. Warnai dalam 2% larutan alkohol Safran selama 5 menit
k. Cuci dengan alkohol absolut 2 kali
l. Inkubasi dalam xylol 2 kali masing-masing selama 2 menit
m. Rekatkan dengan objek glass menggunakan Balsam Kanada
Hasil/interpretasi
 Inti bewarna biru
 Sel darah merah bewarna vermillion pink
 Tulang bewarna kuning
 Tulang rawan bewarna hijau kekuningan
 Otot bewarna merah
 Serat kolagen bewarna kuning
Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009
30
Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI
31
IV. Pulasan Giemsa
Pulasan Giemsa digunakan untuk
1. Pewarnaan darah
2. Pewarnaan sumsum tulang
3. Pewarnaan Riketsia
4. Pewarnaan bakteri Helicobacter pylori
Pulasan ini menggunakan fiksasi buffer formalin, metoda blok parafin dengan ketebalan
potongan 4-7 mikron. Larutan yang dipakai adalah
Yenner stock solution
Yenner bubuk ………………………… 1 gram
Methyl alkohol ……………………….. 400ml
Yenner working solution
Yenner stok …………………………… 25ml
Air suling ………………………………. 25 ml
Giemsa solution (Stock Solution)
Giemsa bubuk ……………………………. 1 gram
Glyserin …………………………………….. 66 ml
Methyl alkohol …………………………… 66 ml
Campurkan glyserin dengan bubuk Giemsa, masukkan dalam oven 60
C selama 2 jam
Tambahkan 66 ml methyl alkohol
Giemsa working solution
Campurkan Giemsa stok 50 tetes dengan air suling 50ml
Setiap kali harus dengan larutan segar
Larutan Asam asetat glasial 1%
Asam asetat glasial (cuka) …………………… 1ml
Air suling …………………………………………… 100ml
Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009
Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI
32
Prosedur pulasan adalah sebagai berikut
a. Deparafinisasi dengan xylol 3 kali selama 2-3 menit
b. Alkoholisasi dengan larutan alkohol yang konsentrasinya menurun
secara bertahap : Absolut … 95% …… 90% ….. 80% …… 70%
c. Hidrasi dengan air suling
d. Inkubasi dalam methyl alkohol 2 kali masing-masing selama 3 menit
e. Inkubasi dalam Yenner working solution selama 6 menit
f. Inkubasi dalam Giemsa working solution selama 45 menit
g. Inkubasi dalam asetat glasial 1% sampai inti menjadi jelas
h. Cuci dengan air suling
i. Dehidrasi dalam alkohol dengan konsentrasi yang meningkat secara
bertahap 70%, 80%, 90%, 95%, absolut
j. Dealkoholisasi dengan xylol 2x masing-masing selama 2-3 menit
k. Tutup dengan kaca penutup yang diberi etelan
Hasil/Interpretasi : Bakteri helicobacter dan Riketsia akan bewarna biru
V. Pewarnaan Fite Faraco
Fite Faraco adalah metoda pulasan khusus untuk mendeteksi bakteri tahan asam (BTA)
seperti tuberkulosis dan lepra. Fiksasi yag digunakan adalah buffer formalin 10%, metoda
blok parafin dengan ukuran 4-7 mikron. Larutan yang digunakan adalah
Larutan Carbol Fuchsin
Phenol …………………………….. 2.5ml
Alkohol absolut ………………… 5 ml
Basic Fuchsin …………………… 0.5 gram
Air suling ad……………………… 50 ml
Larutan Methylen Blue
Methylen blue …………………… 0.5 gram
Asam asetat glasial ……………. 0.5 ml
Air suling ………………………….. 100 ml
Larutan alkohol asam 1%
Alkohol 70% …………………………… 99ml
Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009
Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI
Asam chlorida (HCl) ………………… 1 ml
Prosedur pulasan adalah sebagai berikut
 Deparafinisasi dengan Campuran minyak kacang dan xylol (1:2)
dilakukan 2 kali masing-masing selama 12 menit
 Alirkan dan hapus sisa minyak
 Basuh dibawah air mengalir selama 5 menit
 Warnai dengan Carbol Fuchsin 20-30 menit
 Cuci dengan air mengalir
 Cuci dengan alkohol asam 1% selama 1 menit hingga jaringan bewarna
merah jambu
 Cuci dengan air mengalir
 Warnai dengan Methylen Blue hingga jaringan bewarna biru muda
 Bilas dengan air kran
 Keringkan dengan kertas penghisap dan biarkan hingga kering betul
 Inkubasi dalam xylol 2 kali selama 1-2 menit
 Tutup dengan kaca penutup yang diberi Kanada balsem/etelan
Hasil/ Interpretasi hasil
Bakteri tahan asam (BTA) akan memberikan warna merah
Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009
33